JPH1169972A - インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA - Google Patents
インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNAInfo
- Publication number
- JPH1169972A JPH1169972A JP10196222A JP19622298A JPH1169972A JP H1169972 A JPH1169972 A JP H1169972A JP 10196222 A JP10196222 A JP 10196222A JP 19622298 A JP19622298 A JP 19622298A JP H1169972 A JPH1169972 A JP H1169972A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ice
- kda
- amino acid
- seq
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6472—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
- C12N9/6475—Interleukin 1-beta convertase-like enzymes (3.4.22.10; 3.4.22.36; 3.4.22.63)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/0202—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-X-X-C(=0)-, X being an optionally substituted carbon atom or a heteroatom, e.g. beta-amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 前駆インターロイキン−1β(プレIL−1
β)変換酵素(ICE)をコードする相補的DNA(c
DNA)をcDNAライブラリーから単離する。新生I
CEに対する全長読み取り枠(ORF)をコードするc
DNA並びにICEのそれぞれ20kDaサブユニット
及び10kDaサブユニットをコードするcDNAを同
定し、配列決定する。ICEは、プレIL−1βを成熟
IL−1βに変換するのに有効である。 【解決手段】 それぞれ20kDa及び10kDaのサ
ブユニットを含む組換え生産されたICEは、炎症疾患
の診断、組換えIL−1βの製造、及びICE活性の阻
害物質の同定に有用である。
β)変換酵素(ICE)をコードする相補的DNA(c
DNA)をcDNAライブラリーから単離する。新生I
CEに対する全長読み取り枠(ORF)をコードするc
DNA並びにICEのそれぞれ20kDaサブユニット
及び10kDaサブユニットをコードするcDNAを同
定し、配列決定する。ICEは、プレIL−1βを成熟
IL−1βに変換するのに有効である。 【解決手段】 それぞれ20kDa及び10kDaのサ
ブユニットを含む組換え生産されたICEは、炎症疾患
の診断、組換えIL−1βの製造、及びICE活性の阻
害物質の同定に有用である。
Description
【0001】本出願は、1991年8月16日出願の出
願第746,454号の一部継続出願である。
願第746,454号の一部継続出願である。
【0002】
【従来の技術】哺乳動物インターロイキン−1(IL−
1)は、一般炎症応答の一部として所定の細胞タイプに
よって分泌される免疫調節タンパク質である。IL−1
産生を担う主要な細胞タイプは末梢血単球である。しか
しながら他の非形質転換細胞タイプも、IL−1または
IL−1様分子を放出するかまたは含有すると記載され
ている。かかる例としては、上皮細胞〔Luger e
t al.,J.Immunol.127:1493−
1498(1981),Le et al.,J.Im
munol.138:2520−2526(1987)
及びLovettand Larsen,J.Cli
n.Invest.82:115−122(198
8)〕、結合組織細胞〔Ollivierre et
al.,Biochem.Biophys.Res.C
omm.141:904−911(1486),Le
et al.,J.Immunol.138:2520
−2526(1987)〕、神経系細胞(cells
of neuronal origin)〔Giuli
an et al.,J.Exp.Med.164:5
94−604(1986)〕、及び白血球〔Pisto
ia et al.,J.Immunol,136:1
688−1692(1986)、Acres eta
l.,Mol.Immunol.24:479−485
(1987)、Acres et al.,J.Imm
unol.138:2132−2136(1987)及
びLindemann et al.,J.Immun
ol.140:837−839(1988)〕を挙げる
ことができる。形質転換細胞系もまたIL−1を産生す
ることが示されている。かかる例としては、単球性白血
病系P388D、J774、THP.1、U−937
〔Krakauer and Oppenheime
r,Cell.Immunol.80:223−229
(1983)及びMatsushima et a
l.,Biochem.25:3242−3429(1
986)〕、EBV形質転換ヒトBリンパ芽球症系(E
VB−transformed human B ly
mphoblastoidlines)〔Acres
et al.,J.Immunol.138:2132
−2136(1987)〕、及び形質転換ネズミケラチ
ノサイト〔Luger et al.,J.Immun
ol.125:2147−2152(1982)〕を挙
げることができる。
1)は、一般炎症応答の一部として所定の細胞タイプに
よって分泌される免疫調節タンパク質である。IL−1
産生を担う主要な細胞タイプは末梢血単球である。しか
しながら他の非形質転換細胞タイプも、IL−1または
IL−1様分子を放出するかまたは含有すると記載され
ている。かかる例としては、上皮細胞〔Luger e
t al.,J.Immunol.127:1493−
1498(1981),Le et al.,J.Im
munol.138:2520−2526(1987)
及びLovettand Larsen,J.Cli
n.Invest.82:115−122(198
8)〕、結合組織細胞〔Ollivierre et
al.,Biochem.Biophys.Res.C
omm.141:904−911(1486),Le
et al.,J.Immunol.138:2520
−2526(1987)〕、神経系細胞(cells
of neuronal origin)〔Giuli
an et al.,J.Exp.Med.164:5
94−604(1986)〕、及び白血球〔Pisto
ia et al.,J.Immunol,136:1
688−1692(1986)、Acres eta
l.,Mol.Immunol.24:479−485
(1987)、Acres et al.,J.Imm
unol.138:2132−2136(1987)及
びLindemann et al.,J.Immun
ol.140:837−839(1988)〕を挙げる
ことができる。形質転換細胞系もまたIL−1を産生す
ることが示されている。かかる例としては、単球性白血
病系P388D、J774、THP.1、U−937
〔Krakauer and Oppenheime
r,Cell.Immunol.80:223−229
(1983)及びMatsushima et a
l.,Biochem.25:3242−3429(1
986)〕、EBV形質転換ヒトBリンパ芽球症系(E
VB−transformed human B ly
mphoblastoidlines)〔Acres
et al.,J.Immunol.138:2132
−2136(1987)〕、及び形質転換ネズミケラチ
ノサイト〔Luger et al.,J.Immun
ol.125:2147−2152(1982)〕を挙
げることができる。
【0003】生物学的に活性なIL−1は、いずれも約
17,500の分子量を有する形態であるが、約5.2
の等電点を有するIL−1αと約7.0の等電点を有す
るIL−1βとの2種の別個の形態で存在する〔Bay
ne et al.,J.Exp.Med.163:1
267−1280(1986)及びSchmidt,
J.Exp.Med.160:772(1984)〕。
ポリペプチドは進化的に保存されていると見られ、アミ
ノ酸レベルで約27〜33%の相同性を示す〔Clar
k et al.,Nucleic Acids Re
s.14:7897−7914(1986)〕。
17,500の分子量を有する形態であるが、約5.2
の等電点を有するIL−1αと約7.0の等電点を有す
るIL−1βとの2種の別個の形態で存在する〔Bay
ne et al.,J.Exp.Med.163:1
267−1280(1986)及びSchmidt,
J.Exp.Med.160:772(1984)〕。
ポリペプチドは進化的に保存されていると見られ、アミ
ノ酸レベルで約27〜33%の相同性を示す〔Clar
k et al.,Nucleic Acids Re
s.14:7897−7914(1986)〕。
【0004】哺乳動物IL−1βは、約31.5kDa
の細胞関連ポリペプチド前駆体として合成される〔Li
mjuco et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 83:3972−3976(1
986)〕。IL−1β前駆体はIL−1レセプターに
結合することはできず、生物学的に不活性である〔Mo
sley et al.,J.Biol.Chem.2
62:2941−2944(1987)〕。生物学的活
性は、31.5kDaの前駆形態を17.5kDaの成
熟形態に変換する結果となる所定の形態のタンパク質加
水分解プロセッシングによって現れる。
の細胞関連ポリペプチド前駆体として合成される〔Li
mjuco et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 83:3972−3976(1
986)〕。IL−1β前駆体はIL−1レセプターに
結合することはできず、生物学的に不活性である〔Mo
sley et al.,J.Biol.Chem.2
62:2941−2944(1987)〕。生物学的活
性は、31.5kDaの前駆形態を17.5kDaの成
熟形態に変換する結果となる所定の形態のタンパク質加
水分解プロセッシングによって現れる。
【0005】最近の研究では、IL−1βのプロセッシ
ング及び分泌は単球及び単球細胞系に特異的であること
が示されている〔Matsushima et a
l.,J.Immunol.135:1132(198
5)〕。例えば、線維芽細胞及びケラチノサイトはIL
−1β前駆体を合成するが、前駆体を積極的にプロセッ
シングすることも成熟IL−1βを分泌することもない
ことが判っている〔Young et al.,J.C
ell.Biol.107:447(1988)及びC
orbo et al.,Eur.J.Bioche
m.169:669(1987)〕。
ング及び分泌は単球及び単球細胞系に特異的であること
が示されている〔Matsushima et a
l.,J.Immunol.135:1132(198
5)〕。例えば、線維芽細胞及びケラチノサイトはIL
−1β前駆体を合成するが、前駆体を積極的にプロセッ
シングすることも成熟IL−1βを分泌することもない
ことが判っている〔Young et al.,J.C
ell.Biol.107:447(1988)及びC
orbo et al.,Eur.J.Bioche
m.169:669(1987)〕。
【0006】IL−1βのプロセッシング及び分泌が、
古典的に分泌されるタンパク質とは異なる独特の経路で
起こるという仮説を支持する観察も幾つかある。5つの
異なる種由来のIL−1βは疎水性シグナル配列を含ま
ない〔Lomedico et al.,Nature
312:458(1984)、Auron eta
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81;7907(1984),Gray et a
l.,J.Immunol.137:3644(198
6),Maliszewski et al.,Mo
l.Immunol.25:429(1988),Mo
ri et al.,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.150:1237(198
8),及びFurutani et al.,Nucl
eic Acid Res.13:5869(198
5)〕。更に、ヒト及びネズミのIL−1β前駆体はい
ずれも、in vitroで合成したときに、コンピテ
ントミクロソーム膜を越えて転位せず、N結合炭水化物
付加部位が存在するにも拘わらず、N結合炭水化物を含
まない。最後に、光学及び電子顕微鏡調査ではIL−1
βは細胞質に免疫局在しており、古典的分泌に関与する
オルガネラ内にIL−1βは見い出されなかった〔Ba
yne et al.,J.Exp.Med.163:
1267−1280(1986)及びSinger e
t al.,J.Exp.Med.167:389(1
988)〕。
古典的に分泌されるタンパク質とは異なる独特の経路で
起こるという仮説を支持する観察も幾つかある。5つの
異なる種由来のIL−1βは疎水性シグナル配列を含ま
ない〔Lomedico et al.,Nature
312:458(1984)、Auron eta
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
81;7907(1984),Gray et a
l.,J.Immunol.137:3644(198
6),Maliszewski et al.,Mo
l.Immunol.25:429(1988),Mo
ri et al.,Biochem.Biophy
s.Res.Commun.150:1237(198
8),及びFurutani et al.,Nucl
eic Acid Res.13:5869(198
5)〕。更に、ヒト及びネズミのIL−1β前駆体はい
ずれも、in vitroで合成したときに、コンピテ
ントミクロソーム膜を越えて転位せず、N結合炭水化物
付加部位が存在するにも拘わらず、N結合炭水化物を含
まない。最後に、光学及び電子顕微鏡調査ではIL−1
βは細胞質に免疫局在しており、古典的分泌に関与する
オルガネラ内にIL−1βは見い出されなかった〔Ba
yne et al.,J.Exp.Med.163:
1267−1280(1986)及びSinger e
t al.,J.Exp.Med.167:389(1
988)〕。
【0007】活性化された単球におけるパルス−チェイ
ス実験は、IL−1βの分泌がプロセッシングに関係し
得ることを示している。かかる実験では、細胞内に蓄積
しているプロセッシングされていない前駆体が細胞外の
成熟IL−1βに変化するのが追跡される〔Hazud
a et al.,J.Biol.Chem.263:
8473(1989)〕。IL−1β前駆体は時として
細胞外に認められることがあるが、過剰のトリプシン、
キモトリプシンまたはコラゲナーゼの存在下に高濃度で
インキュベートしない限り、17kDaのIL−1βの
形成に寄与するとは考えられない〔Hazuda et
al.,J.Biol.Chem.264:1689
(1989),Black et al.,J.Bio
l.Chem.263:9437(1988)及びHa
zuda et al.,J.Biol.Chem.2
65:6318(1990)〕。しかしながら、これら
のプロテイナーゼはいずれも、Ala117を端部に持
つ成熟IL−1βを生成し得るとは考えられない。
ス実験は、IL−1βの分泌がプロセッシングに関係し
得ることを示している。かかる実験では、細胞内に蓄積
しているプロセッシングされていない前駆体が細胞外の
成熟IL−1βに変化するのが追跡される〔Hazud
a et al.,J.Biol.Chem.263:
8473(1989)〕。IL−1β前駆体は時として
細胞外に認められることがあるが、過剰のトリプシン、
キモトリプシンまたはコラゲナーゼの存在下に高濃度で
インキュベートしない限り、17kDaのIL−1βの
形成に寄与するとは考えられない〔Hazuda et
al.,J.Biol.Chem.264:1689
(1989),Black et al.,J.Bio
l.Chem.263:9437(1988)及びHa
zuda et al.,J.Biol.Chem.2
65:6318(1990)〕。しかしながら、これら
のプロテイナーゼはいずれも、Ala117を端部に持
つ成熟IL−1βを生成し得るとは考えられない。
【0008】IL−1β前駆体を17kDaの成熟IL
−1βに変えるタンパク質加水分解成熟は、Asp11
6とAla117の間の切断から生じることは明らかで
ある。IL−1β前駆体をAsp116−Ala117
及び相同部位のAsp27−Gly28で切断し、Al
a117に適当なアミノ末端を有する成熟IL−1βを
生成し得る、インターロイキン−1変換酵素(Inte
rleukin−1Converting Enzym
e,ICE)と称されるエンドプロテイナーゼが同定さ
れている。位置116にあるAspは、AspをAla
〔Kostura et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.86:5227−5231(1
989)〕または他のアミノ酸〔Howard et
al.,J.Immunol.,147,2964−9
(1991)〕で置換するとこの切断が阻害されること
から、切断に必須であることが判っている。
−1βに変えるタンパク質加水分解成熟は、Asp11
6とAla117の間の切断から生じることは明らかで
ある。IL−1β前駆体をAsp116−Ala117
及び相同部位のAsp27−Gly28で切断し、Al
a117に適当なアミノ末端を有する成熟IL−1βを
生成し得る、インターロイキン−1変換酵素(Inte
rleukin−1Converting Enzym
e,ICE)と称されるエンドプロテイナーゼが同定さ
れている。位置116にあるAspは、AspをAla
〔Kostura et al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.86:5227−5231(1
989)〕または他のアミノ酸〔Howard et
al.,J.Immunol.,147,2964−9
(1991)〕で置換するとこの切断が阻害されること
から、切断に必須であることが判っている。
【0009】ICE活性は、該酵素を天然に産生する細
胞からのみ入手可能である。ICE活性を有する粗細胞
溶解物は上記細胞から入手可能である〔Black,
R.A.et al.,1989,FEBS Let
t.,247,pp386−90;及びKostur
a.M.J.et al.,1989,P.N.A.
S.USA,86,pp5227−31,Howar
d,A.et al.,1991,J.Immuno
l.,印刷中〕。しかしながら、天然資源からICEを
精製しても、該酵素の広範な研究または実用に必要とさ
れる量を得ることはできない。
胞からのみ入手可能である。ICE活性を有する粗細胞
溶解物は上記細胞から入手可能である〔Black,
R.A.et al.,1989,FEBS Let
t.,247,pp386−90;及びKostur
a.M.J.et al.,1989,P.N.A.
