JPH08140678A - 顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａ - Google Patents
顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａInfo
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- JPH08140678A JPH08140678A JP6280655A JP28065594A JPH08140678A JP H08140678 A JPH08140678 A JP H08140678A JP 6280655 A JP6280655 A JP 6280655A JP 28065594 A JP28065594 A JP 28065594A JP H08140678 A JPH08140678 A JP H08140678A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｇ−ＣＳＦと結合活性を有する蛋白質の製
造。 【構成】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域の内、
ＣＲＨ領域、およびＩg−ＣＲＨ領域の蛋白質をコード
しているＤＮＡ、該ＤＮＡを多角体プロモーターの下流
に組み込んでなる組換え型バキュロウイルス、該ウイル
スにより昆虫細胞を形質転換し、得られた形質転換体を
培養し、組換え蛋白質を製造する方法、およびこのよう
にして製造された蛋白質。 【効果】 Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用に
関連する疾患の研究、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、
例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療ま
たは予防に有用である。
造。 【構成】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域の内、
ＣＲＨ領域、およびＩg−ＣＲＨ領域の蛋白質をコード
しているＤＮＡ、該ＤＮＡを多角体プロモーターの下流
に組み込んでなる組換え型バキュロウイルス、該ウイル
スにより昆虫細胞を形質転換し、得られた形質転換体を
培養し、組換え蛋白質を製造する方法、およびこのよう
にして製造された蛋白質。 【効果】 Ｇ−ＣＳＦ受容体とリガンドとの相互作用に
関連する疾患の研究、Ｇ−ＣＳＦ依存性の疾患や異常、
例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白血病の治療ま
たは予防に有用である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は顆粒球コロニー刺激因子
受容体(以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称)の細胞質外領域
の内、リガンド結合領域の蛋白質(即ちＧ−ＣＳＦ結合
領域蛋白質)、さらに詳しくは、サイトカイン受容体相
補領域の蛋白質、またはイムノグロブリン様領域および
サイトカイン受容体相補領域の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該ベクターで形
質転換された形質転換体、および該形質転換体を適当な
培地で培養し、培養物から生成物を回収することからな
る、組換え蛋白質の製造方法に関するものである。
受容体(以下、Ｇ−ＣＳＦ受容体と呼称)の細胞質外領域
の内、リガンド結合領域の蛋白質(即ちＧ−ＣＳＦ結合
領域蛋白質)、さらに詳しくは、サイトカイン受容体相
補領域の蛋白質、またはイムノグロブリン様領域および
サイトカイン受容体相補領域の蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該ベクターで形
質転換された形質転換体、および該形質転換体を適当な
培地で培養し、培養物から生成物を回収することからな
る、組換え蛋白質の製造方法に関するものである。
【０００２】顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)は血
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担
っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、並
びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分か
っている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等の
受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、そ
の増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与
える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子としての
作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄移
植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄性
白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合がある
ことも分かっている。
液細胞の増殖と分化に関与するコロニー刺激因子の１員
であり好中性顆粒球の増殖および分化に重要な役割を担
っている。この因子は、血液中の好中球濃度の制御、並
びに成熟好中球の賦活化に深く関与していることが分か
っている。例えば、Ｇ−ＣＳＦは好中球の前駆細胞等の
受容体(Ｇ−ＣＳＦ受容体)を介して該細胞に作用し、そ
の増殖、あるいは分化を刺激して主に好中性顆粒球を与
える。また、Ｇ−ＣＳＦには好中球の調節因子としての
作用や、臨床面では、がん患者の化学療法および骨髄移
植療法における有用性も示唆されている。他方、骨髄性
白血病細胞などのがん細胞の増殖を刺激する場合がある
ことも分かっている。
【０００３】Ｇ−ＣＳＦの作用する細胞は好中球の前駆
体および成熟した好中球、および種々の骨髄性白血病細
胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ受容体は非
血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤にも存在して
いる。最近の研究では活性発現に際して、同受容体は二
量体などの多量体構造をなしていると考えられる。これ
らのリガンド（つまりＧ−ＣＳＦ）とＧ−ＣＳＦ受容体
との複合体形成反応、また多量体化の機構を解明するこ
とは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防に有
効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細胞が
Ｇ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されているが、そ
れをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止することが
可能である。
体および成熟した好中球、および種々の骨髄性白血病細
胞に限定されているのに対して、Ｇ−ＣＳＦ受容体は非
血液細胞、例えばヒト内皮細胞および胎盤にも存在して
いる。最近の研究では活性発現に際して、同受容体は二
量体などの多量体構造をなしていると考えられる。これ
らのリガンド（つまりＧ−ＣＳＦ）とＧ−ＣＳＦ受容体
との複合体形成反応、また多量体化の機構を解明するこ
とは、関連する疾患や異常の研究、治療または予防に有
効である。例えば、骨髄性白血病細胞などのがん細胞が
Ｇ−ＣＳＦにより増殖することが示唆されているが、そ
れをＧ−ＣＳＦ受容体に拮抗する物質で阻止することが
可能である。
【０００４】従って、本発明はＧ−ＣＳＦ受容体とリガ
ンドとの相互作用に関連する疾患の研究や治療に有用で
あり、臨床的に投与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ
受容体に対する拮抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の
疾患や異常、例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白
血病の治療または予防にも途を開くものである。
ンドとの相互作用に関連する疾患の研究や治療に有用で
あり、臨床的に投与した場合には、生体内のＧ−ＣＳＦ
受容体に対する拮抗作用を通して、Ｇ−ＣＳＦ依存性の
疾患や異常、例えば、顆粒球の増殖の異常に起因する白
血病の治療または予防にも途を開くものである。
【０００５】また、本発明のＧ−ＣＳＦ受容体結合領域
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にし、
Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究(その立体
構造の解析など)を飛躍的に発展させ、ひいてはＧ−Ｃ
ＳＦのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にする
ものである。
蛋白質は、ペプチドライブラリーなどを用いてのペプチ
ド性のＧ−ＣＳＦのアゴニストまたはアンタゴニストの
スクリーニング、非ペプチド性のＧ−ＣＳＦのアゴニス
トまたはアンタゴニストのスクリーニングを可能にし、
Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合の研究(その立体
構造の解析など)を飛躍的に発展させ、ひいてはＧ−Ｃ
ＳＦのアゴニスト、アンタゴニストの合成を可能にする
ものである。
【０００６】現在、Ｇ−ＣＳＦは、その骨髄性白血病細
胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基づき、放
射線治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減
少を回復するための治療剤として有用性が期待されてい
るが、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニス
トは、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳ
Ｆと同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
胞の分化誘導と成熟顆粒球の機能亢進作用に基づき、放
射線治療や抗ガン剤治療を受けたガン患者での白血球減
少を回復するための治療剤として有用性が期待されてい
るが、上記のＧ−ＣＳＦアゴニストまたはアンタゴニス
トは、それら白血球減少患者の治療において、Ｇ−ＣＳ
Ｆと同等またはそれ以上の効果を発揮し得ると予想され
る。
【０００７】
【従来技術】既に、マウスおよびヒト由来のＧ−ＣＳＦ
受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、配列が
明らかにされている[福永ら、Ｃell，６１ ３４１−３
５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ．８７ ８７０２−８７０６(１９９０)；ＷＯ９１／
１４７７６(１９９１年１０月３日公開)]。
受容体をコードするＤＮＡはクローニングされ、配列が
明らかにされている[福永ら、Ｃell，６１ ３４１−３
５０(１９９０)；Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci．ＵＳ
Ａ．８７ ８７０２−８７０６(１９９０)；ＷＯ９１／
１４７７６(１９９１年１０月３日公開)]。
【０００８】福永らは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の発現に成功
したことを報告しているが(Ｃell,前掲,;Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ．前掲,；ＥＭＢＯ Ｊ．１０
２８５５−２８６５(１９９１))いずれも相補ＤＮＡ
の全配列を動物細胞を用いて発現させたものであり、そ
の発現量は極めて低く、需要を満たすだけのＧ−ＣＳＦ
受容体の製造には最適でなく、構造解析、反応機構の研
究も十分に行うことができなかった。
したことを報告しているが(Ｃell,前掲,;Ｐroc．Ｎat
l．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ．前掲,；ＥＭＢＯ Ｊ．１０
２８５５−２８６５(１９９１))いずれも相補ＤＮＡ
の全配列を動物細胞を用いて発現させたものであり、そ
の発現量は極めて低く、需要を満たすだけのＧ−ＣＳＦ
受容体の製造には最適でなく、構造解析、反応機構の研
究も十分に行うことができなかった。
【０００９】平岡らは、Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結
合部位の発現に大腸菌マルトース融合蛋白質を用いて成
功している(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６９，２２４１２−
２２４１９(１９９４)；特願平第６−１１６２５２)。
しかしこの場合には、リガンド結合部位の最小ユニット
を取り出したために、天然のＧ−ＣＳＦ受容体に比べ
て、どうしても結合活性の低下が観察された。また同受
容体の活性発現に際して生ずるとされる受容体の多量体
化は観察されなかった。また精製においてもＱ−セファ
ロース，ファクターＸa処理などいくつかの段階の処理
を必要とした。
合部位の発現に大腸菌マルトース融合蛋白質を用いて成
功している(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６９，２２４１２−
２２４１９(１９９４)；特願平第６−１１６２５２)。
しかしこの場合には、リガンド結合部位の最小ユニット
を取り出したために、天然のＧ−ＣＳＦ受容体に比べ
て、どうしても結合活性の低下が観察された。また同受
容体の活性発現に際して生ずるとされる受容体の多量体
化は観察されなかった。また精製においてもＱ−セファ
ロース，ファクターＸa処理などいくつかの段階の処理
を必要とした。
【００１０】
【発明が解決すべき課題】本発明者らは、上記の様々な
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子の
内、特に、Ｇ−ＣＳＦとの結合および多量体化に必要な
領域の蛋白質が有用であることに着目し、そのような蛋
白質の有効な製造方法を確立するために研究を重ねてき
た。
目的を達成するためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体の全分子の
内、特に、Ｇ−ＣＳＦとの結合および多量体化に必要な
領域の蛋白質が有用であることに着目し、そのような蛋
白質の有効な製造方法を確立するために研究を重ねてき
た。
【００１１】本発明の目的に有用なリガンド結合領域蛋
白質のアミノ酸配列は、上記文献により、ヒト及びマウ
ス等に関して既知である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受
容体をコードするcＤＮＡ(相補ＤＮＡ)をクローニング
し、この受容体はイムノグロブリン様領域(以下Ｉg領域
と略す)、サイトカイン受容体相補領域(以下ＣＲＨ領域
と略す)、フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域からなる
ことを示した(Ｃell,前掲;Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．
ＵＳＡ．前掲)。
白質のアミノ酸配列は、上記文献により、ヒト及びマウ
ス等に関して既知である。即ち、福永らはＧ−ＣＳＦ受
容体をコードするcＤＮＡ(相補ＤＮＡ)をクローニング
し、この受容体はイムノグロブリン様領域(以下Ｉg領域
と略す)、サイトカイン受容体相補領域(以下ＣＲＨ領域
と略す)、フィブロネクチンタイプＩＩＩ領域からなる
ことを示した(Ｃell,前掲;Ｐroc．Ｎatl．Ａcad,Ｓci．
ＵＳＡ．前掲)。
【００１２】ＣＲＨ領域とは、インターロイキン２−
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている[バザン(Ｂ
azan Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ６９３４−６９３
８(１９９０)]。事実、Ｇ−ＣＳＦ受容体でもこのＣＲ
Ｈ領域が必須であり、現在のところこのＣＲＨ領域がこ
のファミリーのリガンド結合、およびシグナル伝達のた
めに必要な１つのユニットと考えられている。
７、エリスロポイエチン、成長ホルモン、ＧＭ−ＣＳＦ
さらにインターフェロンα,β,γなどのサイトカイン系
受容体の細胞質外領域に見られる約２００アミン酸から
なる相補性領域で、これらの受容体のリガンド結合部位
と考えられている。このことから、これらの受容体はサ
イトカイン受容体ファミリーと呼ばれている[バザン(Ｂ
azan Ｐroc．Ｎatl．Ａcad．Ｓci ６９３４−６９３
８(１９９０)]。事実、Ｇ−ＣＳＦ受容体でもこのＣＲ
Ｈ領域が必須であり、現在のところこのＣＲＨ領域がこ
のファミリーのリガンド結合、およびシグナル伝達のた
めに必要な１つのユニットと考えられている。
【００１３】このＣＲＨ領域はさらにアミノ末端側ドメ
イン(以下ＢＮドメインと略す)およびＣ末端側ドメイン
の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させると、
活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結合に
はＢＮドメインが最も重要な役割を果たしていることを
示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持される
