TWI495642B

TWI495642B - 衍生自ｂ型肝炎病毒核蛋白精胺酸密集區之抗菌胜肽

Info

Publication number: TWI495642B
Application number: TW103103950A
Authority: TW
Inventors: Chiaho Shieh; heng li Chen; Pei Yi Su
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2013-02-06
Filing date: 2014-02-06
Publication date: 2015-08-11
Also published as: WO2014124047A1; US20190153042A1; EP2986115A4; TW201434855A; CN105101796B; US10752657B2; EP2986115A1; US10214564B2; WO2014124047A4; US20160002300A1; CN105101796A

Description

衍生自B型肝炎病毒核蛋白精胺酸密集區之抗菌胜肽

本發明係關於抗菌胜肽。

因廣泛使用傳統抗生素而造成病原體抗藥性提升，是全球所重視的問題，因此迫切需要研發更多有效的治療並克服抗藥性問題。抗菌胜肽(Antimicrobial peptides，AMP)是一種新的抗生素種類，具有新穎作用模式及卓越的治療效果。一般來說，抗菌胜肽含有10~50個胺基酸，整體帶有正電並具有雙極性結構(amphipathic structure)。大部份的抗菌胜肽可直接與細菌膜鍵結，並藉由使細胞膜瓦解或是攻擊細胞內的成分而致死。最重要的是，抗菌胜肽對抗藥性病原體是有效的，此種性質使得近幾十年作為新型抗生素之抗菌胜肽被大量研究。

先前未有文獻報導衍生自B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)之胜肽擁有抗菌活性。B型肝炎病毒核蛋白(21KDa)為病毒複製所必需，其在N端(第1至149個胺基酸殘基)包含一蛋白殼(capsid)組裝區域，且在C端(第150至183個胺基酸殘基)有一個精胺酸密集區(arginine-rich domain，ARD)(Birnbaum et al.(1990)J Virol 64：3319-3330；Nassal M(1992)J Virol 66：4107-4116)。ARD含有16個精胺酸，分成4個精胺酸密集群(ARD I、II、III、IV)，並具有鍵結至核苷酸之功能。當其鍵結至HBV前基因體RNA或是聚陰離子時，HBc可組裝為一穩定的蛋白殼。此外，ARD包含HBc核蛋白與粒子之核輸出與輸入的重要訊號。我們意外地發現，表現HBc1~183的大腸桿菌比表現HBc1~149的大腸桿菌其生長慢得多(此結果尚未發表)，而這現象之原因文獻上並沒有任何報告提出一個合理的解釋。

本發明之一目的係關於一醫藥組成物，包含：(a)一有效量之一單離胜肽，其中該單離胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)之精胺酸密集羧基端區域(arginine-rich carboxy-terminal region)，並表現一抗菌活性；以及(b)一藥學上可接受之載體。

本發明之另一目的係關於一醫藥組成物，包含：(a)一有效量之一單離胜肽，該單離胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白之一片段，該片段包含一個以上的精胺酸密集區(ARD)，係選自由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組：(i)HBc ARD I~IV；(ii)HBc ARD I~III；(iii)HBc ARD II~IV；其中該單離胜肽具有一抗菌活性；以及(b)一藥學上可接受之載體。

本發明另一目的係關於一種醫藥組成物包含一有效量之一單離胜肽，該單離胜肽包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白之C端區域的精胺酸密集序列，其中該單離胜肽之特徵在於具有一抗菌活性。

本發明又一目的係關於一種如前所述之醫藥組成物用於殺死及/或抑制一微生物之生長及/或增殖之用途，係經由前述醫藥組成物與該微生物接觸。

本發明又一目的係關於一種如前所述之醫藥組成物用於殺死及/或抑制一需要的個體內一微生物之生長及/或增殖之用途，或用於治療受一微生物感染的一個體。該個體可為感染金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )或克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumonia )。

後述較佳實施方式的說明與後附之圖式使得本案之目的變得顯而易見，本發明的變體與修飾可能有些許不同，但不脫離本發明所揭露新穎概念的精神與範疇。

後附圖式說明本發明一或多個實施方式，並且與說明書之說明一同用於解釋本發明原理。只要有可能，於所有圖中同樣的標號係關於一實施方式的相同或類似元件。

第1圖顯示為測試抗菌能力之不同HBc ARD的胺基酸序列。下方呈現不同的磷酸化胜肽與R替代成A的變異胜肽，係在HBc147~183之ARD-III與ARD-IV有總共4個Arg替代成Ala。

第2圖顯示HBc147~183抗綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌之殺傷動力學。細菌以HBc147~183(1x MBC)處理。於指定的時間點(每隔20分鐘)量測細菌的存活率。樣本以三重複方式量測。

第3圖顯示FITC-HBc147~183胜肽於細菌上的位置。將近10⁷ CFU的綠膿桿菌TCC9027、ATCC27853(A及B)、克雷伯氏肺炎桿菌ATCC13884(C)、大腸桿菌ATCC25922(D)、以及金黃色葡萄球菌ATCC19636、ATCC25923與ATCC 29213(E、F與G)與HBc147-183(0.5x MBC)一起培養1小時。細菌經清洗、固定並以DAPI染色(藍色)。影像以共焦顯微鏡拍攝。

第4圖顯示HBc147~183可能的殺菌機制。(A)綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌經由HBc147~183之SYTOX Green染劑攝入。每分鐘記錄以螢光測量的數據。(B)綠膿桿菌經由0.5、1與2μM的HBc147~183與HBc153~176之細胞膜穿透化劑量依賴曲線。2μM的蜜蜂毒素迷力挺(melittin)作為正控制組。樣本以三重複方式測量。(C)HBc147~183的DNA鍵結活性。HBc147~183與pSUPER質體DNA以指定的N/P比(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2及3)混合30分鐘。DNA的流動性以凝膠阻滯實驗評估。

第5圖顯示LPS與LPS抗體於HBc147~183之殺菌活性的劑量反應作用。綠膿桿菌及大腸桿菌來源的LPS及LPS抗體與綠膿桿菌及HBc147~183(1x MBC)混合3小時。細菌置於MH瓊脂上以測量存活率。樣本以三重複方式測量。

第6圖顯示ARD胜肽HBc147~183在數個不同的體外鍵結分析中，可鍵結至LPS與A脂。每個分析中，樣本以三重複方式量測。(A)草圖顯示胜肽LPS與胜肽A脂鍵結之體外分析，以及LPS/A脂的競爭分析。(B)恆定量的LPS與卵白素偶聯微球上漸增濃度的生物素化ARD HBc 147~183胜肽(0、0.004、0.02、0.1、0.5與2.5μM)一起培養。以LAL ELISA分析量測懸浮液中未鍵結的LPS。將EU值以一不含胜肽的控制組標準化。HBc147~183 8p(含有8個磷酸化的胺基酸)亦作為一控制組胜肽，因其與LPS的鍵結微弱。(C)微珠鍵結的LPS經由胰蛋白酶瓊脂糖消化隔夜而釋放至懸浮液中。以LAL ELISA分析懸浮液中自由的LPS。懸浮液中被釋放的LPS的量係與微珠上ARD胜肽HBc147~183的量成比例。(D)恆定量的A脂分別與增加濃度的HBc147~183以及HBc147~183 8P培養。以LAL ELISA試劑檢測懸浮液。這裡的結果與先前發現一致，係A脂可直接鍵結至HBc147~183。(E)LPS/A脂競爭分析。恆定量的LPS(1μg)塗布於ELISA盤上的每一孔，然後與一含有10nM恆定量的HBc147-183與增加濃度的A脂之反應混合物培養。A脂的增加以劑量依賴的方式降低盤上鍵結ARD胜肽HBc147~183的量。

