CN115166077A - 一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法，属于水产品质量安全领域。本发明以恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5合并使用作为内标试剂，样品中加入不同浓度的恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5内标，只经过一步提取过程，或对样品进行直接稀释，获得两份样品定量溶液，与含有恩诺沙星‑D3和恩诺沙星‑D5的标准溶液曲线同时上机检测，根据样品中恩诺沙星的大致含量，选择合适的校正曲线，通过与两组不同内标浓度的标准溶液曲线进行定量，并且不需要再重新进样，直接对样品进行定量，同时保证了定量结果的准确性，免去了重新进行样品前处理和上机检测的过程。

Description

一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测 方法

技术领域

本发明属于水产品质量安全领域，特别涉及一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin)又名乙基环丙沙星、恩氟沙星，是人工合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，为畜禽和水产用喹诺酮类抗菌药物，是一种微黄色或淡黄色结晶性粉末，味苦，不溶于水，易溶于氢氧化钠溶液、甲醇及氰甲烷等有机溶剂。

恩诺沙星在动物体内半衰期长，有良好组织分布性，在动物体内的代谢主要是脱去乙基而成为环丙沙星，具有抑菌范围广、吸收快、药物在体内存留时间长、药效好的优点，对于革兰氏阳性菌、阴性菌及霉形体具有抑菌作用。对由耐药性致病菌引起的严重感染有效，与其它抗菌素无交叉耐药性。该药对水生动物几乎所有病原菌的抗菌活性均较强，现已被国家指定为动物专用药，在家禽、水产养殖等方面广泛使用。

但长期以及不科学用药导致药物残留超标和细菌的耐药性增强，恩诺沙残留会对中枢神经系统造成不良反应，有潜在的致癌性和遗传毒性，其代谢产物环丙沙星对人体危害较大，因此引起了人们的关注。我国最新版食品安全国家标准GB31650-2019中做了最大残留限量要求。准确、便捷、稳定的检测方法是保证食品质量安全的技术保障，因此，食品中恩诺沙星药物残留检测方法开发研究具有重要意义。

目前，关于恩诺沙星残留常用的检测分析方法主要有高效液相色谱法、化学发光免疫法、分子印迹技术毛细管电泳法等，其中，采用稳定同位素内标试剂的色谱-质谱串联技术具有较高的准确性和灵敏性，越来越多地被应用在食品安全检测领域。

以氘标记化合物为内标试剂的液质联用方法具有较高的准确度和灵敏度，在基于同位素内标试剂的液质法恩诺沙星检测的标准中，目前最常使用的内标为恩诺沙星-D5内标，其结构如下图：

目前主要使用的恩诺沙星检测标准为农业部1077号公告-1-2008水产品中17种磺胺类及15种喹诺酮类药物残留量的测定液相色谱—串联质谱法。该标准前处理方法中，提取较为简易、快速，包括提取、除水、旋蒸浓缩、复溶以及去脂等步骤，以液相色谱串联质谱方法进行检测，通过恩诺沙星-D5内标进行定量。以内标法进行定量具有消除前处理过程中操作误差导致的损失、以及液质连用仪器检测过程中由于进样量的误差、仪器响应性能的变化、基质效应的影响等问题带来的系统稳定性差异，从而保证了方法的良好稳定性。并且，由于前处理过程产生的过多的目标化合物损失，以及仪器灵敏度的变化在内标化合物的信号上都可以进行可靠地质控保证，因而对方法使用者具有很好的规避方法整体误差的作用。

工业上合成恩诺沙星的方法主要是环丙沙星与烃化剂(硫酸二乙酯)反应或由1-环丙基-6-氟-7-氯-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸与乙基哌嗪反应制得，其内标恩诺沙星-D5合成方法较复杂，原料不易获取，且成本高。

然而，由于使用的是内标法进行定量，为了使得内标与分析物之间在前处理过程以及仪器响应信号上具有同步性，分析物与内标之间的浓度不宜差异过大，其含量差异比例一般控制在0.1-50之间，以保证方法的可靠性。