か否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやインタ
ーロイキン６受容体の場合には、Ｃ末端側ドメインも必
要と考えられている。平岡らはこのＢＮドメインをリガ
ンド結合領域として発現させている(平岡ら，前掲)。
イン(以下ＢＮドメインと略す)およびＣ末端側ドメイン
の２つの部分からなり、ＢＮドメインを欠失させると、
活性能が完全に失われる。このことは、リガンド結合に
はＢＮドメインが最も重要な役割を果たしていることを
示唆しているが、ＢＮドメインのみで活性が保持される
か否かは未だ明瞭でなく、例えば成長ホルモンやインタ
ーロイキン６受容体の場合には、Ｃ末端側ドメインも必
要と考えられている。平岡らはこのＢＮドメインをリガ
ンド結合領域として発現させている(平岡ら，前掲)。
【００１４】Ｉg領域は、Ｇ−ＣＳＦ受容体の他に、サ
イトカイン受容体ファミリー、中でもインターロイキン
３,５,６、ＧＭ−ＣＳＦの受容体などに見られる約１０
０アミノ酸からなる領域で免疫イムノグロブリン様のア
ミノ酸配列を成していると考えられている。この領域
の、それぞれの受容体の機能への役割は不明である。し
かしながら、細胞質外領域として、このＩg領域とＣＲ
Ｈ領域(これらをＩg−ＣＲＨと略す)のみから構成され
るＧ−ＣＳＦ受容体はシグナル配列を保持して、しかも
天然の受容体と同じリガンド結合能力を有している。ま
た、ＣＲＨ領域のみでも天然のＧ−ＣＳＦ受容体よりは
リガンド結合能力は低下するが、前掲のＢＮドメインよ
りも高いリガンド結合能力を有している。（後述の実施
例５および１０参照。）
イトカイン受容体ファミリー、中でもインターロイキン
３,５,６、ＧＭ−ＣＳＦの受容体などに見られる約１０
０アミノ酸からなる領域で免疫イムノグロブリン様のア
ミノ酸配列を成していると考えられている。この領域
の、それぞれの受容体の機能への役割は不明である。し
かしながら、細胞質外領域として、このＩg領域とＣＲ
Ｈ領域(これらをＩg−ＣＲＨと略す)のみから構成され
るＧ−ＣＳＦ受容体はシグナル配列を保持して、しかも
天然の受容体と同じリガンド結合能力を有している。ま
た、ＣＲＨ領域のみでも天然のＧ−ＣＳＦ受容体よりは
リガンド結合能力は低下するが、前掲のＢＮドメインよ
りも高いリガンド結合能力を有している。（後述の実施
例５および１０参照。）
【００１５】以上の結果は、本発明におけるリガンド結
合領域蛋白質として、ＣＲＨ領域を含む蛋白質、あるい
はＣＲＨ領域に加えてＩg領域をも含む（Ｉｇ−ＣＲＨ
領域）蛋白質が有用であることを示唆しているが、ＣＲ
Ｈ領域またはＩg−ＣＲＨ領域のみで発現させた例はな
く、また、ＣＲＨ領域またはＩg−ＣＲＨ領域のみで、
どのようなレベルの結合活性を有するか、また多量体化
能を有するかも不明であった。これらの課題を解決する
ためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体結合領域として、ＣＲＨ領
域蛋白質またはＩg−ＣＲＨ領域蛋白質を大量に製造す
る必要がある。
合領域蛋白質として、ＣＲＨ領域を含む蛋白質、あるい
はＣＲＨ領域に加えてＩg領域をも含む（Ｉｇ−ＣＲＨ
領域）蛋白質が有用であることを示唆しているが、ＣＲ
Ｈ領域またはＩg−ＣＲＨ領域のみで発現させた例はな
く、また、ＣＲＨ領域またはＩg−ＣＲＨ領域のみで、
どのようなレベルの結合活性を有するか、また多量体化
能を有するかも不明であった。これらの課題を解決する
ためには、Ｇ−ＣＳＦ受容体結合領域として、ＣＲＨ領
域蛋白質またはＩg−ＣＲＨ領域蛋白質を大量に製造す
る必要がある。
【００１６】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＩg−ＣＲＨ領域は非
常に発現困難と考えられる。その理由として、この結合
部位は多くのシステイン残基を含み(マウス由来では１
４残基、ヒト由来では１７残基)、容易にフォールディ
ングをしないことが挙げられる。また、ＣＲＨ領域につ
いては、マウス由来では１０個、ヒト由来では１２個の
システイン残基を含んでおり、やはり、容易にフォール
ディングしないために、発現が困難であると考えられ
る。しかしながら上記の理由によりＩg−ＣＲＨ領域を
発現させることが出来れば、発現させた同領域が天然の
受容体とほぼ同じ強さの活性を保持するか否か、さらに
は多量体化能を保持するか否かを明確にすることが出来
る。
常に発現困難と考えられる。その理由として、この結合
部位は多くのシステイン残基を含み(マウス由来では１
４残基、ヒト由来では１７残基)、容易にフォールディ
ングをしないことが挙げられる。また、ＣＲＨ領域につ
いては、マウス由来では１０個、ヒト由来では１２個の
システイン残基を含んでおり、やはり、容易にフォール
ディングしないために、発現が困難であると考えられ
る。しかしながら上記の理由によりＩg−ＣＲＨ領域を
発現させることが出来れば、発現させた同領域が天然の
受容体とほぼ同じ強さの活性を保持するか否か、さらに
は多量体化能を保持するか否かを明確にすることが出来
る。
【００１７】上記の理由から、本発明で開示する、Ｇ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質のＤＮＡ組換え
法による製造は、従来困難であった天然のＧ−ＣＳＦ受
容体とほぼ同じ機能を保持する蛋白質をも含む高機能の
同受容体の製造への途を開くものである。
ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質のＤＮＡ組換え
法による製造は、従来困難であった天然のＧ−ＣＳＦ受
容体とほぼ同じ機能を保持する蛋白質をも含む高機能の
同受容体の製造への途を開くものである。
【００１８】
【課題を解決するための手段】本発明者は、Ｇ−ＣＳＦ
受容体のリガンド結合領域、特にＣＲＨ領域およびＩｇ
−ＣＲＨ領域をコードする遺伝子を発現するにあたり、
昆虫由来のウイルス、バキュロウイルスをベクターとし
て用い、昆虫由来の細胞を宿主として用いた。その結果
として、目的産物を効率よく分泌生産することに成功
し、本発明を完成した。
受容体のリガンド結合領域、特にＣＲＨ領域およびＩｇ
−ＣＲＨ領域をコードする遺伝子を発現するにあたり、
昆虫由来のウイルス、バキュロウイルスをベクターとし
て用い、昆虫由来の細胞を宿主として用いた。その結果
として、目的産物を効率よく分泌生産することに成功
し、本発明を完成した。
【００１９】本発明方法により製造されたＧ−ＣＳＦ受
容体のＩｇ−ＣＲＨ領域のリガンド結合領域蛋白質は、
後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同様な
強さのリガンド結合活性を示し、さらにリガンドに依存
した多量体化能も示した。また、ＣＲＨ領域も従来のＢ
Ｎドメイン単独よりは高い結合活性を示した。
容体のＩｇ−ＣＲＨ領域のリガンド結合領域蛋白質は、
後述するように、天然のＧ−ＣＳＦ受容体とほぼ同様な
強さのリガンド結合活性を示し、さらにリガンドに依存
した多量体化能も示した。また、ＣＲＨ領域も従来のＢ
Ｎドメイン単独よりは高い結合活性を示した。
【００２０】本発明は遺伝子操作の手法を用いてＧ−Ｃ
ＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質、詳しくは、ＣＲ
Ｈ領域蛋白質またはＩｇ−ＣＲＨ領域蛋白質を製造する
ためのものであり、同領域をコードしているＤＮＡ断片
を、バキュロウイルス由来の遺伝子制御系に組み込んだ
プラスミッド、該ＤＮＡをやはりこの遺伝子制御系のも
とに組み込んである組換え型バキュロウイルスベクタ
ー、および、同組換え型ウイルスベクターを用い、昆虫
細胞を宿主とする成長ホルモンレセプターのホルモン結
合領域蛋白質を製造する方法を提供するものである。
ＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白質、詳しくは、ＣＲ
Ｈ領域蛋白質またはＩｇ−ＣＲＨ領域蛋白質を製造する
ためのものであり、同領域をコードしているＤＮＡ断片
を、バキュロウイルス由来の遺伝子制御系に組み込んだ
プラスミッド、該ＤＮＡをやはりこの遺伝子制御系のも
とに組み込んである組換え型バキュロウイルスベクタ
ー、および、同組換え型ウイルスベクターを用い、昆虫
細胞を宿主とする成長ホルモンレセプターのホルモン結
合領域蛋白質を製造する方法を提供するものである。
【００２１】本発明の目的に従い、本明細書で用いる語
句を以下に定義する。
句を以下に定義する。
【００２２】本発明において、Ｇ−ＣＳＦ受容体という
語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源のＧ−Ｃ
ＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によって作ら
れるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も含むもの
とする。
語句はヒトを含む天然のあらゆる哺乳動物起源のＧ−Ｃ
ＳＦ受容体を意味すると共に、遺伝子操作によって作ら
れるそれら天然のＧ−ＣＳＦ受容体の変異体も含むもの
とする。
【００２３】Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白
質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に
関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質は、Ｇ
−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域の内、ＣＲＨ領域を
構成するアミノ酸配列を含有しており、さらには、ＣＲ
Ｈ領域に加えてＩg領域をも含んだＩg−ＣＲＨ領域を構
成するアミノ酸配列を有する。発明の目的にとっては、
天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領域蛋白質の
みならず、当業者既知の方法で１またはそれ以上のアミ
ノ酸の変化によって得られる、同様の活性を有する誘導
体も有用である。従って、本明細書中、単に、リガンド
結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミノ酸配列を有
する蛋白質のみならず、その誘導体(上記の意味での変
異体)をも包含するものとする。
質とは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ−ＣＳＦとの結合に
関与する領域を構成する蛋白質を指す。該蛋白質は、Ｇ
−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域の内、ＣＲＨ領域を
構成するアミノ酸配列を含有しており、さらには、ＣＲ
Ｈ領域に加えてＩg領域をも含んだＩg−ＣＲＨ領域を構
成するアミノ酸配列を有する。発明の目的にとっては、
天然のアミノ酸配列を有するリガンド結合領域蛋白質の
みならず、当業者既知の方法で１またはそれ以上のアミ
ノ酸の変化によって得られる、同様の活性を有する誘導
体も有用である。従って、本明細書中、単に、リガンド
結合領域蛋白質と言うときは、天然のアミノ酸配列を有
する蛋白質のみならず、その誘導体(上記の意味での変
異体)をも包含するものとする。
【００２４】Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域蛋白
質をコードするＤＮＡとは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ
−ＣＳＦとの結合に関与する領域を構成するアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを指す。該ＤＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ
受容体のＣＲＨ領域を含むリガンド結合領域をコードし
ており、ＣＲＨ領域とＩｇ領域を含むリガンド結合領域
をコードするＤＮＡもこの定義に含まれる。上記の蛋白
質に関する定義と同様に、該ＤＮＡは天然のリガンド結
合領域蛋白質をコードするもののみならず、当業者既知
の方法で得られた該蛋白質の誘導体をコードするＤＮＡ
をも包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。
質をコードするＤＮＡとは、Ｇ−ＣＳＦ受容体の内、Ｇ
−ＣＳＦとの結合に関与する領域を構成するアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを指す。該ＤＮＡは、Ｇ−ＣＳＦ
受容体のＣＲＨ領域を含むリガンド結合領域をコードし
ており、ＣＲＨ領域とＩｇ領域を含むリガンド結合領域
をコードするＤＮＡもこの定義に含まれる。上記の蛋白
質に関する定義と同様に、該ＤＮＡは天然のリガンド結
合領域蛋白質をコードするもののみならず、当業者既知
の方法で得られた該蛋白質の誘導体をコードするＤＮＡ
をも包含する。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ、合成ＤＮＡのい
ずれでもよい。
【００２５】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＩg−ＣＲＨ領域と
は、イムノグロブリン様領域とサイトカイン受容体相補
領域を指し、本明細書では特記しない限り、該領域のタ
ンパク質、その誘導体をも表す。該領域およびそれのシ
グナル配列に対応するアミノ酸配列はマウス[配列表の
配列番号１;福永ら，Ｃell ６１，３４１−３５０(１
９９０)]およびヒト[配列表の配列番号２；福永ら，Ｐr
oc．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ．８７，８７０２−８
７０６(１９９０)]について既知である。シグナル配列
とは当該業者であればよく知られているように、細胞外
蛋白質が細胞内より細胞外へ分泌する時に必要とするア
ミノ酸配列である。これは分泌蛋白質のＮ末端に連結し
ており、細胞外への蛋白質の分泌に伴い切断除去され
る。この配列は、配列番号１では１番のメチオニンから
２５番目のセリン、配列番号２では１番のメチオニンか
ら２３番目のロイシンに対応すると考えられている。本
明細書では、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域およ
びＩg−ＣＲＨ領域に対応する領域の相補ＤＮＡを用い
てリガンド結合領域蛋白質の発現を示したが、合成ＤＮ
Ａでもよい。当業者ならば容易に理解するように、コド
ンの異なるＤＮＡであっても、本発明の蛋白質のアミノ
酸配列をコードする限り、本発明の範囲に含まれる。ま
た、ヒト由来のものであってもよく、実施例の記載に限
定されない。
は、イムノグロブリン様領域とサイトカイン受容体相補
領域を指し、本明細書では特記しない限り、該領域のタ
ンパク質、その誘導体をも表す。該領域およびそれのシ
グナル配列に対応するアミノ酸配列はマウス[配列表の
配列番号１;福永ら，Ｃell ６１，３４１−３５０(１
９９０)]およびヒト[配列表の配列番号２；福永ら，Ｐr
oc．Ｎatl．Ａcad，Ｓci．ＵＳＡ．８７，８７０２−８
７０６(１９９０)]について既知である。シグナル配列
とは当該業者であればよく知られているように、細胞外
蛋白質が細胞内より細胞外へ分泌する時に必要とするア
ミノ酸配列である。これは分泌蛋白質のＮ末端に連結し
ており、細胞外への蛋白質の分泌に伴い切断除去され
る。この配列は、配列番号１では１番のメチオニンから
２５番目のセリン、配列番号２では１番のメチオニンか
ら２３番目のロイシンに対応すると考えられている。本
明細書では、マウスＧ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨ領域およ
びＩg−ＣＲＨ領域に対応する領域の相補ＤＮＡを用い
てリガンド結合領域蛋白質の発現を示したが、合成ＤＮ
Ａでもよい。当業者ならば容易に理解するように、コド
ンの異なるＤＮＡであっても、本発明の蛋白質のアミノ
酸配列をコードする限り、本発明の範囲に含まれる。ま
た、ヒト由来のものであってもよく、実施例の記載に限
定されない。
【００２６】配列番号１に記載のアミノ酸配列をコード
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７[福永
ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)]に組み込
まれている。このプラスミッドpＢＬＪ１７はＦＥＲＭ
ＢＰ−３３１２(寄託日平成２年３月９日)の下で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる、Ｅscherichia coli Ｋ１２株から入手可能であ
る。
している相補ＤＮＡはプラスミッドpＢＬＪ１７[福永
ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９０)]に組み込
まれている。このプラスミッドpＢＬＪ１７はＦＥＲＭ
ＢＰ−３３１２(寄託日平成２年３月９日)の下で通商
産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されて
いる、Ｅscherichia coli Ｋ１２株から入手可能であ
る。
【００２７】Ｇ−ＣＳＦ受容体のＩg−ＣＲＨ領域と
は、具体的には上記の福永らの開示した配列において、
マウスＧ−ＣＳＦ受容体では、１番目のシステインから
３０９番目のアラニンに至る部分を指す(配列番号１に
おいては、それぞれ２６番目のシステインと３３４番目
のアラニンに相当する)。同様に、ヒトＧ−ＣＳＦ受容
体では、１番目のグルタミン酸から３１０番目のアラニ
ン(配列番号２ではそれぞれ２４番目のグルタミン酸と
３３３番目のアラニンに相当する)に至る領域とされて
いる。
は、具体的には上記の福永らの開示した配列において、
マウスＧ−ＣＳＦ受容体では、１番目のシステインから
３０９番目のアラニンに至る部分を指す(配列番号１に
おいては、それぞれ２６番目のシステインと３３４番目
のアラニンに相当する)。同様に、ヒトＧ−ＣＳＦ受容
体では、１番目のグルタミン酸から３１０番目のアラニ
ン(配列番号２ではそれぞれ２４番目のグルタミン酸と
