CN110749684A - 一种酵素中有机酸的快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酵素中有机酸的快速检测方法，包括如下步骤：(1)配置标准品有机酸甲酯混合物；(2)酵素中有机酸的提取；(3)配置待测有机酸甲酯混合物；(4)采用气相色谱‑质谱测定：取标准品有机酸甲酯混合物、待测有机酸甲酯混合物进样分析，采用外标法计算各检出有机酸的相对百分含量。本发明通过优化酵素中有机酸的提取和甲酯化衍生方法，通过离心分离出酵素中的可溶性杂质沉淀，采用硫酸‑甲醇溶液甲酯化得到有机酸甲酯混合物，进而通过GC‑MS联用法，分析酵素中有机酸的含量，快速简便，微量分析，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种利用气相色谱质谱联用仪用技术分析酵素中有机酸的成分及其含量的方法。
背景技术
酵素是以新鲜的蔬菜、水果、糙米、药食同源中药等植物为原料，经过榨汁或萃取一系列工艺后，再添加酵母菌、乳酸菌等发酵菌株进行发酵所产生的含有丰富的糖类、有机酸、矿物质、维生素、酚类、萜类等营养成分以及一些重要的酶类等生物活性物质的混合发酵液。
酵素的发展主要是由于酵素中各种短链脂肪酸的存在，短链脂肪酸被后肠迅速吸收后，既储存了能量又降低了渗透压，并且短链脂肪酸对于维持大肠的正常功能和结肠上皮细胞的形态和功能具有重要作用。短链脂肪酸还可促进钠的吸收，丁酸在这方面的作用比乙酸和丙酸更强并且丁酸可增加乳酸杆菌的产量而减少大肠杆菌的数量。
气相色谱法(GC)虽然在很多食品成分分析方面得到应用，但当酵素中有机酸组成复杂时，会增加样品的定性难度。与GC相比，GC-MS(气质联用法)测定有机酸近十年得到了应用，该方法灵敏度高，分析快速，精确度高适合于同时测定多组分有机酸甲酯待测样品。使用GC或GC-MS分析有机酸中羧酸类成分时，由于羧酸的极性强，容易和色谱柱相吸附，导致实验结果不准确。此外，有机酸中的长链有机酸的沸点高、高温条件时挥发性差、影响有机酸分离效果，当GC分析时温度过高会损伤色谱柱，所以，为避免上述干扰影响测定结果，并延长色谱柱寿命，一般需先将有机酸提取，再经甲酯化等前处理，目前现有甲酯化方法普遍是常温甲酯化，费时较长需要24h，本方法使用水浴加热甲酯化处理，仅需要1-2h十分快捷，得到该有机酸对应的有机酸甲酯，而后上机分析，并通过换算计算有机酸的含量。而目前还没有关于酵素中有机酸的检测方法。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，在于提供一种酵素中有机酸的快速检测方法，能够在样品量较少的情况下，快速准确的检测出酵素中有机酸的含量。
本发明的具体技术方案如下：
一种酵素中有机酸的快速检测方法，包括如下步骤：
(1)配置标准品有机酸甲酯混合物；
(2)酵素中有机酸的提取：取酵素样品于离心管中离心，分离其中杂质，得到含有有机酸的酵素上清液；
(3)取步骤(2)中得到的酵素上清液于离心管中，加入硫酸-甲醇溶液，水浴加热，再加入二氯甲烷，饱和NaCl，混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物；
(4)采用气相色谱-质谱测定：取步骤(1)中标准品有机酸甲酯混合物、步骤(3)中得到的待测有机酸甲酯混合物进样分析，采用外标法计算各检出有机酸的相对百分含量。
优选的，配置标准品有机酸甲酯混合物包括如下步骤：取各有机酸标准液于离心管中，加入硫酸-甲醇溶液，水浴加热，再加入二氯甲烷，饱和NaCl，混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得标准品有机酸甲酯混合物。
优选的，步骤(2)中，离心管置于10000～14000r/min离心机中离心3～4分钟。
优选的，步骤(2)中，取1.5mL酵素样品于1.5mL离心管中离心。
优选的，步骤(3)中，水浴加热的加热温度为55～65℃，加热时间为1.5～2.5h。
优选的，步骤(3)中，硫酸-甲醇溶液的体积比为13％，所使用的滤头孔径为0.45um。
优选的，步骤(3)中，取步骤(1)中得到的酵素上清液1mL于50mL离心管中，加入硫酸-甲醇溶液10mL，水浴加热，再加入二氯甲烷5mL，饱和NaCl5ml，震荡混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物。
优选的，步骤(4)中，气相色谱-质谱条件为：进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10:1，吹扫流量3.0ml/min；气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气；质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan。
本发明酵素中有机酸甲酯化时，酯化是否完全、反应速率、对最终的分析结果至关重要；本发明采用硫酸-甲醇溶液甲酯化得到有机酸甲酯混合物，降低了脂肪酸的沸点，甲酯化产物易于挥发，便于GC-MS进一步分析，提高了分离效果。
本发明通过优化酵素中有机酸的提取和甲酯化衍生方法，通过离心分离出酵素中的可溶性杂质沉淀，采用硫酸-甲醇溶液甲酯化得到有机酸甲酯混合物，进而通过GC-MS联用法，分析酵素中有机酸的含量，快速简便，灵敏度高。
附图说明
图1为酵素中有丁二酸二甲酯、柠檬酸三甲酯检出图；
图2为酵素中乳酸甲酯、丁二酸二甲酯检出图；
图3为酵素中柠檬酸三甲酯检出图；
