CN113358791A - 一种生物样品中前列腺素类物质的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物样品中前列腺素类物质的检测方法，先通过化学衍生化方法将生物样品中前列腺素类待测物等量转化成胺甲基芳磺酸衍生物，再通过液相色谱‑质谱联机检测，检测时以芳磺酸衍生物负离子[M‑H]^‑作为前体离子。[M‑H]^‑具有比未衍生的前列腺素更高的质谱响应，更短的反向色谱保留时间，同时质谱气相碰撞裂解时[M‑H]^‑还可提高特异性的产物离子[M‑H₂O‑C_15Residue]^‑的裂解转化效率。与目前质谱多反应监测所选用的离子对相比，利用这一高特异性的离子对前列腺素类物质进行定量，其信号强度可提高2倍。本检测方法可简化样品处理步骤、减少生物样品用量、或在保证信噪比的基础上放宽对仪器的要求，满足科研和生产活动中精准分析生物样品中系列前列腺素类物质的需求。

Description

一种生物样品中前列腺素类物质的检测方法

技术领域

本发明属于药物分析研究技术领域，涉及定量分析生物样品中系列前列腺素类物质的方法。

背景技术

前列腺素(Prostaglandin)是一类生物体内由花生四烯酸经酶促代谢产生的、具有生理活性的、含20个碳原子的不饱和脂肪酸。如图1所示，系列前列腺素具有脂肪五元环、两个侧链(A链7个碳原子，首端是羧基；B链8个碳原子，含一个烯丙醇残基)等共有结构。

前列腺素在合成后即被释放到胞外，每种前列腺素都有各自特定的受体，前列腺素与其特异性受体结合后可介导细胞增殖、分化、凋亡、血小板聚集等，并参与炎症以及一些疾病的病理过程。因其具有高生物活性，临床使用的前列腺素类药物剂量通常很低，但体内存在着数十倍于药物达峰浓度的内源性脂肪酸类干扰物质。于此同时，前列腺素作为“局部荷尔蒙”(local hormones)的一个典型代表，极易被分解、代谢，体内半衰期很短。前列腺素类药物口服通常无效，即便原料药的储运条件也十分苛刻。

前列腺素类药物的这一理化性质为体内/外药物分析工作带来了极大的困扰。目前文献报道的生物样品中前列腺素类分析方法包括放射标记法、酶联免疫法、色谱-质谱法。其中基于多反应监测(MRM)的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是体内药物分析的首选。MRM的原理是通过四极杆选择性地将待测物的分子离子作为前体离子送至碰撞池，在碰撞池内前体离子通过碰撞诱导裂解产生出不同质荷比的碎片离子，再从中选取特异性好的碎片离子进行定量。当色谱未能实现分离时，利用前体离子与特征性碎片离子组成的离子对进行筛选，可从质荷比(m/z)差异出发，排除背景干扰。理想情况下，所选择的特征性碎片离子只源自被测物，且是被测物信号离子中响应最高的。

但在分析真实生物样品中前列腺素类药物时会发现，内源性的干扰物不但具有与药物相同的液相保留行为、质荷比，有时甚至展现出与药物类似的气相裂解规律，即相同的特征性碎片离子(Rapid Commun.Mass Spectrom.2006,20,3023–3029.)。常见的例子是选取中性质量丢失(neutral loss)水分子，俗称“脱水峰”，作为特征性碎片离子。例如PGD₁、PGE₁就选择了[PGE₁-H-2H₂O]^-和[PGD₁-H-2H₂O]^-作为特征性碎片离子(m/z 353→317Da)，而在实际工作中会发现，生物样本中的内源性干扰物的“脱水峰”强度完全不亚于待测物。再例如PGF_1α选择中性质量丢失二氧化碳分子[PGF_1α-H-CO₂]^-作为特征性碎片离子(m/z 355→311Da)，即俗称的“脱羧峰”，但内源性脂肪酸类干扰物同样可以裂解脱羧。这种现象发生说明所选的特征性碎片离子特异性不足，即特征性碎片离子无法凭借自身特异性“代表且仅代表”待测物；但有时却又是不得已而为之，即特异性强的特征性碎片离子信号强度太低。

选择特征离子时往往需要在“特异性”与“信号强度”二者之间进行平衡。例如PGD₂和PGE₂定量时就选择了信号强度相对较弱，但特异性较好的子离子进行定量，即中性质量丢失两个水分子和一个二氧化碳分子(m/z 351→271Da)。PGE₁的类似物利马前列素(Limaprost)同样选取这类离子对(m/z 379→299Da)用以定量。

