CN105039494B - 一种初步判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法 - Google Patents

Abstract

一种初步判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法，包括以下步骤：(1)抗生素对菌株抑菌圈直径的分级，并统计21种抗生素对各菌株的抑菌圈直径在各级的数量；(2)抗生素敏感值的计算：抗生素敏感值＝1×I级范围的数量+2×II级范围的数量+…+N×N级范围的数量；(3)初步判断菌株在土壤中定殖能力：若待测菌株对21种指定抗生素敏感值小于85，即可判断菌株在土壤中具有定殖能力。本发明利用菌株对抗生素的敏感分级方法和敏感值计算方法，从而初步判断菌株在土壤中的定殖能力，并通过盆栽试验进一步验证了该方法具有可行性和可靠性。

Description

一种初步判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法

技术领域

本发明涉及一种判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法，具体涉及一种基于计算抗生素敏感值初步判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法。

背景技术

目前，化学肥料给环境带来的负面影响越来越受到人们重视，而生物类制品因为其环境友好性被认为是其最佳的替代品或补充品。因此，功能微生物在农业领域的研究越来越多，微生物肥料、微生物农药等的研究开发也成为了该领域的热点。在大量的研究工作中筛选获得的各类功能微生物，细菌类占有重要的比例。细菌类微生物不仅具有强大的功能，如促生、抗病、抗旱等，其生长速度快，培养条件要求低也是成为研究重点的原因。

定殖能力对功能微生物的应用潜力具有决定性作用，功能再强大的微生物如果不能在应用中具有良好的定殖能力，其在应用中的可行性就会降低。对于在营养丰富的培养条件下分离、筛选所得的功能微生物，判断它们在复杂的环境中的定殖能力是功能微生物从研发走向应用的必经之路。因此，选择一个简便、准确的方法判断其在应用环境中的生存能力显得尤为重要。

土壤是农业类功能微生物主要的定殖载体。目前，常规的检测微生物在土壤中的定殖能力的方法是采集土壤样品，通过分析其中微生物的数量来判断其定殖能力的大小。这个方法准确，但是操作却很繁 琐、所需时间长，不仅包括采集样品、分离计数和对应菌株的鉴定确认等必经程序，还包括微生物施入土壤的试验设计、场地选择、环境条件分析等其它的配套设施投入和相关数据的分析检测。因此，简便、准确的判断功能微生物的定殖能力的方法，不仅可以减少繁琐的操作程序和功能微生物的研究开支，更能反向指导在研究过程中筛选在应用时可能具有高环境适应潜力的菌株，缩短功能微生物从研发到应用的时间，对促进生物制品在农业的应用推广、推进生态环境良好健康发展具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种基于计算抗生素敏感值初步判断微生物在土壤中定殖能力的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种判断菌株在土壤中定殖能力的方法，包括以下步骤：

(1)根据指定21种抗生素药敏片对待测菌株的抑菌圈直径对其进行分级：直径为0的为I级，0＜D≤1为II级，1＜D≤2为III级，2＜D≤3为IV级，3＜D≤4为V级，4＜D≤5为VI级，…，并统计该菌株在各个级别的数量；

(2)根据统计结果，计算待测菌株对抗生素的敏感值，计算公式为：抗生素敏感值＝1×I级范围的数量+2×II级范围的数量+…+N×N级范围的数量；

(3)初步判断菌株在土壤中定殖能力：若待测菌株对21种指定抗生素敏感值小于85，即可判断待测菌株在土壤中具有定殖能力。

本发明通过抗生素对菌株的抑菌圈直径分级和敏感值计算方法，来判断菌株在土壤中的定殖能力，并通过盆栽试验验证了该方法测定和计算方法的可行性和可靠性。

本发明对应用于土壤的功能微生物的定殖潜力提出了新的评价方法，对农业领域生物肥料、生物农药等在应用时筛选高环境适应能力的菌株具有重要的指导意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

实施例1

1、抗生素药敏片在菌株平板上产生抑菌圈直径的分级

将供试1号～9号共计9株微生物菌株进行平板涂布，菌株中5、6、7号3株菌为放线菌，其余为细菌。将21种抗生素药敏片(如表1所示)放于平板上，通过测定抑菌圈直径的大小检测其抑制菌株生长的情况(如表2所示)，每种抗生素3个重复，以不接菌的空白培养基为对照。30℃培养24～48h后，抑菌圈直径计算其平均值。

表1-21种抗生素

编号	抗生素	编号	抗生素	编号	抗生素
						1	庆大霉素	2	妥布霉素	3	克拉霉素
4	米诺环素	5	利福平	6	氨苄青霉素
						7	卡那霉素	8	链霉素	9	阿奇霉素
10	罗红霉素	11	四环素	12	磷霉素
						13	麦迪霉素	14	多粘菌素B	15	新霉素
16	万古霉素	17	氯霉素	18	新生霉素
						19	青霉素G	20	强力霉素	21	红霉素

