CN111971058A - 对铜绿假单胞菌具有细菌活性的溶素及其衍生物的鉴定 - Google Patents

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Abstract

公开了对革兰氏阴性菌，特别是铜绿假单胞菌具有活性的新的溶素多肽、含有它们的药用组合物及其用于治疗革兰氏阴性菌感染，并且更通常地用于抑制生长或减少群体或杀灭革兰氏阴性菌(包括而不限于破坏由这种细菌形成的生物膜)的方法。与溶素的氨基酸序列相比较，某些所公开的溶素已通过用非荷电氨基酸置换某些荷电氨基酸和/或通过经或不经间插接头在N‑或C‑末端与抗菌肽序列融合而在氨基酸序列上进行修饰。

Description

对铜绿假单胞菌具有细菌活性的溶素及其衍生物的鉴定
发明背景
革兰氏阴性菌，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)的成员，是严重且可能威胁生命的侵袭性感染的重要原因。假单胞菌属感染构成烧伤、慢性伤口、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和其他结构性肺病、囊性纤维化、植入生物材料上的表面生长以及医院表面和供水内的主要问题，其中其对脆弱患者比如免疫抑制患者和重症监护(ICU)患者造成许多威胁。
一旦在患者体内确立，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)可能尤其难以治疗。该基因组编码许多抗性基因，包括多药外排泵和赋予对β-内酰胺和氨基糖苷抗生素抗性的酶，由于缺少新的抗微生物治疗剂，使得针对这种革兰氏阴性病原体的治疗特别具有挑战性。铜绿假单胞菌在生物膜中生长的能力加剧了这一挑战，该生物膜可通过保护细菌免受宿主防御和常规抗微生物化学治疗的影响来增强其引起感染的能力。
在医疗保健环境中，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)耐药菌株的发生率正在增加。一项多州点流行率调查估计，铜绿假单胞菌引起所有医疗保健获得性感染(HAI)的7% (1)。每年由铜绿假单胞菌引起的51000 HAI中有超过6000 (13%)为多药耐药(MDR)，每年约有400人死亡(2)。广泛耐药(XDR)和泛耐药(PDR)菌株代表新出现的威胁，对其具有有限或没有可用的治疗(3)。包括血流感染(BSI)在内的侵袭性铜绿假单胞菌感染是最致命的HAI之一，例如铜绿假单胞菌占所有BSI的3%-7%，死亡率在27%-48%之间(4)。由于美国的大多数医疗保健均在较小的非教学型社区医院进行，因此可能低估包括铜绿假单胞菌引起的那些在内的侵袭性血流感染的发生率。在社区医院的BSI观察性研究中，铜绿假单胞菌为前4种MDR病原体之一(5)，并且整体医院死亡率为18%。另外，很好地描述了MDR铜绿假单胞菌的暴发(6)。结果差与铜绿假单胞菌的MDR菌株(stains)有关，后者经常需要用万不得已的药物比如粘菌素治疗(7)。显然，对于具有新颖机制以靶向MDR铜绿假单胞菌以治疗包括(但不限于)BSI在内的侵袭性感染的不同抗微生物剂存在尚未满足的医学需求。
一种创新的治疗细菌感染的方法集中于称为溶素的噬菌体编码的细胞壁肽聚糖(PG)水解酶家族(8)。溶素技术目前基于使用纯化的重组溶素蛋白，该蛋白在外部作用于多种革兰氏阳性(GP)病原体，导致细菌细胞在接触时溶解，具有多重对数倍数杀灭。溶素起“分子剪刀”作用，降解负责保持细胞形状和承受内部渗透压的肽聚糖(PG)网状结构。PG的降解导致渗透性溶解。除了与抗生素相比较快速杀灭和新颖的作用方式之外，溶素活性的其他标志还包括抗生物膜活性、不存在先前存在的抗性、与抗生素(以亚最低抑制浓度(MIC))的有效协同作用和当除溶素之外还使用抗生素时抑制对抗生素的抗性。重要的是，多个研究者组在多种动物模型中证明了局部、鼻内和胃肠外给予溶素控制抗生素抗性GP细菌病原体的能力(9-11)。
溶素技术最初开发是用于治疗GP病原体的。迄今为止，溶素靶向革兰氏阴性(GN)菌的开发受到限制。革兰氏阴性菌的外膜(OM)起着细胞外大分子的屏障的至关重要作用，并限制下邻肽聚糖的进入(12-14)。
OM为GN菌的区别特征，并包含脂质双层，具有内部磷脂小叶和外部两亲性小叶，主要由脂多糖(LPS)组成(15)。LPS具有3个主要部分：称为脂质A的六酰化基于氨基葡萄糖的磷脂、多糖核心和称为O-抗原的延伸的外部多糖链。OM表现出通过3种主要相互作用稳定的非流体连续体，包括：i) LPS分子彼此之间的亲和结合，尤其是如果存在阳离子以中和磷酸根基团时；ii) 大量饱和的酰基链的紧密堆积；和iii) 脂质A部分的疏水堆积。所得结构为疏水和亲水分子两者的屏障。在OM下，PG形成对水解裂解非常敏感的薄层——与厚度为30-100 nm且由最多40层组成的GP菌的PG不同，GN菌的PG厚度仅为2-3 nm且由仅1-3层组成。如果将针对GN菌的溶素改造成单独或与OM去稳定剂和/或抗生素组合渗透OM，则可实现有效的抗微生物活性。
因此，发现和开发渗透OM的GN溶素是一个重要的目标，并将满足重要但尚未满足的需求，以设计出有效的疗法来治疗或预防革兰氏阴性菌感染。先前已经描述了具有OM透化和OM破坏活性的多种药物。例如，包括多粘菌素抗生素和氨基糖苷类在内的多聚阳离子化合物与OM中的稳定二价阳离子竞争与LPS中的磷脂相互作用，从而导致OM解体(16)。类似地，EDTA和弱酸会螯合二价阳离子，导致OM解体(17)。还已知大量天然存在的抗微生物肽及其合成肽模拟物(本文称为AMP)基于自我促进的吸收途径渗透OM (18-20)。多聚阳离子和两亲性AMP两者的易位由与LPS的初级静电相互作用驱动，然后是阳离子置换、膜的解体和瞬时开口，并且在某些情况下是AMP的内化。通过经由改变疏水性、总电荷和极性残基在疏水面上的定位或经由掺入D,L残基代替全L对应物来策略性地改造两亲性结构域，可在血液中“激活”许多AMP的膜相互作用抗微生物活性(18,19,21,22)。
如本文概述的，发明人已经使用多种使得OM能够渗透的技术而推进溶素技术来解决GN病原体。实际上，发明人先前已经提交了国际专利申请PCT/US2016/052338，该申请于2016年9月16日提交，并作为WO/2017/049233公开。出于所有目的，该在先的PCT申请通过参考完全结合至本文中。例如，首先在前述PCT申请中公开了溶素GN2、GN4、GN14、GN43和GN37。
最近的研究确定了溶素具有对GN菌固有的抗微生物活性(12,13,17)。在某些情况下，抗微生物作用归因于N-或C-末端的两亲性或多聚阳离子α螺旋结构域，这些结构域驱动LPS的渗透和跨OM的易位，从而导致PG降解和渗透性溶解。有趣的是，通过包括EDTA和温和的有机酸在内的OM去稳定化合物可促进这种溶素接近PG。尽管与EDTA和温和的有机酸的组合作为药物不切实际，但该发现说明促进GN溶素活性的概念。
最近的方法使用融合于具有多聚阳离子、两亲性和疏水性特征的特定α螺旋结构域的GN溶素来促进跨OM的易位。这些发现导致称为“artilysin”的GN溶素，其在体外高度活性，并有望用于局部应用(17)。然而，据报道artilysin体内活性低。一致地，在本公开中被列为对照的artilysin GN126 (参见表4)也呈现出低活性。
尽管artilysin和溶素(包括GN溶素)具有固有的抗微生物活性的体外效力，但在人血基质中明显缺少活性方面仍然是主要局限性，使得全身治疗成为一个挑战(13,14)。据认为，生理盐和二价阳离子竞争LPS结合位点并干扰溶素(包括GN溶素)的α-螺旋易位结构域，从而限制血液中的活性，并且更具体地讲在存在血清的情况下，从而限制使用溶素治疗侵袭性感染的可能性(23)。据报道，多种不同的OM-渗透性和去稳定的AMP在血液中类似的缺少活性(18-20,22)。
发明概述
用于经全身给予来治疗侵袭性感染的GN溶素开发面临的主要设计挑战为需要减少血液(或例如人血清)中的失活。
首先鉴定具有固有活性(即HEPES缓冲液中的高水平活性和人血清中的低水平活性)的天然GN溶素，并然后通过用非荷电氨基酸置换荷电氨基酸和/或与α-螺旋抗微生物肽融合进行修饰，以改善活性和改善血清中的活性。
基于这项工作，鉴定了推定的天然溶素并对活性进行评估。溶素列于表3中，并通过其序列进行描述。在存在人血清的情况下，未经修饰的溶素呈现出不同水平的活性。
溶素蛋白的修饰基于以下：i) 将氨基酸取代掺入到溶素蛋白中以改变分子的整体pI，以促进OM渗透或降低对人血清的敏感性或两者兼而有之；和/或ii) 抗微生物肽序列(优选地为已知在血清中有活性的序列)融合于溶素的N-或C-末端，形成融合多肽，以促进外膜的渗透和易位。
如本文所述通过修饰溶素蛋白获得经修饰的GN-溶素。与亲本(未经修饰的)溶素相比较，经修饰的GN-溶素被证明在人血清中呈现出改善的活性。通过非荷电氨基酸残基随机诱变天然溶素蛋白的荷电氨基酸残基，并测试所得多肽的活性，包括在存在人血清情况下的活性。经活性修饰的多肽一般地与亲本多肽的区别在于1-3个氨基酸残基。备选地或另外，将抗微生物肽(AMP)序列经或不经接头融合到天然或经修饰的GN溶素序列上。抗微生物肽的特征为α-螺旋结构域，以介导溶素的外膜破坏和易位。接头是长度为5-20个氨基酸的短肽序列，其具有柔性(例如富含丝氨酸和/或甘氨酸残基)，并且设计成不干扰融合多肽的AMP或溶素部分的结构并允许各自自由移动。
本文所述的每种推定的溶素和经修饰的GN-溶素已经或可纯化至> 90%同质性，并在一系列测定中进行检查以评价体外活性。
本公开包括合成和/或重组产生的溶素多肽和经修饰的溶素多肽。本发明包括新颖的溶素多肽和经修饰的溶素多肽，以及所述多肽用于治疗革兰氏阴性菌，并且尤其是在存在血液基质例如人血清的情况下进行治疗的用途。