通过总结现有技术可以发现，系列的前列腺素(包括类似物利马前列素)之间存在着一个共有的质谱裂解规律，即裂解时都会产生一个强度相对较弱但特异性极高的碎片离子，即中性质量丢失一个水分子并伴随着B链烯丙醇残基部分C₁₄-C₁₅之间碳碳单键断裂。这个碎片离子虽然特异性出众，可有效排除内源干扰，但遗憾的是这个裂解反应的效率极低。仍以利马前列素为例，其给药剂量为5μg，达峰浓度(C_max)仅为2.56pg/mL，若要选取这类离子对(m/z 379→233Da)进行定量，样品处理过程除所需生物样品量较大，仍需多步固相萃取富集，并与差分离子淌度、连续可变窗口采集等一系列技术联合使用方能满足要求。这种对操作及设备的苛刻要求使许多实验室暂时难以开展相关研究工作。

发明内容

本发明的目的在于克服以上技术缺陷，提供一种检测生物样品中的前列腺素类物质的高选择性的分析方法，以便简化样品处理步骤、减少生物样品用量或在保证信噪比的基础上放宽对仪器的要求，满足科研和生产活动中精准分析生物样品中系列前列腺素类物质的需求。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明公开了一种生物样品中前列腺素类物质的检测方法，先通过化学衍生化方法将生物样品中前列腺素类待测物等量转化成胺甲基芳磺酸衍生物，再通过液相色谱-质谱联机检测，检测时选择芳磺酸衍生物负离子[M-H]^-作为前体离子。通过化学反应将前列腺素类物质完全转化成相应的芳磺酸衍生物(M)以提高LC-MS/MS分析的选择性、可有效排除内源干扰。检测时选择芳磺酸衍生物负离子[M-H]^-和其高特异性碎片离子[M-H₂O-C_15Residue]^-或者选择芳磺酸衍生物负离子[M-H]^-和报告离子作为定量离子对进行定量；所述M指芳磺酸衍生物；所述C_15Residue指系列前列腺素C₁₄-C₁₅之间碳碳单键断裂后C₁₅一侧残基；所述报告离子指前列腺素芳磺酸衍生物裂解时产生的芳磺酸碎片离子。

进一步的，胺甲基芳磺酸衍生化试剂通式为H₂N-CH₂-Ar-SO₃H，其中Ar为苯环或稠环芳烃；所述稠环芳烃包括芴、苊、萘、蒽、荧蒽、苯并蒽、菲、芘、苯并芘。

进一步的，胺甲基芳磺酸衍生化试剂为4-(胺甲基)苯磺酸或5-(胺甲基)萘-2-磺酸。

进一步的，对于4-(胺甲基)苯磺酸衍生的前列腺素类物质选择报告离子[C₇H₆NO₃S]^-或[C₇H₆O₃S]^·-进行定量；对于5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生的前列腺素类物质选择报告离子[C₁₁H₈NO₃S]^-或[C₁₁H₈O₃S]^·-进行定量。

首先，由于磺酸比羧酸更易解离(或更难质子化)且极性较大，这使得衍生物具有更高的质谱响应和更短的液相色谱反向色谱柱保留时间；其次，相对未衍生的前列腺素而言，衍生后的前列腺素展现出了更高的共有特异性子离子[M-H₂O-C_15Residue]^-裂解转化效率，本发明通过C₁₅,C₁₇(Me)-四氘代利马前列素和C₃,C₄-四氘代PGE₁及其衍生物的子离子分析对此特异性子离子的结构推测进行了确证；再次，芳磺酸基团裂解后还可以作为报告离子用于定量，其中所述报告离子指衍生化试剂在裂解过程中产生的芳磺酸碎片离子，一般为亚氨甲基芳磺酸负离子[HN＝CH-Ar-SO₃]^-或其自由基负离子[·CH₂-Ar-SO₃]^·-；此外，衍生化反应本身相当于在色谱分离、质荷比区分、气相裂解规律区分的基础上增加了化学反应性区分，可籍此排除部分内源性物质干扰。

该方法包含以下步骤：A、待测生物样品处理；B、衍生化处理；C、标准曲线制备；D、生物样品中含量测定。其中，衍生化条件优选典型多肽偶联反应条件，衍生化位点即前列腺素C₁位的羧酸，有机碱优选N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)，偶联试剂优选HATU(Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium)或HBTU(Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium)，溶剂优选乙腈水混合液，室温下反应。