３３３番目のアラニンに相当する)に至る領域とされて
いる。
【００２８】また、ＣＲＨ領域についてはマウスＧ−Ｃ
ＳＦ受容体では、９７番目のチロシンから３０９番目の
アラニンに至る部分を指す(配列番号１においては、そ
れぞれ１２２番目のチロシンと３３４番目のアラニンに
相当する)。同様にヒトＧ−ＣＳＦ受容体では、９８番
目のチロシンから３１０番目のアラニン(配列番号２で
はそれぞれ１２１番目のチロシンから３３３番目のアラ
ニンに相当する)に至る領域とされる。
ＳＦ受容体では、９７番目のチロシンから３０９番目の
アラニンに至る部分を指す(配列番号１においては、そ
れぞれ１２２番目のチロシンと３３４番目のアラニンに
相当する)。同様にヒトＧ−ＣＳＦ受容体では、９８番
目のチロシンから３１０番目のアラニン(配列番号２で
はそれぞれ１２１番目のチロシンから３３３番目のアラ
ニンに相当する)に至る領域とされる。
【００２９】しかしながら、ＣＲＨ領域およびＩg−Ｃ
ＲＨ領域の開始部位および終了部位は必ずしも、本発明
にとって厳密でなく、該ＣＲＨ領域およびＩｇ−ＣＲＨ
領域全体の立体構造に大きな影響を与えることはない。
その機能が保持されることを条件として、Ｎ末端および
／またはＣ末端が、数残基いずれかの方向にずれたも
の、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端に数残基の
アミノ酸が付加したものも包含される。現に、Ｉｇ−Ｃ
ＲＨ領域のＮ末端は１番目のアミノ酸はマウスではシス
テインであるが、アミノ酸の相同性よりこのシステイン
に対応する残基はヒトでは３番目のシステインとなる。
つまり厳密にどこが第１番目のアミノ酸かは完全に決定
されたものではない。またＣ末端に関しては、通常、こ
のような一次構造上の僅かな差異はＩg−ＣＲＨ領域全
体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると
考えられる。
ＲＨ領域の開始部位および終了部位は必ずしも、本発明
にとって厳密でなく、該ＣＲＨ領域およびＩｇ−ＣＲＨ
領域全体の立体構造に大きな影響を与えることはない。
その機能が保持されることを条件として、Ｎ末端および
／またはＣ末端が、数残基いずれかの方向にずれたも
の、あるいは、Ｎ末端および／またはＣ末端に数残基の
アミノ酸が付加したものも包含される。現に、Ｉｇ−Ｃ
ＲＨ領域のＮ末端は１番目のアミノ酸はマウスではシス
テインであるが、アミノ酸の相同性よりこのシステイン
に対応する残基はヒトでは３番目のシステインとなる。
つまり厳密にどこが第１番目のアミノ酸かは完全に決定
されたものではない。またＣ末端に関しては、通常、こ
のような一次構造上の僅かな差異はＩg−ＣＲＨ領域全
体の立体構造に大きな影響を与えず、機能は保たれると
考えられる。
【００３０】また、ＣＲＨ領域についても、後述の実施
例では、Ｉｇ−ＣＲＨ領域全体からＩｇ領域のかなりの
部分を欠失したＤＮＡ配列(配列番号５に示す)を用いて
発現させている。この場合、昆虫細胞中で発現させる
と、ＣＲＨ領域に加えてＮ末端にＩｇ領域由来のアミノ
酸配列が残存して発現されることになる。しかしなが
ら、この残存するＩｇ領域部分は昆虫細胞内のプロテア
ーゼで容易に切断を受け、最終精製物は、チロシンから
始まるＣＲＨ領域に、数残基のアミノ酸が付加された形
の蛋白質となる。これは、ＣＲＨ領域がそれのみでは、
きちんとした立体構造を保持しているのに比べてＮ末端
に残存するＩｇ領域のアミノ酸配列のみでは、恐らくは
構造を保たず、その結果として、容易に昆虫細胞内のプ
ロテアーゼによって切断されやすい形で存在することに
起因すると考えられる。
例では、Ｉｇ−ＣＲＨ領域全体からＩｇ領域のかなりの
部分を欠失したＤＮＡ配列(配列番号５に示す)を用いて
発現させている。この場合、昆虫細胞中で発現させる
と、ＣＲＨ領域に加えてＮ末端にＩｇ領域由来のアミノ
酸配列が残存して発現されることになる。しかしなが
ら、この残存するＩｇ領域部分は昆虫細胞内のプロテア
ーゼで容易に切断を受け、最終精製物は、チロシンから
始まるＣＲＨ領域に、数残基のアミノ酸が付加された形
の蛋白質となる。これは、ＣＲＨ領域がそれのみでは、
きちんとした立体構造を保持しているのに比べてＮ末端
に残存するＩｇ領域のアミノ酸配列のみでは、恐らくは
構造を保たず、その結果として、容易に昆虫細胞内のプ
ロテアーゼによって切断されやすい形で存在することに
起因すると考えられる。
【００３１】さらに、本発明のリガンド結合領域蛋白質
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。
をコードするＤＮＡの配列を用い、当業者周知の方法で
１またはそれ以上のヌクレオチドの欠失、挿入または置
換により修飾することにより、該ＤＮＡがコードするリ
ガンド結合領域蛋白質を構成するアミノ酸やペプチドを
修飾し、天然のリガンド結合領域蛋白質と同等またはそ
れ以上の望ましい生物学的特性を有する、ヒト由来の、
あるいはその他の哺乳動物由来の、改良されたリガンド
結合蛋白質を製造することができる。望ましい性質とは
個々の目的により異なるが、高いＧ−ＣＳＦとの結合活
性、Ｇ−ＣＳＦとＧ−ＣＳＦ受容体の結合を阻害する活
性等が含まれる。従って、そのような方法で改変された
ＤＮＡも本発明の範囲に包含される。
【００３２】発現のためには、目的部分を暗号化するＤ
ＮＡ断片に、細胞外への分泌産生のための、シグナルペ
プチド部分をも含有させておけば、作られたリガンド結
合領域蛋白質は、細胞外へ分泌される。このシグナル配
列は天然のＧ−ＣＳＦ受容体遺伝子にも含まれ、マウス
受容体では−２５番目のメチオニンから−１番目のセリ
ン(配列番号１で１番目のメチオニンから２５番目のセ
リンに相当する)、ヒト受容体では、−２３番目のメチ
オニンから−１番目のロイシン(配列番号２で１番目の
メチオニンから２３番目のロイシンに相当する)であ
る。後述するマウス受容体の発現では、天然のそれに対
応するものを用いているが、昆虫細胞由来、あるいは動
物細胞由来の他の蛋白質のシグナル配列も用いることが
出来る。
ＮＡ断片に、細胞外への分泌産生のための、シグナルペ
プチド部分をも含有させておけば、作られたリガンド結
合領域蛋白質は、細胞外へ分泌される。このシグナル配
列は天然のＧ−ＣＳＦ受容体遺伝子にも含まれ、マウス
受容体では−２５番目のメチオニンから−１番目のセリ
ン(配列番号１で１番目のメチオニンから２５番目のセ
リンに相当する)、ヒト受容体では、−２３番目のメチ
オニンから−１番目のロイシン(配列番号２で１番目の
メチオニンから２３番目のロイシンに相当する)であ
る。後述するマウス受容体の発現では、天然のそれに対
応するものを用いているが、昆虫細胞由来、あるいは動
物細胞由来の他の蛋白質のシグナル配列も用いることが
出来る。
【００３３】このＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領
域、特にＩg−ＣＲＨ領域およびＣＲＨ領域の蛋白質を
コードするＤＮＡ断片を、昆虫細胞を宿主として発現さ
せるためには、あらかじめ、このＤＮＡ断片を遺伝子発
現系と連結しておく必要がある。昆虫細胞の遺伝子発現
系としては、昆虫を宿主とするバキュロウイルスの一種
である核多角体病ウイルス(Ｎuclear Ｐolyhedrosis
virus：ＮＰＶ)の発現系が知られており、Ａutographa
Ｃalifornica ＮＰＶ(ＡcＮＰＶ)とＢombyx moriＮ
ＰＶ(ＢmＮＰＶ)の２種類がある。宿主としては、蛾由
来の細胞を用いてＡcＮＰＶの場合は細胞Ｓpodoptera
frugiperda(Ｓ．f．細胞)、あるいはＴrichoplusia ni
(ＴＮ細胞)を、またＢmＮＰＶの場合は、細胞Ｂomb yx
mori Ｎ(ＢmＮ細胞)を用いる。両バキュロウイルス
は、ともに多角体遺伝子を含み、それは強い多角体プロ
モーターの支配下にある。従ってこれらのウイルスベク
ターを用いて発現させる場合には、この多角体プロモー
ターの下流に所望の遺伝子を挿入した組換え型バキュロ
ウイルスを調製し、これを宿主細胞に感染させた後培養
し、目的とする蛋白質を発現させる。この発現ウイルス
ベクターの調製に際しては、このウイルスが約１３０キ
ロ塩基対と大きいため、直接、それに目的とする遺伝子
を挿入することが出来ない。そこで、実際の手順として
は、まず、遺伝子発現制御領域、つまり多角体プロモー
ターを含む多角体遺伝子部分のみを切り出し、これを大
腸菌を宿主とするベクター、例えばpＵＣ８に挿入した
転位ベクターを使用する。
域、特にＩg−ＣＲＨ領域およびＣＲＨ領域の蛋白質を
コードするＤＮＡ断片を、昆虫細胞を宿主として発現さ
せるためには、あらかじめ、このＤＮＡ断片を遺伝子発
現系と連結しておく必要がある。昆虫細胞の遺伝子発現
系としては、昆虫を宿主とするバキュロウイルスの一種
である核多角体病ウイルス(Ｎuclear Ｐolyhedrosis
virus：ＮＰＶ)の発現系が知られており、Ａutographa
Ｃalifornica ＮＰＶ(ＡcＮＰＶ)とＢombyx moriＮ
ＰＶ(ＢmＮＰＶ)の２種類がある。宿主としては、蛾由
来の細胞を用いてＡcＮＰＶの場合は細胞Ｓpodoptera
frugiperda(Ｓ．f．細胞)、あるいはＴrichoplusia ni
(ＴＮ細胞)を、またＢmＮＰＶの場合は、細胞Ｂomb yx
mori Ｎ(ＢmＮ細胞)を用いる。両バキュロウイルス
は、ともに多角体遺伝子を含み、それは強い多角体プロ
モーターの支配下にある。従ってこれらのウイルスベク
ターを用いて発現させる場合には、この多角体プロモー
ターの下流に所望の遺伝子を挿入した組換え型バキュロ
ウイルスを調製し、これを宿主細胞に感染させた後培養
し、目的とする蛋白質を発現させる。この発現ウイルス
ベクターの調製に際しては、このウイルスが約１３０キ
ロ塩基対と大きいため、直接、それに目的とする遺伝子
を挿入することが出来ない。そこで、実際の手順として
は、まず、遺伝子発現制御領域、つまり多角体プロモー
ターを含む多角体遺伝子部分のみを切り出し、これを大
腸菌を宿主とするベクター、例えばpＵＣ８に挿入した
転位ベクターを使用する。
【００３４】後述のように、転位ベクターとしてはＩｇ
−ＣＲＨ領域の発現では、ｐＡｃＹＭ１、ＣＲＨ領域の
発現では、ｐＶＬ１３９３を用いているが、類似のベク
ターは多数あり、これに拘束されるものではない。
−ＣＲＨ領域の発現では、ｐＡｃＹＭ１、ＣＲＨ領域の
発現では、ｐＶＬ１３９３を用いているが、類似のベク
ターは多数あり、これに拘束されるものではない。
【００３５】次いで目的とする遺伝子を転位ベクター中
の多角体プロモーターの下流へ挿入する。続いてこの目
的遺伝子を組み込んだ転位ベクターＤＮＡを、野性型バ
キュロウイルスゲノムＤＮＡと共に昆虫細胞に同時に移
入して培養し、昆虫細胞中で、細胞内ＤＮＡ組換えをお
こさせることで組換え型バキュロウイルスを得る。この
場合に昆虫細胞へのＤＮＡの移入においても、Ｉｇ−Ｃ
ＲＨ領域の発現ではカルシウムリン酸法、ＣＲＨ領域の
発現ではリポフェクチン法を用いているが、本質的に両
者に差はない。また、転位ベクターとして移入するバキ
ュロウイルスゲノムＤＮＡについても、Ｉｇ−ＣＲＨ領
域の発現では野生型バキュロウイルスゲノムＤＮＡ、Ｃ
ＲＨ領域の発現では変異ゲノムＤＮＡであるバキュロゴ
ールドＤＮＡを用いるがその間に本質的な差はない。
の多角体プロモーターの下流へ挿入する。続いてこの目
的遺伝子を組み込んだ転位ベクターＤＮＡを、野性型バ
キュロウイルスゲノムＤＮＡと共に昆虫細胞に同時に移
入して培養し、昆虫細胞中で、細胞内ＤＮＡ組換えをお
こさせることで組換え型バキュロウイルスを得る。この
場合に昆虫細胞へのＤＮＡの移入においても、Ｉｇ−Ｃ
ＲＨ領域の発現ではカルシウムリン酸法、ＣＲＨ領域の
発現ではリポフェクチン法を用いているが、本質的に両
者に差はない。また、転位ベクターとして移入するバキ
ュロウイルスゲノムＤＮＡについても、Ｉｇ−ＣＲＨ領
域の発現では野生型バキュロウイルスゲノムＤＮＡ、Ｃ
ＲＨ領域の発現では変異ゲノムＤＮＡであるバキュロゴ
ールドＤＮＡを用いるがその間に本質的な差はない。
【００３６】さらに得られた組換え型バキュロウイルス
を幼虫に感染させ、幼虫より目的物を抽出する方法もあ
る。本明細書では、ＡcＮＰＶベクター系を用い、Ｓ．
f．細胞により組換え型バキュロウイルスを得て、さら
にそれをＴＮ細胞へ感染し、培養後目的物を培養液およ
び細胞より抽出する方法について述べているが、本発明
はこれに限定されるものではない。シグナル配列および
リガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子はポリメラ
ーゼチェインリアクション法(以下ＰＣＲと略す)によっ
て取り出すことが出来る。後述の実施例の中で用いられ
る大腸菌を用いての遺伝操作法に関しては、成書(Ｍani
atisら(１９８２)、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborato
ry)など最近の多くの実験書に詳述されている。バキュ
ロウイルスおよびその宿主を用いての実験に関しては、
成書[ＳummersとＳmith(１９８７)，Ａ manual of m
ethods for baculovirus vectors and insect ce
ll culture procedures.，Ｔexas Ａgricultural
Ｅxperiment Ｓtation Ｂulletin Ｎo．１５５５,Ｔ
exas Ａ＆Ｍ Ｕnieversity]あるいは[前田(１９８
９)、実験医学、７巻、１４６−１５１頁]にその手技に
ついて詳しい記述がなされている。
を幼虫に感染させ、幼虫より目的物を抽出する方法もあ
る。本明細書では、ＡcＮＰＶベクター系を用い、Ｓ．
f．細胞により組換え型バキュロウイルスを得て、さら
にそれをＴＮ細胞へ感染し、培養後目的物を培養液およ
び細胞より抽出する方法について述べているが、本発明
はこれに限定されるものではない。シグナル配列および
リガンド結合領域蛋白質をコードする遺伝子はポリメラ
ーゼチェインリアクション法(以下ＰＣＲと略す)によっ
て取り出すことが出来る。後述の実施例の中で用いられ
る大腸菌を用いての遺伝操作法に関しては、成書(Ｍani
atisら(１９８２)、Ｍolecular Ｃloning：Ａ Ｌabor
atory Ｍanual，Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborato
ry)など最近の多くの実験書に詳述されている。バキュ
ロウイルスおよびその宿主を用いての実験に関しては、
成書[ＳummersとＳmith(１９８７)，Ａ manual of m
ethods for baculovirus vectors and insect ce
ll culture procedures.，Ｔexas Ａgricultural
Ｅxperiment Ｓtation Ｂulletin Ｎo．１５５５,Ｔ
exas Ａ＆Ｍ Ｕnieversity]あるいは[前田(１９８
９)、実験医学、７巻、１４６−１５１頁]にその手技に
ついて詳しい記述がなされている。
【００３７】組換え型バキュロウイルスを感染させた宿
主細胞は公知のＳf−９００ＩＩＳＦＭ培地(ＧＩＢＣ
Ｏ)で行うことが出来る。得られた培養液から細胞を除
いた後、Ｇ−ＣＳＦをリガンドとしたアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィー、ゲル濾過ＨＰＬＣにかけるこ
とにより純粋なＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域を
得ることが出来る。アフィニティーカラムは福永ら
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６５,１４００８−１４０１５
(１９９０))の方法により作成することが出来る。得ら
れた発現産物は、挿入したＤＮＡがコードするアミノ酸
配列から予測される分子量より大きい。これは、産物へ
の糖鎖の付加を示すものである。現に糖生合成の阻害剤
であるツニカマイシンの存在下では、ほぼアミノ酸配列
より予測された分子量の発現産物を得る。
主細胞は公知のＳf−９００ＩＩＳＦＭ培地(ＧＩＢＣ
Ｏ)で行うことが出来る。得られた培養液から細胞を除
いた後、Ｇ−ＣＳＦをリガンドとしたアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィー、ゲル濾過ＨＰＬＣにかけるこ
とにより純粋なＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域を
得ることが出来る。アフィニティーカラムは福永ら
(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６５,１４００８−１４０１５
(１９９０))の方法により作成することが出来る。得ら
れた発現産物は、挿入したＤＮＡがコードするアミノ酸
配列から予測される分子量より大きい。これは、産物へ
の糖鎖の付加を示すものである。現に糖生合成の阻害剤
であるツニカマイシンの存在下では、ほぼアミノ酸配列
より予測された分子量の発現産物を得る。
【００３８】アフィニティーカラムの作成あるいはＧ−
ＣＳＦ受容体のリガンド結合活性の測定に用いる非放射
能標識のＧ−ＣＳＦに関しては、キリンビール(株)より
供与されたものを用いたが、天然のＧ−ＣＳＦあるいは
福永ら(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６５,１４００８−１４０
１５(１９９０)]に記載された方法で精製されたものも
使用出来、ここで記載されたものに限定されない。
ＣＳＦ受容体のリガンド結合活性の測定に用いる非放射
能標識のＧ−ＣＳＦに関しては、キリンビール(株)より
供与されたものを用いたが、天然のＧ−ＣＳＦあるいは
福永ら(Ｊ．Ｂiol．Ｃhem．２６５,１４００８−１４０
１５(１９９０)]に記載された方法で精製されたものも
使用出来、ここで記載されたものに限定されない。
【００３９】
【実施例】実施例１ 転位ベクターpＡcＩg−ＣＲＨプラスミッド
の構築 ＡcＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を含む
転位ベクターpＡcＹＭ１(松浦ら、Ｊ．Ｇen．Ｖirol.