图4为标准品混合进样中丁酸甲酯、乳酸甲酯、丁二酸二甲酯、柠檬酸三甲酯检出图；
图5为现有有机酸检测方法中乳酸甲酯、乙酰丙酸甲酯等物质的检出图。
具体实施方式
以下结合附图进一步说明本发明，本发明未提及部分均为现有技术。
本发明使用的色谱柱型号：DB-5(30m*0.25mm*0.25um)，柱流量1ml/min，恒流。
13％硫酸-甲醇溶液制备：冰水浴冷却和搅拌条件下，将13ml浓硫酸缓慢加入100ml无水甲醇中，摇匀备用。
饱和NaCl溶液制备：称取40gNaCl，加入100ml超纯水。
配制标准液(1000ppm)：精确称量有机酸标准品于0.05g，50ml容量瓶，超纯水定容至刻度。
实施例1
一种酵素中有机酸的快速检测方法，包括如下步骤：
(1)配置标准品有机酸甲酯混合物：琥珀酸标准液、柠檬酸标准液各取0.5ml混合于50ml离心管中，加入10ml13％硫酸-甲醇溶液，混匀60℃水浴锅中水浴加热2h，加入5ml二氯甲烷，5ml饱和NaCl，旋涡混匀；待溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，045um滤头过滤，得标准品丁二酸二甲酯、柠檬酸三甲酯混合物。
(2)酵素中有机酸的提取：取酵素样品1.5mL于1.5mL离心管中，置于10000r/min离心机中离心4分钟，分离其中杂质，得到含有有机酸的酵素上清液。
(3)取步骤(2)中得到的酵素上清液1mL加入50mL离心管中，先加入13％硫酸-甲醇溶液10mL，置于60℃水浴锅中水浴加热2h，再加入二氯甲烷5mL，饱和NaCl5ml，置于振荡器上震荡混匀，静置至溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，使用0.45um滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物。
(4)采用气相色谱-质谱测定：取步骤(1)中得到的标准品丁二酸二甲酯、柠檬酸三甲酯混合物及步骤(3)中得到的待测有机酸甲酯混合物进样分析，进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10：1，吹扫流量3.0ml/min，气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气。质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan；采用外标法计算各检出有机酸的含量；酵素中有丁二酸二甲酯含量为：28.01ug/ml、柠檬酸三甲酯含量为：6052.06ug/ml检出图参见图1。
实施例2
一种酵素中有机酸的快速检测方法，包括如下步骤：
(1)配置标准品有机酸甲酯混合物：乳酸标准液、柠檬酸标准液各取0.5ml混合于50ml离心管中，加入10ml 13％硫酸-甲醇溶液，混匀60℃水浴锅中水浴加热2h，加入5ml二氯甲烷，5ml饱和NaCl，旋涡混匀；待溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，045um滤头过滤，得标准品乳酸甲酯、丁二酸二甲酯混合物。
(2)酵素中有机酸的提取：取酵素样品1.5mL于1.5mL离心管中，置于12000r/min离心机中离心3分钟，分离其中杂质，得到含有有机酸的酵素上清液。
(3)取步骤(2)中得到的酵素上清液1mL加入50mL离心管中，先加入13％硫酸-甲醇溶液10mL，置于60℃水浴锅中水浴加热2h，再加入二氯甲烷5mL，饱和NaCl5ml，置于振荡器上震荡混匀，静置至溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，使用0.45um滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物。
(4)采用气相色谱质谱测定：取步骤(1)中得到的标准品乳酸甲酯、丁二酸二甲酯混合物及步骤(3)中得到的待测有机酸甲酯混合物进样分析，进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10：1，吹扫流量3.0ml/min，气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气。质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan；
采用外标法计算各检出有机酸的含量；酵素中乳酸甲酯含量为：4934.26ug/ml、丁二酸二甲酯：334.34ug/ml检出图参见图2。
实施例3
一种酵素中有机酸的快速检测方法，包括如下步骤：
(1)配置标准品有机酸甲酯混合物：取柠檬酸标准液0.5ml混合于50ml离心管中，加入10ml 13％硫酸-甲醇溶液，混匀60℃水浴锅中水浴加热2h，加入5ml二氯甲烷，5ml饱和NaCl，旋涡混匀；待溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，045um滤头过滤，得标准品柠檬酸三甲酯。
(2)酵素中有机酸的提取：取酵素样品1.5mL于1.5mL离心管中，置于14000r/min离心机中离心三分钟，分离其中杂质，得到含有有机酸的酵素上清液。
(3)取步骤(2)中得到的酵素上清液1mL加入50mL离心管中，先加入13％硫酸-甲醇溶液10mL，置于65℃水浴锅中水浴1.5h，再加入二氯甲烷5mL，饱和NaCl5ml，置于振荡器上震荡混匀。静置至溶液分层，吸取二氯甲烷有机相，使用0.45um滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物。