此外，本发明包括溶素多肽和经修饰的溶素多肽用于在体内、离体或体外破坏例如假体或其他医疗装置中包含革兰氏阴性微生物的生物膜的用途。生物膜的革兰氏阴性微生物包括假单胞菌属物种，例如铜绿假单胞菌。
一方面，本公开涉及一种药用组合物或药物制剂，其包含有效量的具有选自SEQID NO: 2、4、5-9和SEQ ID NO: 13-27的氨基酸序列的分离的溶素多肽或与其具有至少80%序列同一性的肽，所述肽具有溶解活性，其中溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种；以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，药用组合物包含有效量的至少一种选自肽GN3、CN147、GN146、GN156、GN54、GN92、GN121、GN94、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123、GN150、GN200、GN201、GN203、GN204和GN205的溶素多肽或其保持溶解活性的片段，其中所述溶素多肽或片段抑制生长或减少群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种；以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明的药用组合物/药物制剂包含有效量的至少一种溶素多肽和至少一种适合于治疗革兰氏阴性菌的抗生素。在一些实施方案中，组合物为两种组合或单独给予的组分的组合，一种含有本公开的溶素，和一种含有抗生素。在一些实施方案中，抗生素以亚最佳剂量提供。在一些实施方案中，抗生素可为革兰氏阴性菌对其出现抗性的抗生素，使用溶素用于克服该抗性。
在一些实施方案中，本发明的组合物(含或不含抗生素)或组合(含有溶素和抗生素)适合于口服、局部、胃肠外或可吸入给予。在一些实施方案中，组合的一种组分可适合于通过与另一组分不同的途径来给予。例如，在以下详述的实验中，抗生素皮下(SC)给予，而溶素则静脉内(IV)给予。
在一个实施方案中，抗生素可选自以下提供的GN合适的抗生素的列表及其组合。在一个更具体的实施方案中，抗生素可选自阿米卡星(amikacin)、阿奇霉素、氨曲南、环丙沙星、粘菌素、利福平、碳青霉烯类和妥布霉素以及前述中两种或更多种的组合。
本公开的某些实施方案考虑无菌容器，容器含有上述药用组合物之一，药物组合物包含溶素多肽和任选地一种或多种另外的组分。举例来说但非限制性地，无菌容器为试剂盒的一个组件；试剂盒还可含有例如第二无菌容器，其含有至少一种另外的治疗剂。因此，本文公开的GN抗生素和GN溶素的组合之一可任选地以这种试剂盒提供。
一方面，本发明包括载体，所述载体包含编码具有选自SEQ ID NO: 2、4、5-9和SEQID NO: 13-27的氨基酸序列的溶素肽或与其具有至少80%序列同一性的肽的核酸分子，所述肽具有溶解活性，其中编码的溶素多肽在不存在或存在人血清的情况下抑制生长或减少群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种。
在另一个实施方案中，载体为重组表达载体，其包含编码前述溶素多肽之一的核酸，所述溶素多肽包括其至少80%序列同一性变体，其中编码的溶素肽具有在不存在和/或存在人血清的情况下抑制生长或减少群体或至少一种革兰氏阴性菌物种的特性，该核酸可操作地连接于异源启动子。
还考虑包含前述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，核酸序列为cDNA序列。
在仍然另一方面，本公开涉及编码包含选自SEQ ID NO: 2、4、5-9和SEQ ID NO:13-27的序列的溶素多肽的分离的纯化核酸。在一个备选实施方案中，分离的纯化核酸包含选自SEQ ID NO: 33至SEQ ID NO:54的核苷酸序列、其简并密码及其转录物。根据本文提出的实施方案，所定义的核酸不仅包括同一的核酸，而且还包括任何较小的碱基变异，特别是包括导致同义密码子(规定相同氨基酸残基的不同密码子)的取代。因此，对核酸所述的权利要求被认为包括任何所述单链序列的互补序列。任选地，核酸为cDNA。
在其他方面，本公开涉及各种方法/用途。一种这种方法/用途为用于抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长或减少至少一种革兰氏阴性菌物种的群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种的方法/用途，所述方法包括使细菌与包含有效量的包含选自SEQ ID NO:2、4、5-9和SEQ ID NO: 13-27的序列的GN溶素多肽或与其具有至少80%序列同一性的肽的组合物接触，持续足以在不存在和/或存在人血清的情况下抑制所述生长或减少所述群体或杀灭所述至少一种革兰氏阴性菌物种的时间段，所述肽具有溶解活性。
另一种这种方法/用途为用于抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长或减少至少一种革兰氏阴性菌物种的群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种，所述方法包括使细菌与包含有效量的至少一种选自如SEQ ID NO: 2、4、5-9和SEQ ID NO: 13-27所述的GN溶素的GN溶素多肽或其活性片段的组合物接触，其中所述多肽或活性片段具有在不存在和/或存在人血清的情况下抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的特性。
另一种方法/医学用途为用于治疗由革兰氏阴性菌比如铜绿假单胞菌或鲍曼不动杆菌(A. baumannii)引起的细菌感染，其包括给予诊断患有细菌感染、处于其风险下或呈现出其症状的受试者一种或多种前述组合物。
在任何前述方法/医学用途中，革兰氏阴性菌为选自鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌、大肠杆菌(E. coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp.)、淋病奈瑟氏菌(N. gonorrhoeae)和志贺氏菌属物种(Shigella spp.)的至少一种。或者，革兰氏阴性菌为铜绿假单胞菌。
另一种方法/医学用途为用于治疗或预防由革兰氏阴性菌引起的局部或全身性病原菌感染，其包括给予需要治疗的受试者前述组合物之一。局部感染包括可通过局域或局部施用抗菌剂治疗的感染。局部感染的实例包括局限于特定位置比如器官或组织或植入假体或其他医疗装置的那些感染。实例为皮肤、牙龈、感染伤口的感染、耳朵等的感染、导管安装区域的感染等。
另一种这种方法/医学用途为用于预防或治疗细菌感染，其包括将第一有效量的前述组合物之一和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的组合共同给予诊断患有细菌感染、处于其风险下或呈现出其症状的受试者。
发明详述
定义
除非上下文另外明确指明，否则本文使用的以下术语及其同源词应具有以下赋予它们的含义。
应用于药用组合物的“载体”是指与活性化合物一起给予的稀释剂、赋形剂、添加剂或媒介物。这种药用载体可为无菌液体，比如水、盐水溶液、右旋糖水溶液、甘油水溶液和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油类，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。其他实例包括分散介质、增溶剂、包衣、防腐剂、等渗和吸收延迟剂、表面活性剂、推进剂等。合适的药用载体描述于E.W. Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”，第18版中。
“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何前述载体。载体必须是在以一般地用于药物的量对待治疗的受试者无害的意义上“可接受的”。药学上可接受的载体与组合物的其他成分相容，而不会使得组合物不适合于其预期目的。此外，药学上可接受的载体适合于与本文提供的受试者一起使用而没有不适当的不良副作用(比如毒性、刺激性和过敏反应)。当副作用的风险超过由组合物提供的益处时，它们是“不适当的”。
在试剂的上下文中，“杀菌的”通常意指在18-24小时时间段内在初始细菌群体中至少减少3-log10 (99.9%)或更好的减少的程度上具有引起细菌死亡或能够杀灭细菌的特性。
“抑菌的”通常意指具有抑制细菌生长(包括抑制细菌细胞的生长)，从而在18-24小时时间段内在初始细菌群体中引起减少2-log10 (99%)或更好的减少并且最多略低于3-log的特性。
在试剂的上下文中，“抗菌的”通常用于包括抑菌剂和杀菌剂两者。
“抗生素”是指抗生素化合物，其可为影响细胞壁肽聚糖生物合成的化合物、影响细胞膜完整性的化合物或影响细菌中DNA或蛋白合成的化合物。对革兰氏阴性菌具有活性的抗生素的非限制性实例包括头孢菌素类(比如头孢曲松-头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普)、氟喹诺酮类(比如环丙沙星、左氧氟沙星)、氨基糖苷类(比如庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)、哌拉西林、替卡西林、碳青霉烯类 (比如亚胺培南、美罗培南、多利培南)及其他对GN菌具有活性的β-内酰胺抗生素(比如广谱青霉素类(含或不含β-内酰胺酶抑制剂))、安沙霉素类(比如利福平)和杀菌多肽(比如多粘菌素B和粘菌素)。