(１９８７),６８,１２３３−１２５０)の多角体プロモ
ーターの下流にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
(以下、Ｉg−ＣＲＨ領域と略す)をコードするＤＮＡを
挿入する。
の構築 ＡcＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を含む
転位ベクターpＡcＹＭ１(松浦ら、Ｊ．Ｇen．Ｖirol.
(１９８７),６８,１２３３−１２５０)の多角体プロモ
ーターの下流にＧ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域
(以下、Ｉg−ＣＲＨ領域と略す)をコードするＤＮＡを
挿入する。
【００４０】公知のマウスＧ−ＣＳＦ受容体のアミノ酸
配列[福永ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９
０)]を基に、本発明のＩg−ＣＲＨ領域蛋白質をコード
するＤＮＡを、配列番号１の、Ｇ−ＣＳＦ受容体の２６
番システインから３３４番アラニンをコードする蛋白質
とし、設計した。このＩg−ＣＲＨ領域の発現におい
て、発現物が培養液中に分泌されるように、Ｉg−ＣＲ
Ｈ領域をコードするＤＮＡの調製に際しては、さらに以
下の付加がなされている。つまり、そのＮ末端にはシグ
ナル配列に対応する１番メチオニンから２５番セリンを
コードする配列が連結され、Ｃ末端には、蛋白合成の終
結コドンＴＡＡが付加されている。該ＤＮＡ断片を、ベ
クターpＡcＹＭ１に挿入するため、さらにそのＮ末端側
およびＣ末端側を延長し、その延長部に制限酵素ＢamＨ
Ｉ認識部位が形成されるように工夫されている。
配列[福永ら，Ｃell，６１，３４１−３５０(１９９
０)]を基に、本発明のＩg−ＣＲＨ領域蛋白質をコード
するＤＮＡを、配列番号１の、Ｇ−ＣＳＦ受容体の２６
番システインから３３４番アラニンをコードする蛋白質
とし、設計した。このＩg−ＣＲＨ領域の発現におい
て、発現物が培養液中に分泌されるように、Ｉg−ＣＲ
Ｈ領域をコードするＤＮＡの調製に際しては、さらに以
下の付加がなされている。つまり、そのＮ末端にはシグ
ナル配列に対応する１番メチオニンから２５番セリンを
コードする配列が連結され、Ｃ末端には、蛋白合成の終
結コドンＴＡＡが付加されている。該ＤＮＡ断片を、ベ
クターpＡcＹＭ１に挿入するため、さらにそのＮ末端側
およびＣ末端側を延長し、その延長部に制限酵素ＢamＨ
Ｉ認識部位が形成されるように工夫されている。
【００４１】上記ＤＮＡ断片の実際の調製にはＰＣＲを
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号３及び配
列番号４に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次い
で、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−末端プ
ライマーpＢＬＪ１７ＤＮＡ(１ng)、１０×反応緩衝液
１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、
dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを加え
て最終の量を１００μlとする。ここで１０×反応緩衝
液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡ
ポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpのキットのものを使
用した。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー(型式
ＰＪ２０００,宝酒造)にセットし、９４℃,１分間熱処
理;３７℃２分間アニーリング;７２℃,３分間反応のサ
イクルプログラムで２５回反応を繰り返すことにより目
的のＤＮＡ断片を合成する。さらに、上記ＰＣＲ反応液
をフェノール処理することにより精製する。その精製Ｄ
ＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マ
グネシウムを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)
５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)５単位と共に３
７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。こ
の消化液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、
１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約１kbpのバン
ドを切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８
０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベ
ートして融解する。これを５０００回転で１０分間遠心
して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り
出す。続いて、上記ＤＮＡ断片を転位ベクターpＡｃＹ
Ｍ−１のＢamＨ部位に挿入する。
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号３及び配
列番号４に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。次い
で、２μＭのＮ−末端プライマー、２μＭのＣ−末端プ
ライマーpＢＬＪ１７ＤＮＡ(１ng)、１０×反応緩衝液
１０μl、各０.２５mＭのdＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、
dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリメラーゼ０.５μlを加え
て最終の量を１００μlとする。ここで１０×反応緩衝
液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡ
ポリメラーゼは宝酒造のＧeneＡmpのキットのものを使
用した。この反応液をＤＮＡサーマルサイクラー(型式
ＰＪ２０００,宝酒造)にセットし、９４℃,１分間熱処
理;３７℃２分間アニーリング;７２℃,３分間反応のサ
イクルプログラムで２５回反応を繰り返すことにより目
的のＤＮＡ断片を合成する。さらに、上記ＰＣＲ反応液
をフェノール処理することにより精製する。その精製Ｄ
ＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ食塩及び１０mＭ塩化マ
グネシウムを含む５０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)
５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)５単位と共に３
７℃で１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。こ
の消化液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、
１％アガロースゲルの電気泳動にかけ、約１kbpのバン
ドを切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８
０℃で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベ
ートして融解する。これを５０００回転で１０分間遠心
して、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノ
ール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り
出す。続いて、上記ＤＮＡ断片を転位ベクターpＡｃＹ
Ｍ−１のＢamＨ部位に挿入する。
【００４２】具体的には、約１μgのpＡｃＹＭ１ ＤＮ
Ａを５０mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１
０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さ
らにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)を加え
て、３７℃で１時間インキュベートすることにより、加
えたＤＮＡを消化する。次に、フェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
これを５mＭ塩化マグネシウムを含む０.１Ｍトリス塩酸
緩衝液(pＨ８.０)５０μlに溶解して、さらに３単位の
アルカリ性ホスファターゼ(アルカリフォスファター
ゼ、Ｅ.coliＣ７５;宝酒造)を加えて３７℃で１時間イ
ンキュベートすることにより、ＤＮＡの５'に付し、目
的とするＤＮＡを取り出す。１％アガロースゲルの電気
泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバンドを
切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。次にフェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取
り出す。
Ａを５０mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む１
０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、さ
らにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)を加え
て、３７℃で１時間インキュベートすることにより、加
えたＤＮＡを消化する。次に、フェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
これを５mＭ塩化マグネシウムを含む０.１Ｍトリス塩酸
緩衝液(pＨ８.０)５０μlに溶解して、さらに３単位の
アルカリ性ホスファターゼ(アルカリフォスファター
ゼ、Ｅ.coliＣ７５;宝酒造)を加えて３７℃で１時間イ
ンキュベートすることにより、ＤＮＡの５'に付し、目
的とするＤＮＡを取り出す。１％アガロースゲルの電気
泳動にかけて大きい方のＤＮＡ断片に相当するバンドを
切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。次にフェノール処理及びエタ
ノール沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取
り出す。
【００４３】続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混
合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６
℃で３０分間反応させる。さらに、これを１００μlの
大腸菌Ｋ１２株のコンピテントセルと混合し、０℃で３
０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすること
で大腸菌へ移入し、転位ベクターpＡcＩg−ＣＲＨプラ
スミッドを構築した。このプラスミッドを導入した大腸
菌Ｋ１２株／pＡcＩg−ＣＲＨは通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている(受託日：平成６
年１１月８日；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４６１８)
合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６
℃で３０分間反応させる。さらに、これを１００μlの
大腸菌Ｋ１２株のコンピテントセルと混合し、０℃で３
０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすること
で大腸菌へ移入し、転位ベクターpＡcＩg−ＣＲＨプラ
スミッドを構築した。このプラスミッドを導入した大腸
菌Ｋ１２株／pＡcＩg−ＣＲＨは通産省工業技術院生命
工学工業技術研究所に寄託されている(受託日：平成６
年１１月８日；受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１４６１８)
【００４４】実施例２ 組換え型ウイルスＡcＩg−ＣＲ
Ｈの作成 実施例１で得られたプラスミッドpＡcＩg−ＣＲＨ Ｄ
ＮＡより組換えバキュロウイルスを作成する。即ち、こ
のプラスミッドＤＮＡを野生型ＡcＮＰＶ ＤＮＡとと
もに、塩化カルシウム−リン酸沈澱法で昆虫細胞に移入
し、該細胞内における組換えにより組換えバキュロウイ
ルスを作成する。その概略を図１に示す。まず野生型バ
キュロウイルスＡcＮＰＶのＤＮＡ１μg[ＡcＮＰＶは
Ｍ．Ｄ．Ｓummers(Ｄepatrment of Ｅntomology，Ｔe
xas Ａgricultural ＥxperimentＳtation and Ｔex
as Ａ＆Ｍ Ｕniversity Ｃollege Ｓtation，Ｔexa
s，７７８４３−２４７５)より入手可能であり、そのＤ
ＮＡの抽出は前田の方法(実験医学Ｖo１７、Ｎo１３、
１４６−１５１、１９８９)による]とpＡcＩg−ＣＲＨ
ＤＮＡ２５μg(塩化セシウム密度勾配法で２回精製し
たもの)を塩化カルシウムを含むＨepes(ヘペス)−リン
酸緩衝液(pＨ７.０５)中で、沈澱させる。他方、昆虫細
胞Ｓpodoptera frugiperda９(Ａmerican Ｔype Ｃul
ture Ｃollection，１２３０１，Ｐarklawn Ｄrive，
Ｒockvlle，ＭＤ２０８５２・１７７６より入手可能、
以下Ｓ．f．９．と略す)を１０％牛胎児血清を含むグレ
ース培地(ギブコ社)で培養したもの(約１〜１.５×１０
6個／２ml)を３５mmの細胞培養用シャーレ(ファルコン
社３００１)に入れて１時間静置し、細胞を培養してお
く。次いで、この細胞上清を抜き取り、上記のＤＮＡ沈
澱物を滴下し、１時間静置する。さらに細胞上清を抜き
取り、新たに１０％牛胎児血清を含むグレース培地を２
ml加えて２６.５℃で４日間培養する。得られた培養液
には、野生型ＡcＮＰＶに加えて目的とする組換え型バ
キュロウイルスＡcＩg−ＣＲＨが含まれている。
Ｈの作成 実施例１で得られたプラスミッドpＡcＩg−ＣＲＨ Ｄ
ＮＡより組換えバキュロウイルスを作成する。即ち、こ
のプラスミッドＤＮＡを野生型ＡcＮＰＶ ＤＮＡとと
もに、塩化カルシウム−リン酸沈澱法で昆虫細胞に移入
し、該細胞内における組換えにより組換えバキュロウイ
ルスを作成する。その概略を図１に示す。まず野生型バ
キュロウイルスＡcＮＰＶのＤＮＡ１μg[ＡcＮＰＶは
Ｍ．Ｄ．Ｓummers(Ｄepatrment of Ｅntomology，Ｔe
xas Ａgricultural ＥxperimentＳtation and Ｔex
as Ａ＆Ｍ Ｕniversity Ｃollege Ｓtation，Ｔexa
s，７７８４３−２４７５)より入手可能であり、そのＤ
ＮＡの抽出は前田の方法(実験医学Ｖo１７、Ｎo１３、
１４６−１５１、１９８９)による]とpＡcＩg−ＣＲＨ
ＤＮＡ２５μg(塩化セシウム密度勾配法で２回精製し
たもの)を塩化カルシウムを含むＨepes(ヘペス)−リン
酸緩衝液(pＨ７.０５)中で、沈澱させる。他方、昆虫細
胞Ｓpodoptera frugiperda９(Ａmerican Ｔype Ｃul
ture Ｃollection，１２３０１，Ｐarklawn Ｄrive，
Ｒockvlle，ＭＤ２０８５２・１７７６より入手可能、
以下Ｓ．f．９．と略す)を１０％牛胎児血清を含むグレ
ース培地(ギブコ社)で培養したもの(約１〜１.５×１０
6個／２ml)を３５mmの細胞培養用シャーレ(ファルコン
社３００１)に入れて１時間静置し、細胞を培養してお
く。次いで、この細胞上清を抜き取り、上記のＤＮＡ沈
澱物を滴下し、１時間静置する。さらに細胞上清を抜き
取り、新たに１０％牛胎児血清を含むグレース培地を２
ml加えて２６.５℃で４日間培養する。得られた培養液
には、野生型ＡcＮＰＶに加えて目的とする組換え型バ
キュロウイルスＡcＩg−ＣＲＨが含まれている。
【００４５】この培養液からＡcＩg−ＣＲＨを取り出す
ためにプラークアッセイを行う。まず、前記と同様に生
育させたＳ．f．９細胞(１０6個／３５mmシャーレ)の培
地を抜き取り、約４倍から１万倍に希釈した培養液０.
１mlを加える。約１時間静置後、培養液を抜き取り、１
％アガロース溶液[３％アガロース(低融点シープラーク
アガロース、エフ・エムシー社)と１０％牛胎児血清を
含むグレース培地を１対２で混合し、３７℃に保温した
もの]を１ml重層する。アガロースの固化後、１mlの１
０％牛胎児血清を含むグレース培地をさらに重層し、２
６.５℃で４日間、保温し、ウイルスプラークを生じさ
せる。生じたプラークの中で、中心が透明なものをピペ
ットの先などでアガロースごとすい上げ、１mlの１０％
牛胎児血清を含むグレース培地に懸濁して単離する(野
生型ウイルスはプラークの中心に白い濁りがあり、組換
え型は、透明である)。透明なプラークが見い出しにく
い時は、プラークが判別しやすいように適当な濃度に、
もとの培養液を希釈しなおして、プラークアッセイをや
りなおす。ひろい上げた透明プラークのプラーク懸濁液
は、それぞれ１００倍から１０００倍程度に希釈して、
その０.２mlを上記と同様な方法でＳ．f．９細胞に重層
することでプラークアッセイを繰り返し、他の野生型ウ
イルス等のプラークの混りのないものとする。こうして
単離したものが組換え型バキュロウイルスＡcＩg−ＣＲ
Ｈである。
ためにプラークアッセイを行う。まず、前記と同様に生
育させたＳ．f．９細胞(１０6個／３５mmシャーレ)の培
地を抜き取り、約４倍から１万倍に希釈した培養液０.