恩诺沙星在水产养殖中属于限用药，在养殖环节可以进行使用，GB31650-2019规定恩诺沙星在水产品中的残留限量为100μg/kg(以恩诺沙星和环丙沙星总量计)，根据兽药质量标准(2017年版)其休药期为500度日。然而，由于养殖户在用药过程中过量使用，或其休药期不足，以及水产品在流通过程中为避免水产品损伤而非法添加，频繁出现恩诺沙星残留超过标准限量问题。不仅如此，恩诺沙星的残留在水产品中普遍存在，其残留含量差异变化范围极大，每一批样品中，从检测定量限1μg/kg～10000μg/kg同时存在，检出率超过20％。残留含量巨大的变化范围频繁导致仪器检测线性曲线的饱和，或与内标含量差异巨大，导致其定量结果出现巨大偏差，影响了准确值的判定，进而影响水产品的残留合格判定。

为了准确定量恩诺沙星残留含量以及与法规残留限量的判定，恩诺沙星残留含量初测超过线性区间或者超过残留限量时，其往往需要进行复测，由于使用的是内标法定量，无法进行样品稀释重新测定。而对于超过线性区间的样品，复测过程中往往要采用增加内标使用量，在最终定容时再次进行等比例稀释后上机检测，或者通过减少取样量降低恩诺沙星待测液的上机测得含量。然而，通过减少取样量进行复测，将使得方法中样品的均一性以及前处理过程稳定性和结果的平行性受到严重影响，因此，通常会对结果带来相当大的不确定性。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂及检测方法，该方法在保证了定量结果的准确性的同时免去了重新进行样品前处理和上机检测的过程。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂，所述双内标试剂为恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5混合物，其中，所述恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5的质量比为1:(0.05-20)。

进一步地，所述恩诺沙星-D3是以环丙沙星和2,2,2-氘代溴乙烷为原料，以DMF为有机溶剂，以碘化钾和三乙胺为催化剂，在85℃条件下反应120min后制得。

本发明还提供一种水产品中恩诺沙星残留的检测方法，采用所述的双内标试剂对水产品中恩诺沙星残留进行检测。

进一步地，所述检测方法包括以下步骤：

1)在样品中加入恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5混合内标液，然后加入酸化乙腈，涡旋混合，超声提取，离心，取上清液过水相滤膜，得到待测溶液a；将待测溶液a稀释后得到的溶液，作为待测溶液b；

2)将待测溶液a和待测溶液b同时进行液相色谱-串联质谱仪测定。

进一步地，所述恩诺沙星-D3加入量为1-200ng/g，所述恩诺沙星-D5加入量为1-200ng/g，二者质量比介于1:(0.05-20)之间。

进一步地，所述酸化乙腈是由冰乙酸、乙腈和水以质量比1:84:15混合而成。

进一步地，进行液相色谱-串联质谱仪测定过程中，色谱分析条件为：C18反相色谱柱，柱温40℃，进样量2μL，流动相A为1％甲酸溶液(含2.0mmol/L醋酸铵)，流动相B为甲醇。

所述流动相洗脱梯度：0-1.1min，85％A，15％B；1.1-3.5min，梯度变化到70％A，30％B；3.5-4.5，保持70％A，30％B；4.5-6.4min，梯度变化到25％A，75％B；6.4-6.46min，梯度变化到5％A，95％B；6.46-8.20min，保持5％A，95％B；8.20-8.21min，梯度变化到85％A，15％B；8.21-9.5min，保持85％A，15％B；流速为0.8mL/min。

