ES2934714T3 - Polipéptidos de lisina activos contra bacterias Gram-negativas - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona métodos y composiciones útiles para la mejora profiláctica y terapéutica y el tratamiento de infecciones provocadas por bacterias Gram negativas, incluida Pseudomonas aeruginosa. La divulgación proporciona además composiciones y métodos para incorporar y utilizar polipéptidos de lisina de la presente divulgación para aumentar la eficacia de los antibióticos generalmente adecuados para el tratamiento de infecciones bacterianas Gram negativas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos de lisina activos contra bacterias Gram-negativas

Antecedentes de la divulgación

Campo técnico

La presente divulgación se refiere en general a la profilaxis y al tratamiento de infecciones causadas por bacterias Gram-negativas. Más específicamente, la divulgación se refiere a agentes y composiciones capaces de prevenir y/o inhibir el crecimiento de bacterias Gram-negativas.

Descripción de la técnica relacionada

Los patógenos gramnegativos representan una amenaza significativa con la evolución de la resistencia a casi todos los fármacos considerados anteriormente para el tratamiento. De particular preocupación son las infecciones asociadas a la atención médica que involucran al patógeno Gram-negativo Pseudomonas aeruginosa que pueden desarrollar resistencia a numerosos agentes antimicrobianos tales como los antibióticos, incluidos, pero sin limitarse a, ciprofloxacina, levofloxacina, gentamicina, cefepima, imipenemo, meropenemo (Lister et al. Clin Microbiol Rev. 4: 582-610 (2009)). Además de la resistencia a fármacos individuales, la prevalencia emergente y creciente de cepas resistentes a múltiples fármacos combinada con la escasez de nuevos antibióticos es motivo de alarma. Claramente, se necesitan tratamientos novedosos y efectivos para las infecciones por Gram-negativos para hacer frente a la amenaza de la resistencia a múltiples fármacos. Un enfoque muy prometedor se basa en el uso de peptidoglucano hidrolasas bacterianas, o PGH, que incluyen lisinas, autolisinas y algunas bacteriocinas para degradar un componente estructural principal de la pared celular bacteriana (es decir, peptidoglicano). Las PGH incluyen glucosaminidasas y muramidasas (es decir, lisozimas), que escinden el esqueleto de azúcar del peptidoglicano, endopeptidasas, que escinden el tallo peptídico o puente cruzado, o L-alanina amidasas, que escinden el enlace amida que conecta los radicales azúcar y peptídico (Bush K., Rec Sci Tech. (1):43-56 (2012); Reith J. et al. Aplicación Microbiol Biotechnol. (1):1-11 (2011)).

El trabajo de los últimos 14 años ha demostrado que las PGH se pueden expresar de forma recombinante, purificar y añadir de forma exógena a bacterias sensibles para una bacteriólisis rápida. Este fenómeno de "lisis desde el exterior" es la base de una estrategia antibacteriana eficaz actualmente en desarrollo para varios patógenos bacterianos Gram-positivos. Sin embargo, en comparación con las bacterias Gram-positivas, el uso de lisinas para el tratamiento de infecciones bacterianas Gram-negativas se ha visto limitado debido a la existencia de una capa de membrana adicional dentro de la pared celular bacteriana. Esta capa adicional, conocida como membrana externa (ME), dificulta el acceso de las lisinas a sus sustratos de peptidoglicano en la pared celular. No obstante, recientemente, se ha informado de que varias PGH de bacterias Gram-negativas y bacteriófagos asociados tienen cierta capacidad innata para destruir bacterias Gram-negativas. Lood et al., Antimicrob Agents Chemother, 4: 1983­ 91, (2015)). Para las lisinas Gram-negativas bactericidas, la actividad puede depender de los dominios alfa helicoidales N- y C-terminales cargados positivamente (y anfipáticos) en las secuencias nativas, que permiten la unión a la ME aniónica y efectúan la translocación al peptidoglicano subyacente. Lai et al. Microbiol Biotechnol, 90:529-539 (2011)). Recientemente, los investigadores han utilizado este conocimiento para crear "artilisinas", lisinas modificadas genéticamente con péptidos catiónicos añadidos para la actividad antibacteriana contra Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii Gram-negativas (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014)). Estas artilisinas consisten en PGH cargadas positivamente (activas contra bacterias Gram-positivas) fusionadas con péptidos catiónicos obtenidos exógenamente que no están relacionados ni se obtienen a partir de las lisinas. Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); Briers et al. MBío. 4:e01379-14 (2014); Patente de Estados Unidos Núm. 8.846.865).

La cita de referencias en el presente documento no se interpretará como una admisión de que tales referencias son relevantes o que constituyen un estado de la técnica anterior a la presente divulgación.

Compendio de la divulgación

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en S^eQ ⁱD NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa; y un portador farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, el polipéptido de lisina está presente en una cantidad eficaz para inhibir el crecimiento, reducir la población o destruir P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una solución, una suspensión, una emulsión, un polvo inhalable, un aerosol o una pulverización.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más antibióticos adecuados para el tratamiento de bacterias Gram-negativas.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un vector que comprende un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, reduce la población o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa o una secuencia complementaria de dicho polinucleótido.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado tiene la propiedad de inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa, estando el ácido nucleico conectado operativamente a un promotor heterólogo. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de ADNc.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En algunas realizaciones, el polinucleótido es ADNc.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición para inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente otra especie de bacteria Gram-negativa, conteniendo la composición una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina tiene la propiedad de inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En un aspecto relacionado, que no forma parte de la presente invención, la divulgación proporciona un método para tratar una infección bacteriana causada por una bacteria Gram-negativa seleccionada del grupo que consiste en P. aeruginosa y opcionalmente una o más especies adicionales de bacterias Gram-negativas, que comprende administrar a un sujeto diagnosticado, en riesgo o que presenta síntomas de una infección bacteriana, una composición que contiene una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 10, o un fragmento activo de la misma, en donde el polipéptido de lisina tiene la propiedad de inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica según la invención para su uso en un método de tratamiento de una infección bacteriana patogénica tópica o sistémica causada por P. aeruginosa y opcionalmente una o más especies adicionales de bacterias Gram-negativas en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto una composición que contiene una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido o péptido tienen la propiedad de inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra bacteria Gram-negativa.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona una combinación para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección por P. aeruginosa, comprendiendo la combinación una primera cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y una segunda cantidad eficaz de un antibiótico adecuado para el tratamiento de la infección por bacterias Gram-negativas.

En algunas realizaciones, las bacterias Gram-negativas se seleccionan del grupo que consiste en Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis y Franciscella tulerensis.

Según la invención, la infección por bacterias Gram-negativas es una infección provocada por Pseudomonas aeruginosa.

En algunas realizaciones, el antibiótico se selecciona entre uno o más de ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicósidos, imipenemo, meropenemo, doripenemo, gentamicina, tobramicina, amikacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B, y colistina.

En otro aspecto, que no forma parte de la presente invención, la divulgación proporciona un método para aumentar la eficacia de un antibiótico adecuado para el tratamiento de infecciones bacterianas Gram-negativas, que comprende administrar conjuntamente el antibiótico combinado con uno o más polipéptidos de lisina que comprenden un secuencia de aminoácidos al menos 80% idéntica a una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 10, o un fragmento activo de la misma, en donde la administración de la combinación es más efectiva para inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir las bacterias Gram-negativas que la administración del antibiótico o del polipéptido de lisina o fragmento activo del mismo individualmente.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de fusión que contiene un péptido catiónico antimicrobiano añadido a un polipéptido de lisina aislado y generado de forma recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un polipéptido de lisina de fusión que comprende (i) un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye a P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa, fusionada con (ii) un péptido antimicrobiano.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 proporciona las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del polipéptido de lisina GN37 referido en la presente divulgación. La Figura 1A (izquierda) es una secuencia de aminoácidos de GN37. La Figura 1A (derecha) es una secuencia de nucleótidos de GN37. La Figura 1B es un esquema de GN37, que indica que GN37 es un miembro de la familia de PGH de peptidasa M15_4 con actividades DD- y DL-carboxipeptidasa (incluidos los miembros de la superfamilia VanY). La Figura 1C muestra un alineamiento de secuencia múltiple que compara GN37 con un homólogo parcial Gram-positivo (Streptomyces, secuencia GenBank AGJ50592.1) y con endolisinas supuestas o confirmadas de otros patógenos Gram-negativos, incluida E. coli (GenBank WP_001117823.1 y Np_543082.1- ambas supuestas endolisinas), Yersinia spp. (GenBank CAJ28446.1-endolisina confirmada) y Acinetobacter baumannii, (GenBank WP_034684053.1, supuesta lisina).

La Figura 2 proporciona secuencias de aminoácidos (fuente en negrita) y nucleótidos (fuente normal) de los polipéptidos de lisina GN2, GN4, GN14 y GN43 referidos en la presente divulgación.

La Figura 3 es un gráfico de barras que representa la multiplicidad de inducción de la señal de fluorescencia sobre el control por la cepa PAO1 de P. aeruginosa en presencia de varios polipéptidos de lisina GN, en donde la fluorescencia indica permeabilización de la membrana externa.

La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra la actividad antibacteriana de los polipéptidos de lisina GN contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa. La reducción de unidades formadoras de colonias (UFC) se presenta en escala logarítmica.

La Figura 5 proporciona secuencias de aminoácidos de cinco péptidos de lisina derivados de GN4: PGN4, FGN4-1, FGN4-2, FGN4-3 y FGN4-4.

La Figura 6 es un gráfico de barras que muestra la actividad antibacteriana de cada péptido de lisina derivado de GN4 (PGN4, FGN4-1, FGN4-2, Fg N4-3 y FGN4-4) contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa. La reducción en los recuentos de UFC se presenta a lo largo de una escala logarítmica.

La Figura 7 es un gráfico de barras que muestra la actividad antibacteriana en suero humano de polipéptidos de lisina GN agrupados y péptidos de lisina derivados de GN4 de la presente divulgación contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa. La reducción en los recuentos de UFC se presenta a lo largo de una escala logarítmica.

Descripción detallada

Definiciones

Como se emplean en el presente documento, los siguientes términos y sus equivalentes tendrán los significados que se les atribuyen a continuación, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

"Bacterias Gram-negativas" generalmente se refiere a bacterias que producen una tinción de cristal violeta que se decolora en la tinción de Gram, es decir, no retienen el colorante cristal violeta en el protocolo de tinción de Gram. Como se emplea en el presente documento, el término "bacterias Gram-negativas" puede describir, sin limitación, una o más (es decir, una o una combinación) de las siguientes especies bacterianas: Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bordetella pertussis, Brucella melitensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Campylobacter fetus, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella ozaenae, Legionella pneumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus mixofaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, providencia alcalifaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chaffeensis, o Bartonella hensenae. Los compuestos de la presente divulgación serán útiles para prevenir o inhibir el crecimiento de bacterias patógenas y para tratar una o más infecciones bacterianas, en particular, pero no necesariamente de manera exclusiva, que involucran bacterias Gram-negativas y, en particular, P. aeruginosa.

El término "bactericida" en el contexto de un agente convencionalmente significa que tiene la propiedad de causar la muerte de bacterias o capaz de destruir bacterias en una medida de al menos una reducción de 3 log (99,9%) o mejor entre una población inicial de bacterias.

El término "bacteriostático" convencionalmente significa que tiene la propiedad de inhibir el crecimiento bacteriano, incluyendo inhibir el crecimiento de células bacterianas, provocando así una reducción de 2 log (99%) o mejor y hasta un poco menos de 3 log entre una población inicial de bacterias.

El término "antibacteriano" en el contexto de un agente se utiliza genéricamente para incluir agentes tanto bacteriostáticos como bactericidas.

El término "resistente a fármacos" en el contexto de un patógeno y más específicamente de una bacteria, generalmente se refiere a una bacteria que es resistente a la actividad antimicrobiana de un fármaco. Cuando se utiliza de una manera más particular, la resistencia a fármacos se refiere específicamente a la resistencia a antibióticos. En algunos casos, una bacteria que generalmente es susceptible a un antibiótico en particular puede desarrollar resistencia al antibiótico, convirtiéndose así en un microbio o cepa resistentes a fármacos. Un patógeno "resistente a múltiples fármacos" es aquel que ha desarrollado resistencia a al menos dos clases de fármacos antimicrobianos, cada uno utilizado como monoterapia. Por ejemplo, se ha encontrado que ciertas cepas de Pseudomonas aeruginosa son resistentes a casi todos o todos los antibióticos, incluidos los aminoglicósidos, las cefalosporinas, las fluoroquinolonas y carbapenemos. Antibiotic Resistant Threats in he United States, 2013, U.S. Department of He4aqlth and Sevices, Centers for Disease Control and Prevention). Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si una bacteria es resistente a fármacos utilizando técnicas de laboratorio de rutina que determinan la susceptibilidad o resistencia de una bacteria a un fármaco o antibiótico.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, aditivos, excipientes, medios de dispersión, agentes solubilizantes, recubrimientos, conservantes, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tensioactivos, propelentes y similares que sean fisiológicamente compatibles. El portador o los portadores deben ser "aceptables" en el sentido de que no sea perjudiciales para el sujeto que se vaya a tratar en las cantidades típicamente utilizadas en los medicamentos. Los portadores farmacéuticamente aceptables son compatibles con los otros ingredientes de la composición sin hacer que la composición no sea adecuada para el propósito previsto. Además, los portadores farmacéuticamente aceptables son adecuados para utilizar con sujetos como se proporciona en el presente documento sin efectos secundarios adversos indebidos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica). Los efectos secundarios son "indebidos" cuando su riesgo supera el beneficio proporcionado por la composición. Los ejemplos no limitantes de portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera de los portadores farmacéuticos convencionales tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua y emulsiones tales como emulsiones y microemulsiones de aceite/agua.

Para composiciones sólidas que comprenden un polipéptido de lisina liofilizado, se pueden incluir excipientes tales como urea o mesna para mejorar la estabilidad. Otros excipientes incluyen agentes de carga, agentes tamponadores, modificadores de la tonicidad, tensioactivos, conservantes y codisolventes.

Para composiciones orales sólidas que comprenden un polipéptido de lisina, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, almidones, azúcares, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares.

Para las composiciones orales líquidas, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero sin limitarse a, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes y similares.

Para composiciones tópicas sólidas tales como cremas, geles, espumas, ungüentos o pulverizaciones, los excipientes adecuados incluyen, pero sin limitarse a, una crema, una base celulósica u oleosa, agentes emulsionantes, agentes endurecedores, modificadores de la reología o espesantes, tensioactivos, emolientes, conservantes, humectantes, agentes alcalinizantes o tamponadores y disolventes.

Los excipientes adecuados para la formulación de la base de espuma incluyen, pero sin limitarse a, propilenglicol, cera emulsionante, alcohol cetílico y estearato de glicerilo. Los conservantes potenciales incluyen metilparabeno y propilparabeno.

El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad que, cuando se aplica o administra con una frecuencia o régimen de dosificación apropiados, es suficiente para prevenir o inhibir el crecimiento bacteriano o prevenir, reducir o mejorar el inicio, la gravedad, la duración o la progresión del trastorno que se está tratando (en este caso, crecimiento o infección de patógenos bacterianos), impedir el avance del trastorno que se está tratando, causar la regresión del trastorno que se está tratando, o potenciar o mejorar los efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia, tal como la terapia con antibióticos o bacteriostáticos .

Se pretende que el término "administrar conjuntamente" abarque la administración por separado de un polipéptido de lisina y un antibiótico o cualquier otro agente antibacteriano de forma secuencial, así como la administración de estos agentes de forma sustancialmente simultánea, tal como en una única mezcla/composición o en dosis proporcionadas por separado, pero no obstante administradas sustancialmente simultáneamente al sujeto, por ejemplo en diferentes momentos en el mismo día o en un período de 24 horas. Tal administración conjunta de polipéptidos de lisina con uno o más agentes antibacterianos adicionales se puede proporcionar como un tratamiento continuo que dura hasta días, semanas o meses. Además, dependiendo del uso, no es necesario que la administración conjunta sea continua o coextensiva. Por ejemplo, si el uso fuera como un agente antibacteriano tópico para tratar, p. ej., una úlcera bacteriana o una úlcera diabética infectada, la lisina podría administrarse solo inicialmente en el plazo de las 24 horas del primer uso de antibiótico y a continuación, el uso de antibiótico puede continuar sin administración adicional de lisina.

El término "sujeto" se refiere a un sujeto que se va a tratar e incluye, entre otros, un mamífero, una planta, un animal inferior, un organismo unicelular o un cultivo celular. Por ejemplo, se pretende que el término "sujeto" incluya organismos, p. ej., procariotas y eucariotas, que son susceptibles o están afectados por infecciones bacterianas Gram-negativas. Los ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, p. ej., seres humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas y animales no humanos transgénicos. En ciertas realizaciones, el sujeto es un ser humano, p. ej., un ser humano que sufre, corre el riesgo de sufrir o es susceptible de sufrir una infección bacteriana Gram-negativa, ya sea que dicha infección sea sistémica o se limite a un órgano o tejido en particular.

El término "polipéptido" se utiliza indistintamente con el término "proteína" y "péptido" y se refiere a un polímero elaborado a partir de restos de aminoácido y que tiene al menos aproximadamente 30 restos de aminoácido. El término incluye no solo polipéptidos en forma aislada, sino también fragmentos activos y derivados de los mismos (definidos a continuación). El término "polipéptido" también abarca proteínas de fusión o polipéptidos de fusión que comprenden un polipéptido de lisina como se describe a continuación y que mantienen la funcionalidad lisina. Un polipéptido puede ser un polipéptido de origen natural o un polipéptido modificado o producido sintéticamente. Un polipéptido de lisina en particular puede ser, por ejemplo, obtenido o eliminado de una proteína nativa mediante escisión enzimática o química, o puede prepararse utilizando técnicas de síntesis de péptidos convencionales (p. ej., síntesis en fase sólida) o técnicas de biología molecular (tales como las descritas en Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)) o puede truncarse o segmentarse estratégicamente para producir fragmentos activos, como se ilustra, por ejemplo, en el presente documento con un fragmento de GN4 que comprende el dominio anfipático de GN4 y otras versiones truncadas del mismo que mantienen la actividad lisina contra la misma o al menos una bacteria diana común. También se incluyen variantes de polipéptidos de lisina nativa que tienen al menos un 80% o al menos 85% o al menos 90% o al menos 95% o al menos 98% de identidad de secuencia con el polipéptido de lisina nativo (que, como se indicó anteriormente, incluye fragmentos activos de una proteína de lisina nativa).

