CN117660413A - 一种内溶素Lys009及其工程改造和应用 - Google Patents

一种内溶素Lys009及其工程改造和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种内溶素Lys009及其工程改造和应用，属于基因工程领域。本发明从人体肠道的宏病毒组中挖掘新型的噬菌体内溶素，发现一种新型的内溶素Lys009，经过工程改造过的新型内溶素可以高效裂解铜绿假单胞菌。新型的内溶素的发现不仅具有重要的理论研究意义，同时也将为临床治疗多重耐药菌提供新的选择。

Description

一种内溶素Lys009及其工程改造和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及内溶素Lys009及其工程改造和应用。更具体地，本发明涉及包含目的的内溶素蛋白，通过表达所述内溶素，对挖掘得到的天然内溶素进行酶活验证。此外，本发明还涉及一种使用经工程改造的天然内溶素对铜绿假单胞菌进行抑菌的方法。
背景技术
目前，全球性的抗生素滥用和过度使用已导致越来越多的新型耐药菌的出现和扩散，对公共卫生构成重大威胁[1]。统计数据，每年由多重耐药细菌(Multi-drug resistant，MDR)病原体引起的感染夺走全世界约70万患者的生命，预计这一数字在未来几年还会增加[2]。因此，在抗击感染的斗争中，开发创新抗菌药物势在必行[3]。根据美国NIH(https://clinicaltrials.gov/)和WHO国际临床试验平台(ICTRP)临床试验数据库(https://www.who.int/clinical-trials-registry-platform)统计，目前有80种抗菌药物正在进行临床试验阶段，其中包括46种抗菌药物和34种非抗菌药物，包括抗体、微生物组调节剂、免疫调节剂、噬菌体和噬菌体内溶素。噬菌体内溶素(Phage endolysins，lysins)是一种肽聚糖(Peptidoglycan，PG)降解酶，由噬菌体编码，在噬菌体周期结束时裂解宿主细菌细胞膜，已成为一类有前途的新型抗菌物。在这些非传统的治疗方案中，噬菌体内溶素具备以下关键优势[4]：(1)特异性和有效活性：它可以有针对性的对多重耐药细菌进行杀伤，同时不破坏正常人体微生态群落。(2)低耐药性风险：由于其依赖相对保守的肽聚糖结构，因此内溶素具有较低的产生耐药性可能性。(3)协同作用：当与其他内溶素或抗生素联合使用时，内溶素能够对定植于黏膜表面并形成生物膜的致病菌产生协同效应。它们对革兰氏阳性菌特别有效[5]。迄今为止，针对革兰阳性细菌，包括金黄色葡萄球菌和艰难梭杆菌，已经有三个与噬菌体内溶素相关的药品进入临床试验阶段[6-8]：SAL200、CF-301和LMN-201。与此相反，针对革兰氏阴性菌的溶解菌素的开发相对滞后。革兰氏阴性菌细胞壁的外膜(Outermembrane，OM)形成了溶酶进入和降解PG层的屏障，使得溶酶治疗对革兰氏阴性菌无效[9]。为了克服这一障碍，研究人员使用辅助内溶素渗透细胞外膜的可行方法，包括与化学试剂，称为外膜渗透剂(OMP)共同给药，这种化学试剂可以破坏细胞外膜，如乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸，或通过蛋白质工程对内溶素进行修饰，包括通过将天然内溶素与穿膜肽进行融合，这可能是一种很有希望的对抗革兰氏阴性菌的策略[10]。
为了扩大潜在的临床应用候选内溶素，本领域仍然需要挖掘出更多更有效的内溶素。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种内溶素Lys009。
本发明的另一目的在于提供一种工程改造内溶素KWK-Lys009。
本发明的再一目的在于提供上述Lys009或KWK-Lys009的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种内溶素Lys009，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者是如SEQ ID NO：1通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列。
上述内溶素Lys009相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
(1)编码所述内溶素Lys009的核酸分子；
(2)含有(1)中所述核酸分子的表达盒；
(3)含有(1)中所述核酸分子的重组表达载体；
(4)含有(2)中所述表达盒的重组表达载体；
(5)含有(1)中所述核酸分子的重组微生物；
(6)含有(2)中所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)或(4)所述重组表达载体的重组微生物。
