CN105483104B - 牛胰蛋白酶的生产工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种牛胰蛋白酶的生产工艺，利用基因重组技术，通过在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，然后进行酸化处理将包涵体蛋白变、复性为折叠好的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，采用原核表达系统表达量高，变性、复性及后续纯化步骤简单易行，工艺成本低。制备的有活性的牛胰蛋白酶可用于重组人胰岛素及胰岛素类似物的生产。

Description

牛胰蛋白酶的生产工艺
技术领域
本发明涉及基因工程及蛋白纯化技术领域，具体地说，涉及一种牛胰蛋白酶的生产工艺。
背景技术
胰蛋白酶(胰蛋白酶EC3.4.21.4)是一种胰腺分泌的肽链内切酶，胰腺分泌出没有活性的胰蛋白酶原，然后在小肠中被肠激酶或胰蛋白酶活化成具有活性的胰蛋白酶，随后有活性的胰蛋白酶又能活化更多的胰蛋白酶原，牛源性胰蛋白酶含有223个氨基酸残基，分子量为23.3KDa.
胰蛋白酶能选择性的水解蛋白质中所有的赖氨酸Lys或精氨酸Arg的C末端，其不仅能起消化酶的作用，还能限制性分解糜蛋白酶原，羧肽酶原等其他酶的前体而起到活化酶原的作用。胰蛋白酶是特异性最强的蛋白酶，在鉴定和分析蛋白质氨基酸序列的排列中起着至关重要的作用。临床上胰蛋白酶被广泛的用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等。喷雾吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治疗毒蛇咬伤。还常用于动物细胞培养前对组织的处理。
在基因工程领域，胰蛋白酶也有着极其广泛的应用，特别在重组人胰岛素和胰岛素类似物生产过程中，胰蛋白酶是不可或缺的工具酶，其比活高低及酶稳定性是影响胰岛素原活化收率的重要参数之一，其中以牛源胰蛋白酶最为人们广泛研究。
目前制备胰蛋白酶的方法主要有两种：一种是直接从动物如猪，牛的胰脏中提取，该方法相对简单，但是该方法不能完全剔除其他动物源杂质蛋白，而且有可能使制备的胰蛋白酶中含有感染物质，例如病毒和脘病毒等；因此存在一定的局限性。另一种是通过基因重组的方式在大肠杆菌中制备人源或猪源胰蛋白酶。该方法主要是利用重组技术在大肠杆菌中表达出人源或猪源胰蛋白酶前体酶原的包涵体，经过体外复性纯化该酶原，再利用酶切除酶原的前肽部分从而获得有活性的胰蛋白酶。
目前仅报道了利用包涵体复性制备猪源及人源胰蛋白酶的方法，还没有利用包涵体复性制备牛源胰蛋白酶的方法。而且在实际应用中，在将胰蛋白酶对所需某些底物蛋白质进行酶切时，人源性和猪源性胰蛋白酶的效果不如牛源胰蛋白酶好，即用人源或猪源胰蛋白酶酶切某些重组融合蛋白时，效果不佳，收率较低。并且由于牛源胰蛋白酶等电点高属于阴离子蛋白酶，在酶切完之后，更容易去除，不容易有残留。开发一种可以简单制备牛源胰蛋白酶的方法尤为迫切。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的牛胰蛋白酶的生产工艺。
为了实现本发明目的，本发明的一种牛胰蛋白酶的生产工艺，利用基因重组技术在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，通过对包涵体蛋白胞外变性、酸化处理、复性、纯化操作，获得可激活的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，再通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，得到有活性的牛胰蛋白酶。
其中，所述胞外变性、酸化处理是指将包涵体蛋白溶解于pH值8-9.5的变性液中3-5小时，然后用酸调变性液的pH为2-5，然后离心取上清液。复性是指向上清液中加入含有环糊精或其衍生物的复性液，于低温条件下复性。
前述的生产工艺，所述变性液为50mM Tris+20mM DTT+8M尿素，或50mM Tris+20mMDTT+6M盐酸胍；所述复性液为50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+试剂G，pH7.5-9.5；其中，试剂G为5mM谷胱甘肽、1-5mM半胱氨酸、0-5mM胱氨酸中的至少一种。
