CN102809655B - 一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，属生物技术领域。该方法在检品供试品的制备中采用蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以总体积为基准，加入蛋白酶K、1/10体积的蛋白酶K缓冲液和1/6体积的超滤浓缩液，混匀后于孵育；加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍。本发明方法消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中的影响，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖的适宜检测体系，提供了一种准确、快速测定4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的方法，该方法具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价脑膜炎球菌多糖结合疫苗质量的方法。

Description

一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法。

背景技术

脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品多糖（抗原）含量是确保疫苗有效性的基本条件之一。对于单独结合物原液多糖含量，A群可通过测定磷含量获得，C、Y、或W135群可通过测定唾液酸含量获得，而4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品，如A、C、Y、W135群结合疫苗成品中A、C、Y、W135群结合物混合在一起，且C、Y、W135群均含有唾液酸，故无法通过测唾液酸含量获得C、Y、W135各群多糖含量。

《火箭免疫电泳法定量检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法学验证》（林云等，发表于在国际生物制品学杂志2008年12月第31卷第6期）中介绍了一种检测4价脑膜炎球菌多糖疫苗中C群脑膜炎球菌多糖含量的方法，解决了测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖疫苗成品各群多糖含量的技术问题，但该方法不适用于测定结合疫苗成品中各群多糖含量，因为实验证明，结合疫苗中各群结合物的载体蛋白会对火箭免疫电泳产生影响，导致结果不能真实准确地反映多糖含量，故测定3个群以上的多糖结合疫苗成品包括A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量是一个技术难点，目前尚无该多糖结合疫苗成品各群多糖含量测定方法的相关报道，需建立一种方法准确测定该多糖结合疫苗成品中A、C、Y、W135等各群的多糖含量。

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。 这种反应即可在机体内进行，也可以在机体外进行。抗原抗体反应的特点主要有三性：即特异性、比例性、可逆性。 特异性，是抗原抗体反应的最主要特征，这种特异性是由抗原决定簇和抗体分子的超变区之间空间结构的互补性确定的。这种高度的特异性在传染病的诊断与防治方面得到有效的应用。随着免疫学技术的发展进步，还将在医学和生物学领域得到更加深入和广泛的应用，比如肿瘤的诊断和特异性治疗等。比例性，是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，在抗原抗体比例相当或抗原过剩或抗体过剩的情况下，反应最彻底，形成的免疫复合物沉淀最多、最大。而当抗原抗体比例超过此范围时，反应速度和沉淀物量都会迅速降低甚至不出现抗原抗体反应。可逆性，是指抗原抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离恢复为抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，可以随时解离，解离后的抗原抗体仍保持原来的理化特征和生物学活性。

火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起来的一项定量技术，实质上是加速度地单向扩散。在含抗体的琼脂板一端打一排抗原孔；加入待测标本后，将抗原置阴极端，用横距2—3mA／cm的电流强度进行电泳。抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量成正比，用已知量标准抗原作对照，可以方便地测定未知标本中的抗原含量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术还没有能对3个群以上多糖结合疫苗成品中各群的多糖含量进行测定的方法，导致该多糖结合疫苗成品质量难以控制，其目的是提供一种可以准确、快速测定脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的方法。

为解决上述技术问题和达到本发明目的，本发明是通过以下技术方案实现的。

本发明所述的一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）检品供试品的制备

①预处理：取待检测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶后，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液、蛋白酶K，蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品；

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V），混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；

（4）电泳及胶片处理

按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；

（5）结果计算

用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品及检品供试品的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将检品供试品峰高值带入回归曲线计算供试品多糖含量。

步骤（3）所述的预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品是预测定群对应的浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的5个多糖标准品。

步骤（1）所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品为A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。

本发明所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品是指4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗的最终生产产品。所述的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品是指A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的最终生产产品。

本发明方法的有益效果是：

本发明方法通过使用蛋白酶K降解多糖结合物中的载体蛋白，消除了各群结合物载体蛋白在免疫电泳中的影响，建立了检测4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖的适宜检测体系，提供了一种准确、快速测定4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的方法，该方法从准确性、精密度及耐用性验证的结果来看，具有耐用性强、准确性及精密度高的特点，建立了评价脑膜炎球菌多糖结合疫苗质量的方法。