进一步，(1)中所述的核酸分子为编码内溶素Lys009的基因序列，如SEQ ID NO：3所示，或者是如SEQ ID NO：3通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。
进一步，(3)、(4)中所述重组表达载体的出发载体为pET系列的载体等；优选为pET32a(+)载体。
进一步，(5)、(6)、(7)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物、酵母或高等真核细胞；所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。更具体而言，所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(E.coli)，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
一种工程改造内溶素KWK-Lys009，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ ID NO：2通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列。
上述工程改造内溶素KWK-Lys009相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
(a)编码所述工程改造内溶素KWK-Lys009的核酸分子；
(b)含有(a)中所述核酸分子的表达盒；
(c)含有(a)中所述核酸分子的重组表达载体；
(d)含有(b)中所述表达盒的重组表达载体；
(e)含有(a)中所述核酸分子的重组微生物；
(f)含有(b)中所述表达盒的重组微生物；
(g)含有(c)或(d)所述重组表达载体的重组微生物。
进一步的，(a)中所述核酸分子为编码工程改造内溶素KWK-Lys009的基因序列，如SEQ ID NO：4所示，或者是如SEQ ID NO：4通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。
进一步的，(c)、(d)中所述重组表达载体的出发载体为pET系列的载体等；优选为pET32a(+)载体。
进一步的，(e)、(f)、(g)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物、酵母或高等真核细胞；所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)以及假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)的细菌。更具体而言，所述原核生物是埃希氏菌属，优选大肠杆菌(E.coli)，具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
上述内溶素Lys009相关的生物材料或工程改造内溶素KWK-Lys009相关的生物材料在制备内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009中的应用。
一种内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009的制备方法，包括如下步骤：培养重组微生物，从重组微生物中得到内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009。
进一步，一种工程改造内溶素KWK-Lys009的制备方法，包括如下步骤：
使用基因工程的方法，在内溶素Lys009的N端连接一个短肽，构成工程改造内溶素KWK-Lys009，将基因序列转化至宿主微生物中，获得重组微生物，并培养重组微生物，从重组微生物中制备得到工程改造内溶素KWK-Lys009。
上述内溶素Lys009及其生物材料或工程改造内溶素KWK-Lys009及其生物材料的应用，为下述应用中的任意一种或多种组合：
①在制备抗革兰氏阴性菌的产品中的应用；
②在制备治疗革兰氏阴性菌感染的产品中的应用；
③在制备抗革兰氏阳性菌的产品中的应用；
④在制备治疗革兰氏阳性菌感染的产品中的应用。
进一步的，①、②中所述的革兰氏阴性菌包括但不限于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、伤鼠伤寒沙门氏菌和致病性大肠杆菌等中的至少一种；
进一步的，③、④中所述的革兰氏阳性菌包括但不限于单增李斯特菌等。
在其中一个实施方式中，本发明的工程改造内溶素KWK-Lys009能够使得铜绿假单胞菌裂解，其裂解铜绿假单胞菌的能力比对照显著提高。
