WO2023167311A1 - ポリペプチド及びその用途 - Google Patents

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WO2023167311A1
WO2023167311A1 PCT/JP2023/007994 JP2023007994W WO2023167311A1 WO 2023167311 A1 WO2023167311 A1 WO 2023167311A1 JP 2023007994 W JP2023007994 W JP 2023007994W WO 2023167311 A1 WO2023167311 A1 WO 2023167311A1
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seq
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acid sequence
polypeptide
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PCT/JP2023/007994
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宗一郎 津田
卓也 依田
一晃 青木
由貴江 笹倉
歩 松橋
翔平 柴垣
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ｂｉｔＢｉｏｍｅ株式会社
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/195—Proteins from microorganisms
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Definitions

  • This invention relates to polypeptides and their uses. More specifically, the present invention relates to endolysins having antibacterial activity against staphylococci and uses thereof.
  • Patent No. 5383481 describes a phage endolysin that lyses and kills Gram-positive bacteria.
  • International Publication WO2012/145630 describes PlySs2 as an endolysin against Staphylococcus aureus.
  • polypeptides have various uses, new polypeptides are desired.
  • new polypeptides with bactericidal activity against Gram-positive bacteria eg Staphylococci
  • uses thereof are desired.
  • novel polypeptides disclosed in this specification have an antibacterial effect equal to or greater than that of PlySs2 against Gram-positive bacteria (eg, staphylococci).
  • the first invention relates to a polypeptide or a salt thereof.
  • This polypeptide contains a first domain and a second domain, in that order.
  • the first domain is (1) a domain having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 13 and SEQ ID NO: 32; (2) Whether the domain has an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added from the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 9 to 13 and SEQ ID NO: 32 , (3) A domain having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 9 to 13 and SEQ ID NO: 32 and having enzymatic activity.
  • the second domain is (1) a domain having the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 14 to 19 and SEQ ID NO: 33; (2) Whether the domain has an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added from the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 14 to 19 and SEQ ID NO: 33 , (3) having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 14 to 19 and SEQ ID NO: 33, and a cell-binding domain;
  • a preferred polypeptide is (1) is a polypeptide consisting of a first domain and a second domain, (2) Is a polypeptide comprising a first domain, a linker, and a second domain in this order, and does the linker have an amino acid sequence with a length of 1 to 20 amino acid residues (in this embodiment, The polypeptide may consist only of the first domain, the linker, and the second domain), (3) consisting of a first domain, a second domain and a tag sequence, a linker connecting the first domain and the second domain and having an amino acid sequence having a length of 1 to 20 amino acid residues, the tag sequence being , a polypeptide having an amino acid sequence having a length of 2 to 10 amino acid residues added to either or both of the first domain and the second domain, or (4) the first domain, the linker, the second Consisting of a domain and a tag sequence, the linker connects the first domain and the second domain and has an amino acid sequence having a length of 1 to 20 amino acid residues, and the
  • the first domain is a domain having an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 13 and SEQ ID NO: 32
  • the second domain is a domain having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 14-19 and SEQ ID NO:33.
  • a preferred polypeptide is (1) a polypeptide having an amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 8 and SEQ ID NO: 31; (2) A polypeptide having an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added from the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOS: 1 to 8 and SEQ ID NO: 31 mosquito, (3) A polypeptide having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 8 and SEQ ID NO: 31, and having antibacterial activity against staphylococci.
  • a preferred polypeptide is a polypeptide having an amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1-8 and SEQ ID NO:31.
  • the following invention is an isolated polynucleotide containing a nucleic acid encoding any of the above polypeptides.
  • the following inventions relate to vectors containing the above-described polynucleotides.
  • An example of a vector is a plasmid.
  • the following inventions relate to host cells containing the vectors described above.
  • the following invention relates to an antimicrobial agent comprising the above polypeptide or salt thereof, the above polynucleotide, the above vector, or the above host cell.
  • antimicrobial agents are (1) food additives or disinfectants, (2) cosmetic raw materials or additives for cosmetics, (3) antifouling agents or cleaning agents for medical devices, medical manufacturing equipment or food manufacturing equipment, (4) It is a therapeutic or preventive agent for diseases associated with staphylococcus (Staphylococcus aureus) infection.
  • This specification discloses a new polypeptide.
  • This specification also discloses novel polypeptides with bactericidal activity against Gram-positive bacteria (eg Staphylococcus) and uses thereof.
  • FIG. 1 is a photograph in lieu of a drawing showing the results of SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of the purified polypeptide of SEQ ID NO:1.
  • Lane 1 is molecular weight markers.
  • Lane 2 relates to the polypeptide of SEQ ID NO:1.
  • FIG. 2 is a graph replacing a drawing showing the results of measuring the bactericidal activity of each polypeptide and antibiotic against Staphylococcus aureus over time.
  • the horizontal axis indicates elapsed time.
  • the vertical axis indicates relative OD600 values.
  • FIG. 3 is a graph replacing a drawing showing the results of measuring the bactericidal activity of each polypeptide and antibiotic against Staphylococcus epidermidis over time.
  • the horizontal axis indicates elapsed time.
  • FIG. 4 is a graph in place of a drawing showing the results of measuring the concentration-dependent bactericidal activity of SEQ ID NO: 5 (bbst1027), SEQ ID NO: 8 (bbst1037), SEQ ID NO: 31, and PlySs2 against Staphylococcus aureus.
  • the horizontal axis indicates elapsed time.
  • the vertical axis indicates relative OD600 values.
  • FIG. 5 is a graph replacing a drawing showing the results of measuring the bactericidal activity of SEQ ID NOs: 5, 8, PlySs2, and vancomycin at MIC concentrations against Staphylococcus aureus.
  • the horizontal axis indicates elapsed time.
  • FIG. 6 is a graph replacing a drawing showing the results of measuring the pharmacological effects of SEQ ID NOs: 5, 8, PlySs2, and vancomycin in a methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection bacteremia mouse model.
  • the horizontal axis indicates elapsed time.
  • the vertical axis indicates relative OD600 values.
  • the first invention relates to a polypeptide or a salt thereof.
  • This polypeptide is a polypeptide comprising a first domain and a second domain in that order.
  • Polypeptides, genes, and the like in this specification are preferably isolated and purified.
  • the polypeptide may be in salt form.
  • Polypeptides, if present, may also be solvates (eg, hydrates). Is this polypeptide (1) a polypeptide consisting of the first domain and the second domain, or (2) a polypeptide comprising the first domain, the linker, and the second domain in this order?
  • the polypeptide may consist only of the first domain, the linker, and the second domain), (3) is a polypeptide consisting of the first domain, the second domain and the tag sequence, or (4) It may be a polypeptide consisting of a first domain, a linker, a second domain and a tag sequence. Also, this polypeptide is preferably an endolysin.
  • the salt of the polypeptide is a pharmaceutically acceptable salt of the polypeptide. Examples of salts are hydrochlorides, nitrates, sulfates, sodium salts, potassium salts, calcium salts and magnesium salts.
  • the first domain is a domain having enzymatic activity.
  • An example of enzymatic activity is cell wall degrading activity.
  • the cell wall decomposing activity can be evaluated by the method shown in Examples.
  • the first domain is one of the following domains. (1) The first domain is a domain having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 9-13 and 32. (2) The first domain has 1 to 10 (preferably 1 to 4, more preferably 1 or 2) amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 9 to 13 and 32 A domain having an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added. In this case, the first domain preferably has enzymatic activity.
  • the enzymatic activity may be equivalent to the domain having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 9-13 and 32.
  • the substituted, inserted and added amino acid residues may be modified amino acid residues (the same shall apply hereinafter).
  • the first domain is a domain having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 9-13 and 32 and having enzymatic activity.
  • the enzymatic activity may be equivalent to the domain having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 9-13 and 32.
  • the enzymatic activity may be equal to or greater than the corresponding domain of the polypeptide shown in SEQ ID NO:30.
  • a linker is a region that connects the first domain and the second domain. Specifically, the linker is adjacent to the C-terminus of the first domain and the N-terminus of the linker, and the C-terminus of the linker is adjacent to the N-terminus of the second domain.
  • a linker is a moiety having a length of 1 to 20 amino acid residues. The linker may have a length of 2 or more and 15 or less amino acid residues, may have a length of 2 or more and 10 or less amino acid residues, or may have a length of 4 or more and 8 or less amino acid residues. or have a length of 5 or more and 7 or less amino acid residues.
  • a specific linker is a site having the amino acid residue sequence (GAGAGA) shown in SEQ ID NO: 20, or 1 or 2 amino acid residues are substituted or deleted from the amino acid residue sequence shown in SEQ ID NO: 20 , is the site with the inserted or added amino acid sequence.
  • the second domain is a cell binding domain (CBD).
  • CBD for example, is a targeting motif that recognizes the outer surface of bacteria.
  • the second domain is one of the following domains. (1) The second domain is a domain having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 14-19 and 33. (2) The second domain has 1 to 10 (preferably 1 to 4, more preferably 1 or 2) amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOS: 14 to 19 and 33 A domain having an amino acid sequence in which amino acid residues are substituted, deleted, inserted or added. (3) The second domain has an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 14-19 and 33, and is a cell-binding domain.
  • the second domain preferably has cell-binding ability.
  • the cell-binding ability can be evaluated based on the method described later in Examples.
  • the cell binding ability may be equal to or greater than that of the corresponding domain of the polypeptide shown in SEQ ID NO:30.
  • a tag sequence is a site with a length of 2 or more and 10 or less amino acid residues added to either or both of the first domain and the second domain.
  • Preferred tag sequences have a length of 4 or more and 8 or less amino acid residues.
  • the tag sequence is preferably added to the second domain, particularly preferably added to the C-terminus of the second domain.
  • Examples of tag sequences are His-tag (poly-His-tag), FLAG-tag, HA-tag and Myc-tag. Among these, a His tag (poly-His tag) is preferred.
  • a specific tag sequence is a site having the amino acid residue sequence (HHHHHH) shown in SEQ ID NO: 21, or one or two amino acid residues are substituted or deleted from the amino acid residue sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • a site with a deleted, inserted or added amino acid sequence is a site having the amino acid residue sequence (HHHHHH) shown in SEQ ID NO: 21, or one or two amino acid residues are substituted or deleted from the amino acid residue sequence shown in SEQ ID NO: 21.
