CN102053029A - 多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法，尤其适用于两种或者多种由化学性质，以及物理性质相同或者极其相似的糖链的混合物，包括与糖链偶联的蛋白等的混合物的分析，本发明的检测方法，包括以下步骤：步骤1、将多糖降解为完整单糖，步骤2、使用常规技术手段定量测定降解后的单糖的含量。

Description

多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法

技术领域：

本发明涉及多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法，尤其适用于两种或者多种由化学性质，以及物理性质相同或者极其相似的糖链的混合物，包括与糖链偶联的蛋白等的混合物的分析，目前与多糖偶联的蛋白包括：精制破伤风类毒素、白喉类毒素、减毒白喉毒素、B群脑膜炎球菌外膜蛋白、牛血清白蛋白等。

背景技术：

糖是生物环境中含量最多的有机化合物之一，在许多生命体系中起着重要作用。糖类化合物的分析对生命科学、食品科学、药物学、农业科学都有着重要意义。

糖类的检测方法大体包括：分光光度法、液相色谱法、气相色谱法等

糖含量的检测多种多样，许多多糖混合物可以根据多糖之间不同的物理性质、化学性质、或者生物学性质而加以区分，或者定量检出。例如脑膜炎奈瑟球菌多糖中的A群与C群，A群脑膜炎奈瑟球菌多糖中有不同于C群脑膜炎奈瑟球菌多糖的磷酸盐组成，所以可以通过检测磷酸盐的含量进而就可以算得A群脑膜炎奈瑟球菌多糖的含量，同样C群脑膜炎奈瑟球菌多糖也拥有完整的N-乙酰神经氨酸，所以也可以通过检测唾液酸的方法检出C群脑膜炎奈瑟球菌多糖的含量。

结构1为A群脑膜炎球菌特异性荚膜多糖结构式的组成基团

结构2为C群脑膜炎球菌特异性荚膜多糖结构式的组成基团

结构3为Y群脑膜炎球菌特异性荚膜多糖结构式的组成基团

结构4为W₁₃₅群脑膜炎球菌特异性荚膜多糖结构式的组成基团

由上述结构式可知，C群、Y群、W₁₃₅群同样也是以糖链形式存在的，也拥有完整的N-乙酰神经氨酸。如果分别和A群脑膜炎奈瑟球菌多糖混合到一起，可按照上述的方法分别检出。如果A群和C、Y、W₁₃₅群四种多糖混在一起，A群脑膜炎奈瑟球菌多糖可以通过检测磷酸盐的含量进而就可以算得A群脑膜炎奈瑟球菌多糖的含量，而C、Y、W₁₃₅群都拥有唾液酸基团，无法区分，所以又出现了火箭电泳的方法，利用抗原抗体之间的特异性反应达到区分，以及定量的检测。

当四种单糖都与蛋白偶联后，形成多糖蛋白结合物的时候，由于电荷及分子质量的影响，火箭电泳的方法就会受到影响，无法正常检测。故需要一种方法可将C、Y、W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖或C、Y、W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物达到区分并定量的检测。

同样在生物学领域许多需要应用的糖类混合使用后，无法有效的检测出各自的含量。例如肺炎荚膜多糖一般都是应用几个甚至几十个群的荚膜多糖混合使用、或者与蛋白偶联后混合使用。许多类似的多糖类以及多糖蛋白结合物都迫切需要解决定量检测的问题。

本发明是起始于检测C群脑膜炎奈瑟球菌多糖、Y群脑膜炎奈瑟球菌多糖、W₁₃₅群脑膜炎奈瑟球菌多糖混合或者两两混合时，各个多糖含量的检测；同样能够检测任何由固定组成单位且每个单位含有可检测的小分子化合物的样品(小分子化合物与整个基团通过氧连接或者氮连接)的含量尤其适用于各种性质相同或者极其近似的多糖混合物的检测。

发明内容：

本发明提供一种含有多糖的疫苗的检测方法，其中所述的多糖包括多价多糖或多糖蛋白混合物。

本发明的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、将多糖降解为完整单糖，

步骤2、使用常规技术手段定量测定降解后的单糖的含量。

本发明的检测方法，所述多糖，优选C群脑膜炎奈瑟球菌多糖、Y群脑膜炎奈瑟球菌多糖、W₁₃₅群脑膜炎奈瑟球菌多糖或它们的混合物。

本发明的检测方法，能够检测任何由固定组成单位且每个单位含有可检测的小分子化合物的样品(小分子化合物与整个基团通过氧连接或者氮连接)的含量尤其适用于各种性质相同或者极其近似的多糖混合物的检测。

本发明的检测方法，其中所述的将多糖降解为完整单糖，可以采用任何现有的已经知道的降解技术，如：水解，酸解等。

本发明的检测方法，其中所述常规技术手段包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用、原子吸收等等各种检测单糖的检测手段。

本发明的检测方法，其中将多糖降解为完整单糖的步骤前，优选的还包括将多糖或者多糖蛋白结合物中容易在酸水解过程中聚合的活性基团还原为相对稳定的基团的步骤，该步骤得到的产物必要时可以通过透析、纯化、脱盐柱、超滤膜包等方法除去其中的小分子物质。然后进行水解。