其中，衍生化试剂优选含胺甲基的芳磺酸类物质，一方面因为磺酸类物质具有极强的质谱负谱响应，而负谱模式下干扰物信号明显少于正谱模式；另一方面胺甲基中的伯胺反应活性显著高于苯胺的胺基(如对氨基苯磺酸或5-氨基-1-萘磺酸)，衍生化效率可达100％；而更重要的一方面是前列腺素的芳磺酸类衍生物的C₁₄-C₁₅裂解特异性子离子[M-H₂O-C_15Residue]^-强度要高于未衍生的前列腺素以及前列腺素脂肪类磺酸(如牛磺酸)、无机磺酸(如羟胺-O-磺酸)和芳羧酸(如4-(胺甲基)苯甲酸)的衍生物。经过筛选比较，胺甲基芳磺酸优选4-(胺甲基)苯磺酸和5-(胺甲基)萘-2-磺酸。

进一步的，步骤D典型的色谱条件为：高效液相色谱；反向色谱柱；乙腈/水流动相；梯度洗脱。步骤D典型的质谱条件为：多重四极杆型串联质谱仪，ESI离子化源；负离子检测模式，提取反应离子对[M-H]^-→[M-H₂O-C_15Residue]^-或[HN＝CH-Ar-SO₃]^-、[·CH₂-Ar-SO₃]^·-等报告离子。

所述的生物样品为血浆、组织液、尿液。所述前列腺素类物质不仅包含系列前列腺素如PGE₁、PGE₂、PGD₂、PGI₂等，也包含前列腺素类似物如利马前列素、贝前列素等。

如图2所示，5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生后PGE₁的质谱信号比未衍生的PGE₁信号要高13倍；提取离子对[M-H]^-→[M-H₂O-C_15Residue]^-信号与目前三重四极杆质谱MRM所选用的提取离子对[PGE₁-H]^-→[PGE₁-2H₂O-CO₂]^-信号强度相当，但选择性则高于后者；并且与未衍生的PGE₁同类裂解反应的提取离子信号相比，萘磺酸衍生物信号强度要高1.5倍。而这仅是以定性见长的高分辨质谱的检测结果，这一方面说明通过衍生化可在保证信噪比的基础上放宽对仪器的要求，另一方面若将衍生化与三重四极杆质谱以及差分离子淌度等技术相结合，将进一步地提高检测的准确性和选择性。

当衍生化与三重四极杆质谱以及差分离子淌度等技术相结合，衍生化的技术优势将被进一步放大。如图3所示，利马前列素4-(胺甲基)苯磺酸衍生物的提取离子对[M-H]^-→[M-H₂O-C_15Residue]^-信号是目前常用的利马前列素MRM提取离子对[Limaprost-H]^-→[Limaprost-H-2H₂O-CO₂]^-信号强度高2倍。对于诸如利马前列素类低浓度、强干扰的药物分析而言，通过衍生化可简化样品处理步骤、减少生物样品用量。

本发明的有益效果：

本发明中衍生物的前体离子[M-H]^-具有比未衍生的前列腺素更高的质谱响应，更短的反向色谱保留时间，同时质谱气相碰撞裂解时[M-H]^-还可提高特异性的产物离子[M-H₂O-C_15Residue]^-的裂解转化效率。与目前质谱MRM所选用的离子对相比，利用这一高特异性的离子对前列腺素类物质进行定量，其信号强度可提高2倍。

本发明检测方法可简化样品处理步骤、减少生物样品用量、或在保证信噪比的基础上放宽对仪器的要求，满足科研和生产活动中精准分析生物样品中系列前列腺素类物质的需求。

下面结合附图和实施例对发明作一详细描述。

附图说明

图1前列腺素共有骨架结构；

图2 PGE₁的5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生物与未衍生的PGE₁提取离子对信号比较；

图3利马前列素的4-(胺甲基)苯磺酸衍生物与未衍生的利马前列素提取离子对信号比较。

具体实施方式

系列的前列腺素裂解时都会产生一个强度相对较弱但特异性极高的B链断裂碎片离子，本发明尝试了系列衍生化试剂，以期提高这一特异性碎片离子的裂解转化效率。首先通过d-C₁₅，C₁₇(d₃-Me)-四氘代利马前列素和d₂-C₃,d₂-C₄-四氘代PGE₁及其4-(胺甲基)苯磺酸衍生物的子离子分析，对此特异性子离子的结构推测进行了确证，证实该特异性碎片离子是由系列的前列腺素中性质量丢失一个水分子并伴随着B链烯丙醇残基C₁₄-C₁₅碳碳单键断裂形成的。