实施例1—实施例12对A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中各群多糖含量的测定，每一群作了3个处理，每个处理3次重复，每个群9次实验，A、C、Y、W135群各群多糖含量测定的标准偏差SD分别为0.34、0.28、0.37、0.37，表明本发明方法重复性好、耐用性强。其A、C、Y、W135群各群多糖含量测定的相对标准偏差CV分别为5.65%、4.46%、6.19%、6.14%，表明本发明方法的精密度高（详见表1—表4）。

实施例还采用了用已知多糖浓度的单群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测其多糖浓度，与用相同结合物采用本发明方法检测其多糖浓度的比较实验，验证本发明方法的准确性，实验表明：

直接进行免疫电泳检测单群脑膜炎球菌结合物中多糖含量，重复性较差，且检测值与实际值偏差较大，回收率低（69.08%—75.92%），不能准确反映多糖结合物中的多糖浓度，故直接进行免疫电泳检测的方法不适于检测结合疫苗成品中多糖含量（详见表5）。

而本发明方法对已知多糖浓度的单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量的检测，通过使用蛋白酶K对多糖结合物供试品进行处理，消除了载体蛋白在免疫电泳中对电泳迁移率等相关因素的影响。其检测重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为3.22%、2.98%、3.21%、2.60%，相对标准偏差CV分别为3.25%、3.00%、3.22%、2.61%，酶处理后的各群结合物多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，验证了本发明方法的准确性和精密度均高，本发明方法可以准确测定结合疫苗成品中各群多糖含量（详见表5）。

本发明方法采用的低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作的标准曲线，既曲线线性好，又增强了检测灵敏度。在4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中，每1剂量各群多糖含量都较低，本发明采用的降低标准品浓度（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）来制作标准曲线，从各群标准曲线相关系数r的数据可以看出，各群标准曲线相关系数r平均值均在0.985以上，且精密度高，即标准偏差SD在0.0009～0.0013之间，相对标准偏差CV值均低于1%，曲线的重复性和稳定性都非常好，检测灵敏度高（详见表6）。

具体实施方式

以下各实施例所用样品、试剂均为市售。 

实施例1    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群多糖含量的测定

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群多糖含量的测定，作3次重复，分别为重复1、重复2、重复3，各重复均按以下步骤进行：

（1）检品供试品制备

①预处理：取A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品12瓶（标示量是每瓶0.5ml），用注射用水6ml复溶后（即用注射用水按标示量复溶），取5.0ml于超滤杯中，5000×g 4℃离心超滤40min，收集浓缩液，补注射用水至1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度，测得其蛋白浓度为271.2μg/ml；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以酶解反应体系总体积420μl为基准，取1/6体积的超滤浓缩液70μl， 加入1/10体积的蛋白酶K缓冲液42μl，加入2μl蛋白酶K、并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育4小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2倍。蛋白酶K的量的计算：

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1489g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%（V/V，即体积分数）即为0.3ml，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个A群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个A群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。

（4）电泳及胶片处理

稳压40V电泳5小时，然后将琼脂糖胶片于生理盐水中浸泡、振摇2小时，再置于两层干净滤纸之间，放37℃过夜制成干胶；将干胶于考马斯亮蓝染色液中浸泡10分钟，脱色液脱色至胶片火箭峰清晰、背景无色。

（5）结果计算

用游标卡尺量取各多糖标准品（2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）及检品供试品的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将检品供试品峰高值带入回归曲线计算供试品多糖含量。结果见表1。

实施例2   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1521g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴20min，加入0.3ml 效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；结果见表1。

实施例3    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1522g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴30min，加入0.3ml 效价为1：640的A群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。结果见表1。

 

分析：本发明方法的技术方案中有检品供试品预处理时离心条件5000～10000×g 离心超虑20～40min，蛋白酶K处理时37℃孵育6小时±2小时以及加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的2～8倍等，在实施例1—实施例3中分别对以上技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一实验重复进行了3次，共计9次实验，通过对检测结果的统计分析，多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在6%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中A群多糖含量的精密度高。

实施例4   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1513g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml 效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个C群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表2。

实施例5   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1503g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴20min，加入0.3ml 效价为1：640的C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个C群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表2。

实施例6    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1518g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴30min，加入0.3ml效价为1：640的 C群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个C群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个C群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表2。

 