第7圖顯示ARD胜肽HBc147~183之細胞毒性分析。(A)以10%人類紅血球細胞(RBC)測量HBc147~183與迷力挺之溶血活性。與迷力挺相較，未顯示HBc147~183具有溶血活性。(B)Huh7、HepG2、Vero以及HEK293細胞與不同濃度(0至100μM)的HBc147~183與迷力挺於37℃培養1小時。對細胞存活率的影響以MTT分析測定。迷力挺用於作為一正控制組。未檢測到HBc147~183對於細胞存活率的影響，而迷力挺則顯示強烈的細胞毒性。(C)腎臟細胞Vero與HEK293以CFSE染色並於第0天植入。第1天時細胞以不同濃度(0至100μM)的HBc147~183培養1小時。以流式細胞儀評估第1天及第3天的細胞增殖。與空的控制組(mock control)實驗相似，在Vero與HEK293細胞上未有顯著作用。於第7A~C圖的樣本係以三重複的方式分析。(D)利用3周大ICR公小鼠評估ARD胜肽HBc147~183的體內細胞毒性。小鼠腹膜內注射胜肽(10與20mg/體重kg)。所有的小鼠於7天後仍存活。

第8圖顯示體內ARD胜肽HBc147~183抗金黃色葡萄球菌的保護活性試驗。(A)3周大ICR公小鼠接受致命濃度的金黃色葡萄球菌ATCC 19636，然後分為5組不同的時間點。於每一時間點(n=5)收集、稀釋血液樣本，並將其覆於BHI瓊脂上。第二天計算細菌的數目。觀察到接種後2小時血液中有最大細菌量。數據以平均值±標準差(SD)表示。(B)如前所述以致命濃度的金黃色葡萄球菌培養的ICR小鼠，分別在接種後1、1.5或2小時以腹膜內注射ARD胜肽(10mg/kg)治療。每組包含10隻小鼠。以PBS治療的控制組小鼠全數(100%)於第一天死亡，而以ARD胜肽於接種後1、1.5或2小時治療的小鼠，7天後存活率分別為100%、70%與40%。(C)如前所述，ICR小鼠腹膜內接種金黃色葡萄球菌，隨即腹膜內注射PBS(n=5)或於接種後1小時腹膜內注射10mg/kg ARD胜肽(n=5)。接種後4小時，收集血液、肝臟及脾臟。肝臟及脾臟樣本經均質化、稀釋，並與血液樣本一同覆於BHI瓊脂上。於隔日計算細菌量。與用PBS治療的小鼠相較，ARD胜肽之治療能有效降低血液、肝臟及脾臟中的細菌量。(D)以PBS治療(空心的圓形、菱形與正方形)與ARD胜肽HBc147~183治療(實心的圓形、菱形與正方形)的小鼠血液、肝臟及胰臟樣本細菌量的量化比較。圖中的線表示細菌量的平均值。**表示於PBS與ARD胜肽HBc147~183治療結果之間的P<0.01(Mann-Whitney U test)。

第9圖顯示ARD胜肽抗克雷伯氏肺炎桿菌之體內抗菌活性的IVIS分析。(A)感染克雷伯氏肺炎桿菌的小鼠，在接種後1小時以PBS(n=5)或10mg/kg ARD胜肽(n=5)治療。接種後4小時，麻醉小鼠並攝影。細菌量顯示於生物螢光疊加之攝影影像中。假色影像(False color imaging)將強螢光處以紅色表示，中度螢光處以綠色表示，低螢光處以藍色與紫色表示。(B)總光通量以IVIS影像軟體量化。**表示於PBS與ARD胜肽HBc147~183治療結果之間的P<0.01(Mann-Whitney U test)。

第10圖為一顯示HBC ARD胜肽的抗菌活性表。

第11圖為一顯示ARD胜肽HBc147~183對於對黏菌素具有抗藥性與敏感性之綠膿桿菌與鮑氏不動桿菌之抗菌活性的表。

第12圖顯示人類B型肝炎病毒(HBV)核蛋白(HBc)之精胺酸密集區(ARD)的序列組合。HBc ARD區域從目前不同地域的病患中分離出來的不同血清型中，係為高度保守。

第13A~B圖顯示從靈長類、齧齒動物及禽類來源嗜肝病毒之HBc ARD區域的序列組合。HBc ARD序列在人類、絨毛猴(wooly monkey)、地松鼠、土撥鼠以及蝙蝠之間是高度保守的。在HBc ARD的精胺酸(正電荷)群集之次區域為ARD-I、ARD-II、ARD-III、以及ARD-IV。第13B圖進一步顯示在鴨、蒼鷺、鸚鵡、羅斯雁及雪雁之核蛋白C端也有4個群集正電荷胺基酸。不論靈長類、齧齒動物及禽類嗜肝病毒之間的序列歧異度與演化距離，可考慮這些齧齒動物(A)及禽類(B)來源嗜肝病毒之核蛋白之C端正電荷密集區域亦具有抗菌活性(參考表1)。

在以下實施例更具體地描述本發明，本發明中有眾多本領域具有通常知識者認為明顯的修飾與變體，因此實施例僅為例示。在此詳細說明本發明不同的實施方式。關於圖式，所有的圖中相同的數字表示相同的元件。本說明書及隨後的申請專利範圍所使用的描述，除非清楚指明，「一」及「該」的意思係包括複數的範圍。相同地，本說明書及隨後的請求項所使用的描述，除非清楚指明，「內」(in)包含「其內」(in)以及「其上」(on)的意思。此外，說明書中的標題或副標題可使讀者方便閱讀，不應影響本發明之範疇。另外，本說明書中的一些用詞更具體地定義如下。

定義

本說明書所使用的用詞，於本發明整體以及於該用詞所用的特定上下文中，皆具有本領域通常所習知的意義。用於描述本發明之一些用詞討論如下或是說明書中其他地方，以提供操作者於本發明描述之額外指引。為方便起見，一些用詞以強調方式顯示，例如以斜體或是引號標示。強調方式的使用不影響用詞的範圍與意義；一用詞的範圍與意義在相同的脈絡中是一樣的，無論該用詞是否以強調方式顯示。同一件事以不同的方式說明是可以被理解的。因此，本文一個以上的用詞皆可用替換的說法及同義詞，不論該用語是否有在此有被詳細描述。本說明書會提供一些用詞的同義詞。此處列舉一或多個同義詞並不排除其他同義詞的使用。本說明書所載之實施例，包括這裡任何討論之用詞的例子，皆僅為例示，不限制本發明或任何示例性用詞之範圍及意義。同樣地，本發明不侷限於本說明書中所載之實施方式。

除非另有定義，這裡所使用之所有的技術上與科學上的用詞，其意義與本領域及相關領域中通常知識者所通常知悉的意義相同。在有衝突的情況下，以本說明書所定義者為準。

本說明書所使用的「大約」、「大概」或是「約略」意思為所給數值或範圍之±20%以內，較佳為±10%以內，更佳為±5%以內。本說明書所給的數值為大致估計的，因此如果沒有特別說明，可推測含有「大約」、「大概」或是「約略」的意思。