经筛选比较，胺甲基芳磺酸类物质，如4-(胺甲基)苯磺酸或5-(胺甲基)萘-2-磺酸，从化学反应性以及B链裂解效率方面要显著高于苯胺类磺酸(如对氨基苯磺酸或5-氨基-1-萘磺酸)，脂肪类磺酸(如牛磺酸)、无机磺酸(如羟胺-O-磺酸)和芳羧酸(如4-(胺甲基)苯甲酸)。

发明公开的一种高选择性定量测定生物样品中系列前列腺素类物质的方法包含以下步骤：A、待测生物样品处理；B、衍生化处理；C、标准曲线制备；D、生物样品中含量测定。其中，步骤A为样品前处理标准操作，不同样本前处理包括如下操作：血浆样本：加抗凝剂、蛋白沉淀剂、内标溶液、选择性加入抑制剂和抗吸附剂溶液、离心、取上清液、选择性进行液液萃取和/或固相萃取；尿液样本：沉淀蛋白、加内标溶液、选择性加入抗吸附剂溶液、离心、取上清液、选择性进行液液萃取和/或固相萃取；粪便样本：冷冻干燥、粉碎、涡旋复溶、加内标溶液、选择性加入抗吸附剂溶液、离心、取上清液、选择性进行液液萃取和/或固相萃取。

其中，步骤B衍生化条件优选典型多肽偶联反应条件，衍生化位点即前列腺素C₁-位的羧酸，有机碱优选N,N-二异丙基乙基胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)，偶联试剂优选HATU(Hexafluorophosphate Azabenzotriazole Tetramethyl Uronium)或HBTU(Hexafluorophosphate Benzotriazole Tetramethyl Uronium)，溶剂优选乙腈水混合液，室温下反应。

步骤C标准物的处理和测定方法与待测物的处理和测定方法完全相同。

实施例1：

取1mL乙腈/水混合液加入抗吸附EP管中，依次加入1mg/mL PGE₁乙腈溶液20μL，1μL/mL DIPEA乙腈溶液50μL，1mg/mL HATU乙腈溶液50μL，室温下振摇10分钟；加入1mg/mL 5-(胺甲基)萘-2-磺酸水溶液50μL，室温下振摇20分钟。

反应完毕后从反应液中取出50μL反应混合液加入到4950μL乙腈水1/1(v/v)中稀释成待测液。质谱检测未发现[PGE₁-H]^-信号(m/z 353.23Da)，而对应的PGE₁苯磺酸衍生物信号明显(m/z 572.27Da)，说明在此条件下PGE₁完全衍生化。

Triple TOF^TM 6600⁺型串联质谱仪，配有ESI离子化源；负离子方式检测；离子喷射电压-5000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力50psi；气体2：氮气压力50psi；气帘气体：氮气压力20psi；解簇电压：-100V；高灵敏度模式；针泵进样；提取[M-H]^-→[M-H₂O-C_15Residue]^-转化过程中相应离子对(m/z 572.3→454.187±0.02Da)，优化后PGE₁的5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生物最佳碰撞能量为-55eV；优化后PGE₁的[PGE₁-H]^-→[PGE₁-H-2H₂O-CO₂]^-离子对(m/z 353.2→273.231±0.02Da)最佳碰撞能量为-30eV。

取反应混合液50μL与同摩尔浓度的PGE₁乙腈溶液50μL加入到4900μL乙腈/水1/1(v/v)中稀释成待测液。超高效液相色谱系统；色谱柱：ACQUITY^TM BEH C₁₈柱，100mm×2.1mmI.D.，1.7μm粒径；流动相：水相：5％乙腈+95％水(含1mMol醋酸铵+0.02％乙酸)pH值5、有机相：乙腈；梯度洗脱；柱温40℃；流速0.3mL/min；进样量20μL。所述的色谱条件中的梯度洗脱，程序见表1，其中A是5％乙腈+95％水(含1mMol醋酸铵+0.02％乙酸)，B是乙腈。

表1梯度洗脱程序

实验结果如图2所示，5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生后PGE₁的质谱信号(m/z 572Da)未衍生的PGE₁信号(m/z 353Da)要高13倍；提取离子对(m/z 572→454Da)信号与目前三重四极杆质谱MRM所选用的提取离子对(m/z 353→273Da)信号强度相当，但选择性则高于后者；并且与未衍生的PGE₁同类裂解反应的提取离子信号(m/z 353→235Da)相比，萘磺酸衍生物信号强度要高1.5倍。