进一步地，进行液相色谱-串联质谱仪测定过程中，质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压：4500V，碰撞气(氮气)：Medium，加热温度：550℃，气帘气：42psi，加热气1：60psi，加热气2:55psi。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明以环丙沙星和2,2,2-氘代溴乙烷合成恩诺沙星-D3化合物，与恩诺沙星-D5合并使用作为内标，样品中加入不同浓度的恩诺沙星-D3和恩诺沙星-D5内标，只经过一步提取过程，或对样品进行直接稀释，获得两份样品定量溶液，与含有恩诺沙星-D3和恩诺沙星-D5的标准溶液曲线同时上机检测，根据样品中恩诺沙星的大致含量，选择合适的校正曲线，通过与两组不同内标浓度的标准溶液曲线进行定量，并且不需要再重新进样，直接对样品进行定量，同时保证了定量结果的准确性，免去了重新进行样品前处理和上机检测的过程。

本发明可以实现一次对恩诺沙星高残留含量的样品进行准确定量。在样品含量未知情况下，对高残留含量样品直接进行稀释确保内外标均在仪器的可适应线性范围，极大地提高了恩诺沙星检测效率。

不仅如此，本发明提出了一种简易快捷的恩诺沙星新内标恩诺沙星-D3同位素的快速合成方法，成功应用于水产品中恩诺沙星残留检测的双内标检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1恩诺沙星-D3电喷雾正离子化后质谱图；

图2为实施例1恩诺沙星-D3核磁共振氢谱谱图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

恩诺沙星结构式：

恩诺沙星-D5结构式：

恩诺沙星-D3结构式：

恩诺沙星-D3合成路线：

恩诺沙星简称En。

本发明所用动物样品均为人工养殖。

实施例1恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5的质量比为1:0.05。

1、试剂

酸化乙腈的制备：分别移取1mL冰乙酸、15mL水，均置于100mL量筒中，混匀后加入乙腈至100mL刻度。该溶液中含1％冰乙酸、84％乙腈和15％水。

2、仪器和设备

1)高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾(ESI)离子源

2)电子天平：感量0.01g和0.0001g

3)涡旋混合器

4)高速离心机

5)超声波清洗仪

3.样品测定

3.1标准工作液准备

恩诺沙星-D3：以环丙沙星和2,2,2-氘代溴乙烷为原料，以DMF为有机溶剂，以碘化钾、三乙胺为催化剂，在85℃条件下反应120min后制得。

以甲醇溶剂分别配制恩诺沙星标准溶液(50ppm)、氘代恩诺沙星-D5标准溶液(1ppm)，氘代恩诺沙星-D3标准溶液(20ppm)。

3.2样品提取

准确称取均质后的样品5.00g(精确到0.02g)于40mL具塞聚丙烯塑料离心管中，准确加入混合内标标准工作液(50ng En-D5，1000ng En-D3)，加入10mL酸化乙腈，涡旋混合10min，超声提取10min，4000r/min离心5min，取上清液于1mL过0.22μm水相滤膜，进小瓶，获得待测溶液1，同时取待测溶液150μL，加入950μL酸化乙腈，得到的溶液作为待测溶液2，两份溶液同时进行液相色谱-串联质谱仪测定。

3.3基质标准工作曲线制作

称取1份基质空白样品5.00g，不加内标，按3.2的方法操作，过水相滤膜获得空白基质液，用空白基质液10mL中加入混合内标标准工作液(50ng En-D5，1000ng En-D3)，以此内标溶液配制恩诺沙星浓度为1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL、729ng/mL、2187ng/mL、6561ng/mL，获得恩诺沙星标准校正溶液组1。

注：系列浓度标准曲线点配制可以采用梯度稀释方式进行。即：配制6561ng/mL含内标基质空白标准溶液1.5mL(其中含有50ng/mL(En-D5)，1000ng/mL(En-D3))，取400μL加入到800μL含内标空白基质提取液(酸化乙腈)，混匀后，即得2187ng/mL标准溶液点，其他低浓度依次类推。

同时，将以上校正溶液标准曲线组(27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL、729ng/mL、2187ng/mL、6561ng/mL)以酸化乙腈提取液进行稀释20倍(50μL，加入950μL提取液)后，其中含有2.5ng/mL的En-D5，50ng/mL的En-D3，获得恩诺沙星标准校正溶液组2，将两组溶液分别上机，分别绘制标准工作曲线。