抗微生物活性係關於殺死或抑制微生物之生長，該微生物例如細菌、真菌及/或原生動物。

如同這裡所使用的，「B型肝炎病毒核蛋白之精胺酸密集羧基端區域」指的是一高度保守的B型肝炎病毒核蛋白之精胺酸密集C端區域(第12圖與第13A、B圖)，且其特徵在於具有一抗菌活性。以禽類及/或齧齒目動物肝炎病毒科(Hepadnaviruses)為來源之精胺酸密集羧基端區域有相同的抗菌活性，是可以被理解的。B型肝炎病毒核蛋白之C端含有稱為ARD I~IV的四個精胺酸密集群或區域。每一精胺酸密集群或區(ARD)含有二或多個連續或很接近的精胺酸殘基(所述很接近的精胺酸殘基，例如被一或二個不同的胺基酸殘基隔開)。在一實施例中，每一ARD可含有2、3或4個連續的精胺酸殘基。

如同這裡所使用的，「衍生自HBc之一胺基酸序列」指的是「一胺基酸序列源自B型肝炎病毒核蛋白，並具有抗菌活性」。可能是HBc的一個片段，可能經修飾或未經修飾，且含有ARD並擁有抗菌活性。經修飾之HBc的一個片段包含但不限於聚乙烯二醇化(PEGylation)。

「二群」與「二重複」用詞是可替換的。用詞「二群的SPRRRR」意為「二重複SPRRRR」或「2SPRRRR」。

「雙極性結構」用詞意為一分子具有親水性及疏水性。

B型肝炎病毒分為四種主要的血清型(adr、adw、ayr、ayw)，係基於其包膜蛋白上的抗原決定位。用詞「血清型」、「血清變型」意為一種菌、病毒或不同個體之免疫細胞當中可區分的變體。

「保護基」用詞意為附於一有療效的蛋白質或胜肽之一功能基，以延長該蛋白質或胜肽的循環時間(circulatory time)。保護基包括但不限於一聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)。聚乙二醇化亦可提供疏水性蛋白質或胜肽之水溶性。

「治療」用詞意為施予一需要的個體一有效量之治療劑，使痊癒、減輕、緩解、補救、改善或預防該疾病、該疾病之症狀或疾病之傾向。這樣的個體可由健康照護專業人員基於任何適合診斷方法的結果判斷出。

「一有效量」意指一給予接受治療個體之活性劑，為達到治療效果所需要的量。有效劑量會有所不同，如同本領域中通常知識者所瞭解的，依據給藥途徑、賦形劑的使用、以及共同使用其他治療藥物的可能而有所不同。

美國健康與人類食品及藥品管理局(U.S.Department of Health and Human Services Food and Drug Administration)所公佈的「健康成人受試者於工業與治療性臨床試驗安全劑量審查準則(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)」揭露「一人類相等劑量」可自下式計算而得：人類相等劑量(HED)=動物劑量(mg/kg)×(動物體重(kg)/人類體重(kg))^0.33 。

以腹膜內注射舉例，若一體重為20g之小鼠的劑量為10mg/kg，則一人類的劑量可用10mg/kg×(0.02/患者體重)^0.33 計算。人類相等計量可能不同，取決於其他因素，例如給藥途徑。

關於大腸桿菌表現HBc1-183的上升非常少，且比大腸桿菌表現HBc1-149的上升慢得多，這是一個意外地發現與未解之謎。這顯示HBc 150-183會以某種方式減緩大腸桿菌的生長，且會急遽降低HBc 1-183蛋白質產生。本發明揭露HBc147-183之體外抗菌活性，可廣泛地抗不同種的細菌，包括多重抗藥性與對黏菌素(colistin；polymyxin E)有抗藥性之鮑氏不動桿菌(A.baumannii )。來自B型肝炎病毒核蛋白(HBc)精胺酸密集區(ARD)之抗菌胜肽主要由SPRRR重複組成，並除了可有效抗革蘭氏陽性菌以及革蘭氏陰性菌之外，亦可有效抗真菌。利用腹腔膿毒症小鼠模型，使小鼠面臨致命劑量之金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的情況下，進一步顯示ARD胜肽可有效保護所有的小鼠。ARD胜肽之治療亦造成受感染小鼠體內金黃色葡萄球菌(S.aureus )與克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumoniae )含菌量的顯著降低。對於殺菌活性的潛在機制進行研究，ARD胜肽在數個不同的鍵結分析中，顯示可直接鍵結至脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)的A脂基(lipid A moiety)。總體來說，因為在人類細胞以及動物模型中之高抗菌活性及非常低的細胞毒性，這些HBc ARD胜肽在未來可能具有治療潛力(Chen et al.“Identification of a Novel Antimicrobial Peptides from Human Hepatitis B Virus Core Protein Arginine-Rich Domain(ARD)”PLoS Pathog 9(6)：e1003425，以參考的方式整體併入本說明書中)。

本發明之另一目的係關於一醫藥組成物，包含：(a)一有效量之一單離胜肽，該單離胜肽包含B型肝炎病毒核蛋白之一片段，該片段包含一個以上的精胺酸密集區(ARD)，係選自由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組：(i)HBc ARD I~IV；(ii)HBc ARD I~III；或(iii)HBc ARD II~IV；其中該單離胜肽具有一抗菌活性；以及(b)一藥學上可接受之載體。

HBc可選自由哺乳動物的HBc以及禽類的HBc所組成之群組。哺乳動物的HBc包括但不限於人類B型肝炎病毒核蛋白(HBc)、絨毛猴HBc、地松鼠HBc、土撥鼠HBc、以及蝙蝠HBc。禽類的HBc包括但不限於鴨HBc，蒼鷺HBc，鸚鵡HBc，羅斯雁HBc和雪雁HBc。

本發明另一目的係關於一種醫藥組成物包含一有效量之一單離胜肽，該單離胜肽包含一衍生自B型肝炎病毒核蛋白之C端區域(HBc)的精胺酸密集序列，其中該單離胜肽之特徵在於具有一抗菌活性。

本發明又一目的係關於一種如前所述之醫藥組成物用於殺死及/或抑制一微生物之生長及/或增殖之用途，係經由將該醫藥組成物與該微生物接觸，該微生物可存在於一個體中。

本發明又一目的係關於一種如前所述之醫藥組成物用於殺死及/或抑制一需要的個體內一微生物之生長及/或增殖之用途，或用於治療受一微生物感染的一個體，該個體係感染金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )或克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumonia )。

本發明之該抗菌胜肽含有少數幾個疏水性胺基酸或無疏水性胺基酸，因此沒有雙極性結構。

本發明之一實施例，該單離胜肽包含Ser Pro Arg Arg Arg Arg(SPRRRR；SEQ ID NO：13)或Arg Arg Arg Ser(RRRS；SEQ ID NO：14)之胺基酸序列。

該單離胜肽可選擇性地包含二群SPRRRR(SEQ ID NO：13)，或三群SPRRR(SEQ ID NO：15)。該單離胜肽可包含RRRS(SEQ ID NO：14)。

本發明另一實施例，該單離胜肽包含至少2群位於RRRS(SEQ ID NO：14)上游之Pro Arg(脯胺酸精胺酸，PR)。至少二群之PR可相鄰，或是靠近RRRS序列並以幾個殘基隔開，例如以7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個胺基酸殘基隔開。