实施例2

按实施例1所述衍生化方案将利马前列素等量转化成4-(胺甲基)苯磺酸衍生物；并优化质谱条件。

色谱柱：ACQUITY^TM BEH C₁₈柱，100mm×2.1mm I.D.，1.7μm粒径；流动相：水相：5％乙腈+95％水(含1mMol醋酸铵+0.02％乙酸)pH值5、有机相：乙腈；梯度洗脱；柱温40℃；流速0.3mL/min；进样量20μL。所述的色谱条件中的梯度洗脱，程序见表2，其中A是5％乙腈+95％水(含1mMol醋酸铵+0.02％乙酸)，B是乙腈。

表2梯度洗脱程序

质谱条件为：Triple Quad^TM 6500型串联质谱仪，配有ESI离子化源、SelexION差分离子淌度系统；负离子方式检测；离子喷射电压-4500V；温度500℃；源内气体1：氮气压力45psi；气体2：氮气压力45psi；气帘气体：氮气压力25psi；DMS温度：Medium；改性剂：异丙醇；改性剂流速：low；分离电压：3600V；高灵敏度模式。优化后利马前列素的4-(胺甲基)苯磺酸衍生物离子对[M-H]^-→[M-H₂O-C_15Residue]^-解簇电压：-100V；碰撞能量：-54eV；COV：7V。优化后未衍生的利马前列素离子对(m/z 379.2→299.2Da)解簇电压：-45V；碰撞能量：-50eV；COV：-7V。

如图3所示，利马前列素4-(胺甲基)苯磺酸衍生物的提取离子对(m/z 548.3→402.1Da)信号比目前常用的利马前列素MRM提取离子对(m/z 379.2→299.2Da)信号强度高2倍。

以上实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不构成对本发明的任何限制，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：先通过化学衍生化方法将生物样品中前列腺素类物质等量转化成胺甲基芳磺酸衍生物，再通过液相色谱-质谱联机检测；检测时选择芳磺酸衍生物负离子[M-H]^-和其高特异性碎片离子[M-H₂O-C_15Residue]^-或者选择芳磺酸衍生物负离子[M-H]^-和报告离子作为定量离子对进行定量；所述M指芳磺酸衍生物；所述C_15Residue指系列前列腺素C₁₄-C₁₅之间碳碳单键断裂后C₁₅一侧残基；所述报告离子指前列腺素芳磺酸衍生物裂解时产生的芳磺酸碎片离子。

2.根据权利要求1所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：胺甲基芳磺酸衍生化试剂通式为H₂N-CH₂-Ar-SO₃H，其中Ar为苯环或稠环芳烃；所述稠环芳烃包括芴、苊、萘、蒽、荧蒽、苯并蒽、菲、芘、苯并芘。

3.根据权利要求2所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：胺甲基芳磺酸衍生化试剂为4-(胺甲基)苯磺酸或5-(胺甲基)萘-2-磺酸。

4.根据权利要求3所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：对于4-(胺甲基)苯磺酸衍生的前列腺素类物质选择的报告离子为[C₇H₆NO₃S]^-或[C₇H₆O₃S]^·-；对于5-(胺甲基)萘-2-磺酸衍生的前列腺素类物质选择的报告离子为[C₁₁H₈NO₃S]^-或[C₁₁H₈O₃S]^·-。

5.根据权利要求1所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：采用化学衍生化方法对生物样品中前列腺素类待测物进行衍生化处理时，衍生化条件为典型肽偶联反应条件：有机碱为N，N-二异丙基乙基胺或三乙胺；偶联试剂为HATU或HBTU；溶剂为乙腈水混合液，室温反应。

6.根据权利要求1所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：色谱条件为：高效液相色谱；反相色谱柱；乙腈/水流动相；梯度洗脱；质谱条件为：多重四极杆型串联质谱仪，ESI离子化源，选择性加装离子淌度；负离子检测模式。

7.根据权利要求1所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：所述的生物样品为血浆、组织液、尿液。

8.根据权利要求1所述的生物样品中前列腺素类物质的检测方法，其特征在于：所述前列腺素类物质包括系列前列腺素及前列腺素类似物；所述系列前列腺素包括PGE₁、PGE₂、PGD₂、PGI₂，所述前列腺素类似物包括利马前列素、贝前列素。

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