3.4测定

3.4.1色谱条件：

色谱柱：C18色谱柱，Agilentporeshell 120EC-C18，4.6mm×100mm,2.7μm；或相当性能。

柱温：40℃

进样量：2μL

流动相：A为0.1％甲酸溶液(含2.0mmol/L醋酸铵)，B为甲醇；梯度洗脱程序见表1。

表1流动相梯度洗脱程序

时间(min)	A(％)	B(％)	流速(mL/min)
				0.0	85	15	0.8
1.1	85	15	0.8
				3.5	70	30	0.8
4.5	70	30	0.8
				6.4	25	75	0.8
6.46	5	95	0.8
				8.20	5	95	0.8
8.21	85	15	0.8
				9.5	85	15	0.8

3.4.2质谱条件：

离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式

扫描方式：选择反应监测(SRM)，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表2。

喷雾电压：4500V。

碰撞气(氮气)：Medium。

加热温度：550℃

气帘气：42psi。

加热气1：60psi。

加热气2:55psi。

表2选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

3.4.3定量测定

按上述分析条件，将基质标准工作曲线和样品制备液等体积进样测定，以恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5为内标试剂，内标法定量。

校正曲线组1绘制恩诺沙星标准校正曲线(以恩诺沙星-D5为内标)，曲线浓度点(1ng/mL、3ng/mL、9ng/mL、27ng/mL、81ng/mL、243ng/mL、729ng/mL)。

校正曲线组2绘制恩诺沙星标准校正曲线(以恩诺沙星-D3为内标)，曲线浓度点(27ng/mL、81ng/mL、324ng/mL、972ng/mL、2916ng/mL、6561ng/mL)。

恩诺沙星定量时，样品待测液1以校正曲线组1进行定量，样品待测液2以校正曲线组2进行定量。选取定量结果在合适线性区间的校正曲线组作为最终结果。

结果计算：

X＝C*V/m(1)

X：样品中目标分析物含量μg/kg

C：样品提取液测定分析物含量ng/mL

V：样品提取液体积，10mL

M：样品质量，5g

实施例2

同实施例1，区别在于，恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5的质量比为1:20。

具体为：以含内标基质空白溶液配制6561ng/mL溶液1.5mL(其中含有1000ng/mL(En-D5)，50ng/mL(En-D3))，取400μL加入到800μL含内标空白基质提取液，混匀后，即得2187ng/mL标准溶液点，其他低浓度依次类推。

同时，将以上校正溶液标准曲线组(27ng/mL,81ng/mL,243ng/mL,729ng/mL,2187ng/mL,6561ng/mL)以提取液进行稀释20倍(50μL,加入950μL提取液)后，其中含有50ng/mL的En-D5，2.5ng/mL的En-D3，获得校正溶液组2，将两组溶液分别上机，分别绘制标准工作曲线。

对比例1

参考农业部1077号公告-1-2008对恩诺沙星进行定量检测。

1、试剂

酸化乙腈：99mL乙腈中加入1mL甲酸；

以甲醇溶剂分别配制恩诺沙星标准溶液(1ppm)、氘代恩诺沙星-D5标准溶液(1ppm)；

20％甲醇溶液：取甲醇20mL用水稀释至100mL。

2、仪器和设备

1)高效液相色谱-串联质谱联用仪：配有电喷雾(ESI)离子源

2)电子天平：感量0.01g和0.0001g

3)涡旋混合器

4)高速离心机

5)超声波清洗仪

3.样品测定

3.1标准工作液准备

以甲醇溶剂分别配制恩诺沙星标准溶液(50ppm)、氘代恩诺沙星-D5标准溶液(1ppm)