該單離胜肽之C端不含有RRGGRRRR序列(SEQ ID NO：17)。該單離胜肽可包含一保護基。

本發明之另一實施例中，該單離胜肽的C端具有一個半胱氨酸(cysteine)。

本發明之另一實施例中，該單離胜肽長度至少有19個胺基酸。

本發明另一實施例中，該單離胜肽之特徵在於具有一抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、及/或真菌之活性。

本發明另一實施例中，該單離胜肽包含一個以上的HBc精胺酸密集區，該HBc精胺酸密集區係選自由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組：(i)HBc ARD I、II、III及IV；(ii)HBc ARD I、II及III；(iii)HBc ARD II、III及IV。

該單離胜肽包含3或4個精胺酸密集區。在本發明另一實施例中，該單離胜肽表現一對於具有黏菌素抗藥性之鮑氏不動桿菌(A.baumannii )之抗菌活性。

在本發明之另一實施例中，該單離胜肽在C端不具有SQSRESQC(SEQ ID NO：16)序列，且特徵在於具有一抗革蘭氏陰性菌之活性。

該單離胜肽可選擇性地包含HBc ARD II~IV但不包含HBc ARD I，並表現出抗綠膿桿菌(P.aeruginosa )之活性，或是該單離胜肽可包括HBc ARD I~III但不包括HBc ARD IV，並表現出抗克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumonia )之活性。

在本發明另一實施例中，該單離胜肽表現以下特徵：i)抗菌活性降低的條件是存在於二群SPRRRR(SEQ ID NO：13)其中一群的Ser被磷酸化；及/或ii)抗菌活性喪失的條件在於各群SPRRR(SEQ ID NO：15)內的Ser被磷酸化。

該單離胜肽表現抗菌活性並對紅血球、腎臟細胞及/或肝臟細胞無細胞毒性。

在本發明另一實施例中，前述單離胜肽包含：i)該單離胜肽之C端部分ARD IV下游為Ser或Pro胺基酸殘基。該單離胜肽可進一步包含：ii)在每一ARD之間有Ser及/或Pro胺基酸殘基(即ARD I及II之間、ARD II及III之間、以及ARD III及IV之間)。

在本發明另一實施例中，該單離胜肽胺基酸序列中Ser殘基未被磷酸化。

該醫藥組成物之劑型為外用劑、噴霧劑、口服劑、全身性靜脈注射劑、腹膜內、眼內、或直腸給藥、或是吸入給藥。

在本發明另一實施例中，該單離胜肽包含選自於由SEQ ID NOs：1~10及其任何血清型所組成之群組的胺基酸序列。

該醫藥組成物中單離胜肽的量為有效殺死及/或抑制革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及/或真菌之生長及/或增殖。

實施例

根據本發明實施方式之示例性的儀器、器材、方法及其相關結果如後，且未意圖限制本發明之範疇。為使讀者方便閱讀實施例可能使用標題與副標題，但不應用於限制本發明之範疇。此外，這裡提出與揭露一些理論；然而無論該些理論對錯與否，本發明之範疇應以本發明實際操作所限制而無關於任何特定理論或動作的過程。

材料與方法

所有動物實驗的進行皆經中央研究院動物實驗管理小組核准(ASIACUC核准號12-02-322)。研究符合國家研究委員會於1996年所發布的實驗動物的照顧與使用指引之原則。

細菌分離

HBc ARD胜肽之抗菌活性以ATCC中大量的菌株測試，包括綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )Migula株(ATCC 27853，抗安比西林)、綠膿桿菌Migula株(ATCC 9027，抗安比西林)、克雷伯氏肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae )(ATCC 17593)、大腸桿菌(Escherichia coli )(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )亞種菌株(ATCC 25923，抗二甲氧苯青黴素)、金黃色葡萄球菌亞種菌株(ATCC 29213，抗二甲氧苯青黴素)、金黃色葡萄球菌亞種菌株(ATCC 19636，抗二甲氧苯青黴素)、以及白色念珠菌(Candida albicans )(ATCC 10231)。

臨床上分離綠膿桿菌(NHRI-01、NHRI-02以及NHRI-04)，係經由臺灣衛生研究院之臺灣抗生素耐藥性監控計劃取得。鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii )(ATCC 17989,ATCC 17978 CR,ATCC19606,ATCC 19606 CR,TCGH 45530以及TCGH 46709)由臺灣慈濟佛教醫院取得，臨床分離株(TCGH 45530 and TCGH 46709)以Vitek系統(Biomerieux Vitek,Inc.,MO,USA)辨識。當鮑氏不動桿菌對必倍西林(piperacillin)、必倍西林-他唑巴坦(piperacillin-tazobactam)、安比西林/舒巴克坦(ampicillin/sulbactam)、亞胺培南(imipenem)、頭孢他汀(ceftazidime)、建它黴素(gentamicin)、丁胺卡那黴素(amikacin)、四環素(tetracycline)、氯黴素(chloramphenicol)、塞普沙辛(ciprofloxacin)、以及cotrimoxazole有抗藥性時，定義為具有多重抗藥性。對黏菌素之敏感性以肉湯培養基稀釋法(broth-dilution method)測試，係依據臨床與實驗室標準協會之準則實行。

抗微生物活性

所有的胜肽購自曜鴻生物科技有限公司(臺北，臺灣)，同時提供胜肽特徵之資料，包括HPLC及分子量。抗微生物活性的測試與胜肽的一些修飾，詳細說明如後。細菌在米勒亨頓液態培養基(Mueller-Hinton broth，Difco)，37℃的環境中培養隔夜，在對數生長中期(mid-log phase)，細菌以磷酸鹽緩衝液(10mM磷酸鈉以及50mM氯化鈉，pH 7.2)稀釋至10⁶ 菌落形成單位(colony formation unit，CFU)/ml。將胜肽依序以相同的緩衝液稀釋。50μl的細菌與不同濃度的50μl胜肽混合，培養於37℃ 3小時且不搖晃。培養結束時，將細菌放置米勒亨頓培養盤(Mueller-Hinton broth agar plate)，培養於37℃隔夜以測量最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)。由MBC測試瓊脂培養基上最低胜肽濃度，顯示無細菌生長(零菌落)。所有的胜肽皆以三重複試驗。

為測試殺傷動力學(killing kinetics)，細菌與胜肽之準備如前所述。將50μl的細菌與對應於MBC濃度的50μl的胜肽混合，並於37℃下培養。培養期間，將細菌依次稀釋並置於米勒亨頓培養盤上作存活率測試。

共焦螢光顯微鏡

利用共焦螢光顯微鏡觀察胜肽的位置。細菌生長至對數生長中期時離心收集。將接近10⁷ CFU置於磷酸鹽緩衝溶液中再懸浮，該磷酸鹽緩衝溶液含有濃度為0.5x MBC之FITC標記的HBc 147-183。接著於37℃培養1小時，沖洗、固定細胞並固定於塗布聚離胺酸(poly-L-lysine)的載玻片(glass slide)上。在固定前於載玻片中加入含有4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)之ProLong Gold antifade reagent(Invitrogen公司)。已標記胜肽之位置以裝載100x油浸鏡頭之Olympus Ultraview共焦顯微鏡觀察。

SYTOX Green染劑攝入

簡短地說，將細菌(10⁷ CFU)與1μM SYTOX Green (Invitrogen公司)於黑暗中混合15分鐘。在加入胜肽至對應的個別MBC最終濃度後，在37℃利用485nm及520nm濾光片量測其激發波長與發散波長，以測量螢光強度。迷力挺(Melittin，Sigma公司)是蜂毒的一種主要毒素，用於作為一正控制組以提供最大通透性。