在其中一个实施方式中，本发明的工程改造内溶素KWK-Lys009能够使得大肠杆菌工程菌裂解，重组蛋白被释放出来，进而提高工程菌在重组蛋白提取中的效率。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明从人体肠道的宏病毒组中挖掘新型的噬菌体内溶素，发现一种新型的内溶素Lys009，经过工程改造过的新型内溶素可以高效裂解铜绿假单胞菌。新型的内溶素的发现不仅具有重要的理论研究意义，同时也将为临床治疗多重耐药菌提供新的选择。
附图说明
图1示出基于内溶素候选蛋白的表达与纯化策略以及所采用的pET32a-POI-His-tag表达载体结构图；其中，POI为Lys009。
图2示出Lys009内溶素候选蛋白基于His-tag方法的纯化方法的表达与纯化的SDS-PAGE分析结果图；其中，A：表达后裂解上清(ES)和裂解沉淀(EP)制样的SDS-PAGE分析结果图；B：ES经过镍柱纯化，制样纯化后的Lys009内溶素蛋白的SDS-PAGE分析结果图，蛋清溶菌酶(HEWL)为阳性对照，BSA 1-3分别为0.0625、0.25和0.5mg/mL。
图3示出内溶素酶活检测分析，内溶素候选蛋白的饱和曲线结果图。
图4示出KWK-Lys009工程改造内溶素蛋白基于His-tag方法的纯化方法的表达与纯化的SDS-PAGE分析结果图；其中，A：ES和EP制样的SDS-PAGE分析结果图；B：ES经过镍柱纯化，制样纯化后的KWK-Lys009工程改造内溶素蛋白的SDS-PAGE分析结果图，BSA1-4分别为0.03125、0.0625、0.25和0.5mg/mL。
图5示出KWK-Lys009工程内溶素候选蛋白的最小抑菌浓度(MIC)测定结果图。
图6示出KWK-Lys009工程内溶素活性验证；其中，A：浓度对工程内溶素的影响；B：温度对工程内溶素的影响；C：pH对工程内溶素的影响。
图7示出KWK-Lys009工程内溶素的裂解谱测定。
图8示出KWK-Lys009工程内溶素在大肠杆菌BL21/pET30a-CpA-PT-RFP工程菌株上的菌体裂解测试；A：添加KWK-Lys009的菌体裂解离心后的上清(ES)和沉淀(EP)图；B：添加KWK-Lys009后裂解工程大肠杆菌的上清(ES)和沉淀(EP)的SDS-PAGE分析结果图；BSA1-4分别为0.03125、0.0625、0.25和0.5mg/mL。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例
为使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面将通过实施例对本发明实施方式作进一步地详细描述。应当理解实施例不应理解为限制性的，本领域技术人员能够基于本发明的原理对实施方式做进一步的调整。
菌株大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)来自北京全式金。DNA测序由中国广州的生工公司完成。限制性内切酶和DNA聚合酶购自New England Biolabs(Beverly,USA)。DNA纯化、凝胶回收、基因组DNA提取和质粒扩增试剂盒购于天根生化科技有限公司。铜绿假单胞菌PAO1为第三军医大学胡福泉教授赠送。用于克隆的寡核苷酸由生工生物工程股份有限公司(中国广州部)合成。
实施例1.内溶素编码的基因的获得和蛋白序列分析
我们从人体微生物组的宏病毒组测序数据进行数据挖掘，健康人肠道宏病毒组数据集(Gut virome dataset，GutV，https://nmdc.cn/，Biosample ID：NMDC40044006)，挖掘得到一条内溶素候选蛋白，编号Lys009。Lys009内溶素的氨基酸序列见SEQ ID NO：1所示。
所述噬菌体内溶素蛋白序列与现有的蛋白数据库相似度(Identity)均低于60％，包括非冗余(Non-redundant，NR)蛋白数据库和Uniprot(Universal protein)数据库。本研究进一步对序列进行结构域注释，使用Interproscan软件进行Pfam数据库注释，具体序列信息见表1所示。
表1本实施例内溶素Lys009序列信息
实施例2：内溶素蛋白表达载体的构建
本实施例中的Lys009内溶素基因由睿博生物技术有限公司(中国广州部)合成，其DNA序列在大肠杆菌中进行了密码子优化，大肠杆菌密码子优化后的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
为了构建表达载体pET32a-POI-His-tag(其中，POI为Lys009)，将pET32a(+)载体的NdeⅠ和XhoⅠ限制酶切位点间的序列替换为上述Lys009内溶素基因(为了便于目的蛋白的纯化，在Lys009内溶素基因的3'端添加有组氨酸标签(His-tag))，构建得到重组表达载体pET32a-Lys009-His-tag。由睿博生物技术有限公司(中国广州部)完成，质粒构建图谱见图1。
实施例3内溶素蛋白表达与纯化