在病原体并且更具体地讲在细菌的上下文中，“耐药的”通常是指对药物的抗菌活性具有抗性的细菌。当以更特定的方式使用时，耐药性具体地讲是指抗生素抗性。在某些情况下，通常对特定抗生素敏感的细菌可对抗生素出现抗性，从而成为耐药微生物或菌株。“多药耐药的” (“MDR”)病原体为对各自用作单一治疗的至少两类抗微生物药物出现抗性的病原体。例如，发现铜绿假单胞菌的某些菌株对几种抗生素具有抗性，其中包括头孢洛扎-他唑巴坦、头孢他啶、头孢吡肟、哌拉西林-他唑巴坦、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、环丙沙星、替卡西林、妥布霉素、阿米卡星和粘菌素。本领域的技术人员可使用确定细菌对药物或抗生素的敏感性或抗性的常规实验室技术易于确定细菌是否耐药。参见例如Cabot, G.et al, 2016, Antimicrob. Agents and Chemother. 60(3):1767, DOI: 10.1128/AAC.02676-15; 和(Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013,U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control andPrevention)。
“有效量”是指当以适当的频率或给药方案施用或给予时足以预防、减少、抑制或消除细菌生长或细菌负荷或者预防、减少或改善所治疗病症的发作、严重性、持续时间或进展(此处为革兰氏阴性菌病原体的生长或感染)、阻止所治疗病症的发展、导致所治疗病症的消退或者增强或改善另一种治疗(比如抗生素或抑菌治疗)的预防或治疗效果的量。本发明多肽的有用的有效量范围为约0.01 mg/kg-约50 mg/kg，典型范围为约0.01-25 mg/kg，并且常见范围为约0.01-约10 mg/kg。取决于特定溶素的效力，考虑向上调节至下限；还主要取决于特定溶素的毒性，考虑向下调节至上限。这种调节处于本领域技术内。此外，如果将溶素与抗生素同时给予，则可基于使目标细菌对同时给予的抗生素重新敏感所需的量来调节溶素的量。
“共同给予”旨在包括以依序方式分开给予溶素多肽和抗生素或任何其他抗菌剂以及以基本上同时的方式给予这些试剂，比如以单一混合物/组合物或以分开给予的剂量但是仍然基本上同时给予受试者，例如在同一天或24小时时间内的不同时间。溶素多肽与一种或多种另外的抗菌剂的这种共同给予可作为持续长达数天、数周或数月的连续治疗提供。另外，取决于用途，共同给予不必为连续的或共同扩展的。例如，如果用途是作为局部抗菌剂治疗例如细菌性溃疡或感染的糖尿病性溃疡，则溶素可只在首次使用抗生素的24小时内初始给予，并且然后可继续使用抗生素而无需进一步给予溶素。
“受试者”是指待治疗的受试者，并且尤其包括哺乳动物、植物、低等动物、单细胞生物体或细胞培养物。例如，术语“受试者”旨在包括对细菌感染例如革兰氏阴性菌感染易感或患有该感染的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在某些实施方案中，受试者为人，例如患有野生型(亲本)溶素对其有效的革兰氏阴性菌感染、处于患有该感染的风险下或对该感染易感的人，无论这种感染是全身性的、局部的还是以其他方式集中或局限于特定的器官或组织。
“多肽”本文可与术语“蛋白”和“肽”互换使用，并且是指由氨基酸残基制成并且通常具有至少约30个氨基酸残基的聚合物。该术语不仅包括分离形式的多肽，而且还包括其活性片段和衍生物。术语“多肽”还包括包含如下所述的溶素多肽并保持溶素功能的融合蛋白或融合多肽。取决于上下文，多肽或蛋白或肽可为天然存在的多肽或者重组、改造或合成产生的多肽。特定的溶素多肽可例如通过酶促或化学切割从天然蛋白(即与从天然来源分离出的该蛋白具有相同氨基酸序列的蛋白)衍生或取出，或者可使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(比如Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)中公开的那些技术)制备，或者可策略性地将其截短或分段以产生保持针对相同或至少一种常见目标细菌的溶素活性的活性片段。
“融合多肽”是指由两个或更多个核酸区段融合，导致融合的表达产物一般地具有两个具有不同特性或功能性的结构域或区段而产生的表达产物。在更具体的意义上，术语“融合多肽”还指包含直接或经氨基酸或肽接头共价连接的两个或更多个异源多肽或肽的多肽或肽。尽管形成融合多肽的多肽也可将C-末端连接于C-末端、将N-末端连接于N-末端或将N-末端连接于C-末端，但是它们一般地将C-末端连接于N-末端。术语“融合多肽”可与术语“融合蛋白”互换使用。因此，开放式表述“包含某种结构的多肽”包括比所述结构更大的分子，比如融合多肽。
“异源的”是指不是天然连续的核苷酸、肽或多肽序列。例如，在本公开的上下文中，术语“异源的”可用于描述两种或更多种肽和/或多肽的组合或融合，其中融合肽或多肽在自然界通常不存在，比如溶素多肽或其活性片段和阳离子和/或多聚阳离子肽、两亲性肽、寿司肽(sushi peptide) (Ding et al. Cell Mol Life Sci., 65(7-8):1202-19(2008))、防御素肽(Ganz, T. Nature Reviews Immunology 3, 710-720 (2003))、疏水性肽和/或抗微生物肽，其可具有增强的溶素活性。该定义包括两种或更多种溶素多肽或其活性片段。这些可用于制备具有溶素活性的融合多肽。
“活性片段”是指本文公开的全长多肽的一部分，该部分保留从其中获取片段的分离多肽的一种或多种功能或生物活性，例如对一种或多种革兰氏阴性菌的杀菌活性，或更具体地讲为溶解活性，无论其是否保留与外膜结合的能力。
“两亲性肽”是指具有亲水和疏水性官能团两者的肽。优选地，二级结构将疏水和亲水性氨基酸残基置于两亲性肽的对侧(例如内侧相对于外侧)。这些肽通常采用螺旋二级结构。
“阳离子肽”是指具有高百分比的荷正电氨基酸残基的肽。优选地，阳离子肽的pKa值为8.0或更大。在本公开的上下文中，术语“阳离子肽”还包括多聚阳离子肽，其为主要由荷正电氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基组成的合成产生的肽。不荷正电的氨基酸残基可为中性荷电氨基酸残基和/或荷负电氨基酸残基和/或疏水性氨基酸残基。
“疏水性基团”是指化学基团比如氨基酸侧链，其对水分子具有低亲和力或无亲和力但对油分子具有较高亲和力。疏水性物质在水或水相中倾向于具有低溶解性或无溶解性，并且一般地为非极性的，但在油相中倾向于具有较高溶解性。疏水性氨基酸的实例包括甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、甲硫氨酸(Met)和色氨酸(Trp)。
在本公开的上下文中，“增强”意指抗微生物活性的程度高于其原来的情况。“增强”包括加性以及协同(超加性)作用。例如，本公开天然溶素的结构修饰用于在存在血清的情况下增强溶素的活性。
关于作用的“协同”或“超加性”意指由两种活性物质组合产生的有益作用，其超过、优选地显著超过两种物质独立起作用的作用总和。一种或两种活性成分可以亚阈值水平，即如果单独使用活性物质则不会产生作用或作用非常有限的水平(或至少亚最佳水平，即活性物质产生的作用显著低于其最大作用的水平)使用。或者，可通过测定比如此处所述的棋盘测定来测量效果。
“治疗”是指任何过程、行动、应用、疗法等，其中受试者(包括人)受到医疗援助，目的是直接或间接地治愈病症或根除病原体或改善受试者的状况。治疗还指降低发生率或减轻症状、消除复发、预防复发、预防发生或降低发生的风险、改善症状、改善预后或其组合。“治疗”进一步包括减少受试者中细菌的群体、生长速率或毒力，从而控制或减少受试者中的细菌感染或者器官或组织或环境的细菌污染。因此，降低发生率的“治疗”有效抑制特定环境中至少一种革兰氏阳性菌的生长，无论其为受试者还是环境。另一方面，对已经建立的感染的“治疗”是指减少造成感染或污染的革兰氏阳性菌的群体或者杀灭该革兰氏阳性菌、抑制其生长，包括甚至根除该革兰氏阳性菌。
术语“预防”包括预防病症比如细菌感染的发生、复发、扩散、发作或建立。不旨在将本公开限于完全预防或防止感染的建立。在一些实施方案中，发作被延迟，或随后感染的疾病的严重性或感染的机会被降低，并且这构成了预防的实例。
在本公开的上下文中，感染的疾病包括表现出临床或亚临床症状的那些疾病，比如发烧、败血症或菌血症(BSI)的检测，以及当尚未表现出与这种病理学相关的症状时细菌病原体(例如培养物中)的生长的检测。
在肽或多肽(如本文所述，其包括活性片段)的上下文中，术语“衍生物”旨在包括例如修饰成含有除氨基酸以外的基本上不会不利地影响或破坏溶素活性的一个或多个化学部分的多肽。化学部分可例如经氨基末端氨基酸残基、羧基末端氨基酸残基或在内部氨基酸残基处共价连接于肽。这种修饰包括在反应性部分添加保护性或封端基团、添加可检测标记(比如抗体和/或荧光标记)、添加或修饰糖基化或添加填充基团(比如PEG (聚乙二醇化))和基本上不会不利地影响或破坏溶素多肽活性的其他变化。可添加至溶素多肽的常用保护基包括(但不限于) t-Boc和Fmoc。常用的荧光标记蛋白，比如(但不限于)绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)、青色荧光蛋白(CFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和mCherry，为致密蛋白，其可与溶素多肽共价或非共价结合或者融合于溶素多肽而不干扰细胞蛋白的正常功能。一般地，将编码荧光蛋白的多核苷酸插入溶素多核苷酸序列的上游或下游。这将产生不干扰细胞功能或其附接的溶素多肽的功能的融合蛋白(例如溶素多肽::GFP)。聚乙二醇(PEG)与蛋白的缀合已被用作延长许多药用蛋白循环半衰期的方法。因此，在溶素多肽衍生物的上下文中，术语“衍生物”包括通过共价附接一个或多个PEG分子而化学修饰的溶素多肽。预计与未聚乙二醇化的溶素多肽相比较，聚乙二醇化的溶素多肽将呈现出延长的循环半衰期，同时保留生物学和治疗活性。另一个实例为“artilysin”的使用，籍此短的多聚阳离子和两亲性α螺旋被附加到链球菌溶素的N-或C-末端，以改善体外抗链球菌活性(Rodriguez-Rubio et al., 2016)。