S.USA,86,pp5227−31,Howar
d,A.et al.,1991,J.Immuno
l.,印刷中〕。しかしながら、天然資源からICEを
精製しても、該酵素の広範な研究または実用に必要とさ
れる量を得ることはできない。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、プレ
IL−1βを、アミノ末端のアミノ酸としてAla117
を有する生物学的に活性な成熟IL−1βに変換し得
る、組換え生産されたICEをコードするcDNAを提
供することである。本発明の別の目的は、全長ICEま
たは酵素のそれぞれ20kDa及び10kDaのサブユ
ニットをコードするcDNAを含む発現ベクターを提供
することである。本発明の別の目的は、全長プレIL−
1β、ICE及び/または酵素のそれぞれ20kDa及
び10kDaのサブユニットをコードするcDNAを含
む組換え宿主細胞を提供することである。更に別の目的
は、組換え宿主細胞中でICE及びIL−1βを同時発
現させて、生物学的に活性のIL−1βを生産する方法
を提供することである。本発明の更に別の目的は、20
kDaのICEサブユニット単離体及び10kDaのI
CEサブユニット単離体を提供することである。本発明
の更に別の目的は、全長ICEを提供することである。
更に別の目的は、20kDaまたは10kDaのICE
サブユニットのいずれかに結合する単一特異性抗体を提
供すること、及びかかる抗体を診断試薬として使用する
ことである。
IL−1βを、アミノ末端のアミノ酸としてAla117
を有する生物学的に活性な成熟IL−1βに変換し得
る、組換え生産されたICEをコードするcDNAを提
供することである。本発明の別の目的は、全長ICEま
たは酵素のそれぞれ20kDa及び10kDaのサブユ
ニットをコードするcDNAを含む発現ベクターを提供
することである。本発明の別の目的は、全長プレIL−
1β、ICE及び/または酵素のそれぞれ20kDa及
び10kDaのサブユニットをコードするcDNAを含
む組換え宿主細胞を提供することである。更に別の目的
は、組換え宿主細胞中でICE及びIL−1βを同時発
現させて、生物学的に活性のIL−1βを生産する方法
を提供することである。本発明の更に別の目的は、20
kDaのICEサブユニット単離体及び10kDaのI
CEサブユニット単離体を提供することである。本発明
の更に別の目的は、全長ICEを提供することである。
更に別の目的は、20kDaまたは10kDaのICE
サブユニットのいずれかに結合する単一特異性抗体を提
供すること、及びかかる抗体を診断試薬として使用する
ことである。
【0011】
【課題を解決するための手段】単球細胞系cDNAライ
ブラリーから、全長形態をコードする相補的DNA(c
DNA)を同定し、それらから、それぞれ20kDa及
び10kDaのICEサブユニットを誘導する。cDN
Aを完全に配列決定し、組換え宿主中で発現させるため
に発現ベクター中にクローニングする。cDNAは、組
換え全長ICE並びに酵素のそれぞれ20kDa及び1
0kDaのサブユニットを生産するのに有効である。
ブラリーから、全長形態をコードする相補的DNA(c
DNA)を同定し、それらから、それぞれ20kDa及
び10kDaのICEサブユニットを誘導する。cDN
Aを完全に配列決定し、組換え宿主中で発現させるため
に発現ベクター中にクローニングする。cDNAは、組
換え全長ICE並びに酵素のそれぞれ20kDa及び1
0kDaのサブユニットを生産するのに有効である。
【0012】本発明は、IL−1産生細胞から単離され
るプレIL−1β変換酵素(ICE)をコードするcD
NAに係わる。本明細書中でICEとは、IL−1β前
駆体の位置116にあるアルパラギン酸(Asp116)
と位置117にあるアラニン(Ala117)の間のペプ
チド結合、及び位置27にあるアルパラギン酸(Asp
27)と位置28にあるグリシン(Gly28)の間のペプ
チド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。
るプレIL−1β変換酵素(ICE)をコードするcD
NAに係わる。本明細書中でICEとは、IL−1β前
駆体の位置116にあるアルパラギン酸(Asp116)
と位置117にあるアラニン(Ala117)の間のペプ
チド結合、及び位置27にあるアルパラギン酸(Asp
27)と位置28にあるグリシン(Gly28)の間のペプ
チド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。
【0013】ヒトIL−1βのアミノ酸配列は既知であ
る〔March et al.,Nature 31
5:641−647(1985)〕。IL−1βを産生
し得る哺乳動物細胞としては、限定的ではないが、ケラ
チノサイト、内皮細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細
胞、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリ
オーム細胞、単核食細胞、顆粒球、T及びBリンパ球、
並びにNK細胞を挙げることができる。IL−1βを産
生する形質転換哺乳動物細胞としては、限定的ではない
が、P388D1、J774、THP.1、Mono
Mac 6及びU−937のような単球白血病系、EB
V形質転換ヒトBリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケ
ラチノサイトを挙げることができる。本発明に好ましい
細胞系としては、正常ヒト末梢血単球及びTHP.1細
胞を挙げることができるが、最も好ましい細胞はTH
P.1細胞である。
る〔March et al.,Nature 31
5:641−647(1985)〕。IL−1βを産生
し得る哺乳動物細胞としては、限定的ではないが、ケラ
チノサイト、内皮細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細
胞、皮膚線維芽細胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリ
オーム細胞、単核食細胞、顆粒球、T及びBリンパ球、
並びにNK細胞を挙げることができる。IL−1βを産
生する形質転換哺乳動物細胞としては、限定的ではない
が、P388D1、J774、THP.1、Mono
Mac 6及びU−937のような単球白血病系、EB
V形質転換ヒトBリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケ
ラチノサイトを挙げることができる。本発明に好ましい
細胞系としては、正常ヒト末梢血単球及びTHP.1細
胞を挙げることができるが、最も好ましい細胞はTH
P.1細胞である。
【0014】他の細胞及び細胞系も、ICE cDNA
を単離するのに使用が適し得る。適当な細胞系の選択
は、細胞抽出物またはならし培地においてICE活性を
スクリーニングすることにより行ない得る。ICE活性
を検出する方法は当分野において良く知られており〔K
ostura,M.J.et al.,1989,P.
N.A.S.USA,86,pp.5227−523
1〕、IL−1β前駆体の成熟IL−1βへの変換を測
定するものである。このアッセイにおいてICE活性を
有する細胞は,ICE cDNAの単離に適していると
言える。
を単離するのに使用が適し得る。適当な細胞系の選択
は、細胞抽出物またはならし培地においてICE活性を
スクリーニングすることにより行ない得る。ICE活性
を検出する方法は当分野において良く知られており〔K
ostura,M.J.et al.,1989,P.
N.A.S.USA,86,pp.5227−523
1〕、IL−1β前駆体の成熟IL−1βへの変換を測
定するものである。このアッセイにおいてICE活性を
有する細胞は,ICE cDNAの単離に適していると
言える。
【0015】ヒト末梢血単球はロイコフォレーシス(l
eukophoresis)によって健康なドナーから
入手し、まずリンパ球分離培地(Lymphocyte
Separation Media,Organon
Teknika)により沈降し、次いでWicker
et al.,Cell.Immunol.106:
318−329(1978)に記載のごとくベックマン
向流遠心機(Beckman counterflow
centrifuge)において分粒(elutri
ation)することにより精製される。単球は、まず
抗MACl抗体で標識し、次いで当分野においては公知
の標準方法を使用してFACS分析することにより同定
する。
eukophoresis)によって健康なドナーから
入手し、まずリンパ球分離培地(Lymphocyte
Separation Media,Organon
Teknika)により沈降し、次いでWicker
et al.,Cell.Immunol.106:
318−329(1978)に記載のごとくベックマン
向流遠心機(Beckman counterflow
centrifuge)において分粒(elutri
ation)することにより精製される。単球は、まず
抗MACl抗体で標識し、次いで当分野においては公知
の標準方法を使用してFACS分析することにより同定
する。
【0016】本発明は、IL−1産生細胞から単離され
る、プレIL−1βコンバーターゼ(converta
se)とも記載されている独特のプレIL−1β変換酵
素(ICE)に係わる。プレIL−1β変換酵素または
コンバーターゼとは、本明細書においては、プレIL−
1β分子の位置116にあるアスパラギン酸(Asp1
16)と位置117にあるアラニン(Ala117)の
間のペプチド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。ヒ
トIL−1βのアミノ酸配列は既知である〔March
et al.,Nature 315:641−64
7(1985)〕。IL−1βを産生し得る哺乳動物細
胞としては、限定的ではないが、ケラチノサイト、内皮
細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細胞、皮膚線維芽細
胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリオーム細胞、単核
食細胞、顆粒球、T及びBリンパ球、並びにNK細胞を
挙げることができる。IL−1βを産生する形質転換哺
乳動物細胞としては、限定的ではないが、P388D
1、J774、THP−1、U−937及びMono
Mac 6のような単球性白血病系;EBV形質転換ヒ
トBリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケラチノサイト
を挙げることができる。本発明に好ましい細胞として
は、正常ヒト末梢血単球、Mono Mac6細胞及び
THP−1細胞を挙げることができるが、最も好ましい
細胞はTHP−1細胞である。
る、プレIL−1βコンバーターゼ(converta
se)とも記載されている独特のプレIL−1β変換酵
素(ICE)に係わる。プレIL−1β変換酵素または
コンバーターゼとは、本明細書においては、プレIL−
1β分子の位置116にあるアスパラギン酸(Asp1
16)と位置117にあるアラニン(Ala117)の
間のペプチド結合を特異的に切断し得る酵素を指す。ヒ
トIL−1βのアミノ酸配列は既知である〔March
et al.,Nature 315:641−64
7(1985)〕。IL−1βを産生し得る哺乳動物細
胞としては、限定的ではないが、ケラチノサイト、内皮
細胞、糸球体間質細胞、胸腺上皮細胞、皮膚線維芽細
胞、軟骨細胞、星状神経膠細胞、グリオーム細胞、単核
食細胞、顆粒球、T及びBリンパ球、並びにNK細胞を
挙げることができる。IL−1βを産生する形質転換哺
乳動物細胞としては、限定的ではないが、P388D
1、J774、THP−1、U−937及びMono
Mac 6のような単球性白血病系;EBV形質転換ヒ
トBリンパ芽球症系及び形質転換ネズミケラチノサイト
を挙げることができる。本発明に好ましい細胞として
は、正常ヒト末梢血単球、Mono Mac6細胞及び
THP−1細胞を挙げることができるが、最も好ましい
細胞はTHP−1細胞である。
【0017】Tsuchiya et al.,In
t.J.Cancer 26:171−176(198
0)に記載されているヒトTHP−1細胞(Ameri
canType Culture Collectio
n,ATCC TIB 202)のようなインターロイ
キン−1β産生細胞は、例えば約10%ウシ胎児血清
(HyClone;検出可能な内毒素を含まない既定血
清)を含むダルベッコ改良最小必須培地(Hazelt
on Research Products)または約
9%ウマ血清を含むIscove改良ダルベッコ培地
(JRH Biosciences)において約37℃
で浮遊培養する。細胞は、回転壜、Wheatonター
ボリフト46ルットル浮遊フラスコ(Wheato
n)、または、75、200もしくは300リットル発
酵器内で増殖させ、約1〜2×106細胞/ml(3〜
4倍増/週)を毎週回収する。浮遊フラスコまたは発酵
器内に使用する培地は、細胞にかかる剪断力を小さくす
るために約0.1〜0.3%のF6pluronicを
含んでもよい。細胞は、一次培養のあと、典型的には3
〜4カ月以上増殖させる。
t.J.Cancer 26:171−176(198
0)に記載されているヒトTHP−1細胞(Ameri
canType Culture Collectio
n,ATCC TIB 202)のようなインターロイ
キン−1β産生細胞は、例えば約10%ウシ胎児血清
(HyClone;検出可能な内毒素を含まない既定血
清)を含むダルベッコ改良最小必須培地(Hazelt
on Research Products)または約
9%ウマ血清を含むIscove改良ダルベッコ培地
(JRH Biosciences)において約37℃
で浮遊培養する。細胞は、回転壜、Wheatonター
ボリフト46ルットル浮遊フラスコ(Wheato
n)、または、75、200もしくは300リットル発
酵器内で増殖させ、約1〜2×106細胞/ml(3〜
4倍増/週)を毎週回収する。浮遊フラスコまたは発酵
器内に使用する培地は、細胞にかかる剪断力を小さくす
るために約0.1〜0.3%のF6pluronicを
含んでもよい。細胞は、一次培養のあと、典型的には3
〜4カ月以上増殖させる。
【0018】細胞を窒素キャビテーション、低張溶解な
どによって破壊することにより、ヒト末梢血単球または
THP−1から無細胞抽出物を調製する。遠心分離によ
って細胞を回収し、pH約7.4のリン酸緩衝溶液のよ
うな等張緩衝液中で洗浄することができる。低張溶解
は、細胞を約10倍容の等張緩衝液(約10mM KC
l,約20mM HEPES,pH約7.4,約1.5
mM MgCl2、約0.1mM EDTA)または
(約25mM HEPES,pH約7.5,約5mM
MgCl2及び1mM EGTA)中で洗浄し、遠心分
離によって回収することで行なう。溶解緩衝液は、ジチ
オトレイトール(DTT)のような還元剤を含むことも
できる。低張緩衝液は通常、PMSF、ロイペプチン及
びペプスタチンのようなプロテアーゼ阻害剤を含む。細
胞を約3培容の低張緩衝液中に懸濁させ、氷上に約20
分間置き、Dounceホモジナイザー中で約20スト
ロークで溶解する。100または300mlのDoun
ceホモジナイザーを一杯に満たして、それぞれ約25
または約15ストロークで約90〜95%の細胞が破壊
される。窒素加圧破壊もまた低張緩衝液中で行なう。再
懸濁させた細胞を、窒素圧400psiの窒素加圧セル
中に入れ、約4℃で約30分間振盪する。圧力を解放
し、加圧セルから細胞を取り出すことにより破壊が行わ
れる。細胞溶解物は、約400〜約1000×g(上清
S1)、約30,000×g(上清S2)及び約30
0,000×g(上清S3)の連続遠心ステップによっ
て清澄化する。細胞溶解物は以下の手順で清澄化するこ
ともできる。ベックマンGPR遠心機において約300
0rpm、約5℃で、約10分間遠心することにより、
未破壊の細胞及び核を除去する。核を除いた上清液を、
SS34ロータを備えたSorval遠心機において約
16,000rpmで約20分間遠心する。更に、上清
液を、ベックマン遠心機(50.2Tiロータ)におい
て約50,000rpmまたは45,000rpm(4
5Tiロータ)で約60分間遠心することにより清澄化
する。得られた上清液は、約2mM DTTと0.1%
CHAPSを加えて約−80℃で保存する。
どによって破壊することにより、ヒト末梢血単球または
THP−1から無細胞抽出物を調製する。遠心分離によ
って細胞を回収し、pH約7.4のリン酸緩衝溶液のよ
うな等張緩衝液中で洗浄することができる。低張溶解
は、細胞を約10倍容の等張緩衝液(約10mM KC
l,約20mM HEPES,pH約7.4,約1.5
mM MgCl2、約0.1mM EDTA)または
(約25mM HEPES,pH約7.5,約5mM
MgCl2及び1mM EGTA)中で洗浄し、遠心分
離によって回収することで行なう。溶解緩衝液は、ジチ
オトレイトール(DTT)のような還元剤を含むことも
できる。低張緩衝液は通常、PMSF、ロイペプチン及
びペプスタチンのようなプロテアーゼ阻害剤を含む。細
胞を約3培容の低張緩衝液中に懸濁させ、氷上に約20
分間置き、Dounceホモジナイザー中で約20スト
ロークで溶解する。100または300mlのDoun
ceホモジナイザーを一杯に満たして、それぞれ約25
または約15ストロークで約90〜95%の細胞が破壊
される。窒素加圧破壊もまた低張緩衝液中で行なう。再
懸濁させた細胞を、窒素圧400psiの窒素加圧セル
中に入れ、約4℃で約30分間振盪する。圧力を解放
し、加圧セルから細胞を取り出すことにより破壊が行わ
れる。細胞溶解物は、約400〜約1000×g(上清
S1)、約30,000×g(上清S2)及び約30
0,000×g(上清S3)の連続遠心ステップによっ
て清澄化する。細胞溶解物は以下の手順で清澄化するこ
