CN117069801B - 一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽及其筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽及其筛选方法。本发明提供的特征多肽如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明筛选的尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽，具有优异的专属性和稳定性，特异性强，具有良好的应用前景；本发明利用相关特征多肽对全蝎药材、饮片以及含全蝎相关药品进行检查，检验上述药品中是否掺伪了尖刺信使蝎或条斑钳蝎。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽及其筛选方法。
背景技术
尖刺信使蝎（Lychas mucronatus），尾部有双针结构，尾巴和钳子更饱满，身上没有线纹，尾节渐变为深色，唇部没有异色；其主要产地为中国海南、东南亚地区。条斑钳蝎（Mesobuthus eupeus）属于小型的沙漠蝎 ，成体 4-5cm，以青色和黄色较多见，还有橙色、黄色、红色、淡金色、黑色个体。
目前，《中国药典》规定全蝎的来源仅为东亚钳蝎，市场上出现了一些其他种类的蝎子如尖刺信使蝎和条斑钳蝎以次充好的现象。这种不合规定的行为不仅损害了消费者的权益，也严重影响了全蝎的质量和疗效。
在现有技术中，对于条斑钳蝎、尖刺信使蝎和东亚钳蝎进行区分时，多从其体色、个体大小进行区分：例如东亚钳蝎的足肢颜色为橙黄色。条斑钳蝎的足肢颜色较浅，呈淡黄色。条斑钳蝎的背部颜色多样，东亚钳蝎则为单调的蓝青色。此外，东亚钳蝎尾部倒数第二节有黑青色斑，而条斑钳蝎则不明显。临床使用全蝎必须依赖于其正确的药材来源。不同种类的蝎子可能含有不同成分和药理活性，因此，将尖刺信使蝎和条斑钳蝎替代东亚钳蝎，可能会导致治疗效果的不确定性和不稳定性。同时，这种以次充好的行为会严重影响中药产业的信誉和形象。中药作为中国传统的宝贵药物资源，具有悠久的历史和文化底蕴。然而，不规范的市场行为和不诚信的经营模式，容易使公众对中药的信任受到影响，甚至造成负面的舆论效应。因此，加强对全蝎等中药药材来源的管理和监督，严惩以次充好等违法行为，是维护中药产业声誉和保障公众健康的必要措施。目前，尚未有可以有效的将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎进行区分的方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽。
本发明还提供了上述尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽的筛选方法。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽，所述特征多肽的序列为：
；
所述A（+42.01）代表丙氨酸的乙酰化修饰。
本发明还提供了一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽的筛选方法，包括以下步骤：
（1）样品预处理：分别将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎样品粉碎，分别称取粉末后加入变性缓冲液和DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心；然后量取上清液加入IAA溶液，避光反应后混匀，离心，然后对样品进行脱盐和酶解，酶解结束后离心，取上清液即得待检测溶液；
（2）采用纳升液相-高分辨质谱进行检测，处理质谱数据，筛选尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有的特征多肽。
进一步的，步骤（1）中，样品预处理的具体步骤为：分别将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎粉碎，分别称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液和1mL DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心后量取上清液，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心，取500μL上清液使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解，酶解结束后离心，取上清液即得待检测溶液。
本发明所使用的变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0，加水定容；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M。
进一步的，步骤（1）中，所述脱盐和酶解为将样品加入到分子量为3kDa的超滤离心管，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL 质量浓度1%的NH4HCO3溶液和10μL 浓度为10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应即可。
进一步的，步骤（2）中，所述纳升液相-高分辨质谱的参数为：使用 C18 色谱柱：75μm × 2 cm、3 μm，进行脱盐和富集，流速为 300 nL/min；流动相A为含2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱；进样量为1μL; 高分辨率质谱的条件为：分析采用正离子模式，喷雾电压为1,800 V；离子传输毛细管温度为275℃；离子传输管传输效率设置为60%；初级质谱在分辨率为 60,000、采集范围为 350-1550 m/z，二次质谱采用快速扫描模式，顶部用于母离子选择的速度数据依赖模式、用于碎片的 HCD 模式以及碎片能量 NCE 设置为 40%。
进一步的，上述梯度洗脱的程序为：0-1 min，1%B→6%B；1-96min，6%B→22%B；96-113min，22%B→30%B；113-117min，30%B→95%B；117-120min，95%B。
进一步的，所述特征多肽的检测离子对为：
。
本发明的有益效果为：
（1）本发明筛选的尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽，具有优异的专属性和稳定性，特异性强，具有良好的应用前景；
（2）本发明利用相关特征多肽对全蝎药材、饮片以及含全蝎相关药品进行检查，检验上述药品中是否掺伪了尖刺信使蝎或条斑钳蝎。
附图说明
图1为肽段1的质谱氨基酸序列解析图；
图2为肽段2的质谱氨基酸序列解析图；
图3为肽段1在样品中的质谱出峰情况图；
图4为肽段2在样品中的质谱出峰情况图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1
（1）样品处理方法