El término "polipéptido de fusión" se refiere a un producto de expresión resultante de la fusión de dos o más segmentos de ácido nucleico, lo que da como resultado un producto de expresión fusionado que normalmente tiene dos dominios o segmentos con diferentes propiedades o funcionalidad. En un sentido más particular, el término "polipéptido de fusión" también se refiere a un polipéptido o péptido que comprende dos o más polipéptidos o péptidos heterólogos conectados covalentemente, ya sea directamente o a través de un conector aminoacídico o peptídico. Los polipéptidos que forman el polipéptido de fusión normalmente están conectados del extremo C terminal al extremo N terminal, aunque también pueden estar conectados del extremo C terminal al extremo C terminal, del extremo N terminal al extremo N terminal o del extremo N terminal al extremo C terminal. El término "polipéptido de fusión" se puede utilizar de manera intercambiable con el término "proteína de fusión". Por lo tanto, la expresión abierta "un polipéptido que comprende" una cierta estructura incluye moléculas más grandes que la estructura citada, tales como los polipéptidos de fusión.

El término "heterólogo" se refiere a secuencias de nucleótidos, péptidos o polipéptidos que no son naturalmente contiguas. Por ejemplo, en el contexto de la presente divulgación, el término "heterólogo" puede utilizarse para describir una combinación o fusión de dos o más péptidos y/o polipéptidos en donde el péptido o polipéptido de fusión normalmente no se encuentran en la naturaleza, tal como por ejemplo, un polipéptido de lisina o un fragmento activo del mismo y un péptido catiónico y/o policatiónico, un péptido anfipático, un péptido sushi (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19 (2008)), un péptido tipo defensina (Ganz, T. Nature Reviews Inmunology 3, 710-720 (2003)), un péptido hidrófobo y/o un péptido antimicrobiano que puede tener actividad lisina potenciada. En esta definición se incluyen dos o más polipéptidos de lisina o fragmentos activos de los mismos. Estos se pueden utilizar para preparar un polipéptido de fusión con actividad lisina.

El término "fragmento activo" se refiere a una parte de un polipéptido de longitud completa divulgado en el presente documento que retiene una o más funciones o actividades biológicas del polipéptido original aislado. Véase por ejemplo GN4 en la Figura 2 y fragmentos del mismo en la Figura 5 (FGN4-1 y FGN4-2). Una actividad biológica de particular interés en el presente documento es la de una lisina activa para perforar la membrana externa e hidrolizar el recubrimiento de bacterias Gram-negativas, ya sea escindiendo un esqueleto de azúcar o un enlace peptídico. El término "péptido anfipático" se refiere a un péptido que tiene grupos funcionales hidrófilos e hidrófobos. Preferiblemente, la estructura secundaria coloca residuos de aminoácidos hidrófobos e hidrófilos en diferentes extremos del péptido. Estos péptidos suelen adoptar una estructura secundaria helicoidal.

El término "péptido catiónico" se refiere a un péptido que tiene residuos de aminoácidos cargados positivamente. Preferiblemente, un péptido catiónico tiene un valor de pKa de 9,0 o mayor. El término "péptido catiónico" en el contexto de la presente divulgación también abarca péptidos policatiónicos.

El término "péptido policatiónico", como se emplea en el presente documento, se refiere a un péptido producido sintéticamente compuesto principalmente de restos de aminoácido cargados positivamente, en particular restos de lisina y/o arginina. Los restos de aminoácido que no están cargados positivamente pueden ser restos de aminoácido con carga neutra y/o restos de aminoácido con carga negativa y/o restos de aminoácido hidrófobos.

El término "grupo hidrófobo" se refiere a un grupo químico tal como una cadena lateral de aminoácido que tiene poca o ninguna afinidad por las moléculas de agua, pero una mayor afinidad por las moléculas de aceite. Las sustancias hidrófobas tienden a tener baja o nula solubilidad en agua o fases acuosas y son típicamente apolares, pero tienden a tener mayor solubilidad en fases oleosas. Los ejemplos de aminoácidos hidrófobos incluyen glicina (Gly), alanina (Ala), valina (Val), leucina (Leu), isoleucina (Ile), prolina (Pro), fenilalanina (Phe), metionina (Met) y triptófano (Trp). El término "aumentar" dentro del contexto de la presente divulgación significa que un grado de actividad antimicrobiana es más alto de lo que sería de otro modo. El "aumento" abarca efectos tanto aditivos como sinérgicos (superaditivos).

El término "sinérgico" o "superaditivo" con relación a un efecto significa un efecto beneficioso provocado por dos sustancias activas que excede el producido por cada sustancia administrada o aplicada sola. Uno o ambos ingredientes activos pueden emplearse a un nivel por debajo del umbral, es decir, un nivel en el que, si el principio activo se emplea individualmente, produce un efecto muy limitado o nulo.

El término "tratamiento" se refiere a cualquier procedimiento, acción, aplicación, terapia o similar, en donde un sujeto, incluido un ser humano, se somete a asistencia médica con el objeto de curar un trastorno, erradicar un patógeno o mejorar el estado del sujeto, directa o indirectamente. El tratamiento también se refiere a reducir la incidencia o aliviar los síntomas, eliminar la recurrencia, prevenir la recurrencia, prevenir la incidencia, mejorar los síntomas, mejorar el pronóstico o combinaciones de los mismos. "Tratamiento" comprende adicionalmente la reducción de la población, la tasa de crecimiento o la virulencia de las bacterias en el sujeto y, por lo tanto, el control o la reducción de una infección bacteriana en un sujeto o la contaminación bacteriana de un órgano, tejido o entorno. Por tanto, el "tratamiento" que reduce la incidencia es eficaz para inhibir el crecimiento de al menos una bacteria Gram-negativa en un medio particular, ya sea un sujeto o un entorno. Por otro lado, el "tratamiento" de una infección ya establecida se refiere a la reducción de la población o la destrucción, incluyendo incluso erradicar las bacterias Gram-negativas responsables de una infección o contaminación.

El término "prevenir" incluye la prevención de la incidencia, recurrencia, propagación, inicio o establecimiento de un trastorno tal como una infección bacteriana. No se pretende que la presente divulgación se limite a la prevención completa o a la prevención del establecimiento de una infección. En algunas realizaciones, se retrasa el inicio o se reduce la gravedad de una enfermedad contraída posteriormente, y esto constituye ejemplos de prevención. Las enfermedades contraídas en el contexto de la presente divulgación abarcan tanto aquellas que se manifiestan con síntomas clínicos o subclínicos, tales como la detección y la detección del crecimiento de un patógeno bacteriano cuando los síntomas asociados con tal patología aún no se manifiestan.

Se pretende que el término "derivado" en el contexto de un péptido o polipéptido (que, como se establece en el presente documento, incluye un fragmento activo) abarque, por ejemplo, un polipéptido modificado para contener uno o más radicales químicos distintos de un aminoácido que no afecten de manera sustancialmente adversa o destruyan la actividad de la lisina. El radical químico se puede conectar covalentemente al péptido, p. ej., a través de un resto de aminoácido amino terminal, un resto de aminoácido carboxi terminal o en un resto de aminoácido interno. Tales modificaciones incluyen la adición de un grupo protector o de protección terminal a un radical reactivo, la adición de una marca detectable, tal como un anticuerpo y/o una marca fluorescente, la adición o modificación de la glicosilación, o la adición de un grupo voluminizador tal como PEG (pegilación) y otros cambios que no afecten de manera sustancialmente adversa o destruyan la actividad del polipéptido de lisina.

Los grupos protectores de uso común que se pueden añadir a los polipéptidos de lisina incluyen, pero no se limitan a, t-Boc y Fmoc.

Las proteínas marcadoras fluorescentes de uso común tales como, pero sin limitarse a, la proteína fluorescente verde (GFP), la proteína fluorescente roja (RFP), la proteína fluorescente cian (CFP), la proteína fluorescente amarilla (YFP) y mCherry, son proteínas compactas que se pueden unir covalente o no covalentemente a un polipéptido de lisina o fusionar a un polipéptido de lisina sin interferir en las funciones normales de las proteínas celulares. Típicamente, un polinucleótido que codifica una proteína fluorescente se inserta aguas arriba o aguas abajo de la secuencia de polinucleótidos de lisina. Esto producirá una proteína de fusión (p. ej., polipéptido de lisina::GFP) que no interfiere en la función celular o la función de un polipéptido de lisina al que se ancla.

La conjugación de polietilenglicol (PEG) con proteínas se ha utilizado como método para prolongar la semivida circulante de muchas proteínas farmacéuticas. Por lo tanto, en el contexto de los derivados de polipéptidos de lisina, el término "derivado" abarca polipéptidos de lisina modificados químicamente mediante el anclaje covalente de una o más moléculas de PEG. Se anticipa que los polipéptidos de lisina pegilados exhibirán una semivida en circulación prolongada en comparación con los polipéptidos de lisina no pegilados, al tiempo que conservan la actividad biológica y terapéutica.

El término "porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias del polipéptido de lisina se define en el presente documento como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los restos de aminoácido en la secuencia específica del polipéptido de lisina, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y no considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con el fin de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias formas que están dentro del conocimiento práctico de la técnica, por ejemplo, utilizando un soporte lógico disponible públicamente tal como BLAST o un soporte lógico Megalign (DNASTAR). Dos o más secuencias polipeptídicas pueden ser idénticas entre 0 y 100%, o cualquier valor entero intermedio. En el contexto de la presente divulgación, dos polipéptidos son "sustancialmente idénticos" cuando al menos 80% de los restos de aminoácido (preferiblemente al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90% y preferiblemente al menos aproximadamente 95%) son idénticos. El término "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" como se describe en el presente documento también se aplica a los péptidos de lisina. Por lo tanto, el término "sustancialmente idéntico" abarcará variantes mutadas, truncadas, fusionadas o modificadas de otro modo de polipéptidos de lisina aislados y péptidos descritos en el presente documento, y fragmentos activos de los mismos, así como polipéptidos con una identidad de secuencia sustancial (p. ej., al menos 80%, al menos 85%, al menos 90% o al menos 95% de identidad medida, por ejemplo, mediante uno o más métodos mencionados anteriormente) en comparación con el polipéptido de referencia.

Dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" cuando al menos aproximadamente 80% de los restos de aminoácido (preferiblemente al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90% y preferiblemente al menos aproximadamente 95%) son idénticos o representan sustituciones conservativas. Las secuencias de polipéptidos de lisina de la presente divulgación son sustancialmente homólogas cuando uno o más, o varios, o hasta 10%, o hasta 15%, o hasta 20% de los aminoácidos del polipéptido de lisina están sustituidos con una sustitución de aminoácidos similar o conservativa, y en donde la lisina resultante tiene el perfil de actividades, efectos antibacterianos y/o especificidades bacterianas de los polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento. El significado de "sustancialmente homólogo" descrito en el presente documento también se aplica a los péptidos de lisina.

El término "composición inhalable" se refiere a las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación que se formulan para el suministro directo al tracto respiratorio durante o junto con la respiración de rutina o asistida (p. ej., mediante administración intratraqueobronquial, pulmonar y/o nasal), que incluye, pero sin limitarse a, formulaciones atomizadas, nebulizadas, en polvo seco y/o en aerosol.

El término "biopelícula" se refiere a las bacterias que se adhieren a las superficies y se agregan en una matriz polimérica hidratada de su propia síntesis. Una biopelícula es un agregado de microorganismos en el que las células se adhieren entre sí sobre una superficie. Estas células adherentes están frecuentemente incluidas dentro de una matriz de producción propia de sustancia polimérica extracelular (SPE). Una biopelícula SPE, también conocida como limo (aunque no todo lo que se describe como limo es una biopelícula) o placa, es un conglomerado polimérico compuesto generalmente por ADN extracelular, proteínas y polisacáridos.

El término "adecuado" en el contexto de un antibiótico que es adecuado para su uso contra ciertas bacterias se refiere a un antibiótico que resultó ser eficaz contra esas bacterias incluso si se desarrolló resistencia posteriormente.

El término "péptido antimicrobiano" (PAM) se refiere a un miembro de una amplia gama de antibióticos peptídicos catiónicos codificados por genes cortos (generalmente de 6 a 50 restos de aminoácido de longitud) que se pueden encontrar en prácticamente todos los organismos. Diferentes PAM muestran diferentes propiedades, y muchos péptidos de esta clase se están investigando intensamente no solo como antibióticos, sino también como moldes para péptidos que penetran en las células. A pesar de compartir algunas características comunes (p. ej., carácter catiónico, carácter anfipático y tamaño pequeño), las secuencias de PAM varían mucho y se han propuesto al menos cuatro grupos estructurales (hélice alfa, lámina beta, extendido y en bucle) para adaptarse a la diversidad. de las conformaciones de PAM observadas. Asimismo, se han propuesto varios modos de acción como antibióticos, y se demostró, p. ej., que la diana principal de muchos de estos péptidos es la membrana celular, mientras que para otros péptidos la diana principal es la invasión citoplásmica y la alteración de las funciones metabólicas centrales. Los PAM pueden concentrarse lo suficiente como para exhibir actividad cooperativa a pesar de la ausencia de unión específica a la diana; por ejemplo, formando un poro en la membrana, como es el caso de la mayoría de los PAM. Sin embargo, este fenómeno solo se ha observado en bicapas de fosfolípidos modelo y, en algunos casos, se requerían concentraciones de PAM en la membrana de hasta una molécula peptídica por cada seis moléculas de fosfolípido para que ocurrieran estos eventos. Estas concentraciones están cerca, si no en, la saturación completa de la membrana. Dado que la concentración mínima inhibitoria (CMI) para los PAM se encuentra típicamente en el rango micromolar bajo, es comprensible que haya surgido escepticismo con respecto a la relevancia de estos umbrales y su importancia in vivo (Melo et al., Nature Reviews Microbiology, 7, 245-250 (2009)).

Las defensinas son una gran familia de péptidos antimicrobianos pequeños, catiónicos, ricos en cisteína y arginina, que se encuentran tanto en vertebrados como en invertebrados (Wilmes, M. y Sahl, H., Int J Med Microbio!.; 304(1):93-9 (2014)). Las defensinas se dividen en cinco grupos según el patrón de espaciado de las cisteínas: defensinas de plantas, invertebrados, alfa, beta y theta. Las tres últimas se encuentran principalmente en mamíferos. Las alfa-defensinas son proteínas que se encuentran en los neutrófilos y el epitelio intestinal. Las beta-defensinas son las más ampliamente distribuidas y son secretadas por leucocitos y células epiteliales de muchos tipos. Las theta-defensinas se han encontrado raramente hasta ahora, p. ej., en leucocitos de macacos rhesus. Las defensinas son activas contra bacterias, hongos y muchos virus con envoltura y sin envoltura. Sin embargo, las concentraciones necesarias para la destrucción eficiente de bacterias son en su mayoría altas, es decir, en el rango micromolar. La actividad de muchos péptidos puede verse limitada en presencia de condiciones salinas fisiológicas, cationes divalentes y suero. Además, las defensinas a menudo tienen actividad hemolítica que no es deseable para los productos y métodos de la presente divulgación.

Los péptidos Sushi se caracterizan por la presencia de dominios sushi, también conocidos como módulos de proteína de control del complemento (CCP) o repeticiones cortas consenso (SCR)). Los dominios Sushi se encuentran en una variedad de proteínas de adhesión y del complemento, que contienen disposiciones en tándem de dominios Sushi intercaladas con secuencias de conexión cortas. Los dominios Sushi contienen una secuencia consenso que abarca aproximadamente 60 restos, que a su vez contiene cuatro restos de cisteína invariantes que están involucrados en enlaces disulfuro intramoleculares, un triptófano altamente conservado y residuos conservados de glicina, prolina e hidrófobos (Kirkitadze, M. y Barlow, P., Immunol Rev., 180:146-61 (2001)). Se sabe que los dominios de sushi están implicados en interacciones proteína-proteína y proteína-ligando. Se ha demostrado que los péptidos que contienen un dominio Sushi tienen actividades antimicrobianas (Ding, JL. y Ho, B. Drug Development Research, 62:317-335 (2004)).

Las catelicidinas son péptidos antimicrobianos multifuncionales, también conocidos como péptidos catiónicos de defensa del anfitrión (CHDP), una clase de péptidos propuestos como agentes terapéuticos antimicrobianos, y un componente importante de la defensa innata del anfitrión contra la infección. Además del potencial microbicida, estos péptidos tienen propiedades con capacidad para modular la inflamación y la inmunidad. Recientemente, se descubrió que el suministro de catelicidina LL-37 humana exógena mejora una respuesta proinflamatoria protectora a la infección en un modelo murino de infección pulmonar aguda por P. aeruginosa, lo que demuestra un aumento del aclaramiento bacteriano in vivo mediado por catelicidina (Beaumont et al. PloS One. 2;9(6):e99029 (2014)). Por lo tanto, la catelidicina promovió eficazmente el aclaramiento bacteriano del pulmón en ausencia de actividad microbicida directa, con una respuesta temprana de neutrófilos mejorada que requirió tanto la exposición a la infección como al péptido y fue independiente de la producción nativa de catelicidina. Además, aunque los ratones con deficiencia de catelicidina tenían una respuesta inflamatoria celular temprana intacta, la respuesta de neutrófilos de fase posterior a la infección estuvo ausente en estos animales, con un aclaramiento significativamente disminuido de P. aeruginosa. Estos hallazgos demostraron la importancia de las propiedades moduladoras de las catelicidinas en la infección pulmonar in vivo y destacaron el papel clave de las catelicidinas en la inducción de respuestas protectoras de neutrófilos pulmonares, específicas del medio infeccioso. Beaumont, PE et al., PLoS One. 2014; 9(6): e99029. Publicado en línea el 2 de junio de 2014. doi: 10.1371/journal.pone.0099029.