ともできる。ベックマンGPR遠心機において約300
0rpm、約5℃で、約10分間遠心することにより、
未破壊の細胞及び核を除去する。核を除いた上清液を、
SS34ロータを備えたSorval遠心機において約
16,000rpmで約20分間遠心する。更に、上清
液を、ベックマン遠心機(50.2Tiロータ)におい
て約50,000rpmまたは45,000rpm(4
5Tiロータ)で約60分間遠心することにより清澄化
する。得られた上清液は、約2mM DTTと0.1%
CHAPSを加えて約−80℃で保存する。
【0019】ICEの精製は、放射性標識プレIL−1
βを基質として使用するin vitro切断アッセイ
によってモニターする。プレIL−1βの全コーディン
グ配列を含む約1.5キロベース(kb)のcDNAク
ローンをEcoRI−PstIで切断したpGEM−3
プラスミドDNA(Promega−Biotec)中
に挿入し、標準方法に従ってE.coli中で増殖させ
る〔Maniatiset al.,Molecula
r Cloning,A Laboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor,C
old Spring Harbor,NY(198
2)〕。精製プラスミドをPstIを用いて直線化し、
T7 RNAポリメラーゼin vitro転写系(P
romega−Biotec)を使用して転写させ、次
いで製造業者の指示通りにmRNAをプロセッシングす
る。翻訳は、製造業者の指示通りに25μCiの35S−
Methionine(Amersham)の存在下
に、ミクロコッカスヌクレアーゼ(micrococc
al nuclease)で処理したウサギ網状赤血球
抽出物(Promega Biotec)をin vi
tro合成mRNAを用いてプログラミングすることに
より行われる。これで、ナトリウムドデシルスルフェー
トポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAG
E)において、見掛けの分子量が約34及び約31キロ
ダルトン(kDa)の二重鎖として移動した標識プレI
L−1βが与えられた。プレIL−1βの切断は、放射
性標識前駆体を含むウサギ網状赤血球抽出物1μlを、
IL−1β変換酵素を含む試料約10〜約20μlと一
緒にインキュベートすることにより行なう。プレIL−
1βを切断すると17.5kDaの成熟IL−1βが得
られることは、Laemmliの方法〔Nature
227:680−685(1970)〕に従うSDS−
PAGE、次いで当分野においては公知の手順に従うフ
ルオログラフィーによって分析することができる。酵素
切断の特異性及び切断産物の特性は、天然プレIL−1
β及び突然変異プレIL−1βを用いて決定される。突
然変異プレIL−1βの構築は、当分野においては公知
の特定部位オリゴヌクレオチド突然変異誘発によって行
われる。アミノ酸115〜126に対応しApaLI−
HpaII末端を有する、ヌクレオチド27個の長さ
(27mer)の合成二重鎖長鎖オリゴデオキシリボヌ
クレオチドは、確立された製造業者のプロトコルに従っ
てApplied Biosystems DNA 3
80A合成装置において合成される。27merは、プ
レIL−1βのプロセッシング部位の隣りの位置−1
に、Asp116−−>Ala116のアミノ酸置換を
コードする。オリゴヌクレオチドは当分野において公知
の方法で、全長プレIL−1β cDNAを切断して得
られるEcoRI−ApaLI及びHpaII−Pst
Iフラグメントに連結される。プレIL−1β翻訳産物
のヒトヌクレオチド及び推定アミノ酸配列はMarch
et al.,によってNature 315:64
1−647(1985)に記載されている。連結フラグ
メントは、EcoRI−PstI切断pGEM−3を含
む連結反応に加えられる。pGEM/IL−1β突然変
異体を含むクローンは、突然変異オリゴヌクレオチド配
列とハイブリダイズすることにより同定される。クロー
ンは、制限エンドヌクレアーゼ切断によってマップ作成
し、DNA配列を決定して突然変異の信頼性を検証す
る。突然変異構築物または天然構築物を担うベクターの
転写から1.5キロベース(kb)のmRNAが生成さ
れ、翻訳されると、34及び31kDaの二重鎖タンパ
ク質を生じる。
βを基質として使用するin vitro切断アッセイ
によってモニターする。プレIL−1βの全コーディン
グ配列を含む約1.5キロベース(kb)のcDNAク
ローンをEcoRI−PstIで切断したpGEM−3
プラスミドDNA(Promega−Biotec)中
に挿入し、標準方法に従ってE.coli中で増殖させ
る〔Maniatiset al.,Molecula
r Cloning,A Laboratory Ma
nual,Cold Spring Harbor,C
old Spring Harbor,NY(198
2)〕。精製プラスミドをPstIを用いて直線化し、
T7 RNAポリメラーゼin vitro転写系(P
romega−Biotec)を使用して転写させ、次
いで製造業者の指示通りにmRNAをプロセッシングす
る。翻訳は、製造業者の指示通りに25μCiの35S−
Methionine(Amersham)の存在下
に、ミクロコッカスヌクレアーゼ(micrococc
al nuclease)で処理したウサギ網状赤血球
抽出物(Promega Biotec)をin vi
tro合成mRNAを用いてプログラミングすることに
より行われる。これで、ナトリウムドデシルスルフェー
トポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAG
E)において、見掛けの分子量が約34及び約31キロ
ダルトン(kDa)の二重鎖として移動した標識プレI
L−1βが与えられた。プレIL−1βの切断は、放射
性標識前駆体を含むウサギ網状赤血球抽出物1μlを、
IL−1β変換酵素を含む試料約10〜約20μlと一
緒にインキュベートすることにより行なう。プレIL−
1βを切断すると17.5kDaの成熟IL−1βが得
られることは、Laemmliの方法〔Nature
227:680−685(1970)〕に従うSDS−
PAGE、次いで当分野においては公知の手順に従うフ
ルオログラフィーによって分析することができる。酵素
切断の特異性及び切断産物の特性は、天然プレIL−1
β及び突然変異プレIL−1βを用いて決定される。突
然変異プレIL−1βの構築は、当分野においては公知
の特定部位オリゴヌクレオチド突然変異誘発によって行
われる。アミノ酸115〜126に対応しApaLI−
HpaII末端を有する、ヌクレオチド27個の長さ
(27mer)の合成二重鎖長鎖オリゴデオキシリボヌ
クレオチドは、確立された製造業者のプロトコルに従っ
てApplied Biosystems DNA 3
80A合成装置において合成される。27merは、プ
レIL−1βのプロセッシング部位の隣りの位置−1
に、Asp116−−>Ala116のアミノ酸置換を
コードする。オリゴヌクレオチドは当分野において公知
の方法で、全長プレIL−1β cDNAを切断して得
られるEcoRI−ApaLI及びHpaII−Pst
Iフラグメントに連結される。プレIL−1β翻訳産物
のヒトヌクレオチド及び推定アミノ酸配列はMarch
et al.,によってNature 315:64
1−647(1985)に記載されている。連結フラグ
メントは、EcoRI−PstI切断pGEM−3を含
む連結反応に加えられる。pGEM/IL−1β突然変
異体を含むクローンは、突然変異オリゴヌクレオチド配
列とハイブリダイズすることにより同定される。クロー
ンは、制限エンドヌクレアーゼ切断によってマップ作成
し、DNA配列を決定して突然変異の信頼性を検証す
る。突然変異構築物または天然構築物を担うベクターの
転写から1.5キロベース(kb)のmRNAが生成さ
れ、翻訳されると、34及び31kDaの二重鎖タンパ
ク質を生じる。
【0020】THP−1精製プレIL−1β変換酵素
を、Asp116がAla116に突然変異したプレI
L−1βと組み合わせても、突然変異前駆体の切断はわ
ずかしか、または全く見られなかった。プレIL−1β
とプレIL−1β変換酵素の相互作用から生じる正常切
断産物は、成熟IL−1βのN末端アミノ酸配列を有す
る17.5kDポリペプチドである。即ちプレIL−1
βのAsp116残基は、IL−1β変換酵素による成
熟IL−1βのプロセッシングに重要である。
を、Asp116がAla116に突然変異したプレI
L−1βと組み合わせても、突然変異前駆体の切断はわ
ずかしか、または全く見られなかった。プレIL−1β
とプレIL−1β変換酵素の相互作用から生じる正常切
断産物は、成熟IL−1βのN末端アミノ酸配列を有す
る17.5kDポリペプチドである。即ちプレIL−1
βのAsp116残基は、IL−1β変換酵素による成
熟IL−1βのプロセッシングに重要である。
【0021】切断産物のバイオ活性は、IL−1膜レセ
プターに結合する、放射性標識及びプロセッシングされ
たIL−1βの量を測定することにより定量化される。
このアッセイはChin et al.,J.Exp.
Med.165:70−86(1987)及びTocc
i et al.,J.Immunol.138:11
09−1114(1987)の技術を使用する。プレI
L−1β変換酵素によって野生または天然プレIL−1
βから生成される切断産物は、上述のごときレセプター
結合競合アッセイにおいてIL−1βレセプターに結合
する能力によって決定されたところでは、生物学的に活
性である。
プターに結合する、放射性標識及びプロセッシングされ
たIL−1βの量を測定することにより定量化される。
このアッセイはChin et al.,J.Exp.
Med.165:70−86(1987)及びTocc
i et al.,J.Immunol.138:11
09−1114(1987)の技術を使用する。プレI
L−1β変換酵素によって野生または天然プレIL−1
βから生成される切断産物は、上述のごときレセプター
結合競合アッセイにおいてIL−1βレセプターに結合
する能力によって決定されたところでは、生物学的に活
性である。
【0022】上記精製方法によって、実質的に純粋な生
物学的活性ICEが与えられる。
物学的活性ICEが与えられる。
【0023】プレIL−1β変換酵素活性の細胞内位置
を理解するために、パーコール勾配分画法によって調製
した単核細胞フラクションを使用し、切断を調査する。
第1の清澄化ステップから得た細胞ホモジネートを、約
0.25M スクロース、約10mM HEPES,p
H7.4,10mM KCl、1.5mM MgC12
及び0.1mM EDTAを用いて調製した0−100
%プレフォームパーコール勾配(Pharmacia)
上に層状に重ねる。試料負荷勾配を約48,000×g
で約25分間遠心し、1.0mlのフラクションを頂部
から回収する。種々の細胞内小器官(subcellu
lar compartments)に関係する酵素マ
ーカーアッセイを実施する:細胞質ゾル、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ〔Morgorstern et al.,A
nal.Biochem.13:149−161(19
65)〕;リソソーム,N−アセチルβ−D−グルコサ
ミニダーゼ〔Wollen et al.,Bioch
em.78:111−121(1961)〕;形質膜,
5’−ヌクレオチダーゼ〔Rome et al.,C
ell 17:143−153(1979)〕;及びミ
クロソーム,スルファターゼC〔Canonico e
t al.,J.Reticulo.Soc.24:1
15−135(1978)〕。細胞質ゾルフラクソン
は、プレIL−1βを、成熟IL−1βと大きさが同様
の産物に切断し得る唯一のフラクションであった。
を理解するために、パーコール勾配分画法によって調製
した単核細胞フラクションを使用し、切断を調査する。
第1の清澄化ステップから得た細胞ホモジネートを、約
0.25M スクロース、約10mM HEPES,p
H7.4,10mM KCl、1.5mM MgC12
及び0.1mM EDTAを用いて調製した0−100
%プレフォームパーコール勾配(Pharmacia)
上に層状に重ねる。試料負荷勾配を約48,000×g
で約25分間遠心し、1.0mlのフラクションを頂部
から回収する。種々の細胞内小器官(subcellu
lar compartments)に関係する酵素マ
ーカーアッセイを実施する:細胞質ゾル、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ〔Morgorstern et al.,A
nal.Biochem.13:149−161(19
65)〕;リソソーム,N−アセチルβ−D−グルコサ
ミニダーゼ〔Wollen et al.,Bioch
em.78:111−121(1961)〕;形質膜,
5’−ヌクレオチダーゼ〔Rome et al.,C
ell 17:143−153(1979)〕;及びミ
クロソーム,スルファターゼC〔Canonico e
t al.,J.Reticulo.Soc.24:1
15−135(1978)〕。細胞質ゾルフラクソン
は、プレIL−1βを、成熟IL−1βと大きさが同様
の産物に切断し得る唯一のフラクションであった。
【0024】変換酵素活性は細胞質ゾルフラクション中
に存在したため、上清S3に更なる精製ステップを実施
し、実質的に純粋なIL−1β変換酵素を得た。粒状硫
酸アンモニウムを約4℃で約45%飽和となるまで加え
て、上清を沈澱させる。沈澱したタンパク質を約30,
000×gでペレット化し、硫酸アンモニウムを約75
〜約80%飽和とした。この沈澱物をペレット化し、緩
衝液A(約20mMKCl,約25mM HEPES,
pH約7.4,約5.0mM EDTA,約2mM D
TT,約1mM PMSF,約0.01% NP−40
及び約10%グリセロール)中に再懸濁し、約16時間
透析する。透析溶液を約30,000×gで遠心し、粒
状物質を除去する。
に存在したため、上清S3に更なる精製ステップを実施
し、実質的に純粋なIL−1β変換酵素を得た。粒状硫
酸アンモニウムを約4℃で約45%飽和となるまで加え
て、上清を沈澱させる。沈澱したタンパク質を約30,
000×gでペレット化し、硫酸アンモニウムを約75
〜約80%飽和とした。この沈澱物をペレット化し、緩
衝液A(約20mMKCl,約25mM HEPES,
pH約7.4,約5.0mM EDTA,約2mM D
TT,約1mM PMSF,約0.01% NP−40
及び約10%グリセロール)中に再懸濁し、約16時間
透析する。透析溶液を約30,000×gで遠心し、粒
状物質を除去する。
【0025】硫酸アンモニウム沈澱材料の試料を、緩衝
液Aで平衡化しておいたジエチルアミノエチル(DEA
E)アニオン交換カラムに添加する。フラクションを通
る流れを保持し、同じ緩衝液で平衡化しておいたスルフ
ィルプロピル(SP)カチオン交換カラム上に負荷す
る。プレIL−1β変換酵素を、緩衝液A中の約30〜
500mM KClの直線濃度勾配で溶出させる。活性
フラクションを緩衝液Aで約16時間透析する。プレI
L−1β変換酵素は、活性回収率50%の別個のピーク
として溶出した(表1)。
液Aで平衡化しておいたジエチルアミノエチル(DEA
E)アニオン交換カラムに添加する。フラクションを通
る流れを保持し、同じ緩衝液で平衡化しておいたスルフ
ィルプロピル(SP)カチオン交換カラム上に負荷す
る。プレIL−1β変換酵素を、緩衝液A中の約30〜
500mM KClの直線濃度勾配で溶出させる。活性
フラクションを緩衝液Aで約16時間透析する。プレI
L−1β変換酵素は、活性回収率50%の別個のピーク
として溶出した(表1)。
【0026】生物学的に活性なICEのタンパク質成分
を分析するために、上記の分画化ステップから得た試料
に、Laemmliの方法〔Laemmli,Natu
re227:680−685(1970)〕に実質的に
従ってナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を実施した。電気泳動後、単離したタ
ンパク質を、Oakley et al.〔Analy
tical Biochemistry,105:36
1−363(1980)〕によって開発された方法の改
変法を使用して銀で染色すことにより可視化する。IC
Eの段階的精製から得られる電気泳動パターン(図1)
は、最後のTSK及びHAPステップにおいてICE活
性に相関する22kDa及び10kDaのタンパク質の
出現を示している。更に、高度に精製されたICEのカ
ラムフラクション中には24kDaタンパク質の存在も
幾分認められる。
を分析するために、上記の分画化ステップから得た試料
に、Laemmliの方法〔Laemmli,Natu
re227:680−685(1970)〕に実質的に
従ってナトリウムドデシルスルフェートポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を実施した。電気泳動後、単離したタ
ンパク質を、Oakley et al.〔Analy
tical Biochemistry,105:36
1−363(1980)〕によって開発された方法の改
変法を使用して銀で染色すことにより可視化する。IC
Eの段階的精製から得られる電気泳動パターン(図1)
は、最後のTSK及びHAPステップにおいてICE活
性に相関する22kDa及び10kDaのタンパク質の
出現を示している。更に、高度に精製されたICEのカ
ラムフラクション中には24kDaタンパク質の存在も
幾分認められる。
【0027】22kDa及び10kDaのタンパク質
は、口径の小さい(narrow bore)C4逆相
HPLCを使用して個々に単離することができる。SP
精製ICEの200mlアリコートを、脱イオン水中の
0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化しておい
たApplied Biosystems C4(2.