前述的生产工艺，将1g包涵体蛋白溶于20mL变性液中，室温下搅拌3-5小时，然后用酸调变性液的pH至3.0，4℃9500rpm离心30min，上清液于-20℃保存。然后，按1:20-100的体积比向上清液中加入复性液进行稀释复性8-12小时。
前述的生产工艺，使用阳离子交换柱对复性后的溶液进行纯化；优选地，使用AKTAexplorer层析纯化系统，以GE SPbigbeads树脂为填料对复性后的溶液进行纯化，首先按1:100的体积比向复性后的溶液中加样缓冲液A进行稀释，然后4℃4000rpm离心30min，收集上清过柱，用缓冲液B按10倍柱体积进行洗脱(采用一步洗脱方式)，收集洗脱液。
其中，缓冲液A和缓冲液B选自如下组合：
缓冲液A：20mM醋酸钠，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+10％乙醇，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+30％乙醇，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+0.5％PEG1000，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％PEG1000，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+5％甘油，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+5％甘油，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5。
本发明中涉及的环糊精或其衍生物选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基环糊精、乙基环糊精、羟丙基环糊精、丁基环糊精、磺丁基环糊精、磺酸酯环糊精、氨基环糊精、环糊精磷酸酯、羟乙基环糊精、三甲基环糊精、乙酰基环糊精、羧酸酯环糊精、硝酸酯环糊精、硫酸酯环糊精、葡萄糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、半乳糖环糊精、琥珀酰环糊精等。
前述的生产工艺，调pH使用的酸为醋酸、硫酸、磷酸或盐酸等。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
(1)原核生产菌株的构建；(2)重组菌发酵；(3)菌体破碎：向1g菌体中加入20mL裂解液(50mM Tris+250mM NaCl，pH8.0)，采用超声破碎的方法进行菌体破碎，10mm探头，30％power，2秒开，6秒关，25分钟；(4)包涵体溶解变性:1g包涵体溶于20mL pH8.0-9.5变性液(50mM Tris+20mM-50mM DTT+9M尿素或7M盐酸胍)中，室温下搅拌3-5小时，用冰醋酸或5N盐酸调变性溶液pH至3.0，4℃9500rpm离心30min，-20℃保留上清；(5)复性：按1:50或1：100或1：20的体积比进行稀释复性，复性液配方：50mM Tris+1-2M尿素+0.5％-3％羟基β环糊精+0.1％-1.5％PEG1000+1-5mM半胱氨酸+0-5mM胱氨酸，pH7.5-9.5，4℃过夜复性；(6)层析纯化：使用AKTAexplorer层析纯化装置，以GE SPbigbeads树脂为填料，对复性溶液进行纯化。纯化步骤同上。
本发明还提供一种包涵体蛋白复性液，所述复性液中含有0.5％-5％的环糊精或其衍生物。
优选地，所述复性液的配方为：50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+5mM谷胱甘肽，或50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+1-5mM半胱氨酸，或50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+0-5mM胱氨酸，pH7.5-9.5。