待测菌：重组菌BL21(DE3)-pET32a-Lys009-His-tag和空白对照菌BL21(DE3)-pET32a。其中，重组菌是将实施例2的重组表达载体pET32a-Lys009-His-tag转化至大肠杆菌BL21(DE3)制备得到；空白对照菌是将pET32a(+)载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)制备得到。
1、将待测大肠杆菌单菌落接种到含100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养过夜(12-16h)；过夜菌液按1：50转接到100μg/mL氨苄青霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养至OD600值达到0.6-0.8，将菌液和摇床预冷30min至16℃，加入IPTG至终浓度为0.2mM进行诱导表达，16℃、220rpm诱导表达24h，4℃、4,000rpm离心20min收集菌体。
2、完成步骤1后，进行破碎菌体：将收集的菌体用Binding Buffer重悬至20OD600，用超声破碎仪进行破碎细胞；
3、内溶素蛋白纯化：
镍柱纯化方法：超声破碎结束后，4℃，15,000g，离心30min，分离裂解上清(ES)和裂解沉淀(EP)，ES和EP制样用于SDS-PAGE检测。SDS-PAGE检测结果如图2A所示。从图2A可知，与pET32a(+)空载表达条带进行对比，表明Lys009蛋白可以表达并大部分表达于上清(ES)中，条带大小与理论分子质量25.6kDa相符合(见表4)。将ES用0.22μm的滤膜过滤，加入HisPur Ni-NTA离心柱中，放置在摇床上4℃，100rpm孵育30min，以便目的蛋白与离心柱特异性结合，4℃，700g离心2min，收集流穿液。随后采用梯度洗脱方法，依次使用10％、30％、50％、80％、和100％的洗脱缓冲液(Elution Buffer)，逐步增加咪唑浓度进行梯度洗脱，收集各浓度的洗脱液。
4、浓缩和透析：纯化后蛋白使用10kDa超滤管进行浓缩，浓缩到小体积(1-2mL)后用10kDa透析袋进行透析，将缓冲液置换成10mM PBS(pH 7.4)，在4℃冰箱透析过夜，透析后留取少量样品制样。
5、所有样品用于SDS-PAGE检测，采用ImageJ进行蛋白灰度计算，使用BSA蛋白标准浓度样品做参比，制作BSA标准蛋白浓度曲线，来测定获得的候选内溶素浓度。SDS-PAGE检测结果如图2B所示。从图2B可知，表明Lys009蛋白可通过镍柱纯化的方法成功进行纯化，且纯度为92％。
实施例4内溶素蛋白活性检测
本实施例中所使用的铜绿假单胞菌外膜透化的细胞底物制备方法，参考Yoyeon和Lim等人[11,12]方法。本实施例中所使用的阳性对照为蛋清溶菌酶(Hen egg whitelysozyme，HEWL,Sigma-Aldrich,L6876,CAS:12650-88-3)。
1、将铜绿假单胞菌PAO1菌株单菌落在无抗的MHB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养过夜(12-16h)。过夜菌液体按1：50转接到新鲜的无抗的MHB液体培养基中，生长至对数期，即OD600为0.5-0.6，4℃，4,000g，离心15min。将离心收集后的细胞用20mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤1次，用含20mM Tris-HCl(pH 8.0)和100mM EDTA的缓冲液在25℃恒温培养箱孵育5min，最后用20mM Tris-HCl洗涤3次以离心去除残留的EDTA，再用蛋白缓冲液10mM PBS(pH7.4)将细胞沉淀重悬至OD600为0.8-1.2，置于冰上，外膜透化的细胞底物制备完成；
2、取20μL 10μg/mL纯化内溶素蛋白加入到96孔板中，向蛋白中分别加入180μL外膜透化的细胞底物，25℃下孵育，空白对照为20μL 10mM PBS(pH 7.4)，阳性对照为20μL；置于预热好的酶标仪中，连续测量OD600共30min，所有实验均独立重复三次。
3、内溶素活性定量：取20μL不同稀释浓度(具体浓度梯度根据候选内溶素活性进行调整)的候选蛋白加入到96孔板中，向蛋白中分别加入180μL外膜透化的细胞底物，25℃下孵育，以20μL 10mM PBS(pH 7.4)为空白对照；置于多功能酶标仪中，连续测量OD600共30min。所有实验均独立重复三次。
4、酶活计算根据Briers等人[13]的方法进行计算，不同浓度内溶素蛋白的饱和曲线见图3，最终计算得到的酶活单位为units/mg，实验表明，Lys009酶活是阳性对照(HEWL)的6.2倍，见表2所示。
表2本实施例中内溶素蛋白活性检测结果
实施例5内溶素蛋白工程改造
本实施例对Lys009内溶素进行工程改造实验。