  • polypeptides suitably include any combination of the above.
  • preferred ones are as follows. (1) a polypeptide having an amino acid sequence represented by any of SEQ ID NOS: 1-8 and 31; (2) Substitution of 1 to 10 (preferably 1 to 4, more preferably 1 or 2) amino acid residues from the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 8 and 31 , a polypeptide having a deleted, inserted or added amino acid sequence, or (3) having an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 8 and 31, grape A polypeptide having antibacterial activity against cocci.
  • the antibacterial activity against staphylococci should be comparable to that of the polypeptide having the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOs: 1-8 and 31.
  • the above polypeptide may have an antibacterial effect equal to or greater than that of the polypeptide (PlySs2) having the amino acid sequence shown by SEQ ID NO:30. If there is any discrepancy between the sequence listing and the text below, the sequence in the text below is correct.
  • the above polypeptide is preferably an endolysin polypeptide specific to the genus Staphylococcus.
  • This polypeptide is a polypeptide having lytic activity against Staphylococci.
  • the lytic activity is peptidoglycan hydrolase activity against Staphylococcal peptidoglycan.
  • the Staphylococcus genus is selected from the group consisting of S. aureus, S. epidermidis, S. simulans and S. carnosus preferably. Lytic activity can be assessed by any suitable method known to those skilled in the art. It is preferred to use one of the analytical methods described in the examples herein.
  • Polypeptides may have modifications in the amino acid sequence (eg, at the N-terminus or C-terminus) or substitutions to increase stability, solubility and activity.
  • Polypeptides of SEQ ID NOs: 1-8 and 31 include those having the amino acid residue sequences shown in SEQ ID NOs: 20 and 21 as tag sequences and linkers, respectively.
  • the relationship between the polypeptides of SEQ ID NOs: 1 to 8 and 31 and the first and second domains is as follows.
  • the polynucleotide is an isolated polynucleotide that includes nucleic acid encoding any of the polypeptides described above. This polynucleotide may be isolated and purified. Polynucleotides may be either RNA or DNA, with DNA being preferred. Examples of nucleic acids encoding any of the above polypeptides are nucleic acids having any of the base sequences of SEQ ID NOs: 22-29 and 34 (and their complementary base sequences). Nucleic acids encoding polypeptides can be designed by analyzing the codons corresponding to the amino acid residues. And methods for obtaining such nucleic acids are known. A "nucleic acid” may be deoxyribonucleotides, ribonucleotides, or mixed polymers in single- or double-stranded form.
  • This vector is a vector containing the polynucleotides described above.
  • Vectors can be plasmids, cosmids, bacteriophages and viruses that are transformed by introducing a polynucleotide, preferably plasmid vectors.
  • inventions relate to host cells containing the vectors described above.
  • host cells are E. coli, fission yeast and budding yeast.
  • Antimicrobial agents are compositions that have a bactericidal effect against Gram-positive bacteria (eg, staphylococci, including Staphylococcus aureus).
  • the antimicrobial agent comprises any polypeptide, polynucleotide, vector, or host cell described above.
  • the antimicrobial agent may optionally include a carrier such as water, a diluent, or may be a component of various products.
  • This antimicrobial agent can be used as a food additive or disinfectant.
  • Food additives are agents added to various foods to prevent food from being contaminated with microorganisms.
  • a disinfectant is a composition used to prevent microbial contamination.
  • This antimicrobial agent can be used as a raw material for cosmetics or as an additive for cosmetics.
  • the cosmetic raw material can be used as an active ingredient in cosmetics claiming antibacterial properties against microorganisms.
  • Additives for cosmetics can be used as one element added when manufacturing cosmetics.
  • This antimicrobial agent can be used as an antifouling agent or cleaning agent for medical equipment, medical manufacturing equipment, or food manufacturing equipment.
  • this antimicrobial agent can effectively dissolve biofilms, so it is preferable as an antifouling agent or cleaning agent for medical equipment, medical manufacturing equipment, or food manufacturing equipment. can be used.
  • This antimicrobial agent can be used as a therapeutic or preventive agent for diseases associated with staphylococcal infection (especially Staphylococcus aureus infection).
  • This therapeutic agent or prophylactic agent contains an effective amount of any of the above-described polypeptides or salts thereof, polynucleotides, vectors, or host cells as an active ingredient.
  • diseases associated with staphylococcal infections are epidermal infections, food poisoning, pneumonia, meningitis and sepsis.
  • These therapeutic agents and prophylactic agents can be produced by mixing known auxiliary materials (for example, carriers such as water) in addition to the above active ingredients.
  • the effective amount may be appropriately adjusted depending on the target species (human or non-human animal), sex, body weight and age.
  • a specific example of an effective amount is 0.1 to 10,000 ⁇ g per 1 kg of body weight, and the administration frequency may be appropriately adjusted according to the application.
  • This specification also provides a method of sterilizing microorganisms using an antimicrobial agent.
  • This specification also provides methods of treating and preventing the diseases described above, comprising administering to a subject (human or non-human animal) the therapeutic or prophylactic agents described above.
  • Each endolysin gene consisting of SEQ ID NOs: 22 to 29 and 34 was cloned into an E. coli expression vector pET17b vector (Novagen) so as to be expressed under the control of the T7 promoter, and transformed into the BL21(DE3) pLysS strain. .
  • the transformed bacteria were inoculated into 2 ml of LB medium containing ampicillin at a final concentration of 100 ⁇ g/ml (ampicillin-containing LB medium) and incubated overnight at 37° C. with shaking. One ml of the overnight culture was transferred to 100 ml of ampicillin-containing LB medium and cultured with shaking at 37°C.
  • IPTG was added to a final concentration of 0.1 to 0.5 mM, followed by culture with shaking at 16°C overnight. After overnight culture, the culture solution was centrifuged to collect the cells.
  • xTractor TM buffer (Clontech) was added to 100 mg of collected cells, and appropriate amounts of protease inhibitor and DNaseI were added. This was incubated on ice or at room temperature until the bacteria were lysed, then centrifuged at 10000 g and the supernatant was recovered as the soluble fraction. The soluble fraction was added to a gravity flow column packed with 1 ml of cobalt resin to allow endolysin to be captured by the cobalt resin.
  • the column was washed with 7 ml of washing solution (phosphate buffer containing 10 mM imidazole), and finally 5 ml of elution solution (phosphate buffer containing 150 mM imidazole) was added to the column and eluted through the column.
  • the liquid was collected as a purified endolysin fraction. Purified endolysin fractions were dialyzed against PBS as required.
  • the culture scale is not limited to 100 mL and is variable, and culture was performed using 5 mL to 2 L of ampicillin-containing LB medium according to the amount of endolysin required for the test.
  • the resin used for purification is not limited to cobalt resin, nickel resin can be substituted, and the purification method is not limited to gravity flow. No significant difference was observed in the activity of the purified endolysin depending on the culture scale and purification conditions.
  • MIC Minimum inhibitory concentration of endolysin against Staphylococcus aureus Antibacterial activity against Staphylococcus aureus of each endolysin and antibiotic was analyzed.
  • methicillin-sensitive Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan
  • methicillin-resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus clinical isolate No. 1658; provided by Gunma University, Japan
  • Staphylococcus aureus strain MW2 ATCC, USA
  • Staphylococcus aureus was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, the supernatant was removed, and resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). The bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of 0.1 OD600, and this was further diluted 1:100 with 2x cation-containing Mueller-Hinton medium. Diluted.
  • Endolysins or antibiotics were injected into a 96-well plate, and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was used to prepare various concentrations of proteins and antibiotics in a two-fold dilution series in a final volume of 100 ⁇ l. 100 ⁇ l of bacterial suspension was added to a 96-well plate and mixed. The plates were incubated at 37° C. for 18 hours and the OD600 values of the wells were measured to measure bacterial growth. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined, which is the lowest concentration of endolysin or antibiotic at which the OD600 value fell below 0.2.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • PlySs2 is an endolysin against Staphylococcus aureus reported by Fischetti Vincent et al. (WO2012/145630) and was used as a control. Vancomycin, a low-molecular-weight antibiotic, was used as a control.
  • MIC is a method commonly used to evaluate the efficacy of antibacterial agents, and since the MIC value is the minimum concentration of the antibacterial agent necessary to inhibit the growth of bacteria, the lower the MIC value, the higher the antibacterial activity. Indicates high.
  • the endolysins of SEQ ID NOS: 1 to 8 and SEQ ID NO: 31 exhibited better antibacterial activity against methicillin-susceptible Staphylococcus aureus and methicillin-resistant Staphylococcus aureus than the previously reported endolysin (PlySs2). Therefore, it was confirmed that the endolysins of SEQ ID NOS: 1-8 and SEQ ID NO: 31 are useful as effective antimicrobial agents against Staphylococcus aureus.
  • MIC Minimum inhibitory concentration
  • Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, and the supernatant was Removed and resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). The bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of 0.1 OD600, and this was further diluted 1:100 with 2x cation-containing Mueller-Hinton medium. Diluted.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the endolysins of SEQ ID NOS: 1-8 showed antibacterial activity even in serum.
  • the endolysins of SEQ ID NOs: 1 to 8 show lower MIC values in the presence of serum than in the absence of serum (Table 1), and have significantly antibacterial activity compared to known endolysins (PlySs2). shown to be high.
  • infectious diseases it is important that antibacterial agents act in the blood, and the above results confirmed the usefulness of the endolysins of SEQ ID NOs: 1 to 8 against infections caused by Staphylococcus aureus.
  • Bactericidal activity of endolysins against Staphylococcus aureus The bactericidal activity of each endolysin and antibiotic against Staphylococcus aureus was analyzed.
  • Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, and the supernatant was Removed and resuspended in a buffer for bactericidal activity measurement (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 0.9 mM magnesium chloride, 2.5 mM calcium chloride). The thus-prepared bacterial suspension was diluted with a bactericidal activity assay buffer to an optical density of 0.8 OD600, and 90 ⁇ l of each was added to a 96-well plate.
  • PBS Phosphate buffer solution
  • endolysin solution adjusted to 256 ⁇ g/ml with PBS
  • antibiotics were added in 10 ⁇ l portions, and immediately after mixing, OD600 value measurement was started, and OD600 values were recorded over time for 40 minutes.
