CN113341026A - Lc_ms_ms检测丁螺环酮及其代谢产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请属于药物检测技术领域，具体公开了一种LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法，其包括确定LC条件，确定MS条件以及将待测样本以上述确定的LC条件和MS条件进行检测。本申请至少具有以下有益效果之一：本申请提供的方法可测定丁螺环酮、6‑羟基丁螺环酮和1‑(2‑嘧啶基)‑哌嗪中的一种、两种或三种。同时检测丁螺环酮、6‑羟基丁螺环酮和1‑(2‑嘧啶基)‑哌嗪时，所需样本量小，减少了分析时间，提高了检测效率，更有利于大批量检测。

Description

LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法
技术领域
本申请属于药物检测技术领域，更具体地说，它涉及一种LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法。
背景技术
丁螺环酮属氮杂螺环癸烷双酮类抗焦虑药物，通过减少5-羟色胺神经递质的作用发挥疗效，具有临床应用效果好、副作用小、无成瘾性等优点，是一种较理想的抗焦虑药。丁螺环酮在体内主要经两种途径代谢，一种途径是通过羟化反应生成活性代谢产物6-羟基丁螺环酮（Dockens RC, Salazar DE, Fulmor IE et al. Journal of ClinicalPharmacology, 2006; 46:1308），另一种途径是通过氧化脱烷基形成活性代谢产物1-(2-嘧啶基)-哌嗪。
临床上丁螺环酮用药剂量小，由于肝脏的首过效应使得其血药浓度较低，临床上丁螺环酮及其两种活性代谢产物的生物参考区间仅有1-4ng/mL，警戒值为30ng/mL，因此需要灵敏度高，精密度高，准确度好的LC_MS_MS对丁螺环酮及其活性代谢产物的含量进行监测。研究发现，服用丁螺环酮类药物，血药浓度达峰时，6-羟基丁螺环酮浓度是丁螺环酮浓度的40倍，是1-(2-嘧啶基)-哌嗪的2倍，而达到稳态时，6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪的浓度相当，此时丁螺环酮几乎被代谢完毕。因此，只对血液中丁螺环酮和/或1-(2-嘧啶基)-哌嗪进行监测的做法是不完善的（吴景岩, 等. 黑龙江医药, 2004(4)；杜青, 等.药物分析杂志, 2003(23)）。
发明内容
液相色谱串联质谱技术既具有色谱的分离能力，又具有质谱的特异性鉴定能力，而MS/MS型质谱检测器在小分子检测中具有极大的优势，被认为是小分子定量检测的参考方法。文献HPLC_MS_MS测定人血浆中丁螺环酮浓度及人体药动学（刘文芳, 等. 中国药学杂志, 2009(4)）仅测定了人血浆中丁螺环酮原型药物的浓度，且只采用定量离子对，由于患者服用药物不同，血液成分复杂，血液中可能存在着两种母离子及子离子均相同的类似物的干扰，因此，使用单一的离子对进行监测可能造成对待测物的误判，而且待测样本的需求量大，前处理过程复杂，耗费时间多。
针对临床需求，本申请为了解决上述存在的问题之一，提供一种LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法，该方法可同时测定丁螺环酮及其代谢产物6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪，而且待测样本需求量少，检测时间短，大大提高了检测效率。
本申请是通过以下方案实现的：
本申请提供了一种LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法，该方法包括如下步骤：
确定LC条件：
色谱柱为PhenomenexKinetex EVO C18，5.0µm，4.6mm×100mm；流动相：按体积比流动相A：流动相B＝（30-20）：（70-80），流速：0.4-0.5ml/min，等度洗脱；流动相A含5mM甲酸铵的水溶液；流动相B含5mM甲酸铵的甲醇溶液；
确定MS条件：
采用电喷雾电离源，正离子，多反应监测（MRM），毛细管电压为3500-5000V，雾化气为氮气，雾化气压力为10-15psi，加热气为氮气，流速为10-15L/min，加热气温度300-350℃。
将待测样本以上述确定的LC条件和MS条件进行检测。
本申请利用LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物，优选地，利用本申请提供的检测方法同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪的浓度，使得测定结果更加准确和完善，真实地反应患者血药浓度的变化，以便更加准确地指导患者用药。