关于溶素多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比”本文定义为在比对序列并引入缺口(如果必要的话)以达到最大序列同一性百分比之后，并且不考虑将任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与特定溶素多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以本领域技术内的各种方式来实现，例如，使用可公开获得的软件比如BLAST或可例如自DNASTAR市售获得的软件。两个或更多个多肽序列可为0-100%同一性的任何值，或之间的任何整数值。在本公开的上下文中，当至少80%的氨基酸残基(优选地至少约85%、至少约90%和优选地至少约95%)相同时，两个多肽为“基本上相同的”。
如本文所述的术语“氨基酸序列同一性百分比(%)”也适用于溶素肽。因此，术语“基本上相同”将包括本文所述的分离的溶素多肽和肽的突变、截短、融合或者其他序列修饰的变体及其活性片段以及与参照(野生型或其他完整)多肽相比较具有显著序列同一性(例如，如例如通过上述一种或多种方法测量的至少80%、至少85%、至少90%或至少95%同一性)的多肽。当至少约80%的氨基酸残基(优选地至少约85%、至少约90%和优选地至少约95%或98%)相同或代表保守取代时，两个氨基酸序列为“基本上同源的”。当溶素多肽的一个或多个、或几个、或至多10%、或至多15%或至多20%的氨基酸被相似或保守的氨基酸取代进行取代时，并且其中所得溶素具有本文公开的溶素多肽的活性、抗菌作用和/或细菌特异性概况，本公开溶素多肽的序列为基本上同源的。本文所述的“基本上同源”的含义也适用于溶素肽。
“可吸入组合物”是指配制成在常规或辅助呼吸期间或者连同常规或辅助呼吸一起直接递送至呼吸道(例如通过气管支气管内、肺和/或鼻给予)的本公开药用组合物，包括(但不限于)雾化、喷雾化、干粉和/或气雾化制剂。
“生物膜”是指附着于表面并聚集在水合聚合物基质中的细菌，该基质可包含细菌和/或宿主衍生的组分。生物膜为微生物的聚集体，其中细胞在生物或非生物表面上彼此粘附。这些粘附细胞通常被嵌入包含(但不限于)胞外聚合物(EPS)的基质内。生物膜EPS也称为粘液(尽管并非所有描述为粘液的东西均为生物膜)或菌斑，为一种通常包含胞外DNA、蛋白和多糖的聚合物团聚物。
在适用于针对某些细菌使用的抗生素的上下文中，“合适的”是指即使随后出现抗性也发现对那些细菌有效的抗生素。
对人血清中的铜绿假单胞菌具有杀菌活性的溶素的鉴定。本公开基于鉴定对指数期铜绿假单胞菌菌株PAOl具有有效抗菌活性的5种溶素(实施例1和2)。该菌株代表铜绿假单胞菌菌株。为了鉴定本公开的溶素多肽，发明人使用了与抗菌筛选结合的基于生物信息学的方法。从GenBank数据库中鉴定出推定的溶素和溶素样分子(参见表1)。GenBank序列注释为假设或预测蛋白，并且在某些情况下列为推定的噬菌体蛋白和/或推定的溶素。发明人不知道关于这些多肽的活性的任何报道。也不能从其序列预测其活性，更不用说其在存在人血清情况下的活性了。
表1.
Figure DEST_PATH_IMAGE002
对人血清中的铜绿假单胞菌具有改善的杀菌活性的经修饰的溶素的鉴定。5种溶素GN3、GN150、GN203、GN4和GN37用于生成12种新的GN-溶素衍生物。参见表2。考虑修饰(氨基酸取代或者经或不经接头的N-或C-末端肽融合)可单独或同时应用于天然溶素或修饰的溶素。因此，例如，考虑添加表2中公开的N-和/或C-末端肽以修饰溶素多肽。作为更具体的实例，对GN147考虑作为GN156或GN92的一部分的肽，即使在表2中未举例说明这种构建体。并且这种肽可添加到例如GN4或GN146中。换句话说，可将抗微生物肽融合于天然溶素或通过非荷电氨基酸取代而代替荷电氨基酸残基进行修饰的溶素的N-或C-末端。此外，N-末端和/或C-末端肽和/或抗微生物肽可经接头结构域例如表2中定义的接头结构域，或如本节以上所述的另一合适的接头，与溶素多肽连接。
表2.
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
本发明的溶素和经修饰的GN-溶素及其氨基酸序列概述于表3中。表3中还包括如上所述的WO/2017/049233中公开的未经修饰的溶素。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
对于GN3和GN4 (各自均为溶菌酶样超家族的成员)，基于在与人溶菌酶中所示位置(31-33)等同的位置引入两个氨基酸取代以改善体外(在缓冲液和/或培养基中)和体内抗菌活性(在动物感染模型中)两者，分别生成经修饰的衍生物GN147和GN146。
修饰GN3溶素多肽以包含氨基酸取代，特别是R101D和R117H氨基酸取代。这产生经修饰的多肽GN147。这些氨基酸取代导致pI从GN3多肽的9.98降至GN147多肽的9.39。
GN4溶素被修饰成包含氨基酸取代，特别是K99D、R115H。这产生经修饰的溶素多肽GN146。这些氨基酸取代导致pI从GN4多肽的9.58降至GN146多肽的8.01。
基于与人溶菌酶(HuLYZ)中的突变的粗略比较，估量GN3和GN4中每个突变的位置，因为HuLYZ在氨基酸序列水平上与GN3或GN4没有显著同源性。
尽管在氨基酸水平上溶素GN3和GN4与T4溶菌酶并不相似，但它们具有类似的大小。其结构的排列揭示了荷电残基。因此，仅通过T4溶菌酶的一级序列中大致相同位置的GN3和GN4中荷电残基的存在来判断等价性。再次，如上所述，通常，荷电氨基酸被无电荷氨基酸取代，并筛选突变体的活性。
还引入了GN3和GN4多肽两者的另外修饰，包括添加N-末端肽序列(GPRRPRRPGRRAPV - SEQ ID NO:28)(源自Daniels和Schepartz, 2007 (34)所述的大得多的抗微生物肽(AMP))，分别生成GN205和GN156。
GN溶素多肽可通过添加pI修饰突变来进一步修饰。在一个实施方案中，将氨基酸取代(R101D)和(R117H)引入到GN3溶素中以产生GN147溶素。在另一个实施方案中，将氨基酸取代(K99D)和(R115H)引入到GN4溶素中以产生GN146溶素。
GN4多肽还通过添加两种不同的先前描述的N-末端阳离子AMP进行修饰，它们分别是经Briers et al. 2014 (36)先前描述的接头结构域AGAGAGAGAGAGAGAGAS (SEQ ID NO:31)连接于GN4的KFFKFFKFFK (SEQ ID NO:29)或KRKKRKKRK (SEQ ID NO:30) (35,36)，分别生成经修饰的溶素GN92和GN54。
溶素GN37、GN150和GN203 (各自均为VanY超家族的成员)的修饰通过添加C-末端AMP (RKKTRKRLKKIGKVLKWI (SEQ ID NO:32))而产生，该AMP为先前作为猪髓系抗微生物肽-36 (PMAP-36)的衍生物开发(22)。通过添加C-末端RI18肽序列对GN37、GN150和GN203进行修饰分别产生经修饰的衍生物GN121、GN200和GN204。还包括另外的修饰，藉此上述AMP(KFFKFFKFFK - SEQ ID NO:29) (35)和接头结构域(AGAGAGAGAGAGAGAGAS - SEQ ID NO:31) (36)被附加到GN37的N-末端，以产生经修饰的溶素GN94。
不认为用于制备GN121、GN156、GN200、GN201、GN202、GN204和GN205的肽先前已用于修饰溶素。使用它们的基本原理如下：1) 当添加到指定的溶素中时，AMP和溶素两者的预测二级结构不会明显改变或完全不改变(如使用已知的蛋白结构预测程序确定的)，2) 这些肽先前已在文献中描述为具有有效活性；和3) 本发明人在血清中测试了这些AMP并发现了有效活性。GN92和GN9中使用的肽也是如此。然而，当AMP融合于溶素时，在这些构建体中也使用接头序列来连接AMP和溶素，以获得AMP适当的二级结构(密切类似于游离AMP的二级结构)。
对于GN54，AMP和接头两者先前均已用于修饰溶素，但在文献中未见有关血清中活性的报道。GN54在血清中确实有活性。
已将溶素GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123和GN150合成和/或重组生产，并纯化至(> 90%)同质性，且以一系列活性测定进行检查。使用以两种培养基类型(CAA和补充有25%人血清的CAA (“CAA/HuS”))培养的铜绿假单胞菌进行MIC测定。在CAA和CAA/HuS两者中均抑制许多GN溶素(包括表4中的对照T4溶菌酶)的活性。
对于此处检查的9种新的GN溶素(即GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123和GN150)组，我们在CAA和CAA/HuS两者中观察到的MIC均在2-> 128范围内。
将经修饰的溶素GN54、GN92、GN94、GN121、GN146和GN147各自纯化至(> 90%)同质性，并以一系列体外活性测定进行检查。CAA/HuS中每种GN溶素的MIC值(以μg/mL计)如下：GN54，2；GN92，4；GN94，2；GN121，0.5；GN146，2；GN147，4，如表4所示。
表4：纯化的GN溶素的最小抑制浓度(MIC)分析.