表2-9 菌株对抗生素敏感性测试结果

单位：cm

编号	1	2	3	4	5	6	7
								CK	0	0	0	0	0	0	0
1	1.55±0.08	1.40±0.07	0.65±0.05	0	0	0	2.20±0.10
								2	0.65±0.56	0	0	0	0	0	1.75±0.12
3	1.00±0.14	0.45±0.05	0	1.00±0.02	0	0	2.05±0.07
								4	0	0	0	1.70±0.07	0.95±0.06	0	0
5	2.75±0.24	2.80±0.10	3.95±0.09	2.85±0.09	2.20±0.15	1.60±0.13	3.40±0.19
								6	0	0	0	0	0	0	4.20±0.33
7	2.04±0.23	3.02±0.34	2.81±0.19	4.37±0.15	3.46±0.27	2.13±0.14	4.10±0.47
								8	0.63±0.38	4.01±0.43	3.21±0.42	4.13±0.25	3.52±0.31	2.78±0.36	2.49±0.21
9	1.29±0.11	4.12±0.01	2.19±0.41	3.01±0.30	2.66±0.87	0.78±0.21	3.13±0.34
								编号	8	9	10	11	12	13	14
CK	0	0	0	0	0	0	0
								1	2.10±0.18	0	0	0.55±0.05	0	0	0.95±0.14
2	1.95±0.41	0	0	0	0	0	1.25±0.15
								3	1.90±0.13	1.70±0.15	0	0.55±0.11	0.45±0.06	0	1.55±0.39
4	0	0	0.50±0.21	0	0	0	1.50±0.10
								5	0	2.75±0.28	3.90±0.12	1.85±0.18	2.00±0.02	2.40±0.15	1.65±0.08
6	0	1.30±0.10	2.30±0.16	1.80±0.13	0	2.00±0.03	1.30±0.15
								7	1.69±0.42	2.54±0.16	3.57±0.31	4.26±0.19	1.54±0.51	3.13±0.24	2.91±0.42
8	1.74±0.56	0.56±0.34	3.92±0.41	3.72±0.34	2.91±0.21	4.21±0.34	3.46±0.12
								9	0.39±0.10	2.96±0.06	1.38±0.24	2.36±0.20	4.01±0.31	1.93±0.13	3.16±0.31
编号	15	16	17	18	19	20	21
								CK	0	0	0	0	0	0	0
1	2.00±0.06	0	0	0	0	0	0
								2	2.05±0.09	0	2.20±0.36	0	0	0	0
3	2.15±0.36	0	2.70±0.07	0	0	0	0
								4	0	0	1.20±0.08	0	0	0	0
5	2.35±0.21	2.05±0.24	3.40±0.17	2.85±0.10	0	1.45±0.39	3.30±0.35
								6	3.50±0.13	3.00±0.47	2.00±0.04	3.40±0.19	2.50±0.17	2.20±0.32	1.50±0.17
7	3.60±0.14	3.52±0.42	4.12±0.43	1.20±0.73	3.40±0.13	0.89±0.14	1.32±0.62
								8	3.73±0.25	2.15±0.42	0.30±0.41	0.79±0.35	0	3.12±0.24	1.42±0.53
9	2.91±0.03	1.47±0.10	3.55±0.50	2.45±0.32	0.69±0.12	3.42±0.31	2.21±0.30

注：以上数据为3个重复的平均值±标准差

根据抑菌圈直径大小将其分级，抑菌圈为0的为I级，0＜D≤1 为II级，1＜D≤2为III级，2＜D≤3为IV级，3＜D≤4为V级，4＜D≤5为VI级…

统计各菌株在各级中的分布数量，结果如表3所示。

表3 各菌株抗分级统计结果

2、计算菌株对抗生素的敏感值

各菌株对抗生素的敏感值计算公式：抗生素敏感值＝1×I级范围的数量+2×II级范围的数量+…+N×N级范围的数量

根据公式计算出9株细菌的抗生素敏感值如表3所示，由于抗生素敏感性越高则认为该菌的适应性越低。表3中各菌株的敏感值排序为7＞8＞9＞5＞6＞3＞1＞2＞4，因此初步判断供试的9株菌的定殖能力排序大小为4＞2＞1＞3＞6＞5＞9＞8＞7。