KWK(KWKLFKKI)短肽来源于cecropin A(CepA)的前8个氨基酸[14]。据报道，KWK对的抗菌活性可以忽略不计[14]。KWK短肽由生工生物公司(中国宁波部)采用Fmoc固相法化学方法合成。
1、工程改造内溶素质粒构建：构建工程内溶素蛋白Lys009的表达质粒，表达载体为pET32a-KWK-AG Linker-Lys009-His-tag。通过PCR将KWK肽段与内溶素序列的N端进行融合(KWK-Lys009的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，使用两个含有肽段编码序列的引物，由上海生工公司合成，如表3所示的寡聚核苷酸引物。从实施例2中构建的质粒pET32a-Lys009-His-tag中扩增出两个靶蛋白的DNA片段1：AmpR和片段2：KWK-lac I，采用Gibson组装法进行组装。
2、表达和纯化：均参照实施例3中的镍柱纯化方法，天然内溶素与工程内溶素纯化情况见表4所示。参照实施例3，SDS-PAGE检测结果如图4所示。从图4可知，表明KWK-Lys009蛋白可以表达，条带大小与理论分子质量27.2kDa相符合(见表4)。
表3本实施例所用载体构建的引物信息
注：下划线加粗部分为KWK序列，下划线部分为AG Linker序列。
表4本实施例所用天然内溶素与工程内溶素纯化结果统计
实施例6工程改造内溶素的抑菌活性测试
本实施例选取了实施例5中工程改造的KWK-Lys009进行细菌抑制实验。本研究以铜绿假单胞菌PAO1作为测试菌株。
将铜绿假单胞菌PAO1菌株在无抗MHB平板上划线复苏，挑取单菌落在无抗MHB液体培养基中，37℃、220rpm震荡培养过夜(12-16h)。过夜菌液按1:50转接到新鲜无抗MHB液体培养基中，生长至对数期(OD600＝0.5-0.6)，4℃，4,000g，离心15min，弃掉培养基。用10mMPBS(pH 7.4)洗涤细胞1次，重悬至OD600为0.5左右，将试验菌悬液稀释至1×105CFU/mL。将100μL不同浓度内溶素加入到100μL试验菌悬液，总体积200μL，细菌对照为100μLPBS缓冲液和100μL试验菌悬液，空白对照为200μL PBS缓冲液，将混合物在37℃培养箱箱孵育1h。取100μL混合物均匀涂板，37℃培养过夜，记录菌落数量，所有实验均独立重复三次。
按照上述工程内溶素与对数期PAO1细胞混合孵育，通过涂布平板法对进行菌落计算，进一步表征内溶素的抗菌活性。如图5所示，工程内溶素抗菌活性高于改造前天然的内溶素，且随着浓度的增加而增强，Lys009系列，100μg/mL KWK-Lys009可清除99.8％的细菌，使细菌数量减少3个对数级，而天然Lys009在相同条件抗菌效果微弱。
实施例7：工程改造内溶素的酶学特征测定
1、浓度对内溶素的影响：收集对数期铜绿假单胞菌PAO1细胞(4℃，4,000g，15min)，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞1次，重悬至OD600为0.5左右，将试验菌悬液稀释至1×105CFU/mL；将100μL终浓度分别为1-128μg/mL的KWK-Lys009加入到100μL试验菌悬液中(总体积200μL)，37℃培养箱箱孵育1h。取100μL混合物均匀涂板，37℃培养过夜，记录菌落数量，所有实验均独立重复三次，IC50通过https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator进行计算，通过计算工程改造内溶素KWK-Lys009的IC50为4.0μg/mL，如图6A所示。
2、温度对内溶素的影响：收集对数期铜绿假单胞菌PAO1细胞(4℃，4,000g，15min)，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞1次，重悬至OD600为0.5左右，将试验菌悬液稀释至1×105CFU/mL；将100μL终浓度为100μg/mL的KWK-Lys009在不同温度(4-70℃)下孵育30min。随后加入到100μL试验菌悬液中(总体积200μL)，37℃培养箱箱孵育1h。测定每个处理组(4-70℃)对于对照组(37℃)的相对活性，所有处理均进行三个平行实验测定。不同温度对KWK-Lys009抗菌活性的影响的结果如图6B所示。从图6B可知，表明KWK-Lys009蛋白在4-60℃均可以保持80％以上的酶活。
3、pH对内溶素的影响：收集对数期铜绿假单胞菌PAO1细胞(4℃，4,000g，15min)，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞1次，重悬至OD600为0.5左右，将试验菌悬液稀释至1×105CFU/mL；将100μL终浓度为100μg/mL的KWK-Lys009加入到100μl不同pH值的试验菌悬液中(总体积200μL)，37℃孵育1h。测定每个处理组(pH 4-10)对于对照组(pH 7.4)的相对活性，所有实验均独立重复三次。不同pH对KWK-Lys009抗菌活性的影响的结果如图6C所示。从图6C可知，表明KWK-Lys009蛋白在碱性(pH大于7.4)的条件下可表现出80％以上的抑菌活性，而pH低于7.0时，抑菌效率表现下降。
