PL208592B1 - Sposób wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18 - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18.

IL-18, znana również jako czynnik indukujący interferon-γ, jest odkrytą niedawno cytokiną. Aktywna IL-18 zawiera 157 reszt aminokwasowych. Ma ona silne aktywności biologiczne, łącznie z indukcją limfocytów T produkujących interferon-γ i splenocytów, wzmocnieniem aktywności zabijającej komórek NK oraz promowaniem różnicowania naiwnych limfocytów T CD4⁺ w komórki Th1. Dodatkowo, ludzka IL-18 zwiększa wytwarzanie GM-CSF i zmniejsza wytwarzanie IL-10. Wykazano, że IL-18 na większe zdolności do indukcji interferonu-γ niż IL-12 i sygnalizuje przez inny receptor oraz wykorzystuje odmienną ścieżkę transdukcji sygnału.

Znana jest sekwencja nukleotydowa kodująca IL-18 oraz pewne właściwości fizykochemiczne oczyszczonego białka (Ushio, S., i wsp., 1996, J. Immunology, 156, 4274-4279; Dinarello, C. A., i wsp. 1998, J. Leukocyte Biology, 1998.63,658-664).

Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujo (Hayashibara) w opisie patentowym USA nr 5192324, który odpowiada EP 0692536, opublikowanym 17 stycznia 1996, ujawnia mysie białko, które indukuje wytwarzanie IFN-gamma przez komórki immunokompetentne. Białko to dokładniej scharakteryzowano jako mające pewne właściwości fizykochemiczne i określoną częściową sekwencję aminokwasową. Ujawnione jest również białko mające 157-aminokwasową sekwencję, jego dwa fragmenty, DNA (471 bp) kodujący to białko, hybrydomy, sposoby oczyszczania białka i sposoby wykrywania białka.

Hayashibara w opisie patentowym USA nr 6214584, który odpowiada EP 0712931, opublikowanym 22 maja 1996, ujawnia 157- aminokwasowe ludzkie białko oraz jego homologi, DNA kodujący to białko, transformanty, proces wytwarzania białka, przeciwciała monoklonalne przeciw białku, hybrydomy, sposoby oczyszczania białka, sposoby wykrywania białka oraz sposoby leczenia i/lub zapobiegania nowotworom złośliwym, chorobom wirusowym, infekcyjnym chorobom bakteryjnym i chorobom immunologicznym.

W publikacji WO 97/24441, opublikowanej (Incyte Pharmaceuticals, Inc) 10 lipca,1997, ujawniono 193-aminokwasowe białko odpowiadające prekursorowi IL-18 oraz kodujący DNA.

W komórkach ludzkich, polipeptydy wytworzone przez, ekspresję genów mogą być obrabiane przez enzymy wewnątrzkomórkowe w celu częściowego strawienia i w celu otrzymania łańcuchów cukrowych. Polipeptydy, które mają być z powodzeniem włączane do środków farmaceutycznych, mogą być poddane podobnej obróbce jak w komórkach ludzkich. Wiadomo, że większość cytokin jest zwykle wytwarzana jako prekursory bez aktywności biologicznej, a następnie jest obrabiana przez enzymy wewnątrzkomórkowe w celu przekształcenia w aktywne polipeptydy.

Polipeptyd IL-18 zwykle występuje w komórkach ludzkich w formie 193-aminokwasowego prekursora bez aktywności biologicznej. Prekursor IL-18 jest również określany jako Pro-IL-18. Jeden sposób wytwarzania aktywnej formy IL-18 z jej prekursora jest przedstawiony przez Hayashibara w opisie patentowym USA nr 5879942, który odpowiada EP 0819757, opublikowanym 21 stycznia 1998. W opisie patentowymi ujawniono enzym lub białko, które przekształca prekursor IL-18 w aktywną IL-18.

Inny sposób wytwarzania aktywnej formy IL-18 z jej prekursora jest przedstawiony przez Hayashibara w opisie patentowym USA nr 5891663, który odpowiada EP 0821005, opublikowanym 28 stycznia 1998. W opisie patentowym, ujawniono kontaktowanie się prekursora IL-18 z enzymem przekształcającym interleukinę-1 β (ICE). Cytowane patenty i literaturę wprowadzono tu jako stan techniki.

Rolę ICE jako pośrednika apoptozy i zapalenia obszernie badano w literaturze. Wiadomo także, że ICE może obrabiać prekursory zarówno Interleukiny-1 jak i Interleukiny-18 do form aktywnych (Thornberry, NA, i wsp., 1992, Nature 356, 768-774; Ghayur, T i wsp., 1997, Nature 386,619-623). Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18, który obejmuje:

(i) subklonowanie kwasu nukleinowego ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18 do wektora pET28a, pod kontrolą promotora T7 obejmującego sekwencję Shine-Dalgarno do optymalnej inicjacji translacji z sekwencji kwasu nukleinowego polipeptydu prekursora IL-18;

(ii) subklonowanie genu kaspazy 4 połączonego ze znacznikiem his bezpośrednio po sekwencji kwasu nukleinowego polipeptydu prekursora IL-18 z włączoną defektywną przez mutację sekwenPL 208 592 B1 cją Shine-Dalgarno, w ten sposób pozwalając na minimalną inicjację translacji z sekwencji kwasu nukleinowego kaspazy 4 o sekwencji aminokwasowej kaspazy 4 przedstawionej na ID. SEKW. NR :4;

(iii) współwyrażanie ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18 z pojedynczego transkryptu z kaspazą 4 w plazmidzie ekspresyjnym pET28-Pro-IL-18/Casp4 w komórce bakteryjnej;

(iv) oczyszczenie aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na ID. SEKW. NR : 3.

KRÓTKI OPIS TOWARZYSZĄCYCH RYSUNKÓW.

Na fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasów ludzkiej prekursorowej IL-18 (ID. SEKW. NR: 1)

Na fig. 2 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego kodującego pełnej długości ludzką IL-18 (ID. SEKW. NR: 2).

Na fig. 3 przedstawiono sekwencję aminokwasów aktywnej ludzkiej IL-18 (ID. SEKW. NR: 3).

Na fig. 4 przedstawiono sekwencję aminokwasów obciętej na N-końcu kaspazy 4 ze znacznikiem 6-his (ID. SEKW. NR: 4).

Na fig. 5 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasów obciętej na N-końcu kaspazy 4 ze znacznikiem 6-his (ID. SEKW. NR: 5).

Na fig. 6 przedstawiono sekwencję aminokwasów obciętej na N-końcu kaspazy 5 ze znacznikiem 6-his (ID. SEKW. NR: 6).

Na fig. 7 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasów obciętej na N-końcu kaspazy 5 ze znacznikiem 6-his (ID. SEKW. NR: 7).

Figura 8 jest schematycznym diagramem bicistronowej kasety ekspresyjnej zawartej w obrębie pET28-ProIL-18/Casp 4 do współwyrażania Pro-IL-18 oraz obciętej kaspazy 4 w E. coli.

Na fig. 9 przedstawiono sekwencję kasety ekspresyjnej Pro-IL-18/Kaspaza 4 w obrębie pET28 (ID. SEKW. NR: 8).

Na fig. 10 przedstawiono z adnotacjami sekwencję kasety ekspresyjnej Pro-IL-18/Kaspaza 4. Numeracja odpowiada pozycji w obrębie wektora pET28a.

Na fig. 11 przedstawiono indukcję Pro-IL-18/Kaspaza 4.

Figura. 12 jest schematycznym diagramem bicistronowej kasety ekspresyjnej zawartej w obrębie pET28-ProIL-18/obcięta kaspaza 5 do współwyrażania Pro-IL-18 oraz kaspazy 5 w E. coli.

Na fig. 13 przedstawiono sekwencję kasety ekspresyjnej Pro-IL-18 /Kaspaza 5 w obrębie pET28 (ID. SEKW. NR: 9).

Na fig. 14 przedstawiono z adnotacjami diagram sekwencji kasety ekspresyjnej Pro-IL-18/obcięta kaspaza 5, wyszczególniając właściwości sekwencji regulatorowych i translacji Pro-IL-18 i obcię tej kaspazy 5. Numeracja odpowiada pozycji w obrębie wektora pET28a.

Na fig. 15 przedstawiono indukcję Pro-IL-18/Kaspaza 5.

Na fig. 16 przedstawiono sekwencję aminokwasów Ub-IL-18 (ID. SEKW. NR: 10).

Na fig. 17 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego kodującego sekwencję aminokwasową Ub-IL-18 (ID. SEKW. NR: 11).

Na fig. 18 przedstawiono sekwencję kwasu nukleinowego kasety ekspresyjnej Ub-IL-18/Ubp-1 w obrę bie wektora pET28 (ID. SEKW. NR: 12).

Na fig. 19 przedstawiono z adnotacjami sekwencję kasety ekspresyjnej Ub-IL-18/Ubp-1 w obrębie wektora pET28. Numeracja odpowiada pozycji w obrębie wektora pET28a.

Na fig. 20 przedstawiono ekspresje Ub-IL-18 oraz obróbkę przez Ubp-1.

Na fig. 21 przedstawiono test aktywności IL-18 z zastosowaniem komórek KG-1 (ludzka szpiczakowa linia komórkowa) w celu monitorowania wytwarzania IFN-γ (IL-18 wyrażana na różne sposoby, jak wskazano).

Na fig. 22 przedstawiono test aktywności IL-18 z zastosowaniem oczyszczonych ludzkich PBMC w celu monitorowania wytwarzania IFN-γ (IL-18 wyrażana na różne sposoby, jak wskazano).

Kaspazy 4 i 5 są przedstawicielami rodziny proteaz cysteinowych, która obejmuje enzym przekształcający interleukinę-1 β (ICE), który preferencyjnie tnie substraty zawierające motyw aktywujący proteazę składający się z sekwencji aminokwasowych XEYD, w której X jest wybrany z grupy aminokwasów obejmującej W, L, F, Y, I, V, D i E; E oznacza kwas glutaminowy, Y jest wybrany z grupy aminokwasów obejmującej H, I, A, T, S, P i E, a D oznacza kwas asparaginowy (Munday, N. A., i wsp., 1995, J. Biol. Chemistry, 270,15870-15876; Talanian, R. V. i wsp., 1997, J. Biol. Chemistry 272,9677-82;

Thornberry, N. A. i wsp. 1997 J. Biol. Chemistry 2 7 2,17907-11). Uważa się, że rozpoznawanie substratu przez kaspazę 5 jest w zasadzie takie samo dla ICE i kaspazy 4 oraz odmienne od innych przedstawicieli kaspaz (Talanian, R. V. i wsp., 1997, J. Biol. Chemistry 272, 9677-82; Thornberry, N. A.

PL 208 592 B1 i wsp. 1997 J. Biol. Chemistry 272, 17907-11). Kaspaza 4 jest ujawniona w EP-B-0 754 234. Kaspaza 5 jest ujawniona w opisach patentowych USA nr nr 5552536 i 5760180.