溶素 溶素类型 CAA中的MIC (μg/mL) CAA/HuS中的MIC (μg/mL)
GN3 天然 16 16
GN147 修饰的GN3 2 4
GN4 天然 64 16
GN146 修饰的GN4 2 2
GN156 修饰的GN4 32 2
GN54 修饰的GN4 64 2
GN92 修饰的GN4 32 4
GN37 天然 >128 32
GN121 修饰的GN37 0.5 0.5
GN94 修饰的GN37 16 2
GN9 天然 8 2
GN10 天然 8 16
GN13 天然 8 >128
GN17 天然 32 16
GN105 天然 >128 32
GN108 天然 8 8
GN123 天然 2 128
GN150 天然 2 32
GN126 天然(对照) 2 128
T4 LYZ 天然(对照) >128 >128
显著的是，使用CAA/HuS测定的每种亲本溶素分子GN3、GN4和GN37的MIC值(以μg/mL计)分别为16、16和32；因此，每种物质的修饰导致人血清中活性的改善。T4溶菌酶(MIC = >128μg/mL)作为在人血清中无活性的GN溶素的对照标准品包括在内。GN126 (MIC = 128 μg/mL)也作为对照包括在内，并且对应于Art-175 (37)；Art-175为一种artilysin，如文献所述，由AMP SMAP-29与GN溶素KZ144的融合物组成。
除MIC分析之外，还显示经修饰的GN溶素(GN54、GN92、GN94、GN121、GN146和GN147)具有有效的抗生物膜活性，其中最小生物膜根除浓度(MBEC)值在0.25-2 μg/mL的范围内，参见表5。
GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108和GN123中的每一种均显示出有效的抗生物膜活性，MBEC值在0.125-4 μg/mL的范围内(表5)，并且无任何溶血活性(表6)。预计与亲本溶素相比较，其余经修饰的溶素将对生物膜呈现出改善的活性，并且在存在包括人血清在内的血液基质的情况下，还将具有降低或消除的溶血特性以及增加的活性。
表5：纯化的GN溶素的最小生物膜根除浓度(MBEC)分析
溶素 溶素类型 MBEC (μg/mL)
GN3 天然 0.25
GN147 修饰的GN3 0.25
GN4 天然 1
GN146 修饰的GN4 2
GN156 修饰的GN4 0.5
GN54 修饰的GN4 n.d.
GN92 修饰的GN4 0.5
GN37 天然 0.25
GN121 修饰的GN37 0.25
GN94 修饰的GN37 2
GN9 天然 0.125
GN10 天然 0.5
GN13 天然 0.125
GN17 天然 0.125
GN105 天然 4
GN108 天然 0.125
GN123 天然 4
GN150 天然 0.25
经修饰的GN溶素(GN54、GN92、GN94、GN121、GN146和GN147)也显示出无溶血活性(MHC值> 128 μg/mL)，参见表6。
表6：纯化的GN溶素的最小溶血浓度(MHC)分析
溶素 溶素类型 MHC (μg/mL)
GN3 天然 >128
GN147 修饰的GN3 >128
GN4 天然 >128
GN146 修饰的GN4 >128
GN156 修饰的GN4 >128
GN54 修饰的GN4 >128
GN92 修饰的GN4 >128
GN37 天然 >128
GN121 修饰的GN37 >128
GN94 修饰的GN37 >128
GN9 天然 >128
GN10 天然 >128
GN13 天然 >128
GN17 天然 >128
GN105 天然 >128
GN108 天然 >128
GN123 天然 >128
GN150 天然 >128
经修饰的GN溶素(GN54、GN92、GN94、GN121、GN146和GN147)也显示出具有时间-杀灭形式的杀菌活性，如由到溶素添加之后3小时CFU降低≥3-Log10所定义的。参见表7和表8。
在时间-杀灭测定形式中，GN3、GN17、GN108、GN123和GN150各自在以CAA/HuS或HEPES缓冲液中浓度为10 μg/mL加入之后3小时的时间点均表现出杀菌活性(分别为表7和8)。
表7. CAA/HuS中纯化的GN溶素活性的时间-杀灭分析
Figure DEST_PATH_IMAGE014
Figure DEST_PATH_IMAGE016
*检测限为3.7 Log10 CFU/mL。‡表示杀菌活性。
表8：HEPES缓冲液中纯化的GN溶素活性的时间-杀灭分析
Figure DEST_PATH_IMAGE018
Figure DEST_PATH_IMAGE020
*检测限为3.7 Log10 CFU/mL。‡表示杀菌活性。
使用CAA/HuS以棋盘测定检查GN溶素的子集(GN4、GN37、GN108和GN150)，并显示出与多种抗生素具有协同作用，所述抗生素包括阿米卡星、阿奇霉素、氨曲南、环丙沙星、粘菌素、利福平和妥布霉素(表9)。
重要的是，如表9所示，经修饰的溶素GN92、GN121和GN147各自均显示出在CAA/HuS中与对革兰氏阴性菌具有活性的多种抗生素(阿米卡星、阿奇霉素、氨曲南、环丙沙星、粘菌素、利福平和妥布霉素)具有协同作用。这些数据表明，在存在人血清的情况下，协同作用将在体内持续存在。
表9：纯化的GN溶素与抗生素的棋盘分析
阿米卡星 阿奇霉素 氨曲南 环丙沙星 粘菌素 利福平 妥布霉素
GN4 0.531 0.094 0.156 0.250 0.156 0.156 0.375
GN92 0.375 0.063 0.188 0.281 0.094 0.094 0.500
GN147 0.375 0.250 0.188 0.281 0.188 0.281 0.5
GN37 0.125 0.188 0.531 0.281 0.156 0.281 0.156
GN121 0.375 0.188 0.625 0.313 0.375 0.313 0.188
GN108 0.156 0.060 0.250 0.281 0.133 0.125 0.188
GN150 0.313 0.125 0.188 0.250 0.094 0.094 0.500
基于特定GN溶素在存在人血清情况下的活性(和基于其氨基酸序列的性质和与其他溶素的同源性以及蛋白的表达和纯化概况)，预计溶素GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123、GN150和203为以其天然溶素形式或以本文所述的方式进一步修饰(即一般地用非荷电残基取代1-3个荷电氨基酸残基(并且在不存在和存在人血清的情况下保持活性)，和/或在N-或C-末端融合于具有α螺旋结构的AMP肽)之后进行进一步开发的优良候选物。
对应于GN200-GN205的经修饰的溶素仍在分析中，并且可具有类似于GN54、GN92、GN94、GN121、GN146和GN147的活性。
发明人在存在人血清的情况下鉴定了具有不同活性水平的GN-溶素。另外，获得了经修饰的GN-溶素，并且证明与亲本溶素或已知溶菌酶(T4)或已知的artilysin (GN126)相比较，在存在人血清的情况下呈现出改善的活性。
本文公开的特定实施方案可使用“由...组成”和/或“基本上由...组成”的语言在权利要求中进一步限制。当在权利要求中使用时，无论是原始提交的还是根据修改增加的，过渡术语“由...组成”不包括权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。过渡术语“基本上由...组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不会实质性地影响基本和新颖特征的那些材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方案在本文中固有或明确地描述和能够实现。申请人保留放弃本文描述的任何实施方案或特征的权利。
实施例
实施例1. 细菌菌株和生长条件. 使用从纽约特种外科医院(the Hospital forSpecial Surgery)获得的(由病理和实验室医学(Pathology and Laboratory Medicine)教授Lars Westblade博士提供的)人血中的铜绿假单胞菌临床分离株(CFS-1292)进行抗菌筛选。菌株CFS-1292在溶源性肉汤(LB; Sigma-Aldrich)、酪蛋白氨基酸(CAA)培养基(5 g/L酪蛋白氨基酸, Ameresco/VWR; 5.2 mM K2HPO4, Sigma-Aldrich; 1 mM MgSO4, Sigma-Aldrich)或补充有25%人血清(AB型，男性，合并；Sigma-Aldrich)的CAA中进行培养。对于本公开的目的，铜绿假单胞菌的特定分离株并不重要，并且本实验中可使用市售可获得的分离株。
实施例2. 基因合成与克隆. 所有溶素和经修饰的溶素均作为gBlocks (IDTTechnologies)进行合成，并通过重叠延伸PCR或通过兼容粘性末端的连接克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24 (24)中。将所有构建体转化到大肠杆菌菌株TOP10 (Thermo FisherScientific)中。可使用其他市售可获得的表达载体和系统。
实施例3. 具有固有活性的溶素的鉴定. 在铜绿假单胞菌基因组序列的GenBank数据库中鉴定出一组多达250种推定的溶素和溶素样酶。使用3种搜索方法：i) 使用已知溶素的查询序列对所有铜绿假单胞菌基因组进行有针对性的BLASTp筛选，ii) 对所有带注释的铜绿假单胞菌基因组进行基于关键词的搜索，重点是与溶素(和细胞壁水解酶)催化和结合结构域相关的所有超家族名称；和iii) 在非注释基因组的噬菌体序列中目视搜索溶素样基因。一旦鉴定，就将溶素序列合成为gBlocks，克隆到pBAD24中并转化到大肠杆菌TOP10细胞中。然后使用基于琼脂覆盖板的方法(11,13)以初级抗菌活性筛选(针对活铜绿假单胞菌)对大肠杆菌克隆进行检查，所述方法具有修改，以允许检测包含悬浮于50 mM Tris缓冲液(pH7.5)中的软琼脂的覆盖物中的GN溶素活性。鉴定出一组109种溶解克隆，并将其选择用于进行表达和纯化。
实施例4. 溶素和经修饰的溶素的表达和纯化.