在本申请的一个具体实施方式中，所述流动相A：流动相B＝25：75。
在本申请的一个具体实施方式中，LC检测时，柱温：30-50℃。优选地，柱温为30℃。
在本申请的一个具体实施方式中，LC检测时，流动相的流速为0.4mL/min或0.5mL/min。
在本申请的一个具体实施方式中，LC检测时，运行时间为3.0-4.5min，例如运行时间为3.0min，3.5min，4min或4.5min。
在本申请的一个具体实施方式中，LC检测时，进样量为10µL。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法还包括加入定性离子对和定量离子对。
本申请在LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物时，加入了定性离子对，以避免患者血液中可能存在两种母离子及子离子均相同的类似物的干扰，使得检测结果更加准确。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法还包括加入内标物，所述内标物为所述内标物为同位素标记的内标物。
在本申请的一个具体实施方式中，所述同位素为氘。
本申请中的内标物利用同位素标记，并结合定性和定量离子对，使测定结果更加准确，以便更真实的反应患者血药浓度的变化。
在本申请的一个具体实施方式中，所述MS条件中，监测离子对如下表所示：
Figure 446015DEST_PATH_IMAGE001
表中的*为定量离子对。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法还包括待测样本的前处理，所述前处理具体过程为：向待测样本中加入甲基叔丁基醚，混合均匀，离心，取上清，干燥得到干燥物，将所述干燥物溶于甲醇：水（V/V）=70:30的溶液中。
在本申请的一个具体实施方式中，所述干燥为室温下采用氮气吹干。
在本申请的一个具体实施方式中，所述方法还包括制作标准曲线，所述标准曲线采用内标法，以待测目标物的标准品的色谱峰面积与待测目标物的内标物的色谱峰面积的比值为纵坐标，以待测目标物的标准品的浓度与内标物的浓度的比值为横坐标形成。
在本申请的一个具体实施方式中，所述标准曲线的制作方法如下：
S1：制备待测目标物的一系列浓度的标准品工作液；
S2：向所述标准品工作液中分别加入待测目标物的内标物，所述内标物标记有同位素，混合均匀；
S3：向步骤S2中加入甲醇：水（V/V）=70：30的溶液，混合均匀；
S4：将步骤S3溶液按照上述确定的LC条件和MS条件进行检测。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样本为血清或血浆样本。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样本的取样量为50-100μL。本申请大大降低了对待测样本的需求量。
在本申请的一个具体实施方式中，所述待测样本的前处理具体包括如下步骤：
称取100μL待测样本，加入标记有同位素的待测目标物的内标物溶液，再加入甲基叔丁基醚以2000rpm的转速混匀5min，然后以14000r/min的转速离心10min，取上清，室温氮气下吹干，加入甲醇：水（V/V）=70:30的混合溶剂，混匀，得到待测样本溶液。
利用本申请提供的方法检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪时，所需样本量较少，而且样本前处理过程简单，所需时间短，提高了检测效率。
本申请提供的方法至少具有以下有益效果之一：
本申请提供的LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法可测定丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪中的一种、两种或三种。同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪时，所需样本量小，减少了分析时间，提高了检测效率，更有利于大批量检测。
附图说明
图1A为本申请实施例中提供的丁螺环酮的化学结构式。
图1B为本申请实施例中提供的丁螺环酮的代谢产物6-OH-丁螺环酮的化学结构式。
图1C为本申请实施例中提供的丁螺环酮的代谢产物1-(2-嘧啶基)-哌嗪的化学结构式。
图2为本申请实施例中提供的标准品中丁螺环酮色谱图。
图3为本申请实施例中提供的标准品中丁螺环酮同位素色谱图。
图4为本申请实施例中提供的血液样本中丁螺环酮色谱图。
图5为本申请实施例中提供的血液样本中丁螺环酮同位素内标的色谱图。
图6为本申请实施例中提供的标准品中6-羟基丁螺环酮色谱图。
图7为本申请实施例中提供的标准品中6-羟基丁螺环酮同位素内标色谱图。
图8为本申请实施例中提供的血液样本中6-羟基丁螺环酮色谱图。