实施例8：工程改造内溶素的裂解谱测定
本实施例所用到的测试菌株均来源于本实验室保存。共9株革兰氏阴性菌，3株革兰氏阳性菌，测试菌株表见表5所示。其中，2株铜绿假单胞菌(PALWL1.002和PALWL1.003)来源于本实验室分离培养，并在参考文献[15]中公开。
表5本实施例所使用的测试菌株
我们以实施例5中工程改造的高酶活KWK-Lys009内溶素为研究对象，对其结构域和三维结构进行初步的分析，KWK-Lys009和裂解谱测定(Lytic spectrum)，选择100μg/mL的KWK-Lys009与等体积的对数期不同菌株细胞混合孵育1h，通过计数处理后残余菌落数量来评估内溶素的抗菌活性。如图7所示，KWK-Lys009对大多数铜绿假单胞菌菌株(6/7)和两株革兰氏阴性菌(鲍曼不动杆菌ATCC 19606和伤鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028)显示出有效的裂解活性。
KWK-Lys009对其中两株多重耐药菌株(ATCC 10145和ATCC 19606)表现出较强的杀菌效果，其中，铜绿假单胞菌ATCC 10145分离于土壤，对氨苄西林、卡那霉素、青霉素和万古霉素具有耐药性[16]。鲍曼不动杆菌ATCC 19606分离于临床尿液样本，对氨苄西林、阿莫西林、头孢唑林、头孢西丁、硝基呋喃妥因、三甲双胍等具有耐药性[17]。通过https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator/计算IC50，KWK-Lys009对PAO1、ATCC 10145和ATCC 19606的IC50分别为4.0、9.3和14.1μg/mL，具有用于铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌耐药性感染的潜力。KWK-Lys009对革兰氏阳性菌(单增李斯特菌CICC 21634)显示出较高的抗菌活性。有望用于铜绿假单胞菌及胞曼不动杆菌、伤鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌耐药性感染的治疗。
实施例9：KWK-Lys009工程改造内溶素在蛋白质生产中的裂解应用
测试工程改造内溶素KWK-Lys009在工程菌株中的裂解效果，工程菌株选取大肠杆菌BL21，其中含有红色荧光蛋白的质粒pET30a-CpA-PT-RFP，其中目的蛋白为红色荧光蛋白(RFP)，该质粒为本实验室前期构建，由pET30-CpA-Mtu-RFP质粒为前体(专利号：WO2022253266A1)，构建质粒所需要的引物，通过oligo 6设计并由上海生工合成如表3所示的寡聚核苷酸引物，最终得到RFP表达质粒pET30a-CpA-PT-RFP，工程菌株简称BL21/pET30a-CpA-PT-RFP。选取了实施例5中工程改造的KWK-Lys009进行工程菌株的裂解实验。我们向实验组10OD600(5×108CFU)上述工程菌体中加入含400μg KWK-Lys009的Tris-HCl缓冲液(100mM Tris-HCl，150mM NaCl，1.0mM EDTA，pH＝8.0)，充分吹打混匀，对照组为不含KWK-Lys009的Tris-HCl缓冲液，将实验组重悬菌液在37℃，220rpm条件下孵育1h；15,000g，4℃离心5min，取上清(ES)和沉淀(EP)分别制样进行SDS-PAGE鉴定。结果如图8A所示，可以从离心后的菌体看出，添加KWK-Lys009孵育后菌体上清呈现较深的红色，沉淀变白色，表明菌体内的表达的RFP大部分被释放到上清。对照组在未添加KWK-Lys009的情况下，菌体几乎没有裂解现象。通过SDS-PAGE的结果图8B所示，根据RFP在上清中的定量结果，上清的蛋白量是沉淀中的3.8倍；因此，添加了我们工程改造内溶素KWK-Lys009可以提高工程菌的裂解效率。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009，其特征在于：
所述内溶素Lys009的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者是如SEQ ID NO：1通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列；
所述工程改造内溶素KWK-Lys009的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是如SEQ IDNO：2通过一个或多个氨基酸替换、插入、缺失而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示，或者与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相似度95％以上且仍具有相同或相似功能的序列。