1mm×100mm,300A孔径)逆相カラムに添加
する。0.1%TFA水溶液中の15〜90%アセトニ
トリル直線濃度勾配を使用してタンパク質を26分間溶
出させる。22kDa及び10kDaの成分は、カラム
から純粋な形態で単離することができる(図2)。
は、口径の小さい(narrow bore)C4逆相
HPLCを使用して個々に単離することができる。SP
精製ICEの200mlアリコートを、脱イオン水中の
0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)で平衡化しておい
たApplied Biosystems C4(2.
1mm×100mm,300A孔径)逆相カラムに添加
する。0.1%TFA水溶液中の15〜90%アセトニ
トリル直線濃度勾配を使用してタンパク質を26分間溶
出させる。22kDa及び10kDaの成分は、カラム
から純粋な形態で単離することができる(図2)。
【0028】22kDa及び10kDaのICEサブユ
ニットの分子量を極めて正確に測定するために、各々5
ピコモルのタンパク質を上記方法によって均一になるま
で精製し、Finnigan Triple−Sect
or QuadropoleModel 700エレク
トロスプレー(electrospray)質量分析計
にオンライン接続された毛管液体クロマトグラフィーを
実施した。装置の精度を測定するために基準タンパク質
としてウシシトクロムcを使用し、質量測定の標準誤差
は0.01〜0.02%であることが判明した。エレク
トロスプレーイオン化一次スペクトルのバイオマスデコ
ンボリューション(biomassdeconvolu
tion)の後に、単離した“10kDa”成分は1
0,248原子質量単位(図4)の平均質量を有し、
“22kDa”成分は19,866原子質量単位(図
3)の平均質量を有することが判った。本明細書中、
“22kDa”のICEサブユニットは20kDa I
CEサブユニットと表記し、“10kDa”のICEサ
ブユニットは10kDa ICEサブユニットと表記す
る。これら2種のタンパク質は、完全活性形態のICE
に関係している。20及び10kDaのICEサブユニ
ットと場合によっては同時精製される“24kDa”タ
ンパク質は、SDS−PAGEによって分析すると、2
0kDa ICEサブユニットより約2000ダルトン
大きいので、22kDaタンパク質と表記する。
ニットの分子量を極めて正確に測定するために、各々5
ピコモルのタンパク質を上記方法によって均一になるま
で精製し、Finnigan Triple−Sect
or QuadropoleModel 700エレク
トロスプレー(electrospray)質量分析計
にオンライン接続された毛管液体クロマトグラフィーを
実施した。装置の精度を測定するために基準タンパク質
としてウシシトクロムcを使用し、質量測定の標準誤差
は0.01〜0.02%であることが判明した。エレク
トロスプレーイオン化一次スペクトルのバイオマスデコ
ンボリューション(biomassdeconvolu
tion)の後に、単離した“10kDa”成分は1
0,248原子質量単位(図4)の平均質量を有し、
“22kDa”成分は19,866原子質量単位(図
3)の平均質量を有することが判った。本明細書中、
“22kDa”のICEサブユニットは20kDa I
CEサブユニットと表記し、“10kDa”のICEサ
ブユニットは10kDa ICEサブユニットと表記す
る。これら2種のタンパク質は、完全活性形態のICE
に関係している。20及び10kDaのICEサブユニ
ットと場合によっては同時精製される“24kDa”タ
ンパク質は、SDS−PAGEによって分析すると、2
0kDa ICEサブユニットより約2000ダルトン
大きいので、22kDaタンパク質と表記する。
【0029】種々の方法のうち任意のものを使用して、
ICE cDNAを分子レベルでクローニングすること
ができる。かかる方法としては、限定的ではないが、I
CE遺伝子を直接に機能的発現させ、適当な発現ベクタ
ー系においてICEを含むcDNAライブラリーを構築
することを挙げることができる。別の方法は、バクテオ
リオファージまたはプラスミドシャトルベクターにおい
て構築されたICEを含むcDNAライブラリーを、I
CEサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングする
ことからなる。好ましい方法は、バクテオリオファージ
またはプラスミドシャトルベクターにおいて構築された
ICEを含むcDNAライブラリーを、ICEサブユニ
ットをコードする部分cDNAでスクリーニングするこ
とからなる。この部分cDNAは、精製ICEサブユニ
ットのアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライ
マーを設計して、ICE DNAフラグメントを特異的
PCR増幅することにより得られる。
ICE cDNAを分子レベルでクローニングすること
ができる。かかる方法としては、限定的ではないが、I
CE遺伝子を直接に機能的発現させ、適当な発現ベクタ
ー系においてICEを含むcDNAライブラリーを構築
することを挙げることができる。別の方法は、バクテオ
リオファージまたはプラスミドシャトルベクターにおい
て構築されたICEを含むcDNAライブラリーを、I
CEサブユニットのアミノ酸配列から設計された標識オ
リゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングする
ことからなる。好ましい方法は、バクテオリオファージ
またはプラスミドシャトルベクターにおいて構築された
ICEを含むcDNAライブラリーを、ICEサブユニ
ットをコードする部分cDNAでスクリーニングするこ
とからなる。この部分cDNAは、精製ICEサブユニ
ットのアミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライ
マーを設計して、ICE DNAフラグメントを特異的
PCR増幅することにより得られる。
【0030】他のタイプのライブラリー及び他の細胞ま
たは細胞系から構築されたライブラリーも、ICEをコ
ードするDNAを単離するのに有効となり得ることは当
業者には容易に明らかである。他のタイプのライブラリ
ーとしては、限定的ではないが、THP.1細胞以外の
他の細胞または細胞系から誘導されるcDNAライブラ
リーや、ゲノムDNAライブラリーを挙げることができ
る。
たは細胞系から構築されたライブラリーも、ICEをコ
ードするDNAを単離するのに有効となり得ることは当
業者には容易に明らかである。他のタイプのライブラリ
ーとしては、限定的ではないが、THP.1細胞以外の
他の細胞または細胞系から誘導されるcDNAライブラ
リーや、ゲノムDNAライブラリーを挙げることができ
る。
【0031】適当なcDNAライブラリーは、ICE活
性を有する細胞または細胞系から調製し得ることは当業
者には容易に明らかである。ICE cDNAを単離す
るためのcDNAライブラリーを作製するのに使用する
細胞または細胞系の選択は、まず前述したIL−1β前
駆体切断アッセイを使用して細胞に伴なうICE活性を
測定することにより行ない得る。
性を有する細胞または細胞系から調製し得ることは当業
者には容易に明らかである。ICE cDNAを単離す
るためのcDNAライブラリーを作製するのに使用する
細胞または細胞系の選択は、まず前述したIL−1β前
駆体切断アッセイを使用して細胞に伴なうICE活性を
測定することにより行ない得る。
【0032】cDNAライブラリーの作製は、当分野に
おいて良く知られている標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたcDNAライブラリー構築技
術は、例えばManiatis,T.,Fritsc
h,E.F.,Sambrook,J.,Molecu
lar Cloning:A LaboratoryM
anual(Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Ha
rbor,New York,1982)に記載されて
いる。
おいて良く知られている標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたcDNAライブラリー構築技
術は、例えばManiatis,T.,Fritsc
h,E.F.,Sambrook,J.,Molecu
lar Cloning:A LaboratoryM
anual(Cold Spring Harbor
Laboratory,Cold Spring Ha
rbor,New York,1982)に記載されて
いる。
【0033】ICEをコードするDNAは、適当なゲノ
ムDNAライブラリーから単離し得ることも当業者には
容易に明らかである。
ムDNAライブラリーから単離し得ることも当業者には
容易に明らかである。
【0034】ゲノムDNAライブラリーの構築は、当分
野において良く知られた標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたゲノムDNAライブラリー構
築技術は、例えばManiatis,T.,Frits
ch,E.F.,Sambrook,J.,Molec
ular Cloning:A Laboratory
Manual(Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982)に記載さ
れている。
野において良く知られた標準的な技術によって行なうこ
とができる。良く知られたゲノムDNAライブラリー構
築技術は、例えばManiatis,T.,Frits
ch,E.F.,Sambrook,J.,Molec
ular Cloning:A Laboratory
Manual(Cold Spring Harbo
r Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982)に記載さ
れている。
【0035】好ましい方法によってICE遺伝子をクロ
ーニングするためには、ICEのアミノ酸配列決定が必
要である。これを行なうために、ICEタンパク質を精
製し、自動シークエネーターによって部分アミノ酸の配
列を決定することができる。全アミノ酸配列を決定する
必要はないが、部分ICE DNAフラグメントをPC
R増幅するために、20kDa及び10kDaサブユニ
ットの両方からアミノ酸6〜8個の2つの領域の一次配
列を決定する。
ーニングするためには、ICEのアミノ酸配列決定が必
要である。これを行なうために、ICEタンパク質を精
製し、自動シークエネーターによって部分アミノ酸の配
列を決定することができる。全アミノ酸配列を決定する
必要はないが、部分ICE DNAフラグメントをPC
R増幅するために、20kDa及び10kDaサブユニ
ットの両方からアミノ酸6〜8個の2つの領域の一次配
列を決定する。
【0036】一旦適当なアミノ酸配列が同定されたな
ら、それらをコードし得るDNA配列を合成する。遺伝
コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードす
るのに1つ以上のコドンを使用することができ、従って
1組の類縁DNAオリゴヌクレオチドのいずれかによっ
てアミノ酸配列をコードすることができる。組内のただ
1つのメンバーのみがICE配列と同一であるが、不一
致を含むDNAオリゴヌクレオチドが存在してもICE
DNAにハイブリダイズし得る。不一致のDNAオリ
ゴヌクレオチドでもICE DNAに実質的にハイブリ
ダイズし、ICEをコードするDNAの同定及び単離す
ることができる。
ら、それらをコードし得るDNA配列を合成する。遺伝
コードは縮重しているため、特定のアミノ酸をコードす
るのに1つ以上のコドンを使用することができ、従って
1組の類縁DNAオリゴヌクレオチドのいずれかによっ
てアミノ酸配列をコードすることができる。組内のただ
1つのメンバーのみがICE配列と同一であるが、不一
致を含むDNAオリゴヌクレオチドが存在してもICE
DNAにハイブリダイズし得る。不一致のDNAオリ
ゴヌクレオチドでもICE DNAに実質的にハイブリ
ダイズし、ICEをコードするDNAの同定及び単離す
ることができる。
【0037】好ましい方法を使用し、ポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)に基づく技術とcDNAライブラリース
クリーニングとを使用する2段階方法においてICEを
コードするcDNAクローンを単離する。第1段階で
は、20kDa及び10kDaの精製ICEサブユニッ
トから得たNH2末端及び内側アミノ酸配列情報を使用
して、ICE特異的DNAフラグメントの増幅のための
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第2段
階では、上記フラグメントをクローニングして、TH
P.1細胞(ATCC#TIB 202)から誘導され
た市販のλgt10cDNAライブラリー(Clont
ech)から全長cDNAを単離するためのプローブと
して作用させる。
反応(PCR)に基づく技術とcDNAライブラリース
クリーニングとを使用する2段階方法においてICEを
コードするcDNAクローンを単離する。第1段階で
は、20kDa及び10kDaの精製ICEサブユニッ
トから得たNH2末端及び内側アミノ酸配列情報を使用
して、ICE特異的DNAフラグメントの増幅のための
縮重オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第2段
階では、上記フラグメントをクローニングして、TH
P.1細胞(ATCC#TIB 202)から誘導され
た市販のλgt10cDNAライブラリー(Clont
ech)から全長cDNAを単離するためのプローブと
して作用させる。
【0038】20kDa及び10kDaの精製ICEサ
ブユニット由来のアミノ酸配列情報は、無傷の20kD
a及び10kDaサブユニットと、特定のタンパク質加
水分解切断によって作製した20kDa及び10kDa
サブユニットのペプチドフラグメントとの両方のアミノ
酸配列を、エドマン化学法を使用して自動的に決定する
ことにより得る。20kDa及び10kDaのICEサ
ブユニットの酵素によるフラグメント化は、トリプシン
(Promega)またはエンドプロテイナーゼ As
p.N(Boehringer Mannheim)の
いずれかを使用して行った。消化する前に、個々のIC
Eサブユニットをシステイン残基のところで、4−ビニ
ルピリジンによって還元的アルキル化した。40〜50
pmolの20kDaまたは10kDa ICEサブユ
ニットを、6Mグアニジン−HCl,1mM EDT
A,0.25M Tris−HCl,pH8.5を含む
溶液50μl中に溶解する。2.5μlの71mM β
−メルカプトエタノールを加え、次いで溶液を暗所でア
ルゴン下に室温で2時間インキュベートする。370m
M 4−ビニルピリジン溶液2μlを加え、得られた溶
液を暗所でアルゴン下に室温で更に2時間インキュベー
トする。次いでアルキル化ICEサブユニットを、15
%から90%のBの直線濃度勾配を使用するC−4逆相
クロマトグラフィー(Applied Biosyst
em butyl,7ミクロンカラム)によって26分
間で脱塩した(緩衝液A=0.06%TFA水溶液;緩
衝液B=89.99%アセトニトリル,10%H2O,
0.055%TFA)。トリプシン対ICEサブユニッ
トの比(w/w)を1:100(10ngのトリプシン
に対して1000ng(50pmol)の20kDaサ
ブユニット;5ngのトリプシンに対して500ng
(50pmol)の10kDaサブユニット)として、
50μlの50mM重炭酸アンモニウム緩衝液,pH
9.0中で37℃で16時間、トリプシン消化を行なっ
た。また、エンドプロテイナーゼ Asp.N対ICE
サブユニットの比(w/w)を1:20(40ngのA
sp.Nに対して800ng(40pmol)の20k
Daサブユニット;20ngのAsp.Nに対して40
0ng(40pmol)の10kDaサブユニット)と
して、50μlの50mM重炭酸アンモニウム緩衝液,
pH9.0中で25℃で36時間、エンドプロテイナー
ゼAsp.N消化を行なった。
ブユニット由来のアミノ酸配列情報は、無傷の20kD
a及び10kDaサブユニットと、特定のタンパク質加
水分解切断によって作製した20kDa及び10kDa
サブユニットのペプチドフラグメントとの両方のアミノ
酸配列を、エドマン化学法を使用して自動的に決定する
ことにより得る。20kDa及び10kDaのICEサ
ブユニットの酵素によるフラグメント化は、トリプシン
(Promega)またはエンドプロテイナーゼ As
p.N(Boehringer Mannheim)の
いずれかを使用して行った。消化する前に、個々のIC
Eサブユニットをシステイン残基のところで、4−ビニ
ルピリジンによって還元的アルキル化した。40〜50
pmolの20kDaまたは10kDa ICEサブユ
ニットを、6Mグアニジン−HCl,1mM EDT
A,0.25M Tris−HCl,pH8.5を含む
溶液50μl中に溶解する。2.5μlの71mM β
−メルカプトエタノールを加え、次いで溶液を暗所でア
ルゴン下に室温で2時間インキュベートする。370m
M 4−ビニルピリジン溶液2μlを加え、得られた溶
液を暗所でアルゴン下に室温で更に2時間インキュベー
トする。次いでアルキル化ICEサブユニットを、15
%から90%のBの直線濃度勾配を使用するC−4逆相
クロマトグラフィー(Applied Biosyst
em butyl,7ミクロンカラム)によって26分
間で脱塩した(緩衝液A=0.06%TFA水溶液;緩
衝液B=89.99%アセトニトリル,10%H2O,
0.055%TFA)。トリプシン対ICEサブユニッ
トの比(w/w)を1:100(10ngのトリプシン
に対して1000ng(50pmol)の20kDaサ
ブユニット;5ngのトリプシンに対して500ng
(50pmol)の10kDaサブユニット)として、
50μlの50mM重炭酸アンモニウム緩衝液,pH
9.0中で37℃で16時間、トリプシン消化を行なっ
た。また、エンドプロテイナーゼ Asp.N対ICE
サブユニットの比(w/w)を1:20(40ngのA
sp.Nに対して800ng(40pmol)の20k
Daサブユニット;20ngのAsp.Nに対して40
0ng(40pmol)の10kDaサブユニット)と
して、50μlの50mM重炭酸アンモニウム緩衝液,
pH9.0中で25℃で36時間、エンドプロテイナー
ゼAsp.N消化を行なった。
【0039】規定の時間インキュベートした後、5μl
の10%TFAを加えることにより消化を停止し、得ら
れたペプチドフラグメントを、Applied Bio
systems 130A Separation S
ystemにおけるC−18逆相HPLCによって分画
化する。逆相クロマトグラフィー条件としては、流量2
00μl/分及び温度52℃で動作するVydac C
−18カラム(2.1×100mm)の使用を含む。緩
衝液Aは0.06%TFA水溶液であり、一方、緩衝液
Bは89.99%アセトニトリル/10%H2O/0.