  • Fig. 2 shows the results of the bactericidal activity measurement over time.
  • Vancomycin one of the antibiotics used in Staphylococcus aureus infections, did not show clear bactericidal activity in the 40-minute measurement.
  • the endolysins of SEQ ID NOs: 1 to 8 exhibited rapid bactericidal activity, which is a characteristic of endolysins, like the endolysins already reported.
  • Biofilm Disruption Activity of Endolysins Against Staphylococcus Aureus The biofilm disruption activity of each endolysin and antibiotic against biofilms of Staphylococcus aureus was analyzed.
  • Staphylococcus aureus (NBRC 13276; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, and the optical density was 0.2 to an OD600 of 0.1. It was diluted with TSB medium containing % glucose (TSBg medium) and further diluted 1:100 with TSBg medium. After suspending the thus-prepared bacterial dilution for 1 minute with a vortex mixer, 150 ⁇ l of each suspension was added to a polystyrene 96-well plate and cultured at 37° C. for 24 hours to form a biofilm. The culture medium was removed and the wells were washed by adding 300 ⁇ l of PBS.
  • This washing operation was performed two more times to completely remove the PBS.
  • 150 ⁇ l each of endolysin or antibiotic adjusted to 25.6 ⁇ g/ml with PBS was added and incubated at room temperature for 24 hours. The supernatant was removed and the wells were washed by adding 300 ⁇ l of PBS.
  • This washing operation was performed two more times to completely remove the PBS.
  • a staining solution (0.05% crystal violet, 20% methanol solution) was added in 150 ⁇ l portions and incubated at room temperature for 15 minutes. The staining solution was removed and the wells were washed by adding 300 ⁇ l of PBS. PBS was completely removed, 150 ⁇ l of 33% acetic acid was added, the stain was dissolved by pipetting, and the optical density of OD590 was measured.
  • Biofilm destruction activity was calculated by the following formula.
  • Biofilm destruction rate (%) (OD590 control -OD590 sample ) / (OD590 control -OD590 blank ) x 100
  • OD590 control is the OD590 value of the biofilm without the addition of endolysin or antibiotics
  • OD590 sample is the OD590 value of the biofilm with the addition of endolysin or antibiotics
  • OD590 blank is the biofilm without the addition of Staphylococcus aureus. is the OD590 value of the wells where there is no .
  • Vancomycin one of the antibiotics used in Staphylococcus aureus infections, did not show significant biofilm disruption activity.
  • the endolysins of SEQ ID NOs: 1 to 8 exhibited high biofilm disrupting activity, similar to the already reported endolysins.
  • Staphylococcus epidermidis (NBRC 113847; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, and the SEQ ID NO: The bactericidal activity of endolysins 1-8 was measured. The results of the bactericidal activity measurement over time are shown in FIG.
  • the endolysins of SEQ ID NOs: 1 to 8 have rapid bactericidal activity against not only Staphylococcus aureus but also Staphylococcus epidermidis, It was confirmed that the effect is exhibited.
  • Concentration-dependent bactericidal activity of endolysin against Staphylococcus aureus The concentration-dependent bactericidal activity of endolysins of SEQ ID NOs: 5, 8, 31 and PlySs2 against Staphylococcus aureus was comparatively analyzed.
  • Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, and the supernatant was Removed and resuspended in a buffer for bactericidal activity measurement (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 0.9 mM magnesium chloride, 2.5 mM calcium chloride). The thus-prepared bacterial suspension was diluted with a bactericidal activity assay buffer to an optical density of 0.9 at OD600, and 90 ⁇ l of each was added to a 96-well plate.
  • PBS Phosphate buffer solution
  • endolysin solution adjusted to 256 ⁇ g/ml with PBS
  • antibiotics were added in 10 ⁇ l portions, and immediately after mixing, OD600 value measurement was started, and OD600 values were recorded over time for 40 minutes.
  • Fig. 4 shows the results of the bactericidal activity measurement over time.
  • the endolysin of SEQ ID NO: 8 showed concentration-dependent bactericidal activity similar to PlySs2 against Staphylococcus aureus.
  • the endolysins of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 31 exhibited rapid and high bactericidal activity even at lower concentrations than PlySs2.
  • Endolysins of SEQ ID NO: 5, 8, PlySs2 and vancomycin were comparatively analyzed for their bactericidal activity against Staphylococcus aureus under MIC concentration conditions.
  • Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, and the supernatant was Removed and resuspended in a buffer for bactericidal activity measurement (20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM sodium chloride, 0.9 mM magnesium chloride, 2.5 mM calcium chloride).
  • the bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of 0.1 OD600, and this was further diluted 1:100 with 2x cation-containing Mueller-Hinton medium. After dilution, aliquots of 100 ⁇ l were taken. To this, 100 ⁇ l each of endolysin and vancomycin adjusted to double the MIC concentration was added and incubated at 37°C. At 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 6 hours, and 24 hours after the start of incubation, 20 ⁇ l of the reaction solution was collected, diluted appropriately with 1 ⁇ cation-containing Mueller-Hinton medium, and 100 ⁇ l was added to 7.5% chloride.
  • FIG. 5 shows the bactericidal activity of endolysins against Staphylococcus aureus at MIC concentrations.
  • Vancomycin showed no significant bactericidal effect until 1 hour after the start of the reaction, and showed a bactericidal effect over time from 6 hours to 24 hours.
  • all endolysins exhibited a rapid bactericidal effect within 1 hour, but with SEQ ID NO: 8 and PlySs2, bacterial regrowth was observed after 1 hour under MIC concentration conditions.
  • SEQ ID NO: 5 the number of viable bacteria decreased to below the detection limit 30 minutes after the start of the reaction, and no bacterial growth was observed until 24 hours later, demonstrating an extremely high bactericidal effect.
  • MIC Minimum inhibitory concentration of endolysin against various bacteria
  • SEQ ID NOS: 5, 8 and PlySs2 the minimum inhibitory concentration (MIC) against various types of fungi was measured, and the antibacterial spectrum of endolysin was analyzed.
  • Table 4 shows the list of bacteria used for evaluation.
  • the culture solution of each bacterium was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, the supernatant was removed, and resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0).
  • the bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of OD600 of 0.1, which was further diluted 1:100 with Mueller Hinton medium containing 2x cations. did. Endolysins or antibiotics were injected into a 96-well plate, and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was used to prepare various concentrations of proteins and antibiotics in a two-fold dilution series in a final volume of 100 ⁇ l.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the minimum inhibitory concentration ( ⁇ g/ml) results for various fungi are shown in Table 5 below.
  • >32 and >128 indicate that no significant growth inhibition was observed at least at the highest concentration of endolysin performed in each test.
  • PlySs2 showed an inhibitory effect on the growth of Staphylococcus aureus, but no significant inhibitory effect on the growth of Staphylococcus epidermidis or Staphylococcus saprophyticus of the same genus Staphylococcus. No growth inhibitory effect was observed.
  • the endolysins of SEQ ID NOs: 5 and 8 exhibit growth-inhibitory effects on bacteria belonging to the genus Staphylococcus (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus), but do not exhibit growth-inhibitory effects on bacteria other than those belonging to the genus Staphylococcus. Ta.
  • the endolysins of SEQ ID NOS: 5 and 8 exhibit a growth inhibitory effect specific to Staphylococcus bacteria, but are shown to have a broader antibacterial spectrum compared to PlysSs2, only against Staphylococcus aureus. However, it was confirmed that it is useful as an effective antimicrobial agent against Staphylococcus bacteria.
  • mice (BALB/c, female, 7 weeks old) were intraperitoneally administered with 1.0 ⁇ 10 7 CFU of methicillin-resistant Staphylococcus aureus per mouse, 1 hour, 3 hours, and 5 hours after administration of the cells. were administered at a dose of 20 mg/kg each.
  • the same amount of phosphate buffered saline (PBS) as the test substance was administered at 1 hour, 3 hours and 5 hours after administration of the cells.
  • Endolysin and phosphate buffer were administered intraperitoneally, and vancomycin subcutaneously. The survival rate of mice up to 80 hours after administration of the cells was evaluated.
  • Fig. 6 shows the results of the pharmacological effects of endolysin in the bacteremia mouse model.
  • Antibacterial activity by second domain (CBD) substitution Starting from the sequence bbst1021, bbst1027, bbst1035, bbst1036, bbst1037, nnst0103-1, several modified chimeric endolysins were generated and analyzed for antibacterial activity against Staphylococcus aureus. . Specifically, several modified endolysins were constructed that combined the first domain (EAD) of bbst1027 with the second domain (CBD) of other polypeptides. For the analysis, methicillin-sensitive Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus NBRC 100910; obtained from National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Japan) was used.
  • Staphylococcus aureus NBRC 100910 methicillin-sensitive Staphylococcus aureus
  • Staphylococcus aureus was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, the supernatant was removed, and resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). The bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of 0.1 OD600, and this was further diluted 1:100 with 2x cation-containing Mueller-Hinton medium. Diluted.
  • Endolysins or antibiotics were injected into a 96-well plate, and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was used to prepare various concentrations of proteins and antibiotics in a two-fold dilution series in a final volume of 100 ⁇ l. 100 ⁇ l of bacterial suspension was added to a 96-well plate and mixed. The plates were incubated at 37° C. for 18 hours and the OD600 values of the wells were measured to measure bacterial growth. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined, which is the lowest concentration of endolysin or antibiotic at which the OD600 value fell below 0.2.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • the modified endolysin in which the second domain was changed showed equivalent antibacterial activity compared to the original SEQ ID NO:5. Since the first domain is a domain having enzymatic activity, it directly contributes to the antibacterial activity. Confirmed to be useful.
  • Staphylococcus aureus was grown in TSB medium containing 7.5% sodium chloride, the culture solution was centrifuged at 6000 g for 5 minutes, the supernatant was removed, and resuspended in 10 mM Tris-HCl (pH 8.0). The bacterial suspension thus prepared was diluted with 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) to an optical density of 0.1 OD600, and this was further diluted 1:100 with 2x cation-containing Mueller-Hinton medium. Diluted.