3.2样品提取

准确称取均质后的样品5.00g(精确到0.02g)于25mL具塞聚丙烯塑料离心管中，准确加入50μL氘代恩诺沙星-D5标准溶液，加入15mL酸化乙腈，涡旋混合1min，超声提取10min，4000r/min离心5min，取上清液于50mL梨形瓶中。残渣中加入15mL酸化乙腈，重复提取一次，合并两次提取液，于40℃水浴旋转蒸发至近干，吹干(或向梨形瓶中加入1mL乙腈溶解底部残留物后，转移至玻璃离心管中，氮吹至干)。向梨形瓶中(或玻璃离心管中)加入1.0mL20％甲醇溶液，涡旋溶解残留物，再加入2.0mL正己烷涡旋混合30s，转入10mL具塞离心管中，4000r/min离心5min，弃上层液，取下层溶液过0.2μm有机相滤膜，待液相色谱-串联质谱仪测定。

3.3标准工作曲线制作

用20％甲醇溶液稀释配制氘代恩诺沙星-D5标准溶液至50ng/mL.准确量取适量恩诺沙星标准溶液50ng/mL,以此内标溶液作为溶剂，配制恩诺沙星标准溶液(1ng/mL,2ng/mL,4ng/mL,8ng/mL,16ng/mL,32ng/mL,64ng/mL,128ng/mL)。

注：系列浓度标准曲线点配制可以采用梯度稀释方式进行。即：以含氘代恩诺沙星-D5甲醇溶液(50ng/mL)配制128ng/mL溶液1.5mL(其中含有50ng/mL(En-D5)，取500μL加入到500μL含氘代恩诺沙星-D5甲醇溶液(50ng/mL)，混匀后，即得64ng/mL标准溶液点，其他低浓度依次类推。按前述前处理方法操作并上机，绘制标准工作曲线。

3.4测定

3.4.1色谱条件：

色谱柱：C18色谱柱，MGII，100mm×2.0mm，5μm

柱温：40℃

进样量：2μL

流动相：A为0.1％甲酸溶液(含2.0mmol/L醋酸铵)，B为甲醇；梯度洗脱程序见表3。

表3流动相梯度洗脱程序

3.4.2质谱条件：

离子化模式：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式

扫描方式：选择反应监测(SRM)，选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量见表4。

喷雾电压：3700V

碰撞气(氩气)压力：1.5mTorr

鞘气：35psi

辅气：10psi

电子传输毛细管温度：350℃

表4选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

定量测定

按上述分析条件，将标准工作曲线和样品制备液等体积进样测定，以恩诺沙星-D5为内标试剂，内标法定量。

校正曲线绘制恩诺沙星标准校正曲线，曲线浓度点(1ng/mL,2ng/mL,4ng/mL,8ng/mL,16ng/mL,32ng/mL,64ng/mL,128ng/mL)。

结果计算：

X＝C*V*f/m(1)

X：样品中目标分析物含量μg/kg

C：样品提取液测定分析物含量ng/mL

V：样品提取液体积，1mL

M：样品质量，5g

F:样品稀释倍数，根据实际样品稀释倍数进行计算。

试验例

以武昌鱼、牛蛙和鲤鱼为待测样品，分别采用实施例1、实施例2和对比例的检测方法，对样品进行检测，结果如表5-10所示。实施例1结果

表5恩诺沙星-D5为内标校正曲线结果

表6恩诺沙星-D3为内标校正曲线结果

表7武昌鱼、牛蛙和鲤鱼样品测定结果

实施例2结果

表8武昌鱼、牛蛙和鲤鱼样品测定结果

对比例1结果

表9以恩诺沙星-D5单内标进行定量曲线

表10武昌鱼、牛蛙和鲤鱼样品测定结果

由具体实施例1和具体实施例2以及对比例结果可以看出：

1、由于使用双内标的含量与校正曲线的浓度点的相对比值不同，其在不同曲线点上的校正计算浓度结果的偏差程度显现出不同的趋势。在恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5比值为1:0.05的比例下，以恩诺沙星-D5为内标进行的制作的标准曲线在低浓度点的偏差情况均低于7％，在高浓度点(STD7，DTD8，STD9)的偏差则高于10％；而当采用恩诺沙星-D3为内标制备标准曲线对高浓度点的偏差均低于3％，在低浓度点(STD1，DTD2)的偏差则高于10％，分别为111％和32％，对于定量结果将产生巨大偏差。由此可推断，在不同的浓度区间，采用不同的定量曲线对样品进行定量，是保证结果准确的基础。