055%TFAである。ペプチドは、2%Bから75%
Bの濃度勾配を用いて60分間、次いで75%Bから9
5%Bの濃度勾配を用いて10分間溶出させ、214n
m(0.25AUFS)において検出する。
の10%TFAを加えることにより消化を停止し、得ら
れたペプチドフラグメントを、Applied Bio
systems 130A Separation S
ystemにおけるC−18逆相HPLCによって分画
化する。逆相クロマトグラフィー条件としては、流量2
00μl/分及び温度52℃で動作するVydac C
−18カラム(2.1×100mm)の使用を含む。緩
衝液Aは0.06%TFA水溶液であり、一方、緩衝液
Bは89.99%アセトニトリル/10%H2O/0.
055%TFAである。ペプチドは、2%Bから75%
Bの濃度勾配を用いて60分間、次いで75%Bから9
5%Bの濃度勾配を用いて10分間溶出させ、214n
m(0.25AUFS)において検出する。
【0040】エドマン化学法による自動アミノ酸配列決
定は、オンラインPTH−アミノ酸同定のために120
Aアナライザーに接続されたApplied Bios
ystems 477A装置において実施した。無傷の
20kDa及び10kDaサブユニットの配列を決定す
るために、15pmolのタンパク質を定期的にシーク
エネーターに与え、また、酵素処理により誘導されたペ
プチドフラグメントについては5〜20pmolを使用
した。
定は、オンラインPTH−アミノ酸同定のために120
Aアナライザーに接続されたApplied Bios
ystems 477A装置において実施した。無傷の
20kDa及び10kDaサブユニットの配列を決定す
るために、15pmolのタンパク質を定期的にシーク
エネーターに与え、また、酵素処理により誘導されたペ
プチドフラグメントについては5〜20pmolを使用
した。
【0041】表3は、無傷のICEサブユニットの配列
分析から決定された、20kDa及び10kDaのIC
Eサブユニットから得られたアミノ酸配列の詳細を示
す。無傷の10kDaタンパク質の配列決定を行なった
とき、相同タンパク質の単一遊離アミノ末端と一致する
単一の配列が常に認められた。無傷の20kDaタンパ
ク質の配列を決定したときには、ほとんどの部分におい
て単一遊離アミノ末端が認められた。しかしながら場合
によっては、無傷の20kDaタンパク質を含む高度に
精製された調製物において、二次配列が検出された。二
次配列が認められたことは、24kDaタンパク質が2
0kDaICEサブユニットと同時精製されることに一
致する(図11)。二次配列が得られたタンパク質は、
一次配列が得られた20kDaタンパク質よりも混合物
中で劣勢であり、二次配列を22kDaタンパク質に割
当てることができる(図3)。22kDaタンパク質と
20kDa ICEサブユニットのアミノ末端配列を比
較すると、22kDaタンパク質は、20kDa IC
EサブユニットのNH2末端に直接対応するアミノ酸配
列と、アミノ酸16個のNH2末端伸長部とを含むこと
が判明した(図16)。24kDaタンパク質と20k
Daタンパク質の重複配列の唯一の相違は、24kDa
タンパク質において+1位置にあるAspがAsnで置
換されていることである。
分析から決定された、20kDa及び10kDaのIC
Eサブユニットから得られたアミノ酸配列の詳細を示
す。無傷の10kDaタンパク質の配列決定を行なった
とき、相同タンパク質の単一遊離アミノ末端と一致する
単一の配列が常に認められた。無傷の20kDaタンパ
ク質の配列を決定したときには、ほとんどの部分におい
て単一遊離アミノ末端が認められた。しかしながら場合
によっては、無傷の20kDaタンパク質を含む高度に
精製された調製物において、二次配列が検出された。二
次配列が認められたことは、24kDaタンパク質が2
0kDaICEサブユニットと同時精製されることに一
致する(図11)。二次配列が得られたタンパク質は、
一次配列が得られた20kDaタンパク質よりも混合物
中で劣勢であり、二次配列を22kDaタンパク質に割
当てることができる(図3)。22kDaタンパク質と
20kDa ICEサブユニットのアミノ末端配列を比
較すると、22kDaタンパク質は、20kDa IC
EサブユニットのNH2末端に直接対応するアミノ酸配
列と、アミノ酸16個のNH2末端伸長部とを含むこと
が判明した(図16)。24kDaタンパク質と20k
Daタンパク質の重複配列の唯一の相違は、24kDa
タンパク質において+1位置にあるAspがAsnで置
換されていることである。
【0042】縮重オリゴヌクレオチドは、20kDa及
び10kDaの両タンパク質のアミノ末端及び内側領域
由来のアミノ酸配列に基づいて設計した(実施例2
3)。20kDaタンパク質においては、アミノ末端プ
ライマーGAYCCNGCNATGCCNAC(配列番
号3)は128倍通りの縮重があり、一方、内側プライ
マー3’−ATRGGNTADTACCTRTT−5’
(配列番号4)は48通りの縮重があった(図17)。
10kDaタンパク質においては、アミノ末端プライマ
ーGCNATHAARAARGCNCA(配列番号5)
は192通りの縮重があり、一方、内側プライマーGT
YTACGGNTGNTGNCT(配列番号6)は12
8通りの縮重があった(図18)。
び10kDaの両タンパク質のアミノ末端及び内側領域
由来のアミノ酸配列に基づいて設計した(実施例2
3)。20kDaタンパク質においては、アミノ末端プ
ライマーGAYCCNGCNATGCCNAC(配列番
号3)は128倍通りの縮重があり、一方、内側プライ
マー3’−ATRGGNTADTACCTRTT−5’
(配列番号4)は48通りの縮重があった(図17)。
10kDaタンパク質においては、アミノ末端プライマ
ーGCNATHAARAARGCNCA(配列番号5)
は192通りの縮重があり、一方、内側プライマーGT
YTACGGNTGNTGNCT(配列番号6)は12
8通りの縮重があった(図18)。
【0043】THP.1細胞ポリA+mRNAから一重
鎖THP.1 cDNAを合成し、PCR鋳型として使
用した。PCRは実質的に、MOPAC法の改変法〔L
eeet al.,Science 239,1288
(1988)〕に記載されているように実施した。各P
CRにおいて、10pmolの各プライマーを、50m
M KCl、10mM TRIS−HCl(pH8.
3)、1.5mM MgCl2、0.01%v/vゼラ
チン、及び20uMの各dNTPからなる終容積10μ
lの緩衝液中で、0.4μgのポリA+mRNAに対し
て合成された量のcDNAに加えた。PCRプログラム
は、100℃で10分間変性し、2単位のTaqポリメ
ラーゼを加えた後、95℃で30秒間のステップ、48
℃で30秒間のステップ及び70℃で1分間のステップ
からなるサイクルを30回繰り返すことからなった。2
0kDaのタンパク質に対しては116bpのPCR産
物が合成され、そのアイデンティティを、内側イノシン
置換オリゴヌクレオチド[ATIGGRTAIATYT
CIGCR](配列番号7)とハイブリダイズすること
により検証し、10kDaのタンパク質に対しては22
1bpのPCR産物が合成され、同様のタイプのプロー
ブ[ATIGARAARGAYTTYATIGC](配
列番号8)を用いて検証した。両PCR産物をBlue
scriptベクター(Stratagene)中にサ
ブクローニングし、チェーンターミネーション法〔Sa
nger et al.,PNAS 74,5463
(1977)〕によって配列決定した。
鎖THP.1 cDNAを合成し、PCR鋳型として使
用した。PCRは実質的に、MOPAC法の改変法〔L
eeet al.,Science 239,1288
(1988)〕に記載されているように実施した。各P
CRにおいて、10pmolの各プライマーを、50m
M KCl、10mM TRIS−HCl(pH8.
3)、1.5mM MgCl2、0.01%v/vゼラ
チン、及び20uMの各dNTPからなる終容積10μ
lの緩衝液中で、0.4μgのポリA+mRNAに対し
て合成された量のcDNAに加えた。PCRプログラム
は、100℃で10分間変性し、2単位のTaqポリメ
ラーゼを加えた後、95℃で30秒間のステップ、48
℃で30秒間のステップ及び70℃で1分間のステップ
からなるサイクルを30回繰り返すことからなった。2
0kDaのタンパク質に対しては116bpのPCR産
物が合成され、そのアイデンティティを、内側イノシン
置換オリゴヌクレオチド[ATIGGRTAIATYT
CIGCR](配列番号7)とハイブリダイズすること
により検証し、10kDaのタンパク質に対しては22
1bpのPCR産物が合成され、同様のタイプのプロー
ブ[ATIGARAARGAYTTYATIGC](配
列番号8)を用いて検証した。両PCR産物をBlue
scriptベクター(Stratagene)中にサ
ブクローニングし、チェーンターミネーション法〔Sa
nger et al.,PNAS 74,5463
(1977)〕によって配列決定した。
【0044】20kDa及び10kDaのICEサブユ
ニット由来のPCR産物の推定核酸配列(それぞれ図1
9及び20,実施例23)は、PCR増幅のためのプラ
イマーまたはプローブの設計において使用しなかった既
に配列決定されているトリプシンペプチド(図19及び
図20)の幾つかと完全な一致を見せる。
ニット由来のPCR産物の推定核酸配列(それぞれ図1
9及び20,実施例23)は、PCR増幅のためのプラ
イマーまたはプローブの設計において使用しなかった既
に配列決定されているトリプシンペプチド(図19及び
図20)の幾つかと完全な一致を見せる。
【0045】実施例23のPCR誘導産物を、THP.
1細胞(Clontech)由来のλgt10cDNA
ライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用した。ライブラリーの平
板培養及びプラークリフト(plaque lift
s)は標準方法で行った〔T.Maniatis,E.
F.Fritsch,J.Sambrook,Mole
cular Cloning:A Laborator
y Manual(Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982)〕。プ
ローブは、ランダムプライマー処理し、32P−dCTP
で標識して高比活性にし、各プローブを用いてライブラ
リーを別個にスクリーニングした(600,000プラ
ーク/スクリーン)。プローブはハイブリダイゼーショ
ン緩衝液(50%ホルムアミド、5X Denhard
ts、6X SSC(1X SSC=0.15M)、
0.5%SDS、100μg/mlサケ精子DNA)に
1×106cpm/mlで加えた。
1細胞(Clontech)由来のλgt10cDNA
ライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイ
ゼーションプローブとして使用した。ライブラリーの平
板培養及びプラークリフト(plaque lift
s)は標準方法で行った〔T.Maniatis,E.
F.Fritsch,J.Sambrook,Mole
cular Cloning:A Laborator
y Manual(Cold Spring Harb
or Laboratory,Cold Spring
Harbor,New York,1982)〕。プ
ローブは、ランダムプライマー処理し、32P−dCTP
で標識して高比活性にし、各プローブを用いてライブラ
リーを別個にスクリーニングした(600,000プラ
ーク/スクリーン)。プローブはハイブリダイゼーショ
ン緩衝液(50%ホルムアミド、5X Denhard
ts、6X SSC(1X SSC=0.15M)、
0.5%SDS、100μg/mlサケ精子DNA)に
1×106cpm/mlで加えた。
【0046】10kDa特異的プローブを使用して11
個のハイブリダイズ陽性ファージを検出し、また、20
kDaプローブを使用して7個のハイブリダイズ陽性フ
ァージを認めた。
個のハイブリダイズ陽性ファージを検出し、また、20
kDaプローブを使用して7個のハイブリダイズ陽性フ
ァージを認めた。
【0047】長さが1.0kb〜1.6kbであって、
アミノ酸404個の単一読取り枠を含む幾つかのcDN
AクローンをpGEMベクター(Promega)中に
サブクローニングし、チェーンターミネーション法〔S
anger et al.,P.N.A.S.USA,
74,pp5463,1977〕によって全体を双方向
から配列決定した。
アミノ酸404個の単一読取り枠を含む幾つかのcDN
AクローンをpGEMベクター(Promega)中に
サブクローニングし、チェーンターミネーション法〔S
anger et al.,P.N.A.S.USA,
74,pp5463,1977〕によって全体を双方向
から配列決定した。
【0048】ICEをコードする全長cDNAの配列を
表5に示し、これをクローンOCP9と称する。クロー
ン化cDNA由来のICEの推定アミノ酸配列を表6に
示す。推定アミノ酸配列の調査から、アミノ酸404個
の大きな単一読取り枠の存在が明らかとなった。天然I
CEの精製20kDa及び10kDaサブユニットから
誘導されるアミノ酸配列と比較すると、読取り枠コーデ
ィング配列内のアミノ酸119個の付加物が、20kD
aサブユニットのアミノ末端に位置している。20kD
a及び10kDaのICEサブユニットの配列に加え
て、24kDaのタンパク質のNH2末端全体がこの読
取り枠においてコードされる。
表5に示し、これをクローンOCP9と称する。クロー
ン化cDNA由来のICEの推定アミノ酸配列を表6に
示す。推定アミノ酸配列の調査から、アミノ酸404個
の大きな単一読取り枠の存在が明らかとなった。天然I
CEの精製20kDa及び10kDaサブユニットから
誘導されるアミノ酸配列と比較すると、読取り枠コーデ
ィング配列内のアミノ酸119個の付加物が、20kD
aサブユニットのアミノ末端に位置している。20kD
a及び10kDaのICEサブユニットの配列に加え
て、24kDaのタンパク質のNH2末端全体がこの読
取り枠においてコードされる。
【0049】質量分析計で測定した分子量と、推定アミ
ノ酸配列によって計算した分子量とを比較すると、20
kDa及び10kDaのICEサブユニットの両方にお
いて分子量に正確な相関がある。10kDaサブユニッ
トでは、推定配列から決定された分子量は10,242
(アミノ酸317〜404)であり、これは質量分析計
による測定値と全く一致した。20kDaサブユニット
では、推定配列(19,844、アミノ酸120〜29
7)と質量分析計による測定値とで20原子質量単位未
満の差が認められる。
ノ酸配列によって計算した分子量とを比較すると、20
kDa及び10kDaのICEサブユニットの両方にお
いて分子量に正確な相関がある。10kDaサブユニッ
トでは、推定配列から決定された分子量は10,242
(アミノ酸317〜404)であり、これは質量分析計
による測定値と全く一致した。20kDaサブユニット
では、推定配列(19,844、アミノ酸120〜29
7)と質量分析計による測定値とで20原子質量単位未
満の差が認められる。
【0050】個々のICEサブユニットを直接エドマン
配列決定することにより決定されたアミノ酸配列と、c
DNA由来の推定アミノ酸配列とでは、全長新生ICE
タンパク質の120番目にある1つのアミノ酸を除き、
完全な配列一致が認められる。cDNA配列によれば、
全長タンパク質の120番目にはAsnがコードされて
いる。このアミノ酸位置は、20kDaサブユニットの
NH2末端に対応している。精製天然20kDaサブユ
ニット由来のアミノ酸配列では、NH2末端アミノ酸は
Aspであることが判った。推定アミノ酸配列と既知の
アミノ酸配列とに唯一認められたこの相違は、20kD
aのNH2末端のAsnが脱アミド化されてAspを形
成したことに起因し得る。
配列決定することにより決定されたアミノ酸配列と、c
DNA由来の推定アミノ酸配列とでは、全長新生ICE
タンパク質の120番目にある1つのアミノ酸を除き、
完全な配列一致が認められる。cDNA配列によれば、
全長タンパク質の120番目にはAsnがコードされて
いる。このアミノ酸位置は、20kDaサブユニットの
NH2末端に対応している。精製天然20kDaサブユ
ニット由来のアミノ酸配列では、NH2末端アミノ酸は
Aspであることが判った。推定アミノ酸配列と既知の
アミノ酸配列とに唯一認められたこの相違は、20kD
aのNH2末端のAsnが脱アミド化されてAspを形
成したことに起因し得る。
【0051】20kDaサブユニットのNH2末端にA
snまたはAspが認められるか、またはICEポリペ
プチドにおいて全長タンパク質の120番目またはポリ
ペプチドフラグメント内にAsnまたはAspが認めら
れるかは、ICE活性に、あるとしても有意には影響し
ないと推定される。
snまたはAspが認められるか、またはICEポリペ
プチドにおいて全長タンパク質の120番目またはポリ
ペプチドフラグメント内にAsnまたはAspが認めら
れるかは、ICE活性に、あるとしても有意には影響し
ないと推定される。
【0052】ICE推定アミノ酸配列を更に調査する
と、アミノ酸位置103−104、119−120、2
97−298及び316−317の各間でICE様切断
部位が明らかとなった。かかる機構は、放射性標識した