凝膠阻滯實驗(Gel retardation assay)

HBc 147~183之胺基氮(amino nitrogen，NH₃ ⁺ )與DNA之磷酸根(PO₄ ^- )的比例定義為N/P比。簡單地說，HBc 147~183與不同N/P比(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3及4)的pSUPER質體DNA一起在37℃培養30分鐘。pSUPER質體DNA的流動性以1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

ARD胜肽與LPS/LipidA之體外鍵結分析

數種LPS胜肽或是A脂胜肽鍵結分析以下列步驟操作：

1)與卵白素(Streptavidin)結合的微珠(Dynabeads MyOne Streptavidin T1，Invitrogen公司)以綠膿桿菌LPS(Sigma公司)於37℃阻隔1.5小時。以PBST(含有0.1%(w/v)Tween-20之PBS，pH 7.4)沖洗之後，將含有250pmol等份的卵白素結合微珠與一反應混合物於4℃培養隔夜。該反應混合物為將放大的生物素標記的胜肽HBc147-183(0、0.004、0.02、0.1、0.5與2.5μM)以及5μg/ml的綠膿桿菌LPS(Sigma公司)或200μg/ml大腸桿菌A脂(Sigma公司)，在37℃混合3小時。於4℃培養隔夜之後，懸浮液中LPS(或A脂)降低的量利用ELISA讀取器(Molecular Devices公司)以美洲鱟試驗法(Limulus Amebocyte Lysate，LAL)(Charles River Endosafe公司)測試。LPS的量(EU/ml)係依據原廠的內毒素標準比對曲線計算。

2)為直接量測放大的LPS鍵結至胜肽塗布微珠上放大的HBc147-183胜肽的數量，將微珠以PBST沖洗三次並以100μl含有0.15單位的胰蛋白酶瓊脂糖(Sigma公司)之PBS於37℃培養隔夜。經胰蛋白酶的消化作用後，收集懸浮液中胰蛋白酶釋放的LPS，並以美洲鱟試驗法分析。在另一LPS分析方法：Endosafe-PTS Cartridges(Charles River Laboratories公司)得到相似的結果。

3)為製作LPS/A脂競爭分析，1μg的LPS塗布於高鍵結ELISA培養盤(Corning)上於4℃隔夜。將LPS塗布培養盤以PBST清洗並以含有5%BSA的PBST於37℃阻隔1小時。清洗之後，將HBc 147-183(10nM)與不同濃度的大腸桿菌A脂(0至10μg/ml)混合置入培養盤的每一孔(well)中於37℃培養1小時。鍵結於培養盤上的HBc 147-183以卵白素偶聯HRP(稀釋比1：10000)於37℃ 1小時測量。每孔加入TMB受質以顯色。測量波長為450nm之吸收度，並以波長655nm為參考波長。

溶血活性

胜肽之溶血活性以溶血抗人類紅血球細胞(hemolysis against human red blood cells，hRBCs)評估。人類血液取自於含有EDTA的試管，並以450g離心10分鐘。將沉澱物以PBS清洗三次，並製成10% hRBCs溶液。hRBCs溶液與連續稀釋之含有胜肽的PBS緩衝液混合，然後反應混合物於37℃培養1小時。以450g離心10分鐘後，溶血之百分比以懸浮液之波長405nm的吸光度評估。空白組與100%溶血組係分別為PBS緩衝液以及加入1% Triton X-100之溶液。

細胞毒性

細胞毒性係以HepG2、Huh7、HEK293以及Vero細胞並經由MTT分析評估。細胞以10⁴ 個細胞/孔之密度植入96孔培養盤，並將連續稀釋之胜肽加入每孔內。PBS用於作為負控制組，迷力挺(melittin)用於作為正控制組。1小時的培養之後，培養液換成含有10% MTT溶液(PROMEGA^TM )的新鮮培養液，且將培養盤置於37℃ 5% CO₂ 的環境下培養4小時。利用ELISA 讀取器(BIO-RAD^TM model 680)讀取波長為595nm之吸收值。

CFSE細胞增殖試驗

為建立CFSE細胞增殖試驗，293個細胞(來源為人類腎臟)以及非洲綠猴腎(Vero)細胞(來源為猴腎臟)於PBS中再懸浮，至密度為10⁶ 個細胞/ml之最終濃度，並以10μM CFSE染劑(CELLTRACE^TM CFSE細胞增殖套組，INVITROGEN^TM )於37℃培養10分鐘。為停止染色，加入冰的培養液並於冰上培養5分鐘。收集被標記的細胞並以含有10%FBS新鮮培養液清洗三次，以3.3×10⁵ 個細胞/孔的密度植入六孔培養盤中。20小時後，去除培養液並培養於含有5、25與100μM HBc 147-183之新鮮培養液中1小時(在加入ARD胜肽至HepG2細胞之培養液中10分鐘後，標記FITC之ARD胜肽大量內化)。48小時後，收集細胞並以流式細胞儀分析(FACSCanto，BD Bioscience公司)。

動物體內試驗

3週大ICR公小鼠(19至21g)購自BioLASCO公司(臺灣)。於腦心浸出物培養液(BHI broth，Difco公司)中培養隔夜之細菌，於新鮮腦心浸出物培養液繼代培養至對數增殖期(log phase)。接種物以腦心浸出物培養液稀釋至所指定的密度。為準確測試ARD胜肽之體內毒性，ICR公小鼠分別接受腹膜內接種(i.p.)10與20mg/kg含有HBc147-183的PBS溶液。每組有5隻小鼠。胜肽注射後，注射後7天內每天記錄小鼠死亡的數量。為測試ARD胜肽的體內抗菌活性，所有的小鼠皆以腹膜內接種含有金黃色葡萄球菌ATCC 19636(4 x 10⁶ CFU/mouse)之腦心浸出物培養液。於接種後1、1.5以及2小時給予胜肽HBc147-183(10mg/kg)。於接種後1小時給予PBS(10ml/kg)作為控制組。每組有10隻小鼠。接種後7天內每天記錄小鼠的死亡率。另外實驗細菌含量，小鼠以腹膜內接種含有金黃色葡萄球菌ATCC 19636(10⁶ CFU/mouse)之腦心浸出物培養液。所有的小鼠在接種後1小時給予胜肽HBc 147-183(10mg/kg)或是PBS(10mg/kg)控制組，並於接種後4小時犧牲。血液樣本(200μl)先與100mM EDTA(10μl)混合，再以PBS(無Ca²⁺ 及Mg²⁺ )稀釋20倍。肝臟及脾臟樣本(0.1g)於滅菌的PBS中均質化(500μl)。樣本稀釋約100倍並置於腦心浸出物瓊脂上，以記錄其菌落數。