分别将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎样品粉碎，分别称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液（6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0），和1mL DTT(0.5M)溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心（12000rpm，10min）。量取上清液500μL，加入100μL IAA (0.55M)溶液，避光反应30min，混匀，离心（12000rpm，10min），取500μL，使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解（12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL 1% 的NH4HCO3溶液和10μL牛胰蛋白酶溶液（10mg/mL），37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应，离心，取上清液），即得；
（2）纳升液相-高分辨质谱方法
使用纳升液相色谱仪（EASY-nLC 1000，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）结合高分辨率质谱仪（Orbitrap-Fusion，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）对制备的样品进行分析，条件如下：使用 Thermo Acclaim PepMap C18 色谱柱（75 μm × 2 cm、3 μm，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA）进行脱盐和富集，使用 Thermo Acclaim PepMapC18 色谱柱（75 μm × 15 cm， 3 μm，Thermo Scientific，San Jose，CA，USA），流速为 300nL/min；流动相A为含2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（0-1 min，1%B→6%B；1-96min，6%B→22%B；96-113min，22%B→30%B；113-117min，30%B→95%B；117-120min，95%B)；进样量为1μL。 高分辨率质谱分析的条件如下：离子源为Nanospray Flex；分析采用正离子模式，喷雾电压为1,800 V；离子传输毛细管温度为275℃； 离子传输管的传输效率设置为60%。 初级质谱在分辨率为 60,000、采集范围为 350-1550 (m/z) 的 Orbitrap 质量分析仪上进行，二次质谱在采用快速扫描模式进行扫描的Orbitrap 质量分析仪上进行，顶部用于母离子选择的速度数据依赖模式、用于碎片的 HCD模式以及碎片能量 NCE 设置为 40%；
（3）使用PEAKS 8.5处理三种样品质谱数据，进行序列的预测，寻找出尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有，而东亚钳蝎没有的特征多肽。尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有的序列如表1所示。
表1
。
肽段1、肽段2的质谱氨基酸序列解析如图1-图2所示。
实施例2
使用 HPLC-三重四极杆 质谱法（QTRAP6500 LC/MS，AB SCIEX，Foster City，CA，USA）验证肽生物标志物（肽段1-2）的特异性并建立 MRM 方法。
HPLC 参数设置如下：色谱柱为 C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm，ZORBAX SBRRHD，Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA），柱温 43℃ ，流速0.3mL/min，流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，B为1:1甲醇乙腈溶液，梯度洗脱（(0-12 min, 10% B →20% B;12-21 min, 20% B→97% B; 21-25 min, 97% B; 25-25.5 min, 97% B→10% B; 25.5-30min, 10% B) 与进样体积5μL，溶剂延迟为0-4min和26-30min。
质谱参数设置如下：质谱检测器，电喷雾电离（ESI）正离子模式用于多反应监测，鞘气流量46L/h，辅助气体流量850L/h，喷雾电压3.5kV，离子源温度150℃，辅助气体温度400℃，锥孔电压30V，碰撞电压35V。
使用找到的母离子和子离子（如表2）建立方法，鉴别方法：使用尖刺信使蝎、条斑钳蝎对照药材和样品，按照实施例1中方法制备，若样品中肽段1-2在对照药材出峰处出峰，则认为样品中含有尖刺信使蝎或条斑钳蝎。
表2
。
效果实施例1
分别使用东亚钳蝎、尖刺信使蝎、条斑钳蝎样品按照实施例1中样品处理方法处理后进三重四极杆液相色谱质谱联用仪，使用实施例2所建立的方法结果如下：东亚钳蝎样品中肽段1-2未出峰，尖刺信使蝎、条斑钳蝎均出峰，具体如图3和图4所示。
Claims (2)
1.一种尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽，其特征在于，所述特征多肽的序列为：
；
所述A（+42.01）代表丙氨酸的乙酰化修饰。
2.一种如权利要求1所述的尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有特征多肽的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品预处理：分别将东亚钳蝎、尖刺信使蝎和条斑钳蝎粉碎，分别称取粉末50mg，加入10mL变性缓冲液和1mL DTT溶液，摇匀，置80℃处理过夜，取出放冷至室温，离心后量取上清液，加入100μL IAA溶液，避光反应30min，混匀，离心，取500μL上清液使用分子量3kDa的超滤离心管对样品进行脱盐和酶解，酶解结束后离心，取上清液即得待检测溶液；
（2）采用纳升液相-高分辨质谱进行检测，处理质谱数据，筛选尖刺信使蝎和条斑钳蝎共有的特征多肽；
所述变性缓冲液为6M盐酸胍，1M Tris，2.5mM乙二胺四乙酸，加浓盐酸调pH至8.0，加水定容；所述DTT溶液的浓度为0.5M；所述IAA溶液的浓度为0.55M；
所述脱盐和酶解为将样品加入到分子量为3kDa的超滤离心管，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL水，12000rpm离心10min，弃去下层溶液，加入500μL 质量浓度1%的NH4HCO3溶液和10μL 浓度为10mg/mL的牛胰蛋白酶溶液，37℃酶解1小时，取出放冷至室温，于100℃终止酶解反应即可；
步骤（2）中，所述纳升液相-高分辨质谱的参数为：使用 C18 色谱柱：75 μm × 2 cm、3μm，进行脱盐和富集，流速为 300 nL/min；流动相A为含2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱；进样量为1μL；高分辨率质谱的条件为：分析采用正离子模式，喷雾电压为1,800 V；离子传输毛细管温度为275℃；离子传输管传输效率设置为60%；初级质谱在分辨率为 60,000、采集范围为 350-1550 m/z，二次质谱采用快速扫描模式，顶部用于母离子选择的速度数据依赖模式、用于碎片的 HCD 模式以及碎片能量NCE 设置为 40%；
所述梯度洗脱的程序为：0-1 min，1%B→6%B；1-96min，6%B→22%B；96-113min，22%B→30%B；113-117min，30%B→95%B；117-120min，95%B；
所述特征多肽的检测离子对为：
。
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