图9为本申请实施例中提供的血液样本中6-羟基丁螺环酮同位素内标的色谱图。
图10为本申请实施例中提供的标准品中1-(2-嘧啶基)-哌嗪色谱图。
图11为本申请实施例中提供的标准品中1-(2-嘧啶基)-哌嗪同位素色谱图。
图12为本申请实施例中提供的血液样本中1-(2-嘧啶基)-哌嗪色谱图。
图13为本申请实施例中提供的血液样本中1-(2-嘧啶基)-哌嗪同位素内标的色谱图。
图14为本申请实施例中提供的丁螺环酮的线性关系图。
图15为本申请实施例中提供的6-羟基丁螺环酮的线性关系图。
图16为本申请实施例中提供的1-(2-嘧啶基)-哌嗪的线性关系图。
图17为本申请实施例中标记为1的检测结果图。
图18为本申请实施例中标记为2的检测结果图。
图19为本申请实施例中标记为3的检测结果图。
图20为本申请实施例中标记为4的检测结果图。
图21为本申请实施例中标记为5的检测结果图。
图22为本申请实施例中标记为6的检测结果图。
图23为本申请实施例中标记为7的检测结果图。
图24为本申请实施例中标记为8的检测结果图。
图25为本申请实施例中标记为9的检测结果图。
图26为本申请实施例中标记为10的检测结果图。
图27为本申请实施例中标记为11的检测结果图。
具体实施方式
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语具有与本申请所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请中主要药物或材料的来源如下表所示。
Figure 782450DEST_PATH_IMAGE002
本申请提供的方法可以检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪中的一种、两种或三种，以下实施例以同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪三种物质为例进行说明。其中，丁螺环酮及其活性代谢产物6-OH-丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪的化学结构式分别如图1A、图1B和图1C所示。
实施例1 丁螺环酮及其代谢产物的检测
一、标准品工作液的制备
1. 配制含丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪三种目标物的标准溶液，三种目标物浓度均为1ng/mL、4ng/mL、10ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、200ng/mL和400ng/mL七个浓度的系列标准溶液。
2. 配制内标液：配置浓度均为40ng/mL的丁螺环酮-d8、6-OH-丁螺环酮-d8和1-(2-嘧啶基)-哌嗪-d8的混合同位素内标溶液。
3. 取七个离心管，分别加入10μL上述七个不同浓度的标准溶液，分别加入10μL混合同位素内标溶液，分别加入甲醇：水（V:V）=70:30的混合溶剂100μL混匀，得到七个不同浓度的标准品工作液，备用。
二、血液样本前处理
1. 取待检测血液2mL，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液，将上述血清/血浆置于-80℃冷冻下保存至分析前备用。本实施例中的上清液可以是血清也可以是血浆，以下以血清样本为例进行说明。
取100μL待测血清样本，加入10μL上述浓度均为40ng/mL的丁螺环酮-d8、6-OH-丁螺环酮-d8和1-(2-嘧啶基)-哌嗪-d8的混合同位素内标溶液，2000rpm混匀0.5min。
2. 分别加入1000μL甲基叔丁基醚，2000rpm混匀5min，然后以14000r/min的转速离心10min，分别取上清950μL，室温氮气下吹干得干燥物。
3. 向干燥物中分别加入甲醇：水（V:V）=70:30的混合溶剂100μL混匀，得到待测样本溶液，备用。
三、LC_MS_MS检测
1. LC条件的确定
本申请的发明人采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱、Hypersil GOLD PFP色谱柱和PhenomenexKinetex EVO C18色谱柱分别同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪，并实验适应于不同色谱柱的条件。在实验过程中，发明人发现：当流速＜0.4ml/min时，分析时间太长；当流速＞0.5ml/min时，6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪出峰时间较接近，会出现分离不好的情况；当温度较低，例如温度低于30℃时，柱温不好控制，特别是在夏天，需要等待色谱柱平衡的时间较长；温度过高，例如温度高于50℃时，对色谱柱损耗较大，会直接影响色谱柱使用寿命。综合考虑，本实施例中，确定流速：0.50mL/min；柱温：30℃；进样量10µL的条件下进行实验。以下以表1-3中所示的条件为例说明不同的色谱柱以及不同的流动相及其比例对检测结果的影响。实验结果见图17-27所示。