為測試ARD胜肽在體內對於革蘭氏陰性菌的抗菌活性，小鼠接種克雷伯氏肺炎桿菌Xen39(10⁷ cfu/mouse)(Caliper LifeSciences公司)，是一株含有一光桿菌(Photorhabdus luminescens )luxABCDE 操縱子修飾的基因工程菌。接種1小時後，小鼠接受10ml/kg的PBS(n=5)或是10mg/kg的ARD胜肽(n=5)。接種後4小時拍攝體內影像。先麻醉小鼠並移至活體分子影像系統(IVIS spectrum)，測量螢光1分鐘以下。影像系統測量光子的數量並轉換數據為假色影像(false color image)，假色影像中將強螢光區域以紅色顯示，中度螢光區域以黃色及綠色顯示，微弱螢光區域以藍色顯示。生物螢光的增加表示細菌數減少。這些影像是攝影影像與生物螢光利用電腦產生的色階疊合而成。感興趣區域(ROI)的總光通量(RLU)以活體分子影像系統軟體量化。

結果 HBc胜肽的體外抗微生物活性

如第1及10圖所示，HBc147~183表現出廣泛的抗革蘭氏陰性菌(綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌以及大腸桿菌)、革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)以及真菌(白色念珠菌)的活性。在這些測試菌株中，綠膿桿菌與克雷伯氏肺炎桿菌對此胜肽最為敏感。對於綠膿桿菌與克雷伯氏肺炎桿菌來說，HBc147-183的MBCs低於4μM，而大腸桿菌與金黃色葡萄球菌之MBCs約為4μM。白色念珠菌是對此胜肽最不敏感的(MBCs約為8μM)。

為進一步指出具有抗菌活性的序列，合成不同長度的胜肽(第1圖)並如前述方法測試。胜肽HBc 147-175，於C端刪除最後8個胺基酸，儘管它喪失了抗金黃色葡萄球菌與白色念珠菌的活性，但仍維持強烈的抗革蘭氏陰性菌活性。胜肽ARD I~II(HBc147~159)或ARD III~IV(HBc164~176與HBc162~175)未具有抗所有測試的細菌與真菌之活性。相對地，所有含有ARD II~IV(HBc153~176、HBc157~176、HBc153~175、HBc155~175及HBc157~175)以及ARD I~III(HBc147~167)的胜肽顯示分別具有抗綠膿桿菌與克雷伯氏肺炎桿菌的強烈活性，雖然它們抗大腸桿菌之活性微弱(第10圖)。因此，胜肽ARD II~IV與ARD I~III是必要的且能有效抗綠膿桿菌與克雷伯氏肺炎桿菌。

ARD胜肽之正電荷對於殺菌活性是具有關鍵性

絲胺酸殘基S155、S162、S170、S176及S181之磷酸化研究顯示絲胺酸磷酸化通常會使抗菌活性減弱。我們發現所有的HBc胜肽一旦磷酸化就會喪失對白色念珠菌的抗菌活性(第11圖)。對細菌來說，在S181磷酸化未有任何作用，但在S155、S162、S170、及S176磷酸化會減弱其抗菌能力。HBc155p及HBc176p之MBCs降至8μM，HBc162p及HBc170p則降至32μM。當S155、S162及S170同時磷酸化(HBc155p162p170p)時，抗菌活性則完全喪失(>32μM)。此結果顯示，除了S181之外，絲胺酸磷酸化通常不利於HBc ARD之抗菌活性。為確認精胺酸殘基對於殺菌活性之重要性，我們合成並測試胜肽HBc147-183-III-IV AA，係於每個ARD III與ARD IV具有二個R替換成A的變異。與磷酸化HBc ARD胜肽相似，與HBc147-183相較，HBc147-183-III-IV AA之MBC顯著地提升，這個結果指出精胺酸殘基對於抗菌活性是必要的。

抗藥性

測試HBc147-183對於對黏菌素有抗藥性之綠膿桿菌與鮑氏不動桿菌之抗菌活性。如第11圖所示，HBc147~183於4μM可殺死對黏菌素敏感之綠膿桿菌，而對黏菌素有抗藥性之綠膿桿菌對HBc147~183有交叉抗性(MBC>16μM)。與綠膿桿菌相反，HBc147~183對於抗黏菌素敏感綠膿桿菌與抗對黏菌素有抗藥性之鮑氏不動桿菌之MBCs有著在0.5~1μM的相似範圍。這個結果顯示，我們的ARD胜肽HBc147~183對黏菌素有抗藥性之鮑氏不動桿菌未有交叉抗性。

殺傷動力學

依時間之細菌存活率在試驗菌株(綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌)以依據MBC濃度之HBc147~183處理之後評估(第2圖)。這個結果顯示綠膿桿菌在添加HBc147-183(2μM)20分鐘內即被殺死。雖然克雷伯氏肺炎桿菌及大腸桿菌屬於革蘭氏陰性菌，其於180分鐘內被4μM之HBc147~183殺死。而金黃色葡萄球菌，可發現其於120分鐘內被4μM HBc147~183殺死。

HBc147~183之定位與機制

綠膿桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌以FITC標記的HBc147~183依據0.5x MBC處理，HBc147~183之位置利用共焦螢光顯微鏡觀察(第3圖)。在胜肽治療下，綠膿桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌與大腸桿菌以螢光顯示為空的桿狀物，清楚定義細菌的表面，表示HBc147~183累積在細胞膜上(第3A~D圖)。為更了解HBc胜肽對細胞膜的作用，做SYTOX Green攝入分析。綠膿桿菌在添加2μM HBc147~183的情況下，引起細胞膜顯著的穿透化(第4A圖)。雖然4μM的HBc147~183也會累積在克雷伯氏肺炎桿菌與大腸桿菌的細胞膜上，但其未能造成金黃色葡萄球菌的細胞膜穿透化。如同HBc147~183對於綠膿桿菌的殺菌能力，HBc153~176在10分鐘內以劑量依賴的方式造成相同的細胞膜穿透化(第4B圖)。這結果表示HBc胜肽對綠膿桿菌的殺菌作用是直接經由一個與殺傷動力學相似之快速動力的細胞膜透化(第2圖)。另一方面，發現HBc147~183穿過金黃色葡萄球菌的細胞膜，並位於細胞質中(第3E~G圖)。為研究HBc 147~183與DNA潛在的交互作用，將HBc147~183與pSUPER質體DNA以不同的N/P比(如材料與方法中所述)混合，並以膠體電泳分析(第4C圖)。結果顯示當胜肽/DNA比例升高時DNA的流動性降低，且在比例為1時質體DNA完全滯留，表示HBc147~183對質體DNA有強烈的鍵結活性。總體來說，HBc147~183於革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌的殺菌機制可能完全不一樣。

HBc147~183直接鍵結至LPS

為評估革蘭氏陰性菌之LPS是否可作為一有潛力的HBc147~183標靶，將綠膿桿菌或大腸桿菌(Sigma公司)的LPS(0.05至50μg/ml)分別與綠膿桿菌及2μM HBc147-183培養3小時。結果顯示，HBc147~183之殺菌能力因為添加50μg/ml之其中一種LPS而顯著降低(第5圖)。此外，HBc147~183優先鍵結至綠膿桿菌的LPS，而不是大腸桿菌的LPS。然而，添加抗LPS多株抗體(Genetex Co.公司)不能有效中和HBc147~183的殺菌活性(第5圖)。這表示HBc147~183不只與LPS鍵結，也與細胞膜上其他標靶分子鍵結。或者，HBc147~183與這裡使用的抗LPS多株抗體可主要鍵結至LPS上2個不同的抗原決定位。