因此本发明的优选的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、将多糖或者多糖蛋白结合物中容易在酸水解过程中聚合的活性基团还原为相对稳定的基团的步骤，

步骤2、得到的产物必要时可以通过透析、纯化、脱盐柱、超滤膜包等方法除去其中的小分子物质。

步骤3、将多糖降解为完整单糖，

步骤4、使用常规技术手段定量测定降解后的单糖的含量。

现以检测聚合糖链为例详细介绍本发明的原理：

本发明检测多糖的方法通过将样品降解为完整单糖，再利用各种检测手段定量测定单糖。

首先需要将多糖或者多糖蛋白结合物中容易在酸水解过程中聚合的活性基团还原为相对稳定的基团，可根据水解条件选择还原剂。现以Y群脑膜炎球菌多糖为例说明，Y群脑膜炎球菌多糖全称：N-乙酰神经氨酸α-(1-4)葡萄糖α(2-6)，其中活泼的基团包括酰胺基、羰基、以及羧基。需要加入还原剂例如硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂等。硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂等，这些还原剂均携带负氢离子，可以将酰胺基、羰基、以及羧基还原为稳定的羟基。

下面以氢化铝锂还原碳氧双键为例介绍：

经过还原反应后溶液的pH会变为碱性，在碱性条件下硼氢化钠、硼氢化钾、氢化铝锂等都能稳定存在于水溶液中，同时还原反应也会引入小分子的无机盐类，为了除去这些对后续处理有影响的小分子化合物，我们可以选用透析、纯化、脱盐柱、超滤膜包等一切除去小分子的方法。

下面仅介绍一种除去小分子的方法。

用透析法除去小分子，透析前需要调节pH值以适应透析袋的要求，调节pH可选择各种酸、缓冲液等可以将溶液由碱性调为中性的试剂，但前提是糖链对所使用的调节溶液是稳定的。本次调节溶液pH选择醋酸，是因为糖链对强酸不稳定，我们选用0.1mol/L的醋酸溶液温和的将pH值调节至6.0-7.0进行透析，除去小分子的物质。

然后可以选择直接将透析后溶液用水解试剂调节成所需浓度，或者先采用将溶液蒸干，蒸干可以采用加热蒸干或者减压蒸干的方法将溶液中水分蒸干。

下一步水解，可以采用包括酸水解、碱水解等各种水解方法，尤以稀酸水解为最优，在稀酸条件下可以使多糖水解，而单糖在稀酸溶液中不水解。

以Y群脑膜炎球菌多糖酸水解为例：

Y群脑膜炎球菌多糖分子式中葡萄糖是连接在了N-乙酰神经氨酸的2，6位，是葡萄糖的1位连接在N-乙酰神经氨酸的6位上，葡萄糖的4位连接在N-乙酰神经氨酸的2位上。

在水解时发生的反应是：

CHO-(CHOH)₄-CH₂-OH

酸水解只是断裂了上述化学式中的C-O键，使C-O-变成了C-H；而对于糖蛋白结合物来说酸水解会断裂C-O键和C-N键，多糖和蛋白偶联多数都是酰胺键。

例如Y群脑膜炎球菌多糖与蛋白偶联的方式

Y糖-CH₂-NH₂-CH₂-O-NH-NH-CO-(CH₂)₆-CO-NH-NH-O-CO-蛋白

式中Y糖与蛋白连接的方式比较复杂，但是连接位置始终逃不掉C-N键所以水解后仍然能够得到完整的单糖结构。

水解结束后的溶液还是含有酸，而一般的液相色谱柱(离子交换柱除外)都不能适应强酸环境，所以需要调节pH以适应所选柱子的pH范围，可以选择用碱溶液、碱性缓冲液等等可以中和酸的试剂调节pH，因为用碱调节pH值会使溶液中出现很高浓度的盐，而高浓度的盐会严重干扰色谱柱的分离作用。

故本次实例选择用稀硫酸进行水解，为此选择碳酸钡来调节溶液的pH值是最合适的。加过量的碳酸钡与硫酸反应

BaCO₃+H₂SO₄→BaSO₄↓+CO₂↑+H₂O

反应生成的硫酸钡会沉淀，过量的碳酸钡也会沉淀，二氧化碳以气泡形式会从溶液排除。

沉淀可以通过过滤、离心等手段除去，是否去除沉淀或去除沉淀的方法应与采用的检测手段相匹配。如果样品中糖浓度低，达不到检测手段的检出限的话，收集的上清还可以通过各种浓缩手段进行浓缩。

对于单糖来说，可以使用各种检测方法包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用、原子吸收等等各种检测单糖的检测手段。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。本实施例只是一种举例，是本发明的解决方案之一，并非将本发明局限于实施例。

实施例一多糖活性基团的处理

绝大多数的荚膜多糖都含有有活性的氨基或者是羧基、羰基等等基团，而这些活性基团在降解时容易出现自身的聚合，从而影响后续的分析。所以我们需要将羧基以及氨基等活性基团还原为相对比较稳定的羟基。现以脑膜炎球菌多糖为例介绍。将含有Y群脑膜炎奈瑟球菌多糖的溶液(2mg/ml)取10毫升加入硼氢化钾72mg，于暗处用磁力搅拌器搅拌反应24小时；