2、对于使用双内标检测方法(采用恩诺沙星-D3：恩诺沙星-D5＝1：0.05或1：20)时，无论采用恩诺沙星D5还是恩诺沙星D3为内标检测，对于三种阳性样品的检测的结果值的相对偏差均不超过15％，批内结果稳定性均小于5％，显示二者检测结果的良好的可对比性以及高稳定性。加标回收实验结果显示其回收率符合70％-110％的范围要求。

3、然而，从3个阳性样品的检测结果只可以看出，阳性样品的值分别在50μg/kg(武昌鱼)、300μg/kg(鲤鱼)和2000μg/kg(牛蛙)左右的检测值左右。对于使用的两种内标进行定量的合适区间不同。对于检出值在50μg/kg(武昌鱼)、300μg/kg(鲤鱼)左右的样品，其适应区间为添加量低的内标定量曲线区间，而对于300μg/kg(鲤鱼)和2000μg/kg(牛蛙)样品，其适应区间为添加量高的内标定量曲线区间。对于中间测定值的样品，其检出值可采用两种曲线中的任一值，二者的值并不会产生过大的差别。而无论采用哪种曲线定量，在不知道阳性样品具体检出值的情况下，双内标检测曲线很好地适应了不同浓度的检出情况，达到了对大批次样品仅采取一次简便的稀释操作，实现对残留值差异巨大的大量样品单批次前处理操作后，同时检测分析的目的，并对残留量在中间值的样品具有采用两种曲线相互印证，准确定性的目的。

4、对比农业部1077号公告-1-2008改进方法对3个样品的检测结果可以看出，其规定线性区间较窄，诚然根据仪器性能，可将曲线高点延伸至256ng/mL，甚至到512ngmL，但对另外2个高值样品(牛蛙和武昌鱼)的检测结果均不能一次检出。对于鲤鱼样品，其检出值在曲线线性范围区间内，而对于牛蛙和武昌鱼样品，其初始检测值均超过了线性区间。需要对样品进行重新测定，重新进行前处理，并通过增加内标的使用量进行相应的稀释，使得样品内标浓度与曲线保持一致，并使得外标检出浓度落在线性区间范围内。同时，由于各高残留样品值之间的差异巨大，并不能采用单一的稀释系数，增加了复测的过程的同时，使得不同样品分别需要单独处理，最终得出稳定的在线性区间的可靠检出数值。

综合以上具体实施例1、具体实施例2和对比例1对3个阳性样品的实际检测情况可以得出，对恩诺沙星在水产品残留检测中应用时：

1、恩诺沙星-D3可作为恩诺沙星-D5的内标的替代化合物，通过高效液相色谱串联质谱法对恩诺沙星的残留进行分析。当以恩诺沙星-D5进行恩诺沙星检测过程中，出现内标干扰信号时，可以选择恩诺沙星-D3作为替代内标。

2、以双内标方法对恩诺沙星在水产品中残留进行液相色谱串联质谱检测时，可有效的拓宽线性检测范围，通过选择不同的内标进行定量的曲线，可以获得可靠的定量结果。

3、以双内标方法对恩诺沙星在水产品中残留进行液相色谱串联质谱检测时，对阳性样品中的残留值以双内标都可以进行定量时，二者得出的结果具有高度的一致性，增加了检测结果的可靠性。

4、以双内标方法对恩诺沙星在水产品中残留进行液相色谱串联质谱检测时，当一批次的样品中阳性样品残留值差异巨大时，可以进行单次检测，直接进行定量。而不需要像单内标定量时，频繁出现超过线性定量范围，需要再次通过增加内标加入量和检测液的稀释倍数，实现对高残留样品的定量检测。

5、以双内标方法对恩诺沙星在水产品中残留进行液相色谱串联质谱检测时，可以通过调整恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5的绝对量和相对比值，灵活调整检测曲线的线性区间，并最大限度适应同批次巨大样品残留值样品的同时检测。