Realizaciones

La presente divulgación se refiere a nuevos agentes antibacterianos contra bacterias Gram-negativas. En particular, la presente divulgación se refiere a polipéptidos de lisina (incluidos sus fragmentos activos) activos contra bacterias Gram-negativas, tales como Pseudomonas aeruginosa. Los ejemplos de tales polipéptidos de lisina son aquellos que tienen una secuencia de aminoácidos dentro del conjunto SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 10. Las secuencias nativas se identificaron mediante técnicas bioinformáticas a partir de un genoma de fago previamente secuenciado, pero parcialmente dilucidado. Aunque algunas de las secuencias así identificadas se habían anotado como supuestas endolisinas, previamente no se había atribuido ninguna función de manera definitiva a los polipéptidos que tenían estas secuencias. Por otra parte, varias secuencias anotadas como supuestas endolisinas, en síntesis o expresión, resultaron estar totalmente desprovistas de actividad lisina o inactivas contra el patógeno diana. En el aislamiento, la expresión y las pruebas, solo un puñado de las secuencias identificadas bioinformáticamente tenían, de hecho, función lisina Gram-negativa. Adicionalmente, se identificaron fragmentos activos de las lisinas y se prepararon péptidos y polipéptidos activos de secuencia modificada que tenían actividad lisina Gram-negativa. Además, de acuerdo con la presente divulgación, tales péptidos de secuencia modificada incluyen fragmentos de los polipéptidos de lisina Gram-negativos nativos confirmados que mantienen la actividad lisina, así como variantes de los mismos que tienen 80% o más (tal como al menos 85%, al menos 90% al menos 85% o al menos 98% de identidad de secuencia con los polipéptidos de lisina nativos o fragmentos activos de los mismos y, de hecho, las porciones no idénticas podrían incluir sustituciones con restos de aminoácido tanto naturales como no naturales (sintéticos). Los autores de la presente invención han determinado que el dominio helicoidal alfa del extremo C-terminal de estos polipéptidos es importante para la actividad de la lisina Gram-negativa y han realizado estudios para identificar la actividad, pero cualquier péptido con una secuencia que sea 80% o más (tal como 85%, 90%, 95% o 98% o 99% idéntica a las lisinas nativas descritas en el presente documento o fragmentos de las mismas pueden analizarse rápidamente para determinar su actividad contra bacterias Gram-negativas, incluidas P. aeruginosa, y otras tales como Klebsiella spp, Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis y Franciscella tulerensis. Tales pruebas pueden seguir, por ejemplo, las enseñanzas proporcionadas en los Ejemplos 2, 3, 4 o el Ejemplo Profético 1. Por supuesto, los procedimientos y protocolos de prueba en sí mismos no se limitan a los de estos Ejemplos, sino que pueden ser cualquier método conocido por los expertos en la técnica para evaluar la eficacia de un agente antibacteriano y, de hecho, antimicrobiano.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en S^eQ ⁱD NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa; y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en forma de solución, suspensión, emulsión, polvo inhalable, aerosol o pulverización.

En otra realización, la presente invención proporciona un vector que comprende un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico, opcionalmente un ADNc, que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 9, y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa, o una secuencia complementaria de dicho polinucleótido, en donde opcionalmente el ácido nucleico está conectado operativamente a un promotor heterólogo.

En otra realización más, la presente invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector de la invención.

En otra realización más, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico, opcionalmente un ADNc, que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO: 6, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, reduce la población o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido de lisina aislado, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

En algunas realizaciones, las bacterias pueden seleccionarse del grupo que consiste en Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Bacteroides fragilis, Bacteroides theataioatamicron, Bacteroides distasonis, Bacteroides ovatus, Bacteroides vulgatus, Bordetella pertussis, Brucella melitensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei Fusobacterium, Prevotella corporis, Prevotella intermedia, Prevotella endodontalis, Porphyromonas asaccharolytica, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Campylobacter coli, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Edwarsiella tarda, Eikenella corrodens, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter agglomerans, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Kingella kingae, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella rhinoscleromatis, Klebsiella ozaenae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus penneri, Proteus myxofaciens, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Providencia alcalifaciens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Salmonella typhi, Salmonella paratyphi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Streptobacillus moniliformis, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Vibrio alginolyticus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Ricketsia prowazekii, Coxiella burnetii, Ehrlichia chafeensis, and Bartonella hensenae. Por ejemplo, en una realización particular, la infección bacteriana Gram-negativa es una infección causada por bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Acinetobacter baumannii, Bordetella pertussis, Burkholderia cepacia, Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Legionella penumophila, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Stenotrophomonas maltophilia, Vibrio cholerae, y Chlamydia pneumoniae. En una realización específica, la infección bacteriana Gram-negativa es una infección causada por una o más de las bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Salmonella typhimurium, Salmonella typhi, Shigella spp., Escherichia coli, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Serratia spp. Proteus mirabilis, Morganella morganii, Providencia spp., Edwardsiella spp., Yersinia spp., Haemophilus influenza, Bartonella quintana, Brucella spp., Bordetella pertussis, Burkholderia spp., Moraxella spp., Francisella tularensis, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Bacteroides spp., Enterobacter spp., y Chlamydia spp.

Basándose en (i) el hecho de que los péptidos y polipéptidos de lisina de la presente divulgación pueden perforar la ME de las bacterias Gram-negativas y llegar a su sustrato, destruyendo tales bacterias y reduciendo sustancialmente la tasa de crecimiento de las colonias bacterianas, y (ii) observaciones similares con otros polipéptidos de lisina que están diseñados para penetrar la ME en tampón y medios tales como artilisinas, se anticipa que los polipéptidos de lisina de la presente divulgación serán útiles en el tratamiento de una o más infecciones bacterianas Gramnegativas. Por otra parte, el hecho de que los presentes polipéptidos de lisina posean actividad contra dianas Gramnegativas incluso antes de la fusión (si la hay) con péptidos catiónicos y otros antimicrobianos puede ser ventajoso sobre las artilisinas ya que estas últimas parecen ser inhibidas por sueros humanos. Deslouches, B. et al, Activity of the De Novo Engineered Antimicrobial Peptide WLBU2 against Pseudomonas aeruginosa in Human Serum and Whole Blood: Implications for Systemic Applications, Antimicrobial Agents & Chemotherapy, agosto de 2005, pág.

3208-3216 Vol. 49, Núm. 8; Brogden N. et al, Int J Antimicrob Agents. septiembre de 2011; 38(3): 217-225. doi:10.1016/j.ijantimicag.2011.05.004; Svenson, J. et al, J. Med. Chem., 2007, 50 (14), pág. 3334-3339.

En una realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse, entre otras cosas, a una infección del tracto respiratorio (ITR), especialmente, pero no exclusivamente, a infecciones del tracto respiratorio inferior. En otra realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a una enfermedad de transmisión sexual. En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a una infección del tracto urinario. En una realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a la exacerbación aguda de la bronquitis crónica (EABC). En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a infecciones del tracto respiratorio de pacientes que tienen fibrosis quística (FQ). En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a otitis media aguda o septicemia neonatal. En otra realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a sinusitis aguda. En una realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a una infección causada por bacterias resistentes a fármacos, incluso bacterias resistentes a múltiples fármacos. En otra realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a sepsis relacionada con catéter. En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a clamidia. En una realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a neumonía adquirida en la comunidad (NAC) o a infecciones nosocomiales del tracto respiratorio. En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a una infección complicadas de la piel y la estructura de la piel. En otra realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a infecciones no complicadas de la piel y de la estructura de la piel. En una realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a endocarditis. En otra realización, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a neutropenia febril. En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a cervicitis gonocócica. En otra realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a la uretritis gonocócica. En una realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a neumonía adquirida en el hospital (NAH). En otra realización más, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a osteomielitis. En otra realización adicional, los términos "infección" e "infección bacteriana" pueden referirse a sepsis. Los patógenos gramnegativos comunes y las infecciones asociadas se enumeran en la Tabla 1 de la presente divulgación. Se pretende que estas realizaciones, así como los patógenos y enfermedades enumerados en la Tabla 1, sirvan como ejemplos de usos de los presentes métodos y no se pretende que sean limitantes.

Tabla 1. Bacterias Gram-negativas médicamente relevantes y enfermedades asociadas.

Patógeno gramnegativo Enfermedad o enfermedades primarias

Salmonella typhimurium Infecciones gastrointestinales (GI - salmonelosis

Shigella spp. Infecciones GI - shigelosis

Escherichia coli Infecciones del tracto urinario (ITU)

Acinetobacter baumanii Infecciones de heridas

Pseudomonas aeruginosa Infecciones del torrente sanguíneo y neumonía

Klebsiella pneumoniae Neumonía, ITU, e infecciones del torrente sanguíneo Neisseria gonorrhoeae Enfermedad de transmisión sexual (ETS) - gonorrea Neisseria meningitides Meningitis

Serratia spp. Contaminaciones del catéter, OTU, y neumonía

Proteus mirabilis ITU

Morganella spp. ITU

Providencia spp. ITU

Edwardsiella sp. ITU

Salmonella typhi Infecciones GI - fiebre tifoidea

Yersinia pestis Peste bubónica y neumónica

Yersinia enterocolitica Infecciones GI

Yersinia pseudotuberculosis Infecciones GI

Haemophilus influenza Meningitis

Bartonella quintana Fiebre de las trincheras

Brucella spp. Brucelosis

Bordetella pertussis Respiratoria - Tos ferina

Burkholderia spp. Respiratoria

Moraxella sp. Respiratoria

Francisella tularensis Tularemia

Legionella pneumophila Respiratoria - Enfermedad del legionario

Coxiella burnetii Fiebre Q

Bacteroides spp. Infecciones abdominales

Enterobacter spp. ITU y respiratoria

Clamidia spp. ETS, respiratoria y ocular

En un aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento de la infección bacteriana Gram-negativa en un sujeto causada por Pseudomonas aeruginosa y opcionalmente por al menos una especie adicional de bacterias Gram-negativas tales como las seleccionadas del grupo que consiste en, Klebsiella spp, Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis y Franciscella tulerensis, que son las bacterias Gram-negativas más significativas en la enfermedad humana.

En un aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento de la infección bacteriana Gram-negativa en un sujeto causada por Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es un organismo en forma de bastoncillo, Gram-negativo, oxidasa positiva que se encuentra de forma ubicua en el medio ambiente. P. aeruginosa puede crecer en numerosos hábitats, incluidos, pero sin limitarse a, el suelo, el agua y el tejido vegetal y animal. Es un organismo oportunista y uno de los patógenos nosocomiales más problemáticos, capaz de causar enfermedades sistémicas o localizadas en individuos susceptibles, tales como personas con fibrosis quística, cáncer, quemaduras, úlceras diabéticas o una deficiencia del sistema inmunitario. En un entorno hospitalario en particular, se ha vuelto resistente a muchos antibióticos de uso común.

Según datos de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. y el Sistema Nacional de Vigilancia de Infecciones Nosocomiales, P. aeruginosa es la segunda causa más común de neumonía nosocomial, la tercera causa más común de infección del tracto urinario, la cuarta causa más común de infección del sitio quirúrgico, el séptimo patógeno aislado con mayor frecuencia del torrente sanguíneo y el quinto aislado más común en general de todos los sitios (Solh y Alhajhusain, J Antimicrob Chemother. 64(2):229-38 (2009)). Es más, P. aeruginosa es el patógeno gramnegativo multirresistente (MDR) más común que causa neumonía en pacientes hospitalizados (Goossens et al., Clin Microbiol Infect. 980-3 (2003)).

Los ejemplos no limitantes de infecciones causadas por P. aeruginosa incluyen: A) Infecciones nosocomiales: 1. Infecciones del tracto respiratorio, especialmente en pacientes con fibrosis quística y pacientes con ventilación mecánica; 2. Bacteriemia y sepsis; 3, Infecciones de heridas, particularmente las de víctimas de quemaduras; 4. Infecciones del tracto urinario; 5. Infecciones posquirúrgicas en dispositivos invasivos; 6. Endocarditis por administración intravenosa de soluciones de fármacos contaminados; 7. Infecciones en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida, quimioterapia contra el cáncer, terapia con esteroides, neoplasias malignas hematológicas, trasplante de órganos, terapia de reemplazo renal y otras afecciones con neutropenia grave. B) Infecciones adquiridas en la comunidad: 1. Infecciones del tracto respiratorio adquiridas en la comunidad; 2. Meningitis; 3. Foliculitis e infecciones del canal auditivo causadas por agua contaminada; 4. Otitis externa maligna en ancianos y diabéticos; 5. Osteomielitis del calcáneo en niños; 6. Infecciones oculares comúnmente asociadas con lentes de contacto contaminadas; 7. Infecciones de la piel, tales como infecciones de las uñas en personas cuyas manos están frecuentemente expuestas al agua; 8. Infecciones del tracto gastrointestinal; y 9. Infecciones del sistema musculoesquelético.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación pueden utilizarse para tratar a un sujeto en riesgo de contraer una infección debida a P. aeruginosa y/u otra bacteria Gram-negativa. Los sujetos en riesgo de adquirir una infección por P. aeruginosa u otra bacteria Gram-negativa incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, pacientes con fibrosis quística, pacientes neutropénicos, pacientes con enterocolitis necrosante, víctimas de quemaduras, pacientes con infecciones de heridas y, más generalmente, pacientes en un entorno hospitalario, en particular pacientes quirúrgicos y pacientes que están siendo tratados utilizando un dispositivo médico implantable tal como un catéter, por ejemplo, un catéter venoso central, un dispositivo Hickman o dispositivos cardíacos electrofisiológicos, por ejemplo, marcapasos y desfibriladores implantables. Otros grupos de pacientes con riesgo de infección por bacterias Gram-negativas, que incluyen P. aeruginosa incluyen, sin limitación, pacientes con prótesis implantadas tales como un reemplazo total de articulación (por ejemplo, reemplazo total de rodilla o cadera).

En una realización, el sujeto sufre una infección respiratoria bacteriana Gram-negativa. En otra realización, el sujeto padece fibrosis quística y cada ingrediente activo se administra de forma independiente en una composición inhalable, una composición oral o una composición bucal. En una realización más específica, el sujeto padece una infección respiratoria bacteriana Gram-negativa asociada con fibrosis quística y cada uno de los ingredientes activos se administra conjuntamente en una composición inhalable. En una realización, el sujeto sufre una herida que ha sido infectada con P. aeruginosa u otra bacteria Gram-negativa. Un ejemplo de una herida que se puede tratar mediante los métodos de la presente divulgación es una quemadura infectada o una quemadura con riesgo de infectarse. Tales quemaduras incluyen quemaduras térmicas (calor), quemaduras por temperatura fría, quemaduras químicas, quemaduras eléctricas o quemaduras por radiación.

Además, P. aeruginosa y otras bacterias Gram-negativas colonizan con frecuencia la comida, los lavabos, los grifos, las fregonas y los equipos respiratorios de los hospitales. La infección se transmite de un paciente a otro a través del contacto con fómites o por la ingestión de alimentos y agua contaminados (Barbara Iglewski, Medical Microbiology, 4.a edición, capítulo 27, Pseudomonas, 1996).

De manera más general, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación pueden utilizarse para el tratamiento de una infección bacteriana Gram-negativa (o de una infección que no ha sido caracterizada) en un sujeto combinado con otras terapias. Tal terapia combinada opcional puede comprender la administración conjunta al paciente que lo necesite de un agente terapéutico adicional, tal como un antibiótico u otro agente bactericida o bacteriostático, y/u otra lisina dirigida a un componente diferente de la superficie del patógeno (por ejemplo, dirigida a un componente diferente de la membrana externa). Además de los antibióticos, los agentes bactericidas y bacteriostáticos incluyen, pero sin limitarse a, lisinas, desinfectantes, antisépticos y conservantes. Cualquiera de estos puede utilizarse opcionalmente combinado con los polipéptidos de lisina de la presente divulgación.

Los desinfectantes antimicrobianos incluyen, pero sin limitarse a, hipocloritos, cloraminas, dicloroisocianurato y tricloroisocianurato, cloro húmedo, dióxido de cloro, ácido peracético, persulfato de potasio, perborato de sodio, percarbonato de sodio y perhidrato de urea, yodopovidona, tintura de yodo, tensioactivos no iónicos yodados, etanol, n-propanol e isopropanol y mezclas de los mismos; 2-fenoxietanol y 1- y 2-fenoxipropanol, cresoles, hexaclorofeno, triclosán, triclorofenol, tribromofenol, pentaclorofenol, Dibromol y sus sales, cloruro de benzalconio, bromuro o cloruro de cetiltrimetilamonio, cloruro de didecildimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de bencetonio, clorhexidina, glucoprotamina, dihidrocloruro de octenidina, soluciones de ozono y permanganato, plata coloidal, nitrato de plata, cloruro de mercurio, sales de fenilmercurio, cobre, sulfato de cobre, óxido-cloruro de cobre, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido amidosulfúrico, ácido toluenosulfónico, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio e hidróxido de calcio.

La combinación de polipéptidos de lisina de la presente divulgación con reactivos antisépticos puede proporcionar más eficacia contra bacterias Gram-negativas que las combinaciones de antibióticos. Los reactivos antisépticos incluyen, pero sin limitarse a, solución de Daquin, solución de hipoclorito de sodio o potasio, solución de bencenosulfocloramida de sodio, ciertas preparaciones de yodo, tales como yodopovidona, peróxidos como soluciones de perhidrato de urea y soluciones de ácido peracético con pH tamponado, alcoholes con o sin aditivos antisépticos, ácidos orgánicos débiles tales como ácido sórbico, ácido benzoico, ácido láctico y ácido salicílico, algunos compuestos fenólicos, como hexaclorofeno, triclosán y Dibromol, y compuestos activos catiónicos, tales como soluciones de benzalconio, clorhexidina, metilisotiazolona, a-terpineol, timol, cloroxilenol octenidina.

Las lisinas de la presente divulgación se pueden administrar conjuntamente con antibióticos de cuidado convencionales o con antibióticos de último recurso, individualmente o en varias combinaciones según los expertos en la técnica. Los antibióticos tradicionales utilizados contra la actividad de P. aeruginosa incluyen aminoglicósidos, ticarcilina, ureidopenicilinas, ceftazidima, cefepima, aztreonam, carbapenemos, ciprofloxacina, levofloxacina, etc. (Tabla 2). Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación pueden administrarse conjuntamente con antibióticos utilizados para el tratamiento de P. aeruginosa y otras enumeradas en la Tabla 2. La lista de antibióticos para otras bacterias Gram-negativas, tales como Klebsiella spp., Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, y Franciscella tulerensis, será similar a la prevista anteriormente para P. aeruginosa y serán antibióticos de cuidado convencionales para una bacteria en particular involucrada o incluso antibióticos de último recurso (si la cepa en particular es resistente a los antibióticos de cuidado convencionales). Los agentes terapéuticos opcionales adicionales para administrar conjuntamente incluyen, pero sin limitarse a, los antibióticos mencionados anteriormente y los enumerados en la Tabla 2, tales como una combinación de ticarcilinaclavulanato, combinación de piperacilina-tazobactam, ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ciprofloxacina, levofloxacina, imipenemo, meropenemo, doripenemo, gentamicina, tobramicina, amikacina, polimixina B y colistina (polimixina E). Para el tratamiento de heridas, los agentes terapéuticos que se administrarán conjuntamente incluyen, pero sin limitarse a, un hidrogel de propilenglicol (p. ej., SOLUGEL® (Johnson y Johnson)); un antiséptico; un antibiótico; y un corticosteroide.