3、根据指定21种抗生素敏感值初步判断菌株定殖能力的验证及判断菌株在土壤中具有定殖能力的敏感值的确定

3.1菌株定殖能力检测方法的研究确定

将待测菌株1号～9号菌进行阶梯式递增浓度驯化其抗300μg/mL利福平，以此标记菌株在土壤中的定殖能力，并以摇瓶发酵检 测其效果。

实验方法为：将1号～9号菌的驯化菌分别标记为1′号～9′号，并进行混合液体发酵。发酵组合共计CK、1R～9R号共计10个，接入的菌株分别包括1+2+3+4+5+6+7+8+9(CK为对照)，

1′+2+3+4+5+6+7+8+9(1R)，

1+2′+3+4+5+6+7+8+9(2R)，

1+2+3′+4+5+6+7+8+9(3R)，

1+2+3+4′+5+6+7+8+9(4R)，

1+2+3+4+5′+6+7+8+9(5R)，

1+2+3+4+5+6′+7+8+9(6R)，

1+2+3+4+5+6+7′+8+9(7R)，

1+2+3+4+5+6+7+8′+9(8R)，

1+2+3+4+5+6+7+8+9′(9R)，将10组发酵好的摇瓶菌液进行含300μg/mL利福平培养基划线分离确定驯化菌株在此条件下的生长能力。

实验结果表明：对照组合菌液CK在该平皿上无菌株生长，而1R～9R分别有纯菌落生长，根据其形态特征等方法进行对比，长出菌株分别为1′～9′号。从而证明9株驯化菌在众多菌同时存在的情况下，可以在含300μg/mL利福平培养基中单独分离出，具有排它性，可以将含300μg/mL利福平的培养基作为驯化菌株的计数培养基。

3.2盆栽测定菌株在土壤中的定殖能力

将供试土壤在121℃高压灭菌3小时，分别在各个盆中装10kg灭菌土，将分别进行液体发酵的浓度为×10⁸cfu/mL的1′号～9′号菌 液与灭菌土壤进行混合，以不接菌的培养液为对照，栽培烟草植株，每个菌液处理5个重复。

在烟草的整个生长期中，分别在种植后的第2天、25天、40天、65天采集各个处理中的土壤样品，利用含300μg/mL利福平培养基用稀释平板涂布法计数10个处理中的菌落含量。

由表4可知，采集的4次样品中，1′号、2′号、3′号、4′号、5′号、6′号随着时间推移其菌落数量都有所增加，而7′号、8′号的菌落则在第2次已经无检出，并且第1次检测结果菌落数量8′号＞7′号，9′号在第3次无菌落检出。由检测结果可知，在整个样品菌落分析所反应出的各菌株的定殖能力从大到小都表现出了以下排序：4＞2＞1＞3＞6＞5＞9＞8＞7，这和之前分析所得各菌株的敏感值大小所反映出的各菌株的定殖能力的排序一致。由此，充分验证了用抗生素对菌株的抑菌圈直径分级方法和敏感值计算方法判断菌株在土壤中的定殖能力具有可行性。

另外，从分析结果中可以得知，当菌株抗生素敏感值为83时(9′号)，其定殖能力较敏感值为78(5′号)的菌株下降很多，并且其定殖时间仅为接入土壤后的25天，而当菌株抗生素敏感值为85时(8′号)，菌株已无定殖能力。由此判断，当菌株抗生素敏感值小于85时，菌株在土壤中有一定的定殖能力，而当菌株抗生素敏感值大于85时，菌株在土壤中无的定殖能力。

表4 各菌株4次采集样品中在含300μg/mL利福平培养基的菌落数量

单位：个/g

Claims (1)

1.一种初步判断细菌类微生物在土壤中定殖能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)根据指定21种抗生素药敏片对待测菌株的抑菌圈直径对其进行分级：直径单位为cm，直径为0的为Ⅰ级，0＜D≤1为Ⅱ级，1＜D≤2为Ⅲ级，2＜D≤3为Ⅳ级，3＜D≤4为Ⅴ级，4＜D≤5为Ⅵ级，…，并统计该菌株在各个级别的数量；其中，所述21种抗生素药敏片为：庆大霉素、妥布霉素、克拉霉素、米诺环素、利福平、氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、阿奇霉素、罗红霉素、四环素、磷霉素、麦迪霉素、多粘菌素B、新霉素、万古霉素、氯霉素、新生霉素、青霉素G、强力霉素、红霉素；

(2)根据统计结果，计算待测菌株对抗生素的敏感值，计算公式为：抗生素敏感值＝1×Ⅰ级范围的数量+2×Ⅱ级范围的数量+…+N×N级范围的数量；

(3)判断菌株在土壤中定殖能力：若待测菌株对21种指定抗生素敏感值小于85，即可判断待测菌株在土壤中具有定殖能力。