如第6A圖所示，利用不同的鍵結分析研究體外HBc147~183與LPS(或A脂基；Lipid A moiety)之間潛在的交互作用。第6B圖中，當HBc147~183鍵結至卵白素偶聯之Dynabeads的量上升，並維持培養基中LPS的量時，漸增的LPS量來自懸浮液中減少的量。HBc147~183 8p係具有8個ser/thr磷酸化，用於作為控制組胜肽。相似的結果以另一個LPS測試方法得到：Endosafe-PTS Cartridges(Charles River Laboratories公司)。在第6C圖，經由ARD胜肽HBc147~183之胰蛋白酶瓊脂糖消化法自微珠分離微珠所捕捉的LPS。釋放的LPS量以LAL測試測量(如材料與方法所述)。LPS主要含有多醣及A脂基。為評估ARD胜肽是否可直接鍵結至A脂基，我們在第6D圖中經由與第6B圖相似的方法，測試A脂基與ARD胜肽之間的鍵結。如所預期的，微珠上的HBc147-183增加導致留存在懸浮液中的A脂數量減少。這個微球上ARD胜肽與懸浮液中A脂之間的負相關性(第6D圖)明顯地與先前在微球上ARD胜肽HBc147~183與LPS之間所發現的相似(第6B圖)。為直接表示ARD胜肽可鍵結至LPS的A脂基，我們做了一個A脂與LPS的競爭實驗(第6E圖)。塗布LPS的ELISA培養盤內培養定量的HBc147-183(10nM)，該HBc147~183已預先與不同濃度的大腸桿菌A脂(0至10μg/ml)混合。在大範圍的沖洗後，與培養盤結合的(即與LPS結合)生物素化胜肽HBc147~183以卵白素偶聯HRP檢測，接著加入TMB受質與顯色劑。HBc147-183鍵結至LPS經由增加A脂的濃度而顯著降低(第6E圖)。此結果支持LPS的A脂基可作為ARD胜肽HBc147~183的直接標靶。

細胞毒性

為評估HBc胜肽的細胞毒性，我們測量HBc147~183的溶血活性。與迷力挺控制組相較，在培養1小時後未檢測出HBc147~183有溶血性(第7A圖)。此外，利用MTT分析評估HBc147~183對於人類肝癌細胞(Huh 7細胞與HepG2細胞)以及腎臟細胞(Vero細胞與HEK293細胞)之細胞毒性。以低劑量(3.125μM)迷力挺處理之細胞的存活率顯著降低。相反地，HBc147~183對於人類肝癌細胞(Huh 7細胞與HepG2細胞)以及腎臟細胞(Vero細胞與HEK293細胞)，只有在100μM的劑量時具有低程度的細胞毒性(第7B圖)。做CFSE細胞增殖分析以評估HBc147-183於Vero與HEK293腎臟細胞增殖的影響。與第1日相較，以HBc147-183(5、25與100μM)處理過細胞的CFSE強度降低至與第3日空控制組(mock control)相同(第7C圖)，顯示ARD 胜肽HBc147~183對於細胞增殖未有顯著影響。

動物實驗

為達到實驗上的細菌感染，我們使小鼠腹膜內接種金黃色葡萄球菌ATCC 19636(4x10⁶ cfu/mouse)。評估小鼠在接種後1、2、4及6小時血液中的細菌量。如第8A圖所示，細菌快速地自腹腔移至血液。在2小時以內，血液中的細菌數達到最大值(10⁶ cfu/ml)。之後，血液中的細菌數自發性地漸漸降低。為從自然清除細菌的作用中區別ARD胜肽的效果，我們測試ARD胜肽在接種後2小時內，於體內的保護活性。簡單地說，小鼠以腹膜內接種金黃色葡萄球菌ATCC 19636並於接種後1、1.5、2小時分別接受單一劑10ml/kg PBS或是單一劑10mg/kg ARD胜肽。以PBS處理的小鼠(n=10)於接種後24小時內死亡(第8B圖)。相反地，接種後1小時施予ARD胜肽(10mg/kg)在第7天可有效保護所有的小鼠免於死亡。當我們在接種後1.5小時(n=10)與2小時(n=10)施予ARD胜肽，存活率分別降至70%與40%。除了以死亡作為ARD胜肽抗菌活性的替代指標之外，我們也直接評估受感染小鼠體內ARD胜肽對於細菌量的影響(第8C圖)。小鼠如先前方法接種金黃色葡萄球菌，並於接種後1小時以10ml/kg PBS(n=5)或10mg/kg ARD胜肽(n=5)處理。接種後4小時，控制組的小鼠於血液、肝臟、及脾臟樣本之細菌量在10⁶ cfu/ml的範圍(第8C及8D圖)。施予ARD胜肽的小鼠於血液、肝臟、及脾臟樣本之細菌量(~10⁴ cfu/ml)明顯比PBS控制組小鼠低100倍(P <0.01)。除了金黃色葡萄球菌之外，我們也以IVIS影像系統測試了ARD胜肽於體內對克雷伯氏肺炎桿菌的抗菌活性。與金黃色葡萄球菌的細菌量變化相似，接種克雷伯氏肺炎桿菌Xen39之小鼠的生物螢光，於接種後2小時達到最大值(數據未顯示)。接著我們在接種後1小時分別以PBS或ARD胜肽處理感染克雷伯氏肺炎桿菌Xen的小鼠。結果顯示以ARD胜肽處理的小鼠，其生物螢光非常微弱，而PBS控制組的小鼠顯示更強的生物螢光(第9A圖)。在所有以PBS處理與以ARD 胜肽處理之RLU值具有顯著差異(P <0.01)(第9B圖)。綜上所述，實驗結果顯示HBc147~183具有顯著的體內抗菌活性。表1顯示人類HBc ARD與土撥鼠HBc ARD抗革蘭氏陰性菌與革蘭氏陽性菌之最小殺菌濃度比較。

本發明關於一種分離自HBc之C端區域的新穎抗菌胜肽(HBc147~183)。基於該抗菌胜肽資料庫之電腦軟體(Wang et al.(2004)Nucleic Acids Res 32：D590-592)預測HBc147~183不利於作為一抗菌胜肽，因其疏水性胺基酸的含量非常低。然而，我們驚訝地發現，HBc147~183顯示出廣泛的抗菌活性，與電腦所預測的相反。當對黏菌素具有抗藥性的綠膿桿菌表現對ARD胜肽HBc147~183的交互抗性，我們發現HBc147~183對所有測試的具有黏菌素抗藥性的鮑氏不動桿菌，具有強烈抗菌活性(MBC=0.5~1μm)。我們的ARD胜肽可鍵結至大腸桿菌之A脂與綠膿桿菌之LPS(第6圖)。全長的HBc147~183(ARD I~IV)對所測試的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌具有抗性；較短長度的ARD II-IV(HBc153-176)以及ARD I-III(HBc147-167)，分別顯示對綠膿桿菌以及克雷伯氏肺炎桿菌之革蘭氏陰性菌(但不包括大腸桿菌)具有優異抗性。