Tabla 2. Antibióticos utilizados para el tratamiento de Pseudomonas aeruginosa

(continuación)

Los péptidos antibióticos tales como la polimixina B y la colistina relacionada (polimixina E) se han utilizado como agentes antibacterianos para el tratamiento de infecciones bacterianas por P. aeruginosa. Por lo tanto, en una realización, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se deben administrar conjuntamente con polimixina B y/o colistina.

La combinación de polipéptidos de lisina de la presente divulgación con antibióticos proporciona un nuevo régimen antimicrobiano eficaz. En una realización, la administración conjunta de polipéptidos de lisina de la presente divulgación con uno o más antibióticos puede llevarse a cabo a dosis y cantidades reducidas de la lisina o del antibiótico o de ambos, y/o frecuencia y/o duración reducidas del tratamiento con actividad bactericida y bacteriostática aumentada, riesgo reducido de resistencia a antibióticos y con riesgo reducido de efectos secundarios neurológicos o renales nocivos (tales como los asociados con el uso de colistina o polimixina B). Estudios previos han demostrado que la dosis total acumulada de colistina se asocia con daño renal, lo que sugiere que la disminución de la dosis o el acortamiento de la duración del tratamiento con la terapia combinada con polipéptidos de lisina podría disminuir la incidencia de nefrotoxicidad (Spapen et al. Ann Intensive Care. 1: 14 (2011))). Como se emplea en el presente documento, el término "dosis reducida" se refiere a la dosis de un ingrediente activo en la combinación en comparación con la monoterapia con el mismo ingrediente activo. Lo mismo ocurre con la "duración del tratamiento". En algunas realizaciones, la dosis de la lisina o el antibiótico en una combinación puede ser subóptima o incluso subumbral en comparación con la monoterapia respectiva.

En algunos aspectos, que no forman parte de la invención, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se utilizan para tratar una infección bacteriana tal como una infección causada por bacterias Gram-negativas resistentes a fármacos. Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación solos o con uno o más antibióticos pueden utilizarse para tratar una infección bacteriana tal como una infección causada por una bacteria Gramnegativa resistente a múltiples fármacos. Las bacterias Gram-negativas resistentes a fármacos o resistentes a múltiples fármacos en el contexto de esta divulgación incluyen, pero no se limitan a P. aeruginosa.

En una realización, la presente invención también proporciona una combinación para utilizar en la prevención o el tratamiento de una infección por P. aeruginosa, comprendiendo la combinación una primera cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y una segunda cantidad eficaz de un antibiótico adecuado para el tratamiento de infecciones bacterianas Gram-negativas.

En la práctica, las infecciones son comúnmente polimicrobianas, con especies mixtas Gram-positivas y Gramnegativas (Citron et al. J. Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007)). En algunas realizaciones, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación activos contra bacterias Gram-negativas pueden utilizarse no solo con un antibiótico efectivo contra bacterias Gram-negativas sino también combinados con uno o más antibióticos y/o una o más lisinas adecuadas para el tratamiento de bacterias Gram-positivas dependiendo de la infección de un sujeto dado.

En una realización, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación son capaces de romper o degradar una pared celular de bacterias Gram-negativas. En una realización preferida, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación son capaces de romper o degradar la pared celular de P. aeruginosa.

En algunos aspectos, que no forman parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para inhibir el crecimiento de una o más bacterias Gram-negativas que comprende administrar a un sujeto o suministrar a un entorno particular uno o más polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento o una composición farmacéuticamente aceptable de los mismos en una cantidad y en condiciones tales que se inhiba el crecimiento de bacterias Gram-negativas.

En otro aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para inhibir el crecimiento de P. aeruginosa y/o una o más bacterias Gram-negativas que comprende administrar a un sujeto uno o más polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento combinados con otros agentes clínicamente relevantes.

En algún aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la permeabilidad de una membrana externa de P. aeruginosa y/o una o más bacterias Gram-negativas diferentes poniendo en contacto la membrana externa con (exponiendo las bacterias a) uno o más polipéptidos de lisina de la presente divulgación.

En un aspecto adicional, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la permeabilidad de una membrana externa de P. aeruginosa y/o una o más bacterias Gramnegativas diferentes poniendo en contacto la membrana externa con polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento combinados con otros agentes clínicamente relevantes, tales como antibióticos, agentes bactericidas, antisépticos, etc.

En algún aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la actividad antibiótica de uno o más antibióticos contra bacterias Gram-negativas en comparación con la actividad de dichos antibióticos utilizados solos mediante la administración a un sujeto de uno o más polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento junto con un antibiótico de interés. La combinación es efectiva contra las bacterias y permite vencer la resistencia al antibiótico y/o emplear el antibiótico a dosis más bajas, disminuyendo los efectos secundarios indeseables, tales como los efectos nefrotóxicos y neurotóxicos de la polimixina B.

Los compuestos de la presente divulgación se pueden utilizar solos o combinados con agentes permeabilizantes adicionales de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, incluidos, pero sin limitarse a, quelantes de metales como p. ej., EDTA, TRIS, ácido láctico, lactoferrina, polimixinas, ácido cítrico (Vaara M. Microbiol Rev.

56(3):395-441 (1992)).

En una realización, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se modifican químicamente. Una modificación química incluye, pero sin limitarse a, la adición de radicales químicos, la creación de nuevos enlaces y la eliminación de radicales químicos. Las modificaciones químicas pueden ocurrir en cualquier parte de un polipéptido de lisina, incluidas las cadenas laterales de aminoácidos, así como los extremos amino o carboxilo. Tal modificación puede estar presente en más de un sitio en un polipéptido de lisina. Además, uno o más grupos laterales o grupos terminales de un polipéptido de lisina pueden estar protegidos por grupos protectores conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, los polipéptidos de lisina contienen un anclaje de radicales que potencian la duración. En una realización, el radical que potencia la duración es polietilenglicol. El polietilenglicol ("PEG") se ha utilizado para obtener polipéptidos terapéuticos de mayor duración (Zalipsky, S., Bioconjugate Chemistry, 6:150-165 (1995); Mehvar, R., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136 (2000)). La cadena principal de PEG [(CH² CH²-O-)n, n: número de monómeros repetitivos] es flexible y anfífila. Cuando se anclan a otra entidad química, tal como un polipéptido de lisina, las cadenas de polímero de PEG pueden proteger tal polipéptido de lisina de la respuesta inmunitaria y otros mecanismos de aclaramiento. Como resultado, la pegilación puede conducir a una mayor eficacia y seguridad del polipéptido de lisina mediante la optimización de la farmacocinética, el aumento de la biodisponibilidad y la disminución de la inmunogenicidad y la cantidad y/o frecuencia de dosificación. "Pegilación" se refiere a la conjugación de una molécula de PEG con otro compuesto, p. ej., polipéptido de lisina.

En un aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación se refiere a la prevención, reducción, tratamiento o eliminación de la contaminación bacteriana Gram-negativa de dispositivos médicos, superficies tales como suelos, escaleras, paredes y mostradores en hospitales y otros lugares de salud. edificios relacionados o de uso público y superficies de equipos en quirófanos, salas de emergencia, cuartos de hospital, clínicas y baños y similares. Los ejemplos de dispositivos médicos que se pueden proteger utilizando las composiciones descritas en el presente documento incluyen, pero sin limitarse a, tubos y otros dispositivos médicos de superficie, tales como catéteres urinarios, catéteres de extracción de moco, catéteres de succión, cánulas umbilicales, lentes de contacto, dispositivos intrauterinos, dispositivos intravaginales e intraintestinales, tubos endotraqueales, broncoscopios, prótesis dentales y dispositivos de ortodoncia, aparatos quirúrgicos, aparatos dentales, tubos, líneas de agua dental, telas, papel, tiras indicadoras (p. ej., tiras indicadoras de papel o tiras indicadoras de plástico), adhesivos (p. ej., adhesivos de hidrogel, adhesivos de fusión por calor, o adhesivos con una base de disolvente), vendajes, apósitos de tejido o dispositivos de cicatrización y parches oclusivos, y cualquier otro dispositivo de superficie utilizado en el campo médico. Los dispositivos pueden incluir electrodos, prótesis externas, cintas de fijación, vendajes de compresión y monitores de varios tipos. Los dispositivos médicos también pueden incluir cualquier dispositivo que pueda colocarse en el sitio de inserción o implantación, tal como la piel cerca del sitio de inserción o implantación, y que puede incluir al menos una superficie que sea susceptible de colonización por bacterias Gram-negativas.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden utilizar para conservar alimentos frente a la contaminación por bacterias Gram-negativas, lo que comprende añadir al alimento las composiciones de la presente divulgación que comprenden polipéptidos de lisina. Los ejemplos de tales productos alimenticios son productos cárnicos (curados y/o sin curar, frescos y/o cocidos), ensaladas y otros productos vegetales, bebidas y productos lácteos, alimentos semiprocesados, platos preparados como p. ej. alimentos listos para consumir y productos alimenticios deshidratados, etc.

Uno de los problemas que plantean las bacterias a los seres humanos es la formación de biopelículas. La formación de biopelículas ocurre cuando las células microbianas se adhieren entre sí y se incluyen en una matriz de sustancia polimérica extracelular (SPE) sobre una superficie. El crecimiento de microbios en un entorno tan protegido que está enriquecido con biomacromoléculas (p. ej., polisacáridos, ácidos nucleicos y proteínas) y nutrientes permite una interacción microbiana mejorada y una mayor virulencia. Dado que la biopelícula puede desarrollarse en cualquier entorno de soporte, se necesita un método o una composición que pueda prevenir o eliminar la formación de biopelícula. Se ha demostrado que Pseudomonas aeruginosa forma biopelículas sobre una variedad de superficies vivas y no vivas, tales como los tapones de moco del pulmón con FQ, catéteres contaminados, lentes de contacto, etc. Sharma et al. Biologicals, 42(1):1-7 (2014)). Por lo tanto, en una realización, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden utilizar para la prevención, el control, la interrupción y el tratamiento de biopelículas bacterianas, en particular aquellas formadas por o con la contribución de P. aeruginosa.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación pueden utilizarse in vivo, por ejemplo, para tratar infecciones bacterianas en un sujeto, así como in vitro, por ejemplo, para tratar células (p. ej., bacterias) en cultivo para eliminar o reducir el nivel de contaminación bacteriana de un cultivo celular.

Métodos para producir polipéptidos de lisina

En un aspecto, que no forma parte de la presente invención, la presente divulgación incluye métodos para producir polipéptidos de lisina de la presente divulgación que destruyen o inhiben el crecimiento de una o más bacterias Gram-negativas, preferiblemente P. aeruginosa, comprendiendo el método cultivar una célula anfitriona que comprende un polinucleótido de lisina que codifica uno o más polipéptidos de lisina en condiciones adecuadas para expresar dicho polipéptido.

Para obtener un alto nivel de expresión del polipéptido de lisina, las secuencias de polinucleótidos de lisina se expresan típicamente conectándolas operativamente a una secuencia de control de expresión en un vector de expresión apropiado y empleando ese vector de expresión para transformar un anfitrión celular apropiado. Tal conexión operativa de secuencias polinucleotídicas que codifican polipéptidos de lisina de la presente divulgación a una secuencia de control de la expresión incluye la provisión de un codón de iniciación, ATG, en el marco de lectura correcto aguas arriba de la secuencia polinucleotídica (ADN). Generalmente, puede utilizarse cualquier sistema o vector adecuado para mantener, propagar o expresar polinucleótidos y/o para expresar un polipéptido en un anfitrión para la expresión de polipéptidos de lisina. La secuencia de ADN/polinucleótido apropiada puede insertarse en el sistema de expresión mediante cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias bien conocidas, tales como, por ejemplo, las expuestas en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Además, también se pueden añadir etiquetas a los polipéptidos de lisina para proporcionar métodos convenientes de aislamiento, p. ej., c-myc, biotina, poli-His, etc. Los kits para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente.

Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones de anfitrión/vector de expresión para expresar las secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos de lisina de la presente divulgación. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente. Se proporcionan ejemplos de vectores adecuados en Sambrook et al, eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.), vol. 1-3, Laboratorio de Cold Spring Harbor (2001)). Tales vectores incluyen, entre otros, vectores cromosómicos, episómicos y derivados de virus, p. ej., vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de trasnsposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como baculovirus, papovavirus, tales como SV40, virus vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, virus de la pseudorrabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Además, dichos vectores pueden proporcionar la expresión constitutiva o inducible de los polipéptidos de lisina de la presente divulgación. Más específicamente, los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y plásmidos bacterianos conocidos, p. ej., plásmidos de E. coli colEl, pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4, pBAD24 y pBAD-TOPO; ADN de fagos, p. ej., los numerosos derivados del fago A, p. ej., NM989, y otros ADN de fagos, p. ej., M13 y ADN de fago filamentoso de hebra sencilla; plásmidos de levadura tales como el plásmido 2D o derivados del mismo; vectores útiles en células eucarióticas, tales como vectores útiles en células de insectos o mamíferos; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que han sido modificados para emplear ADN de fagos u otras secuencias de control de la expresión; y similares. Muchos de los vectores mencionados anteriormente están disponibles comercialmente de proveedores tales como New England Biolabs, Addgene, Clontech, Life Technologies, etc., muchos de los cuales también proporcionan células anfitrionas adecuadas).

Además, los vectores pueden comprender varios elementos reguladores (incluidos promotor, sitio de unión al ribosoma, terminador, potenciador, varios elementos en cis para controlar el nivel de expresión) en donde el vector se construye de acuerdo con la célula anfitriona. Cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de la expresión (secuencias que controlan la expresión de una secuencia de polinucleótidos conectada operativamente a ella) puede utilizarse en estos vectores para expresar las secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos de lisina. Las secuencias de control útiles incluyen, pero no se limitan a: los promotores tempranos o tardíos de SV40, CMV, vaccinia, polioma o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC, el sistema TRC, el sistema LTR, las regiones operadoras y promotoras principales del fago A, las regiones de control de la proteína de la cubierta fd, el promotor de la 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa ácida (p. ej., Pho5), los promotores de los factores de apareamiento de levadura, el promotor de E. coli para la expresión en bacterias, y otras secuencias promotoras conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y diversas combinaciones de los mismos.

Una amplia variedad de células anfitrionas es útil para expresar los polipéptidos de lisina de la presente divulgación. Los ejemplos no limitantes de células anfitrionas adecuadas para la expresión de polipéptidos de lisina de la presente divulgación incluyen anfitriones eucarióticos y procarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos tales como levaduras y células animales, tales como células CHO, Rl.l, B-W y L-M, células renales de Mono Verde Africano (p. ej., COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 y BMT10), células de insecto (p. ej., Sf9), y células humanas y células vegetales en cultivo de tejidos. Si bien el anfitrión de expresión puede ser cualquier célula anfitriona de expresión conocida, en una realización preferida el anfitrión de expresión es una de las cepas de E. coli. Estas incluyen, pero no se limitan a las cepas de E. coli disponibles comercialmente tales como Top10 (Thermo Fisher Scientific), DH5a (Thermo Fisher Scientific), XL1-Blue (Agilent Technologies), SCS110 (Stratagene), JM109 (Promega), LMG194 (ATCC) y BL21 (Thermo Fisher Scientific). Existen varias ventajas al utilizar E. coli como sistema anfitrión que incluyen: cinética de crecimiento rápido, donde en condiciones ambientales óptimas, su tiempo de duplicación es de aproximadamente 20 minutos (Sezonov et al., J. Bacteriol. 189 8746-8749 (2007)), cultivos de alta densidad fácilmente logrados, transformación fácil y rápida con ADN exógeno, etc. Los detalles sobre la expresión de proteínas en E. coli, incluyendo la selección de plásmidos, así como la selección de cepas son comentado en detalle por Rosano, G. y Ceccarelli, E., Front Microbiol., 5: 172 (2014).

La expresión eficaz de polipéptidos de lisina y vectores de los mismos depende de una variedad de factores tales como señales de expresión óptimas (tanto a nivel de transcripción como de traducción), plegamiento correcto de proteínas y características de crecimiento celular. Con respecto a los métodos para construir el vector y los métodos para transducir el vector recombinante construido a la célula anfitriona, se pueden utilizar métodos convencionales conocidos en la técnica. Si bien se entiende que no todos los vectores, las secuencias de control de la expresión y los anfitriones funcionarán igual de bien para expresar las secuencias de polinucleótidos que codifican los péptidos de lisina de la presente divulgación, un experto en la técnica podrá seleccionar los vectores, secuencias de control de la expresión y anfitriones apropiados sin experimentación indebida para lograr la expresión deseada sin apartarse del alcance de esta divulgación. En algunas realizaciones, los autores de la presente invención han encontrado una correlación entre el nivel de expresión y la actividad del polipéptido expresado; en sistemas de expresión de E. coli en particular, niveles moderados de expresión (por ejemplo, entre aproximadamente 1 y 10 mg/litro) han producido polipéptidos de lisina con niveles más altos de actividad que aquellos que se expresaron a niveles más altos en E. coli (por ejemplo, entre aproximadamente 20 y aproximadamente 100 mg/litro), habiendo producido estos últimos a veces polipéptidos completamente inactivos.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes mediante métodos bien conocidos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita y cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución también se puede emplear para la purificación de polipéptidos de lisina. Alternativamente, el sistema vector utilizado para la producción de polipéptidos de lisina de la presente divulgación puede ser un sistema de expresión libre de células. Varios sistemas de expresión libre de células están disponibles comercialmente, incluidos, pero sin limitarse a, los disponibles de Promega, LifeTechnologies, Clonetech, etc.

Como se mencionó anteriormente, existe una variedad de opciones cuando se trata de la producción y purificación de proteínas. A continuación, los autores de la presente invención incluyen a modo de ejemplo no limitante un protocolo general que se puede utilizar para la producción de polipéptidos de lisina de la presente divulgación en E. coli. Se proporcionan más ejemplos de métodos y estrategias adecuados para ser considerados en la producción y purificación de proteínas en Structural Genomics Consortium, Nat Methods., 5(2): 135-146 (2008).

Protocolo ilustrativo:

1. El ADN que codifica el polipéptido de lisina se genera mediante la síntesis total de genes.

2. A continuación, los fragmentos de ADN se ligan en un vector preferiblemente inducible tal como pBAD24 (inducible con arabinosa) y se transforman en células de E. coli (por ejemplo, TOP10 de Invitrogen, Carlsbad, CA).

3. Las bacterias transformadas se esparcen sobre placas de agar con un suplemento de caldo, tal como caldo de Lisogenia (LB), agente de inducción de vectores (p. ej., arabinosa al 0,2%) y un marcador de selección (p. ej., 50 pg/ml de carbenicilina) y se incuban preferiblemente durante la noche a 37°C.