Proteazy specyficzne wobec ubikwityny są rodziną enzymów ATP-niezależnych, które mogą dokładanie ciąć konserwowany ewolucyjnie 76-aminokwasowy peptyd ubikwityny od N-końca białek, które są z nim połączone. Proteazy te specyficznie tną wiązanie peptydowe między resztą aminokwasową końca karboksylowego białka ubikwityny a grupą α-aminową dowolnego białka nie będącego ubikwityną, do którego przyłączona jest ubikwityna. Znane są proteazy specyficzne wobec ubikwityny z Saccharomyces cerevisiae, na przykład, Ubp-1, Ubp-2 i Ubp-3, które mogą być wyrażane w formie rekombinowanej i katalizują reakcje deubikwitynizacji, których celem są białka fuzyjne ubikwityny, zarówno in vivo jak i in vitro (Baker, RT i wsp., 1992, J. Biol. Chem. 267: 23364-23375; Baker, RT i wsp., 1994 J. Biol. Chem. 269: 2 5 3 81-25386). Specyficzność proteaz ubikwityno-specyficznych z Saccharomyces cerevisiae pozwala na precyzyjne usuwanie ubikwityny z dowolnego peptydu, z wyjątkiem peptydów, rozpoczynających się od proliny. Proteaza ubikwityno-specyficzna z innych gatunków taka, jak mysia Unp i jej ludzki homolog Unph, jest zdolna do wydajnego cięcia nawet przed proliną (Gilchrist CA i wsp. 1997, J. Biol. Chem. 272: 32280-32285). Zatem, rzeczywiście dowolny pożądany N-koniec może być wytwarzany przez usunięcie precyzyjnie dołączonego peptydu ubikwityny, po zmieszaniu in vitro lub współwyrażaniu z proteazami ubikwityno-specyficznymi. Proteazy specyficzne wobec ubikwityny są ujawnione w opisach patentowych USA nr nr 5212058; 5683904; 5391490 oraz 5494818.

W obecnym wynalazku może być stosowana dowolna naturalna i sztucznie wytworzona kaspaza 4 pod warunkiem, że wytwarzają aktywne polipeptydy, które indukują wytwarzanie IFN-γ w komórkach immunokompetentnych, niezależnie od ich struktur, źródeł i pochodzenia.

W komórkach ludzkich, polipeptydy uzyskane przez ekspresje genów mogą być obrabiane przez enzymy wewnątrzkomórkowe. Enzymy wewnątrzkomórkowe tną białka prekursorowe takie, jak ProIL-18, do ich form aktywnych. Polipeptydy, które mają być z powodzeniem wprowadzane do środków farmaceutycznych, powinny być poddane obróbce podobnej do obróbki polipeptydów w komórkach ludzkich. W komórkach ludzkich polipeptydy występują zwykle w formie prekursorów bez aktywności biologicznej. Wiadomo, że większość cytokin, w tym polipeptyd IL-18, jest zwykle wytwarzana jako prekursory bez aktywności biologicznej, a następnie obrabiana przez enzymy wewnątrzkomórkowe, w celu przekształcenia w aktywne polipeptydy.

Prekursor IL-18, jak określono w obecnym wynalazku, występuje, na przykład, w komórkach, które naturalnie wytwarzają polipeptyd w systemach bakteryjnych, takich jak E. coli transformowane przez wprowadzenie DNA np. DNA o sekwencji nukleotydowej ID. SEKW. NR: 2, zawierające region kodujący polipeptyd. Stosując takie bakteryjne komórki gospodarza, można uzyskać koekspresję prekursora IL-18 z proteazami w celu wytworzenia aktywnej IL-18.

Cięcie in vitro

Sposób aktywacji in vitro polipeptydu prekursora takiego, jak prekursor IL-18 enzymem aktywującym może obejmować kontaktowanie polipeptydu prekursora z enzymem aktywującym.

Korzystnie, sposób aktywacji in vitro prekursora ludzkiej IL-18 może obejmować kontaktowanie pekursorowej ludzkiej IL-18 z kaspaza 4.

Korzystnie prekursor IL-18 jest aktywowany in vitro przez ciecie enzymem aktywującym, który rozpoznaje motyw aktywujący specyficzną proteazę składający się z sekwencji aminokwasowej XEYD, gdzie X jest wybrany z grupy aminokwasów obejmującej W, L, F, Y, I, V, D i E, a Y jest wybrany z grupy aminokwasów obejmującej H, I, A, T, S, P i E.

Korzystnie prekursor IL-18 może być aktywowany in vitro przez cięcie wiązania peptydowego między kwasem asparaginowym 36 i tyrozyną 37 w ID. SEKW. NR: 1 kaspazą 4 w celu wytworzenia aktywnego polipeptydu, który indukuje wytwarzanie IFN-γ w komórkach immunokompetentnych.

Na ogół, kaspazę 4 można otrzymać z komórek, które naturalnie ją wytwarzają oraz z transformantów otrzymanych przy zastosowaniu technologii rekombinacji DNA. Przykładami takich komórek są komórki wyprowadzone ze ssaczych i ludzkich komórek, takich jak komórki nabłonkowe, komórki śródbłonkowe, komórki śródmiąższowe, komórki chrząstki, monocyty, granulocyty, limfocyty oraz wyprowadzone z nich linie. Przykłady transformantów obejmują transformowane mikroorganizmy i komórki zwierzęce otrzymane przez wprowadzenie DNA kodującego kaspazę 5 do mikroorganizmów i komórek zwierzęcych. Kaspaza 4 jest wytwarzana przez hodowanie tych transformantów na konwencjonalnych pożywkach do hodowli używanych w danej dziedzinie, traktowanie ultradźwiękami hodowli w postaci nienaruszonej albo po oddzieleniu od hodowli, lub moczenie transformantów w rozPL 208 592 B1 puszczalnikach hipotonicznych, poddawanie wytworzonych szczątków komórek lub mieszanin zawierających supernatanty hodowli i szczątki komórek następującym konwencjonalnymi technikom używanym do oczyszczania enzymów w danej dziedzinie: wysalaniu, dializie, filtrowaniu, zagęszczaniu, sedymentacji oddzielającej, chromatografii jonowymiennej, chromatografii żelowej, chromatografii adsorpcyjnej, chromatografii izoelektrycznej, chromatografii hydrofobowej, chromatografii z fazą odwróconą, chromatografii powinowactwa, elektroforezie w żelu i elektroogniskowaniu. Dwie lub więcej z tych metod można stosować w kombinacji. DNA kodujący kaspazę 4 (fig. 5) (ID. SEKW. NR: 5) i kaspazę 5 (fig. 7) (ID. SEKW. NR: 7) i transformanty wytwarzające kaspazę 4 i kaspazę 5 są znane w stanie techniki. Na przykład, enzymy mogą być wytwarzane w aktywnej formie w E. coli przez ekspresję obciętych na N-końcu peptydów, pozbawionych regionu pro, jak opisano w Munday NA i wsp., 1996, J. Biol. Chem 26: 15870-76.

Komórki wytwarzające polipeptyd prekursorowy, taki jak Pro-IL-18, naturalnie lub komórki transformowane w celu wytwarzania prekursora, są hodowane w pożywkach do hodowli. Korzystne pożywki do hodowli obejmują pożywki do hodowli dobrze znane w technice, takie jak pożywka Luria-Bertani lub inna bogata pożywka do hodowli E. coli, zawierająca trypton i ekstrakt drożdżowy.

Kaspaza 4 otrzymana przy zastosowaniu powyższego sposobu, może współwystępować w uzyskanych hodowlach lub może być dodawana do wytworzonych mieszanin lub szczątków komórek po rozerwaniu namnożonych komórek, oddzielonych lub nieoddzielonych od hodowli. Wymagana ilość kaspazy 4 jest mniejsza niż równomolowa względem prekursora. Kaspazę 4 kontaktuje się z prekursorem w temperaturach i przy wartościach pH pozwalających na działanie kaspazy 4 na prekursor, zwykle, kaspaza 4 może reagować z prekursorem do momentu powstania pożądanej ilości aktywnego polipeptydu z materiału prekursorowego w temperaturach około 4 - 40CC przy pH około 6-9. Korzystna temperatura wynosi około 25°C, a korzystne pH wynosi około 7,2. W ten sposób mogą być otrzymane mieszaniny reakcyjne zawierające aktywny polipeptyd.

Aktywność kaspazy 4 lub kaspazy 5 można testować i wyrażać w jednostkach aktywności według μg obrobionego polipeptydu wytworzonego na μg kaspazy 4 lub kaspazy 5 na minutę.

Współwyrażanie in vivo

Obecny wynalazek obejmuje aktywację in vivo polipeptydu prekursorowego, takiego jak prekursor IL-18, która polega na współwyrażaniu białka z aktywującą proteazą. Bardziej szczegółowo aktywacja in vivo IL-18, obejmuje bicistronowe współwyrażanie polipeptydów, takich jak IL-18 z proteazami, takimi jak kaspazą 4, znaną również jako ICERELII.

Obcięta ludzka kaspaza 4 (ID. SEKW. NR: 4) jest współwyrażana bicistronowo z ludzkim Pro-IL-18, aby umożliwić obróbkę in vivo Pro-IL-18 (ID. SEKW. NR: 1) do aktywnej IL-18 (ID. SEKW. NR: 3).

DNA kodujący kaspazę 4 jak i DNA kodujący prekursor polipeptydu są wprowadzane do odpowiedniej bakteryjnej komórki gospodarza w celu transformacji. W tym przypadku, kaspaza 4, powstała przez ekspresję DNA, działa na prekursor polipeptydu, wytworzony przez ekspresję DNA w tym samym transformancie, aby wytworzyć aktywny polipeptyd (fig. 11 i 15). Komórkami gospodarza są komórki E. coli. DNA kodujący kaspazę 4 i DNA kodujący prekursor polipeptydu wprowadza się do komórek gospodarza stosując wektor ekspresyjny pET28a zawierający odpowiedni promotor wzmacniacze, miejsca inicjacji replikacji, miejsca terminatorowe, sekwencje składania eksonów, sekwencje poliadenylacji i/lub marker selekcyjny. Można go stosować według standardowych procedur opisanych w Ausubel FM i wsp., 1994 Current Protocols in Molecular Biology, New York: Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience. Klony, które, jak wykazano stosując detekcję immunologiczną, wytwarzają aktywowany polipeptyd, selekcjonowano przez wybranie pożądanego klonu spośród transformantów po hodowli w pożywce odżywczej. Hodowle zawierające aktywny polipeptyd można otrzymać przez hodowanie sklonowanych transformantów w konwencjonalnej hodowli z pożywką stosowana w tej dziedzinie. W przypadku komórek naturalnie wytwarzających prekursor polipeptydu jak i innych komórek, które transformowano w celu wytworzenia polipeptydu, komórki mogą wytwarzać prekursor razem z enzymem aktywującym -kaspaza 4. Technologie rekombinowanego DNA wykorzystujące bakteryjne komórki gospodarza są opisane w Protein Expression: A Practical Approach, S. J. Higgins and B. D. Hames eds. 1999, New York, Oxford University Press.

Chociaż uzyskiwane mieszaniny reakcyjne i hodowle zawierające aktywny polipeptyd IL-18 mogą być stosowane w postaci nienaruszonej jako induktory IFN-γ, w korzystnym wykonaniu, komórki w hodowlach są rozrywane przez ultradźwięki, enzymy lizujące komórkę i/lub surfaktanty, następnie polipeptyd jest oddzielany od powstałych komórek i szczątków komórek przez filtrowanie, wirowanie itp., po czym poddawany jest standardowym procedurom przemysłowym, opisanym w Protein Puri6

PL 208 592 B1 fication: Principles and Practice, Cantor, C. R. ed. 1993, New York, Spinger-Verlag. Polipeptyd uwolniony z komórek i szczątków komórek może być oczyszczany przy zastosowaniu konwencjonalnych metod oczyszczania wykorzystywanych do oczyszczania substancji aktywnych biologicznie w danej dziedzinie, na przykład, wysalania, dializy, filtrowania, zagęszczania, sedymentacji oddzielającej, chromatografii jonowymiennej, chromatografii żelowej, chromatografii adsorpcyjnej, chromatografii izoelektrycznej, chromatografii hydrofobowej, chromatografii z fazą odwróconą, chromatografii powinowactwa, elektroforezy w żelu i elektroogniskowania. W razie konieczności, dwie lub więcej z tych metod oczyszczania można stosować w kombinacji. Wytworzony oczyszczony polipeptyd może być zatężony i liofilizowany do postaci ciekłego lub stałego produktu, aby spełniać warunki końcowych zastosowań.