本发明利用基因重组技术，通过在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，然后进行酸化处理将包涵体蛋白变、复性为折叠好的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，采用原核表达系统表达量高，变性、复性及后续纯化步骤简单易行，工艺成本低。制备的有活性的牛胰蛋白酶可用于重组人胰岛素及胰岛素类似物的生产。
附图说明
图1为本发明实施例1中目的片段bTrypsin的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M:Marker 1:样品。
图2为本发明实施例1中bTrypsin与pET21b连接后的重组质粒图谱。
图3为本发明实施例1中目的蛋白牛胰蛋白酶原的SDS-PAGE电泳检测结果。
图4-图8分别为本发明实施例1中步骤7-步骤11各自对应的目的蛋白牛胰蛋白酶原的纯化结果。
图9为本发明实施例1中制备的牛胰蛋白酶与商品化的胰蛋白酶的酶活测定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1牛胰蛋白酶的生产工艺
1、原核生产菌株的构建
bTrypsin(牛胰蛋白酶原)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。根据其氨基酸序列推导出牛胰蛋白酶原的核酸序列，并经密码子优化，使其适合于在基因工程菌中表达。核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
利用全基因合成的方法，合成基因。借助限制性内切酶NdeI和BamHl将bTrypsin克隆至商业化表达载体pET21b。实验流程如下：
采用PCR技术从克隆载体上扩增得到目的片段。
引物序列如下(5′-3′)：
bTrypsin21b-F:GGGAATTCCATATGATCGTTGGTGGTTACACCTG
bTrypsin21b-R:CGCGGATCCTTAGTTAGAAGCGATGGTCTGT
PCR反应体系(50μl)如下：10×Pfu反应缓冲液5μl，引物F、R(5μM)各5μl，dNTPs(2.5mM)4μl，模板1μl，Pfu DNA聚合酶1μl，无菌ddH2O补足至50μl。
PCR程序如下：94℃3min，94℃30s，56℃30s，72℃45s，共30个循环；4℃保存。
琼脂糖凝胶电泳检测后，用试剂盒进行胶回收。回收后的片段进行琼脂糖凝胶检测。检测结果见图1。
用限制性内切酶NdeI和BamHl对PCR片段和载体进行消化，回收，连接。连接后的产物转入DH5α，经鉴定含有插入片段的克隆送去测序。bTrypsin与pET21b连接后的重组质粒图谱见图2。
将测序正确的克隆转入表达宿主菌BL21(DE3)，进行表达。用含有Amp+的LB培养基培养菌体，当菌体OD值达到0.8时，加入终浓度为0.5mM IPTG，30℃诱导过夜。
采用SDS-PAGE电泳进行蛋白表达检测，电泳结果见图3。
2、菌体破碎
从-20℃冰箱中取牛胰酶菌体沉淀5g，向1g菌体中加入20mL裂解液(50mM Tris+250mM NaCl，pH8.0)，使用超声破碎法进行菌体破碎(10mm探头，30％power，2秒开，6秒关，破碎25min)，离心，4℃9500rpm 30min去上清。用含Triton X-100的Tris液(50mM Tris+500mM NaCl+1％Triton X-100，pH8.0)100mL洗包涵体，离心，4℃9500rpm 30min去上清。用Tris液(50mM Tris+250mM NaCl，pH8.0)100mL洗包涵体，离心，4℃9500rpm 30min去上清。用50mM Tris(pH8.0)100mL洗包涵体，离心，4℃9500rpm 30min去上清。-20℃冰箱中保存包涵体。
3、包涵体变性溶解
取-20℃冰箱中保存的牛胰酶包涵体1g，加入20mL 50mM Tris20mM DTT 9M UreapH9.0，室温下搅拌4小时，用冰醋酸调pH至3.0，离心，4℃9500rpm 30min保留上清，-20℃冰箱中保存。
4、包涵体变性溶解
从-20℃冰箱中取出保存的牛胰酶包涵体1g，加入50mM Tris+20mM DTT+9M Urea(pH9.0)20mL，室温下搅拌4小时，用5N盐酸调pH至3.0，离心，9500rpm 30min保留上清-20℃冰箱中保存。