  • Endolysins or antibiotics were injected into a 96-well plate, and 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) was used to prepare various concentrations of proteins and antibiotics in a two-fold dilution series in a final volume of 100 ⁇ l. 100 ⁇ l of bacterial suspension was added to a 96-well plate and mixed. The plates were incubated at 37° C. for 18 hours and the OD600 values of the wells were measured to measure bacterial growth. The minimum inhibitory concentration (MIC) was determined, which is the lowest concentration of endolysin or antibiotic at which the OD600 value fell below 0.2.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • Endolysins with altered linker length showed equivalent antibacterial activity compared to the original SEQ ID NO:5. It was confirmed that the endolysins of SEQ ID NOS: 1-8 exhibit bactericidal activity against infections caused by Staphylococcus aureus, regardless of the presence or absence of linkers and their length.
  • this invention relates to a polypeptide having an antibacterial effect against staphylococci, it can be used in the food additive, pharmaceutical, daily necessities and cosmetics industries.

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Abstract

【解決課題】　新規ポリペプチドを提供する。 【解決手段】　第１ドメイン，リンカー及び第２ドメインを含み，　第１ドメインは，　配列番号９～１３及び３２のいずれかから１個以上４個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加してもよいアミノ酸配列を有するドメインであるか，配列番号９～１３及び３２のいずれかと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，酵素活性を有するドメインであり，　リンカーは，２以上１０以下のアミノ酸残基長を有するリンカーであり，　第２ドメインは，配列番号１４～１９及び３３のいずれかから１個以上４個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加してもよいアミノ酸配列を有するドメインであるか，配列番号１４～１９及び３３のいずれかと８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，細胞結合ドメインである，ポリペプチド。

Description

ポリペプチド及びその用途
　この発明は，ポリペプチドやその用途に関する。より詳しく説明すると，この発明は，ブドウ球菌に対する抗菌作用を有するエンドリシンやその用途に関する。
　特許５３８３４８１号公報には，グラム陽性細菌を溶解・死滅させるファージエンドリシンが記載されている。国際公開ＷＯ２０１２／１４５６３０号パンフレットには，ＰｌｙＳｓ２が黄色ブドウ球菌に対するエンドリシンとして記載されている。
特許５３８３４８１号公報 国際公開ＷＯ２０１２／１４５６３０号パンフレット
　ポリペプチドは，様々な用途があるので，新しいポリペプチドが望まれる。特に，グラム陽性細菌（例えばブドウ球菌）に対して殺菌作用を有する新しいポリペプチドやその用途が望まれる。
　実施例により示された通り，この明細書において開示される新規なポリペプチドは，グラム陽性細菌（例えばブドウ球菌）に対して，ＰｌｙＳｓ２と同等かそれ以上の抗菌作用を有する。
　最初の発明は，ポリペプチド又はその塩に関する。このポリペプチドは，第１ドメイン，及び第２ドメインをこの順で含む。
　第１ドメインは，
　　（１）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであるか，
　（２）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインであるか，
　（３）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，酵素活性を有するドメインである。
　第２ドメインは，
　（１）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであるか，
　（２）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインであるか，
　（３）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，細胞結合ドメインである。
　好ましいポリペプチドは，
　（１）第１ドメイン及び第２ドメインからなるポリペプチドであるか，
　（２）第１ドメイン，リンカー，及び第２ドメインをこの順で含むポリペプチドであり，リンカーは，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有するものであるか（この態様では，ポリペプチドは第１ドメイン，リンカー，及び第２ドメインのみからなるものであってもよい），
　（３）第１ドメイン，第２ドメイン及びタグ配列からなり，リンカーは，第１ドメイン及び第２ドメインを接続し，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有し，タグ配列は，第１ドメイン及び第２ドメインのいずれか又は両方に付加した２以上１０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有する，ポリペプチドであるか，又は
　（４）第１ドメイン，リンカー，第２ドメイン及びタグ配列からなり，リンカーは，第１ドメイン及び第２ドメインを接続し，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有し，タグ配列は，第１ドメイン及び第２ドメインのいずれか又は両方に付加した２以上１０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有する，ポリペプチドである。
　好ましいポリペプチドは，第１ドメインは，配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであり，
　第２ドメインは，配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインである。
　好ましいポリペプチドは，
　（１）配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，
　（２）配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，
　（３）配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，ブドウ球菌に対する抗菌作用を有するポリペプチドである。
　好ましいポリペプチドは，配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
　次の発明は，上記したいずれかのポリペプチドをコードする核酸を含む，単離されたポリヌクレオチドである。
　次の発明は，上記したポリヌクレオチドを含むベクターに関する。ベクターの例は，プラスミドである。
　次の発明は，上記したベクターを含む宿主細胞に関する。
　次の発明は，上記したポリペプチド又はその塩，上記したポリヌクレオチド，上記したベクター，又は上記した宿主細胞を含む抗微生物剤に関する。
　抗微生物剤の例は，（１）食品添加物又は消毒剤，（２）化粧品原料又は化粧品用の添加剤，（３）医療機器，医療製造装置又は食品製造装置の防汚剤又は洗浄剤，（４）ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌）感染に伴う疾患の治療又は予防剤である。
　この明細書は，新しいポリペプチドを開示する。また，この明細書は，グラム陽性細菌（例えばブドウ球菌）に対して殺菌作用を有する新しいポリペプチドやその用途を開示する。
図１は，精製された配列番号１のポリペプチドのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。レーン１は，分子量マーカーである。レーン２が配列番号１のポリペプチドに関する。 図２は，各ポリペプチド及び抗生物質の黄色ブドウ球菌に対する経時的な殺菌活性を測定した結果を示す図面に代わるグラフである。横軸は経過時間を示す。縦軸はＯＤ６００値の相対値を示す。 図３は，各ポリペプチド及び抗生物質の表皮ブドウ球菌に対する経時的な殺菌活性を測定した結果を示す図面に代わるグラフである。横軸は経過時間を示す。縦軸はＯＤ６００値の相対値を示す。 図４は配列番号５（ｂｂｓｔ１０２７），配列番号８（ｂｂｓｔ１０３７），配列番号３１，ＰｌｙＳｓ２の黄色ブドウ球菌に対する濃度依存的な殺菌活性を測定した結果を示す図面に代わるグラフである。横軸は経過時間を示す。縦軸はＯＤ６００値の相対値を示す。 図５はＭＩＣ濃度における配列番号５，８，ＰｌｙＳｓ２，バンコマイシンの黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性を測定した結果を示す図面に代わるグラフである。横軸は経過時間を示す。縦軸は生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を示す。 図６はメチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染菌血症マウスモデルにおける配列番号５，８，ＰｌｙＳｓ２，バンコマイシンの薬理効果を測定した結果を示す図面に代わるグラフである。横軸は経過時間を示す。縦軸はＯＤ６００値の相対値を示す。
　以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
　最初の発明は，ポリペプチド又はその塩に関する。このポリペプチドは，第１ドメイン及び第２ドメインをこの順で含むポリペプチドである。この明細書におけるポリペプチドや遺伝子などは，単離・精製されたものであることが好ましい。このポリペプチドは，塩の形のものであってもよい。また，ポリペプチドは，もし存在すれば，溶媒和物（例えば水和物）であってもよい。このポリペプチドは，（１）第１ドメイン及び第２ドメインからなるポリペプチドであるか，（２）第１ドメイン，リンカー，及び第２ドメインをこの順で含むポリペプチドであるか（この態様では，ポリペプチドは第１ドメイン，リンカー，及び第２ドメインのみからなるものであってもよい），（３）第１ドメイン，第２ドメイン及びタグ配列からなるポリペプチドであるか，又は（４）第１ドメイン，リンカー，第２ドメイン及びタグ配列からなる，ポリペプチドであってもよい。またこのポリペプチドは，エンドリシンであることが好ましい。ポリペプチドの塩は，ポリペプチドの薬学的に許容される塩であることが好ましい。塩の例は，塩酸塩，硝酸塩，硫酸塩，ナトリウム塩，カリウム塩，カルシウム塩，及びマグネシウム塩である。
　第１ドメインは，酵素活性を有するドメインであることが好ましい。酵素活性の例は，細胞壁分解活性である。細胞壁分解活性は，実施例により示した方法により評価すればよい。
　第１ドメインは，以下のいずれかのドメインである。
　（１）第１ドメインは，配列番号９～１３及び３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインである。