１mlを加える。約１時間静置後、培養液を抜き取り、１
％アガロース溶液[３％アガロース(低融点シープラーク
アガロース、エフ・エムシー社)と１０％牛胎児血清を
含むグレース培地を１対２で混合し、３７℃に保温した
もの]を１ml重層する。アガロースの固化後、１mlの１
０％牛胎児血清を含むグレース培地をさらに重層し、２
６.５℃で４日間、保温し、ウイルスプラークを生じさ
せる。生じたプラークの中で、中心が透明なものをピペ
ットの先などでアガロースごとすい上げ、１mlの１０％
牛胎児血清を含むグレース培地に懸濁して単離する(野
生型ウイルスはプラークの中心に白い濁りがあり、組換
え型は、透明である)。透明なプラークが見い出しにく
い時は、プラークが判別しやすいように適当な濃度に、
もとの培養液を希釈しなおして、プラークアッセイをや
りなおす。ひろい上げた透明プラークのプラーク懸濁液
は、それぞれ１００倍から１０００倍程度に希釈して、
その０.２mlを上記と同様な方法でＳ．f．９細胞に重層
することでプラークアッセイを繰り返し、他の野生型ウ
イルス等のプラークの混りのないものとする。こうして
単離したものが組換え型バキュロウイルスＡcＩg−ＣＲ
Ｈである。
【００４６】実施例３ ＡcＩg−ＣＲＨを用いたＩｇ−
ＣＲＨ領域の分泌発現 組換え体ウイルスＡcＩg−ＣＲＨをＴＮ細胞(Ｉnvitrog
en；ＨＩＧＨ ＦＩＶＥTMＣＥＬＬＳ)をＳf−９００Ｉ
Ｉ ＳＦＭ培地(ＧＩＢＣＯ社)で２２５−cm2フラスコ
(Ｃoastar)を用いてコンフルエントまで増殖させた後、
同培地で１０倍に希釈後、２７℃で１日培養する。これ
に組換え型ウイルスＡcＩg−ＣＲＨを添加して(ＭＯＩ
１〜１０)１８℃で９日間培養して培養液を回収し
た。
ＣＲＨ領域の分泌発現 組換え体ウイルスＡcＩg−ＣＲＨをＴＮ細胞(Ｉnvitrog
en；ＨＩＧＨ ＦＩＶＥTMＣＥＬＬＳ)をＳf−９００Ｉ
Ｉ ＳＦＭ培地(ＧＩＢＣＯ社)で２２５−cm2フラスコ
(Ｃoastar)を用いてコンフルエントまで増殖させた後、
同培地で１０倍に希釈後、２７℃で１日培養する。これ
に組換え型ウイルスＡcＩg−ＣＲＨを添加して(ＭＯＩ
１〜１０)１８℃で９日間培養して培養液を回収し
た。
【００４７】培養液中へのＩg−ＣＲＨの分泌産生は、
ウエスタンブロット法でも検出出来る。ウエスタンブロ
ット法は成書(続生化学実験講座第１巻、日本生化学全
編、東京化学同人)などに記載された方法で行うことが
出来る。ここではバイオラッド社のキット(Ｉmmun−Ｂl
ot，Ｇoat Ａnti−Ｒabbit ＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)Ａlkaline
Ｐhosphatase Ｃonjugate)を使用しており、手順も
それに添付されているものに従って行なった。具体的に
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで培養液(約１０μl)を泳動させ
た後、それをセルロースアセテートメンブレン(Ｓchlei
cher & Ｓchchuell社;ＢＡ８５)へ転位させる。同メ
ンブレンは抗Ｇ−ＣＳＦ受容体ＣＲＨ抗体(抗Ｍ１血清;
大阪バイオサイエンス研究所の長田氏より供与)を含む
トリス緩衝液ｐＨ７.５中でインキュベーション後、さ
らに抗ウサギＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)−アルカリホスファターゼ
コンジュゲートに作用させ、同メンブレン上のバンドと
してＩｇ−ＣＲＨを検出する。
ウエスタンブロット法でも検出出来る。ウエスタンブロ
ット法は成書(続生化学実験講座第１巻、日本生化学全
編、東京化学同人)などに記載された方法で行うことが
出来る。ここではバイオラッド社のキット(Ｉmmun−Ｂl
ot，Ｇoat Ａnti−Ｒabbit ＩgＧ(Ｈ＋Ｌ)Ａlkaline
Ｐhosphatase Ｃonjugate)を使用しており、手順も
それに添付されているものに従って行なった。具体的に
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで培養液(約１０μl)を泳動させ
た後、それをセルロースアセテートメンブレン(Ｓchlei
cher & Ｓchchuell社;ＢＡ８５)へ転位させる。同メ
ンブレンは抗Ｇ−ＣＳＦ受容体ＣＲＨ抗体(抗Ｍ１血清;
大阪バイオサイエンス研究所の長田氏より供与)を含む
トリス緩衝液ｐＨ７.５中でインキュベーション後、さ
らに抗ウサギＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)−アルカリホスファターゼ
コンジュゲートに作用させ、同メンブレン上のバンドと
してＩｇ−ＣＲＨを検出する。
【００４８】その結果、約４５キロダルトンに対応する
位置にＩg−ＣＲＨのバンドが検出され、これは移入し
たＤＮＡでコードされるアミノ酸配列から予想される値
より大きい。これは生産されたＩg−ＣＲＨに糖鎖が付
加されていることを示唆するものであり、実際に、糖鎖
の生合成の阻害剤であるツニカマイシンを添加すると、
この約４５キロダルトンのバンドは消失し、約４０−４
２キロダルトンのバンドが現れる。これは、ほぼアミノ
酸配列から予想されるバンドの大きさに対応する。この
ことは４５キロダルトンのバンドには糖鎖が付加してい
ることを裏付けるものである。
位置にＩg−ＣＲＨのバンドが検出され、これは移入し
たＤＮＡでコードされるアミノ酸配列から予想される値
より大きい。これは生産されたＩg−ＣＲＨに糖鎖が付
加されていることを示唆するものであり、実際に、糖鎖
の生合成の阻害剤であるツニカマイシンを添加すると、
この約４５キロダルトンのバンドは消失し、約４０−４
２キロダルトンのバンドが現れる。これは、ほぼアミノ
酸配列から予想されるバンドの大きさに対応する。この
ことは４５キロダルトンのバンドには糖鎖が付加してい
ることを裏付けるものである。
【００４９】実施例４ Ｇ−ＣＳＦ受容体のＩg−ＣＲ
Ｈ領域の精製 培養液中のＧ−ＣＳＦ受容体はＧ−ＣＳＦをリガンドと
したＧ−ＣＳＦ−アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで精製出来る。Ｇ−ＣＳＦ−アフィニティーカラム
クロマトグラフィーの作製法は、福永ら[Ｊ．Ｂiol．Ｃ
hem.，２６５,１４００８−１４０１５]に従った。具体
的には、１０ｍｇのヒトＧ−ＣＳＦ(キリンビール社よ
り供与)を０.５Ｍ食塩を含む０.１Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８.０）中で０.４ｇのＡＦ−Ｔresyl−
Ｔoyopearlゲルレジン(トソー)と混合し、最終液量を約
２ｍｌとして、室温で４時間撹拌する。さらに４℃で一
晩撹拌した後、同ゲルレジンは０.５Ｍ食塩を含む０.１
Ｍトリス緩衝液(ｐＨ８.０)でさらに３時間、室温で撹
拌する。最後に、ＰＢＳリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄
することにより作成される。
Ｈ領域の精製 培養液中のＧ−ＣＳＦ受容体はＧ−ＣＳＦをリガンドと
したＧ−ＣＳＦ−アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィーで精製出来る。Ｇ−ＣＳＦ−アフィニティーカラム
クロマトグラフィーの作製法は、福永ら[Ｊ．Ｂiol．Ｃ
hem.，２６５,１４００８−１４０１５]に従った。具体
的には、１０ｍｇのヒトＧ−ＣＳＦ(キリンビール社よ
り供与)を０.５Ｍ食塩を含む０.１Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ８.０）中で０.４ｇのＡＦ−Ｔresyl−
Ｔoyopearlゲルレジン(トソー)と混合し、最終液量を約
２ｍｌとして、室温で４時間撹拌する。さらに４℃で一
晩撹拌した後、同ゲルレジンは０.５Ｍ食塩を含む０.１
Ｍトリス緩衝液(ｐＨ８.０)でさらに３時間、室温で撹
拌する。最後に、ＰＢＳリン酸緩衝化生理食塩水で洗浄
することにより作成される。
【００５０】即ち、実施例３で調製したＡcＩg−ＣＲＨ
に感染させた細胞培養液(約１ｌ)をＧ−ＣＳＦアフィニ
ティーカラム(１×５cm)に添加する。添加後、ＰＢＳリ
ン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、０.２Ｍ食塩を含む０.
１Ｍグリシン塩酸緩衝液で溶出する。溶出蛋白質は、２
Ｍのトリズマ塩基でただちに中和する。次にこれを０.
２Ｍ食塩を含む２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化したゲル濾過ＨＰＬＣ(内径７.６mm×６０cm；ＴＳＫ
ＧＥＬ Ｇ３０００ ＳＷＨＰＬＣカラム、東ソー)
に添加して、同緩衝液で溶出する。溶出蛋白質の大部分
は８５kＤaの部分に溶出される。この８５kＤaのピーク
はＳＤＳ−ＰＡＧＥでは４５kＤaの単一のバンドとな
り、ウエスタンブロットでも染ることから目的とするＩ
g−ＣＲＨ領域の二量体と考えられる。またＮ末端アミ
ノ酸シークエンス法によると、この標品のＮ末端はＣys
−Ｇly−Ｈis−Ｉle−Ｓer−Ｐro−Ｐro−で、これは福
永ら[Ｃell、 前掲]の示したＩg−ＣＲＨ領域のＮ末端
配列と予想される配列と一致するものであった。また８
５kＤaピークの他に二つの小さなピークが４５kＤaと２
００−２５０kＤaの位置に溶出されるが、これらもＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでは単一の４５kＤaバンドを示し、ウエス
タンブロットでも染ることから、Ｉg−ＣＲＨ領域蛋白
質の単量体(４５kＤa)と四量体(２００−２５０kＤa)で
あると考えられる。発現量は、０.２mg〜０.５mg／lで
あった。
に感染させた細胞培養液(約１ｌ)をＧ−ＣＳＦアフィニ
ティーカラム(１×５cm)に添加する。添加後、ＰＢＳリ
ン酸緩衝化生理食塩水で洗浄し、０.２Ｍ食塩を含む０.
１Ｍグリシン塩酸緩衝液で溶出する。溶出蛋白質は、２
Ｍのトリズマ塩基でただちに中和する。次にこれを０.
２Ｍ食塩を含む２０mＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡
化したゲル濾過ＨＰＬＣ(内径７.６mm×６０cm；ＴＳＫ
ＧＥＬ Ｇ３０００ ＳＷＨＰＬＣカラム、東ソー)
に添加して、同緩衝液で溶出する。溶出蛋白質の大部分
は８５kＤaの部分に溶出される。この８５kＤaのピーク
はＳＤＳ−ＰＡＧＥでは４５kＤaの単一のバンドとな
り、ウエスタンブロットでも染ることから目的とするＩ
g−ＣＲＨ領域の二量体と考えられる。またＮ末端アミ
ノ酸シークエンス法によると、この標品のＮ末端はＣys
−Ｇly−Ｈis−Ｉle−Ｓer−Ｐro−Ｐro−で、これは福
永ら[Ｃell、 前掲]の示したＩg−ＣＲＨ領域のＮ末端
配列と予想される配列と一致するものであった。また８
５kＤaピークの他に二つの小さなピークが４５kＤaと２
００−２５０kＤaの位置に溶出されるが、これらもＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥでは単一の４５kＤaバンドを示し、ウエス
タンブロットでも染ることから、Ｉg−ＣＲＨ領域蛋白
質の単量体(４５kＤa)と四量体(２００−２５０kＤa)で
あると考えられる。発現量は、０.２mg〜０.５mg／lで
あった。
【００５１】実施例５ Ｉg−ＣＲＨ領域の活性測定 精製Ｉg−ＣＲＨ領域蛋白質(８５kＤa)の活性測定を行
なった。活性測定は、福永ら[Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６
５,１４００８−１４０１５(１９９０)]に記載されてい
るスキャチャードプロット法に若干の修正を加えて行な
った。即ち、５０μlのＰＢＳ中でＩg−ＣＲＨ領域蛋白
質、１２.５,２５,５０,１００,２５０,５００,１００
０pＭ、各濃度の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ(アムシャム社)、１
０％牛胎児血清、０.１％チャップス(ＣＨＡＰＳ,３−
[(３−cholamidopropyl)dimethylammonio]−１−propan
esulfonic acid；ドージン社)を加え、さらに５００μ
Ｍ非標識Ｇ−ＣＳＦの存在下および非存在下での反応液
を調製し、室温で９０分間反応させる。これにＰＢＳ中
１００μgのγ−グロブリンを含む溶液１５０μlを加
え、さらにＰＢＳ中に３０％(w／v)ポリエチレングリコ
ール６０００を含む溶液２００μlを加える。これを０
℃で３０分間インキュベーションした後、１２０００回
転、３０分間遠心して、Ｉg−ＣＲＨ・Ｇ−ＣＳＦ複合
体を沈澱させる。そして、沈澱中に含まれる125Ｉ−Ｇ
−ＣＳＦの放射能をγ−カウンター(パッカード社製コ
ブラ)でカウントする。その結果を図２に示す。この結
果は、Ｉg−ＣＲＨ領域のリガンド結合活性が二層性を
示し、高結合活性は約１００pＭの解離定数を低結合活
性は約２.５nＭの解離定数を示した。この高結合活性
は、天然の細胞上のＧ−ＣＳＦ受容体の示す活性とほぼ
同じである。
なった。活性測定は、福永ら[Ｊ．Ｂiol．Ｃhem.，２６
５,１４００８−１４０１５(１９９０)]に記載されてい
るスキャチャードプロット法に若干の修正を加えて行な
った。即ち、５０μlのＰＢＳ中でＩg−ＣＲＨ領域蛋白
質、１２.５,２５,５０,１００,２５０,５００,１００
０pＭ、各濃度の125Ｉ−Ｇ−ＣＳＦ(アムシャム社)、１
０％牛胎児血清、０.１％チャップス(ＣＨＡＰＳ,３−
[(３−cholamidopropyl)dimethylammonio]−１−propan
esulfonic acid；ドージン社)を加え、さらに５００μ
Ｍ非標識Ｇ−ＣＳＦの存在下および非存在下での反応液
を調製し、室温で９０分間反応させる。これにＰＢＳ中
１００μgのγ−グロブリンを含む溶液１５０μlを加
え、さらにＰＢＳ中に３０％(w／v)ポリエチレングリコ
ール６０００を含む溶液２００μlを加える。これを０
℃で３０分間インキュベーションした後、１２０００回
転、３０分間遠心して、Ｉg−ＣＲＨ・Ｇ−ＣＳＦ複合
体を沈澱させる。そして、沈澱中に含まれる125Ｉ−Ｇ
−ＣＳＦの放射能をγ−カウンター(パッカード社製コ
ブラ)でカウントする。その結果を図２に示す。この結
果は、Ｉg−ＣＲＨ領域のリガンド結合活性が二層性を
示し、高結合活性は約１００pＭの解離定数を低結合活
性は約２.５nＭの解離定数を示した。この高結合活性
は、天然の細胞上のＧ−ＣＳＦ受容体の示す活性とほぼ
同じである。
【００５２】実施例６ Ｉg−ＣＲＨ領域の多量体化 Ｉg−ＣＲＨ領域蛋白質の多量体化能を測定するため
に、ゲル濾過ＨＰＬＣによるＩg−ＣＲＨ・Ｇ−ＣＳＦ
複合体の大きさの解析を行なった。まずＩg−ＣＲＨ領
域とＧ−ＣＳＦを０.２Ｍ食塩を含む２０mＭリン酸ナト
リウム緩衝液中で１:１０,１:１,１:０.５,１:０.１,
１:０のモル比で混合し(Ｉg−ＣＲＨ領域の濃度は１.６
μＭに固定)、８０μlの混合物としてゲル濾過ＴＳＫゲ
ルＧ３０００ＳＷＨＰＬＣに添加して溶出した。結果を
図３に示す。図から、１:１の量比の時は、２００−２
５０kＤaの位置に複合体が溶出されることが分かる。量
比１:１０の時もその位置は変わらない。また、１:０.