4. Los cultivos cerrados individuales de células de E. coli Top10 que contienen plásmido de lisina se cultivan en caldo con un suplemento de marcador seleccionable (p. ej., LB con un suplemento con 50 |jg/ml de carbenicilina) preferiblemente durante la noche a 37°C. A continuación, el cultivo puede diluirse, por ejemplo, 1:200 en medio de nueva aportación con un suplemento de marcador seleccionable (p. ej., LB con un suplemento de carbenicilina) e incubarse, por ejemplo, durante 3 h más. La expresión de lisina se induce con la adición del agente inducible (p. ej., L-arabinosa al 0,2%) y las células se incuban preferiblemente durante la noche a 30°C.

5. El sedimento celular se resuspende en tampón (p. ej., Tris 20 mM, pH 6,8) y se homogeneiza.

6. La solubilización y purificación de proteínas (utilizando una o más técnicas cromatográficas) se realizan en una solución bien tamponada que contiene una fuerza iónica adecuada de una sal monovalente, p. ej., una fuerza iónica equivalente a 300-500 mM de NaCl.

7. La cromatografía de afinidad con iones metálicos inmovilizados (IMAC) se utiliza preferiblemente como etapa de purificación inicial. Si se requiere una purificación adicional, se puede utilizar la cromatografía de exclusión por tamaño (filtración en gel) en un paso posterior. Si es necesario, se puede utilizar la cromatografía de intercambio iónico como paso final.

Identificación de polipéptidos de lisina

La presente divulgación se basa en la identificación de cinco lisinas, que no forman parte de la presente invención, con una potente actividad antibacteriana contra la cepa PAO1 de Pseudomonas aeruginosa en fase exponencial (Ejemplos 1 y 2). Para identificar los polipéptidos de lisina de la presente divulgación, los autores de la presente invención utilizaron un enfoque basado en bioinformática junto con una pantalla antibacteriana. De las secuencias así identificadas, algunas se anotaron previamente como supuestas endolisinas. Sin embargo, los autores de la presente invención encontraron que una mayoría sustancial entre ellas (seleccionaron más de 80 polipéptidos) no tenía ninguna actividad lisina o no tenía actividad contra el organismo diana P. aeruginosa. Las cinco lisinas, que no forman parte de la presente invención, identificadas como activas se designaron como GN37 (SEQ ID NO: 1), GN2 (SEQ ID NO: 2), GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4), y GN43 (SEQ ID NO: 5). Inicialmente, los autores de la presente invención evaluaron la capacidad de las lisinas purificadas (que se sintetizaron, clonaron en el vector de expresión pBAD26 y, a continuación, se purificaron) para permeabilizar la membrana externa (ME) de P. aeruginosa. (Ejemplo 1).

La mayoría de las bacterias Gram-negativas excluyen los compuestos hidrófobos y no permiten la absorción de agentes hidrófobos tales como 1-N-fenilnaftilamina (NPN), cristal violeta o ácido 8-anilino-1-naftalenosulfónico (ANS). La fuerte resistencia a los compuestos hidrófobos se debe a la presencia de membrana externa (ME), que contiene proteínas asociadas que anclan la ME al peptidoglicano y lo mantienen estable. Debido a su naturaleza hidrófoba, la NPN emite una fuerte fluorescencia en condiciones hidrófobas y débil en condiciones acuosas (J Sokatch, The biology of pseudomonas, diciembre de 2012, Elsevier). En consecuencia, la fluorescencia NPN se puede utilizar como medida de la permeabilidad de la membrana externa.

En la presente divulgación, se probó la capacidad de numerosas lisinas (GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 y GN43) para permeabilizar la ME de la cepa PAO1 de P. aeruginosa incubando NPN con células PAO1 en presencia o ausencia de las lisinas mencionadas anteriormente. Como se muestra en la Figura 3, la incubación de NPN en presencia de GN37 (SEC ID NO: 1), GN2 (SEC ID NO: 2), GN4 (SEC ID NO: 3), GN14 (SEC ID NO: 4) y GN43 (SEQ ID NO: 5) dio como resultado la mayor inducción de fluorescencia en comparación con la fluorescencia emitida sin la presencia de lisinas (control negativo). Por otra parte, cada una de las cinco lisinas (GN2, GN4, GN14, GN37 y GN43) causó una permeabilidad de ME significativamente más fuerte en comparación con la causada por el agente permeabilizante establecido EDTA (etilendiaminotetraacetato). Además, cada una de las cinco lisinas permeabilizó la ME de manera similar o mejor que un antibiótico conocido de último recurso utilizado en el tratamiento de P. aeruginosa, Polimixina B (PMB). Las lisinas activas de la presente divulgación generalmente tienen un dominio anfipático de hélice alfa C-terminal (excepto GN14 que tiene un N-terminal) cuyo tamaño varía entre 15 restos de aminoácido para GN14 y 33 restos de aminoácido para GN43. Las características comunes de GN2, GN4, GN14, GN37 y GN43, incluida la secuencia del dominio anfipático de hélice alfa, se incluyen en la Tabla 3. La estructura del polipéptido secundario se puede determinar utilizando varios programas de soporte lógico tales como Jpred4 en http://www.compbio.dundee.ac.uk/jpred/. Las hélices alfa anfipáticas en particular se examinaron utilizando Helical Wheel (http://kael.net/helicoidal.htm). También se proporcionan las secuencias de ácido nucleico de GN37 (SEC ID NO: 11), GN2 (SEC ID NO: 12), GN4 (SEC ID NO: 13), GN14 (SEC ID NO: 14) y GN43 (SEC ID NO: 15) (Figura 1A y Figura 2).

Tabla 3. Características generales de cada polipéptido de lisina y secuencias de los dominios anfipáticos alfahelicoidales C-terminales correspondientes (La región en negrita y subrayada representa el dominio antipático alfahelicoidal).

1

GN2 • proteína hipotética GOS_817346 [metagenoma marino] ' • GenBank: EDG23390.1

• 147 aminoácidos, 16.700 Da, pI 6,16

• 50-75% idéntica a la gama de lisinas de fagos gramnegativos

MRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTIT VE QAERMLSNDIQRFEPELDRLAKVPLNQNQ WDALMSFVYNLG AANLASSTLLKLLNKGDYOGAADOFPRWVNAGGKRLDGLVKR RAAERALFLEPLS

(continuación)

GN37

MTYTLSKRSLDNLKGVHPDLVA VVHRAIQLTP VDFA VIEG LRSVSRQKELVAAGASKTMNSRHLTGHA VDLAA YVNGIRW D WPLYDAIA VA VKAAAKELGVAIVWGGDWTTFKDGPHFELDRS KYR

GN43

sa M23

MKRTTLNLELESNTDRLLQEKDDLLPQSVTNSSDEGTPFAQVEG ASDDNTAEQDSDKPGASVADADTKPVDPEWKTITVASGDTLSTV FTKAGLSTSAMHDMLTSSKDAKRFTHLKVGQEVKLKLDPKGEL QALR VKQSELETIGLDKTDKGYSFKREKA QIDLHTA YAHGRITSS LFVA GRNA GLP YNL VTSLSNIFG YDIDFALDLRE GDEFD VI YE QH KVNGKQVATGNILAARFVNRGKTYTAVRYTNKQGNTSYYRADGS SMRKAFIRTPVDFARISSRFSLGRRHPILNKIRAHKGVDYAAPIGT PIKATGDGKILEAGRKGGYGNAVVIQHGQRYRTIYGHMSRFAKG IRAGTSVKQGQIIGYVGMTGLATGPHLHYEFQINGRHVDPLSAKL PMADPLGGADRKRFMAOTOPMIARMDOEKKTLLALNKOR

Dado que GN2, GN4, GN14, GN37 y GN43 exhibieron una potente actividad de permeabilización de la membrana, se evaluó la actividad antibacteriana de cada una de las cinco lisinas contra cepa PAO1 de P. aeruginosa (Ejemplo 2). Además de utilizar EDTA y PMB como controles positivos, también se incluyeron lisozima humana y novobiocina. La lisozima humana (HuLYS) es un péptido antimicrobiano natural que se encuentra en una variedad de tejidos, células y secreciones involucradas en la fisiopatología de la infección pulmonar (Callewaert et al. J. Biosci. 35:127-160 (2010)). Se ha demostrado que es eficaz contra organismos Gram-positivos y Gram-negativos, incluyendo P. aeruginosa, degradando los peptidoglicanos en la pared celular bacteriana. La novobiocina (Albamicina, Catamicina, Esferomicina) es un antibiótico de aminocumarina aislado de Streptomyces niveus. Es principalmente activo contra bacterias Gram-positivas, pero ciertas cepas Gram-negativas también son susceptibles (Lindsey Grayson, Kucers' The Use of Antibiotics: A Clinical Review of Antibacterial, Antifungal and Antiviral Drugs, CRC Press 6a Edición, 2010).

Como se muestra en la Figura 4, las cinco lisinas (GN2, GN4, GN14, GN37 y GN43) mostraron una mayor actividad antibacteriana contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa que HuLYS o novobiocina solas, mientras que GN4, GN14 y GN37 mostraron una actividad antibacteriana equivalente a la de EDTA y PMB.

GN37 se obtuvo de Micavibrio aeruginosavorus, un depredador de P. aeruginosa que no ha sido utilizado previamente como fuente de actividades de PGH anti-pseudomonas. El uso de Micavibrio aeruginosavorus vivo se ha sugerido como un agente de base biológica para controlar P. aeruginosa MDR (Dashiff et al. J Appl., 110(2):431 -44 (2011)). Pero según el conocimiento de los autores de la presente invención, no ha habido ningún informe sobre el uso de este organismo como fuente de proteínas antimicrobianas individuales, PGH, bacteriocinas, antibióticos, etc. Los autores de la presente invención razonaron que una bacteria depredadora epibiótica que se adhiere a la superficie de Pseudomonas aeruginosa y extrae los nutrientes del interior debe codificar una actividad PGH antipseudomonas para perforar la membrana externa y la pared celular. En base a esto, la secuencia genómica de la cepa ARL-13 de Micavibrio aeruginosavorus se escaneó en busca de genes anotados como enzimas similares a PGH. Se identificaron, clonaron y rastrearon cinco hidrolasas para actividad anti-pseudomonas. El locus ahora designado como GN37 fue el único ORF que produjo una zona clara (halo) en placas superpuestas de agar. Por lo tanto, debido a la fuente única de GN37 y la potente actividad descrita en el Ejemplo 3, se examinó GN37 con mayor detalle. Como se ilustra en el Ejemplo 3, un alineamiento múltiple de secuencias que compara GN37 con varias lisinas conocidas o supuestas reveló que GN37 es solo 67% idéntico a Mitrecina A (Farris y Steinberg, Lett Appl Microbiol., 58(5):493-502 (2014); y publicación de patente US20140094401 A1). A diferencia de GN37, la Mitrecina A se identificó en el genoma del organismo Gram-positivo (es decir, Streptomyces). Además, la actividad descrita para la Mitrecina A es muy débil en comparación con la de GN37 (a concentraciones aproximadamente equivalentes). La mitrecina A solo logró una disminución de <1 log en la viabilidad bacteriana durante 16 horas de incubación (frente a Yersinia pseudotuberculosis), en comparación con la disminución de >3 log después de solo 1 hora de tratamiento con GN37.

Además de las lisinas de longitud completa divulgadas aquí, la presente divulgación proporciona derivados peptídicos basados en el dominio anfipático de hélice alfa C-terminal de las lisinas de la presente divulgación. El truncamiento progresivo (deleción de aminoácidos) del C-terminal (y/o del N-terminal) de los polipéptidos que comprenden este dominio puede producir fragmentos de péptido de lisina activa hasta un péptido de lisina activa de longitud mínima. Tales péptidos pueden modificarse adicionalmente mediante la adición de uno o más aminoácidos (distintos de los de la lisina natural) al C-(o N-) terminal truncado de manera que no rompa la hélice alfa. Ambos dominios anfipáticos alfa-helicoidales C y N-terminales se pueden identificar utilizando un enfoque bioinformático. Los ejemplos de aminoácidos que no alteran la hélice alfa son los restos hidrófobos o cargados que extienden la región de la hélice alfa o que promueven la inserción en la membrana. La adición de aminoácidos se ilustra adicionalmente utilizando el polipéptido de lisina GN4 (Ejemplo 4, Figura 5). Mientras que los péptidos FGN4-1 (SEQ ID NO: 7) y FGN4-2 (SEQ ID NO: 8), que no forman parte de la presente invención, son fragmentos peptídicos de GN4 (SEQ ID NO: 3), PGN4 (SEQ ID NO: NO: 6), FGN4-3 (SEQ ID NO: 9) y FGN4-4 (SEQ ID NO: 10), que son polipéptidos de lisina de la presente invención, cada uno contiene una modificación (Figura 5), un ensayo de viabilidad indicó que PGN4 y FGN4-3 exhiben una mayor actividad antibacteriana que los otros péptidos GN4 probados (Figura 6). PGN4-4 es un polipéptido de 39 aminoácidos, que comprende un polipéptido FGN4-2 de 31 aminoácidos y un péptido antibacteriano de 8 residuos identificado a partir de la cápside de la hepatitis B (SQSRESQC). Por lo tanto, como se observa en la Figura 6, la adición del péptido SQSRESQC aumenta la actividad de FGN4-2. La comparación del fragmento nativo FGN4-1 y FGN4-4, que tiene una cisteína C-terminal (FGN4-4) añadida, indica que la adición de cisteína al extremo C-terminal mejoró la actividad de FGN4-1. Se añadió la cisteína para ver si promovía la dimerización y aumentaba la actividad. Los resultados indican que la cisteína terminal aumenta la actividad. Las modificaciones adicionales incluyen FGN4-2 en el que se eliminan 11 residuos C-terminales. Estos restos no son necesarios para la estructura helicoidal alfa (basándose en consideraciones de la estructura de la proteína secundaria) y los autores de la presente invención sondearon para ver si se mantenía la actividad. La eliminación de los 11 restos redujo la actividad, pero la actividad podría restablecerse y, de hecho, mejorarse mediante otras modificaciones, como las descritas anteriormente en este párrafo. A la luz de lo anterior, los expertos pueden producir fácilmente lisinas truncadas con su dominio anfipático helicoidal alfa C-terminal intacto produciendo polipéptidos de lisina que carecen progresivamente de uno o más restos de aminoácido del C-terminal de este dominio o del N-terminal o ambos y probando tales polipéptidos solos o combinados con uno o más antibióticos activos contra bacterias Gram-negativas para determinar la actividad contra (es decir, la capacidad para inhibir, reducir la población o destruir) P. aeruginosa y/u otra bacteria Gram-negativa. Tales pruebas pueden seguir, por ejemplo, las enseñanzas proporcionadas en los Ejemplos 2, 3, 4 o el Ejemplo Profético 1. Por supuesto, los procedimientos y protocolos de prueba en sí mismos no se limitan a los de estos Ejemplos, sino que pueden ser cualquier método conocido por los expertos en la técnica para evaluar la eficacia de un agente antibacteriano y, de hecho, antimicrobiano.

Para el análisis de la actividad antibacteriana en suero humano, los polipéptidos de lisina GN y los péptidos GN se agruparon en presencia y ausencia de una concentración sub-CMI de polimixina B (Ejemplo 5, Figura 7). La PMB es un potente antibiótico con actividad contra P. aeruginosa y, a una concentración de 1 mcg/ml, dio como resultado una disminución de <2-log10 en la viabilidad después del tratamiento durante 1 hora en suero humano. El grupo de péptidos GN4 (que contiene cada péptido a 25 mcg/ml, marcado como "grupo de péptidos" en la Figura 7) solo no dio como resultado una viabilidad reducida y el grupo de polipéptidos de lisina (que contiene cada lisina GN a una concentración de 25 mcg/ml) solo dio como resultado solamente una reducción de <2-log10 en la viabilidad (Figura 7). Sin embargo, cuando se combinó con la PMB, tanto el grupo de péptidos como el grupo de lisina dieron como resultado una disminución de >4-log10 en la viabilidad (Fig. 7). Estos hallazgos indican un fuerte efecto aditivo o incluso sinérgico de la combinación de PMB y los polipéptidos de lisina GN de la presente divulgación. Se anticipa que los polipéptidos de lisina individuales también darán como resultado una disminución sustancial en la viabilidad de las bacterias Gram-negativas tales como P. aeruginosa si se utiliza individualmente en lugar de en un grupo. Una observación con respecto a la Fig. 7 es que el grupo de péptidos por sí solo no es tan activo como se hubiera predicho a partir de la Fig. 6. Esto probablemente se deba al hecho de que la actividad biológica de muchos agentes antibacterianos disminuye en presencia de suero humano (Zhanel et al., Antimicrob Agents Chemother. 42(9): 2427­ 2430 (1998)). Sin embargo, una vez que se administra conjuntamente el grupo de lisina con PMB, se restablece la actividad antibacteriana del grupo de lisina, a pesar de la presencia de suero (Figura 7). Por tanto, la disminución de la actividad antimicrobiana del grupo de lisina en presencia de suero humano puede deberse a la actividad antagónica entre los péptidos en el grupo de péptidos que ya no es inhibidora en presencia de PMB. Alternativamente, una o más proteínas presentes en el suero humano pueden tener un efecto antagónico sobre el grupo de lisina, en donde el efecto se reprime con la adición de PMB. Los dos escenarios posibles se pueden distinguir repitiendo el ensayo utilizando polipéptidos de lisina individuales, realizando el ensayo en suero en presencia o ausencia de PMB y comparando los resultados con los obtenidos utilizando grupos de lisina. Además, la inhibición de la actividad del grupo de lisina en el suero podría deberse a que las altas concentraciones de sal interrumpen la interacción electrostática entre la lisina y la membrana externa.

Los polipéptidos de lisina GN de la presente divulgación tienen una actividad bacteriana distinta de los tratamientos tradicionales con antibióticos, vacunas y antitoxinas y son útiles para combatir infecciones causadas por bacterias Gram-negativas. Como se describe en los Ejemplos, a diferencia de otros tratamientos, las lisinas proporcionan un efecto bactericida rápido y, cuando se utilizan en cantidades por debajo de la CMI, tienen un efecto bacteriostático y son activas contra una variedad de bacterias resistentes a los antibióticos, lo que refleja los resultados obtenidos previamente utilizando lisinas específicas contra bacterias Gram-positivas que incluyen S. aureus, S. pyogenes, S. pneumoniae, B. anthracis, y B. cereus y no se han asociado con la evolución de la resistencia (Fischetti, V. Curr Opin Microbiol., 11(5): 393-400 (2008)). Basándose en la presente divulgación, en un entorno clínico, las lisinas son una potente alternativa para tratar infecciones que surgen de bacterias resistentes a fármacos y múltiples fármacos. Los mecanismos de resistencia existentes para las bacterias Gram-negativas no deberían afectar a la sensibilidad a la actividad PGH de las lisinas.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación difieren de las PGH existentes en desarrollo para el tratamiento de infecciones Gram-negativas. Las artilisinas descritas anteriormente consisten en PGH cargadas positivamente fusionadas con péptidos catiónicos obtenidos exógenamente (Briers et al., Antimicrob Agents Chemother. 58(7): 3774-84 (2014); Briers et al. MBío. 4:e01379-14 (2014); Patente de Estados Unidos Núm. 8.846.865). Por otra parte, las artilisinas utilizan péptidos policatiónicos que no se obtienen a partir de las endolisinas. Por el contrario, las regiones policatiónicas de los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se obtienen a partir de lisinas que interactúan de forma natural con, y desestabilizan la ME de P. aeruginosa, una característica que se anticipa que dará como resultado una mejor eficiencia de selección de dianas contra este patógeno.

Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación no necesitan modificarse mediante la adición de péptidos catiónicos antimicrobianos, aunque ciertamente se contemplan polipéptidos de fusión que contienen tales péptidos añadidos a polipéptidos de lisina aislados y generados de forma recombinante como se describe en el presente documento. Sin embargo, incluso en ausencia de péptidos catiónicos u otros antimicrobianos (antibacterianos) añadidos, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación tienen una actividad antibacteriana anti-Gram-negativa sustancial, que incluye tanto actividad bacteriostática como bactericida. No obstante lo anterior, la presente divulgación también contempla polipéptidos de lisina de fusión que comprenden un polipéptido de lisina que tiene una función antibacteriana Gram-negativa nativa fusionada a un tramo de péptido antimicrobiano (PAM, defensina, péptido sushi, péptido catiónico, péptido policatiónico, péptido anfipático, péptido hidrófobo) tal como los descritos en la Solicitud de Patente de E^e .UU. US2015/0118731_y las Solicitudes de Patentes Internacionales WO 2014/0120074, WO 2015/070912; WO 2015/071436; WO 2015/070911; WO.2015/071437; WO/2012/085259; WO 2014/001572, y WO 2013/0344055. También se contemplan polipéptidos de fusión que contienen segmentos bactericidas adicionales, es decir, segmentos que tienen actividad bactericida por sí mismos antes de la fusión o que contribuyen positivamente a la actividad bactericida del polipéptido de lisina original.

Composiciones y preparaciones farmacéuticas.

Las composiciones de la presente divulgación pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones para aplicaciones de tampones, aerosoles, pulverizaciones, suspensiones, pastillas, trociscos, caramelos, inyectables, gomas de mascar, ungüentos, frotis, parches de liberación prolongada, toallitas absorbentes líquidas y combinaciones de los mismos.

La administración de las composiciones de la presente divulgación o formas farmacéuticamente aceptables de las mismas puede ser tópica, es decir, la composición farmacéutica se aplica directamente donde se desea su acción (por ejemplo, directamente sobre una herida), o sistémica. A su vez, la administración sistémica puede ser enteral u oral, es decir, la sustancia se administra a través del tracto digestivo, parenteral, es decir, la sustancia se administra por otras vías distintas del tracto digestivo, tal como mediante inyección o inhalación. Por lo tanto, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden administrar a un sujeto por vía oral, parenteral, por inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal o mediante un reservorio implantado o mediante cualquier otro método conocido. Los polipéptidos de lisina de la presente divulgación también se pueden administrar por medio de formas de dosificación de liberación sostenida.

Para la administración oral, los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden formular en preparaciones sólidas o líquidas, por ejemplo, comprimidos, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones y dispersiones. El compuesto se puede formular con excipientes tales como, p. ej., lactosa, sacarosa, almidón de maíz, gelatina, almidón de patata, ácido algínico y/o estearato de magnesio.

Para preparar composiciones sólidas tales como comprimidos y píldoras, se mezcla un polipéptido de lisina de la presente divulgación o un fragmento del mismo con un excipiente farmacéutico para formar una composición de preformulación sólida. Si se desea, los comprimidos se pueden recubrir con azúcar o con recubrimiento entérico mediante técnicas convencionales. Los comprimidos o las píldoras se pueden recubrir o combinar de otro modo para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, el comprimido o píldora pueden incluir un componente de dosificación interno y uno de dosificación externo, estando este último en forma de envoltorio sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa entérica, que sirve para resistir la disgregación en el estómago y permitir que el componente interno pase intacto al duodeno o retrase su liberación. Se puede utilizar una variedad de materiales para tales capas o recubrimientos entéricos, incluyendo tales materiales una serie de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con sustancias tales como goma laca, alcohol cetílico y acetato de celulosa.

Las composiciones tópicas de la presente divulgación pueden comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable, tal como un portador dermatológicamente u óticamente aceptable. Tales portadores, en el caso de portadores dermatológicamente aceptables, son preferiblemente compatibles con la piel, las uñas, las membranas mucosas, los tejidos y/o el cabello, y pueden incluir cualquier portador dermatológico utilizado convencionalmente que cumpla estos requisitos. En el caso de portadores óticamente aceptables, el portador es preferentemente compatible con todas las partes del oído. Tales portadores pueden ser seleccionados fácilmente por un experto en la técnica. Los portadores para la administración tópica de los compuestos de la presente divulgación incluyen, pero sin limitarse a, aceite mineral, petróleo líquido, petróleo blanco, propilenglicol, compuestos de polioxietileno y/o polioxipropileno, cera emulsionante, monoestearato de sorbitán, polisorbato 60, cera de ésteres de cetilo, alcohol cetearílico, 2-octildodecanol, alcohol bencílico y agua. Al formular ungüentos para la piel, los componentes activos de la presente divulgación pueden formularse en una base de hidrocarburo oleaginoso, una base de absorción anhidra, una base de absorción de agua en aceite, una base de aceite en agua que se puede eliminar con agua y/o una base soluble en agua. Al formular composiciones óticas, los componentes activos de la presente divulgación pueden formularse en una suspensión polimérica acuosa que incluye portadores tales como dextranos, polietilenglicoles, polivinilpirrolidona, geles de polisacáridos, Gelrite®, polímeros celulósicos como hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros que contienen carboxi tales como polímeros o copolímeros de ácido acrílico, así como otros demulcentes poliméricos. Las composiciones tópicas según la presente divulgación pueden estar en cualquier forma adecuada para aplicación tópica, incluidas soluciones acuosas, hidroalcohólicas u oleosas, dispersiones de lociones o sueros, geles acuosos, anhidros u oleosos, emulsiones obtenidas por dispersión de una fase grasa en un fase acuosa (OAV o aceite en agua) o, por el contrario, (W/O agua en aceite), microemulsiones o en su defecto microcápsulas, micropartículas o dispersiones de vesículas lipídicas de tipo iónico y/o no iónico, cremas, lociones, geles, espumas (que generalmente requerirá un bote presurizado, un aplicador adecuado, un emulsionante y un propelente inerte), esencias, leches, suspensiones o parches. Las composiciones tópicas de la presente divulgación también pueden contener adyuvantes tales como agentes gelificantes hidrófilos o lipófilos, agentes activos hidrófilos o lipófilos, agentes conservantes, antioxidantes, disolventes, fragancias, cargas, filtros solares, absorbentes de olores y colorantes. En otro aspecto, las composiciones antibacterianas tópicas pueden administrarse junto con dispositivos tales como parches transdérmicos, apósitos, almohadillas, envolturas, matrices y vendajes capaces de adherirse o asociarse de otro modo con la piel u otro tejido de un sujeto, siendo capaces de suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más polipéptidos de lisina antibacterianos de acuerdo con la presente divulgación.

Las composiciones tópicas de la presente divulgación pueden comprender adicionalmente uno o más componentes utilizados para tratar quemaduras tópicas. Tales componentes típicamente incluyen, pero no se limitan a, un hidrogel de propilenglicol; una combinación de un glicol, un derivado de celulosa y una sal de aluminio soluble en agua; un antiséptico; un antibiótico; y un corticosteroide. También se pueden añadir humectantes (tales como ésteres de cera sólidos o líquidos), promotores de absorción (tales como arcillas hidrófilas o almidones), agentes que aumentan la viscosidad y agentes protectores de la piel. Las formulaciones tópicas pueden estar en forma de enjuagues tales como enjuagues bucales. Véase, p. ej., el documento WO2004/004650.

Los compuestos de la presente divulgación también pueden administrarse mediante inyección de un agente terapéutico que comprenda la cantidad adecuada de polipéptido de lisina y un portador. Por ejemplo, los polipéptidos de lisina se pueden administrar por vía intramuscular, intratecal, subdérmica, subcutánea o intravenosa para tratar infecciones por bacterias Gram-negativas, más específicamente las causadas por P. aeruginosa. El portador puede estar compuesto por agua destilada, solución salina, albúmina, suero o cualquier combinación de los mismos. Además, las composiciones farmacéuticas de las inyecciones parenterales pueden comprender soluciones acuosas o no acuosas farmacéuticamente aceptables de polipéptidos de lisina además de uno o más de los siguientes: soluciones tamponadas para el pH, adyuvantes (p. ej., conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes), formulaciones liposomales, nanopartículas, dispersiones, suspensiones o emulsiones, así como polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso. En los casos en que la inyección parenteral es el modo de administración elegido, se utiliza preferiblemente una formulación isotónica. Generalmente, los aditivos para la isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren las soluciones isotónicas, tales como la solución salina tamponada con fosfato. Los estabilizadores pueden incluir gelatina y albúmina. Se puede añadir un agente de vasoconstricción a la formulación. Las preparaciones farmacéuticas según este tipo de aplicación se proporcionan estériles y libres de pirógenos.

El diluyente puede comprender adicionalmente uno o más excipientes tales como, por ejemplo, etanol, propilenglicol, un aceite o un emulsionante o tensioactivo farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones de la presente divulgación pueden ser composiciones inhalables. Las composiciones inhalables de la presente divulgación pueden comprender adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. El polipéptido o los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden formular ventajosamente como un polvo inhalable seco. La solución para inhalación de polipéptidos de lisina se puede formular adicionalmente con un propelente para administración en aerosol. Las soluciones se pueden nebulizar.

Se puede añadir un tensioactivo a una composición farmacéutica inhalable de la presente divulgación para reducir la tensión superficial e interfacial entre los medicamentos y el propelente. Cuando los medicamentos, el propelente y el excipiente van a formar una suspensión, puede ser necesario o no un tensioactivo. Cuando los medicamentos, el propelente y el excipiente van a formar una solución, puede ser necesario o no un tensioactivo, dependiendo en parte de la solubilidad del medicamento y excipiente particulares. El tensioactivo puede ser cualquier compuesto no tóxico adecuado que no reaccione con el medicamento y que reduzca sustancialmente la tensión superficial entre el medicamento, el excipiente y el propelente y/o actúe como lubricante de válvula.

Los ejemplos de tensioactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a: ácido oleico; trioleato de sorbitán; cloruro de cetilpiridinio; lecitina de soja; monolaurato de polioxietilen (20) sorbitán; polioxietilen (10) estearil éter; polioxietilen (2) oleil éter; copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietilen etilendiamina; monoestearato de polioxietilen (20) sorbitán; monooleato de polioxietilen (20) sorbitán; copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno; producto etoxilato de aceite de ricino; y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de propelentes adecuados incluyen, pero no se limitan a: diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano y dióxido de carbono.

Los ejemplos de excipientes adecuados para su uso en composiciones inhalables incluyen, pero no se limitan a: lactosa, almidón, diésteres de propilenglicol de ácidos grasos de cadena media; ésteres de triglicéridos de ácidos grasos de cadena media, cadenas cortas o cadenas largas, o cualquier combinación de los mismos; perfluorodimetilciclobutano; perfluorociclobutano; polietilenglicol; mentol; lauroglicol; monoetiléter de dietilenglicol; glicéridos poliglicolizados de ácidos grasos de cadena media; alcoholes; aceite de eucalipto; ácidos grasos de cadena corta; y combinaciones de los mismos.

Las composiciones de la presente divulgación pueden comprender aplicaciones nasales. Las aplicaciones nasales incluyen, por ejemplo, pulverizaciones nasales, gotas nasales, ungüentos nasales, lavados nasales, inyecciones nasales, tapones nasales, pulverizaciones bronquiales e inhaladores, o indirectamente mediante el uso de pastillas para la garganta, enjuagues bucales o gárgaras, o mediante el uso de ungüentos aplicados en las narinas nasales, o la cara o cualquier combinación de estos y métodos similares de aplicación.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden contener un agente complementario, incluidos uno o más agentes antimicrobianos y/o uno o más antibióticos convencionales. Para acelerar el tratamiento de la infección o aumentar el efecto antibacteriano, el agente terapéutico que contiene uno o más polipéptidos de lisina de la presente divulgación puede incluir adicionalmente al menos un agente complementario que también puede potenciar la actividad bactericida del polipéptido de lisina. El agente complementario puede ser uno o más antibióticos utilizados para tratar bacterias Gram-negativas. Preferiblemente, los agentes complementarios son antibióticos o agentes antimicrobianos utilizados para el tratamiento de infecciones causadas por P. aeruginosa. Dosificación y frecuencia de administración a los sujetos

Las composiciones de la presente divulgación se pueden presentar en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar mediante cualquier método bien conocido en la técnica. La cantidad de ingredientes activos que se pueden combinar con un material portador para producir una forma de dosificación unitaria variará según el anfitrión que se esté tratando, la duración de la exposición del receptor a las bacterias infecciosas, el tamaño y el peso del sujeto y el modo particular de administración. La cantidad de ingredientes activos que se pueden combinar con un material portador para producir una forma de dosificación unitaria generalmente será la cantidad de cada compuesto que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por ciento, la cantidad total oscilará entre aproximadamente 1 por ciento y aproximadamente noventa y nueve por ciento de los ingredientes activos, preferiblemente entre aproximadamente 5 por ciento y aproximadamente 70 por ciento, lo más preferiblemente entre aproximadamente 10 por ciento y aproximadamente 30 por ciento.

Las dosificaciones administradas dependen de una serie de factores que incluyen la actividad de la infección que se está tratando, la edad, la salud y el estado físico general del sujeto que se va a tratar, la actividad de un polipéptido de lisina en particular, la naturaleza y la actividad del antibiótico, si lo hay, con el que se empareja un polipéptido de lisina según la presente divulgación y el efecto combinado de tal emparejamiento. En general, se prevé que las cantidades eficaces de los presentes polipéptidos de lisina que se van a administrar estén dentro del intervalo de 1 a 50 mg/kg administrados de 1 a 4 veces al día durante un período de hasta 14 días. El antibiótico, si también se utiliza uno, se administrará en regímenes de dosificación convencionales o en cantidades más bajas. Sin embargo, todas estas dosificaciones y regímenes (tanto del polipéptido de lisina como de cualquier antibiótico administrado junto con el mismo) están sujetos a optimización. Las dosificaciones óptimas se pueden determinar realizando experimentos piloto de eficacia in vitro e in vivo como está dentro del conocimiento práctico de la técnica, pero teniendo en cuenta la presente divulgación.

En algunas realizaciones, el tiempo de exposición a las unidades de polipéptido de lisina activa puede influir en la concentración deseada de unidades de polipéptido de lisina activa por ml. Los portadores clasificados como portadores de liberación "prolongada" o "lenta" (tales como, por ejemplo, ciertas pulverizaciones nasales o pastillas) podrían poseer o proporcionar una concentración más baja de unidades de polipéptido de lisina por ml, pero durante un período de tiempo más largo, mientras que un portador de liberación "corta" o "rápida" (tal como, por ejemplo, hacer gárgaras) podría poseer o proporcionar una alta concentración de unidades de polipéptido de lisina por ml, pero durante un período de tiempo más corto. Hay circunstancias en las que puede ser necesario tener una dosificación unitaria/ml mucho más alta o una dosificación unitaria/ml más baja.

Para cualquier polipéptido de lisina de la presente divulgación, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se puede utilizar para lograr un intervalo de concentración y una vía de administración deseables. La información obtenida se puede utilizar a continuación para determinar las dosis eficaces, así como las vías de administración en seres humanos. La dosificación y la administración se pueden ajustar adicionalmente para proporcionar niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores adicionales que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la edad, el peso y el sexo del paciente; la dieta, la duración deseada del tratamiento, el método de administración, el tiempo y la frecuencia de administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia y el criterio del médico a cargo.

Un régimen de tratamiento puede implicar la administración diaria (p. ej., una, dos, tres veces, etc. al día), cada dos días (p. ej., una, dos, tres veces, etc. cada dos días), quincenal, semanal, una vez cada dos semanas, una vez al mes, etc. En una realización, el tratamiento puede administrarse como una infusión continua. Las dosis unitarias se pueden administrar en múltiples ocasiones. Los intervalos también pueden ser irregulares, según indique el seguimiento de los síntomas clínicos. Alternativamente, la dosis unitaria se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia pueden variar según el paciente. Un experto en la técnica entenderá que tales directrices se ajustarán para la administración localizada, p. ej., intranasal, inhalación, rectal, etc., o para la administración sistémica, p. ej. oral, rectal (p. ej., mediante enema), i.m. (intramuscular), i.p. (intraperitoneal), i.v. (intravenosa), s.c. (subcutánea), transuretral y similares.