　（２）第１ドメインは，配列番号９～１３及び３２のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下（好ましくは１個以上４個以下，より好ましくは１個又は２個）のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインである。この場合，第１ドメインは，酵素活性を有することが好ましい。酵素活性は，配列番号９～１３及び３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインと同等であればよい。置換，挿入及び付加したアミノ酸残基は，修飾アミノ酸残基であってもよい（以下同様）。
　（３）第１ドメインは，配列番号９～１３及び３２のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，酵素活性を有するドメインである。酵素活性は，配列番号９～１３及び３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインと同等であればよい。酵素活性は，配列番号３０で示されるポリペプチドの対応するドメインと同等又はそれ以上であってもよい。
　リンカーは，第１ドメインと第２ドメインとを連結する領域である。具体的には，リンカーは第１ドメインのＣ末端とリンカーのＮ末端が隣接し，リンカーのＣ末端が第２ドメインのＮ末端と隣接する。リンカーは，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有する部分である。リンカーは，２以上１５以下のアミノ酸残基長を有してもよいし，２以上１０以下のアミノ酸残基長を有してもよいし，４以上８以下のアミノ酸残基長を有してもよいし，５以上７以下のアミノ酸残基長を有してもよい。具体的なリンカーは，配列番号２０で示されるアミノ酸残基配列（ＧＡＧＡＧＡ）を有する部位であるか，配列番号２０で示されるアミノ酸残基配列から１又は２個のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有する部位である。
　第２ドメインは，細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）であることが好ましい。ＣＢＤは，例えば，細菌の外表面を認識するターゲティングモチーフである。
　第２ドメインは，以下のいずれかのドメインである。
　（１）第２ドメインは，配列番号１４～１９及び３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインである。
　（２）第２ドメインは，配列番号１４～１９及び３３のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下（好ましくは１個以上４個以下，より好ましくは１個又は２個）のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインである。
　（３）第２ドメインは，配列番号１４～１９及び３３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，細胞結合ドメインである。
　上記のとおり，第２ドメインは，細胞結合能を有するものであることが好ましい。細胞結合能は，後述する実施例における方法に基づいて評価すればよい。細胞結合能は，配列番号３０で示されるポリペプチドの対応するドメインと同等又はそれ以上であってもよい。
　タグ配列は，第１ドメイン及び第２ドメインのいずれか又は両方に付加した２以上１０以下のアミノ酸残基長を有する部位である。好ましいタグ配列は，４以上８以下のアミノ酸残基長を有する。タグ配列は，第２ドメインに付加したものであることが好ましく，特に第２ドメインのＣ末端に付加したものが好ましい。タグ配列の例はＨｉｓタグ（ポリＨｉｓタグ），ＦＬＡＧタグ，ＨＡタグ及びＭｙｃタグである。これらの中では，Ｈｉｓタグ（ポリＨｉｓタグ）が好ましい。具体的なタグ配列は，配列番号２１で示されるアミノ酸残基配列（ＨＨＨＨＨＨ）を有する部位であるか，配列番号２１で示されるアミノ酸残基配列から１又は２個のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有する部位である。
　上記したポリペプチドは，上記した任意の組み合わせを適宜含む。また，上記したポリペプチドのうち好ましいものは，以下のものである。
　（１）配列番号１～８及び３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド，
　（２）配列番号１～８及び３１のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下（好ましくは１個以上４個以下，より好ましくは１個又は２個）のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するポリペプチド，又は
　（３）配列番号１～８及び３１のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，ブドウ球菌に対する抗菌作用を有するポリペプチド。ブドウ球菌に対する抗菌作用は，配列番号１～８及び３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと同程度であればよい。または，上記のポリペプチドは，配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（ＰｌｙＳｓ２）と同等又はそれ以上の抗菌作用を有すればよい。なお，配列表と，以下のテキストとの間に齟齬がある場合，以下のテキストの配列が正しい。
　配列番号１   ｂｂｓｔ１００１        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＹＮＡＤＧＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＱＶＬＦＧＹＮＬＫＧＶＧＡＫＤＩＰＳＡＮＤＦＮＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＱＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＧＶＱＱＰＧＳＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＶＱＳＰＴＱＡＳＫＫＥＴＧＡＧＡＧＡＥＩＡＫＱＥＶＬＰＴＧＷＫＫＮＫＨＧＴＹＹＫＡＱＫＧＳＦＩＮＧＮＱＰＩＱＡＲＹＶＧＰＦＲＬＫＮＮＡＡＧＤＬＰＡＮＴＫＩＥＹＤＥＩＭＬＱＤＫＨＶＷＶＧＹＤＳＦＥＧＥＲＩＹＬＰＶＧＴＷＮＧＫＫＰＰＫＮＫＭＫＱＶＷＧＩＬＨＨＨＨＨＨ
　配列番号２   ｂｂｓｔ１００５        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＹＮＡＤＧＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＱＶＬＦＧＹＮＬＫＧＶＧＡＫＤＩＰＳＡＮＤＦＮＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＱＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＧＶＱＱＰＧＳＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＶＱＳＰＴＱＡＳＫＫＥＴＧＡＧＡＧＡＶＫＮＫＰＧＳＡＳＴＰＡＮＲＲＤＭＳＧＷＫＩＮＫＹＧＴＹＹＫＳＥＶＡＨＦＴＰＮＴＰＩＫＴＨＹＶＧＰＦＲＳＣＰＶＳＧＶＬＱＰＧＱＩＶＲＹＤＴＶＣＫＱＤＧＨＶＷＩＳＹＴＡＹＮＧＫＤＶＷＬＡＶＲＴＷＤＫＮＴＤＳＬＧＫＬＷＧＴＩＮＨＨＨＨＨＨ
　配列番号３   ｂｂｓｔ１０１４        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＹＮＡＤＧＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＱＶＬＦＧＹＮＬＫＧＶＧＡＫＤＩＰＳＡＮＤＦＮＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＱＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＧＶＱＱＰＧＳＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＶＱＳＰＴＱＡＳＫＫＥＴＧＡＧＡＧＡＶＫＮＫＰＧＳＡＳＴＰＡＮＲＲＤＭＮＧＷＫＩＮＫＹＧＴＹＹＫＳＥＶＡＲＦＴＰＮＴＰＩＫＴＨＹＶＧＰＦＲＳＣＰＶＳＧＶＬＱＰＧＱＴＩＫＹＤＴＶＣＫＱＤＧＨＶＷＶＳＹＴＡＹＮＧＫＤＶＷＬＡＶＲＴＷＮＫＴＮＤＳＬＧＫＬＷＧＴＩＮＨＨＨＨＨＨ
　配列番号４   ｂｂｓｔ１０２１        
　ＭＫＴＱＳＱＩＮＡＲＬＮＡＹＫＮＧＴＶＤＳＰＹＲＶＫＴＷＴＳＹＤＰＡＦＧＴＭＥＰＧＣＩＤＶＤＨＡＹＨＡＱＣＡＤＬＰＩＤＹＩＬＷＬＴＤＮＱＹＲＡＷＧＮＡＫＤＦＰＮＮＫＦＰＴＧＷＫＶＩＥＮＬＰＳＴＶＰＱＫＧＷＩＡＶＦＳＳＧＴＹＡＱＹＧＨＩＧＬＶＹＤＧＧＮＴＮＳＦＥＩＬＥＱＮＷＮＧＹＡＮＫＫＰＴＬＲＷＤＮＹＹＧＬＴＨＦＩＶＰＰＶＡＫＥＶＨＴＬＴＴＫＶＫＥＡＰＫＱＴＧＡＧＡＧＡＴＫＫＴＳＴＳＮＥＫＷＮＫＮＱＹＧＩＬＷＲＫＥＶＧＳＦＴＣＮＶＰＱＧＩＩＴＲＲＩＧＰＧＲＱＹＰＩＡＧＡＬＫＫＡＱＴＶＮＹＴＥＩＱＫＮＤＧＹＩＷＩＳＷＭＴＮＳＧＹＴＶＹＭＰＶＲＱＶＫＳＤＧＳＬＧＰＬＷＧＴＩＫＨＨＨＨＨＨ
　配列番号５   ｂｂｓｔ１０２７        
　ＭＡＫＴＱＴＱＩＮＫＬＶＤＳＹＬＧＫＹＶＤＦＤＧＹＹＡＦＱＣＭＤＬＡＶＳＹＶＹＫＬＴＤＧＳＦＲＭＹＧＮＡＫＤＡＩＮＮＫＦＰＳＧＷＫＶＩＲＮＱＡＡＴＶＰＫＫＧＷＩＡＶＹＴＴＧＶＹＱＱＹＧＨＩＧＩＶＹＮＧＧＮＴＳＱＦＱＩＬＥＱＮＦＤＧＬＡＮＳＰＡＫＬＲＷＤＮＹＳＧＬＴＨＦＩＶＰＰＴＫＳＡＴＴＳＳＮＧＳＡＫＴＴＴＡＫＡＫＴＳＴＰＫＴＫＫＲＫＩＭＬＶＡＧＨＧＹＮＤＰＧＡＧＡＧＡＳＳＮＴＶＫＰＶＡＳＡＷＫＲＮＫＹＧＴＹＹＭＥＥＳＡＲＦＴＮＧＮＱＰＩＴＶＲＫＶＧＰＦＬＳＣＰＶＧＹＱＦＱＰＧＧＹＣＤＹＴＥＶＭＬＱＤＧＨＶＷＶＧＹＴＷＶＧＱＲＹＹＬＰＩＲＴＷＮＧＳＡＰＰＮＱＩＬＧＤＬＷＧＥＩＨＨＨＨＨＨ
　配列番号６   ｂｂｓｔ１０３５        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＦＮＶＤＬＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＫＶＬＦＧＬＬＬＫＧＬＧＡＫＤＩＰＦＡＮＮＦＤＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＱＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＲＩＥＱＰＧＷＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＩＱＳＰＴＱＡＳＫＫＥＴＡＫＰＱＰＫＡＶＥＧＡＧＡＧＡＫＮＱＫＮＰＰＶＰＡＧＹＴＬＤＫＮＮＶＰＹＫＫＥＴＧＮＹＴＶＡＮＶＫＧＮＮＶＲＤＧＹＳＴＮＳＲＩＴＧＶＬＰＮＮＡＴＩＫＹＤＧＡＹＣＩＮＧＹＲＷＩＴＹＩＡＮＳＧＱＲＲＹＩＡＴＧＥＶＤＫＡＧＮＲＩＳＳＦＧＫＦＳＴＩＨＨＨＨＨＨ
　配列番号７   ｂｂｓｔ１０３６        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＦＮＶＤＬＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＫＶＬＦＧＬＬＬＫＧＬＧＡＫＤＩＰＦＡＮＮＦＤＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＫＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＧＩＥＱＰＧＷＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＶＱＳＰＴＱＡＰＫＫＥＴＡＫＰＱＰＫＡＶＥＧＡＧＡＧＡＫＮＱＫＮＰＰＶＰＡＧＹＴＬＤＫＮＮＶＰＹＫＫＥＴＧＮＹＴＶＡＮＶＫＧＮＮＶＲＤＧＹＳＴＮＳＲＩＴＧＶＬＰＮＮＡＴＩＫＹＤＧＡＹＣＩＮＧＹＲＷＩＴＹＩＡＮＳＧＱＲＲＹＩＡＴＧＥＶＤＫＡＧＮＲＩＳＳＦＧＫＦＳＴＩＨＨＨＨＨＨ
　配列番号８   ｂｂｓｔ１０３７        
　ＭＱＡＫＬＴＫＫＥＦＩＥＷＬＫＴＳＥＧＫＱＦＮＶＤＬＷＹＧＦＱＣＦＤＹＡＮＡＧＷＫＶＬＦＧＬＬＬＫＧＬＧＡＫＤＩＰＦＡＮＮＦＤＧＬＡＴＶＹＱＮＴＰＤＦＬＡＫＰＧＤＭＶＶＦＧＳＮＹＧＡＧＹＧＨＶＡＷＶＩＥＡＴＬＤＹＩＩＶＹＥＱＮＷＬＧＧＧＷＴＤＧＩＥＱＰＧＷＧＷＥＫＶＴＲＲＱＨＡＹＤＦＰＭＷＦＩＲＰＮＦＫＳＥＴＡＰＲＳＶＱＳＰＴＱＡＰＫＫＥＴＡＫＰＱＰＫＡＶＥＧＡＧＡＧＡＴＫＫＴＳＴＳＮＥＫＷＮＫＮＱＹＧＩＬＷＲＫＥＶＧＳＦＴＣＮＶＰＱＧＩＩＴＲＲＩＧＰＧＲＱＹＰＩＡＧＡＬＫＫＡＱＴＶＮＹＴＥＩＱＫＮＤＧＹＩＷＩＳＷＭＴＮＳＧＹＴＶＹＭＰＶＲＱＶＫＳＤＧＳＬＧＰＬＷＧＴＩＫＨＨＨＨＨＨ