Bicistronowe kasety ekspresyjne są uniwersalnymi wektorami, które mogą być stosowane w obróbce in vivo dowolnego rzeczywistego peptydu, zawierającego odpowiednie miejsca cięcia rozpoznawane przez kaspazę 4 jak opisano wcześniej (Tobias, J. W. i wsp., Journal of Biological Chemistry, 1991.266 (18): str. 12021- 12028; Talanian, R. V. i wsp., Journal of Biological Chemistry, 1997.272 (15): str. 9677-9682). Bicistronowa ekspresja zapewnia przewagę nad innymi strategiami współwyrażania, ponieważ oba geny są połączone w tę samą jednostkę transkrypcyjną, zapewniając zgodną ekspresję obu genów w czasie. Jest to przeciwieństwem systemów podwójnych plazmidów, gdzie jeden plazmid może być zgubiony w czasie lub systemów pojedynczego plazmidu z podwójnym promotorem, gdzie ekspresja każdego pojedynczego promotora może się różnić pomiędzy eksperymentami. W szczególności bicistronowy system ekspresji opisany tutaj jest idealnie dopasowany do aktywacji in vivo cytokiny IL-18, która może być aktywowana proteolitycznie, przez to umożliwia wytwarzanie białka z komórek na dużą skalę w pojedynczym etapie, eliminując potrzebę oddzielnego etapu aktywacji in vitro.

Aktywującą proteazę, kaspazę 4 (Ala105 do Asn377) subklonowano jako N-końcowe fuzje ze znacznikiem 6-His bezpośrednio po sekwencji Pro-IL-18 w celu wytworzenia fuzji transkrypcyjnej dwóch genów. Terminator T7 znajduje się poniżej sekwencji kaspazy 4, aby terminować transkrypcję bicistronowej jednostki transkrypcyjnej. Dodano również mały region międzygenowy, zawierający defektywną sekwencję Shine-Dalgarno, aby umożliwić tylko minimalną inicjację translacji sekwencji kaspazy 4 (fig. 10 i 14). Inne regiony regulatorowe zawierają 25 pz sekwencję operatora lac, umieszczoną bezpośrednio poniżej 17 pz regionu promotorowego, która jest związana z represorem, kodowanym przez kopię genu lac-I umieszczoną na plazmidzie, przez to tłumiąc podstawową transkrypcję przy braku polimerazy RNA T7. Następnie powstałe plazmidy, nazwane ProILl8/Casp4 i ProIL18/Casp5, transfekowano oddzielnie do szczepu E. coli BL21 (DE3), który zawiera indukowalną chromosomalną kopię genu polimerazy T7.

Transkrypcja bicistronowej kasety jest pod kontrolą promotora T7, który jest kontrolowany przez białko polimerazy RNA faga T7, kodowane z lizogenicznej kopii genu polimerazy RNA T7. Ta chromosomalna kopia pilomerazy T7 jest pod kontrolą promotora lacUV5 indukowanego przez dodanie izopropylo-1-tio-e-D- galaktopiranozydu. Indukcja prowadzi do skoordynowanej transkrypcji i translacji Pro-IL13 i His-kaspazy 4. Powstająca po translacji kaspaza 4 podlega samoobróbce do aktywnej formy, która inicjuje proteolityczną aktywację ProIL-18. Zarówno prekursor IL-18 po translacji jak i post-tranlacyjnie aktywowana IL-18 jest w większości rozpuszczalna w E. coli. Dojrzała aktywna IL-18, zawierająca N-końcową tyrozynę jest oczyszczana bezpośrednio z lizatów komórek bakteryjnych po indukcji na drodze konwencjonalnych metod chromatograficznych. Całkowite cięcie do dojrzałej IL-18 przez kaspazę 4 jest osiągane w 4 godziny w 37°C lub 18 godzin w 29°C (fig. 11), a całkowite cięcie do dojrzałej IL-18 przez kaspazę 5 jest osiągane w 18 godzin w 29°C (fig. 15).

W obecnym wynalazku wykorzystano obciętą kaspazę 4, jak pokazano na fig. 4 (ID. SEKW. NR: 4 i ID. SEKW. NR: 5) obcinanie kaspazy 4 i kaspazy 5 jest ujawnione w Munday, N. A., i wsp., 1995, J. Biol ; Chemistry, 270,15870-15876.

Można również uzyskać ludzką IL-18 stosując białko ubikwityny.

76-aminokwasowe białko ubikwityny, zawierające autentyczną N-końcową tyrozynę, jest połączone w fuzję z dojrzałym N-końcem ludzkiej IL-18 i współwyrażane z proteazą ubikwitynospecyficzną w E. coli, na przykład, tak jak pokazano ID. SEKW. NR: 10 i ID. SEKW. NR: 11. Ubikwityną jest wysoce konserwowanym 76-aminokwasowym białkiem komórek eukariotycznych, którego funkcją jest naznaczanie białek mających ulec degradacji (Baker, R. T., Current Opinion in Biotechnology, 1996.7 (5): p. 541-6). Ubikwityną jest specyficznie odcinana od białek przez proteazy ubikwitynospecyficzne, które są endogennie wyrażane w komórkach eukariotycznych, ale nieobecne u bakterii.

PL 208 592 B1

Współwyrażanie białek połączonych z ubikwityną z proteazą ubikwityno-specyficzną w E. coli również prowadzi do wydajnego usuwania ubikwityny (Baker, R. T. i wsp., Journal of Biological Chemistry, 1992.267 (32): p. 23364-75) (fig. 20). Dodatkowo, większość z tych enzymów deubikwitynujących jest zdolna do cięcia w zasadzie przed dowolnym aminokwasem z wyjątkiem proliny. Zatem, odcinanie ubikwityny od dojrzałej IL- 18 jest możliwe pomimo obecności dużej, aromatycznej reszty tyrozyny pozycj i P1'.

Współwyrażanie Ubikwityna-IL-18 (Ub-IL-18) i proteazy ubikwityno-specyficznej (Ubp-1) (Tobias, J. W. i wsp., Journal of Biological Chemistry, 1991.266 (18): p. 12021. 12028) jest dokonywane przez ekspresję bicistronową dwóch genów pod kontrolą indukowalnego promotora T7. Dojrzała IL-18 jest wyrażana jako N-końcowa fuzja z ewolucyjnie konserwowanym 76-aminokwasowym peptydem ubikwityny. cDNA Ub-IL-18 jest subklonowane pod kontrolą promotora polimerazy RNA T7 w obrębie wektora pET28a. Następnie cDNA kodujący pełnej długości proteazę ubikwityno-specyficzną jest subklonowany poniżej przed sekwencją terminatora T7 (fig. 19). Zarówno cDNA Ub-IL-18 jak i proteazy ubikwityno-specyficznej są transkrybowane do pojedynczego transkryptu mRNA, z którego białka Ub-IL-18 i proteaza ubikwityno-specyficzna są oddzielnie translowane.

Jak opisano powyżej, aktywny ludzki polipeptyd IL-18, wytwarzany niniejszymi sposobami ma aktywność indukującą wytwarzanie IFN-γ jako użytecznej substancji aktywnej biologicznie, stymulującą wytwarzanie IFN-γ z komórek KG-1 (ludzka szpiczakowa linia komórkowa) (fig. 21) i oczyszczonych ludzkich PBMC (fig. 22).

PRZYKŁAD 1 - Przygotowywanie prekursora IL-18 (pro-IL-18)

Ludzki prekursorowy IL-18 wyrażano w E. coli jako N-końcową fuzję ze znacznikiem heksahistydynowym. Plazmid ekspresyjny, ProEx-hIL18, był pochodną wektora pPROEX-l (Life Technologies), zawierającego promotor Trc i laclg do indukowalnej ekspresji z izopropylo-1-tio-e-D-galaktopiranozydem (IPTG). W celu skonstruowania rekombinowanego wektora ekspresyjnego, fragment DNA, zawierający cały gen prekursora kaspazy 5, namnożono w PCR z klonu cDNA, dodając na końcu 5' miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej Ndel i na 3' miejsce BamHI. Namnożony produkt subklonowano pomiędzy te dwa miejsca restrykcyjne do pPROEX^-, wytwarzając w ten sposób N-końcową fuzję w ramce odczytu obecnej w wektorze sekwencji kodującej heksa-histydynę.

Otrzymany plazmid wyrażano w komórkach gospodarza DH10B, a następnie indukowano z 1 mM IPTG przez 5 godzin w 37°C. Rekombinowane białko zbierano z osadów komórek, otrzymanych po wirowaniu indukowanych hodowli.

PRZYKŁAD 2 - Oczyszczanie pro-IL-18

1,5 kg komórek E. coli wyrażających pro-IL-18, jak opisano w przykładzie 1, zawieszono w 3,6 l Buforu C do lizy (50 mM Tris-HCl, 10 mM BME, 0,5 M NaCl, 5% glicerol, 1 μg/ml pepstatyna A, 1 μg/ml leupepsyna, 0,4 mM AEBSF), lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 82737109.04 Pa, wirowano przy 28000 x g i zebrano 3,7 l supernatantu. Do supernatantu dodawano 600 ml agarozy NiNTA wyrównanej Buforem C, zawierającym 5 mM imidazol (Bufor D) i zawiesinę inkubowano przez godzinę w celu wychwycenia pro-IL-18. Zawiesinę wirowano z małą szybkością (3000 obr./min.), supernatant dekantowano i zawiesinę nakładano na kolumnę. Kolumnę płukano Buforem D i wymywano pro-IL-18 300 mM imidazolem w Buforze C. Pulę dializowano w Buforze E (25 mM HEPES, 10 mM BME, pH 8,0) i nakładano na kolumnę DEAE ToyoPearl 650 M zrównoważoną tym samym buforem. Kolumnę eluowano w gradiencie liniowym od 0 do 0,5 M NaCl w Buforze E. Pula zawierała 650 mg pro-IL-18 o > 90% czystości.

PRZYKŁAD 3 - Przygotowywanie kaspazy 4

Ludzką kaspazę 4 wyrażano również jako N-końcową fuzję ze znacznikiem heksa-histydynowym w E. coli. Plazmid ekspresyjny, pET16b-kaspaza 4, pochodził z wektora pET16b (Novagen), zawierającego promotor faga T7. Rekombinowany wektor konstruowano przez amplifikację PCR aktywnej domeny kaspazy 4 (aminokwasy od Ile146 do Asn418) włączając sekwencję kodującą heksahistydynę na N-końcu i dodając na końcach miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych Ncol i XhoI. Powstały produkt PCR następnie subklonowano pomiędzy te dwa miejsca restrykcyjne w celu utworzenia wektora fuzyjnego N-końcowa heksa-histydyna-kaspaza 4.

Otrzymany plazmid transformowano do lizogenego szczepu E. coli BL21 DE3, zawierającego chromosomalną kopię polimerazy RNA T7 pod kontrolą promotora lacUV5, umożliwiającego indukowalną ekspresję kaspazy 4 po indukcji 1mM IPTG. Aktywne białko oczyszczano z osadów komórek izolowanych po indukcji w 37°C przez 3 godziny.