與其他AMPs比較

HBc蛋白之ARD區域(HBc147~183)顯現出新穎且廣泛的殺菌活性是令人驚訝的。此胜肽與數個文獻中的抗菌胜肽有一些相似度，例如魚精蛋白(PRRRRSSSRPVRRRRRPRVSRRRRRRGGRRRR；SEQ ID NO：11)與蠅肽(drosocin，GKPRPYSPRPTSHPRPIRV；SEQ ID NO：12)。輻射擴散分析顯示單一精胺酸密集區(RRRR)對抗菌活性是足夠的，特別是抗革蘭氏陰性菌(Lesmes et al.(2009)Peptides 30：2150-2160)。不像魚精蛋白，HBc147-183之精胺酸密集區，例如ARD I-II與ARD III-IV，不具有抗菌活性。此外，抗菌胜肽資料庫的序列組合顯示HBc153~176與蠅肽共享44%的胺基酸序列一致性，蠅肽是一個自果蠅分離出來的脯胺酸密集胜肽。然而，除了綠膿桿菌，蠅肽有著優越的抗多數革蘭氏陰性菌的活性。蠅肽明顯地係經由非膜溶解機制殺死細菌。HBc ARD是一個具有廣泛殺菌活性的新穎胜肽，與其它已知精胺酸密集抗菌胜肽不同。魚精蛋白含有RRGGRRRR(SEQ ID NO：17)，但HBc147~183在HBc的C端是含有SQSRESQC(SEQ ID NO：16)。

抗菌機制

結果顯示革蘭氏陰性菌上HBc147~183之膜定位(第3圖)，綠膿桿菌或大腸桿菌之LPS的中和活性(第5圖)，表示HBc147~183具有強烈鍵結至LPS之活性。這個結果揭露HBc147~183直接鍵結至LPS及A脂(第6B、6C與6D圖)。而且，LPS的A脂基表現為HBc147~183的一主要直接標靶(第6E圖)。然而，LPS抗體與綠膿桿菌、HBc147~183之培養未中和HBc ARD胜肽之殺菌活性(第5圖)。這個負面結果之一解釋為HBc147~183可不僅鍵結至LPS，亦可鍵結至其他細菌膜上的分子。我們在發現綠膿桿菌比大腸桿菌中的LPS有較好的中和效果(第5圖)。HBc147~183與綠膿桿菌的LPS鍵結的優先度係關於其較強烈的抗綠膿桿菌活性。

HBc147~183對綠膿桿菌的作用模式，基於快速動力學(第2圖)及其膜定位(第3A及3B圖)的結果，係關於細胞膜穿透化。這個推測也被SYTOX Green攝入實驗的結果支持(第4A圖)。如同綠膿桿菌，HBc147~183也累積於克雷伯氏肺炎桿菌與大腸桿菌的細胞膜上。然而，克雷伯氏肺炎桿菌與大腸桿菌的殺傷動力學及SYTOX Green攝入實驗並不支持細胞膜透化機制的結果。ARD胜肽除了經由細胞膜透化，是如何殺死細菌，仍待進一步的研究。

在革蘭氏陽性菌的例子中，我們發現HBc147~183並未累積於其細胞膜上(第3圖)。但可以在沒有任何明顯的細胞膜穿透化的情況下，進入金黃色葡萄球菌(第4A圖)。除了LPS之外，HBc147~183也可以強力鍵結至質體DNA(第4C圖)。總而言之，HBc147~183對於革蘭氏陽性菌之殺菌機制較相似於Buforin II，Buforin II為一種習知經由穿透細菌細胞膜後，鍵結至DNA與RNA以殺菌的胜肽。

雖然HBc147~183可穿透Huh 7與HepG2細胞的細胞膜(數據未顯示)，我們在MTT分析(第7B圖)與增殖分析(第7C圖)中發現，HBc147~183對於Huh 7與HepG2細胞、腎臟細胞Vero與HEK293未有顯著的細胞毒性，即使是在高胜肽濃度(100μM)的情況下。與溶血分析的結果(第7A圖)綜合來看，細胞培養實驗中HBc147~183比迷力挺更安全。動物模型實驗顯示ARD胜肽對於ICR小鼠經由腹腔注射20mg/kg的劑量下，未有明顯毒性(第7D圖)。在如10mg/kg的低劑量下，ARD胜肽的治療可保護小鼠免於死亡(第8B圖)。相反地，PBS控制組的小鼠在接種細菌之後很快就死亡。除了膿毒症存活模型(sepsis survival model)，ARD胜肽的治療(10mg/kg)亦可造成金黃色葡萄球菌與克雷伯氏肺炎桿菌的含菌量顯著降低，而PBS控制組的小鼠表現高細菌量(第8C~D圖與第9圖)。這個結果表示HBc ARD胜肽之體內抗菌潛力。

<110> 中央研究院

<120> 衍生自B型肝炎病毒核蛋白精胺酸密集區之抗菌胜肽

<130> 10011-023PCT

<150> US 61/761,650

<151> 2013-02-06

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

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<213> 人類B型肝炎病毒

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<213> 絨毛猴B型肝炎病毒

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<213> 地松鼠B型肝炎病毒

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<213> 土撥鼠B型肝炎病毒

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<213> 蝙蝠B型肝炎病毒

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<213> 鴨B型肝炎病毒

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<213> 蒼鷺B型肝炎病毒

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<213> 鸚鵡B型肝炎病毒

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<213> 羅斯雁B型肝炎病毒

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<213> 雪雁B型肝炎病毒

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<213> 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)

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<213> 黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)

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<213> B型肝炎病毒

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<213> 虹鱒(Oncorhynchus mykiss)

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Claims

一種醫藥組成物用於製備抗菌藥物之用途，該醫藥組成物包含：(a)一有效量之一單離胜肽，其中該單離胜肽包含三或四個B型肝炎病毒核蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)之精胺酸密集羧基端區域(arginine-rich carboxy-terminal region)，並表現一抗菌活性；以及(b)一藥學上可接受之載體。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含Ser Pro Arg Arg Arg Arg(SPRRRR；SEQ ID NO：13)或Arg Arg Arg Ser(RRRS；SEQ ID NO：14)之胺基酸序列。
如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該單離胜肽包含二重複SPRRRR(SEQ ID NO：13)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含三群(clusters)的SPRRR(SEQ ID NO：15)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含RRRS(SEQ ID NO：14)，且包含二群位於RRRS(SEQ ID NO：14)上游之脯胺酸精胺酸(proline Arginine，PR)序列。
如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該單離胜肽之C端不包含RRGGRRRR序列(SEQ ID NO：17)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽之C端具有一半胱胺酸(cysteine，C)。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽不包含雙極性結構。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含SEQ ID NO：1 之胺基酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽的特徵在於具有一抗革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、及/或真菌之活性。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含一保護基。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽包含之三或四個精胺酸密集區，係選自於由下列(i)、(ii)及(iii)所組成之群組：(i)HBc ARD I、II、III及IV；(ii)HBc ARD I、II及III；(iii)HBc ARD II、III及IV。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽表現一對於具有黏菌素抗藥性之鮑氏不動桿菌(A.baumannii)之抗菌活性。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該單離胜肽之C端未有SQSRESQC(SEQ ID NO：16)之序列，且特徵在於具有抗革蘭氏陰性菌之活性。
如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該單離胜肽包含HBc ARD II-IV但不包含HBc ARD I，並表現出抗綠膿桿菌(P.aeruginosa )之活性。
如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該單離胜肽包含HBc ARD I-III但不包含HBc ARD IV，並表現出抗克雷伯氏肺炎桿菌(K.pneumonia )之活性。
如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之用途，其中該醫藥組成物之劑型為外用劑、噴霧劑、口服劑、全身性靜脈注射劑、腹膜內、眼內、或直腸給藥、或是吸入給藥。
如申請專利範圍第1至16項中任一項所述之用途，係用於殺死及/或抑制一需要的個體內一微生物之生長及/或增殖，或用於治療受一微生物感染的一個體。