分析：同实施例1—实施例3，在实施例4—实施例6中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一实验重复进行了3次，共计9次实验，通过对检测结果的统计分析，多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在5%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中C群多糖含量的精密度高。

实施例7    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1517g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml；结果见表3。

实施例8   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1492g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴20min，加入0.3ml效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表3。

实施例9    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1510g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴30min，加入0.3ml效价为1：640的Y群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个Y群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表3。

 

分析：同实施例1—实施例3，在实施例7—实施例9中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一实验重复进行了3次，共计9次实验，通过对检测结果的统计分析，多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在7%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中Y群多糖含量的精密度高。

实施例10   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1520g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴10min，加入0.3ml效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表4。

实施例11   A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入4μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的4倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1521g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴20min，加入0.3ml效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml；结果见表4。

实施例12    A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群多糖含量的测定

除以下步骤的操作不同外，其余操作与实施例1相同，不再赘述。

（1）检品供试品制备

②蛋白酶K处理：取超滤浓缩液70μl，加入8μl蛋白酶K、42μl蛋白酶K缓冲液并补注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育8小时，即得检品供试品。加入的蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白的含量的8倍。

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖0.1496g，加入pH8.6巴比妥电泳缓冲液10.0ml，加热溶胀完全，放56℃水浴30min，加入0.3ml效价为1：640的W135群脑膜炎球菌多糖抗血清，混均后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔。

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂、然后，在其余各孔依次分别加入已知不同浓度的5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；5个W135群脑膜炎球菌多糖标准品的浓度分别是2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml。结果见表4。

 

分析：同实施例1—实施例3，在实施例10—实施例12中分别对本发明技术方案中提到的相关技术参数进行了范围两端及中间参数运用的实验，每一实验重复进行了3次，共计9次实验，通过对检测结果的统计分析，多糖重复性测定结果相对标准偏差CV在7%以内，表明本方法的耐用性强，且测定A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中W135群多糖含量的精密度高。

实施例13  本发明方法准确性的验证

本实施例是用已知多糖浓度为40μg/ml的单群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测其多糖浓度，与用相同结合物采用本发明方法检测其多糖浓度的比较实验，比较其准确性。

（1）-1：已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳

检测A群多糖含量，除步骤（3）上样所述的检品供试品为多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物外，其余实验方法与实施例1第（2）步—第（5）步相同。

（1）-2：已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物采用本发明方法检测A群多糖浓度，除供试品为已知多糖浓度为40μg/ml的A群脑膜炎球菌多糖结合物外，其余方法与实施例1所述的方法相同。

（2）-1：已知多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测C群多糖含量，除步骤（3）上样所述的检品供试品为多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物外，实验方法与实施例4第（2）步—第（5）步相同。

（2）-2：已知多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物采用本发明方法检测C群多糖浓度，除供试品为已知多糖浓度为40μg/ml的C群脑膜炎球菌多糖结合物外，其余方法与实施例4所述的方法相同。

（3）-1：已知多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测Y群多糖含量，除步骤（3）上样所述的检品供试品为多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物外，实验方法与实施例7第（2）步—第（5）步相同。

（3）-2：已知多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物采用本发明方法检测Y群多糖浓度，除供试品为已知多糖浓度为40μg/ml的Y群脑膜炎球菌多糖结合物外，其余方法与实施例7所述的方法相同。

（4）-1：已知多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物直接进行免疫电泳检测W135群多糖含量，除步骤（3）上样所述的检品供试品为多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物外，实验方法与实施例10第（2）步—第（5）步相同。

（4）-2：已知多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物采用本发明方法检测W135群多糖浓度，除供试品为已知多糖浓度为40μg/ml的W135群脑膜炎球菌多糖结合物外，其余方法与实施例10所述的方法相同。

各单群脑膜炎球菌多糖结合物酶处理前和酶处理后的多糖含量免疫电泳检测结果对比见表5。试验结果显示：

1、直接进行免疫电泳检测单群脑膜炎球菌多糖结合物中多糖含量，其多糖浓度检测重复性较差，且检测值与实际值偏差较大，回收率低（69.08%—75.92%），不能准确反映多糖结合物中的多糖浓度，故对于多糖结合疫苗成品而言，直接进行免疫电泳检测方法不适于检测结合疫苗成品中多糖含量。