PL 208 592 B1

PRZYKŁAD 4 - Oczyszczanie kaspazy 4

Po lizie komórek E. coli wyrażających ludzką kaspazę z N-końcowym, znacznikiem heksa-His opisanych w przykładzie 2, aktywność kaspazy 4 można wykryć w supernatancie lizatu. Po wychwyceniu białka z supernatantu na perełkach agarozowych NiNTA, odzyskano zarówno p10 jak i p20. To wskazuje na to, że proteazowa domena kaspazy 4 jest aktywowana podczas hodowli komórkowej przez autocięcie na złączu p10 i p20 i pozostaje jako rozpuszczalny niekowalencyjny heterodimer. Dzięki tej informacji, możliwe jest oczyszczanie heterodimeru p20/p10 ze znacznikiem heksa-His. Cały proces przeprowadzano w 4°C, aby uniknąć dalszego rozpadu cząsteczki.

Około 400 g mokrego osadu komórek E. coli zawieszono w 1,6 1 buforu do lizy, zawierającego 25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 500 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptoetanol (BME) o pH 7,4 i 10% glicerol (Buffer A) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 82737109.04 Pa. Lizat wirowano przy 30000 x g przez godzinę i odzyskiwano supernatant lizatu, 1,7 1. Do supernatantu lizatu dodano agarozę NiNTA, którą zrównoważono buforem do lizy, zawierającym 5 mM imidazol, doprowadzono pH zawiesiny do wartości 8,0 2 N MaOH i kaspazę 4 adsorbowano w porcjach przez godzinę. Agarozę NiNTA nałożono na kolumnę, przemyto kolejno 5 mM i 25 mM imidazolem w Buforze A w celu usunięcia zanieczyszczenia, a kaspazę 5 eluowano 300 mM imidazolem w Buforze A. Białko dializowano wobec Buforu B (25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 10% glicerol, 10 mM BME, pH 8,0) i nałożono na kolumnę DEAE ToyoPearl 650 M, wyrównaną tym samym buforem.

Kaspazę 4 eluowano z kolumny 100 mM NaCl w tym samym buforze. Połączono frakcje wykazujące najwyższą aktywność kaspazy 4 w teście wykorzystującym fluorescencyjny substrat peptydowy LEED-AMC.

PRZYKŁAD 5 - Aktywacja in vitro i przygotowywanie polipeptydu

Pro-IL-18, oczyszczony tak jak opisano w przykładzie 2, inkubowano z kaspazą 4 w stosunku 1: 500 wag./wag. przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję cięcia prodomeny zakończono przy > 90% na podstawie analizy SDS-PAGE. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 140 ml agarozy NiNTA w Buforze D, inkubowano przez godzinę i przelano do wyprażonego szklanego lejka w celu odzyskania niezwiązanego materiału, zawierającego głównie dojrzałą IL-18. Małe ilości pozostającego pro-IL-18, prodomeny, kaspazy 4 i innych nieczystości związano z agarozą NiNTA. Niezwiązany roztwór doprowadzono do 25 mM DTT, inkubowano przez godzinę do zakończenia reakcji redukcji, doprowadzono pH zawiesiny do 6,0 przez dodanie 2 M kwasu fosforowego i zagęszczono do 86 ml stosując błonę YM10. Zagęszczoną próbkę nałożono na kolumnę Superdex 75 wyrównana 10 mM fosforanem sodu pH 6,0, zawierającym 0,1 M NaCl. Połączone frakcje zawierały 560 mg dojrzałej IL-18.

PRZYKŁAD 6 - Aktywacja in vivo i przygotowywanie polipeptydu

Aktywację IL-18 można również osiągać in vivo przez jednoczesną ekspresję ludzkiego prekursora IL-18 i kaspazy 4. Pro-IL-18 jest współwyrażany bicistronowo w E. coli z jednego transktyptu z ludzką kaspazą 4 w obrębie plazmidu ekspresyjnego, pET28-Pro-IL-18/Casp4 (fig. 5 i 6). Ludzki gen pro-IL-18 jest subklonowany do pET28a (Novagen) pod kontrolą promotora T7, zawierającego wydajną sekwencję Shine-Dalgarno dla optymalnej inicjacji translacji sekwencji Pro-IL-18 (fig. 8). Gen kaspazy 4 (Ile146 do Asn418) subklonowano bezpośrednio za sekwencją Pro-IL-18, włączając defektywną sekwencję Shine-Dalgarno, umożliwiającą minimalną inicjację translacji sekwencji kaspazy 4. Sekwencję terminatorową T7 włączono dla terminacji transkrypcji za bicistronową jednostką transkrypcyjną. Następnie powstały konstrukt transfekowano do gospodarza BL21 (DE3), zawierającego indukowalną chromosomalną kopię genu polimerazy T7. Indukcja tego konstruktu w tym gospodarzu 1 mM IPTG doprowadzała do skoordynowanej transkrypcji i translacji pro-IL-18 i prokaspazy 4. Powstała po translacji pro-kaspaza 4 jest samoobrabiana do postaci aktywnej, która inicjuje proteolityczną aktywację pro-IL-18. Na fig. 8 przedstawiono aktywację IL-18 w czasie przez 18 godzin w 29°C po indukcji 1 mM IPTG (0-18 godzin).

PRZYKŁAD 7 - Aktywacja kaspazy 4 in vivo

Aktywacja kaspazy 4 in vivo jest opisana w (Munday, N. A., i wsp., 1995, J. Biol. Chemistry, 270,15870-15876). Ekspresja obciętej formy kaspazy 4, zaczynającej się od Ala 59 i pozbawionej regionu pro w E. coli, prowadzi do samoaktywacji przez cięcie do podjednostek P10 i P20, które składają się w aktywny heterodimer enzymu. Opóźnienie w aktywacji kaspazy 4 przekłada się na opóźnienie w cięciu i aktywacji Pro-IL-18 do dojrzałej IL-18 (fig. 9). Pozwala to na gromadzenie się bardziej stabilnego Pro-IL-18 przed jej obcięciem do dojrzałej IL-18, która jest mniej stabilna w komórkach.

PL 208 592 B1

PRZYKŁAD 8 - Oczyszczanie ludzkiej IL-18 współwyrażanej z kaspaza 4 g komórek E. coli wyrażających IL-18, jak opisano w przykładzie 6, zawieszono w 130 ml 0,1 M HEPES pH 7,5, zawierającego 1 mM EDTA i 10 mM DTT (cały proces z wyjątkiem ostatniego etapu przeprowadzano w 4°C i w obecności 10 mM DTT celu zachowania wolnego SH) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 1034211386,3 PaLizat (230 ml) wirowano przy 34000 x g przez 30 min. Supernatant (200 ml) rozcieńczono 25 mM HEPES pH 7,0 do objętości 1 l i przepuszczono przez dwie kolumny połączone ToyoPearl SP 650M oraz ToyoPearl DEAE 650M. Większość zanieczyszczeń pochodzących z komórek E. coli związało się na kolumnach. Przepuszczony materiał doprowadzono do pH 9,5 25 mM bistris propanem, rozcieńczono do 2 l i nałożono na kolumnę Source 15Q wyrównaną 25 mM bis-Tris-propanem HCl pH 9,5. Kolumnę eluowano w liniowym gradiencie od 0 do 0,5 M NaCl w tym samym buforze. Frakcje zawierające IL-18 zidentyfikowano stosując Vydac C4 RP-HPLC i połączono (250 ml). Pulę zagęszczono do 50 ml stosując błonę YM10 i nałożono na kolumnę Superdex 75 wyrównaną 10 mM NaPO4 pH 6,0, zawierającym 1 mM EDTA i 0,15 M NaCl (bez DTT do stosowania in vivo).

PRZYKŁAD 9 - Przygotowywanie obciętej kaspazy 5

Ludzką obciętą kaspazę 5 również wyrażano jako N-końcową fuzję ze znacznikiem heksahistydynowym w E. coli. Plazmid ekspresyjny, pET16b-obcięta kaspaza 5, pochodził z wektora pET16b (Novagen), zawierającego promotor faga T7. Rekombinowany wektor skonstruowano przez amplifikację w PCR obciętej aktywnej domeny kaspazy 5 (aminokwasy od Ile146 do Asn418), włączając sekwencję kodującą heksa-histydynę na N-końcu i dodając na końcach miejsca dla endonukleaz restrykcyjnych Ncol i XhoI. Następnie powstały produkt PCR subklonowano pomiędzy te dwa miejsca restrykcyjne w celu utworzenia wektora fuzyjnego N-końcowa heksa-histydyna-obcięta kaspaza 5.

Otrzymany plazmid transformowano do lizogenego szczepu E. coli BL21DE3, zawierającego chromosomalną kopię polimerazy RNA T7 pod kontrolą promotora lacUV5, umożliwiającego indukowalną ekspresję obciętej kaspazy 5 po indukcji 1 mM IPTG. Aktywne białko oczyszczano z osadów komórek izolowanych po indukcji w 37°C przez 3 godziny.

PRZYKŁAD 10 - Oczyszczanie obciętej kaspazy 5

Po lizie komórek E. coli wyrażających ludzką kaspazę z N-końcowym znacznikiem heksa-His, opisanych w przykładzie 9, aktywność obciętej kaspazy 5 można wykryć w supernatancie lizatu. Po wychwyceniu białka z supernatantu na perełkach agarozowych NiNTA, odzyskano zarówno p10 jak i p20. To wskazuje na to, że proteazowa domena obciętej kaspazy 5 jest aktywowana podczas hodowli komórkowej poprzez autocięcie na złączu p10 i p20 i pozostaje jako rozpuszczalny niekowalencyjny heterodimer. Dzięki tej informacji, możliwe jest oczyszczanie heterodimeru p20/p10 ze znacznikiem heksa-His. Cały proces przeprowadzono w 4°C, aby uniknąć dalszego rozpadu cząsteczki.

Około 400 g mokrego osadu komórek E. coli zawieszono w 1,6 l buforu do lizy, zawierającego 25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 500 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptoetanol (BME) o pH 7,4 i 10% glicerol (Buffer A) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 82737109.04 Pa. Lizat wirowano przy 30000 x g przez godzinę i odzyskano supernatant lizatu, 1,7 l. Do supernatantu lizatu dodawano agarozę NiNTA, którą zrównoważono buforem do lizy, zawierającym 5 mM imidazol, doprowadzono pH zawiesiny do wartości 8,0 2 N NaOH i obciętą kaspazę 5 absorbowano w porcjach przez godzinę. Agarozę NiNTA nałożono na kolumnę, przemyto kolejno 5 mM i 25 mM imidazolem w Buforze A, aby usunąć zanieczyszczenia, a kaspazę 5 eluowano 300 mM imidazolem w Buforze A. Białko dializowano wobec Buforu B (25 mM HEPES, 0,1% CHAPS, 10% glicerol, 10 mM BME, pH 8,0) i nałożono na kolumnę DEAE ToyoPearl 650 M, zrównoważona tym samym buforem. Obciętą kaspazę 5 eluowano z kolumny 100 mM NaCl w tym samym buforze. Połączono frakcje wykazujące najwyższą specyficzną aktywność obciętej kaspazy 5 w teście wykorzystującym fluorescencyjny substrat peptydowy LEED-AMC.