2.权利要求1中所述的内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009相关的生物材料，其特征在于：
所述内溶素Lys009相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
(1)编码所述内溶素Lys009的核酸分子；
(2)含有(1)中所述核酸分子的表达盒；
(3)含有(1)中所述核酸分子的重组表达载体；
(4)含有(2)中所述表达盒的重组表达载体；
(5)含有(1)中所述核酸分子的重组微生物；
(6)含有(2)中所述表达盒的重组微生物；
(7)含有(3)或(4)所述重组表达载体的重组微生物；
所述工程改造内溶素KWK-Lys009相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：
(a)编码所述工程改造内溶素KWK-Lys009的核酸分子；
(b)含有(a)中所述核酸分子的表达盒；
(c)含有(a)中所述核酸分子的重组表达载体；
(d)含有(b)中所述表达盒的重组表达载体；
(e)含有(a)中所述核酸分子的重组微生物；
(f)含有(b)中所述表达盒的重组微生物；
(g)含有(c)或(d)所述重组表达载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：
(1)中所述的核酸分子为编码内溶素Lys009的基因序列，如SEQ ID NO：3所示，或者是如SEQ ID NO：3通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示；
(a)中所述核酸分子为编码工程改造内溶素KWK-Lys009的基因序列，如SEQ ID NO：4所示，或者是如SEQ ID NO：4通过碱基插入、缺失、或替换而获得的仍具有相同或相似功能的类似序列所示。
4.根据权利要求2或3所述的生物材料，其特征在于：
(3)、(4)、(c)、(d)中所述重组表达载体的出发载体为pET系列的载体；
(5)、(6)、(7)、(e)、(f)、(g)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物、酵母或高等真核细胞；所述原核生物包括埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)的细菌。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：
(3)、(4)、(c)、(d)中所述重组表达载体的出发载体为pET32a(+)载体；
(5)、(6)、(7)、(e)、(f)、(g)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自大肠杆菌(E.coli)。
6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：
(5)、(6)、(7)、(e)、(f)、(g)中所述重组微生物对应的宿主微生物选自大肠杆菌BL21(DE3)。
7.权利要求2～6任一项所述的生物材料在制备内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009中的应用。
8.一种内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：培养权利要求2～6任一项中所述的重组微生物，从重组微生物中得到内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009。
9.权利要求1所述的内溶素Lys009或工程改造内溶素KWK-Lys009、或者权利要求2～6任一项所述的生物材料的应用，其特征在于：为下述应用中的任意一种或多种组合：
①在制备抗革兰氏阴性菌的产品中的应用；
②在制备治疗革兰氏阴性菌感染的产品中的应用；
③在制备抗革兰氏阳性菌的产品中的应用；
④在制备治疗革兰氏阳性菌感染的产品中的应用；
⑤在裂解大肠杆菌工程菌生产重组蛋白中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：
①、②中所述的革兰氏阴性菌包括但不限于铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、伤鼠伤寒沙门氏菌和致病性大肠杆菌中的至少一种；
③、④中所述的革兰氏阳性菌包括但不限于单增李斯特菌。
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