in vitro翻訳p45を、アフィニティ精製IC
Eの存在下にインキュベートすると、既知の精製ICT
形態またはp45の単一切断から生じ得る推定中間体と
大きさが等しい標識切断産物を精製するという知見によ
り立証される。テトラペプチドアルデヒドICE阻害物
質はp45の切断を特異的にブロックしたため、プロセ
ッシングは夾雑プロテアーゼによるものではなかった。
上記各部位におけるAspのAlaへの突然変異によっ
て、その特定部位におけるプロセッシングから予想され
る切断産物の形成は妨げられる。上記潜在的切断部位の
各々は、全長ICEタンパク質から20kDa及び10
kDaのサブユニットを生成するよう作用し得、ICE
の活性化及びプロセッシングのための自己触媒機構に関
与し得る。
と、アミノ酸位置103−104、119−120、2
97−298及び316−317の各間でICE様切断
部位が明らかとなった。かかる機構は、放射性標識した
in vitro翻訳p45を、アフィニティ精製IC
Eの存在下にインキュベートすると、既知の精製ICT
形態またはp45の単一切断から生じ得る推定中間体と
大きさが等しい標識切断産物を精製するという知見によ
り立証される。テトラペプチドアルデヒドICE阻害物
質はp45の切断を特異的にブロックしたため、プロセ
ッシングは夾雑プロテアーゼによるものではなかった。
上記各部位におけるAspのAlaへの突然変異によっ
て、その特定部位におけるプロセッシングから予想され
る切断産物の形成は妨げられる。上記潜在的切断部位の
各々は、全長ICEタンパク質から20kDa及び10
kDaのサブユニットを生成するよう作用し得、ICE
の活性化及びプロセッシングのための自己触媒機構に関
与し得る。
【0053】生物学的に活性な精製ICEは幾つかの異
なる物理的形態を有し得る。ICEは、全長新生もしく
は未プロセッシングポリペプチドとして、または一部プ
ロセッシングされたポリペプチドもしくはプロセッシン
グされたポリペプチドの混合体として存在し得るが、こ
のことは、全長cDNA(図23)に対応するinvi
tro転写mRNAを用いて無細胞in vitro翻
訳系をプログラミングすることで45kDaポリペプチ
ドを合成することにより立証される。認められるICE
翻訳産物は、ICE cDNAの404個のアミノ酸を
コードする読取り枠の推定サイズと一致する。全長新生
ICEポリペプチドは特異的タンパク質加水分解切断作
用によって翻訳後修飾され、結果的に全長新生ポリペプ
チドのフラグメントを形成する。フラグメントまたはフ
ラグメントの物理的結合体は、ICEに伴なう全生物学
的活性(IL−1β前駆体を切断して成熟IL−1βと
する活性)を有し得るが、ICE活性の程度は、個々の
ICEフラグメントと物理的に結合しているICEポリ
ペプチドフラグメントとで変わり得る。
なる物理的形態を有し得る。ICEは、全長新生もしく
は未プロセッシングポリペプチドとして、または一部プ
ロセッシングされたポリペプチドもしくはプロセッシン
グされたポリペプチドの混合体として存在し得るが、こ
のことは、全長cDNA(図23)に対応するinvi
tro転写mRNAを用いて無細胞in vitro翻
訳系をプログラミングすることで45kDaポリペプチ
ドを合成することにより立証される。認められるICE
翻訳産物は、ICE cDNAの404個のアミノ酸を
コードする読取り枠の推定サイズと一致する。全長新生
ICEポリペプチドは特異的タンパク質加水分解切断作
用によって翻訳後修飾され、結果的に全長新生ポリペプ
チドのフラグメントを形成する。フラグメントまたはフ
ラグメントの物理的結合体は、ICEに伴なう全生物学
的活性(IL−1β前駆体を切断して成熟IL−1βと
する活性)を有し得るが、ICE活性の程度は、個々の
ICEフラグメントと物理的に結合しているICEポリ
ペプチドフラグメントとで変わり得る。
【0054】本明細書に記載の精製方法に従って天然資
源から誘導された実質的に純粋形態のICEは、単一m
RNAによってコードされる2つのICEポリペプチド
フラグメントの結合体であることが判る。2つのICE
ポリペプチドフラグメントは、20kDa及び10kD
aの見掛けの分子量を有することが判っている。
源から誘導された実質的に純粋形態のICEは、単一m
RNAによってコードされる2つのICEポリペプチド
フラグメントの結合体であることが判る。2つのICE
ポリペプチドフラグメントは、20kDa及び10kD
aの見掛けの分子量を有することが判っている。
【0055】上述の方法によって得られたクローン化I
CE cDNAは、適正なプロモーター及び他の適当な
転写調節エレメントを含む発現ベクター中に分子クロー
ニングすることにより組換え発現させ、原核または真核
宿主細胞中に移入して組換えICEを生産することがで
きる。かかる操作のための技術はManiatis,
T,et al.(上掲)に十分に記載されており、当
分野において公知である。
CE cDNAは、適正なプロモーター及び他の適当な
転写調節エレメントを含む発現ベクター中に分子クロー
ニングすることにより組換え発現させ、原核または真核
宿主細胞中に移入して組換えICEを生産することがで
きる。かかる操作のための技術はManiatis,
T,et al.(上掲)に十分に記載されており、当
分野において公知である。
【0056】本明細書において発現ベクターとは、遺伝
子のクローン化コピーの転写及び適当な宿主内でのそれ
らのmRNAの翻訳に必要なDNA配列と定義される。
このようなベクターを使用して、細菌、ラン藻、植物細
胞、昆虫細胞及び動物細胞のような種々の宿主中で真核
性遺伝子を発現させることができる。
子のクローン化コピーの転写及び適当な宿主内でのそれ
らのmRNAの翻訳に必要なDNA配列と定義される。
このようなベクターを使用して、細菌、ラン藻、植物細
胞、昆虫細胞及び動物細胞のような種々の宿主中で真核
性遺伝子を発現させることができる。
【0057】特別に設計されたベクターによって、細菌
−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間のDNAの
シャトルが可能となる。適正に構築された発現ベクター
は、宿主細胞中で自律複製するための複製開始部、選択
的マーカー、限定数の有効制限酵素部位、高コピー数の
可能性及び活性プロモーターを含むべきである。プロモ
ーターは、DNAに結合してRNA合成を開始するよう
にRNAポリメラーゼに働きかけるDNA配列と定義さ
れる。強力なプロモーターは、mRNAを高頻度で始動
させるものである。発現ベクターとしては、限定的では
ないが、クローニングベクター、修飾クローニングベク
ター、特に設定されたプラスミドまたはウイルスを挙げ
ることができる。
−酵母または細菌−動物細胞のような宿主間のDNAの
シャトルが可能となる。適正に構築された発現ベクター
は、宿主細胞中で自律複製するための複製開始部、選択
的マーカー、限定数の有効制限酵素部位、高コピー数の
可能性及び活性プロモーターを含むべきである。プロモ
ーターは、DNAに結合してRNA合成を開始するよう
にRNAポリメラーゼに働きかけるDNA配列と定義さ
れる。強力なプロモーターは、mRNAを高頻度で始動
させるものである。発現ベクターとしては、限定的では
ないが、クローニングベクター、修飾クローニングベク
ター、特に設定されたプラスミドまたはウイルスを挙げ
ることができる。
【0058】種々の哺乳動物ベクターを使用して、哺乳
動物細胞中で組換えICEを発現させることができる。
組換えICE発現に適当となり得る市販の哺乳動物発現
ベクターとしては、限定的ではないが、pMClneo
(Stratagene)、pXT1(Stratag
ene)、pSG5(Stratagene)、EBO
−pSV2−neo(ATCC 37593)、pBP
V−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBP
V−MMTneo(342−12)(ATCC3722
4)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pR
SVneo(ATCC 37198)、pSV2−dh
fr(ATCC 37146)、pUCTag(ATC
C 37460)及びλZD35(ATCC 3756
5)を挙げることができる。
動物細胞中で組換えICEを発現させることができる。
組換えICE発現に適当となり得る市販の哺乳動物発現
ベクターとしては、限定的ではないが、pMClneo
(Stratagene)、pXT1(Stratag
ene)、pSG5(Stratagene)、EBO
−pSV2−neo(ATCC 37593)、pBP
V−1(8−2)(ATCC 37110)、pdBP
V−MMTneo(342−12)(ATCC3722
4)、pRSVgpt(ATCC 37199)、pR
SVneo(ATCC 37198)、pSV2−dh
fr(ATCC 37146)、pUCTag(ATC
C 37460)及びλZD35(ATCC 3756
5)を挙げることができる。
【0059】ICEをコードするDNAは、組換え宿主
細胞中で発現させるために発現ベクター中にクローニン
グすることもできる。組換え宿主細胞は原核性でも真核
性でもよく、その例としては、限定的ではないが、細
菌、酵母、哺乳動物(非限定的には例えばヒト、ウシ、
ブタ、サル及び齧歯動物由来の細胞系)、昆虫細胞(非
限定的には例えばショウジョウバエ由来の細胞系)を挙
げることができる。市販されている適当な哺乳動物種由
来の細胞系としては、限定的ではないが、CV−1(A
TCC CCL 70)、COS−1(ATCC CR
L 1650)、COS−7(ATCC CRL 16
51)、CHO−K1(ATCC CCL61)、3T
3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(AT
CC CRL 1658)、HeLa(ATCC CC
L 2)、C127I(ATCCCRL 1616)、
BS−C−1(ATCC CCL 26)及びMRC−
5(ATCC CCL 171)を挙げることができ
る。
細胞中で発現させるために発現ベクター中にクローニン
グすることもできる。組換え宿主細胞は原核性でも真核
性でもよく、その例としては、限定的ではないが、細
菌、酵母、哺乳動物(非限定的には例えばヒト、ウシ、
ブタ、サル及び齧歯動物由来の細胞系)、昆虫細胞(非
限定的には例えばショウジョウバエ由来の細胞系)を挙
げることができる。市販されている適当な哺乳動物種由
来の細胞系としては、限定的ではないが、CV−1(A
TCC CCL 70)、COS−1(ATCC CR
L 1650)、COS−7(ATCC CRL 16
51)、CHO−K1(ATCC CCL61)、3T
3(ATCC CCL 92)、NIH/3T3(AT
CC CRL 1658)、HeLa(ATCC CC
L 2)、C127I(ATCCCRL 1616)、
BS−C−1(ATCC CCL 26)及びMRC−
5(ATCC CCL 171)を挙げることができ
る。
【0060】発現ベクターは、限定的ではないが、形質
転換、トランスフェクション、原形質体融合及びエレク
トロポレーション(electroporation)
を含む多数の技術の任意のものによって宿主細胞中に導
入することができる。発現ベクターを含む細胞をクロー
ン増殖させ、個々に分析してICEタンパク質を産生す
るか判定する。ICE発現宿主細胞クローンの同定は、
限定的ではないが、抗ICE抗体との免疫学的反応性、
及び宿主細胞に伴なうICE活性の存在を含む幾つかの
手段によって行なうことができる。
転換、トランスフェクション、原形質体融合及びエレク
トロポレーション(electroporation)
を含む多数の技術の任意のものによって宿主細胞中に導
入することができる。発現ベクターを含む細胞をクロー
ン増殖させ、個々に分析してICEタンパク質を産生す
るか判定する。ICE発現宿主細胞クローンの同定は、
限定的ではないが、抗ICE抗体との免疫学的反応性、
及び宿主細胞に伴なうICE活性の存在を含む幾つかの
手段によって行なうことができる。
【0061】ICE DNAの発現は、in vitr
o生産した合成mRNAを使用して行なうこともでき
る。合成mRNAは、限定的ではないが、コムギ胚抽出
物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系中で効率
的に翻訳することもできるし、限定的ではないが、カエ
ル卵母細胞中にマイクロインジェクションすることを含
む細胞ベースの系において効率的に翻訳することもでき
るが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
好ましい。
o生産した合成mRNAを使用して行なうこともでき
る。合成mRNAは、限定的ではないが、コムギ胚抽出
物及び網状赤血球抽出物を含む種々の無細胞系中で効率
的に翻訳することもできるし、限定的ではないが、カエ
ル卵母細胞中にマイクロインジェクションすることを含
む細胞ベースの系において効率的に翻訳することもでき
るが、カエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
好ましい。
【0062】最適レベルの酵素活性及び/またはICE
タンパク質を与えるICE cDNA配列を決定するた
めに、限定的ではないが、ICE cDNAの全長読取
り枠(45kDa=塩基4〜塩基1215)及び、20
kDa及び10kDaサブユニットの両方をコードする
cDNA部分を含む幾つかの構築物を含むICE cD
NA分子を構築することができる。全ての構築物は、I
CE cDNAの3’未翻訳領域(塩基1216〜14
88)を全く含めずにまたは全部もしくは一部を含むよ
うに設計することができる。ICE活性及びタンパク質
発現レベルは、上記構築物を適当な宿主細胞中に単独で
または組合せて導入することで測定することができる。
トランジェントアッセイ(transient ass
ay)において最適発現を与えるICE cDNAカセ
ットを決定したら、このICEcDNA構築物を、限定
的ではないが、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆
虫細胞、E.coli及び酵母S.cerevisia
eを含む種々の発現ベクターに移入する。
タンパク質を与えるICE cDNA配列を決定するた
めに、限定的ではないが、ICE cDNAの全長読取
り枠(45kDa=塩基4〜塩基1215)及び、20
kDa及び10kDaサブユニットの両方をコードする
cDNA部分を含む幾つかの構築物を含むICE cD
NA分子を構築することができる。全ての構築物は、I
CE cDNAの3’未翻訳領域(塩基1216〜14
88)を全く含めずにまたは全部もしくは一部を含むよ
うに設計することができる。ICE活性及びタンパク質
発現レベルは、上記構築物を適当な宿主細胞中に単独で
または組合せて導入することで測定することができる。
トランジェントアッセイ(transient ass
ay)において最適発現を与えるICE cDNAカセ
ットを決定したら、このICEcDNA構築物を、限定
的ではないが、哺乳動物細胞、バキュロウイルス感染昆
虫細胞、E.coli及び酵母S.cerevisia
eを含む種々の発現ベクターに移入する。
【0063】トランスフェクトした哺乳動物細胞及びマ
イロクインジェクションした卵母細胞のICE酵素活性
レベル及びICEタンパク質レベルは以下の方法によっ
て評価する。ICE酵素活性を評価する第1の方法は、
ICEに対する天然基質である31.5K IL−1β
前駆体をICEと同時に直接導入することを含む。発現
したICEの基質特異性を評価するために、ICE切断
部位のアミノ酸が置換されているIL−1β前駆体基質
を試験する。哺乳動物細胞の場合には、これは、一方が
ICE cDNAを含み、他方がプレIL−1β cD
NAを含む2つのプラスミドを同時トランスフェクショ
ンすることを含む。卵母細胞の場合には、これは、IC
Eに対する合成mRNA及びIL−1β前駆体に対する
合成mRNAの両方を同時インジェクションすることを
含む。発現するのに適当な時間を経た後、細胞タンパク
質を35S−メチオニンで24時間かけて代謝標識し、そ
の後、細胞溶解物及び細胞培養上清を回収し、IL−1
βタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて免疫
沈降を実施する。野生型前駆体の28K及び17K形態
への切断、及び(Asp116からAla116への)
変性下流プロセッシング部位を含む前駆体の28K形態
への切断を、SDS−PAGEゲルに基づくアッセイに
よって評価する。
イロクインジェクションした卵母細胞のICE酵素活性
レベル及びICEタンパク質レベルは以下の方法によっ
て評価する。ICE酵素活性を評価する第1の方法は、
ICEに対する天然基質である31.5K IL−1β
前駆体をICEと同時に直接導入することを含む。発現
したICEの基質特異性を評価するために、ICE切断
部位のアミノ酸が置換されているIL−1β前駆体基質
を試験する。哺乳動物細胞の場合には、これは、一方が
ICE cDNAを含み、他方がプレIL−1β cD
NAを含む2つのプラスミドを同時トランスフェクショ
ンすることを含む。卵母細胞の場合には、これは、IC
Eに対する合成mRNA及びIL−1β前駆体に対する