2、本发明方法通过使用蛋白酶K对单群脑膜炎球菌多糖结合物供试品进行处理，重复性好，检测值与实际值偏差较小，从A群、C群、Y群到W135群的标准偏差SD分别为3.22%、2.98%、3.21%、2.61%，相对标准偏差CV分别为3.25%、3.00%、3.22%、2.61%，标准偏差SD及相对标准偏差CV值均在5%以内，酶处理后的各群结合物多糖含量重复性检测结果平均回收率X均在99%以上，验证了本发明方法的准确性和精密度均高，可以准确测定结合疫苗成品中各群多糖含量。

从表6各群标准曲线相关系数r的数据可以看出，各群标准曲线相关系数r平均值均在0.985以上，且精密度高，即标准偏差SD在0.0009～0.0013之间，相对标准偏差CV值均低于1%，曲线的重复性和稳定性都非常好。采用的低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作标准曲线，既曲线线性好，也增强了检测灵敏度。

 

在4个群以上脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品中，每1剂量各群多糖含量都较低，本发明采用降低标准品浓度，通过5个不同低浓度的标准品即2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml来制作标准曲线，增强了检测灵敏度，且曲线线性好。结果见表6。

 

由表6的数据可以看出，各群标准曲线相关系数r平均值均在0.985以上，且精密度高，即标准偏差SD在0.0009～0.0013之间，相对标准偏差CV值均低于1%，曲线的重复性和稳定性都非常好。

所用试剂的配制方法：

1、蛋白酶K缓冲液（pH8.0）：

    量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0）、5mol/L氯化钠溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml，加注射用水至100ml。

2、巴比妥电泳缓冲液（pH8.6）

称取巴比妥4.14g、巴比妥钠23.18g，加水适量，加热使之溶解，放冷至室温，再加叠氮钠0.15g，溶解后，加水稀释至1500ml。

3、考马斯亮蓝R250脱色液： 

   准确量取无水乙醇225ml，冰醋酸50ml，注射用水225ml混匀即得。

4、考马斯亮蓝染色液： 

   准确称取考马斯亮蓝R250 1.0g，加入考马斯亮蓝R250脱色液200ml溶解混匀即得。

Claims (3)

1.一种脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，包括以下步骤：

（1）检品供试品的制备

①预处理：取待检测的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品用注射用水按标示量复溶后，取5.0ml于超滤杯中，5000～10000×g离心超滤20～40min，收集浓缩液，补注射用水至总体积为1.0ml，得超滤浓缩液；用Lowry法测定该超滤浓缩液中蛋白的浓度；

②蛋白酶K处理：酶解反应体系总体积为420μl，以所述的酶解反应体系总体积为基准，取1/6体积的超滤浓缩液，加入蛋白酶K和1/10体积的蛋白酶K缓冲液，其中，蛋白酶K的量为酶解反应体系中蛋白含量的2～8倍，并补加注射用水至420μl，混匀后于37℃孵育6小时±2小时，即得检品供试品；

（2）抗血清琼脂糖胶板的制备

称取琼脂糖，加入pH8.6的巴比妥电泳缓冲液使胶浓度为1.5%，加热溶胀完全，放56℃水浴10～30min，加入预测定群对应的效价为1：640的特异性抗血清，该抗血清的量为琼脂糖溶液体积的3%，混匀后立即铺板、在抗血清琼脂糖胶板的一端打一排孔；

（3）上样

待抗血清琼脂糖胶板凝固后，在其中一个孔加入溴酚蓝指示剂，然后在其余各孔依次分别加入预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品、检品供试品，加入量均为7μl/孔；

（4）电泳及胶片处理

按常规方法进行电泳、干胶制备、染色和脱色处理；

（5）结果计算

用游标卡尺量取预测定群对应的各多糖标准品及检品供试品的峰高值，以多糖标准品浓度对数为横坐标，对应峰高值为纵坐标作回归曲线，将检品供试品峰高值带入回归曲线计算供试品多糖含量。

2.根据权利要求1所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，其特征在于：步骤（3）所述的预测定群对应的4个以上已知不同浓度的多糖标准品是预测定群对应的浓度分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的5个多糖标准品。

3.根据权利要求1或2所述的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品各群多糖含量的测定方法，其特征在于：所述的4个群以上的脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品为A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗成品。