Ejemplos

Ejemplo 1 (no según la invención)

Identificación de lisinas Gram-negativas

Los supuestos candidatos de PGH, que pueden utilizarse para destruir bacterias Gram-negativas, se identificaron mediante un protocolo de búsqueda bioinformático. En primer lugar, los autores de la presente invención generaron una breve lista de PGH de P. aeruginosa obtenidas de secuencias genómicas anotadas que se escrutaron con términos de búsqueda de lisinas de bacteriófagos, que incluían "amidasa", "lisozima", "glucosaminidasa", "endopeptidasa", "peptidoglicano hidrolasa", "transglicosilasa lítica", "endolisina", "lisina", e "hidrolasa de la pared celular". Las PGH identificadas de esta manera se utilizaron para buscar, mediante análisis BLASTP, todas las secuencias de P. aeruginosa del genoma en GenBank (grupo de P. aeruginosa; Taxid: 136841) y la secuencia genómica de la cepa ARL-13 de Micavibrio aeruginosavorus para generar un grupo más grande de supuestas PGH. A continuación, se eligió un subgrupo de este grupo, compuesto por 46 PGH, para un estudio adicional: los criterios para la inclusión aquí fueron la diversidad con respecto a la conservación de la secuencia e incluían enzimas altamente y escasamente conservadas con una gama de supuestas actividades catalíticas/de unión a la pared celular. Las 46 PGH se sintetizaron, se clonaron en el vector de expresión bacteriano pBAD24 (Guzman et al., J Bacterio!. (14):4121-30 (1995)), y transformaron en la cepa Top10 de E. coli (Life Technologies). Para evaluar la actividad, todos los clones de E. coli (incluidos los controles de vector) se escrutaron utilizando un ensayo basado en placa para determinar la actividad lítica contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa. A continuación, los clones positivos se analizaron adicionalmente con respecto a la inducción de proteína soluble en cultivos líquidos de LB de la manera descrita (Schuch et al., Nature, 418 (6900):884-9, (2002)). Para las lisinas solubles y activas, se examinaron a continuación extractos de E. coli brutos de cultivos inducidos para determinar la capacidad para inducir la permeabilización de la cepa PAO1 de aeruginosa utilizando la sonda fluorescente hidrófoba 1-N-fenilnaftilmina (NPN). El ensayo NPN es un método convencional (Helander y Mattila-Sandholm, J Appl Microbiol., 88(2):213-9. (2000)) para escrutar compuestos que alteran la membrana externa bacteriana. Este enfoque de escrutinio finalmente produjo 5 PGH candidatas (con dominios helicoidales alfa N- y C-terminales) en los genomas de las cepas de Pseudomonas aeruginosa, y otros organismos Gram-negativos (incluyendo Micavibrio aeruginosavorus), así como aquellos identificados mediante metagenómica marina. A continuación, las proteínas resultantes se analizaron para determinar su actividad antibacteriana contra la cepa PAO1 de P. aeruginosa, que es resistente a los antibióticos de penemo (Okamoto et al. Antimicrob Agents Chemother. 45(7): 1964-71 (2001)).

Para evaluar la actividad de las lisinas purificadas, se examinó la absorción de la sonda fluorescente hidrófoba 1-N-fenilnaftilmina (NPN) por la cepa PAO1 de P. aeruginosa. Dado que la membrana externa de las bacterias Gramnegativas actúa como una barrera de permeabilidad para los compuestos hidrófobos, incluidas las lisinas y NPN, la actividad permeabilizante de las GN puede evaluarse y se evaluó por la capacidad del compuesto hidrófobo para alcanzar la diana interna. Por lo tanto, mientras que la NPN normalmente está excluida por la membrana externa, exhibe una intensidad de fluorescencia prominente cuando se reparte en la bicapa lipídica de la membrana externa.

Se obtuvo PAO1 de P. aeruginosa de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Las bacterias se cultivaron a una concentración inicial de 105 UFC/ml en medio LB (Sigma-Aldrich) en una incubadora con agitador oscilante a 37°C y 250 r.p.m. El cultivo de P. aeruginosa se hizo crecer hasta el comienzo de la fase exponencial (A550 ~ 0,3) al que se añadió cada una de las lisinas candidatas (GN) a una concentración de 10 mcg/ml. Para medir la captación de NPN, se añadió NPN 10 pM a células en crecimiento exponencial que contenían GN1, GN2, GN4, GN8, GN14, GN20, GN22, GN26, GN27, GN28, GN30, GN37 y GN43 en PBS y se controló la fluorescencia a 420 nm a 1 hora con un espectrofotómetro de fluorescencia (Figura 3). Se utilizaron antibióticos de polimixina B (5 mcg/ml) y EDTA (1 mM) como controles positivos, mientras que las células tratadas con NPN, pero sin la adición de lisina sirvieron como control negativo.

Como se muestra en la Figura 3, se observó una fuerte señal fluorescente cuando las células de P. aeruginosa se trataron con GN2 (SEC ID NO: 2), GN4 (SEC ID NO: 3), GN14 (SEC ID NO: 4), GN37 (SEC ID NO: 1) o GN43 (SEC ID NO: 5) en presencia de NPN (barras de color gris). Las características generales de cada lisina se muestran en la Tabla 4.

En conjunto, estos resultados identifican un grupo de lisinas GN que exhiben la capacidad de penetrar en la ME de bacterias Gram-negativas, estableciendo un primer paso en la identificación de lisinas activas contra bacterias Gramnegativas sin la necesidad de recurrir a la adición de segmentos de péptidos heterólogos.

Tabla 4. Características generales de G2, GN4, GN14, GN37 y GN43.

Lisina Tamaño _Pl Clase Fuente Acceso a Homología Característica (AA) GenBank

GN2 147 6,16 Lisozima Metagenoma EDG23390.1 50-75% con Extremo C-marino gama de lisinas terminal a-Gram- helicoidal

GN4 144 9,58 Lisozima Pseudomonas YP_002284361.1 >90% (lisinas de Extremo C-fago PAJU2 fago Pa) terminal ahelicoidal

GN14 189 9,14 NLPC_P60 Pseudomonas YP_006382555.1 >97% con 3 Amidasa?

fago PAJU2 lisinas de fago

Pa

GN37 126 9,69 Peptidasa_M15_4 Micavibrio <67% con Gran dominio de aeruginosavorus

bacteriocina y unión N-terminal petidasas G- a-helicoidal

GN43 439 9,55 LysM- Pseudomonas PaerPAb_03459 <100% con la Multidominio Peptidasa_M 23 sp. gama de

peptidasas de

pseudomonas

Ejemplo 2 (no según la invención)

Las lisinas GN exhiben una fuerte actividad antibacteriana contra bacterias Gram-negativas

Para evaluar la actividad antibacteriana de las lisinas purificadas, se evaluó la viabilidad de la cepa PAO1 de P. aeruginosa viva después de la incubación con lisinas GN individuales. Brevemente, se trataron 106 células PAO1 con la lisina GN indicada a una concentración de 25 mcg/ml durante 1 hora (a 37 °C, sin agitación) en presencia de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2). Como controles se utilizaron polimixina B (PMB, a 25 mcg/ml), novobiocina (Nov, a 5 mcg/ml), EDTA (1 mM) y lisozima humana (HuLYZ, a 25 mcg/ml). El umbral de detección fue de 2,0 Log10 UFC/ml.

Como muestra la Figura 4, cada lisina GN exhibió una mayor actividad antibacteriana que HuLYZ o novobiocina, mientras que GN4 (SEQ ID NO: 3), GN14 (SEQ ID NO: 4) y GN37 (SEQ ID NO: 1) mostraron una mayor actividad antibacteriana o actividad antibacteriana equivalente en comparación con EDTA y PMB respectivamente.

Este experimento demuestra que las GN pueden exhibir una actividad antibacteriana equivalente o mayor que cualquiera de los antibióticos convencionales, la lisozima humana o el agente quelante EDTA contra las bacterias Gram-negativas.

Ejemplo 3 (no según la invención)

GN37 es un agente antibacteriano gramnegativo altamente efectivo

La lisina GN37 es un polipéptido de 126 aminoácidos (Figura 1A) codificado por el locus MICA_542 de 381 pb de Micavibrio aeruginosavorus. M. aeruginosavorus es un depredador de P. aeruginosa y no se ha explotado previamente como fuente de actividades de PGH anti-pseudomonas. La lisina GN37 es una proteína altamente cargada positivamente con un pI previsto de 9,69. Además, GN37 es miembro de la familia Peptidasa_M15_4 de PGH con actividades DD- y DL-carboxipeptidasa (incluidos los miembros de la superfamilia VanY) (Figura 1B). Según el análisis BLASTP, GN37 (SEQ ID NO: 1) es <67% [idéntico a las proteínas de más de 50 especies Gramnegativas diferentes y 1 especie de bacteria Gram-positiva. En la Figura 1C se muestra un alineamiento de secuencia múltiple que compara GN37 con el homólogo Gram-positivo (de Streptomyces, secuencia GenBank AGJ50592.1) y proteínas de patógenos Gram-negativos, incluidos E. coli (WP_001117823.1 y NP_543082.1), Yersinia spp. (CAJ28446.1) y Acinetobacter baumannii, (WP_034684053.1). Es importante destacar que no hay secuencias en la base de datos pública con >67% de identidad con GN37.

Ejemplo 4

Los derivados peptídicos de GN4 exhiben una potente actividad antibacteriana

Además de las lisinas de longitud completa, también se generaron y examinaron cinco derivados peptídicos de GN4 (correspondientes a un fragmento C-terminal helicoidal de base alfa) (Figura 5). El primer péptido (FGN4-1, (SEQ ID NO: 7)) corresponde a un dominio alfa-helicoidal C-terminal de 42 aminoácidos. Se llegó a esto teniendo en cuenta las predicciones de la estructura secundaria de la proteína de que esta región era suficiente para generar el dominio anfipático alfa-helicoidal C-terminal de GN4 (alternativamente, se podría haber llegado a él mediante el truncamiento progresivo del extremo del C-terminal y probando el efecto sobre la actividad cada vez). La justificación de las modificaciones adicionales se ha descrito en otra parte de la memoria descriptiva.

Se añadió una sola cisteína C-terminal a FGN4-1 (SEQ ID NO: 7) para generar FGN4-4 (SEQ ID NO: 10). Para los 3 péptidos adicionales, los 11 restos C-terminales de FGN4-1 se eliminaron (FGN4-2, (SEQ ID NO: 8)) o se eliminaron y reemplazaron por un solo resto de lisina (K) (FGN4-3, (SEQ ID NO: 9)) o un péptido antibacteriano de 8 restos identificado a partir de la cápside de la hepatitis B (PGN4, (SEQ ID NO: 6)). El péptido de la hepatitis B es SQSRESQC y tiene el número de ID de epítopo 96916 de la Base de Datos de Epítopos Inmunitarios. La actividad antibacteriana de cada péptido derivado de GN4 se examinó en un ensayo de destrucción (Figura 6), donde 105 células PAO1 se trataron con el derivado peptídico indicado a una concentración de 10 mcg/ml durante 1 hora (a 37°C, sin agitación) en presencia de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2). El umbral de detección fue de 2,0 log 10 UFC/ml. Como se ilustra en la Figura 6, cada uno de los péptidos probados mostró cierta actividad antibacteriana (en comparación con el tampón que sirvió como control negativo), mientras que FGN4-1 y FGN4-4 exhibieron una actividad superior, con una disminución de >4 log en la viabilidad celular.

Ejemplo 5

Las lisinas GN y los péptidos GN muestran sólidas propiedades antibacterianas

A continuación, se evaluaron las propiedades antibacterianas de las lisinas GN y los péptidos GN en suero humano. Las células de P. aeruginosa se incubaron en suero humano durante 1 hora a 37°C, sin agitación, y se examinó la actividad frente a la fase exponencial de PAO1. Las lisinas GN y los péptidos GN (a 25 mcg/ml) se reunieron cada uno en presencia y ausencia de una concentración sub-CMI de polimixina B (PMB) (1 mcg/ml). El umbral de detección fue de 2,0 log 10 UFC/ml. Como se muestra en la Figura 7, el grupo de lisina GN solo demostró propiedades antibacterianas similares a las mostradas por la polimixina B. Además, cuando se combinó con PMB, tanto el grupo de péptidos como el grupo de lisina dieron como resultado una disminución de la viabilidad de >4 log10.

En conjunto, estos hallazgos indican una fuerte actividad aditiva o sinérgica entre PMB y los polipéptidos de lisina (GN) o los péptidos de lisina en el suero humano. Dado que estudios previos han demostrado una fuerte actividad antimicrobiana de los componentes individuales de una mezcla de lisina combinada, se anticipa que además de los grupos de lisina, los componentes de lisina individuales también mostrarán una fuerte actividad aditiva o sinérgica con los antibióticos (Loeffler et al. Antimicrob Agents Chemother. Ene; 47(1):375-377 (2003)).

Ejemplo profético 1

Prueba de lisinas GN aisladas

En este Ejemplo, el objetivo es verificar que los polipéptidos de lisina GN y los derivados peptídicos de GN4 descritos en el presente documento son capaces individualmente de inhibir el crecimiento o destruir cepas bacterianas Gram-negativas además de P. aeruginosa. Para hacerlo, los polipéptidos aislados de esta divulgación (que pueden expresarse como se describe en el presente documento y purificarse mediante técnicas convencionales) se probarán para determinar su actividad antimicrobiana frente a varias cepas Gram-negativas tales como Klebsiella pneumoniae NCTC 9633 (ATCC 13883), Enterobacter aerogenes NCTC 10006 (ATCC 13048), Citrobacter freundii NCT 9750 (ATCC 8090), Salmonella typhimurium CDC 6516-60 (ATCC 14028), Yersinia pestis (ATCC BAA-1511D-5), Francisella tulerensis (ATCC 6223) y Escherichia coli DSM 1103 (ATCC 25822), todas disponibles comercialmente. En brazos adicionales de este experimento, la cepa se puede seleccionar para que sea resistente a uno o más antibióticos de atención convencionales, como la cepa Br667 de P. aeruginosa resistente a múltiples fármacos.

Brevemente, los polipéptidos de lisina GN y los péptidos GN4 se probarán a una concentración de 5-15 mcg/ml durante 1 hora (a 37 °C, sin agitación) en presencia de tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,2). El umbral de detección será de 2,0 Log10 UFC/ml. La actividad de cada polipéptido de lisina o fragmento del mismo se probará sola o en combinación con un antibiótico activo contra bacterias Gram-negativas tales como la polimixina B u otro antibiótico activo contra bacterias Gram-negativas tal como la gentamicina. En brazos de este experimento en donde se prueba la capacidad de un polipéptido de lisina para superar la resistencia a un antibiótico, el antibiótico seleccionado será uno al que sea resistente la bacteria particular. Se retirará una alícuota de 100 pL de inóculo del medio de cultivo en diferentes momentos (0, 1, 4 y 8 h) para la determinación de UFC/mL por la técnica de recuento en placa.

Basándose en la conservación de la estructura de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, y en la efectividad de GN4 y sus derivados anteriores y otras lisinas de la presente divulgación y Ejemplos contra P. aeruginosa, se anticipa que los polipéptidos de lisina de la presente divulgación exhibirán actividad antibacteriana contra otras cepas (distintas de P. aeruginosa) de bacterias Gram-negativas.

Ejemplo profético 2

Prueba de los efectos sinérgicos y aditivos entre las lisinas GN/péptidos de lisina y antibióticos adicionales De manera similar al diseño experimental descrito en el Ejemplo 5, los polipéptidos de lisina divulgados en el presente documento se probarán para determinar efectos sinérgicos o aditivos cuando se usen combinados con antibióticos adicionales (que no sean PMB). Las propiedades antibacterianas sinérgicas o aditivas de las lisinas GN y los péptidos GN se evaluarán en suero humano. Se incubará P. aeruginosa en suero humano durante 1h a 37°C, sin agitación, y se examinará la actividad frente a la fase exponencial de PAO1. Las lisinas GN y los péptidos GN (a 10-25 mcg/ml) se incubarán cada uno en presencia y ausencia de una concentración por debajo de la CMI de un antibiótico tal como novobiocina, un aminoglucósido, Carbapenemo, Ceftazidima (tercera generación), Cefepima (cuarta generación), Ceftobiprol (quinta generación), una Fluoroquinolona, Piperacilina, Ticarcilina, Colistina, una Rifamicina (tal como rifampicina, rifabutina, rifapentina, etc.) y una Penicilina. La viabilidad bacteriana se determinará en UFC/ml mediante la técnica de recuento en placa.

Ejemplo profético 3

Prueba de polipéptidos de lisina para el tratamiento de P. aeruginosa resistente a múltiples fármacos utilizando un modelo de neumonía in vivo

Los ratones C57 Black adultos se mantendrán en un entorno controlado en jaulas en condiciones específicas libres de patógenos. Serán anestesiados brevemente con sevorano inhalado (Abbot Laboratories) en una cámara oxigenada y colocados en posición supina con la cabeza elevada. Se instilarán lentamente inóculos bacterianos (106 ufc en 50 pl de solución de Ringer lactato) de la cepa Ka02 de P. aeruginosa MDR en el pulmón izquierdo de cada animal utilizando una aguja de sonda.

Los animales se separarán aleatoriamente en 3 grupos de tratamiento experimental. Los 3 grupos consistirán en lo siguiente: 1) Grupo Tratado con Solución Salina (n=5), en donde la solución salina se administrará i.v. 1 h después de la infección seguida de una administración i.p. adicional a las 5 h de la infección; 2) Grupo GN4 del Polipéptido de Lisina (n = 5), en donde se administrará GN4 i.v. 1 hora después de la infección a una dosis de 20 mg/kg seguida de una administración i.p. adicional a las 5 h de la infección a una dosis de 15 mg/kg; y 3) Control positivo - Grupo tratado con imipenemo (n = 5), en donde "Tienam" (Merck, Sharpe and Dohme)] (ingrediente activo, imipenemo, un antibiótico de carbapenemo) se administrará i.p. 1 h después de la infección a una dosis de 25 mg/kg seguida de una administración i.p. adicional a 25 mg/kg en puntos de tiempo de 5 horas, 24 horas, 29 horas, 48 horas y 53 horas después de la infección.

Se controlará la supervivencia de los tres grupos cada 12 horas hasta el día 9 después de la infección. El mismo diseño experimental se utilizará para probar la actividad antimicrobiana in vivo de polipéptidos de lisina adicionales divulgados en el presente documento.

Ejemplo profético 4

Prueba del potencial de protección de los polipéptidos de lisina contra sepsis inducida por Pseudomonas aeruginosa en un modelo de ratón de neutropenia

La eficacia protectora de los polipéptidos de lisina contra la infección invasiva con Pseudomonas aeruginosa se medirá en el modelo de ratón neutropénico, descrito anteriormente (Pier et al. Infect. immune 57:174-179 (1989); Schreiber et al. J. Immunol. 146:188-193 (1991)). Los ratones adultos BALB/c ByJ (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) se mantendrán en un entorno libre de patógenos y pseudomonas. La neutropenia se establecerá mediante la administración de 3 mg de ciclofosfamida (Cytoxan, Bristol-Myers Squibb, Princeton, N.J.) por vía intraperitoneal a cada ratón los días 1, 3 y 5. El día 5, la ciclofosfamida se administrará a las 0 horas, y 2 horas más tarde, se administrará i.p. lisina (a 20 mg/kg) o control de PBS, seguido de 103 ufc de Pseudomonas aeruginosa 06ad PA viva dos horas después. A partir de entonces, los ratones se controlarán diariamente y se medirá la mortalidad como resultado. Además, para determinar la concentración óptima de lisina para el tratamiento de animales, se probarán concentraciones adicionales de polipéptidos de lisina.

El mismo diseño experimental se utilizará para probar la actividad antimicrobiana protectora in vivo de polipéptidos de lisina adicionales divulgados en el presente documento.