合成mRNAの両方を同時インジェクションすることを
含む。発現するのに適当な時間を経た後、細胞タンパク
質を35S−メチオニンで24時間かけて代謝標識し、そ
の後、細胞溶解物及び細胞培養上清を回収し、IL−1
βタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いて免疫
沈降を実施する。野生型前駆体の28K及び17K形態
への切断、及び(Asp116からAla116への)
変性下流プロセッシング部位を含む前駆体の28K形態
への切断を、SDS−PAGEゲルに基づくアッセイに
よって評価する。
【0064】ICE活性を検出する第2の方法は、IC
E cDNAを用いてトランスフェクトした哺乳動物細
胞またはICE mRNAを注入した卵母細胞から調製
した細胞溶解物においてICE活性を直接測定すること
を含む。このアッセイは、IL−1β切断部位にまたが
るIL−1β前駆体タンパク質または合成ペプチドを使
用して行なうことができる。前駆体の切断産物はゲルベ
ースの標準アッセイによって分析し、ペプチドの切断産
物はHPLCによって分析する。
E cDNAを用いてトランスフェクトした哺乳動物細
胞またはICE mRNAを注入した卵母細胞から調製
した細胞溶解物においてICE活性を直接測定すること
を含む。このアッセイは、IL−1β切断部位にまたが
るIL−1β前駆体タンパク質または合成ペプチドを使
用して行なうことができる。前駆体の切断産物はゲルベ
ースの標準アッセイによって分析し、ペプチドの切断産
物はHPLCによって分析する。
【0065】宿主細胞中のICEタンパク質のレベル
は、イムノアフィニティ及び/またはリガンドアフィニ
ティ技術によって定量化される。ICE特異的アフィニ
ティビーズまたはICE特異的抗体を使用して、35S−
メチオニン標識または非標識ICEタンパク質を単離す
る。標識ICEタンパク質はSDS−PAGEによって
分析する。非標識ICEタンパク質は、ウェスタンブロ
ット法、ELISA、またはICE特異的抗体を使用す
るRIAアッセイによって検出する。
は、イムノアフィニティ及び/またはリガンドアフィニ
ティ技術によって定量化される。ICE特異的アフィニ
ティビーズまたはICE特異的抗体を使用して、35S−
メチオニン標識または非標識ICEタンパク質を単離す
る。標識ICEタンパク質はSDS−PAGEによって
分析する。非標識ICEタンパク質は、ウェスタンブロ
ット法、ELISA、またはICE特異的抗体を使用す
るRIAアッセイによって検出する。
【0066】組換え宿主細胞中でICEを発現させた
後、ICEタンパク質を回収すると、IL−1β前駆体
を成熟IL−1βに切断し得る活性形態のICEを与え
ることができる。幾つかのICE精製方法の使用可能で
あり、適している。天然資源由来のICEの精製につい
て上記したように、組換えICEは細胞溶解物及び抽出
物からまたはならし培地から、例えば塩析(salt
fractionation)、イオン交換クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作
用クロマトグラフィーといった方法を種々に組合せてま
たは個々に適用して精製することができる。
後、ICEタンパク質を回収すると、IL−1β前駆体
を成熟IL−1βに切断し得る活性形態のICEを与え
ることができる。幾つかのICE精製方法の使用可能で
あり、適している。天然資源由来のICEの精製につい
て上記したように、組換えICEは細胞溶解物及び抽出
物からまたはならし培地から、例えば塩析(salt
fractionation)、イオン交換クロマトグ
ラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシ
ルアパタイト吸着クロマトグラフィー及び疎水性相互作
用クロマトグラフィーといった方法を種々に組合せてま
たは個々に適用して精製することができる。
【0067】更に、組換えICEは、全長新生ICE、
ICEのポリペプチドフラグメントまたは20kDa及
び10kDaのICEサブユニットに特異的なモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体を用いて構成したイム
ノアフィニティーカラムを使用することにより他の細胞
タンパク質から単離することができる。
ICEのポリペプチドフラグメントまたは20kDa及
び10kDaのICEサブユニットに特異的なモノクロ
ーナルまたはポリクローナル抗体を用いて構成したイム
ノアフィニティーカラムを使用することにより他の細胞
タンパク質から単離することができる。
【0068】ICEに対する単一特異性抗体は、ICE
に対して反応性を示す抗体を含む哺乳動物抗血清から精
製するか、または、Kohler及びMilstei
n,Nature 256:495−497(197
5)の技術を使用して、ICEに対して反応性を示すモ
ノクローナル抗体として調製する。本明細書において単
一特異性抗体とは、ICEに対して同種結合特性を有す
る単一抗体種または複数抗体種と定義される。本明細書
において同種結合(homogenous bindi
ng)とは、上述のごときICEに伴なうような特定の
抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。
酵素特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヤギ、ウマなどの哺乳動物、好ましくはウサギを、
免疫アジュバントを含むまたは含まない適当な濃度のI
CEで免疫することにより産生される。
に対して反応性を示す抗体を含む哺乳動物抗血清から精
製するか、または、Kohler及びMilstei
n,Nature 256:495−497(197
5)の技術を使用して、ICEに対して反応性を示すモ
ノクローナル抗体として調製する。本明細書において単
一特異性抗体とは、ICEに対して同種結合特性を有す
る単一抗体種または複数抗体種と定義される。本明細書
において同種結合(homogenous bindi
ng)とは、上述のごときICEに伴なうような特定の
抗原またはエピトープに結合する抗体種の能力を指す。
酵素特異的抗体は、マウス、ラット、モルモット、ウサ
ギ、ヤギ、ウマなどの哺乳動物、好ましくはウサギを、
免疫アジュバントを含むまたは含まない適当な濃度のI
CEで免疫することにより産生される。
【0069】前免疫血清を回収してから初回免疫を行な
う。各動物は、容認可能な免疫アジュバントを伴って約
0.1μg〜約1000μgのICEを受取る。かかる
容認可能なアジュバントとしては、限定的ではないが、
完全フロイント、不完全フロイン、ミョウバン沈降物、
Corynebacterium parvum及びt
RNAを含む油中水型エマルジョンを挙げることができ
る。初回免疫は、好ましくは完全フロイントアジュバン
ト中の酵素を、皮下(SC)もしくは腹腔内(IP)ま
たは両方で複数部位に投与することからなる。抗体力価
を測定するために、各被検動物から定期的に、好ましく
は毎週採血する。被検動物は、初回免疫の後に二次免疫
注射を受けても受けなくてもよい。二次免疫注射を受け
る被検動物には、不完全フロイントアジュバント中の同
量の酵素を同じ経路で与える。二次免疫注射は、約3週
間の間隔で、最大力価が得られるまで与える。各二次免
疫の約7日後または単回免疫のあとおおよそ毎週、被検
動物から採血し、血清を回収し、アリコートを約−20
℃で保管する。
う。各動物は、容認可能な免疫アジュバントを伴って約
0.1μg〜約1000μgのICEを受取る。かかる
容認可能なアジュバントとしては、限定的ではないが、
完全フロイント、不完全フロイン、ミョウバン沈降物、
Corynebacterium parvum及びt
RNAを含む油中水型エマルジョンを挙げることができ
る。初回免疫は、好ましくは完全フロイントアジュバン
ト中の酵素を、皮下(SC)もしくは腹腔内(IP)ま
たは両方で複数部位に投与することからなる。抗体力価
を測定するために、各被検動物から定期的に、好ましく
は毎週採血する。被検動物は、初回免疫の後に二次免疫
注射を受けても受けなくてもよい。二次免疫注射を受け
る被検動物には、不完全フロイントアジュバント中の同
量の酵素を同じ経路で与える。二次免疫注射は、約3週
間の間隔で、最大力価が得られるまで与える。各二次免
疫の約7日後または単回免疫のあとおおよそ毎週、被検
動物から採血し、血清を回収し、アリコートを約−20
℃で保管する。
【0070】ICEに反応性を示すモノクローナル抗体
(mAb)を、近交系マウス、好ましくはBalb/c
をICEで免疫することにより作製する。マウスは、上
述のごとき同量の容認可能なアジュバント中に配合され
た0.5mlの緩衝液または生理食塩水中、約0.1μ
g〜約10μg、好ましくは約1μgのICEを用い
て、IPまたはSC経路で免疫する。完全フロイントア
ジュバントが好ましい。マウスは0日目に初回免疫を受
け、約3〜約30週間安静にする。免疫マウスに、リン
酸緩衝溶液のような緩衝液中の約0.1〜約10μgの
ICEの二次免を静脈内(IV)経路で1回以上与え
る。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓リ
ンパ球を、当分野においては公知の標準方法によって免
疫マウスから脾臓を取り出すことにより入手する。脾臓
リンパ球を適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と、
安定ハイブリドーマを形成し得る条件下に混合すること
により、ハイブリドーマ細胞を作製する。融合相手とし
ては、限定的ではないが、マウス骨髄腫P3/NS1/
Ag 4−1;MPC−11;S−194;及びSp2
/0を挙げることができるが、好ましいのはSp 2/
0である。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、ポリエチレン
グリコール約1000mol.wt.中で濃度約30%
〜約50%で融合する。融合ハイブリドーマ細胞を、ヒ
ポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充した
ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で当分野に
おいて公知の方法によって増殖させることで選択する。
約14、18及び21日目に増殖陽性ウェルから上清液
を回収し、抗原としてICEを使用する固相イムノラジ
オアッセイ(SPIRA)のようなイムノアッセイによ
って、抗体産生についてスクリーニングする。更にmA
bのイソタイプを判定するために、オクテルロニー沈降
アッセイにおいて培養液を試験した。抗体陽性ウェル由
来のハイブリドーマ細胞を、MacPherson,S
oft AgarTechniques,in Tis
sue Culture Methodsand Ap
plications,Kruse and Pate
rson,Eds.,Academic Press,
1973の軟質寒天法のような技術によってクローニン
グする。
(mAb)を、近交系マウス、好ましくはBalb/c
をICEで免疫することにより作製する。マウスは、上
述のごとき同量の容認可能なアジュバント中に配合され
た0.5mlの緩衝液または生理食塩水中、約0.1μ
g〜約10μg、好ましくは約1μgのICEを用い
て、IPまたはSC経路で免疫する。完全フロイントア
ジュバントが好ましい。マウスは0日目に初回免疫を受
け、約3〜約30週間安静にする。免疫マウスに、リン
酸緩衝溶液のような緩衝液中の約0.1〜約10μgの
ICEの二次免を静脈内(IV)経路で1回以上与え
る。抗体陽性マウス由来のリンパ球、好ましくは脾臓リ
ンパ球を、当分野においては公知の標準方法によって免
疫マウスから脾臓を取り出すことにより入手する。脾臓
リンパ球を適当な融合相手、好ましくは骨髄腫細胞と、
安定ハイブリドーマを形成し得る条件下に混合すること
により、ハイブリドーマ細胞を作製する。融合相手とし
ては、限定的ではないが、マウス骨髄腫P3/NS1/
Ag 4−1;MPC−11;S−194;及びSp2
/0を挙げることができるが、好ましいのはSp 2/
0である。抗体産生細胞と骨髄腫細胞は、ポリエチレン
グリコール約1000mol.wt.中で濃度約30%
〜約50%で融合する。融合ハイブリドーマ細胞を、ヒ
ポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを補充した
ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)中で当分野に
おいて公知の方法によって増殖させることで選択する。
約14、18及び21日目に増殖陽性ウェルから上清液
を回収し、抗原としてICEを使用する固相イムノラジ
オアッセイ(SPIRA)のようなイムノアッセイによ
って、抗体産生についてスクリーニングする。更にmA
bのイソタイプを判定するために、オクテルロニー沈降
アッセイにおいて培養液を試験した。抗体陽性ウェル由
来のハイブリドーマ細胞を、MacPherson,S
oft AgarTechniques,in Tis
sue Culture Methodsand Ap
plications,Kruse and Pate
rson,Eds.,Academic Press,
1973の軟質寒天法のような技術によってクローニン
グする。
【0071】約0.5ml/マウスのプリスタンで初回
免疫したBalb/cマウスに、初回免疫の約4日後に
約2×106〜約6×106のハイブリドーマ細胞を注射
することにより、モノクローナル抗体をin vivo
で産生させる。細胞移入の約8〜12日後に腹水を採取
し、当分野においては公知の方法によりモノクローナル
抗体を精製する。
免疫したBalb/cマウスに、初回免疫の約4日後に
約2×106〜約6×106のハイブリドーマ細胞を注射
することにより、モノクローナル抗体をin vivo
で産生させる。細胞移入の約8〜12日後に腹水を採取
し、当分野においては公知の方法によりモノクローナル
抗体を精製する。
【0072】約2%ウシ胎児血清を含むDMEM中でハ
イブリドーマを増殖させて、十分な量の特異的mAbを
得ることにより、抗プレIL−1βmAbをin vi
troで生産する。当分野においては公知の方法でmA
bを精製する。
イブリドーマを増殖させて、十分な量の特異的mAbを
得ることにより、抗プレIL−1βmAbをin vi
troで生産する。当分野においては公知の方法でmA
bを精製する。
【0073】腹水またはハイブリドーマ培養液の抗体力
価を、限定的ではないが、沈降、受身凝集、酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ(ELISA)法及びラジオイ
ムノアッセイ(RIA)法を含む種々の血清学的及び免
疫学的アッセイによって測定する。同様のアッセイを使
用して、体液または組織及び細胞抽出物中のICEの存
在を検出する。
価を、限定的ではないが、沈降、受身凝集、酵素結合イ
ムノソルベントアッセイ(ELISA)法及びラジオイ
ムノアッセイ(RIA)法を含む種々の血清学的及び免
疫学的アッセイによって測定する。同様のアッセイを使
用して、体液または組織及び細胞抽出物中のICEの存
在を検出する。
【0074】単一特異性抗体を生産する上述の方法を使
用して、ICEポリペプチドフラグメント、または全長
新生ICEポリペプチドまたは個々の20kDa及び1
0kDaのサブユニットに特異的な抗体を生産し得るこ
とは当業者には容易に明らかである。特に、20kDa
のICEサブユニットにのみ、10kDaのICEサブ
ユニットにのみ、または全長新生ICE分子にのみ特異
的な単一特異性抗体を生産し得ることも当業者には容易
に明らかである。
用して、ICEポリペプチドフラグメント、または全長
新生ICEポリペプチドまたは個々の20kDa及び1
0kDaのサブユニットに特異的な抗体を生産し得るこ
とは当業者には容易に明らかである。特に、20kDa
のICEサブユニットにのみ、10kDaのICEサブ
ユニットにのみ、または全長新生ICE分子にのみ特異
的な単一特異性抗体を生産し得ることも当業者には容易
に明らかである。
【0075】ICE抗体アフィニティーカラムは、抗体
を、ゲル支持体であるAffigel−10(Bior
ad)に加えることにより作製される。Affigel
−10は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結
合を形成するように、N−ヒドロキシスクシンイミドを
用いて予め活性化する。次いで、スペーサアームを介す
るアミド結合によって抗体をゲルに結合させる。次いで
1M エタノールアミン HCl(pH8)を用いて、
残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムをま
ず水で、次いで0.23M グリシン−HCl(pH
2.6)で洗浄して、全ての未結合抗体または外来タン
パク質を除去する。次いでカラムをリン酸緩衝溶液(p
H7.3)で平衡化し、ICEまたはICEサブユニッ
トを含む細胞培養液上清または細胞抽出物をゆっくりカ
ラムに通す。次いでカラムをリン酸緩衝溶液で、光学密
度(A280)がバックグラウンドに達するまで洗浄し、
タンパク質を0.23M グリシン−HCl(pH2.