　配列番号３１　ｂｂｓｔ０１０３－１
　ＭＡＫＴＱＴＱＩＮＫＬＶＤＳＹＬＧＫＹＶＤＦＤＧＹＹＡＦＱＣＭＤＬＡＶＳＹＶＹＫＬＴＤＧＳＦＲＭＹＧＮＡＫＤＡＩＮＮＫＦＰＳＧＷＫＶＩＲＮＱＡＡＴＶＰＫＫＧＷＩＡＶＹＴＴＧＶＹＱＱＹＧＨＩＧＩＶＹＮＧＧＮＴＳＱＦＱＩＬＥＱＮＦＤＧＬＡＮＳＰＡＫＬＲＷＤＮＹＳＧＬＴＨＦＩＶＰＰＴＫＳＡＴＴＳＳＮＧＳＡＫＴＴＴＡＫＡＫＴＳＧＡＧＡＧＡＴＫＫＴＳＴＳＮＥＫＷＮＫＮＱＹＧＩＬＷＲＫＥＶＧＳＦＴＣＮＶＰＱＧＩＩＴＲＲＩＧＰＧＲＱＹＰＩＡＧＡＬＫＫＡＱＴＶＮＹＴＥＩＱＫＮＤＧＹＩＷＩＳＷＭＴＮＳＧＹＴＶＹＭＰＶＲＱＶＫＳＤＧＳＬＧＰＬＷＧＴＩＫＨＨＨＨＨＨ
　上記のポリペプチドは，ブドウ球菌属に特異的なエンドリシンポリペプチドであることが好ましい。このポリペプチドは，ブドウ球菌属に対する溶菌活性を有するポリペプチドである。溶菌活性はブドウ球菌属のペプチドグリカンに対するペプチドグリカンヒドロラーゼ活性であることが好ましい。ブドウ球菌属は，黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ），表皮ブドウ球菌（Ｓ．　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ），スタフィロコッカス・シミュランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）及びスタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓ．ｃａｒｎｏｓｕｓ）からなる群から選択されることが好ましい。溶菌活性は当業者には公知の任意の適当な方法によって評価することができる。本明細書の実施例に記載した分析法の１つを用いることが好ましい。ポリペプチドは，安定性，溶解性及び活性を増大させるためにアミノ酸配列中に（例えば，Ｎ－末端又はＣ－末端に）アミノ酸や置換基により修飾を行ってもよい。
　配列番号１～８及び３１のポリペプチドは，タグ配列及びリンカーとして，それぞれ配列番号２０及び２１で示されるアミノ酸残基配列を有するものを含む。配列番号１～８及び３１のポリペプチドと，第１ドメイン及び第２ドメインの関係は，以下のとおりである。
 
　　　全長　　　　第１ドメイン　第２ドメイン
　　配列番号１　　配列番号９　　　配列番号１４　
　　配列番号２　　配列番号９　　　配列番号１５
　　配列番号３　　配列番号９　　　配列番号１６
　　配列番号４　　配列番号１０　　配列番号１７
　　配列番号５　　配列番号１１　　配列番号１８
　　配列番号６　　配列番号１２　　配列番号１９
　　配列番号７　　配列番号１３　　配列番号１９
　　配列番号８　　配列番号１３　　配列番号１７
　　配列番号３１　配列番号３２　　配列番号３３
　上記のポリペプチドは，実施例により示された通り，ブドウ球菌を死滅させる効果を有するので，この明細書は，以下の発明をも提供する。
　他の発明は，ポリヌクレオチドに関する。このポリヌクレオチドは，上記したいずれかのポリペプチドをコードする核酸を含む，単離されたポリヌクレオチドである。このポリヌクレオチドは，単離・精製されたものであってもよい。ポリヌクレオチドは，ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれでもよく，ＤＮＡが好ましい。上記したいずれかのポリペプチドをコードする核酸の例は，配列番号２２～２９及び３４のいずれかの塩基配列（及びその相補的な塩基配列）を有する核酸である。ポリペプチドをコードする核酸は，アミノ酸残基に対応するコドンを解析することで設計することができる。そして，そのような核酸を得る方法は公知である。「核酸」は，一本鎖または二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド，リボヌクレオチド，または混合ポリマーであってもよい。
　他の発明は，ベクターに関する。このベクターは，上記したポリヌクレオチドを含むベクターである。ベクターは，ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換されるプラスミド，コスミド，バクテリオファージ及びウイルスのいずれでもよく，プラスミドベクターが好ましい。
　他の発明は，上記したベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞の例は大腸菌，分裂酵母及び出芽酵母である。
　他の発明は，抗微生物剤に関する。抗微生物剤は，グラム陽性細菌（例えば，黄色ブドウ球菌を含むブドウ球菌）に対する殺菌効果を有する組成物である。この抗微生物剤は，上記した何れかのポリペプチド，ポリヌクレオチド，ベクター，又は宿主細胞を含む。この抗微生物剤は，水などの担体や希釈剤を適宜含んでもよいし，各種製品の成分であってもよい。
　この抗微生物剤は，食品添加物又は消毒剤として用いることができる。食品添加物は，各種食品に添加され，食品が微生物により汚染されることを防ぐ剤である。消毒剤は，微生物による汚染を防ぐ為に用いられる組成物である。
　この抗微生物剤は，化粧品原料又は化粧品用の添加剤として用いることができる。化粧品原料は，微生物に対する抗菌性をうたう化粧料の有効成分として用いることができる。化粧品用の添加剤は，化粧料を製造する際に添加される一要素として利用されうる。
　この抗微生物剤は，医療機器，医療製造装置又は食品製造装置の防汚剤又は洗浄剤として用いることができる。特に，後述する実施例により実証された通り，この抗微生物剤は，バイオフィルムを効果的に溶解させることができるため，医療機器，医療製造装置又は食品製造装置の防汚剤又は洗浄剤として好ましく用いることができる。
　この抗微生物剤は，ブドウ球菌感染（特に黄色ブドウ球菌感染）に伴う疾患の治療又は予防剤として用いることができる。この治療剤や予防剤は，上記した何れかのポリペプチド又はその塩，ポリヌクレオチド，ベクター，又は宿主細胞を有効成分として有効量含む。ブドウ球菌感染（特に黄色ブドウ球菌感染）に伴う疾患の例は，表皮感染症，食中毒，肺炎，髄膜炎及び敗血症である。この治療剤や予防剤は，上記の有効成分のほか，公知の副資材（例えば，水などの担体）を混合することで製造できる。有効量は，対象となる種（ヒト又は非ヒト動物）や，性別，体重及び年齢に応じて適宜調整すればよい。具体的な有効量の例は，体重１ｋｇあたり０．１～１０，０００μｇであり，投与回数は用途に応じて適宜調整すればよい。この明細書は，抗微生物剤を用いた微生物の殺菌方法をも提供する。この明細書は，対象（ヒト又は非ヒト動物）に，上記した治療剤又は予防剤を投与する工程を含む，上記した疾患の治療方法や予防方法をも提供する。
　［評価方法］
　細胞壁分解活性，細胞結合能，及び抗菌作用は，後述する最小発育阻止濃度や抗菌活性により示すことができる。
　エンドリシンの発現及び精製
　各エンドリシンの精製は，ニッケルレジンまたはコバルトレジンを用いたグラビティーフローまたはクロマトグラフィーにより，調製した。具体的な手順を以下に記載した。
　配列番号２２～２９及び３４からなる各エンドリシンの遺伝子を，Ｔ７プロモーター制御下で発現されるように大腸菌発現用ベクターｐＥＴ１７ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし，これをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株にトランスフォーメーションした。トランスフォーメーションされた菌を，１００μｇ／ｍｌの終濃度でアンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン含有ＬＢ培地）に植菌し，３７℃にて終夜振とう培養した。終夜培養液１ｍｌを，１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地に植え継ぎ，３７℃にて振とう培養した。培養液のＯＤ６００光学密度が０．４～０．８に達したら，最終濃度が０．１～０．５ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し，１６℃にて終夜振とう培養した。終夜培養後の培養液を遠心し，菌体を回収した。
　回収した菌体１００ｍｇに対して，２ｍｌのｘＴｒａｃｔｏｒＴＭバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を添加し，更にプロテアーゼインヒビターとＤＮａｓｅＩを適量添加した。菌が溶菌するまで，これを氷上もしくは室温でインキュベートし，その後１００００ｇにて遠心し，上清を可溶性分画として回収した。可溶性分画を１ｍｌのコバルトレジンが充填されたグラビティーフローカラムに添加し，エンドリシンをコバルトレジンにキャプチャーさせた。その後，７ｍｌの洗浄液（１０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝液）でカラムを洗浄し，最後に５ｍｌの溶出液（１５０ｍＭのイミダゾールを含むリン酸緩衝液）をカラムに添加し，カラムを通過した溶出液を精製エンドリシン分画として回収した。必要に応じて，精製エンドリシン分画をＰＢＳにて透析した。
　精製された配列番号１のポリペプチドのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を図１に示した。
　上述の方法において，培養スケールは１００ｍＬに限定されず可変であり，試験に必要となるエンドリシン量に応じて，５ｍＬ～２Ｌのアンピシリン含有ＬＢ培地を用いて培養を実施した。また，精製に用いるレジンはコバルトレジンに限定されず，ニッケルレジンでも代替可能であり，精製手法もグラビティーフローに限定されず，クロマトグラフィーを用いても同様に配列番号１～８のポリペプチドを精製することが可能であり，培養スケール及び精製条件によって，精製されるエンドリシンの活性に顕著な違いは認められなかった。
　エンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
　各エンドリシン及び抗生物質の黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を分析した。分析にはメチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）とメチリシン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ臨床分離株Ｎｏ．１６５８；群馬大学，日本より分与，及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＭＷ２株；ＡＴＣＣ，米国より入手）を用いた。
　黄色ブドウ球菌を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈した。　エンドリシン，または抗生物質を９６ウェルプレートに注入し，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて，様々な濃度のタンパク質及び抗生物質を２倍希釈系列にて最終分量１００μｌで調製した。１００μｌの細菌懸濁液を９６ウェルプレートに添加し，混合した。当該プレートを３７℃で１８時間培養し，ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。ＯＤ６００値が０．２を下回るエンドリシン，または抗生物質の最小濃度である，最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。
　最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を以下の表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　ＰｌｙＳｓ２はＦｉｓｃｈｅｔｔｉ　Ｖｉｎｃｅｎｔら（ＷＯ２０１２／１４５６３０）によって報告された黄色ブドウ球菌に対するエンドリシンであり，コントロールとして用いた。バンコマイシンは低分子の抗生物質であり，コントロールとして用いた。
　ＭＩＣは抗菌剤の効力を評価するのに汎用的に使用される手法であり，ＭＩＣ値は菌の発育を阻止するのに必要最小な抗菌剤濃度であるから，ＭＩＣ値が低いほど抗菌活性が高いことを示す。配列番号１～８，及び配列番号３１のエンドリシンは，メチシリン感受性黄色ブドウ球菌及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対して，既に報告されているエンドリシン（ＰｌｙＳｓ２）と比較して良好な抗菌活性を示した。従って，配列番号１～８，及び配列番号３１のエンドリシンは黄色ブドウ球菌に対する効果的な抗微生物剤として有用であることが確認された。
　ヒト血清中におけるエンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