５,１:０.１の時は、９５kＤaの位置にも複合体は溶出
された。以上の結果は、リガンドであるＧ−ＣＳＦの添
加で二量体としてのＩg−ＣＲＨ領域が四量体化したも
のを示すものである。
に、ゲル濾過ＨＰＬＣによるＩg−ＣＲＨ・Ｇ−ＣＳＦ
複合体の大きさの解析を行なった。まずＩg−ＣＲＨ領
域とＧ−ＣＳＦを０.２Ｍ食塩を含む２０mＭリン酸ナト
リウム緩衝液中で１:１０,１:１,１:０.５,１:０.１,
１:０のモル比で混合し(Ｉg−ＣＲＨ領域の濃度は１.６
μＭに固定)、８０μlの混合物としてゲル濾過ＴＳＫゲ
ルＧ３０００ＳＷＨＰＬＣに添加して溶出した。結果を
図３に示す。図から、１:１の量比の時は、２００−２
５０kＤaの位置に複合体が溶出されることが分かる。量
比１:１０の時もその位置は変わらない。また、１:０.
５,１:０.１の時は、９５kＤaの位置にも複合体は溶出
された。以上の結果は、リガンドであるＧ−ＣＳＦの添
加で二量体としてのＩg−ＣＲＨ領域が四量体化したも
のを示すものである。
【００５３】実施例７ 転位ベクターpＡcＣＲＨプラス
ミッドの構築 ＡcＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を含む
転位ベクターpＶＬ１３９３(Ｉnvitrogen社)の多角体プ
ロモーターの下流にＧ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨリガンド
結合領域(以下、ＣＲＨ領域と略す)をコードするＤＮＡ
を挿入する。昆虫細胞でＣＲＨ領域を発現するＤＮＡと
してはシグナルペプチド領域に続いてＣＲＨ領域が連結
した形に設計せねばならない。こうしたＤＮＡ断片はプ
ラスミッドｐＢＯＳ△Ｉg(福永らＥＭＢＯ．Ｊ．前掲)
より容易にＰＣＲ法によって得ることが出来る。つま
り、このプラスミッド中のＧ−ＣＳＦ受容体に対応する
ＤＮＡ断片は、配列番号１のＧ−ＣＳＦ受容体のＩｇ−
ＣＲＨ領域内で、３０番目のグルタミン酸から１０９番
目のセリンが欠失し、その代わりにグリシンコドンＧＧ
Ｃが挿入されている。つまりＩg領域の大部分が欠失し
た結果、シグナル配列に続いて、１６アミノ酸配列をへ
だてたのみでＣＲＨ領域と連結した配列となっている。
従って本実施例で示すＣＲＨ領域を発現するＤＮＡ断片
として、配列番号５に示される配列を設計した。
ミッドの構築 ＡcＮＰＶの多角体タンパク質をコードする部分を含む
転位ベクターpＶＬ１３９３(Ｉnvitrogen社)の多角体プ
ロモーターの下流にＧ−ＣＳＦ受容体のＣＲＨリガンド
結合領域(以下、ＣＲＨ領域と略す)をコードするＤＮＡ
を挿入する。昆虫細胞でＣＲＨ領域を発現するＤＮＡと
してはシグナルペプチド領域に続いてＣＲＨ領域が連結
した形に設計せねばならない。こうしたＤＮＡ断片はプ
ラスミッドｐＢＯＳ△Ｉg(福永らＥＭＢＯ．Ｊ．前掲)
より容易にＰＣＲ法によって得ることが出来る。つま
り、このプラスミッド中のＧ−ＣＳＦ受容体に対応する
ＤＮＡ断片は、配列番号１のＧ−ＣＳＦ受容体のＩｇ−
ＣＲＨ領域内で、３０番目のグルタミン酸から１０９番
目のセリンが欠失し、その代わりにグリシンコドンＧＧ
Ｃが挿入されている。つまりＩg領域の大部分が欠失し
た結果、シグナル配列に続いて、１６アミノ酸配列をへ
だてたのみでＣＲＨ領域と連結した配列となっている。
従って本実施例で示すＣＲＨ領域を発現するＤＮＡ断片
として、配列番号５に示される配列を設計した。
【００５４】つまり配列番号５に記載の配列では、１番
目のメチオニンから２９番目のイソロイシまでは２６番
目のセリン(配列番号１では２６番目システイン)を除い
ては、配列番号１のアミノ酸配列と同じであり、３０番
目のグリシンに続いて３１番目のバリンから２５５番目
のアラニンに至る配列は配列番号１の１１０番目のバリ
ンから３３４番目のアラニンと同じである。配列番号１
における２６番目のシステインは、配列番号５ではセリ
ンに変換されている。プラスミッドｐＢＯＳ△Ｉgで
は、Ｉg領域に存在する４つのシステイン残基のうち３
つまでがＩg領域の欠失に伴って失われて、２６番目の
システインのみが残っており、これが発現に際し、遊離
のシステインとしてＣＲＨ領域に存在するシステイン残
基とＳＳ結合のかけちがいをおこし、発現を阻害すると
考えられることから、上記の変換を行った。さらにその
Ｃ末端には、蛋白合成の終結コドンＴＡＡが付加されて
いる。該ＤＮＡ断片を、ベクターpＶＬ１３９３に挿入
するため、さらにそのＮ末端側およびＣ末端側を延長
し、その延長部にＮ末端側には制限酵素ＢamＨＩ、Ｃ末
端側にはＸｂａＩ認識部位が形成されるように工夫され
ている。
目のメチオニンから２９番目のイソロイシまでは２６番
目のセリン(配列番号１では２６番目システイン)を除い
ては、配列番号１のアミノ酸配列と同じであり、３０番
目のグリシンに続いて３１番目のバリンから２５５番目
のアラニンに至る配列は配列番号１の１１０番目のバリ
ンから３３４番目のアラニンと同じである。配列番号１
における２６番目のシステインは、配列番号５ではセリ
ンに変換されている。プラスミッドｐＢＯＳ△Ｉgで
は、Ｉg領域に存在する４つのシステイン残基のうち３
つまでがＩg領域の欠失に伴って失われて、２６番目の
システインのみが残っており、これが発現に際し、遊離
のシステインとしてＣＲＨ領域に存在するシステイン残
基とＳＳ結合のかけちがいをおこし、発現を阻害すると
考えられることから、上記の変換を行った。さらにその
Ｃ末端には、蛋白合成の終結コドンＴＡＡが付加されて
いる。該ＤＮＡ断片を、ベクターpＶＬ１３９３に挿入
するため、さらにそのＮ末端側およびＣ末端側を延長
し、その延長部にＮ末端側には制限酵素ＢamＨＩ、Ｃ末
端側にはＸｂａＩ認識部位が形成されるように工夫され
ている。
【００５５】上記ＤＮＡ断片の実際の調製にはＰＣＲを
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号６及び配
列番号７に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。配列番
号７では、２６番目のシステインをセリンに改変するた
めに、１７番目から１９番目の塩基はＡＧＡの配列にな
っている。次いで、２μＭのＮ−末端プライマー、２μ
ＭのＣ−末端プライマー、ｐＢＯＳ△ＩｇＤＮＡ(１n
g)、１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴ
Ｐ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリ
メラーゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlとす
る。ここで１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧ
ＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧe
neＡmpのキットのものを使用した。この反応液をＤＮＡ
サーマルサイクラー(型式ＰＪ２０００，宝酒造)にセッ
トし、９４℃,１分間熱処理;３７℃２分間アニーリン
グ;７２℃,３分間反応のサイクルプログラムで２５回反
応を繰り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成する。
さらに、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理することに
より精製する。これにより、目的とするＤＮＡ断片の上
のＮ末端側が合成される。
使った。具体的には、まず、それぞれ配列番号６及び配
列番号７に記載の塩基配列を有するＮ−末端プライマー
及びＣ−末端プライマーをアプライド・バイオシステム
社の３８０Ｂ型ＤＮＡ合成機を用いて調製する。配列番
号７では、２６番目のシステインをセリンに改変するた
めに、１７番目から１９番目の塩基はＡＧＡの配列にな
っている。次いで、２μＭのＮ−末端プライマー、２μ
ＭのＣ−末端プライマー、ｐＢＯＳ△ＩｇＤＮＡ(１n
g)、１０×反応緩衝液１０μl、各０.２５mＭのdＡＴ
Ｐ、dＴＴＰ、dＧＴＰ、dＣＴＰ溶液、ＴaqＤＮＡポリ
メラーゼ０.５μlを加えて最終の量を１００μlとす
る。ここで１０×反応緩衝液、dＡＴＰ、dＴＴＰ、dＧ
ＴＰ、dＣＴＰ、ＴaqＤＮＡポリメラーゼは宝酒造のＧe
neＡmpのキットのものを使用した。この反応液をＤＮＡ
サーマルサイクラー(型式ＰＪ２０００，宝酒造)にセッ
トし、９４℃,１分間熱処理;３７℃２分間アニーリン
グ;７２℃,３分間反応のサイクルプログラムで２５回反
応を繰り返すことにより目的のＤＮＡ断片を合成する。
さらに、上記ＰＣＲ反応液をフェノール処理することに
より精製する。これにより、目的とするＤＮＡ断片の上
のＮ末端側が合成される。
【００５６】次に配列番号８及び配列番号９に記載の塩
基配列を有するＮ−末端プライマーおよびＣ末端プライ
マーを合成し、やはりｐＢＯＳ△Ｉｇをテンプレートと
して同様にＰＣＲ反応を行い、目的とするＤＮＡ断片の
Ｃ末端側を合成する。配列番号８には２６番目がセリン
になるように、第１０番目から第１１番目の配列はＴＣ
Ｔとなっている。次にＮ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡ
を混合し、Ｎ末端プライマーとして配列番号６のＤＮ
Ａ、Ｃ末端プライマーとして配列番号９のＤＮＡを加え
てもう一度ＰＣＲ反応を行い精製する。
基配列を有するＮ−末端プライマーおよびＣ末端プライ
マーを合成し、やはりｐＢＯＳ△Ｉｇをテンプレートと
して同様にＰＣＲ反応を行い、目的とするＤＮＡ断片の
Ｃ末端側を合成する。配列番号８には２６番目がセリン
になるように、第１０番目から第１１番目の配列はＴＣ
Ｔとなっている。次にＮ末端側ＤＮＡとＣ末端側ＤＮＡ
を混合し、Ｎ末端プライマーとして配列番号６のＤＮ
Ａ、Ｃ末端プライマーとして配列番号９のＤＮＡを加え
てもう一度ＰＣＲ反応を行い精製する。
【００５７】その精製ＤＮＡのうち約１μgを、０.１Ｍ
食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス
塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ(宝
酒造)５単位とＸｂａＩ(宝酒造）５単位と共に３７℃で
１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。この消化
液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、１％ア
ガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.８kbpのバンドを
切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノー
ル沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出
す。続いて、上記ＤＮＡ断片を転位ベクターpＶＬ１３
９３のＢamＨＩ部位、ＸｂａＩ部位に挿入する。
食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む５０mＭトリス
塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μl及び制限酵素ＢamＨＩ(宝
酒造)５単位とＸｂａＩ(宝酒造）５単位と共に３７℃で
１時間インキュベートしてＤＮＡを消化する。この消化
液をフェノール処理及びエタノール沈澱した後、１％ア
ガロースゲルの電気泳動にかけ、約０.８kbpのバンドを
切り出し、スプレック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃
で１５分間凍結した後、３７℃で５分間インキュベート
して融解する。これを５０００回転で１０分間遠心し
て、その濾液を回収する。フェノール処理及びエタノー
ル沈澱によって濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出
す。続いて、上記ＤＮＡ断片を転位ベクターpＶＬ１３
９３のＢamＨＩ部位、ＸｂａＩ部位に挿入する。
【００５８】具体的には、約１μgのpＶＬ１３９３ Ｄ
ＮＡを５０mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む
１０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、
さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)およ
びＸｂａＩ(宝酒造）を加えて、３７℃で１時間インキ
ュベートすることにより、加えたＤＮＡを消化する。次
に、これを１％アガロースゲルの電気泳動にかけて大き
い方のＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、スプレ
ック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結し
た後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。こ
れを５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収
する。次にフェノール処理及びエタノール沈澱によって
濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
ＮＡを５０mＭ食塩及び１０mＭ塩化マグネシウムを含む
１０mＭトリス塩酸緩衝液(pＨ７.５)５０μlに溶解し、
さらにそれぞれ５単位の制限酵素ＢamＨＩ(宝酒造)およ
びＸｂａＩ(宝酒造）を加えて、３７℃で１時間インキ
ュベートすることにより、加えたＤＮＡを消化する。次
に、これを１％アガロースゲルの電気泳動にかけて大き
い方のＤＮＡ断片に相当するバンドを切り出し、スプレ
ック−０１(宝酒造)に入れ、−８０℃で１５分間凍結し
た後、３７℃で５分間インキュベートして融解する。こ
れを５０００回転で１０分間遠心して、その濾液を回収
する。次にフェノール処理及びエタノール沈澱によって
濾液から目的とするＤＮＡ断片を取り出す。
【００５９】続いてこれを上で調製したＤＮＡ断片と混
合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６
℃で３０分間反応させる。さらに、これを１００μｌの
大腸菌Ｋ１２株のコンピテントセルと混合し、０℃で３
０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすること
で大腸菌へ移入し、転位ベクターｐＡcＣＲＨプラスミ
ッドを構築した。このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ
１２株／pＡcＣＲＨは通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている(受託日:平成６年１１月８
日;受託番号:ＦＥＲＭ Ｐ−１４６１７)
合し、１mＭのＥＤＴＡを含む１０mＭトリス塩酸緩衝液
(pＨ７.４)を加えて４μlとする。これを１６μlのＡ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)及び４μlのＢ液
(ＤＮＡライゲーションキット;宝酒造)と混合し、１６
℃で３０分間反応させる。さらに、これを１００μｌの
大腸菌Ｋ１２株のコンピテントセルと混合し、０℃で３
０分間、さらに４２℃で２分間インキュベートすること
で大腸菌へ移入し、転位ベクターｐＡcＣＲＨプラスミ
ッドを構築した。このプラスミッドを導入した大腸菌Ｋ
１２株／pＡcＣＲＨは通産省工業技術院生命工学工業技
術研究所に寄託されている(受託日:平成６年１１月８
日;受託番号:ＦＥＲＭ Ｐ−１４６１７)
【００６０】実施例８ 組換え型ウイルスＡcＣＲＨの
作成およびそれを用いたＣＲＨ領域の発現 実施例１で得られたプラスミッドpＡcＩg−ＣＲＨ Ｄ
ＮＡより組換えバキュロウイルスを作成する。即ち、こ
のプラスミッドＤＮＡを変異型ＡcＮＰＶゲノムＤＮＡ
であるバキュロゴールド(Ｉnvitrogen社)とともに、リ
ポフェクチン法で昆虫細胞に移入した。具体的には、プ
ラスミッドpＡcＣＲＨ ＤＮＡ１μgとバキュロゴールド
ＤＮＡ(Ｉnvitrogen社)１００ngを蒸留水で１０μlに調
整後、４μlの蒸留水とリポフェクチン(ＢＲＬ社)４μl
を混合したもの８μlに少しずつ添加して１５分間室温
で静置する。
作成およびそれを用いたＣＲＨ領域の発現 実施例１で得られたプラスミッドpＡcＩg−ＣＲＨ Ｄ
ＮＡより組換えバキュロウイルスを作成する。即ち、こ
のプラスミッドＤＮＡを変異型ＡcＮＰＶゲノムＤＮＡ
であるバキュロゴールド(Ｉnvitrogen社)とともに、リ
ポフェクチン法で昆虫細胞に移入した。具体的には、プ
ラスミッドpＡcＣＲＨ ＤＮＡ１μgとバキュロゴールド
ＤＮＡ(Ｉnvitrogen社)１００ngを蒸留水で１０μlに調
整後、４μlの蒸留水とリポフェクチン(ＢＲＬ社)４μl
を混合したもの８μlに少しずつ添加して１５分間室温
で静置する。
【００６１】他方、昆虫細胞Ｓpodoptera frugiperda
９(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection, １２
３０１， Ｐarklawn Ｄrive, Ｒockville, ＭＤ２
０８５２・１７７６より入手可能、以下Ｓ．f．９．と
略す)を１０％牛胎児血清を含むグレース培地(ギブコ
社)で培養したもの(約１〜１.５×１０6個／２ml)を３
５mmの細胞培養用シャーレ(ファルコン社３００１)に入
れて１時間静置し、細胞を培養しておく。次いで、この
細胞上清を抜き取り、上記のＤＮＡ・リポフェクチン混
合液を滴下し、１時間静置する。さらに細胞上清を抜き
取り、新たに１０％牛胎児血清を含むグレース培地を２
ml加えて２６.５℃で４日間培養する。得られた培養液
には、野生型ＡcＮＰＶに加えて目的とする組換え型バ
キュロウイルスＡcＩg−ＣＲＨが含まれている。
９(Ａmerican Ｔype Ｃulture Ｃollection, １２
３０１， Ｐarklawn Ｄrive, Ｒockville, ＭＤ２
０８５２・１７７６より入手可能、以下Ｓ．f．９．と
略す)を１０％牛胎児血清を含むグレース培地(ギブコ
社)で培養したもの(約１〜１.５×１０6個／２ml)を３
５mmの細胞培養用シャーレ(ファルコン社３００１)に入
れて１時間静置し、細胞を培養しておく。次いで、この
細胞上清を抜き取り、上記のＤＮＡ・リポフェクチン混
合液を滴下し、１時間静置する。さらに細胞上清を抜き
取り、新たに１０％牛胎児血清を含むグレース培地を２
ml加えて２６.５℃で４日間培養する。得られた培養液
には、野生型ＡcＮＰＶに加えて目的とする組換え型バ
キュロウイルスＡcＩg−ＣＲＨが含まれている。
【００６２】この培養液からＡcＩg−ＣＲＨを取り出す
ためにプラークアッセイを行う。まず、前記と同様に生
育させたＳ．f．９細胞(１０6個／３５mmシャーレ)の培
地を抜き取り、約４倍から１万倍に希釈した培養液０.