①色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18
表1 Agilent Eclipse Plus C18的实验结果
Figure 274611DEST_PATH_IMAGE003
当选择色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18时，试验不同的流动相对检测结果的影响，其结果如图17-19所示。
图17为1的检测结果图；图18为2的检测结果图；图19为3的检测结果图。从图17-19可知，采用Agilent Eclipse Plus C18色谱柱检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪时，保留时间太长，所需要的分析时间太长，不适合临床应用或大批量检测。
②色谱柱：Hypersil GOLD PFP
表2 Hypersil GOLD PFP色谱柱的实验结果
Figure 47395DEST_PATH_IMAGE004
当选择色谱柱为Hypersil GOLD PFP柱时，试验不同的流动相对检测结果的影响，其结果如图20-22所示。
图20为4的检测结果图；图21为5的检测结果图；图22为6的检测结果图。从图20-22可知，采用Hypersil GOLD PFP柱色谱柱检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪时：
1）添加2mM乙酸铵，有机相比例为60%时，3min三种目标化合物出峰完毕，保留时间合适，但三种化合物未完全分离。
2）添加5mM甲酸铵，有机相比例为60%时，2.5min三种目标化合物出峰完毕，保留时间合适，三种化合物完全分离，但峰型较宽，不能排除化合物内包含其他杂质。
3）添加5mM甲酸铵，有机相比例为70%时，2min三种目标化合物出峰完毕，保留时间合适，但三种化合物未完全分离。
所以当有机相比例＜60%时，利用Hypersil GOLD PFP柱色谱柱检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪时，分析时间小于3min，分析时间合适，但是三种目标化合物的峰型较宽，不能排除化合物内包含其他杂质；而当有机相比例大于60%时，三种待测物不能够完全分离，可见，Hypersil GOLD PFP柱色谱柱也不适合用于同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪。
③色谱柱：PhenomenexKinetex EVO C18
表3 PhenomenexKinetex EVO C18的实验结果
Figure 616128DEST_PATH_IMAGE005
当选择色谱柱为PhenomenexKinetex EVO C18时，试验不同的流动相对检测结果的影响，其结果如图23-24所示。
图23为7的检测结果图；图24为8的检测结果图。从图23和24可知，采用PhenomenexKinetex EVO C18色谱柱检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪时：
1）添加5mM甲酸铵，有机相比例为60%时，6min三种目标化合物未能全部出峰，分析时间太长。
2）添加5mM甲酸铵，有机相比例为70%时，三种目标化合物能较好的分离，但是分析时间需要4.5min，分析时间较长。
对流动相的配比进一步优化。其结果见表4所示。
表4 PhenomenexKinetex EVO C18的优化
Figure 790757DEST_PATH_IMAGE006
图25为9的检测结果图；图26为10的检测结果图；图27为11的检测结果图。从图25-27可知，采用PhenomenexKinetex EVO C18色谱柱检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪时：
1）添加5mM甲酸铵，有机相比例为75%时，3.5min三种目标化合物出峰完毕，保留时间合适，且3种目标化合物可达到完全分离。
2）添加5mM甲酸铵，有机相比例为80%时，3.0min三种目标化合物出峰完毕，保留时间合适，后两种目标化合物稍微有些交叉，但是在允许范围之内，3种目标化合物可以分离。
3）添加5mM甲酸铵，有机相比例为85%时，3.0min三种目标化合物出峰完毕，但3种目标化合物无法完全分离。
根据上述实验，最终选择LC的检测条件为：