　血清中における各エンドリシン及び抗生物質の黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を分析した。
　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈した。ヒト血清を用いて２倍希釈系列となる様々な濃度のエンドリシンまたは抗生物質を調製し，最終分量１００μｌで９６ウェルプレートに添加した。１００μｌの細菌懸濁液を９６ウェルプレートに添加し，混合した。当該プレートを３７℃で１８時間培養し，細菌増殖の有無を目視により判定した。菌沈殿物あるいは菌による培養液の混濁が認められないエンドリシンまたは抗生物質の最小濃度である，最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。測定はｎ＝３で実施し，ＭＩＣ値を範囲で示した。
　最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を以下の表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　配列番号１～８のエンドリシンは，血清中においても抗菌活性を示した。また，配列番号１～８のエンドリシンは血清非存在下（表１）と比べて血清存在下ではＭＩＣ値が低くなることが示され，公知のエンドリシン（ＰｌｙＳｓ２）と比較して顕著に抗菌活性が高いことが示された。感染症においては，血液中で抗菌剤が作用することが重要であり，上記の結果から，黄色ブドウ球菌に起因する感染症に対する配列番号１～８のエンドリシンの有用性が確認された。
　エンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性
　各エンドリシン及び抗生物質の黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性を分析した。
　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，殺菌活性測定用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．９ｍＭ塩化マグネシウム，２．５ｍＭ塩化カルシウム）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．８のＯＤ６００の光学密度となるように殺菌活性測定用緩衝液で希釈し，９６ウェルプレートに９０μｌずつ添加した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ），ＰＢＳで２５６μｇ／ｍｌに調製したエンドリシン溶液，または抗生物質を１０μｌずつ添加し，混合後ただちにＯＤ６００値の測定を開始し，４０分間経時的にＯＤ６００値を記録した。
　経時的な殺菌活性測定の結果を図２に示した。
　黄色ブドウ球菌感染症で使用される抗生物質の一つであるバンコマイシンは，４０分間の測定において明瞭な殺菌活性は示さなかった。一方で，配列番号１～８のエンドリシンは，既に報告されているエンドリシンと同様に，エンドリシンの特徴である速やかな殺菌活性を示した。
　黄色ブドウ球菌に対するエンドリシンのバイオフィルム破壊活性
　黄色ブドウ球菌のバイオフィルムに対する各エンドリシン及び抗生物質のバイオフィルム破壊活性を分析した。
　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１３２７６；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう０．２％グルコース含有ＴＳＢ培地（ＴＳＢｇ培地）で希釈し，さらにＴＳＢｇ培地で１：１００に希釈した。このようにして調製した菌希釈液を，ボルテックスミキサーで１分間懸濁した後，ポリスチレン製９６ウェルプレートに１５０μｌずつ添加し，３７℃にて２４時間培養し，バイオフィルムを形成させた。培養液を除き，ＰＢＳを３００μｌずつ添加することでウェルを洗浄した。この洗浄操作を更に２回行い，ＰＢＳを完全に取り除いた。ＰＢＳで２５．６μｇ／ｍｌに調製したエンドリシンまたは抗生物質を１５０μｌずつ添加し，室温で２４時間インキュベートした。上清を取り除き，ＰＢＳを３００μｌずつ添加することでウェルを洗浄した。この洗浄操作を更に２回行い，ＰＢＳを完全に取り除いた。染色液（０．０５％クリスタルバイオレット，２０％メタノール溶液）を１５０μｌずつ添加し，室温で１５分インキュベートした。染色液を除き，ＰＢＳを３００μｌずつ添加することでウェルを洗浄した。ＰＢＳを完全に取り除き，３３％酢酸を１５０μｌずつ添加し，ピペッティングで染色物を溶解し，ＯＤ５９０の光学密度を測定した。
　バイオフィルムの破壊活性は下記計算式によって算出した。
　バイオフィルム破壊率（％）＝（ＯＤ５９０ｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤ５９０ｓａｍｐｌｅ）／（ＯＤ５９０ｃｏｎｔｒｏｌ－ＯＤ５９０ｂｌａｎｋ）ｘ１００
　ここで，ＯＤ５９０ｃｏｎｔｒｏｌはエンドリシンあるいは抗生物質を添加していないバイオフィルムのＯＤ５９０値，ＯＤ５９０ｓａｍｐｌｅはエンドリシンあるいは抗生物質を添加したバイオフィルムのＯＤ５９０値，ＯＤ５９０ｂｌａｎｋは黄色ブドウ球菌を添加せずにバイオフィルムが存在していないウェルのＯＤ５９０値である。
　バイオフィルム破壊率（％）の結果を以下の表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　黄色ブドウ球菌感染症で使用される抗生物質の一つであるバンコマイシンは，顕著なバイオフィルム破壊活性を示さなかった。一方で，配列番号１～８のエンドリシンは，既に報告されているエンドリシンと同様に，高いバイオフィルム破壊活性を示した。
　エンドリシンの表皮ブドウ球菌に対する殺菌活性
　各エンドリシン及び抗生物質の表皮ブドウ球菌に対する殺菌活性を分析した。
　表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，ＮＢＲＣ　１１３８４７；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，実施例４に記載の方法と同じ方法で配列番号１～８のエンドリシンの殺菌活性を測定した。経時的な殺菌活性測定の結果を図３に示した。
　図３に示されるように，配列番号１～８のエンドリシンは，黄色ブドウ球菌のみならず表皮ブドウ球菌に対しても速やかな殺菌活性を有し，菌種を超えてブドウ球菌属菌に対して効果を示すことが確認された。
エンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する濃度依存的殺菌活性
　配列番号５，８，３１，及びＰｌｙＳｓ２のエンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する濃度依存的な殺菌活性を比較分析した。
　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，殺菌活性測定用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．９ｍＭ塩化マグネシウム，２．５ｍＭ塩化カルシウム）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．９のＯＤ６００の光学密度となるように殺菌活性測定用緩衝液で希釈し，９６ウェルプレートに９０μｌずつ添加した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ），ＰＢＳで２５６μｇ／ｍｌに調製したエンドリシン溶液，または抗生物質を１０μｌずつ添加し，混合後ただちにＯＤ６００値の測定を開始し，４０分間経時的にＯＤ６００値を記録した。
　経時的な殺菌活性測定の結果を図４に示した。
　配列番号８のエンドリシンは黄色ブドウ球菌に対してＰｌｙＳｓ２と類似した濃度依存的殺菌活性を示した。一方で、配列番号５及び配列番号３１のエンドリシンはＰｌｙＳｓ２と比較して，より低濃度においても速やかで高い殺菌活性を示した。
ＭＩＣ濃度におけるエンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性
　配列番号５，８，ＰｌｙＳｓ２のエンドリシン及びバンコマイシンについて，ＭＩＣ濃度条件下における黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性を比較分析した。
　黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，殺菌活性測定用緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭ塩化ナトリウム，０．９ｍＭ塩化マグネシウム，２．５ｍＭ塩化カルシウム）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈し，１００μｌずつ分取した。これに，２倍ＭＩＣ濃度に調整したエンドリシン及びバンコマイシンを１００μｌずつ添加し、３７℃にてインキュベーションした。インキュベーション開始後，１５分，３０分，１時間，６時間，２４時間時点で，それぞれ２０μｌの反応液を回収し，１ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で適宜希釈した後，１００μｌを７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ寒天培地に塗布し，３７°Ｃにて終夜培養した。培養後の菌体コロニーの数を測定し，各反応時間における生菌濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を算出した。本試験における生菌濃度の検出下限は１０ＣＦＵ／ｍｌであった。　なお、試験に使用したエンドリシン及びバンコマイシンの各ロットのＭＩＣ値は次の通りであった。バンコマイシン；１μｇ／ｍｌ，ＰｌｙＳｓ２；１６μｇ／ｍｌ，配列番号５；８μｇ／ｍｌ，配列番号８；４μｇ／ｍｌ。
ＭＩＣ濃度におけるエンドリシンの黄色ブドウ球菌に対する殺菌活性を図５に示した。
　バンコマイシンは，反応開始後１時間までの間，顕著な殺菌効果は認められず，６時間から２４時間にかけて経時的な殺菌効果を示した。一方で，いずれのエンドリシンも１時間以内に速やかな殺菌効果を示したが，配列番号８及びＰｌｙＳｓ２については，ＭＩＣ濃度条件下においては，１時間以降に菌の再増殖が認められた。一方で，配列番号５については，反応開始後３０分で生菌数は検出限界以下まで低下し，２４時間後まで菌の再生育は認められず，極めて高い殺菌効果を示した。
　エンドリシンの各種菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
　配列番号５，８，ＰｌｙＳｓ２について，様々な種類の菌に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し，エンドリシンの抗菌スペクトルを解析した。評価に使用した菌のリストを表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　各菌の培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈した。　エンドリシン，または抗生物質を９６ウェルプレートに注入し，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて，様々な濃度のタンパク質及び抗生物質を２倍希釈系列にて最終分量１００μｌで調製した。１００μｌの細菌懸濁液を９６ウェルプレートに添加し，混合した。当該プレートを３７°Ｃで１８時間培養し，ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。ＯＤ６００値が０．２を下回るエンドリシン，または抗生物質の最小濃度である，最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。