5、包涵体变性溶解
从-20℃冰箱中取出保存的牛胰酶包涵体1g，加入50mM Tris+20mM DTT+7M盐酸胍(pH8.0)20mL，室温下搅拌4小时，4℃过夜，用5N盐酸调pH至3.0，离心，4℃9500rpm 30min保留上清。用3K透析袋，在pH3.0醋酸缓冲液中透析5小时，4℃9500rpm 30min去上清保留沉淀。将包涵体沉淀溶于50mL 8M Urea(pH3.0)中，室温下搅拌4小时，离心，4℃9500rpm30min保留上清，-20℃冰箱中保存。
6、复性
用稀释法进行复性，1mL包涵体变性液稀释至100mL复性液，复性液配方：50mMTris+1M Urea+1.5％环糊精+0.5％PEG100+5mM GSH，pH9.0，4℃过夜。
7、纯化
AKTAexplorer 5mL SPbigbeads预装柱，取复性后的溶液调pH至5.0，按1:100的体积比用缓冲液A(20mM NaAc，pH5.0)稀释至200mL，4℃离心4000rpm 30min。缓冲液B(20mMNaAc+500mM NaCl，pH5.0)，用缓冲液B洗脱目的蛋白，收集组份峰。洗脱结果见图4。
8、纯化
AKTAexplorer 5mL SPbigbeads预装柱，取复性后的溶液按1:100的体积比用缓冲液A(20mM NaAc+5％甘油，pH5.0)稀释至200mL，4℃离心4000rpm,30min。缓冲液B(20mMNaAc+500mM NaCl+5％甘油，pH5.0)，用缓冲液B洗脱目的蛋白，收集组份峰。洗脱结果见图5。
9、纯化
AKTAexplorer 5mL SPbigbeads预装柱，取复性后的溶液按1:100的体积比用缓冲液A(20mM NaAc+0.5％PEG1000，pH5.0)稀释至200mL，离心4000rpm,30min。缓冲液B(20mMNaAc+500mM NaCl+0.5％PEG1000，pH5.0)，用缓冲液B洗脱目的蛋白，收集组份峰。洗脱结果见图6。
10、纯化
AKTAexplorer 5mL SPbigbeads预装柱，取复性后的溶液按1:100的体积比用缓冲液A(20mM NaAc+1％吐温-20，pH5.0)稀释至200mL，4℃离心4000rpm,30min。缓冲液B(20mMNaAc+500mM NaCl+1％吐温-20，pH5.0)，用缓冲液B洗脱目的蛋白，收集组份峰。洗脱结果见图7。
11、纯化
AKTAexplorer 5mL SPbigbeads预装柱，取复性后的溶液按1:100的体积比用缓冲液A(20mM NaAc+10％乙醇，pH5.0)稀释至200mL，4℃离心4000rpm,30min。缓冲液B(20mMNaAc+500mM NaCl+30％乙醇，pH5.0)，用缓冲液B洗脱目的蛋白，收集组份峰。洗脱结果见图8。
12、酶切激活牛胰蛋白酶原
(1)酶切激活重组牛胰蛋白酶原
将以上7～11收集的重组牛胰蛋白酶原用G-25脱盐柱脱盐浓缩，溶于缓冲液C(50mM Tris+10mM CaCl2，pH 8.1)中，然后向其中加入终浓度为1μg/mL的重组牛肠激酶bEK，室温酶切过夜。
(2)重组牛胰蛋白酶的纯化
将酶切后的产物用5N盐酸调至pH5.0,用阳离子交换柱Source30S进行纯化，洗脱液中包含20mM NaAc+300mM NaCl，pH 5.0。
(3)重组牛胰蛋白酶的酶活性测定
a)酶的稀释：取上述制备的活化的重组牛胰蛋白酶100μl，加0.001N HCl 900μl,制成10倍稀释液E，取10倍稀释液E 100μl,加0.001N的HCl 900μl，制成100倍稀释液F。
b)将分光光度计的波长调为247nm,吸取已配好的pH8.1左右的空白对照缓冲液(0.046M Tris-HCl,0.001M TAME)，置于1mL的石英比色皿中。
c)数据读取及样品操作：取967μl上述空白对照液，加入33μl已稀释00倍的酶稀释液F混匀，立即放入UV-1100型紫外可见分光光度计中，每隔10秒计数，至10分钟为止，其线性增长区间须在3分钟以上。
d)活力单位的定义：25℃时，pH8.1反应体系为1mL每分钟酶解TAME使247nm下的紫外吸收OD值增加0.18定义为1个活力单位。
(4)酶活定量及对比
将纯化并激活的牛胰蛋白酶与等量的商品化的从牛胰腺提取的胰蛋白酶(SIGMA货号：T1426)按照上述方法进行酶活定量，两次重复，结果见表1和图9。