色谱柱：PhenomenexKinetex EVO C18，5.0µm，4.6mm×100mm；流动相：流动相A：含5mM甲酸铵的水溶液；流动相B：含5mM甲酸铵的甲醇溶液；按体积比流动相A∶流动相B＝75∶25，等度洗脱；流速：0.50mL/min；柱温：50℃；进样量10µL。
MS条件的确定：
本申请中，采用电喷雾电离源，正离子，多反应监测（MRM），毛细管电压3500-5000V，雾化气为氮气，雾化气压力为10-15psi，加热气为氮气，流速为10-15L/min，加热气温度300-350℃均可。本实施例中，以毛细管电压4500V，雾化气为氮气，雾化气压力为15psi，加热气为氮气，流速为13L/min，加热气温度300℃为例进行说明。串联质谱条件如下表5所示。
表5 串联质谱条件
Figure 922661DEST_PATH_IMAGE007
表中的*为定量离子对。
按照上述确定的条件进行LC_MS_MS分析测定标准品工作液和待测样本溶液等，实验结果如下：
1. 标准溶液中，丁螺环酮色谱图如图2所示；丁螺环酮内标的色谱图如图3所示。血清样本中，丁螺环酮色谱图如图4所示；丁螺环酮内标的色谱图如图5所示。由图2-5可见，标准溶液中丁螺环酮的保留时间与其内标的保留时间一致，并且血清样本中丁螺环酮及其同位素内标的保留时间与标准溶液中一致。
2.标准溶液中，6-羟基丁螺环酮色谱图如图6所示，6-羟基丁螺环酮内标的色谱图如图7所示。血清样本中，6-羟基丁螺环酮色谱图如图8所示，图8中，虽然血清样本中6-羟基丁螺环酮前边有杂质干扰，但是其与6-羟基丁螺环酮可以完全分开，不影响6-羟基丁螺环酮及其他两种目标化合物的检测；6-羟基丁螺环酮内标的色谱图如图9所示。由图6-9可见，标准溶液中6-羟基丁螺环酮的保留时间与其内标的保留时间一致，并且血清样本中6-羟基丁螺环酮及其同位素内标的保留时间与标准溶液中一致。
3.标准溶液中，1-(2-嘧啶基)-哌嗪色谱图如图10所示；1-(2-嘧啶基)-哌嗪内标的色谱图如图11所示。血清样本中，1-(2-嘧啶基)-哌嗪色谱图如图12所示；6-羟基丁螺环酮内标的色谱图如图13所示。由图10-13可见，标准溶液中1-(2-嘧啶基)-哌嗪的保留时间与其内标的保留时间一致，并且血清样本中1-(2-嘧啶基)-哌嗪及其同位素内标的保留时间与标准溶液中一致。
本实施例中以同位素标记物为内标物，使得目标化合物的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
4. 丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪的标准曲线如图14-16及表6所示。
表6 丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪线性方程的测定
Figure 182741DEST_PATH_IMAGE008
由图14-16及表6可知，丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪在0.1-40ng/mL的线性范围内，相关系数R2＞0.9900，线性关系良好。
实施例2 定量限和检测限的测定
采用不含目标物的空白血清样本添加标准品，制成含丁螺环酮（0.1ng/mL）、6-羟基丁螺环酮（0.1ng/mL）和1-(2-嘧啶基)-哌嗪（0.1ng/mL）的血液样本，用空白血清样本做不同程度的稀释，从而制备得到分别稀释2倍、3倍、4倍、5倍的血液样本，加入10μL混合同位素内标溶液，其后处理同上述血液样本前处理过程，按照上述确定的LC_MS_MS检测条件进行测定。丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪的检测限和定量限如下所示：
丁螺环酮：
（1）检测限（LOD）：0.02ng/mL，S/N=5.4。
（2）定量限（LOQ）：0.03ng/mL，S/N=14.6。
6-羟基丁螺环酮：
（1）检测限（LOD）：0.02ng/mL，S/N=2.9。
（2）定量限（LOQ）：0.03ng/mL，S/N=13.6。
1-(2-嘧啶基)-哌嗪：
（1）检测限（LOD）：0.02ng/mL，S/N=8.6。
（2）定量限（LOQ）：0.03ng/mL，S/N=13.1。
由上可知，丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪的定量限均为0.03ng/mL，检测限均为0.02ng/mL，灵敏度很高，对丁螺环酮及其活性代谢产物含量低的生物样本也能准确定量，保证了检测方法的高准确性及广适用性。
实施例3 回收率和精密度的测定