１mlを加える。約１時間静置後、培養液を抜き取り、１
％アガロース溶液[３％アガロース(低融点シープラーク
アガロース、エフ・エムシー社)と１０％牛胎児血清を
含むグレース培地を１対２で混合し、３７℃に保温した
もの]を１ml重層する。アガロースの固化後、１mlの１
０％牛胎児血清を含むグレース培地をさらに重層し、２
６.５℃で４日間、保温し、ウイルスプラークを生じさ
せる。ひろい上げたプラークのプラーク懸濁液は、それ
ぞれ１００倍から１０００倍程度に希釈して、その０.
２mlを上記と同様な方法でＳ．f．９細胞に重層するこ
とでプラークアッセイを繰り返す。こうして単離したも
のが組換え型バキュロウイルスＡcＣＲＨである。
ためにプラークアッセイを行う。まず、前記と同様に生
育させたＳ．f．９細胞(１０6個／３５mmシャーレ)の培
地を抜き取り、約４倍から１万倍に希釈した培養液０.
１mlを加える。約１時間静置後、培養液を抜き取り、１
％アガロース溶液[３％アガロース(低融点シープラーク
アガロース、エフ・エムシー社)と１０％牛胎児血清を
含むグレース培地を１対２で混合し、３７℃に保温した
もの]を１ml重層する。アガロースの固化後、１mlの１
０％牛胎児血清を含むグレース培地をさらに重層し、２
６.５℃で４日間、保温し、ウイルスプラークを生じさ
せる。ひろい上げたプラークのプラーク懸濁液は、それ
ぞれ１００倍から１０００倍程度に希釈して、その０.
２mlを上記と同様な方法でＳ．f．９細胞に重層するこ
とでプラークアッセイを繰り返す。こうして単離したも
のが組換え型バキュロウイルスＡcＣＲＨである。
【００６３】実施例９ ＡｃＣＲＨを用いたＣＲＨ領域
の分泌発現、およびＣＲＨ蛋白質の精製 この組換え型バキュロウィルスＡcＣＲＨを用いて実施
例３と同様に、ＴＮ細胞を用いてＣＲＨの生産を行うこ
とが出来る。培養液中には、その結果、約２９キロダル
トンに対応する位置に目的とするＣＲＨのバンドがウエ
スタンブロッドで検出出来る。この約２９キロダルトン
のＣＲＨ領域は実施例４と同様にＧ−ＣＳＦアフィニテ
ィーカラムで精製することが出来る。そのＮ末端アミノ
酸配列の７５％はＡsp−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｌeu、２５
％はＡla−Ｇly−Ｔyr−Ｐro−Ｐroであり、これは配列
番号５の３５番目のアスパラギン酸と４１番目のアラニ
ンに始まる配列に対応する。配列番号５では、１番のメ
チオニンから２５番目のセリンがシグナル配列に対応す
る。従って、もしもＡcＩg−ＣＲＨを用いた発現と同様
にシグナル配列のみが切断された場合には、目的とする
４３番目から始まるＣＲＨ領域に加えて２６番目のセリ
ンから４２番目のグリシンに対応するＩg領域に由来す
るアミノ酸配列が残存するはずである。しかし、実際の
結果は、配列番号５で４３番目から始まるＣＲＨ領域に
加えて８残基と２残基のＩg領域部分を含んだ形で目的
物が得られたことを示している。これは前述のように、
Ｉg領域に由来する２６番目から４２番目の配列では完
全なＩg領域から大きく欠損した配列であるために、こ
れのみでは有意な高次構造を保持しえず、このために容
易に昆虫細胞内のブロテアーゼで切断され、その大部分
が除去されてしまうためと考えられる。ここにおける発
現量は約１０mg／ｌであった。
の分泌発現、およびＣＲＨ蛋白質の精製 この組換え型バキュロウィルスＡcＣＲＨを用いて実施
例３と同様に、ＴＮ細胞を用いてＣＲＨの生産を行うこ
とが出来る。培養液中には、その結果、約２９キロダル
トンに対応する位置に目的とするＣＲＨのバンドがウエ
スタンブロッドで検出出来る。この約２９キロダルトン
のＣＲＨ領域は実施例４と同様にＧ−ＣＳＦアフィニテ
ィーカラムで精製することが出来る。そのＮ末端アミノ
酸配列の７５％はＡsp−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｌeu、２５
％はＡla−Ｇly−Ｔyr−Ｐro−Ｐroであり、これは配列
番号５の３５番目のアスパラギン酸と４１番目のアラニ
ンに始まる配列に対応する。配列番号５では、１番のメ
チオニンから２５番目のセリンがシグナル配列に対応す
る。従って、もしもＡcＩg−ＣＲＨを用いた発現と同様
にシグナル配列のみが切断された場合には、目的とする
４３番目から始まるＣＲＨ領域に加えて２６番目のセリ
ンから４２番目のグリシンに対応するＩg領域に由来す
るアミノ酸配列が残存するはずである。しかし、実際の
結果は、配列番号５で４３番目から始まるＣＲＨ領域に
加えて８残基と２残基のＩg領域部分を含んだ形で目的
物が得られたことを示している。これは前述のように、
Ｉg領域に由来する２６番目から４２番目の配列では完
全なＩg領域から大きく欠損した配列であるために、こ
れのみでは有意な高次構造を保持しえず、このために容
易に昆虫細胞内のブロテアーゼで切断され、その大部分
が除去されてしまうためと考えられる。ここにおける発
現量は約１０mg／ｌであった。
【００６４】実施例１０ ＣＲＨ領域の活性測定 このＣＲＨ領域のリガンド結合能は実施例５と同様に測
定できる。該ＣＲＨ領域蛋白質のリガンドＧ−ＣＳＦに
対する結合の解離定数は、Ｉg−ＣＲＨ領域の低結合活
性と同様、約２.５nＭであった(図４)。これはＢＮドメ
インの結合活性よりも１０倍強い結合活性であることを
示している。また、この値は、プラスミッドｐＢＯＳ△
Ｉｇにより、動物細胞を用いて行った発現で得られた物
質のリガンド結合活性(福永らＥＭＢＯ．Ｊ．前掲)とほ
ぼ同様であった。
定できる。該ＣＲＨ領域蛋白質のリガンドＧ−ＣＳＦに
対する結合の解離定数は、Ｉg−ＣＲＨ領域の低結合活
性と同様、約２.５nＭであった(図４)。これはＢＮドメ
インの結合活性よりも１０倍強い結合活性であることを
示している。また、この値は、プラスミッドｐＢＯＳ△
Ｉｇにより、動物細胞を用いて行った発現で得られた物
質のリガンド結合活性(福永らＥＭＢＯ．Ｊ．前掲)とほ
ぼ同様であった。
【００６５】さらに、ゲル濾過ＨＰＬＣによって、ＣＲ
Ｈ−Ｇ−ＣＳＦ複合体の大きさを実施例６と同様に測定
した。その結果を図５に示す。図５からＣＲＨ領域は２
９キロダルトンであり、Ｇ−ＣＳＦは１９キロダルトン
である。複合体は４０キロダルトンに溶出される。以上
の結果より、ＣＲＨ領域はリガンドと１：１の量比の結
合を示し、ＣＲＨ領域のみではＩｇ−ＣＲＨ領域の場合
の四量体化というような多量体化は起こらなかった。
Ｈ−Ｇ−ＣＳＦ複合体の大きさを実施例６と同様に測定
した。その結果を図５に示す。図５からＣＲＨ領域は２
９キロダルトンであり、Ｇ−ＣＳＦは１９キロダルトン
である。複合体は４０キロダルトンに溶出される。以上
の結果より、ＣＲＨ領域はリガンドと１：１の量比の結
合を示し、ＣＲＨ領域のみではＩｇ−ＣＲＨ領域の場合
の四量体化というような多量体化は起こらなかった。
【００６６】
【発明の効果】以上述べたように、本発明はＧ−ＣＳＦ
受容体のリガンド結合領域の内、ＣＲＨ領域およびＩｇ
−ＣＲＨ領域の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターを構築し、該ベクターで昆虫細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養液中に分泌され
た発現生成物を回収することにより、組換えＣＲＨ領域
蛋白質およびＩｇ−ＣＲＨ領域蛋白質を製造する方法を
新しく確立したものである。本発明により得られた組換
え蛋白質は、従来のＢＮに比べて、リガンドであるＧ−
ＣＳＦに対して高い結合活性を保持し、特にＩｇ−ＣＲ
Ｈ領域は、天然のＧ−ＣＳＦ受容体と同じリガンド結合
能力を保持しつつ、多量体化能をも有している。しか
も、本発明によれば、天然物からの抽出法で得られる同
領域蛋白質に通常伴っている不純物を含まず、高純度の
標品を大量に得ることが可能であり、顆粒球増殖に起因
する白血病の治療や、さらには、Ｇ−ＣＳＦに置き換え
得るアゴニスト、アンタゴニスト等の医薬の開発および
／または研究に大いに寄与することができる。
受容体のリガンド結合領域の内、ＣＲＨ領域およびＩｇ
−ＣＲＨ領域の蛋白質をコードするＤＮＡを含有する発
現ベクターを構築し、該ベクターで昆虫細胞を形質転換
し、得られた形質転換体を培養して培養液中に分泌され
た発現生成物を回収することにより、組換えＣＲＨ領域
蛋白質およびＩｇ−ＣＲＨ領域蛋白質を製造する方法を
新しく確立したものである。本発明により得られた組換
え蛋白質は、従来のＢＮに比べて、リガンドであるＧ−
ＣＳＦに対して高い結合活性を保持し、特にＩｇ−ＣＲ
Ｈ領域は、天然のＧ−ＣＳＦ受容体と同じリガンド結合
能力を保持しつつ、多量体化能をも有している。しか
も、本発明によれば、天然物からの抽出法で得られる同
領域蛋白質に通常伴っている不純物を含まず、高純度の
標品を大量に得ることが可能であり、顆粒球増殖に起因
する白血病の治療や、さらには、Ｇ−ＣＳＦに置き換え
得るアゴニスト、アンタゴニスト等の医薬の開発および
／または研究に大いに寄与することができる。
【００６７】
【００６８】配列番号：１ 配列の長さ：１００２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Mouse 細胞の種類：ＮＦＳ−６０ 配列 ATG GTA GGG CTG GGA GCC TGC ACC CTG ACT GGA GTT ACC CTG ATC TTC 48 Met Val Gly Leu Gly Ala Cys Thr Leu Thr Gly Val Thr Leu Ile Phe 1 5 10 15 TTG CTA CTC CCC AGA AGT CTG GAG AGC TGT GGA CAC ATC GAG ATT TCA 96 Leu Leu Leu Pro Arg Ser Leu Glu Ser Cys Gly His Ile Glu Ile Ser 20 25 30 CCC CCT GTT GTC CGC CTG GGG GAC CCT GTC CTG GCC TCT TGC ACC ATC 144 Pro Pro Val Val Arg Leu Gly Asp Pro Val Leu Ala Ser Cys Thr Ile 35 40 45 AGC CCA AAC TGC AGC AAA CTG GAC CAA CAG GCA AAG ATC TTA TGG AGA 192 Ser Pro Asn Cys Ser Lys Leu Asp Gln Gln Ala Lys Ile Leu Trp Arg 50 55 60 CTG CAA GAT GAG CCC ATC CAA CCT GGG GAC AGA CAG CAT CAT CTG CCT 240 Leu Gln Asp Glu Pro Ile Gln Pro Gly Asp Arg Gln His His Leu Pro 65 70 75 80 GAT GGG ACC CAA GAG TCC CTC ATC ACT CTG CCT CAC TTG AAC TAC ACC 288 Asp Gly Thr Gln Glu Ser Leu Ile Thr Leu Pro His Leu Asn Tyr Thr 85 90 95 CAG GCC TTC CTC TTC TGC TTA GTG CCA TGG GAA GAC AGC GTC CAA CTC 336 Gln Ala Phe Leu Phe Cys Leu Val Pro Trp Glu Asp Ser Val Gln Leu 100 105 110 CTG GAT CAA GCT GAG CTT CAC GCA GGC TAT CCC CCT GCC AGC CCC TCA 384 Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro Ser 115 120 125 AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC CTC ACC ACC AAC AGC CTG GTC TGC CAG 432 Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys Gln 130 135 140 TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC CAC CTG CCC ACC AGC TTC ATC CTA AAG 480 Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu Lys 145 150 155 160 AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC TGT CAG TAC CAA GGG GAC ACC ATC CCG 528 Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile Pro 165 170 175 GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG CAG AAC AAC TGC TCC ATC CCC CGA AAA 576 Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg Lys 180 185 190 AAC TTG CTC CTG TAC CAG TAT ATG GCC ATC TGG GTG CAA GCA GAG AAT 624 Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn 195 200 205 ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC CCA AAG CTG TGC CTC GAC CCC ATG GAT 672 Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp 210 215 220 GTT GTG AAA TTG GAG CCT CCC ATG CTG CAG GCC CTG GAC ATT GGC CCT 720 Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly Pro 225 230 235 240 GAT GTA GTC TCT CAC CAG CCT GGC TGC CTG TGG CTG AGC TGG AAG CCA 768 Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys Pro 245 250 255 TGG AAG CCC AGT GAG TAC ATG GAA CAG GAG TGT GAA CTT CGC TAC CAG 816 Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr Gln 260 265 270 CCA CAG CTC AAA GGA GCC AAC TGG ACT CTG GTG TTC CAC CTG CCT TCC 864 Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro Ser 275 280 285 AGC AAG GAC CAG TTT GAG CTC TGC GGG CTC CAT CAG GCC CCA GTC TAC 912 Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val Tyr 290 295 300 ACC CTA CAG ATG CGA TGC ATT CGC TCA TCT CTG CCT GGA TTC TGG AGC 960 Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp Ser 305 310 315 320 CCC TGG AGC CCC GGC CTG CAG CTG AGG CCT ACC ATG AAG GCC 1002 Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg Pro Thr Met Lys Ala 325 330