(4)采用气相色谱-质谱测定：取步骤(1)中得到的标准品柠檬酸三甲酯及步骤(3)中得到的待测有机酸甲酯混合物进样分析，进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10：1，吹扫流量3.0ml/min，气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气。质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan；采用外标法计算各检出有机酸的含量；酵素中柠檬酸三甲酯含量为：42934.38ug/ml检出图参见图3。
对比例1
一种有机酸检测方法，包括如下步骤：
(1)样品甲酯化：准确吸取样品100ml，浓缩至25ml左右后，置于150ml碘量瓶中，加入50ml 12.5％硫酸甲醇溶液，混匀后置入30℃调速柜(150r/min)中恒温震荡24h。
(2)萃取：将上述脂化后的样液进行离心分离(3000r/min，5min)，倾出上层清液于150ml分液漏斗中，残渣分两次洗涤并过滤，滤液与上层清液合并，用二氯甲烷萃取三次，合并萃取液，用饱和氯化钠溶液洗涤两次，再用无水硫酸钠脱水，静置过夜，然后滤除硫酸钠，滤液浓缩至25ml，进行GC-MS分析。
(3)采用气相色谱-质谱测定：色谱条件：进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10：1，吹扫流量3.0ml/min，气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气。质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度210℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan；将采集到的质谱图用Nist谱库检索。然后用峰面积归一法计算相对百分比含量。检出图参见图5。
Claims (8)
1.一种酵素中有机酸的快速检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)配置标准品有机酸甲酯混合物；
(2)酵素中有机酸的提取：取酵素样品于离心管中离心，分离其中杂质，得到含有有机酸的酵素上清液；
(3)取步骤(2)中得到的酵素上清液于离心管中，加入硫酸-甲醇溶液，水浴加热，再加入二氯甲烷，饱和NaCl，混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物；
(4)采用气相色谱-质谱测定：取步骤(1)中标准品有机酸甲酯混合物、步骤(3)中得到的待测有机酸甲酯混合物进样分析，采用外标法计算各检出有机酸的相对百分含量。
2.根据权利要求1所述的快速检测方法，其特征在于，配置标准品有机酸甲酯混合物包括如下步骤：取各有机酸标准液于离心管中，加入硫酸-甲醇溶液，水浴加热，再加入二氯甲烷，饱和NaCl，混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得标准品有机酸甲酯混合物。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于步骤(2)中，离心管置于10000～14000r/min离心机中离心3～4分钟。
4.根据权利要求3所述的快速检测方法，其特征在于步骤(2)中，取1.5mL酵素样品于1.5mL离心管中离心。
5.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于步骤(3)中，水浴加热的加热温度为55～65℃，加热时间为1.5～2.5h。
6.根据权利要求5所述的快速检测方法，其特征在于步骤(3)中，硫酸-甲醇溶液的体积比为13％，所使用的滤头孔径为0.45um。
7.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于步骤(3)中，取步骤(1)中得到的酵素上清液1mL于50mL离心管中，加入硫酸-甲醇溶液10mL，水浴加热，再加入二氯甲烷5mL，饱和NaCl5ml，震荡混匀、静置分层，吸取二氯甲烷有机相，使用滤头进行过滤，得待测有机酸甲酯混合物。
8.根据权利要求1或2所述的快速检测方法，其特征在于步骤(4)中，气相色谱-质谱条件为：进样口温度为260℃，离子源为250℃，气质接口为280℃，进样量1.0uL，分流比10:1，吹扫流量3.0ml/min；气相色谱柱温箱升温程序为：40℃保持5min，然后以10℃/min升温至280℃保持5min，载气为99.999％高纯度氦气；质谱条件：离子源EI源，电子能量70eV，接口温度250℃，离子源温度230℃，四级杆温度280℃，进样口温度250℃，质量扫描范围m/z30-450，采集方式Scan。
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| CN112924589A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-08 | 河南神马尼龙化工有限责任公司 | 测定精己二酸中微量己酸、丁二酸、戊二酸含量的方法 |
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