　様々な菌に対する最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を以下の表５に示した。表中の最小発育阻止濃度の表記において，＞３２，＞１２８と記載しているものは，少なくとも各試験で実施した最高濃度のエンドリシン濃度において，顕著な発育抑制が認められなかったことを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ＰｌｙＳｓ２は黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）に対して発育阻止効果を示したが同じブドウ球菌属のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓやＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓに対しては顕著な発育阻止効果は認められず，またその他の細菌に対しても発育阻止効果は認められなかった。一方で，配列番号５及び８のエンドリシンは，ブドウ球菌属の細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）に対して発育阻止効果を示し，ブドウ球菌属以外の細菌には発育阻止効果を示さなかった。従って，配列番号５及び８のエンドリシンはブドウ球菌属細菌に特異的な発育阻止効果を示すが，ＰｌｙｓＳｓ２と比較して広い抗菌スペクトルを有していることが示され，黄色ブドウ球菌に対してのみならず，ブドウ球菌属細菌に対するする効果的な抗微生物剤として有用であることが確認された。
　メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染菌血症マウスモデルにおけるエンドリシンの薬理効果
　菌血症マウスモデルにおけるエンドリシン及び抗菌剤の薬理効果を検証した。菌血症モデルの作成には，メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（臨床分離株Ｎｏ．１５８６；群馬大学，日本より分与）を用いた。被験物質として，配列番号５，配列番号８，ＰｌｙＳｓ２のエンドリシン及びバンコマイシンを用いた。
　マウス（ＢＡＬＢ／ｃ，雌，７週齢）の腹腔内に，一匹当たり１．０ｘ１０７ＣＦＵのメチシリン耐性黄色ブドウ球菌を投与し，菌体投与後，１時間，３時間，５時間の時点で被験物質をそれぞれ２０ｍｇ／ｋｇの用量にて投与した。ビークル群として，被験物質と同量のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を菌体投与後，１時間，３時間，５時間の時点で投与した。エンドリシン及びリン酸緩衝液は腹腔内に，バンコマイシンは皮下にそれぞれ投与した。菌体を投与してから８０時間までのマウスの生存率を評価した。
　　菌血症マウスモデルにおけるエンドリシンの薬理効果の結果を図６に示した。
　リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投与したビークル群では，１２時間から死亡個体が出現し，２４時間時点で全個体が死亡した。一方で，配列番号５，配列番号８，ＰｌｙＳｓ２，バンコマイシンを投与した群では，８０時間の観察期間の間，死亡個体は出現せず，顕著な生存率の改善効果が認められた。従って，配列番号５，配列番号８のエンドリシンは，試験管内のみならず，生体内においても機能し，ブドウ球菌感染症に伴う疾患の治療又は予防に効果的な抗微生物剤として有用であることが確認された。
　第２ドメイン（ＣＢＤ）置換による抗菌活性
ｂｂｓｔ１０２１、ｂｂｓｔ１０２７，　ｂｂｓｔ１０３５，　ｂｂｓｔ１０３６，　ｂｂｓｔ１０３７，　ｎｎｓｔ０１０３－１の配列から開始して、いくつかの改変キメラエンドリシンを作製し、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を分析した。具体的には、ｂｂｓｔ１０２７の第１ドメイン（ＥＡＤ）に対して、他のポリペプチドの第２ドメイン（ＣＢＤ）を組み合わせたいくつかの改変エンドリシンを構築した。分析には、メチシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１００９１０；製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ），日本より取得）を使用した。
　黄色ブドウ球菌を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈した。　エンドリシン，または抗生物質を９６ウェルプレートに注入し，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて，様々な濃度のタンパク質及び抗生物質を２倍希釈系列にて最終分量１００μｌで調製した。１００μｌの細菌懸濁液を９６ウェルプレートに添加し，混合した。当該プレートを３７℃で１８時間培養し，ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。ＯＤ６００値が０．２を下回るエンドリシン，または抗生物質の最小濃度である，最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。
　最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を以下の表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　第２ドメインを変更した改変エンドリシンは元の配列番号５と比較して同等の抗菌活性を示した。第１ドメインは酵素活性有するドメインであることから、抗菌活性に直接的に寄与するため，黄色ブドウ球菌に起因する感染症に対する配列番号５のエンドリシンの第１ドメインが第２ドメインの組み合わせによらず有用であることが確認された。
　リンカー長変更による抗菌活性
　ｂｂｓｔ１０２７の配列から開始して、リンカーなし及びリンカー１２のアミノ酸残基配列（ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ：配列番号３５）のエンドリシンを作製し、黄色ブドウ球菌に対する抗菌活性を分析した。
　黄色ブドウ球菌を７．５％塩化ナトリウム含有ＴＳＢ培地で増殖させ，培養液を６０００ｇにて５分間遠心し，上清を除き，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で再懸濁した。このようにして調製した菌懸濁液を０．１のＯＤ６００の光学密度となるよう１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で希釈し，これをさらに２ｘ陽イオン含有ミューラーヒントン培地で１：１００に希釈した。　エンドリシン，または抗生物質を９６ウェルプレートに注入し，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて，様々な濃度のタンパク質及び抗生物質を２倍希釈系列にて最終分量１００μｌで調製した。１００μｌの細菌懸濁液を９６ウェルプレートに添加し，混合した。当該プレートを３７℃で１８時間培養し，ウェルのＯＤ６００値を測定して細菌増殖を測定した。ＯＤ６００値が０．２を下回るエンドリシン，または抗生物質の最小濃度である，最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定した。
　最小発育阻止濃度（μｇ／ｍｌ）の結果を以下の表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　リンカー長を変更したエンドリシンは元の配列番号５と比較して同等の抗菌活性を示した。黄色ブドウ球菌に起因する感染症に対する配列番号１～８のエンドリシンがリンカー有無及び長さに影響されず殺菌活性を示すことが確認された。
　この発明は，ブドウ球菌に対する抗菌作用を有するポリペプチドなどに関するので，食品添加物，医薬，日用品及び化粧品産業において利用されうる。
　配列番号１～８，３１　全長ポリペプチド
配列番号９～１３，３２　第１ドメイン
配列番号１４～１９，３３　第２ドメイン
配列番号２０　リンカー
配列番号２１　タグ
配列番号２２～２９，３４　全長ヌクレオチド
配列番号３０　ＰｌｙＳｓ２

Claims (15)

  1. 　第１ドメイン及び第２ドメインをこの順で含むポリペプチド又はその塩であって，
    　第１ドメインは，
    　　（１）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであるか，
    　（２）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインであるか，
    　（３）配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，酵素活性を有するドメインであり，
    　
    　第２ドメインは，
    　（１）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであるか，
    　（２）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上１０個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するドメインであるか，
    　（３）配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，細胞結合ドメインである，
    　ポリペプチド又はその塩。
  2. 　請求項１に記載のポリペプチド又はその塩であって，
    　前記ポリペプチドは，
    　第１ドメイン及び第２ドメインからなるポリペプチドであるか，
    　第１ドメイン，リンカー及び第２ドメインをこの順で含むポリペプチドであって，前記リンカーは，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有する，ポリペプチドであるか，
    　第１ドメイン，第２ドメイン及びタグ配列からなり，前記タグ配列は，第１ドメイン及び第２ドメインのいずれか又は両方に付加した２以上１０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有する，ポリペプチドであるか，又は
    　第１ドメイン，リンカー，第２ドメイン及びタグ配列からなり，前記リンカーは，第１ドメイン及び第２ドメインを接続し，１以上２０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有し，前記タグ配列は，第１ドメイン及び第２ドメインのいずれか又は両方に付加した２以上１０以下のアミノ酸残基長を有するアミノ酸配列を有する，
    　ポリペプチド又はその塩。
  3. 　請求項２に記載のポリペプチド又はその塩であって，
    　第１ドメインは，配列番号９～１３，及び配列番号３２のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであり，
    　第２ドメインは，配列番号１４～１９，及び配列番号３３のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するドメインであるポリペプチド又はその塩。
  4. 　請求項１に記載のポリペプチド又はその塩であって，
    　前記ポリペプチドは，
    　配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，
    　配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列から１個以上４個以下のアミノ酸残基が置換，欠失，挿入又は付加したアミノ酸配列を有するポリペプチドであるか，
    　配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し，ブドウ球菌に対する抗菌作用を有する，ポリペプチド又はその塩。
  5. 　請求項１に記載のポリペプチド又はその塩であって，配列番号１～８，及び配列番号３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその塩。
  6. 　請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸を含む，単離されたポリヌクレオチド。
  7. 　請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  8. 　プラスミドである請求項７に記載のベクター。
  9. 　請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。
  10. 　請求項１～５の何れかに記載のポリペプチド又はその塩，請求項６に記載のポリヌクレオチド，請求項７又は８に記載のベクター，又は請求項９に記載の宿主細胞を含む抗微生物剤。
  11. 　食品添加物又は消毒剤である請求項１０に記載の抗微生物剤。
  12. 　化粧品原料又は化粧品用の添加剤である請求項１０に記載の抗微生物剤。
  13. 　医療機器，医療製造装置又は食品製造装置の防汚剤又は洗浄剤である請求項１０に記載の抗微生物剤。
  14. 　ブドウ球菌感染に伴う疾患の治療又は予防剤である，請求項１０に記載の抗微生物剤。
  15. 　黄色ブドウ球菌感染に伴う疾患の治療又は予防剤である，請求項１０に記載の抗微生物剤。
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