分别取丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪标准工作液配制成浓度为0.4 ng/mL、4.0 ng/mL、20 ng/mL和32 ng/mL 4种浓度进行加样回收率和精密度实验，按实施例1中的LC_MS_MS方法进行测定，平行测定4个样本，丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪的回收率和精密度如表7所示。
表7 丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮、1-(2-嘧啶基)-哌嗪加标回收率
Figure 543447DEST_PATH_IMAGE009
由表7可知，丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮和1-(2-嘧啶基)-哌嗪在4个不同层次浓度水平范围内的精密度为0.61% ~2.63%，平均回收率为99.50% ~104.75%，精密度高，加标回收率良好，从而能够提高检测结果的准确度，较大程度上消除系统误差。
综上所述，本申请实施例中提供的LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法，检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，该方法可单独检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮或1-(2-嘧啶基)-哌嗪，也可以同时检测丁螺环酮、6-羟基丁螺环酮或1-(2-嘧啶基)-哌嗪中的两种或三种，而且血液样本需求量小，操作过程简单，减少了样本预处理以及检测的时间（例如，省却了多步萃取过程，避免使用难挥发的萃取溶剂，以及各种洗脱溶剂的配制等），有利于大批量高效率临床检测需求；在检测过程中添加了定性离子对，避免患者血液中可能存在两种母离子及子离子均相同的类似物的干扰，且利用同位素内标，排除了患者联合用药带来的对内标浓度的干扰现象。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (10)

1.一种LC_MS_MS检测丁螺环酮及其代谢产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
确定LC条件：
色谱柱为PhenomenexKinetex EVO C18，5.0µm，4.6mm×100mm；流动相：按体积比流动相A：流动相B＝（30-20）：（70-80），流速：0.4-0.5ml/min，等度洗脱；流动相A含5mM甲酸铵的水溶液；流动相B含5mM甲酸铵的甲醇溶液；
确定MS条件：
采用电喷雾电离源，正离子，多反应监测（MRM），毛细管电压为3500-5000V，雾化气为氮气，雾化气压力为10-15psi，加热气为氮气，流速为10-15L/min，加热气温度300-350℃；
将待测样本以上述确定的LC条件和MS条件进行检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相A：流动相B＝25：75。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述代谢产物包括6-羟基丁螺环酮和/或1-(2-嘧啶基)-哌嗪。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括加入定性离子对和定量离子对。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括加入内标物，所述内标物为同位素标记的内标物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述MS条件中，监测离子对如下表所示：
Figure 203022DEST_PATH_IMAGE001
表中的*为定量离子对。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括待测样本的前处理，所述前处理具体过程为：向待测样本中加入甲基叔丁基醚，混合均匀，离心，取上清，干燥得到干燥物，将所述干燥物溶于甲醇：水（V/V）=70:30的溶剂中。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括制作标准曲线，所述标准曲线采用内标法，以待测目标物的标准品的色谱峰面积与待测目标物的内标物的色谱峰面积的比值为纵坐标，以待测目标物的标准品的浓度与待测目标物的内标物的浓度的比值为横坐标形成。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本为血清或血浆样本。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样本的取样量为50-100μL。
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