广泛种类的宿主/表达载体组合可用于表达编码本公开溶素多肽的多核苷酸序列。大量合适的载体为本领域技术人员已知的，并且是可市售获得的。合适的载体的实例提供于Sambrook et al,编辑, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (2001)中。这种载体尤其包括染色体、附加型和病毒衍生的载体，例如衍生自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(比如杆状病毒、乳多空病毒比如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病毒和逆转录病毒)的载体以及衍生自其组合的载体(比如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的那些载体，比如粘粒和噬菌粒)。此外，所述载体可提供本公开溶素多肽的组成型或诱导型表达。更具体地讲，合适的载体包括(但不限于)SV40的衍生物和已知的细菌质粒(例如大肠杆菌质粒colE1、pCR1、pBR322、pMB9及其衍生物)、质粒(比如RP4、pBAD24和pBAD-TOPO)、噬菌体DNAS (例如噬菌体λ的许多衍生物，例如NM989及其他噬菌体DNA，例如M13和丝状单链噬菌体DNA)、酵母质粒(比如2D质粒或其衍生物)、可用于真核细胞的载体(比如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体)、衍生自质粒和噬菌体DNA的组合的载体(比如经修饰以使用噬菌体DNA或其他表达控制序列的质粒)等。上述许多载体可从供应商比如New England Biolabs、Addgene、Clontech、Life Technologies等市售获得，其中许多还提供合适的宿主细胞。
另外，载体可包含各种调控元件(包括启动子、核糖体结合位点、终止子、增强子、用于控制表达水平的各种顺式元件)，其中根据宿主细胞构建载体。在这些载体中可使用广泛种类的表达控制序列(控制与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达的序列)中的任何一种，以表达编码溶素多肽的多核苷酸序列。有用的控制序列包括(但不限于)：SV40、CMV、牛痘、多瘤或腺病毒的早期或晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC系统、TRC系统、LTR系统、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区域、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶(例如Pho5)的启动子、酵母-交配因子的启动子、用于在细菌中表达的大肠杆菌启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他启动子序列及其各种组合。
广泛种类的宿主细胞可用于表达本公开的溶素多肽。适合于表达本公开溶素多肽的宿主细胞的非限制性实例包括众所周知的真核和原核宿主，比如大肠杆菌、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、真菌比如酵母的菌株和动物细胞比如CHO、Rl.l、B-W和L-M细胞、非洲绿猴肾细胞(例如COS 1、COS 7、BSC1、BSC40和BMT10)、昆虫细胞(例如Sf9)以及组织培养中的人类细胞和植物细胞。尽管表达宿主可为任何已知的表达宿主细胞，但是在优选的实施方案中，表达宿主为大肠杆菌的菌株之一。这些包括(但不限于)市售可获得的大肠杆菌菌株，比如Top 10 (Thermo FisherScientific)、DH5oc (Thermo Fisher Scientific)、XLl-Blue (Agilent Technologies)、SCS110 (Stratagene)、JM109 (Promega)、LMG194 (ATCC)和BL21 (Thermo FisherScientific)。使用大肠杆菌作为宿主系统有几个优点，包括：快速生长动力学，其中在最佳环境条件下其倍增时间为约20分钟(Sezonov et al., J. Bacteriol. 189 8746-8749(2007))；易于实现高密度培养；用外源性DNA的简便快速转化等。Rosano, G.和Ceccarelli, E., Front Microbiol., 5: 172 (2014)详细讨论了关于大肠杆菌中蛋白表达的细节，包括质粒选择以及菌株选择。
溶素多肽及其载体的有效表达取决于多种因素，比如最佳表达信号(在转录和翻译两者水平上)、正确的蛋白折叠和细胞生长特征。关于构建载体的方法和将构建的重组载体转导到宿主细胞中的方法，可利用本领域已知的常规方法。尽管理解的是，并非所有载体、表达控制序列和宿主均同样良好地起作用以表达编码本公开溶素肽的多核苷酸序列，但是本领域的技术人员将能够选择合适的载体、表达控制序列和宿主而无需进行过度实验即可完成期望的表达而不背离本公开的范围。在一些实施方案中，本发明人已经发现表达水平和所表达多肽的活性之间的相关性；特别是在大肠杆菌表达系统中，中等水平的表达(例如约1-10 mg/L之间)产生的溶素多肽的活性水平要高于在大肠杆菌中以较高水平表达(例如约20-约100 mg/L之间)的溶素多肽，后者有时产生完全无活性的多肽。
本公开的溶素多肽可通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括而不限于硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱也可用于溶素多肽纯化。
或者，用于产生本公开溶素多肽的载体系统可为无细胞表达系统。各种无细胞表达系统为可市售获得的，包括(但不限于)可从Promega、LifeTechnologies、Clonetech等获得的那些。
蛋白的溶解和纯化(使用一种或多种色谱技术)在缓冲良好的溶液中进行，该溶液含有合适的离子强度的一价盐，例如相当于300-500 mM NaCl的离子强度。
固定化金属亲和色谱(IMAC)优选地用作初始纯化步骤。如果需要另外的纯化，可在另一步骤中使用尺寸排阻色谱(凝胶过滤)。如果必要，可将离子交换色谱用作最终步骤。
使用一系列诱导时间和温度来确定蛋白表达和纯化的最佳条件。主要方法已在先前研究中进行描述(11,13,25)。简而言之，在24℃-37℃下在2-24小时时间内，在LB和RM培养基(Thermo Fisher Scientific)两者中均诱导了每种表达克隆的重复。然后使诱导的培养物沉淀，并使用BugBuster (Millipore Sigma)破坏，之后通过SDS-PAGE和考马斯染色评价可溶性蛋白的表达。然后使用表达每种溶素的最佳条件扩大生产规模。使用阴离子交换(HiTrap DEAE FF)、阳离子交换(HiTrap Capto MMC)、疏水相互作用柱(HiTrap PhenylFF)和/或尺寸排阻柱(HiLoad 16/600 SuperDex)和运行Unicorn 6.3软件的AktaTM PureFPLC系统纯化。有时使用添加Mg2+来提高溶解度并增加与色谱树脂的结合能力。在纯化期间，使用还原性SDS Page凝胶通过分子量鉴定靶GN溶素。在最后的纯化步骤之后，合并含有目标GN溶素的级分，将缓冲液更换为pH值在7.2-9.0范围内(取决于蛋白的pI)的25 mMTris 150 mM氯化钠，并浓缩至约2 mg/mL。通过NanoDrop测量浓度，并将蛋白以500 µL等分试样储存于-80℃下。
实施例5. 最小抑制浓度(MIC)的测定. 使用临床和实验室标准协会(Clinicaland Laboratory Standards Institute) (CLSI)定义的标准肉汤微量稀释参考方法的修改，确定每种GN溶素对铜绿假单胞菌的最小抑制浓度(26)。该修改基于用CAA培养基或补充有25%人血清的CAA置换Mueller Hinton Broth。
实施例6. 最小生物膜根除浓度(MBEC)的确定. CF-301的MBEC使用具有修改的肉汤微量稀释MIC方法的变体确定(27,28)。在此，将铜绿假单胞菌菌株ATCC 17647的新鲜菌落悬浮于PBS (0.5 McFarland单位)中，在TSBg (补充有0.2%葡萄糖的胰蛋白酶大豆肉汤)中以1:100稀释，作为0.15 ml等分试样添加到Calgary Biofilm Device (盖子上带有96个聚碳酸酯钉的96孔板; Innovotech)中，并在37℃下温育24小时。洗涤生物膜，并在37℃下用以TSBg进行2倍稀释系列的CF-301处理24小时。所有样品一式三份进行检查。处理之后，洗涤孔，在37℃下风干并用0.05%结晶紫染色10分钟。染色之后，将生物膜在33%乙酸中脱色，并测定所提取的结晶紫的OD600。每个样品的MBEC为通过结晶紫定量评价的去除> 95%的生物膜生物量所需的最小药物浓度。
实施例7. 检查与抗生素的协同作用的棋盘测定. 棋盘测定基于对CLSI方法的修改，该方法用于通过肉汤微量稀释进行MIC测定(26,29)。通过首先准备96孔聚丙烯微量滴定板的列来构建棋盘，其中每孔具有相同量的沿水平轴稀释2倍的抗生素。在单独的板中，准备可比较的行，其中每孔具有相同量的沿垂直轴稀释2倍的GN溶素。然后将GN溶素和抗生素稀释液合并，使得每列具有恒定量的抗生素和GN溶素的倍增稀释液，而每行具有恒定量的GN溶素和抗生素的倍增稀释液。因此，每孔具有GN溶素和抗生素的独特组合。在含有25%人血清的CAA中，将细菌以1 x 105 CFU/mL的浓度添加到药物组合中。然后在37℃下于环境空气中16小时之后记录单独和组合的每种药物的MIC。计算每种药物的分级抑菌浓度总和(ΣFIC)，并使用最小ΣFIC值(ΣFICmin)确定协同作用。ΣFIC的计算如下：ΣFIC= FIC A+ FIC B，其中FIC A为组合中每种抗生素的MIC/单独的每种抗生素的MIC，和FIC B为组合中每种GN溶素的MIC/单独的每种GN溶素的MIC。当ΣFIC≤0.5时，组合认为是协同的；当ΣFIC> 0.5至<1时，认为是强加性的；当ΣFIC为1-<2时，认为是加性的；和当ΣFIC≥2时，认为是拮抗的。
实施例8. GN溶素溶血活性的测定. GN溶素的溶血活性作为人红细胞溶解释放的血红蛋白的量来测量(30)。简而言之，将3 ml从合并的健康供体(BioreclamationIVT)中获得的新鲜人血细胞(hRBC)在含有肝素的聚碳酸酯试管中于4℃下以1000×g离心5分钟。将获得的红细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(pH 7.2)洗涤3次，并重悬于30 PBS中。将50 µl体积的红细胞溶液与50 µl每种GN溶素(在PBS中)以2倍稀释范围(从128 μg/mL到0.25 μg/mL)在37℃下一起温育1小时。通过在4℃下以1000×g离心5分钟沉淀完整的红细胞，并将上清液转移至新的96孔板中。通过测量570 nm处的吸光度来监测血红蛋白的释放。作为阴性对照，将PBS中的hRBC用0.1% Triton X-100进行如上处理。
实施例9. GN溶素活性的时间-杀灭试验. 将铜绿假单胞菌的过夜培养物以1:50稀释到新鲜的CAA培养基中，并伴随搅拌于37℃下生长2.5小时。然后使指数期细菌沉淀并重悬于1/5培养体积的25 mM HEPES (pH7.4)中，之后最终调节至对应于McFarland值为0.5的光密度。然后将经调节的培养物以1:50稀释到25 mM HEPES (pH7.4)或CAA/HuS中，并以10 μg/mL的最终浓度添加GN溶素。无添加溶素的对照培养物(即缓冲液对照)包括在内。将所有处理物在37℃下伴随通气进行温育。在添加溶素(或缓冲液对照)之前的时间点以及之后的1小时和3小时间隔，取出培养样品以在CAA琼脂平板上定量铺板。