表1
样品 活性结果1(U/mg) 活性结果2(U/mg)
牛胰蛋白酶 162.51 163.73
胰蛋白酶(货号：T1426) 88.71 87.44
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure IDA0000900744620000011
Figure IDA0000900744620000021

Claims (2)

1.牛胰蛋白酶的生产工艺，其特征在于，利用基因重组技术在大肠杆菌中表达出牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白的包涵体蛋白，通过对包涵体蛋白胞外变性、酸化处理、复性、纯化操作，获得可激活的牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，再通过自激活、肠激酶或胰蛋白酶处理上述牛胰蛋白酶原或牛胰蛋白酶原融合蛋白，得到有活性的牛胰蛋白酶；
其中，所述胞外变性、酸化处理是指将1g包涵体蛋白溶于20mL pH值8-9.5的变性液中，室温下搅拌3-5小时，然后用酸调变性液的pH至3.0，4℃9500rpm离心30min，上清液于-20℃保存；
复性是指向上清液中加入含有环糊精或其衍生物的复性液，于低温条件下复性；
所述变性液为50mM Tris+20mM DTT+8M尿素，或50mM Tris+20mM DTT+6M盐酸胍；所述复性液为50mM Tris+0.5％-5％环糊精或其衍生物+0.1％-1.5％PEG1000+1-2M尿素+试剂G，pH7.5-9.5；
其中，试剂G为5mM谷胱甘肽、1-5mM半胱氨酸、0-5mM胱氨酸中的至少一种；
使用阳离子交换柱对复性后的溶液进行纯化；其中，使用AKTAexplorer层析纯化系统，以GE SPbigbeads树脂为填料对复性后的溶液进行纯化，首先按1:100的体积比向复性后的溶液中加样缓冲液A进行稀释，然后4℃4000rpm离心30min，收集上清过柱，用缓冲液B按10倍柱体积进行洗脱，收集洗脱液；
其中，缓冲液A和缓冲液B选自如下组合：
缓冲液A：20mM醋酸钠，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+10％乙醇，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+30％乙醇，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+0.5％PEG1000，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％PEG1000，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+5％甘油，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+5％甘油，pH4.5-6.5；
缓冲液A：20mM醋酸钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5；缓冲液B：20mM醋酸钠+500mM氯化钠+1％吐温-20，pH4.5-6.5；
所述环糊精或其衍生物选自α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、甲基环糊精、乙基环糊精、羟丙基环糊精、丁基环糊精、磺丁基环糊精、磺酸酯环糊精、氨基环糊精、环糊精磷酸酯、羟乙基环糊精、三甲基环糊精、乙酰基环糊精、羧酸酯环糊精、硝酸酯环糊精、硫酸酯环糊精、葡萄糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、半乳糖环糊精、琥珀酰环糊精；
按1:20-100的体积比向上清液中加入复性液进行稀释复性8-12小时。
2.根据权利要求1所述的生产工艺，其特征在于，调pH使用的酸为醋酸、硫酸、磷酸或盐酸。
CN201610005823.2A 2016-01-05 2016-01-05 牛胰蛋白酶的生产工艺 Active CN105483104B (zh)

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