6、以双内标方法对恩诺沙星在水产品中残留进行液相色谱串联质谱检测时，拓宽了线性定量范围，可得出2个基于不同内标制作校正曲线定量的结果，结果具有高度一致性，提高检测结果的可信度。对于阳性样品，降低了检测结果的误差，避免了因超过线性区间而必须重新进行检测的繁琐操作过程，节省了检测时间、降低了检测成本，提高了检测效率。

恩诺沙星作为水产品批准使用的药物，其水产品中的残留率很高，且由于用药不规范，其残留超过国家规定限量的概率也很高。其残留含量呈现变化范围大，经常超过仪器线性响应区间等问题，极大地增加了恩诺沙星在水产品中残留检测工作的复杂程度。采用内标法进行定量过程中，由于部分样品中恩诺沙星与内标含量的差异较大，影响了结果的稳定性和准确性，虽然采用稀释检测溶液使得恩诺沙星达到仪器线性响应区间，但是，内标同时被稀释，也落在了线性响应区间范围外。因此，时常会出现内外标含量差异较大，且不能同时在仪器线性响应区间的问题。同时，对于高残留含量的样品进行复测，减少取样量将影响结果的稳定性，原溶液稀释并不可行，原则上需要根据初测的数值相应增加内标的加入量，对最终待测液进行比例稀释至仪器线性响应区间。

本发明可以实现一次对恩诺沙星高残留含量的样品进行准确定量。在样品含量未知情况下，对高残留含量样品直接进行稀释确保内外标均在仪器的可适应线性范围，极大地提高了恩诺沙星检测效率。不仅如此，本发明提出了一种简易快捷的恩诺沙星新内标恩诺沙星-D3同位素的快速合成方法，成功应用于水产品中恩诺沙星残留检测的双内标检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂，其特征在于，所述双内标试剂为恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5混合物，其中，所述恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5的质量比为1:(0.05-20)。

2.根据权利要求1所述的用于水产品中恩诺沙星残留测定的双内标试剂，其特征在于，所述恩诺沙星-D3是以环丙沙星和2,2,2-氘代溴乙烷为原料，以DMF为有机溶剂，以碘化钾和三乙胺为催化剂，在85℃条件下反应120min后制得。

3.一种水产品中恩诺沙星残留的检测方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的双内标试剂对水产品中恩诺沙星残留进行检测。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：

1)在样品中加入恩诺沙星-D3与恩诺沙星-D5混合内标液，然后加入酸化乙腈，涡旋混合，超声提取，离心，取上清液过水相滤膜，得到待测溶液a；将待测溶液a稀释后得到的溶液，作为待测溶液b；

2)将待测溶液a和待测溶液b同时进行液相色谱-串联质谱仪测定。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述恩诺沙星-D3加入量为1-200ng/g，所述恩诺沙星-D5加入量为1-200ng/g，二者质量比介于1:(0.05-20)之间。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述酸化乙腈是由冰乙酸、乙腈和水以质量比1:84:15混合而成。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，进行液相色谱-串联质谱仪测定过程中，色谱分析条件为：C18反相色谱柱，柱温40℃，进样量2μL，流动相A为0.1％甲酸溶液，流动相B为甲醇。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述流动相洗脱梯度：0-1.1min，85％A，15％B；1.1-3.5min，梯度变化到70％A，30％B；3.5-4.5，保持70％A，30％B；4.5-6.4min，梯度变化到25％A，75％B；6.4-6.46min，梯度变化到5％A，95％B；6.46-8.20min，保持5％A，95％B；8.20-8.21min，梯度变化到85％A，15％B；8.21-9.5min，保持85％A，15％B；流速为0.8mL/min。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，进行液相色谱-串联质谱仪测定过程中，质谱分析条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式，喷雾电压：4500V，碰撞气(氮气)：Medium，加热温度：550℃，气帘气：42psi，加热气1：60psi，加热气2:55psi。

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