计划的体内实验
目前正在如下进行一项或多项实验以测试本发明多肽的体内活性：
A. 在急性致死菌血症小鼠模型中的试验PK筛选和功效
为了鉴定具有全身性暴露的GN溶素，将在用作为单次IV注射给予的GN溶素治疗的CD1小鼠中进行PK筛选。将使用适合小鼠血清的研究级生物分析测定分析多达10种GN溶素的血液PK特征。预计将鉴定出具有适当PK特征的多种GN溶素。将以全身性感染模型测试显示达到大于1的AUC/MIC浓度的血液暴露的候选物。对于该模型，铜绿假单胞菌菌株(PAO1和其他临床分离株)将被重悬于猪胃粘蛋白中，并通过腹膜内给予以接种物给予到CD1小鼠体内，该接种物在对照小鼠中在24-48小时内产生完全发病率和死亡率。在致死性攻击后2小时，通过侧尾静脉中的静脉内(IV)注射给予小鼠媒介物或GN溶素。在72小时内评价发病率和死亡率。预计以适当的剂量浓度，与媒介物对照相比较，经GN溶素治疗的小鼠将显示出降低的发病率和死亡率。研究可能涉及抗生素的共同给予。A.生存数据将使用GraphPad prism通过Kaplan Meyer生存分析进行分析，对每种分子计算50%的有效浓度(EC50)。预计将鉴定出具有体内活性的多种GN溶素。
B. GN溶素在已建立的鼠侵袭性感染模型中的功效
该实验和其他小鼠感染模型(比如肺和肾)的目标为在这些模型中生成功效数据。在该子目标中提出的功效模型通常利用小鼠组织(大腿、肺或肾)中的细菌感染。用溶素治疗后，在实验结束时对组织中的细菌负荷进行定量(CFU/克组织)，以评价治疗的稳健性。另外，这些模型中的每一个均可用于定义PK/PD指数和功效幅度，例如AUC/MIC。因此，这些模型将用于评估代表性GN抗假单胞菌属溶素单独或与抗生素组合在鼠肺感染模型中的功效，以确定用于进一步体内测试和开发的最佳GN溶素候选物。可使用鲍曼不动杆菌建立类似模型，并用于测试本发明溶素的功效。
B.1鼠中性粒细胞减少大腿感染和肺感染模型
大腿感染模型
为了建立第一个模型，按照给药方案，通过腹膜内给予20 mg/mL的环磷酰胺使得CD-1小鼠(n = 12)中性粒细胞减少，所述给药方案提供中性粒细胞计数减少超过99% (第- 4天为150 mg/kg和第-1天为100 mg/kg)。在第二剂免疫抑制剂之后24小时，通过向两大腿外侧肌肉肌内(IM)注射适当的铜绿假单胞菌接种物(3 x 104或1 x 105或3 x 105或1 x 106cfu/大腿)建立大腿感染。在吸入麻醉下，通过肌内注射到两大腿外侧肌肉进行小鼠感染。每条大腿可接受约1.4 x 105 CFU鲍曼不动杆菌NCTC 13301 (和/或等量的铜绿假单胞菌菌株)。但是如果测试表明合适的话，可对接种物的量进行调整。
在感染后2、6和10小时，通过静脉内(iv)注射，将4只小鼠的组(6，仅媒介物(最末组))给予测试GN溶素或媒介物或对照溶素。在感染后2小时，使用戊巴比妥过量剂量对4只动物的对照组实施人道安乐死，以提供治疗前的对照组(开始)。感染后16小时，通过戊巴比妥对所有其余组实施人道安乐死。取下每只动物的两条大腿并单独称重(视为两项独立评估)。将测试的溶素包括天然和经修饰的溶素，它们具有有前途的特性，即具有显著溶解活性和在存在血液基质的情况下保持显著活性。在本文详述的该实验和其他实验中测试的剂量范围将在0.01-500 mg/kg的宽范围内，但上限可能取决于毒性，而下限可能取决于固有活性而更高。待测试的溶素的实例包括GN108、GN121、GN123和GN156。
将单独大腿组织样品在冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水中匀浆。然后将大腿匀浆定量培养到CLED琼脂上，并在37℃下温育24小时，之后计数菌落。预计溶素将导致细菌菌落的显著减少或消除。
小鼠肺感染模型
将每次治疗多达8只麻醉(IP注射100 mg/kg氯胺酮/6 mg/kg甲苯噻嗪混合物)小鼠的组通过向每个鼻孔鼻内滴注20 μl接种物(鼻孔之间5分钟)进行感染，并在感染后保持直立姿势~10分钟。如上所述先前确定合适的接种物的强度和量。
铜绿假单胞菌ATCC 27853的接种物浓度为~2.5 x 106 cfu/ml (1.0 x 105 cfu/肺)，或鲍曼不动杆菌NCTC 13301的接种物浓度为~8.8 x 108 cfu/ml (3.5 x 107 cfu/肺)。使用相同的给予途径和给药指南将溶素(例如在前述实验中鉴定的溶素)给药，并取出肺，且准备按照大腿模型进行计数。在37℃下温育24小时后计数菌落。将根据小鼠的体重和肺匀浆的细菌负荷来评价功效。如通过显著减少或消除的细菌菌落所测量的，预计溶素在减轻感染方面将令人满意地发挥作用。
B.2中性粒细胞减少鼠肺感染模型
将中性粒细胞减少的BALB/c小鼠用含有足以建立肺感染的接种物的铜绿假单胞菌细菌在麻醉下经鼻内滴注进行接种。在感染后2、6和10小时，通过皮下(SC)注射，将4只小鼠的组(6，仅媒介物(最末组))给予GN溶素、媒介物或对照溶素。在感染后2小时，使用戊巴比妥过量剂量对4只动物的对照组实施人道安乐死，以提供治疗前的对照组(开始)。感染后16小时，通过戊巴比妥对所有其余组实施人道安乐死。将动物称重，并取下每只动物的两个肺且单独称重。溶素和给药可与上述相同。
将单独肺组织样品在冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水中匀浆。然后将大腿匀浆定量培养到CLED琼脂上，并在37℃下温育24小时，之后计数菌落。根据体重和细菌负荷来评价治疗功效。
将每次治疗多达8只麻醉(IP注射100 mg/kg氯胺酮/6 mg/kg甲苯噻嗪混合物)小鼠的组通过向每个鼻孔鼻内滴注铜绿假单胞菌接种物(鼻孔之间5分钟)进行感染，并在感染后保持直立姿势~10分钟。在第-4天以200 mg/kg和第-1天以150 mg/kg皮下给予环磷酰胺对小鼠事先进行免疫抑制。在第二剂免疫抑制之后24小时发生感染。
对于铜绿假单胞菌ATCC 27853，起始接种物浓度可为~2.5 x 106 cfu/ml (1.0 x105 cfu/肺)。可对接种物进行调整，目的是使未经治疗的小鼠细菌负荷增加约1 log 10cfu/g肺。对于以下所述的存活研究，将选择导致在24-72小时内死亡的接种物。
然后将溶素鼻内给药，对小鼠实施安乐死，称重，抽出肺并称重，且取出肺并准备按照大腿模型进行计数。在37℃下温育24小时后计数菌落。可使用与以上相同的溶素和给药。溶素以5 ml/kg静脉内给予。
在相关实验中，将选择亚最佳剂量的对革兰氏阴性菌具有活性的抗生素，并与溶素一起以亚阈值水平使用。可通过用低于、处于或高于最小有效剂量的各种剂量的抗生素治疗感染的小鼠来建立适当的亚阈值水平。对照小鼠单独用各种剂量的媒介物治疗。将有一种媒介物作为溶素治疗的替代品，和另一种媒介物作为抗生素的替代品。对于每种测试的溶素，将使用40只小鼠(每组5只)。
如果亚胺培南为抗生素，则合适的亚阈值剂量可能在10-100 mg/kg之间(更通常地，亚阈值或亚最佳剂量可为使细菌负荷减少1或2 log的剂量)，并例如以5 ml/kg皮下或静脉内给予进行该实验和组合(抗生素+溶素)实验。
对于组合实验，考虑抗生素(例如亚胺培南)的剂量将为所测试的最大亚阈值剂量。通过在组合治疗中测试不同剂量的溶素来确定适当的溶素剂量，以观察在何处出现协同作用。然后将选择最佳的溶素和抗生素用量组。感染后2小时给予溶素和抗生素的首次治疗； 感染后6小时给予第二次抗生素治疗。感染后9小时收获组织。
使用相同的小鼠肺感染模型进行类似研究，但仅评价小鼠的存活。感染的小鼠在感染后24小时给予溶素(或媒介物或对照溶素)。考虑使用3种不同剂量的每种溶素。亚胺培南(或媒介物)将在溶素给药后6小时给予。实验在感染之后72小时结束。考虑存活实验使用每组7只小鼠，即对于每种测试的溶素使用63只小鼠。预计当给予组合时，存活百分比将更好。
C. 鼠感染模型中的PK/PD分析
描述与功效最密切相关的PK/PD变量(例如Cmax/MIC、AUC/MIC或%时间/MIC)的使用抗感染剂的动物实验高度预测临床成功(31)。剂量分割用于确定与功效相关的PK/PD参数。通过将单个总剂量分割成一天一次(q24h)、一天两次(q12h)或一天四次(q6h)给药，可在保持恒定AUC的同时获得Cmax和游离药物时间>MIC (fT>MIC)的多个值。多个剂量的分割产生独特的暴露曲线，其当与功效终点相比较，能够将Cmax/MIC、fT>MIC和AUC/MIC区分为PK指数和功效所需的幅度。
在上文鉴定的一种或多种鼠感染模型中具有稳健活性的GN溶素将进行PK/PD分析。将进行PK研究以生成多个PK曲线，并进行建模以覆盖Cmax/MIC、AUC/MIC和fT>MIC的范围。剂量分割研究将在如上所述的肺功效模型(小鼠、大鼠或兔)中进行。组织细菌负荷用作PD终点，并通过绘制CFU/g组织与不同PK/PD参数的函数图来分析数据。非线性回归分析将确定哪个PK/PD参数对于功效重要。这些数据将用于告知非临床活动的剂量。
一种进行PK研究的方法如下：
表10
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在表10所示的时间，对小鼠实施安乐死，并且每个时间点3只小鼠的组通过心脏穿刺采集血液样品。将分离的血浆样品分为两个等分试样。采血后，从气管中形成的狭窄横向开口采集3x支气管肺泡灌洗液样品(PBS)。将3个BAL样品合并并离心以去除细胞碎片。将BAL上清液分为两个等分试样。进一步测试血浆和BAL的一个样品的溶素含量和细菌负荷。分析第二个样品的尿素含量，以计算在采集BAL期间上皮细胞衬液(ELF)的稀释度。
D. 监测体内抗性的出现
为了确定出现抗性的可能性，对来自小鼠功效研究的体内匀浆进行MIC分析。如果观察到MIC超过2倍的增加，则将细菌铺板，并分离菌落以进行全基因组测序。
实施方案
A. 一种药用组合物，其包含：选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205中的一种或多种的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体以及药学上可接受的载体，其中溶素多肽或片段或变体以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量存在。
B. 一种药用组合物，其包含有效量的选自GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体以及药学上可接受的载体，其中溶素多肽以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量存在；以及药学上可接受的载体。
C. 实施方案A或B的药用组合物，其为溶液剂、混悬剂、乳剂、可吸入粉剂、气雾剂或喷雾剂。
D. 实施方案B的药用组合物，其进一步包含一种或多种适合于治疗革兰氏阴性菌的抗生素。
E. 一种包含分离的多核苷酸或所述多核苷酸的互补序列的载体，所述多核苷酸包含编码实施方案A或B的溶素多肽的核酸分子，其中所编码的溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
F. 一种包含编码溶素多肽的核酸的重组表达载体，所述多肽包含实施方案A或B的多肽的氨基酸序列，其中所编码的溶素多肽具有抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的特性，所述核酸可操作地连接于异源启动子。
G. 一种包含实施方案E或F的载体的宿主细胞。
H. 实施方案E或F的重组载体，其中核酸序列为cDNA序列。
I. 一种分离的多核苷酸，其包含编码选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的核酸分子，其中溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