【００６９】配列番号：２ 配列の長さ：９９９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：Homo sapiens (ヒト) 組織の種類：胎盤またはＵ９３７ 配列 ATG GCA AGG CTG GGA AAC TGC AGC CTG ACT TGG GCT GCC CTG ATC ATC 48 Met Ala Arg Leu Gly Asn Cys Ser Leu Thr Trp Ala Ala Leu Ile Ile 1 5 10 15 CTG CTG CTC CCC GGA AGT CTG GAG GAG TGC GGG CAC ATC AGT GTC TCA 96 Leu Leu Leu Pro Gly Ser Leu Glu Glu Cys Gly His Ile Ser Val Ser 20 25 30 GCC CCC ATC GTC CAC CTG GGG GAT CCC ATC ACA GCC TCC TGC ATC ATC 144 Ala Pro Ile Val His Leu Gly Asp Pro Ile Thr Ala Ser Cys Ile Ile 35 40 45 AAG CAG AAC TGC AGC CAT CTG GAC CCG GAG CCA CAG ATT CTG TGG AGA 192 Lys Gln Asn Cys Ser His Leu Asp Pro Glu Pro Gln Ile Leu Trp Arg 50 55 60 CTG GGA GCA GAG CTT CAG CCC GGG GGC AGG CAG CAG CGT CTG TCT GAT 240 Leu Gly Ala Glu Leu Gln Pro Gly Gly Arg Gln Gln Arg Leu Ser Asp 65 70 75 80 GGG ACC CAG GAA TCT ATC ATC ACC CTG CCC CAC CTC AAC CAC ACT CAG 288 Gly Thr Gln Glu Ser Ile Ile Thr Leu Pro His Leu Asn His Thr Gln 85 90 95 GCC TTT CTC TCC TGC TGC CTG AAC TGG GGC AAC AGC CTG CAG ATC CTG 336 Ala Phe Leu Ser Cys Cys Leu Asn Trp Gly Asn Ser Leu Gln Ile Leu 100 105 110 GAC CAG GTT GAG CTG CGC GCA GGC TAC CCT CCA GCC ATA CCC CAC AAC 384 Asp Gln Val Glu Leu Arg Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ile Pro His Asn 115 120 125 CTC TCC TGC CTC ATG AAC CTC ACA ACC AGC AGC CTC ATC TGC CAG TGG 432 Leu Ser Cys Leu Met Asn Leu Thr Thr Ser Ser Leu Ile Cys Gln Trp 130 135 140 GAG CCA GGA CCT GAG ACC CAC CTA CCC ACC AGC TTC ACT CTG AAG AGT 480 Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Thr Leu Lys Ser 145 150 155 160 TTC AAG AGC CGG GGC AAC TGT CAG ACC CAA GGG GAC TCC ATC CTG GAC 528 Phe Lys Ser Arg Gly Asn Cys Gln Thr Gln Gly Asp Ser Ile Leu Asp 165 170 175 TGC GTG CCC AAG GAC GGG CAG AGC CAC TGC TGC ATC CCA CGC AAA CAC 576 Cys Val Pro Lys Asp Gly Gln Ser His Cys Cys Ile Pro Arg Lys His 180 185 190 CTG CTG TTG TAC CAG AAT ATG GGC ATC TGG GTG CAG GCA GAG AAT GCG 624 Leu Leu Leu Tyr Gln Asn Met Gly Ile Trp Val Gln Ala Glu Asn Ala 195 200 205 CTG GGG ACC AGC ATG TCC CCA CAA CTG TGT CTT GAT CCC ATG GAT GTT 672 Leu Gly Thr Ser Met Ser Pro Gln Leu Cys Leu Asp Pro Met Asp Val 210 215 220 GTG AAA CTG GAG CCC CCC ATG CTG CGG ACC ATG GAC CCC AGC CCT GAA 720 Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Arg Thr Met Asp Pro Ser Pro Glu 225 230 235 240 GCG GCC CCT CCC CAG GCA GGC TGC CTA CAG CTG TGC TGG GAG CCA TGG 768 Ala Ala Pro Pro Gln Ala Gly Cys Leu Gln Leu Cys Trp Glu Pro Trp 245 250 255 CAG CCA GGC CTG CAC ATA AAT CAG AAG TGT GAG CTG CGC CAC AAG CCG 816 Gln Pro Gly Leu His Ile Asn Gln Lys Cys Glu Leu Arg His Lys Pro 260 265 270 CAG CGT GGA GAA GCC AGC TGG GCA CTG GTG GGC CCC CTC CCC TTG GAG 864 Gln Arg Gly Glu Ala Ser Trp Ala Leu Val Gly Pro Leu Pro Leu Glu 275 280 285 GCC CTT CAG TAT GAG CTC TGC GGG CTC CTC CCA GCC ACG GCC TAC ACC 912 Ala Leu Gln Tyr Glu Leu Cys Gly Leu Leu Pro Ala Thr Ala Tyr Thr 290 295 300 CTG CAG ATA CGC TGC ATC CGC TGG CCC CTG CCT GGC CAC TGG AGC GAC 960 Leu Gln Ile Arg Cys Ile Arg Trp Pro Leu Pro Gly His Trp Ser Asp 305 310 315 320 TGG AGC CCC AGC CTG GAG CTG AGA ACT ACC GAA CGG GCC 999 Trp Ser Pro Ser Leu Glu Leu Arg Thr Thr Glu Arg Ala 325 330
【００７０】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGGGATCCAT GGTAGGGCTG GGAGCCTG 28
【００７１】配列番号：４ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCGGATCCTT AGGCCTTCAT GGTAGGCCTC A 31
【００７２】配列番号：５ 配列の長さ：７６５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：Mouse 細胞の種類：ＮＦＳ−６０ 配列 ATG GTA GGG CTG GGA GCC TGC ACC CTG ACT GGA GTT ACC CTG ATC TTC 48 Met Val Gly Leu Gly Ala Cys Thr Leu Thr Gly Val Thr Leu Ile Phe 1 5 10 15 TTG CTA CTC CCC AGA AGT CTG GAG AGC TCT GGA CAC ATC GGC GTC CAA 96 Leu Leu Leu Pro Arg Ser Leu Glu Ser Ser Gly His Ile Gly Val Gln 20 25 30 CTC CTG GAT CAA GCT GAG CTT CAC GCA GGC TAT CCC CCT GCC AGC CCC 144 Leu Leu Asp Gln Ala Glu Leu His Ala Gly Tyr Pro Pro Ala Ser Pro 35 40 45 TCA AAC CTA TCC TGC CTC ATG CAC CTC ACC ACC AAC AGC CTG GTC TGC 192 Ser Asn Leu Ser Cys Leu Met His Leu Thr Thr Asn Ser Leu Val Cys 50 55 60 CAG TGG GAG CCA GGT CCT GAG ACC CAC CTG CCC ACC AGC TTC ATC CTA 240 Gln Trp Glu Pro Gly Pro Glu Thr His Leu Pro Thr Ser Phe Ile Leu 65 70 75 80 AAG AGC TTC AGG AGC CGC GCC GAC TGT CAG TAC CAA GGG GAC ACC ATC 288 Lys Ser Phe Arg Ser Arg Ala Asp Cys Gln Tyr Gln Gly Asp Thr Ile 85 90 95 CCG GAT TGT GTG GCA AAG AAG AGG CAG AAC AAC TGC TCC ATC CCC CGA 336 Pro Asp Cys Val Ala Lys Lys Arg Gln Asn Asn Cys Ser Ile Pro Arg 100 105 110 AAA AAC TTG CTC CTG TAC CAG TAT ATG GCC ATC TGG GTG CAA GCA GAG 384 Lys Asn Leu Leu Leu Tyr Gln Tyr Met Ala Ile Trp Val Gln Ala Glu 115 120 125 AAT ATG CTA GGG TCC AGC GAG TCC CCA AAG CTG TGC CTC GAC CCC ATG 432 Asn Met Leu Gly Ser Ser Glu Ser Pro Lys Leu Cys Leu Asp Pro Met 130 135 140 GAT GTT GTG AAA TTG GAG CCT CCC ATG CTG CAG GCC CTG GAC ATT GGC 480 Asp Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Met Leu Gln Ala Leu Asp Ile Gly 145 150 155 160 CCT GAT GTA GTC TCT CAC CAG CCT GGC TGC CTG TGG CTG AGC TGG AAG 528 Pro Asp Val Val Ser His Gln Pro Gly Cys Leu Trp Leu Ser Trp Lys 165 170 175 CCA TGG AAG CCC AGT GAG TAC ATG GAA CAG GAG TGT GAA CTT CGC TAC 576 Pro Trp Lys Pro Ser Glu Tyr Met Glu Gln Glu Cys Glu Leu Arg Tyr 180 185 190 CAG CCA CAG CTC AAA GGA GCC AAC TGG ACT CTG GTG TTC CAC CTG CCT 624 Gln Pro Gln Leu Lys Gly Ala Asn Trp Thr Leu Val Phe His Leu Pro 195 200 205 TCC AGC AAG GAC CAG TTT GAG CTC TGC GGG CTC CAT CAG GCC CCA GTC 672 Ser Ser Lys Asp Gln Phe Glu Leu Cys Gly Leu His Gln Ala Pro Val 210 215 220 TAC ACC CTA CAG ATG CGA TGC ATT CGC TCA TCT CTG CCT GGA TTC TGG 720 Tyr Thr Leu Gln Met Arg Cys Ile Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe Trp 225 230 235 240 AGC CCC TGG AGC CCC GGC CTG CAG CTG AGG CCT ACC ATG AAG GCC 765 Ser Pro Trp Ser Pro Gly Leu Gln Leu Arg Pro Thr Met Lys Ala 245 250
【００７３】配列番号：６ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CGGGATCCAT GGTAGGCCTG GGAGCCTG 28
【００７４】配列番号：７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GGACGCCGAT GTGTCCAGAG CTCTCCAGAC TTCTGGGGA 39
【００７５】配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 CTGGAGAGCT CTGGACACAT CGGCGTCCAA CTCCTG 36
【００７６】配列番号：９ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列 GCTCTAGATT AGGCCTTCAT GGTAGGCCTC A 31
【図１】 Ｇ−ＣＳＦ受容体のリガンド結合領域の、Ｃ
ＲＨ領域蛋白質、およびＩg−ＣＲＨ領域蛋白質を昆虫
細胞で発現させるための組換え型バキュロウイルスＡc
ＣＲＨおよびＡcＩg−ＣＲＨの構築模式図である。
ＲＨ領域蛋白質、およびＩg−ＣＲＨ領域蛋白質を昆虫
細胞で発現させるための組換え型バキュロウイルスＡc
ＣＲＨおよびＡcＩg−ＣＲＨの構築模式図である。
【図２】 バキュロウィルス系により発現されたＩg−
ＣＲＨ領域蛋白質のＧ−ＣＳＦとの結合活性を示す、ス
キャッチャード分析の結果の模写図である。
ＣＲＨ領域蛋白質のＧ−ＣＳＦとの結合活性を示す、ス
キャッチャード分析の結果の模写図である。
【図３】 ゲル濾過ＨＰＬＣにおけるＩg−ＣＲＨ・Ｇ
−ＣＳＦ複合体の溶出パターンの模写図である。
−ＣＳＦ複合体の溶出パターンの模写図である。
【図４】 バキュロウィルス系により発現されたＣＲＨ
領域蛋白質のＧ−ＣＳＦとの結合活性を示す、スキャッ
チャード分析の結果の模写図である。
領域蛋白質のＧ−ＣＳＦとの結合活性を示す、スキャッ
チャード分析の結果の模写図である。
【図５】 ゲル濾過ＨＰＬＣにおけるＣＲＨ・Ｇ−ＣＳ
Ｆ複合体の溶出パターンの模写図である。
Ｆ複合体の溶出パターンの模写図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (11)
- 【請求項１】 顆粒球コロニー刺激因子受容体の、サイ
トカイン受容体相補領域を含むリガンド結合領域の蛋白
質をコードしているＤＮＡ。 - 【請求項２】 さらに、イムノグロブリン様領域をも含
むリガンド結合領域の蛋白質をコードしている請求項１
記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 該蛋白質が配列番号１のアミノ酸番号１
２２−３３４で示されるアミノ酸配列を含有するもので
ある、請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項４】 該蛋白質が配列番号１のアミノ酸番号２
６−３３４で示されるアミノ酸配列を含有するものであ
る、請求項２記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】 請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
を含有する発現ベクター。 - 【請求項６】 多角体プロモーターの下流に請求項１〜
４のいずれかに記載のＤＮＡを組み込んでなる組換え型
バキュロウイルスである、請求項５記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項７】 図１に記載のＡcＣＲＨまたはＡcＩg−
ＣＲＨである請求項４記載の発現ベクター。 - 【請求項８】 請求項５〜７のいずれかに記載の発現ベ
クターで形質転換された形質転換体。 - 【請求項９】 昆虫由来の細胞である請求項８記載の形
質転換体 - 【請求項１０】 請求項８または９記載の形質転換体を
培養し、培養物から組換え生成物を回収することからな
る、顆粒球コロニー刺激因子受容体のリガンド結合領域
の、サイトカイン受容体相補領域、またはイムノグロブ
リン様領域およびサイトカイン受容体相補領域の蛋白質
を製造する方法。 - 【請求項１１】 請求項９記載の方法で製造された、実
質上純粋な、組換え顆粒球コロニー刺激因子受容体のリ
ガンド結合領域蛋白質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06280655A JP3081761B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06280655A JP3081761B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08140678A true JPH08140678A (ja) | 1996-06-04 |
| JP3081761B2 JP3081761B2 (ja) | 2000-08-28 |
Family
ID=17628087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06280655A Expired - Fee Related JP3081761B2 (ja) | 1994-11-15 | 1994-11-15 | 顆粒球コロニー刺激因子受容体のｃｒｈ領域を含むリガンド結合領域の蛋白質をコードしているｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3081761B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052057A1 (fr) * | 1999-03-04 | 2000-09-08 | Biomolecular Engineering Research Institute | Cristaux et coordonnees structurales d'un complexe proteique et utilisation desdites coordonnees structurales |
-
1994
- 1994-11-15 JP JP06280655A patent/JP3081761B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052057A1 (fr) * | 1999-03-04 | 2000-09-08 | Biomolecular Engineering Research Institute | Cristaux et coordonnees structurales d'un complexe proteique et utilisation desdites coordonnees structurales |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3081761B2 (ja) | 2000-08-28 |
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