Ejemplo profético 5

Tratamiento de la infección sistémica en un sujeto humano

Se tratará a un paciente con diagnóstico de infección respiratoria sistémica por P. aeruginosa resistente a múltiples fármacos con polimixina B intravenosa o en aerosol, combinada con uno o más polipéptidos de lisina descritos en el presente documento.

La dosis recomendada de polimixina B intravenosa es de 1,5 a 2,5 mg/kg/día (1 mg = 10000 UI) (Sobieszczyk ME et al., J Antimicrob Chemother., 54(2):566-9 (2004)). Se administrarán infusiones IV de polimixina B durante 60 a 90 minutos durante 15 días. Una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de lisina de la presente divulgación se administrará diariamente por vía intravenosa a una concentración predeterminada. Alternativamente, la terapia con polimixina B en aerosol se administrará diariamente (durante 14 días) a 2,5 mg/kg/día combinada con una composición farmacéutica que comprende uno o más polipéptidos de lisina de la presente divulgación. Dependiendo del estado clínico de un paciente individual, la duración y/o la concentración del régimen de tratamiento pueden variar. Además, la polimixina B intravenosa o en aerosol se puede administrar en múltiples ocasiones durante el día. Por ejemplo, Falagas et al. en Clin Med Res. 4(2): 138-146 (2006)) proporcionan información detallada sobre el uso de polimixinas intravenosas y en aerosol.

Al final del tratamiento, se evaluará a los pacientes para determinar el aclaramiento microbiológico y la seguridad. Se anticipa que el tratamiento de pacientes aquejados de infección respiratoria sistémica conducirá a la reducción de los síntomas asociados con la infección y/o a una disminución o erradicación de la población bacteriana causante en los pacientes.

Ejemplo profético 6

Tratamiento tópico de la úlcera diabética en un sujeto humano

La infección de la úlcera del pie diabético es una de las complicaciones graves de la diabetes mellitus y una de las principales causas de hospitalización entre los pacientes diabéticos. Notablemente, P. aeruginosa con frecuencia causa daño tisular severo en las úlceras del pie diabético (Sivanmaliappan y Sevanan, Int J Microbiol. ID del artículo: 605195 (2011). Con el fin de demostrar la eficacia de los polipéptidos de lisina de la presente divulgación en el tratamiento de la infección por úlceras del pie diabético, se llevará a cabo un estudio clínico.

Inicialmente, se analizará una muestra de cultivo de herida de un paciente individual para detectar la presencia de P. aeruginosa. A continuación, la susceptibilidad de P. aeruginosa a uno o más polipéptidos de lisina de la presente divulgación (p. ej., en un grupo) se confirmará utilizando, por ejemplo, el método de difusión en disco de acuerdo con los criterios del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (van der Heijden et al. Ann Clin Microbiol Antimicrob._6:8 (2007)). Alternativamente, los pacientes serán preseleccionados para cumplir con el criterio de susceptibilidad microbiana a la lisina. Paralelamente, se determinará la susceptibilidad de una cepa individual a un antibiótico adecuado que se utilizará, p. ej., polimixina B, in vitro (o los pacientes serán preseleccionados para cumplir el criterio de susceptibilidad microbiana a un antibiótico específico). Se puede utilizar una cepa susceptible, p. ej., P. aeruginosa ATCC 27853 (sensible a la polimixina) como control de calidad (CC). Además, se desarrollará la susceptibilidad de P. aeruginosa presente en un espécimen de cultivo de herida a una terapia combinada que comprende uno o varios polipéptidos de lisina y un antibiótico de elección, tal como polimixina B (para excluir la posibilidad de inhibición de lisina por el entorno de la herida; véanse el Ejemplo 5 y la Fig. 7 y la discusión de los mismos más arriba).

Siguiendo estudios de susceptibilidad in vitro, los autores de la presente invención probarán la eficacia in vivo de los polipéptidos de lisina de la presente divulgación en el tratamiento de infecciones de úlceras diabéticas. La lisina se puede administrar mediante inyección, p. ej., inyección intravenosa o subcutánea, o se puede aplicar directamente a la herida como una formulación tópica. Además, los polipéptidos de lisina se probarán combinados con un antibiótico utilizado para el tratamiento de la úlcera diabética, en donde el antibiótico se puede administrar por vía sistémica (oral o parenteral) o tópica como se indique según la dosificación convencional de un antibiótico específico. Por ejemplo, si la polimixina B se utiliza combinada con polipéptidos de lisina, la dosis recomendada de polimixina B intravenosa es de 1,5 a 2,5 mg/kg/día.

Dado que las infecciones de las úlceras del pie diabético son comúnmente polimicrobianas, con especies mixtas Gram-positivas y Gram-negativas (Citron et al. J. Clin Microbiol. 45(9): 2819-2828 (2007)), los polipéptidos de lisina de la presente divulgación se pueden utilizar combinados con más de un antibiótico y/o una o más lisinas adecuadas para el tratamiento de bacterias Gram-positivas presentes en la infección de la úlcera del pie de un paciente dado. Se anticipa que el tratamiento con lisina será seguido por una alta tasa de respuesta, por ejemplo, en términos de reducción logarítmica o erradicación de la población bacteriana o cualquier otra medida de mejora clínica o de laboratorio. Se anticipa que la respuesta a una combinación de una lisina de acuerdo con la presente divulgación y un antibiótico será aún mayor a medida que las lisinas y los antibióticos se sinergizan. De hecho, puede ser posible reducir la cantidad administrada de uno o ambos de una lisina o un antibiótico sin sacrificar la eficacia.

Ejemplo profético 7

Tratamiento tópico de quemaduras en un sujeto humano

Las infecciones de heridas por quemaduras plantean preocupaciones importantes, ya que retrasan la curación, promueven la cicatrización y pueden provocar bacteriemia, sepsis o insuficiencia orgánica. P. aeruginosa es la fuente más común de infecciones por quemaduras (Church et al. Clinical Microbiology Reviews, 19 (2), 403 - 434 (2006)). Debido a que se ha demostrado que los polipéptidos de lisina de la presente divulgación son activos frente a P. aeruginosa, se anticipa que pueden utilizarse para el tratamiento de tales infecciones como monoterapia o ventajosamente combinados sin uno o más antibióticos.

Las composiciones tópicas en forma de crema, gel y/o espuma que comprenden polipéptidos de lisina de la presente divulgación se aplicarán sobre la zona de piel afectada de pacientes que sufren quemaduras de varios grados, incluidas quemaduras de grado I, II y III. La composición tópica que contiene polipéptidos de lisina con o sin antibióticos o agentes activos adicionales (lisinas activas frente a diferentes organismos diana y opcionalmente antibióticos dirigidos a estos organismos diana) se aplicará directamente a la zona de la quemadura infectada durante diferentes intervalos de tiempo.

Se anticipa que la aplicación tópica de polipéptidos de lisina dará como resultado la reducción o eliminación de los síntomas de los pacientes, así como la reducción o erradicación de la población bacteriana causante.

SEC ID NO: 1:

GN37

Secuencia polipeptídica

MT YTLS KRS LDNLKG VHPDLV A V VHR AIQLTP VDF A VIEGLRS V S RQKEL

V A AGAS KTMN S RHLTGH A VDL A A Y VN GIRWD WPLYD AI A V A VKA A AKELG

V AI VW GGD WTTFKD GPHFELDRS KYR

SEC ID NO: 2:

GN2

Secuencia polipeptídica MKISLEGLSLIKKFEGCKLEAYKCSAGVWTIGYGHTAGVKEGDVCTQEEAEKLLRG DIFKFEE Y V QDS VKVDLDQS QFD ALV A WTFNLGPGNLRS S TMLKKLNN GE YES VPF EMRRWNKAGGKTLD GLIRRRQ AES LLFES KE WHQ V SEC ID NO: 3

GN4

Secuencia polipeptídica MRTSQRGIDLIKSFEGLRLSAYQDSVGVWTIGYGTTRGVTRYMTITVEQAERMLSND IQRFEPELDRLAK VPLN QN QWD ALMS F V YNLG A ANLAS S TLLKLLNKGD Y QGA AD QFPRW VN AGGKRLD GL VKRR A AER ALFLEPLS SEC ID NO: 4

GN14

Secuencia polipeptídica

MNNELPW V AE ARKYIGLREDT S KT S HNPKLLAMLDRMGEFS NES RA W WHDDETPW CGLFV GY CLG VAGRYVVREWYRARAWEAPQLTKLDRP A Y GALVTFTRS GGGHV GF IV GKD ARGNLM VLGGN QS N A V SIAPF A V S RVTG YFWPS FWRNKT A VKS VPFEER Y S LPLLKS N GELS TNE A SEC ID NO: 5

GN43

Secuencia polipeptídica MKRTTLNLELESNTDRLLQEKDDLLPQSVTNSSDEGTPFAQVEGASDDNTAEQDSDK PG AS V AD ADTKP VDPEWKTIT V AS GDTLS T VFTKAGLS T S AMHDMLT S S KD AKRFT HLKVGQEVKLKLDPKGELQALRVKQSELETIGLDKTDKGYSFKREKAQIDLHTAYA HGRITSSLFVAGRNAGLPYNLVTSLSNIFGYDIDFALDLREGDEFDVIYEQHKVNGKQ V AT GNIL A ARF VNRGKT YT A VR YTNKQGNT S Y YRADGS S MRKAFIRTP VDF ARIS S R FSLGRRHPILNKIRAHKGVDYAAPIGTPIKATGDGKILEAGRKGGYGNAVVIQHGQR YRTIY GHMS RF AKGIR AGTS VKQGQIIG Y V GMTGLATGPHLH YEF QIN GRH VDPLS A KLPMADPLGGADRKRFMAQTQPMIARMDQEKKTLLALNKQR SEC ID NO: 6

PGN4

Secuencia polipeptídica

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRASQSRESQC SEC ID NO: 7

FGN4-1

Secuencia polipeptídica NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLS SEC ID NO: 8

FGN4-2

Secuencia polipeptídica

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRA SEC ID NO: 9

FGN4-3

Secuencia polipeptídica

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRK SEC ID NO: 10

FGN4-4

Secuencia polipeptídica

NKGDYQGAADQFPRWVNAGGKRLDGLVKRRAAERALFLEPLSC

SEC ID NO: 11

GN37

Secuencia de polinucleótidos ATGACATACACCCTGAGCAAAAGAAGCCTGGATAACCTAAAAGGCGTTCATCCC GATCTGGTTGCCGTTGTCCATCGCGCCATCCAGCTTACACCGGTTGATTTCGCGGT GATCGAAGGCCTGCGCTCCGTATCCCGCCAAAAGGAACTGGTGGCCGCCGGCGC CAGCAAGACCATGAACAGCCGACACCTGACAGGCCATGCGGTTGATCTAGCCGC TTACGTCAATGGCATCCGCTGGGACTGGCCCCTGTATGACGCCATCGCCGTGGCT GTGAAAGCCGCAGCAAAGGAATTGGGTGTGGCCATCGTGTGGGGCGGTGACTGG ACCACGTTTAAGGATGGCCCGCACTTTGAACTGGATCGGAGCAAATACAGATGA

SEC ID NO: 12

GN2

Secuencia de polinucleótidos

ATGAAAATTAGTTTAGAGGGATTATCTCTCATCAAAAAATTTGAGGGTTGTAAAC T AGAAGC AT AC AAATGTTCTGC AGGAGTGTGG ACT AT AGGTT AT GGTC AT ACTGC AGGTGT AAAAGAAGGTGATGTTTGC AC AC AAGAGGAAGCTGAA AAATT ATT AAG

AGGAGATATCTTTAAATTTGAAGAGTATGTGCAAGATAGTGTAAAGGTTGATTTA GACCAAAGTCAATTTGACGCATTAGTTGCATGGACATTTAATTTAGGCCCAGGTA ATTTAAGAAGTTCAACCATGTTGAAAAAATTAAATAATGGAGAGTATGAATCTGT TCCTTTCGAAATGAGAAGGTGGAATAAAGCAGGTGGTAAAACCTTAGATGGTTT AATCAGAAGACGCCAAGCAGAATCATTATTATTTGAAAGTAAAGAGTGGCATCA AGTATAA

SEC ID NO: 13

GN4

Secuencia de polinucleótidos

ATGCGTACATCCCAACGAGGCATCGACCTCATCAAATCCTTCGAGGGCCTGCGCC TGTCCGCTTACCAGGACTCGGTGGGTGTCTGGACCATAGGTTACGGCACCACTCG GGGCGTCACCCGCTACATGACGATCACCGTCGAGCAGGCCGAGCGGATGCTGTC GAACGACATTCAGCGCTTCGAGCCAGAGCTAGACAGGCTGGCGAAGGTGCCACT GAACCAGAACCAGTGGGATGCCCTGATGAGCTTCGTGTACAACCTGGGCGCGGC CAATCTGGCGTCGTCCACGCTGCTCAAGCTGCTGAACAAGGGTGACTACCAGGG AGCAGCGGACCAGTTCCCGCGCTGGGTGAATGCGGGCGGTAAGCGCTTGGATGG TCTGGTTAAGCGTCGAGCAGCCGAGCGTGCGCTGTTCCTGGAGCCACTATCGTGA

SEC ID NO: 14

GN14

Secuencia de polinucleótidos

ATGAATAACGAACTTCCTTGGGTAGCCGAAGCCCGAAAGTATATCGGCCTTCGCG AAGACACTTCGAAGACTTCGCATAACCCGAAACTTCTTGCCATGCTTGACCGCAT GGGCGAATTTTCCAACGAATCCCGCGCTTGGTGGCACGACGACGAAACGCCTTG GTGCGGACTGTTCGTCGGCTATTGCTTGGGCGTTGCCGGGCGCTACGTCGTCCGC GAATGGTACAGGGCGCGGGCATGGGAAGCCCCGCAGCTTACGAAGCTTGACCGG CCCGCATACGGCGCGCTTGTGACCTTCACGCGAAGCGGCGGCGGCCACGTCGGT TTTATTGTGGGCAAGGATGCGCGCGGAAATCTTATGGTTCTTGGCGGTAATCAGT CGAACGCCGTAAGTATCGCACCGTTCGCAGTATCCCGCGTAACCGGCTATTTCTG GCCGTCGTTCTGGCGAAACAAGACCGCAGTTAAAAGCGTTCCGTTTGAAGAACG TTATTCGCTGCCGCTGTTGAAGTCGAACGGCGAACTTTCGACGAATGAAGCGTAA

SEC ID NO: 15

GN43

Secuencias de polinucleótidos

ATGAATAACGAACTTCCTTGGGTAGCCGAAGCCCGAAAGTATATCGGCCTTCGCG AAGACACTTCGAAGACTTCGCATAACCCGAAACTTCTTGCCATGCTTGACCGCAT GGGCGAATTTTCCAACGAATCCCGCGCTTGGTGGCACGACGACGAAACGCCTTG GTGCGGACTGTTCGTCGGCTATTGCTTGGGCGTTGCCGGGCGCTACGTCGTCCGC GAATGGTACAGGGCGCGGGCATGGGAAGCCCCGCAGCTTACGAAGCTTGACCGG CCCGCATACGGCGCGCTTGTGACCTTCACGCGAAGCGGCGGCGGCCACGTCGGT TTTATTGTGGGCAAGGATGCGCGCGGAAATCTTATGGTTCTTGGCGGTAATCAGT CGAACGCCGTAAGTATCGCACCGTTCGCAGTATCCCGCGTAACCGGCTATTTCTG GCCGTCGTTCTGGCGAAACAAGACCGCAGTTAAAAGCGTTCCGTTTGAAGAACG TTATTCGCTGCCGCTGTTGAAGTCGAACGGCGAACTTTCGACGAATGAAGCGTAA

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina aislado que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa; y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente en forma de una solución, una suspensión, una emulsión, una polvo inhalable, una aerosol o una pulverización.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente uno o más antibióticos adecuados para el tratamiento de bacterias Gram-negativas.

3. Un vector que comprende un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico, opcionalmente un ADNc, que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en S^eQ ID NO: 6, SEQ ID ⁿO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa, o una secuencia complementaria de dicho polinucleótido, en donde opcionalmente el ácido nucleico está conectado operativamente a un promotor heterólogo.

4. Una célula anfitriona que comprende el vector de la reivindicación 3.

5. Un polinucleótido aislado que comprende una molécula de ácido nucleico, opcionalmente un ADNc, que codifica un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina codificado inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

6. Una composición para inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir P. aeruginosa y opcionalmente otra especie de bacteria Gram-negativa, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y opcionalmente al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en un método para tratar una infección tópica o sistémica causada por P. aeruginosa y, opcionalmente, causada por al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

8. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 7 o la composición según la reivindicación 6, en donde la al menos otra especie de bacteria Gram-negativa se selecciona del grupo que consiste en Klebsiella spp, Enterobacter spp., Escherichia coli, Citrobacter freundii, Salmonella typhimurium, Yersinia pestis, y Frandscella tulerensis.

9. Una combinación para su uso en la prevención o el tratamiento de una infección por P. aeruginosa, comprendiendo la combinación una primera cantidad eficaz de un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, y una segunda cantidad eficaz de un antibiótico adecuado para el tratamiento de infecciones bacterianas Gramnegativas.

10. La combinación para su uso según la reivindicación 9, en donde el antibiótico se selecciona entre uno o más de ceftazidima, cefepima, cefoperazona, ceftobiprol, ciprofloxacina, levofloxacina, aminoglicósidos, imipenemo, meropenemo, doripenemo, gentamicina, tobramicina, amikacina, piperacilina, ticarcilina, penicilina, rifampicina, polimixina B y colistina.

11. La combinación para su uso según las reivindicaciones 9 o 10, en donde la combinación es más eficaz para inhibir el crecimiento, o reducir la población, o destruir las bacterias Gram-negativas que el antibiótico o el polipéptido de lisina individualmente.

12. Un polipéptido de lisina aislado, que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en s Eq ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

13. Un polipéptido de fusión que contiene un péptido catiónico antimicrobiano añadido a un polipéptido de lisina aislado y generado de forma recombinante que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID No : 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa.

14. Un polipéptido de lisina de fusión que comprende (i) un polipéptido de lisina que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en donde el polipéptido de lisina inhibe el crecimiento, o reduce la población, o destruye P. aeruginosa y, opcionalmente, al menos otra especie de bacteria Gram-negativa, fusionada con (ii) un péptido antimicrobiano.

15. El polipéptido de lisina de fusión de la reivindicación 14, en donde el péptido se selecciona entre defensina, péptido sushi, péptido catiónico, péptido policatiónico, péptido anfipático, péptido hidrófobo.

16. El polipéptido de lisina de fusión de las reivindicaciones 13, 14 ó 15, en donde el polipéptido de lisina está conectado covalentemente al péptido antimicrobiano directamente o a través de un conector aminoacídico o peptídico.