J. 实施方案I的多核苷酸，其为cDNA。
K. 一种抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长或减少至少一种革兰氏阴性菌物种的群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种的方法，所述方法包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量使细菌与药用组合物接触，所述药用组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
L. 一种治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌引起的细菌感染的方法，其包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量给予诊断患有细菌感染、处于其风险下或呈现出其症状的受试者以下组合物，所述组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
M. 实施方案L的方法，其中至少一种革兰氏阴性菌物种选自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、克雷伯菌属物种(Klebsiella spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和土拉弗朗西斯菌(Franciscella tulerensis)。
N. 实施方案L的方法，其中革兰氏阴性菌感染为由铜绿假单胞菌引起的感染。
O. 一种在受试者中治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌引起的局部或全身性病原菌感染的方法，其包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌的量给予受试者以下组合物，所述组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
P. 一种预防或治疗细菌感染的方法，其包括将第一有效量的含有有效量的选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的组合共同给予诊断患有细菌感染、处于其风险下或呈现出其症状的受试者。
Q. 实施方案P的方法，其中抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B和粘菌素中的一种或多种。
R. 一种用于增强适合于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的功效的方法，其包括共同给予抗生素与一种或多种选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的组合，其中给予所述组合在抑制生长或减少群体或杀灭革兰氏阴性菌方面比单独给予抗生素或溶素多肽或其活性片段更有效。
S. 一种选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
T. 一种包含选自GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123、GN150和GN203的革兰氏阴性天然溶素的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中天然溶素或片段已任选地通过用非荷电氨基酸残基取代1-3个荷电氨基酸残基而进行修饰，经修饰的天然溶素或片段保留溶解活性。
U. 一种包含选自GN2、GN4、GN14、GN43和GN37的革兰氏阴性天然溶素的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中天然溶素或变体或片段已通过用非荷电氨基酸残基取代1-3个荷电氨基酸残基而进行修饰，经修饰的天然溶素或片段保留溶解活性。
V. 实施方案A或B的药用组合物，其中溶素多肽选自GN156、GN121、GN108和GN123中的一种或多种或其活性片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
W. 实施方案K的方法，其中所述细菌处于生物膜中，该方法实现生物膜的破坏。
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Claims (23)

1.一种药用组合物，其包含：选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205中的一种或多种的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体以及药学上可接受的载体，其中所述溶素多肽或片段或变体以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量存在。
2.一种药用组合物，其包含有效量的选自GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体以及药学上可接受的载体，其中所述溶素多肽以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量存在；以及药学上可接受的载体。
3.权利要求1或2的药用组合物，其为溶液剂、混悬剂、乳剂、可吸入粉剂、气雾剂或喷雾剂。
4.权利要求2的药用组合物，其进一步包含一种或多种适合于治疗革兰氏阴性菌的抗生素。
5.一种包含分离的多核苷酸或所述多核苷酸的互补序列的载体，所述多核苷酸包含编码权利要求1或2的溶素多肽的核酸分子，其中所编码的溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
6.一种包含编码溶素多肽的核酸的重组表达载体，所述多肽包含权利要求1或2的多肽的氨基酸序列，其中所编码的溶素多肽具有抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的特性，所述核酸可操作地连接于异源启动子。
7.一种包含权利要求5或6的载体的宿主细胞。
8.权利要求5或6的重组载体，其中所述核酸序列为cDNA序列。
9.一种分离的多核苷酸，其包含编码选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的核酸分子，其中所述溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
10.权利要求9的多核苷酸，其为cDNA。
11.一种抑制至少一种革兰氏阴性菌物种的生长或减少至少一种革兰氏阴性菌物种的群体或杀灭至少一种革兰氏阴性菌物种的方法，所述方法包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量使所述细菌与药用组合物接触，所述药用组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
12.一种治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌引起的细菌感染的方法，其包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种的量给予诊断患有细菌感染、处于细菌感染风险下或呈现出细菌感染的症状的受试者以下组合物，所述组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
13.权利要求12的方法，其中至少一种革兰氏阴性菌物种选自铜绿假单胞菌、克雷伯菌属物种、肠杆菌属物种、大肠埃希氏菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、鼠疫耶尔森氏菌和土拉弗朗西斯菌。
14.权利要求12的方法，其中所述革兰氏阴性菌感染为由铜绿假单胞菌引起的感染。
15.一种在受试者中治疗由选自铜绿假单胞菌和任选地一种或多种另外的革兰氏阴性菌物种的革兰氏阴性菌引起的局部或全身性病原菌感染的方法，其包括以有效抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌的量给予受试者以下组合物，所述组合物含有选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
16.一种预防或治疗细菌感染的方法，其包括将第一有效量的含有有效量的选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的组合物和第二有效量的适合于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的组合共同给予诊断患有细菌感染、处于细菌感染风险下或呈现出细菌感染的症状的受试者。
17.权利要求16的方法，其中所述抗生素选自头孢他啶、头孢吡肟、头孢哌酮、头孢吡普、环丙沙星、左氧氟沙星、氨基糖苷类、亚胺培南、美罗培南、多利培南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、哌拉西林、替卡西林、青霉素、利福平、多粘菌素B 和粘菌素中的一种或多种。
18.一种用于增强适合于治疗革兰氏阴性菌感染的抗生素的功效的方法，其包括共同给予抗生素与一种或多种选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205、GN3、GN13、GN17、GN9、GN10、GN105、GN108、GN123、GN150、GN203中的一种或多种的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体的组合，其中给予所述组合在抑制生长或减少群体或杀灭革兰氏阴性菌方面比单独给予抗生素或溶素多肽或其活性片段更有效。
19.一种选自GN147、GN146、GN156、GN92、GN54、GN201、GN202、GN121、GN94、GN200、GN204、GN205的分离的溶素多肽或其具有溶素活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中所述溶素多肽抑制生长或减少群体或杀灭铜绿假单胞菌和任选地至少一种其他革兰氏阴性菌物种。
20.一种包含选自GN3、GN9、GN10、GN13、GN17、GN105、GN108、GN123、GN150和GN203的革兰氏阴性天然溶素的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中所述天然溶素或片段已任选地通过用非荷电氨基酸残基取代1-3个荷电氨基酸残基而进行修饰，所述经修饰的天然溶素或片段保留溶解活性。
21.一种包含选自GN2、GN4、GN14、GN43和GN37的革兰氏阴性天然溶素的溶素多肽或其具有溶解活性的片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体，其中所述天然溶素或变体或片段已通过用非荷电氨基酸残基取代1-3个荷电氨基酸残基而进行修饰，所述经修饰的天然溶素或片段保留溶解活性。
22.权利要求1或2的药用组合物，其中所述溶素多肽选自GN156、GN121、GN108和GN123中的一种或多种或其活性片段或其具有溶解活性并与所述溶素多肽具有至少80%序列同一性的变体。
23.权利要求11的方法，其中所述细菌处于生物膜中，所述方法实现所述生物膜的破坏。
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