PRZYKŁAD 11 - Aktywacja in vitro i wytwarzanie polipeptydu

Pro-IL-18 wytworzony tak jak opisano w przykładach 1 i 2 inkubowano z obciętą kaspazą 5 w stosunku 1:500 wag./wag. przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję cięcia prodomeny zakończono przy > 90% na podstawie analizy SDS-PAGE. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 140 ml agarozy NiNTA w Buforze D, inkubowano przez godzinę i przelano do wyprażonego szklanego lejka w celu odzyskania niezwiązanego materiału, zawierającego głównie dojrzałą IL-18. Małe ilości pozostającego pro-IL-18, prodomeny, obciętej kaspazy 5 i innych nieczystości związano z agarozą NiNTA. Niezwiązany roztwór doprowadzono do 25 mM DTT, inkubowano przez godzinę do zakończenia reakcji redukcji, doprowadzono pH roztworu do 6,0 przez dodanie 2 M kwasu fosforowego i zagęszczono

PL 208 592 B1 do 86 ml stosując błonę YM10. Zagęszczoną próbkę nałożono na kolumnę Superdex 75 zrównoważoną 10 mM fosforanem sodu pH 6,0 zawierającym 0,1 M NaCl. Połączone frakcje zawierały 560 mg dojrzałej IL-18.

PRZYKŁAD 12 - Aktywacja in vivo i wytwarzanie polipeptydu

Aktywację IL-18 można również osiągnąć in vivo przez jednoczesną ekspresję ludzkiego prekursora IL-18 i obciętej kaspazy 5. Pro-IL-18 współwyrażano bicistronowo w E. coli z jednego transkryptu z ludzką obciętą kaspazą 5 w obrębie plazmidu ekspresyjnego, pET28-ProIL18/Casp5 (fig. 9). Ludzki gen pro-IL-18 jest subklonowany do pET28a (Novagen) pod kontrolą promotora T7, zawierającego sekwencję Shine-Dalgarno dla inicjacji optymalnej translacji sekwencji Pro-IL-18 (fig. 10). Gen obciętej kaspazy 5 (Ile146 do Asn418) subklonowano bezpośrednio za sekwencją Pro-IL-18, włączając defektywną sekwencję Shine-Dalgarno, umożliwiającą minimalną inicjację translacji sekwencji obciętej kaspazy 5. Sekwencję terminatorową T7 włączono dla terminacji transkrypcji za bicistronową jednostą transkrypcyjną. Następnie wytworzony konstrukt transfekowano do gospodarza BL21 (DE3), zawierającego indukowalną chromosomalną kopię genu polimerazy T7. Indukcja tego konstruktu w tym gospodarzu 1 mM IPTG doprowadziła do skoordynowanej transkrypcji i translacji pro-IL-18 i prokaspazy 5. Uzyskana po translacji pro-kaspaza 5 podlegała samoobróbce do postaci aktywnej, która inicjuje proteolityczną aktywację pro-IL-18.

PRZYKŁAD 13 - Oczyszczanie ludzkiej IL-18 współwyrażanej z obciętą kaspazą 5 g komórek E. coli wyrażających IL-18, jak opisano w przykładzie 12, zawieszono w 130 ml 0,1 M HEPES pH 7,5, zawierającego 1 mM EDTA i 10 mM DTT (cały proces z wyjątkiem ostatniego etapu przeprowadzano w 4°C i w obecności 10 mM DTT w celu zachowania wolnego SH) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 103421386,3 Pa. Lizat (230 ml) odwirowano przy 34000 x g przez 30 min. Supernatant (200 ml) rozcieńczono 25 mM HEPES pH 7,0 do objętości 1 l i przepuszczono przez dwie połączone kolumny ToyoPearl SP 650M oraz ToyoPearl DEAE 650M. Większość zanieczyszczeń pochodzących z komórek E. coli związało się z kolumną. Przepuszczony materiał doprowadzono do pH 9,5 25 mM bis-Tris-propanem, rozcieńczono do 2 l i nałożono na kolumnę Source 15Q zrównoważoną 25 mM bis-Tris-propanem HCl pH 9,5. Kolumnę eluowano w liniowym gradiencie od 0 do 0,5 M NaCl w tym samym buforze. Frakcje zawierające IL-18 zidentyfikowano stosując Vydac C4 RP-HPLC i połączono (250 ml). Pulę zagęszczono do 50 ml stosując błonę YM10 i nałożono na kolumnę Superdex 75 wyrównaną 10 mM NaPO4 pH 6,0, zawierającym 1 mM EDTA i 0,15 M NaCl (bez DTT do zastosowania in vivo).

PRZYKŁAD 14 - Przygotowanie Ubikwityna/Pro-IL-18/Ubpl

Sekwencję kodującą 76 aminokwasów ubikwityny połączono w ramce z początkiem dojrzałej ludzkiej IL-18 przez ligację tępych końców w taki sposób, że pierwszy kodon tyrozynowy dojrzałej IL-18 następował bezpośrednio po 76 kodonie glicynowym ubikwityny. Następnie fuzję genową subklonowano do wektora pET pod kontrolą promotora T7, zawierającego sekwencję Shine-Dalgarno dla optymalnej inicjacji translacji sekwencji genu ubikwityna-IL-18. Następnie pełnej długości gen Ubp-1 subklonowano bezpośrednio za IL-18, włączając uszkodzoną sekwencję Shine-Dalgarno dla minimalnej inicjacji translacji Ubp-1. Na fig. 11 przedstawiono sekwencję kasety ekspresyjnej UbIL-18/Ubp-1 w obrębie pET28. Na fig. 13 przedstawiono opisaną sekwencję UbIL-18/Ubp-1 w obrębie pET28. Numeracja odpowiada pozycji w obrębie wektora pET28a.

PRZYKŁAD 15 - Aktywacja in vivo i przygotowywanie IL-18

Konstrukt z przykładu 14 stransfekowano do gospodarza BL21(DE3). Indukcja tego konstruktu w tym gospodarzu z ImM IPTG doprowadziła do skoordynowanej transkrypcji i translacji Ubikwityna-IL-18 i Ubp-1. Enzymatyczne działanie Ubp-1 doprowadziło do wydajnej obróbki Ub-IL-18 do dojrzałej aktywnej IL-18, która następnie może być bezpośrednio oczyszczana z lizatów E. coli konwencjonalnymi metodami.

Na fig. 16 przedstawiono ekspresję IL-18 w czasie i obróbkę w 30°C i 37°C po indukcji 1 mM IPTG. Górna strzałka wskazuje nieobrobioną porcję UB-IL-18 w ścieżce 1. Dolna strzałka wskazuje obrobioną porcję IL-18 w ścieżce 1. (Detekcje w Western blot przy zastosowaniu surowic anty-IL-18)

PRZYKŁAD 16 - Oczyszczanie ludzkiej IL-18 współwyrażanej z ubikwityną g komórek E. coli wyrażających IL-18, jak opisano w przykładzie 15, zawieszono w 130 ml 0,1 M HEPES pH 7,5, zawierającego 1 mM EDTA i 10 mM DTT (cały proces z wyjątkiem ostatniego etapu przeprowadzono w 4°C i w obecności 10 mM DTT w celu zachowania wolnego SH) i lizowano przez dwukrotne przepuszczenie przez Microfluidics przy 103421386,3 PA. Lizat (230 ml) odwirowano przy 34000 x g przez 30 min. Supernatant (200 ml) rozcieńczono do 1 l stosując 25 mM HEPES pH 7,0

PL 208 592 B1 i przepuszczono przez 2 połączone kolumny ToyoPearl SP 650M oraz ToyoPearl DEAE 650M. Wię kszość zanieczyszczeń pochodzących z komórek E. coli związało się w kolumnach. Przepuszczony materiał doprowadzono do pH 9,5 25 mM bis-Tris-propanem, rozcieńczono do 2 l i nałożono na kolumnę Source 15Q wyrównaną 25 mM bis-Tris-propanem HCl pH 9,5. Kolumnę wyeluowano liniowym gradientem od 0 do 0,5 M NaCl w tym samym buforze. Frakcje zawierające IL-18 zidentyfikowano stosując Vydac C4 RP-HPLC i łączono (250 ml). Pulę zagęszczono do 50 ml stosując błonę YM10 i nałoż ono na kolumnę Superdex 75 wyrównaną 10 mM NaPO4 pH 6,0, zawierającym 1 mM EDTA i 0,15 M NaCI (bez DTT do zastosowania in vivo).

LISTA SEKWENCJI <110> SMITHKLINE BEECHAM CORPORATION <12O> Sposób wytwarzania aktywnego polipeptydu z polipeptydu prekursora, sposób wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z polipeptydu prekursora oraz sposób wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18 <13O> P51137 <14O> wyznaczony <141> w załączeniu <150> 60/211,832 <151> 2000-06-15 <150> 60/224,128 <151> 2000-08-10 <150> 60/264,923 <151> 2001-01-30 <160> 12 <17O> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapienS <400> 1

Met

Ala

Ala

Glu

Pro

Val

Glu

Asp

Asn

Cys

Ile

Asn

Phe

Val

Ala

Met

1

5

1.0

15

Lys

Phe

Ile

Asp

Asn

Thr

Leu

Tyr

Phe

Ile

Ala

Glu

Asp

Asp

Glu

Asn

20

25

30

Leu

Glu

Ser

Asp

Tyr

Phe

Gly

Lys

Leu

Glu

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Ile

35

40

45

Arg

Asn

Leu

Asn

Asp

Gin

Val

Leu

Phe

Ile

Asp

Gin

Gly

Asn

Arg

Pro

50

55

60

Leu

Phe

Glu

Asp

Met

Thr

Asp Ser

Asp

Cys

Arg

Asp

Asn

Ala

Pro

Arg

65

70

75

80

PL 208 592 B1

Thr Ile

Phe Ile

Ile Ser 85

Met Tyr Lys Asp Ser Gin Pro Arg Gly

Met

90

95

Ala

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Lys

Cys

Glu

Lys

Ile

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

100

105

110

Glu

Asn

Lys

Ile

Ile

Ser

Phe

Lys

Glu

Met

Asn

Pro

Pro

Asp

Asn

Ile

115

120

125

Lys

Asp

Thr

Lys

Ser

Asp

Ile

Ile

Phe

Phe

Gin

Arg

Ser

Val

Pro

Gly

130

135

140

His

Asp

Asn

Lys

Met

Gin

Phe

Glu

Ser

Ser

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Phe

145

150

155

160

Leu

Ala

Cys

Glu

Lys

Glu

Arg

Asp

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Leu

Lys

Lys

165

170

175

Glu

Asp

Glu

Leu

Gly

Asp

Arg

Ser

Ile

Met

Phe

Thr

Val

Gin

Asn

Glu

180

185

190

Asp <210> 2 <211> 582 <212> DNA <213> Homo sapienS <400> 2 atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60 aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120 cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180 gggaatcgtc caćtąttcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240 accattttca ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300 tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360 gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420 agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480 cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540 ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag 582 <210> 3 <211> 157 <212> PRT <213> Homo sapienjr <400> 3

Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn 15 10 15

Asp Gin Val Leu Phe Ile Asp Gin Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp

PL 208 592 B1

	20	25	30
Met	Thr Asp Ser Asp 35	Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr 40 45	Ile Phe Ile
Ile	Ser Met Tyr Lys 50	Asp Ser Gin Pro Arg Gly Met Ala 55 60	Val Thr Ile
Ser 65	Val Lys Cys Glu	Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu 70 75	Asn Lys Ile 80
Ile	Ser Phe Lys Glu 85	Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys 90	Asp Thr Lys 95
Ser	Asp Ile Ile Phe 100	Phe Gin Arg Ser Val Pro Gly His 105	Asp Asn Lys 110
Met	Gin Phe Glu Ser 115	Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu 120 125	Ala Cys Glu
Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu 130 135 140 Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 145 150 155 <210> 4 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4	Asp Glu Leu
Met 1	Gly His His His 5	His His His Gly Ala Leu Lys Leu 10	Cys Pro His 15
Glu	Glu Phe Leu Arg 20	Leu Cys Lys Glu Arg Ala Glu Glu 25	Ile Tyr Pro 30
Ile	Lys Glu Arg Asn 35	Asn Arg Thr Arg Leu Ala Leu Ile 40 45	Ile Cys Asn
Thr	Glu Phe Asp His 50	Leu Pro Pro Arg Asn Gly Ala Asp 55 60	Phe Asp Ile
Thr 65	Gly Met Lys Glu	Leu Leu Glu Gly Leu Asp Tyr Ser 70 75	Val Asp Val 80
Glu	Glu Asn Leu Thr 85	Ala Arg Asp Met Glu Ser Ala Leu 90	Arg Ala Phe 95
Ala	Thr Arg Pro Glu 100	His Lys Ser Ser Asp Ser Thr Phe 105	Leu Val Leu 110
Met	Ser His Gly Ile 115	Leu Glu Gly Ile Cys Gly Thr Val 120 125	His Asp Glu
Lys	Lys Pro Asp Val 130	Leu Leu Tyr Asp Thr Ile Phe Gin 135 140	Ile Phe Asn
Asn	Arg Asn Cys Leu	Ser Leu Lys Asp Lys Pro Lys Val	Ile Ile Val

PL 208 592 B1

145 ISO 155 ISO

Gin Ala

Cys

Arg

Gly Ala Asn Arg Gly Glu Leu Trp Val Arg Asp

Ser

165

170

175

Pro

Thr

Ser

Leu

Glu

Val

Ala

Ser

Ser

Gin

Ser

Ser

Glu

Asn

Leu

Glu

180

185

190

Glu

Asp

Ala

Val

Tyr

Lys

Thr

His

Val

Glu

Lys

Asp

Phe

Ile

Ala

Phe

195

200

205

Cys

Ser

Ser

Thr

Pro

His

Asn

Val

Ser

Trp

Arg

Asp

Ser

Thr

Met

Gly

210

215

220

Ser

Ile

Phe

Ile

Thr

Gin

Leu

Ile

Thr

Cys

Phe

Gin

Lys

Tyr

Ser

Trp

225

230

235

240

Cys

Cys

His

Leu

Glu

Glu

Val

Phe

Arg

Lys

Val

Gin

Gin

Ser

Phe

Glu

245

250

255

Thr

Pro

Arg

Ala

Lys

Ala

Gin

Met

Pro

Thr

Ile

Glu

Arg

Leu

Ser

Met

260

265

270

Thr

Arg

Tyr

Phe

Tyr

Leu

Phe

Pro

Gly

Asn

275

280

<21O> 5 <211> 849 <212> DNA <213> Homo sapien5 <400> 5

atgggccatc	atcatcatca	tcatggcgcc	ctcaagcttt	gtcctcatga	agaattcctg	60
agactatgta	aagaaagagc	tgaagagatc	tatccaataa	aggagagaaa	caaccgcaca	120
cgcctggctc	tcatcatatg	caatacagag	tttgaccatc	tgcctccgag	gaatggagct	180
gactttgaca	tcacagggat	gaaggagcta	cttgagggtc	tggactatag	tgtagatgta	240
gaagagaatc	tgacagccag	ggatatggag	tcagcgctga	gggcatttgc	taccagacca	300
gagcacaagt	cctctgacag	cacattcttg	gtactcatgt	ctcatggcat	cctggaggga	360
atctgcggaa	ctgtgcatga	tgagaaaaaa	ccagatgtgc	tgctttatga	caccatcttc	420
cagatattca	acaaccgcaa	ctgoctcagt	ctgaaggaca	aacccaaggt	catcattgtc	480
caggcctgca	gaggtgcaaa	ccgtggggaa	ctgtgggtca	gagactctcc	agcatccttg	540
gaagtggcct	cttcacagtc	atctgagaac	ctggaggaag	atgctgttta	caagacccac	600
gtggagaagg	acttcattgc	tttctgctct	tcaacgccac	acaacgtgtc	ctggagagac	660
agcacaatgg	gctctatctt	catcacacaa	ctcatcacat	gcttccagaa	atattcttgg	720
tgctgccacc	tagaggaagt	atttcggaag	gtacagcaat	catttgaaac	tccaagggcc	780
aaagctcaaa	tgcccaccat	agaacgactg	tccatgacaa	gatatttcta	cctctttcct	840
ggcaattga						849

<210> 6 <211> 282 <212> PRT

PL 208 592 B1 <213> Homo sapienS <400> 6

Met Gly His His His His	His His	Gly Ile Leu Lys	Leu	Cys	Pro	Arg
1 5		10			15
Glu Glu Phe Leu Arg Leu	Cys Lys	Lys Asn His Asp	Glu	Ile	Tyr	Pro
20		25		30
Ile Lys Lys Arg Glu Asp	Arg Arg	Arg Leu Ala Leu	Ile	Ile	Cys	Asn
35	40		4 5
Thr Lys Phe Asp His Leu	Pro Ala	Arg Asn Gly Ala	His	Tyr	Asp	Ile
50	55	60
Val Gly Met Lys Arg Leu	Leu Gin	Gly Leu Gly Tyr	Thr	Val	Val	Asp
65 70		75				80
Glu Lys Asn Leu Thr Ala	Arg Asp	Met Glu Ser Val	Leu	Arg	Ala	Phe
85		90			95
Ala Ala Arg Pro Glu His	Lys Ser	Ser Asp Ser Thr	Phe	Leu	Val	Leu
100		105		110
Met Ser His Gly Ile Leu	Glu Gly	Ile Cys Gly Thr	Ala	His	Lys	Lys
115	120		125
Lys Lys Pro Asp Val Leu	Leu Tyr	Asp Thr Ile Phe	Gin	Ile	Phe	Asn
130	135	140
Asn Arg Asn Cys Leu Ser	Leu Lys	Asp Lys Pro Lys	Val	Ile	Ile	Val
145 150		155				160
Gin Ala Cys Arg Gly Glu	Lys His	Gly Glu Leu Trp	Val	Arg	Asp	Ser
165		170			175
Pro Ala Ser Leu Ala Val	Ile Ser	Ser Gin Ser Ser	Glu	Asn	Leu	Glu
180		185		190
Ala Asp Ser Val Cys Lys	Ile His	Glu Glu Lys Asp	Phe	Ile	Ala	Phe
195	200		205
Cys Ser Ser Thr Pro His	Asn Val	Ser Trp Arg Asp	Arg	Thr	Arg	Gly
210	215	220
Ser Ile Phe Ile Thr Glu	Leu Ile	Thr Cys Phe Gin	Lys	Tyr	Ser	Cys
225 230		235				240
Cys Cys His Leu Met Glu	Ile Phe	Arg Lys Val Gin	Lys	Ser	Phe	Glu
245		250			255
Val Pro Gin Ala Lys Ala	Gin Met	Pro Thr Ile Glu	Arg	Ala	Thr	Leu
260		265		270
Thr Arg Asp Phe Tyr Leu	Phe Pro	Gly Asn
275	280
<210> 7
<211> 849
<212> DNA

PL 208 592 B1 <213> Homo sapiens <400> Ί

atgggccatc atcatcatca tcatggcata ctcaaacttt gtcctcgtga agaattcctg	60
agactgtgta aaaaaaatca tgatgagatc tatccaataa aaaagagaga ggaccgcaga	120
cgcctggctc tcatcatatg caatacaaag tttgatcacc tgcctgcaag gaatggggct	180
cactatgaca tcgtggggat gaaaaggctg cttcaaggcc tgggctacac tgtggttgac	240
gaaaagaatc tcacagccag ggatatggag tcagtgctga gggcatttgc tgccagacca	300
gagcacaagt cctctgacag cacgttcttg gtactcatgt ctcatggcat cctagaggga	360
atctgcggaa ctgcgcataa aaagaaaaaa ccggatgtgc tgctttatga caccatcttc	420
cagatattca acaaccgcaa ctgcctcagt ctaaaggaca aacccaaggt catcattgtc	480
caggcctgca gaggtgaaaa acatggggaa ctctgggtca gagactctcc agcatccttg	540
gcagtcatct cttcacagtc atctgagaac ctggaggcag attctgtttg caagatccac	600
gaggagaagg acttcattgc tttctgttct tcaacaccac ataacgtgtc ctggagagac	660
cgcacaaggg gctccatctt cattacggaa ctcatcacat gcttccagaa atattcttgc	720
tgctgccacc taatggaaat atttcggaag gtacagaaat catttgaagt tccacaggct	780
aaagcccaga tgcccaccat agaacgagca accttgacaa gagatttcta cctctttcct	840

ggcaattga 849 <210> 8 <211> 1743 <212> DNA <213> Homo sapienS <400> 8

agatctcgat	cccgcgaaat	taatacgact	cactataggg	gaattgtgag	cggataacaa	60
ttcccctcta	gaccacacct	taaggaggat	ataacatatg	gctgctgaac	cagtagaaga	120
caattgcatc	aactttgtgg	caatgaaatt	tattgacaat	acgctttact	ttatagctga	180
agatgatgaa	aacctggaat	cagattactt	tggcaagctt	gagagcaaac	tatcggtcat	240
tcgtaattta	aatgaocagg	tcctatttat	cgaccaaggg	aatcgtcoac	tattcgagga	300
catgacagac	agtgactgcc	gagacaatgc	gccgcgaacc	attttcatta	tatctatgta	360
caaggattct	cagccgcgcg	gaatggccgt	aactatttct	gtcaaatgtg	aaaagatato	420
cacgctgtcg	tgtgagaaca	agattattag	tttcaaagag	atgaatccgc	cggataatat	480
caaggacacg	aagtctgata	tcatattttt	ccagcgcagc	gtgccggggc	acgataacaa	540
gatgcaattt	gaatcatcca	gctatgaagg	gtactttctt	gcatgcgaga	aggaacgcga	600
tctctttaaa	cttattttaa	agaaagagga	cgagctaggc	gatcgcagca	ttatgttcao	660
tgtccaaaat	gaagactagt	ggaggatata	ataccaggaa	taaataaaat	ccatgggcca	720
tcatcatcat	catcatggcg	ccctcaagct	ttgtcctcat	gaagaattcc	tgagactatg	780
taaagaaaga	gctgaagaga	tctatccaat	aaaggagaga	aacaaccgca	cacgcctggc	840
tctcatcata	tgcaatacag	agtttgacca	tctgcctccg	aggaatggag	ctgactttga	900
catcacaggg	atgaaggagc	tacttgaggg	tctggactat	agtgtagatg	tagaagagaa	960
tctgacagcc	agggatatgg	agtcagcgct	gagggcattt	gctaccagac	cagagcacaa	1020
gtcctctgac	agcacattct	tggtactcat	gtctcatggc	atcctggagg	gaatctgcgg	1080