将搅拌过夜的样品取出，用0.1mol/L醋酸调节pH值至6-7，装入透析袋，扎紧，于流动纯水中透析24小时；。

实施例二多糖的降解

将透析后样品取出，转入小烧杯中于恒温水浴箱中80℃水浴蒸干；

用2ml(可根据最后检测方法的检出限来参考)1mol/L硫酸将蒸干的样品溶解，转入冻存管中，用酒精喷灯封管，于100度水解8小时。

将水解后的样品转移入5ml离心管中，并先用纯化水稀释至约3ml，再用过量的碳酸钡调节pH，边加入边混匀，至无气泡溢出且溶液呈中性。于离心机上8000转/分钟离心5分钟，取上清备用。

得到的上清可蒸发浓缩，也可以直接测定体积。

实施例三多糖含量的测定

将上清液置于一个小烧杯中，于85℃水浴蒸发至2ml，选用高效液相色谱法测定溶液中的单糖含量。

色谱条件：

岛津LC-10A RID-10A

Amide-80

流速：0.5ml/min

流动相：丙酮∶注射水(V∶V)为82∶18

柱温：85℃

检测时需要用到葡萄糖作为标准品，做标准曲线来得到葡萄糖的含量。进而折算出原Y群脑膜炎球菌多糖的含量。

实施例四多糖混合物的检测

取多糖混合物适量按照实施例一和二的步骤将多糖混合物降解，再进行检测。以Y群脑膜炎球菌多糖和W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖混合物为例。

将该混合物溶液取10ml，按照实施例一将混合物中的容易在降解时发生副反应的羧基、羰基、氨基还原为在稀酸水解环境下稳定的醇羟基。依次按照实施例一和二的步骤得到降解产物。

检测可选用高效液相色谱法

色谱条件：

岛津LC-10A RID-10A

BENSON BP-100Pb++

流速：0.5ml/min

流动相：注射水

柱温：85℃

检测时需要用到葡萄糖和半乳糖作为标准品，做标准曲线来得到葡萄糖和半乳糖的含量。进而折算出原Y群脑膜炎球菌多糖和W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖的含量。

实施例五多糖蛋白混合物中多糖含量的检测

取多糖蛋白混合物适量按照实施例一和二的步骤将多糖混合物降解，再进行检测。以Y群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物原液和W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物原液混合物为例。

将该混合物溶液取10ml，按照实施例一将混合物中的容易在降解时发生副反应的羧基、羰基、氨基以及酰胺键还原为在稀酸水解环境下稳定的醇羟基，对于酰胺键的还原可以选择还原性更强大的硼氢化钠或者硼氢化钠加三氯化铝。依次按照实施例一和二的步骤得到降解产物。

检测可选用高效液相色谱法

色谱条件：

岛津LC-10A RID-10A

BENSON BP-100Pb++

流速：0.5ml/min

流动相：注射水

柱温：85℃

检测时需要用到葡萄糖和半乳糖作为标准品，做标准曲线来得到葡萄糖和半乳糖的含量。进而折算出原Y群脑膜炎球菌多糖和W₁₃₅群脑膜炎球菌多糖的含量。

Claims (10)

1.多价多糖或多糖蛋白混合物中各单价多糖含量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将多糖降解为完整单糖，

步骤2、使用常规技术手段定量测定降解后的单糖的含量。

2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，包括所有含有可检测的小分子化合物且小分子化合物在样品组成单位上以氧连接或者氮连接，连接在每个基团上，尤其是适用于性质极其近似的糖链混合物。

3.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述多糖，选自C群脑膜炎奈瑟球菌多糖、Y群脑膜炎奈瑟球菌多糖、W135群脑膜炎奈瑟球菌多糖或它们的混合物。

4.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，其中所述的将多糖降解为完整单糖，可以采用任何现有的已经知道的降解技术，如：水解，酸解等。

5.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，其中所述常规技术手段包括分光光度法、液相色谱法、气相色谱法、液质联用、气质联用、原子吸收等等各种检测单糖的检测手段。

6.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将多糖或者多糖蛋白结合物中容易在酸水解过程中聚合的活性基团还原为相对稳定的基团的步骤，

步骤2、得到的产物必要时可以通过透析、纯化、脱盐柱、超滤膜包等方法除去其中的小分子物质。

步骤3、将多糖降解为完整单糖，

步骤4、使用常规技术手段定量测定降解后的单糖的含量。

7.根据权利要求6的检测方法，其特征在于，所述还原使用的还原剂包括硼氢化钠、硼氢化钾、四氢铝锂等以及能还原双键的一切还原剂。

8.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，还原剂加入量约相当于样品中糖类质量的3倍为最优。

9.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，水解，包括酸水解、碱水解等各种水解方法，最好采用稀酸，尤以1mol/L的硫酸为最优。

10.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，水解温度控制在100度为最优，水解时间根据样品而定，以保证水解彻底为准。