PL 208 592 B1 aactgtgcat gatgagaaaa aaccagatgt gctgctttat gacaccatct tccagatatt 1140 caacaaccgc aactgcctca gtctgaagga caaacccaag gtcatcattg tccaggcctg 1200 cagaggtgca aaccgtgggg aactgtgggt cagagactct ccagcatcct tggaagtggc 1260 ctcttcacag tcatctgaga acctggagga agatgctgtt tacaagaccc acgtggagaa 1320 ggacttcatt gctttctgct cttcaacgcc acacaacgtg tcctggagag acagcacaat 1380 gggctctatc ttcatcacac aactcatcac atgcttccag aaatattctt ggtgctgcca 1440 cctagaggaa gtatttcgga aggtacagca atcatttgaa actccaaggg ccaaagctca 1500 aatgcccacc atagaacgac tgtccatgac aagatatttc tacctctttc ctggcaattg 1560 aaaatggatc cgaattcgag ctccgtcgac aagcttgcgg ccgcactcga gcaccaccac 1620 caccaccact gagatccggc tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc 1680 accgctgagc aataactagc ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt 1740 ttg 1743 <210> 9 <211> 1464 <212> DNA <213> Homo sapienS <400> 9 atggctgctg aaccagtaga agacaattgc atcaactttg tggcaatgaa atttattgac 60 aatacgcttt actttatagc tgaagatgat gaaaacctgg aatcagatta ctttggcaag 120 cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 180 gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 240 accattttoa ttatatctat gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 300 tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 360 gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 420 agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 480 cttgcatgćg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 540 ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact agtggaggat ataataccag 600 gaataaataa aatccatggg ccatcatcat catcatcatg gcatactcaa actttgtcct 660 cgtgaagaat tcctgagact gtgtaaaaaa aatcatgatg agatctatcc aataaaaaag 720 agagaggacc gcagacgcct ggctctcatc atatgcaata caaagtttga tcacctgcct 780 gcaaggaatg gggctcacta tgacatcgtg gggatgaaaa ggctgcttca aggcctgggc 840 tacactgtgg ttgaogaaaa gaatctcaca gccagggata tggagtcagt gctgagggca 900 tttgctgcca gaccagagca caagtcctct gacagcacgt tcttggtact catgtctcat 960 ggcatęctag agggaatctg cggaactgcg cataaaaaga aaaaaccgga tgtgctgctt 1020 tatgacacca tcttccagat attcaacaac cgcaactgcc tcagtctaaa ggacaaacco 1080 aaggtcatca ttgtccaggc ctgcagaggt gaaaaacatg gggaactctg ggtcagagac 1140 tctccagcat ccttggcagt catctcttca cagtcatotg agaacctgga ggcagattct 1200 gtttgcaaga tccacgagga gaaggacttc attgctttct gttcttcaac accacataac 1260 gtgtcctgga gagaccgcac aaggggctcc atcttcatta cggaactcat cacatgcttc 1320 cagaaatatt cttgctgctg ccacetaatg gaaatatttc ggaaggtaca gaaatcattt 1380 gaagttccac aggctaaagc ccagatgccc accatagaac gagcaacctt gacaagagat 1440

PL 208 592 B1 ttctacctct ttcctggcaa ttga <210> 10 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Met

Gin

Ile

Phe

Val

Lys

Thr

Leu

Thr

Gly

Lys

Thr

Ile

Thr

Leu

Glu

1

5

10

15

Val

Glu

Ser

Ser

Asp

Thr

Ile

Asp

Asn

Val

Lys

Ser

Lys

Ile

Gin

Asp

20

25

30

Lys

Glu

Gly

Ile

Pro

Pro

Asp

Gin

Gin

Arg

Leu

Ile

Phe

Ala

Gly

Lys

35

40

45

Gin

Leu

Glu

Asp

Gly

Arg

Thr

Leu

Ser

Asp

Tyr

Asn

Ile

Gin

Lys

Glu

50

55

60

Ser

Thr

Leu

His

Leu

Val

Leu

Arg

Leu

Arg

Gly

Gly

Tyr

Phe

Gly

Lys

65

70

75

80

Leu

Glu

Ser

Lys

Leu

Ser

Val

Ile

Arg

Asn

Leu

Asn

Asp

Gin

Val

Leu

85

90

95

Phe

Ile

Asp

Gin

Gly

Asn

Arg

Pro

Leu

Phe

Glu

Asp

Met

Thr

Asp

Ser

100

105

110

Asp

Cys

Arg

Asp

Asn

Ala

Pro

Arg

Thr

Ile

Phe

Ile

Ile

Ser

Met

Tyr

115

120

125

Lys

Asp

Ser

Gin

Pro

Arg

Gly

Met

Ala

Val

Thr

Ile

Ser

Val

Lys

Cys

130

135

140

Glu

Lys

Ile

Ser

Thr

Leu

Ser

Cys

Glu

Asn

Lys

Ile

Ile

Ser

Phe

Lys

145

150

155

160

Glu

Met

Asn

Pro

Pro

Asp

Asn

Ile

Lys

Asp

Thr

Lys

Ser

Asp

Ile

Ile

165

170

175

Phe

Phe

Gin

Arg

Ser

Val

Pro

Gly

His

Asp

Asn

Lys

Met

Gin

Phe

Glu

180

185

190

Ser

Ser

Ser

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Phe

Leu

Ala

Cys

Glu

Lys

Glu

Arg

Asp

195

200

205

Leu

Phe

Lys

Leu

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Asp

Glu

Leu

Gly

Asp

Arg

Ser

210 215 220

Ile Met Phe Thr Val Gin Asn Glu Asp 225 230 <210> 11 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens

PL 208 592 B1 <400> 11 atgcagatct tcgtcaagac gttaaccggt aaaaccataa ctctagaagt tgaatcttcc 60 gataccatcg acaacgttaa gtcgaaaatt caagacaagg aaggcattcc acctgatcaa 120 caaagattga tctttgccgg taagcagctc gaagacggta gaacgctgtc tgattacaac 180 attcagaagg agtcgacctt acatcttgtc ttaagactaa gaggagggta ctttggcaag 240 cttgagagca aactatcggt cattcgtaat ttaaatgacc aggtcctatt tatcgaccaa 300 gggaatcgtc cactattcga ggacatgaca gacagtgact gccgagacaa tgcgccgcga 360 accattttca ttatatctat .gtacaaggat tctcagccgc gcggaatggc cgtaactatt 420 tctgtcaaat gtgaaaagat atccacgctg tcgtgtgaga acaagattat tagtttcaaa 480 gagatgaatc cgccggataa tatcaaggac acgaagtctg atatcatatt tttccagcgc 540 agcgtgccgg ggcacgataa caagatgcaa tttgaatcat ccagctatga agggtacttt 600 cttgcatgcg agaaggaacg cgatctcttt aaacttattt taaagaaaga ggacgagcta 660 ggcgatcgca gcattatgtt cactgtccaa aatgaagact ag 702 <210> 12 <211> 3419 <212> DNA <213> Homo sapienS <400> 12 agatctcgat cccgcgaaat taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa 60 ttcccctcta gaccacacct taaggaggat ataacatatg cagatcttcg tcaagacgtt 120 aaccggtaaa accataactc tagaagttga atcttccgat accatcgaca acgttaagtc 180 gaaaattcaa gacaaggaag gcattccacc tgatcaacaa agattgatct ttgccggtaa 240 gcagctcgag gacggtagaa cgctgtctga ttacaacatt cagaaggagt cgaccttaca 300 tcttgtctta agactaagag gagggtactt tggcaagctt gagagcaaac tatcggtcat 360 tcgtaattta aatgaccagg tcctatttat cgaccaaggg aatcgtccac tattcgagga 420 catgacagac agtgactgcc gagacaatgc gccgcgaacc attttcatta tatctatgta 480 caaggattct cagccgcgcg gaatggccgt aactatttct gtcaaatgtg aaaagatatc 540 cacgctgtcg tgtgagaaca agattattag tttcaaagag atgaatccgc cggataatat 600 caaggacacg aagtctgata tcatattttt ccagcgcagc gtgccggggc acgataacaa 660 gatgcaattt gaatcatcca gctatgaagg gtactttctt gcatgcgaga aggaacgcga 720 tctctttaaa cttattttaa agaaagagga cgagctaggc gatcgcagca ttatgttcac 780 tgtccaaaat gaagactagt ggaggatata ataccaggaa taaataaaat ccatgggcca 840 tcatcatcat catcatggca tggatgaaag caagataaac agtttattac aatttttatt 900 tggttcccga caggattttt tgagaaattt taaaacttgg agtaacaaca ataacaatct 960 atcgatttat ttattaattt ttggcatagt agtatttttt tataaaaaac cagaccatct 1020 aaactacatt gttgagagcg ttagtgaaat gacaacaaac ttcagaaata ataatagcct 1080 tagccgttgg ttgcccagaa gtaagtttac ccacttagac gaagagatct tgaaaagagg 1140 tggtttcatt gctggtttag ttaatgatgg taacacttgt tttatgaact ctgttttgca 1200 atcattggca tcatccagag aattaatgga gttcttggac aataatgtca taaggaccta 1260 tgaggagata gaacaaaatg aacacaatga agaaggaaac gggcaagaat ctgctcaaga 1320

PL 208 592 B1

tgaagecact	cataagaaaa	acactcgtaa	gggtggcaaa	gtttatggta	agcataagaa	1380
gaaattgaat	aggaagtcaa	gttcgaaaga	agacgaagaa	aagagccagg	agccagatat	1440
cactttcagt	gtcgccttaa	gggatctact	ttctgcctta	aatgcgaagt	attatcggga	1500
taaaccctat	ttcaaaacca	atagtttatt	gaaagcaatg	tccaaatctc	caagaaaaaa	1560
tattcttctt	ggctacgacc	aagaggacgc	gcaagaattc	ttccagaaca	tactagccga	1620
gttggaaagt	aacgttaaat	cattgaatac	tgaaaaacta	gataccactc	cagttgcgaa	1680
atcagaatta	cccgatgatg	ctttagtagg	tcaacttaac	cttggtgaag	ttggcactgt	1740
ttacattcca	actgaacaga	ttgatcctaa	ctctatacta	catgacaagt	ccattcaaaa	1800
tttcacacct	ttcaaactaa	tgactccttt	agatggtatc	acggcagaaa	gaattggttg	1860
tttacagtgt	ggtgagaacg	gtggcataag	atattccgta	ttttcgggat	taagcttaaa	1920
tttaccgaac	gagaatattg	gttccacttt	aaaattatct	cagttattga	gcgactggag	1980
taaacctgaa	atcatcgaag	tcgtagaatg	taaccgttgt	gccctcacag	cagcgcactc	2040
tcatttattt	ggtcagttga	aagaatttga	aaaaaaacct	gagggttcga	tcccagaaaa	2100
gccaattaac	gctgtaaaag	atagggtcca	tcaaatcgaa	gaagttcttg	ccaaaccagt	2160
tattgacgat	gaagattata	agaagttgca	tacagcaaat	atggtacgta	aatgctctaa	2220
atctaagcag	attttaatat	caagacctcc	accattatta	tccattcata	tcaacagatc	2280
cgtatttgat	ccaagaacgt	acatgattag	aaaaaataac	tcgaaagtat	tgtttaagtc	2340
aacgttgaat	cttgcccctt	ggtgttgtga	tattaatgaa	atcaatttgg	atgctcgttt	2400
gccaatgtca	aaaaaggaaa	aagctgcgca	acaagattca	agtgaagatg	aaaacattgg	2460
cggtgaatac	tatacgaaat	tacatgaacg	cttcgagcag	gaatttgaag	acagcgagga	2520
agaaaaagaa	tacgatgacg	cagaggggaa	ctatgcgtct	cattacaatc	ataccaagga	2580
tatcagtaac	tatgatcccc	taaacggtga	agtcgatggc	gtgacatccg	atgatgaaga	2640
tgagtacatt	gaagaaaccg	atgctttagg	gaatacaatc	aaaaaaagga	tcatagaaca	2700
ttctgatgtt	gaaaacgaga	atgtaaaaga	taatgaagaa	ctgcaagaaa	tcgacaatgt	2760
gagccttgac	gaaccaaaga	tcaatgttga	agatcaacta	gaaacatcat	ctgatgagga	2820
agatgttata	ccagctccac	ctatcaatta	tgctaggtca	ttttccacag	ttccagccac	2880
tccattgaca	tattcattgc	gctctgtcat	tgttcactac	ggtacccata	attatggtca	2940
ttacattgca	tttagaaaat	acaggggttg	ttggtggaga	atatctgatg	agactgtgta	3000
cgttgtggac	gaagctgaag	tcctttcaac	acccggtgta	tttatgttat	tttacgaata	3060
tgactttgat	gaagaaactg	ggaagatgaa	ggatgatttg	gaagctattc	agagtaataa	3120
tgaagaagat	gatgaaaaag	agcaggagca	aaaaggagtc	caggagccaa	aggaaagcca	3180
agagcaagga	gaaggtgaag	agcaagagga	aggtcaagag	cagatgaagt	tcgagagaac	3240
agaagaccat	agagatattt	ctggtaaaga	tgtaaactaa	gctcgagcac	caccaccacc	3300
accactgaga	tccggctgct	aacaaagccc	gaaaggaagc	tgagttggct	gctgccaccg	3360
ctgagcaata	actagcataa	ccccttgggg	cctctaaacg	ggtcttgagg	ggttttttg	3419

Zastrzeżenia patentowe

Claims (1)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 z ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18, znamienny tym, że obejmuje:

   (i) subklonowanie kwasu nukleinowego ludzkiego polipeptydu prekursora IL-18 do wektora pET28a, pod kontrolą promotora T7 obejmującego sekwencję Shine-Dalgarno do optymalnej inicjacji translacji z sekwencji kwasu nukleinowego polipeptydu prekursora IL-18;

   (ii) subklonowanie genu kaspazy 4 połączonego ze znacznikiem his bezpośrednio po sekwencji kwasu nukleinowego polipeptydu prekursora IL-18 z włączoną defektywną przez mutację sekwencją Shine-Dalgarno, w ten sposób pozwalając na minimalną inicjację translacji z sekwencji kwasu nukleinowego kaspazy 4 o sekwencji aminokwasowej kaspazy 4 przedstawionej na Sekw. Id. Nr: 4;

   PL 208 592 B1 (iii) współwyrażanie ludzkiego polipeptydu prekursoraIL-18 z pojedynczego transkryptu z kaspazą 4 w plazmidzie ekspresyjnym pET28-Pro-IL-18/Casp4 w komórce bakteryjnej;

   (iv) oczyszczenie aktywnego ludzkiego polipeptydu IL-18 o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Sekw. Id. Nr: 3.

   Rysunki

   Fig. 1

   Identyfikator Sekw. Nr 1

   1 MAAEPVEDNC INFVAMKFID NTLYFIAEDD ENLESDYFGK LESKLSVIRN 51 LNDQVLFIDQ GNRPLFEDMT DSDCRDNAPR TIFIISMYKD SQPRGMAVTI 101 SVKCEKISTL SCENKIISFK EMNPPDNIKD TKSDIIFFQR SVPGHDNKMQ 151 FESSSYEGYF LACEKERDLF KLILKKEDEL GDRSIMFTVQ NED '

   Fig. 2

   Identyfikator Sekw. Nr 2 1 50 ATGGCTGCTG AACCAGTAGA AGACAATTGC ATCAACTTTG TGGCAATGAA 51 100 ATTTATTGAC AATACGCTTT ACTTTATAGC TGAAGATGAT GAAAACCTGG 101 150 AATCAGATTA CTTTGGCAAG CTTGAGAGCA AACTATCGGT CATtCGTAAT 151 200 TTAAATGACC AGGTCCTATT TATCGACCAA GGGAATCGTC CACTATTCGA 201 250 GGACATGACA GACAGTGACT GCCGAGACAA TGCGCCGCGA ACCATtTTCA 251 300 TTATATCTAT GTACAAGGAT TCTCAGCCGC GCGGAATGGC CGTAACTATT 301 350 TCTGTCAAAT GTGAAAAGAT ATCCACGCTG TCGTGTGAGA ACAAgATtAT 351 400 tAGTTTCAAA GAGATGAATC CGCCGGATAA TATCAAGGAC ACGAAGTCTG 401 450 ATATCATATT TTTCCAGCGC AGCGTGCCGG GGCACGATAA CAAGATGCAA 451 500 TTTGAATCAT CCAGCTATGA AGGGTACTTT CTTGCATGCG AGAAGGAACG 501 550 CGATCTCTTT AAACTTATTT TAAAGAAAGA GGACGAGCTA GGCGATCGCA 551 582 GCATtATGTT CACTGTCCAA AATGAAGACT AG

   Fig. 3

   Identyfikator Sekw. Nr 3

   1 YFGKLESKLS VIRNŁNDQVL FIDQGNRPLF EDMTDSDCRD NAPRTIFIIS 51 MYKDSQPRGM AVTISVKCEK ISTLSCENKI ISFKEMNPPD NIKDTKSDII 101 FFQRSVPGHD NKMQFESSSY EGYFLACEKE RDLFKLILKK EDELGDRSIM

   PL 208 592 B1

   Fig.4

   Identyfikator Sekw. Nr 4

   1 MGHHHHHHGA LKLCPHEEFL RLCKERAEEI YPIKERNNRT RLALIICNTE 51 FDHLPPRNGA DFDITGMKEL LEGLDYSVDV EENLTARDME SALRAFATRP 101 EHKSSDSTFL VLMSHGILEG ICGTVHDEKK PDVLLYDTIF QIFNNRNCLS 151 LKDKPKVIIV QACRGANRGE LWVRDSPTSL EVASSQSSEN LEEDAVYKTH 201 VEKDFIAFCS STPHNVSWRD STMGSIFITQ LITCFQKYSW CCHLEEVFRK 252 VQQSFETPRA KAQMPTIERL SMTRYFYLFP GN

   Fig. 5

   Identyfikator Sekw. Nr 5 1 50 ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATGGCGCC CTCAAGCTTT GTCCTCATGA 51 100 AGAATTCCTG AGACTATGTA AAGAAAGAGC TGAAGAGATC TATCCAATAA 101 150 AGGAGAGAAA CAACCGCACA CGCCTGGCTC TCATCATATG CAATACAGAG 151 200 TTTGACCATC TGCCTCCGAG GAATGGAGCT GACTTTGACA TCACAGGGAT 201 250 GAAGGAGCTA CTTGAGGGTC TGGACTATAG TGTAGATGTA GAAGAGAATC 251 300 TGACAGCCAG GGATATGGAG TCAGCGCTGA GGGCATTTGC TACCAGACCA 301 350 GAGCACAAGT CCTCTGACAG CACATTCTTG GTACTCATGT CTCATGGCAT 351 400 CCTGGAGGGA ATCTGCGGAA CTGTGCATGA TGAGAAAAAA CCAGATGTGC 401 450 TGCTTTATGA CACCATCTTC CAGATATTCA ACAACCGCAA CTGCCTCAGT 451 500 CTGAAGGACA AACCCAAGGT CATCATTGTC CAGGCCTGCA GAGGTGCAAA 501 550 CCGTGGGGAA CTGTGGGTCA GAGACTCTCC AGCATCCTTG GAAGTGGCCT 551 600 CTTCACAGTC ATCTGAGAAC CTGGAGGAAG ATGCTGTTTA CAAGACCCAC 601 650 GTGGAGAAGG ACTTCATTGC TTTCTGCTCT TCAACGCCAC ACAACGTGTC 651 700 CTGGAGAGAC AGCACAATGG GCTCTATCTT CATCACACAA CTCATCACAT 701 750 GCTTCCAGAA ATATTCTTGG TGCTGCCACC TAGAGGAAGT ATTTCGGAAG 751 800

   PL 208 592 B1

   GTACAGCAAT CATTTGAAAC TCCAAGGGCC AAAGCTCAAA TGCCCACCAT

   801 849

   AGAACGACTG TCCATGACAA GATATTTCTA CCTCTTTCCT GGCAATTGA

   Fig. 6

   Identyfikator Sekw. Nr 6

   1 MGHHHHHHGI LKLCPREEFL RLCKKNHDEI YPIKKREDRR RLALIICNTK 51 FDHLPAKNGA HYDIVGMKRL LQGLGYTWD EKNLTARDME SVLRAFAARP 101 EHKSSDSTFL VLMSHGILEG ICGTAHKKKK PDVLLYDTIF QIFNNRNCLS 151 LKDKPKVIIV QACRGEKHGE LWRDSPASL AVISSQSSEN LEADSVCKIH 201 EEKDFIAFCS STPHNVSWRD RTRGSIFITE LITCFQKYSC CCHLMEIFRK 251 VQKSFEVPQA KAQMPTIERA TLTRDFYLFP GN

   Fig. 7

   Identyfikator Sekw. Nr 7 1 50 ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATGGCATA CTCAAACTTT GTCCTCGTGA 51 100 AGAATTCCTG AGACTGTGTA AAAAAAATCA TGATGAGATC TATCCAATAA 101 150 AAAAGAGAGA GGACCGCAGA CGCCTGGCTC TCATCATATG CAATACAAAG 151 200 TTTGATCACC TGCCTGCAAG GAATGGGGCT CACTATGACA TCGTGGGGAT 2 01 250 GAAAAGGCTG CTTCAAGGCC TGGGCTACAC TGTGGTTGAC GAAAAGAATC 251 300 TCACAGCCAG GGATATGGAG TCAGTGCTGA GGGCATTTGC TGCCAGACCA 301 350 GAGCACAAGT CCTCTGACAG CACCTTCTTG GTACTCATGT CTCATGGCAT 351 400 CCTAGAGGGA ATCTGCGGAA CTGCGCATAA AAAGAAAAAA CCGGATGTGC 401 450 TGCTTTATGA CACCATCTTC CAGATATTCA ACAACCGCAA CTGCCTCAGT 451 500 CTAAAGGACA AACCCAAGGT CATCATTGTC CAGGCCTGCA GAGGTGAAAA 501 550 ACATGGGGAA CTCTGGGTCA GAGACTCTCC AGCATCCTTG GCAGTCATCT 551 600 CTTCACAGTC ATCTGAGAAC CTGGAGGCAG ATTCTGTTTG CAAGATCCAC 601 650 GAGGAGAAGG ACTTCATTGC TTTCTGTTCT TCAACACCAC ATAACGTGTC 651 700 CTGGAGAGAC CGCACAAGGG GCTCCATCTT CATTACGGAA CTCATCACAT

   PL 208 592 B1

   701 750

   GCTTCCAGAA ATATTCTTGC TGCTGCCACC TAATGGAAAT ATTTCGGAAG 751 800

   GTACAGAAAT CATTTGAAGT TCCACAGGCT AAAGCCCAGA TGCCCACCAT 801 849

   AGAACGAGCA ACCTTGACAA GAGATTTCTA CCTCTTTCCT GGCAATTGA

   Fig. 8

   T7-^-lRBSllPro IL18I RBS Casp4