6)を用いて溶出させる。次いで、精製ICEタンパク
質をリン酸緩衝溶液に対して透析する。
を、ゲル支持体であるAffigel−10(Bior
ad)に加えることにより作製される。Affigel
−10は、抗体がアガロースゲルビーズ支持体と共有結
合を形成するように、N−ヒドロキシスクシンイミドを
用いて予め活性化する。次いで、スペーサアームを介す
るアミド結合によって抗体をゲルに結合させる。次いで
1M エタノールアミン HCl(pH8)を用いて、
残りの活性化エステルの反応を停止させる。カラムをま
ず水で、次いで0.23M グリシン−HCl(pH
2.6)で洗浄して、全ての未結合抗体または外来タン
パク質を除去する。次いでカラムをリン酸緩衝溶液(p
H7.3)で平衡化し、ICEまたはICEサブユニッ
トを含む細胞培養液上清または細胞抽出物をゆっくりカ
ラムに通す。次いでカラムをリン酸緩衝溶液で、光学密
度(A280)がバックグラウンドに達するまで洗浄し、
タンパク質を0.23M グリシン−HCl(pH2.
6)を用いて溶出させる。次いで、精製ICEタンパク
質をリン酸緩衝溶液に対して透析する。
【0076】全長ICEをコードするcDNAを含むプ
ラスミドpGEM−Zf(−)をpOCP9と称した。
E.coli株HB101中のpOCP9試料を、ブタ
ペスト条約のもとに、1991年8月15日以前(19
91年7月31日)に、12301 Parklawn
Drive,Rockville,MD.,2085
2のAmerican Type Culture C
ollectionの永久培養体コレクションに寄託
し、寄託番号ATCC 68655が割り当てられてい
る。
ラスミドpGEM−Zf(−)をpOCP9と称した。
E.coli株HB101中のpOCP9試料を、ブタ
ペスト条約のもとに、1991年8月15日以前(19
91年7月31日)に、12301 Parklawn
Drive,Rockville,MD.,2085
2のAmerican Type Culture C
ollectionの永久培養体コレクションに寄託
し、寄託番号ATCC 68655が割り当てられてい
る。
【0077】
【実施例】以下、非限定的な実施例により本発明を説明
する。
する。
【0078】実施例1 無細胞抽出物の調製 白血球泳動法(leukophoresis)によって
健康な供血者からヒト末梢血液単球を採取し、Lymp
hocyte Separation Media(O
rganon Teknika)による沈殿及びBec
kman向流遠心機による分粒をWicker他、Ce
ll.Immunol.106:318〜329(198
7)に記載のごとく順次行なって精製した。抗MAC1
抗体による標識及びFACS分析を順次行なって単球を
同定した。10%ウシ胎仔血清(Hyclone La
boratories、検出可能な内毒素を含まない既
定血清)を添加したダルベッコの改質最小必須培地(H
azelton)中、37℃で、ヒトTHP−1細胞
(American Type Culture Co
llection)を濃度1×106細胞/mlまで浮
遊増殖させた。THP−1細胞をまた、75または20
0リットルの発酵槽で、内毒素をわずかに含有する10
%ウマ血清を加えたIscoves培地中で、pH7.
2、溶存酸素20〜50%、溶存炭酸ガス2〜5%、温
度37℃に調節した条件下で、水中プロペラ翼で速度9
0rpmで攪拌しながら増殖させた。0.6uMの膜の
50平方フィートあたりに2psi未満の圧力を作用さ
せたMillipore Prostak交差流膜濾過
系を用いて細胞を採取した。採取した細胞を遠心してペ
レットにし、ダルベッコのPBSで洗浄し、25mMの
HEPES pH7.5と5mMのMgCl2と1mMの
EGTAを含み、更に1mMのPMSFと10μg/m
lのロイペプチンと10μg/mlのペプスタチンAと
を含むプロテアーゼインヒビターを含む低張バッファに
よって溶解した。S−3の調製後に、DTT及びCHA
PSを夫々最終濃度2mm及び0.1%まで添加した。
懸濁フラスコまたは発酵槽中で使用した培地はまた、細
胞に対する剪断力を抑制するために0.1〜0.3%のF
68 pluronicを含有していた。典型的には、
保存細胞サンプルの再培養開始から3〜4箇月以内の期
間細胞を増殖させた。
健康な供血者からヒト末梢血液単球を採取し、Lymp
hocyte Separation Media(O
rganon Teknika)による沈殿及びBec
kman向流遠心機による分粒をWicker他、Ce
ll.Immunol.106:318〜329(198
7)に記載のごとく順次行なって精製した。抗MAC1
抗体による標識及びFACS分析を順次行なって単球を
同定した。10%ウシ胎仔血清(Hyclone La
boratories、検出可能な内毒素を含まない既
定血清)を添加したダルベッコの改質最小必須培地(H
azelton)中、37℃で、ヒトTHP−1細胞
(American Type Culture Co
llection)を濃度1×106細胞/mlまで浮
遊増殖させた。THP−1細胞をまた、75または20
0リットルの発酵槽で、内毒素をわずかに含有する10
%ウマ血清を加えたIscoves培地中で、pH7.
2、溶存酸素20〜50%、溶存炭酸ガス2〜5%、温
度37℃に調節した条件下で、水中プロペラ翼で速度9
0rpmで攪拌しながら増殖させた。0.6uMの膜の
50平方フィートあたりに2psi未満の圧力を作用さ
せたMillipore Prostak交差流膜濾過
系を用いて細胞を採取した。採取した細胞を遠心してペ
レットにし、ダルベッコのPBSで洗浄し、25mMの
HEPES pH7.5と5mMのMgCl2と1mMの
EGTAを含み、更に1mMのPMSFと10μg/m
lのロイペプチンと10μg/mlのペプスタチンAと
を含むプロテアーゼインヒビターを含む低張バッファに
よって溶解した。S−3の調製後に、DTT及びCHA
PSを夫々最終濃度2mm及び0.1%まで添加した。
懸濁フラスコまたは発酵槽中で使用した培地はまた、細
胞に対する剪断力を抑制するために0.1〜0.3%のF
68 pluronicを含有していた。典型的には、
保存細胞サンプルの再培養開始から3〜4箇月以内の期
間細胞を増殖させた。
【0079】低張溶解バッファ中の窒素キャビテーショ
ンまたはホモジナイゼーションによってヒト末梢血液単
球とTHP−1細胞とから無細胞抽出物を調製した。
1,000×gで遠心して細胞(例えば15リットルの
THP−1細胞)を収集し、塩化マグネシウムまたは塩
化カルシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶
液で3回洗浄し、1,000×gで10分間ペレット化
した。得られた細胞ペレットを、3倍容の低張バッファ
(20mMのKCl、25mMのHEPES pH7.
4、1.5mMのMgCl2、0.1mMのEDTA、1
mMのDTT)に再度浮遊させ、氷浴上に20分間維持
した。細胞をDounceホモジナイザーで溶解し、2
0ストロークでホモジナイズした。より穏やかに溶解す
るために、細胞ペレットを低張バッファに再度浮遊さ
せ、ステンレススチール窒素圧力槽に入れ、窒素ガスで
00psiに加圧し、攪拌しながら4℃に30分間維持
した。圧力の解除と容器からの細胞の排出とを同時に行
なうことによって細胞を溶解した。このときに、細胞膜
は。高速の圧力解除及び剪断流によって有効にに破壊さ
れた。400または1,000×gで20分間遠心する
ことによって細胞性ホモジネートを清澄化し、S−1と
命名した上清流体を−80℃で保存した。調製直後のS
−1上清流体を更に30,000×gで10分間遠心
し、S−2と命名した。S−2上清流体を更に300,
000×gで1.5時間遠心し、上清流体を収集してS
−3と命名した。
ンまたはホモジナイゼーションによってヒト末梢血液単
球とTHP−1細胞とから無細胞抽出物を調製した。
1,000×gで遠心して細胞(例えば15リットルの
THP−1細胞)を収集し、塩化マグネシウムまたは塩
化カルシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝塩類溶
液で3回洗浄し、1,000×gで10分間ペレット化
した。得られた細胞ペレットを、3倍容の低張バッファ
(20mMのKCl、25mMのHEPES pH7.
4、1.5mMのMgCl2、0.1mMのEDTA、1
mMのDTT)に再度浮遊させ、氷浴上に20分間維持
した。細胞をDounceホモジナイザーで溶解し、2
0ストロークでホモジナイズした。より穏やかに溶解す
るために、細胞ペレットを低張バッファに再度浮遊さ
せ、ステンレススチール窒素圧力槽に入れ、窒素ガスで
00psiに加圧し、攪拌しながら4℃に30分間維持
した。圧力の解除と容器からの細胞の排出とを同時に行
なうことによって細胞を溶解した。このときに、細胞膜
は。高速の圧力解除及び剪断流によって有効にに破壊さ
れた。400または1,000×gで20分間遠心する
ことによって細胞性ホモジネートを清澄化し、S−1と
命名した上清流体を−80℃で保存した。調製直後のS
−1上清流体を更に30,000×gで10分間遠心
し、S−2と命名した。S−2上清流体を更に300,
000×gで1.5時間遠心し、上清流体を収集してS
−3と命名した。
【0080】また、THP−1細胞の無細胞抽出物は以
下の手法でも調製できた。細胞をPBS中で3回洗浄
し、25mMのHEPES pH7.5と5mMのMg
Cl2と1mMのEGTAとを含む低張バッファ中で1
08細胞/mlの濃度で0℃で20分間浮遊させた。プ
ロテアーゼインヒビター(1mMのPMSFと10mg
/mlのペプスタチン及びロイペプチン)を添加し、1
00または300mlの緊密に充填できるDounce
ホモジナイザーで夫々90〜95%破壊されるまで25
または15ストロークを用いて細胞を破壊した。破壊し
た細胞をBeckman GPR遠心機中で5℃で30
00rpmで10分間遠心し、核及び未破壊の細胞を除
去した。核除去後の上清を、SS34ロータを備えたS
orval遠心機中で16,000rpmで20分間遠
心し、次いでBeckman遠心機で50,000rp
m(50.2Tiロータ)または45,000rpm(4
5Tiロータ)で60分間遠心した。2mMのDTTと
0.1%のCHAPSとを添加した後に、得られた上清
を−80℃で保存した。
下の手法でも調製できた。細胞をPBS中で3回洗浄
し、25mMのHEPES pH7.5と5mMのMg
Cl2と1mMのEGTAとを含む低張バッファ中で1
08細胞/mlの濃度で0℃で20分間浮遊させた。プ
ロテアーゼインヒビター(1mMのPMSFと10mg
/mlのペプスタチン及びロイペプチン)を添加し、1
00または300mlの緊密に充填できるDounce
ホモジナイザーで夫々90〜95%破壊されるまで25
または15ストロークを用いて細胞を破壊した。破壊し
た細胞をBeckman GPR遠心機中で5℃で30
00rpmで10分間遠心し、核及び未破壊の細胞を除
去した。核除去後の上清を、SS34ロータを備えたS
orval遠心機中で16,000rpmで20分間遠
心し、次いでBeckman遠心機で50,000rp
m(50.2Tiロータ)または45,000rpm(4
5Tiロータ)で60分間遠心した。2mMのDTTと
0.1%のCHAPSとを添加した後に、得られた上清
を−80℃で保存した。
【0081】実施例2 塩分画化 プレ−IL−1β変換酵素活性を濃縮し且つ部分的に精
製するために、実施例1で得られたS−3上清流体を硫
酸アンモニウムの添加によって順次沈殿させた。粒状硫
酸アンモニウムを50mlのS−3上清流体に4℃で4
5%飽和になるまで添加した。流体を氷上で攪拌しなが
ら15分間平衡させた。10,000×gで遠心するこ
とによって濁った沈殿物を清澄化し、得られたペレット
を廃棄した。次いで、上記手順を用い、上清流体を硫酸
アンモニウムで80%飽和させた。次に、沈殿物をペレ
ット化し、バッファA(20mMのKCl、25mMの
HEPES pH7.4、5.0mMのEDTA、2mM
のDTT、1mMのPMSF、0.1%のNP−40
(Nonident界面活性剤P−40)、10%グリ
セロール)に再浮遊させ、同じバッファに一夜透析し
た。透析した沈殿物を30,000×gで遠心し、粒状
物質を除去し、−80℃で保存した。
製するために、実施例1で得られたS−3上清流体を硫
酸アンモニウムの添加によって順次沈殿させた。粒状硫
酸アンモニウムを50mlのS−3上清流体に4℃で4
5%飽和になるまで添加した。流体を氷上で攪拌しなが
ら15分間平衡させた。10,000×gで遠心するこ
とによって濁った沈殿物を清澄化し、得られたペレット
を廃棄した。次いで、上記手順を用い、上清流体を硫酸
アンモニウムで80%飽和させた。次に、沈殿物をペレ
ット化し、バッファA(20mMのKCl、25mMの
HEPES pH7.4、5.0mMのEDTA、2mM
のDTT、1mMのPMSF、0.1%のNP−40
(Nonident界面活性剤P−40)、10%グリ
セロール)に再浮遊させ、同じバッファに一夜透析し
た。透析した沈殿物を30,000×gで遠心し、粒状
物質を除去し、−80℃で保存した。
【0082】実施例3 イオン交換クロマトグラフィー 実施例2で得られた10mlの硫酸アンモニウム沈殿タ
ンパク質、即ち110mgの総タンパク質を、バッファ
Aで平衡させたBio−Rad DEAE−5−PW
HPLCアニオン交換カラムで処理した。タンパク質を
含有する分画を280nmの吸光度によって検出した。
通過分画を保存し、次いでバッファAで緩衝したBio
−Rad SP−5PWスルホプロリルカチオン交換カ
ラムに充填した。次に、バッファAの30〜500mM
の直線勾配を使用して変換酵素活性を溶出させた。溶出
後、280nmの吸光度によって決定したタンパク質含
有カラム分画を、バッファAに16時間透析した(Sp
ectrum Laboratory Product
s、Spectra/Por膜、排除限界分子量8,0
00)。実施例4の手順を用い、個々の分画の変換酵素
活性を検定した。ICE活性はプレ−IL−1βを開裂
し、生物学的活性リンフォカインである17.5kDa
の物質を生成する。これらの塩及びpH条件を用いた酵
素活性は、DEAEアニオン交換樹脂には結合しない
が、スルホプロリルカチオン交換樹脂には結合するであ
ろう。ICEは不連続ピークとして溶出し、初期活性の
少なくとも50%が回収された。
ンパク質、即ち110mgの総タンパク質を、バッファ
Aで平衡させたBio−Rad DEAE−5−PW
HPLCアニオン交換カラムで処理した。タンパク質を
含有する分画を280nmの吸光度によって検出した。
通過分画を保存し、次いでバッファAで緩衝したBio
−Rad SP−5PWスルホプロリルカチオン交換カ
ラムに充填した。次に、バッファAの30〜500mM
の直線勾配を使用して変換酵素活性を溶出させた。溶出
後、280nmの吸光度によって決定したタンパク質含
有カラム分画を、バッファAに16時間透析した(Sp
ectrum Laboratory Product
s、Spectra/Por膜、排除限界分子量8,0
00)。実施例4の手順を用い、個々の分画の変換酵素
活性を検定した。ICE活性はプレ−IL−1βを開裂
し、生物学的活性リンフォカインである17.5kDa
の物質を生成する。これらの塩及びpH条件を用いた酵
素活性は、DEAEアニオン交換樹脂には結合しない
が、スルホプロリルカチオン交換樹脂には結合するであ
ろう。ICEは不連続ピークとして溶出し、初期活性の
少なくとも50%が回収された。
【0083】実施例4 ICE活性のin vitro検出アッセイ 実施例1〜3及び5〜7で得られた分画によってプレ−
IL−1βを開裂するために、放射性標識した前駆物質
を含む1μlのウサギ網状赤血球抽出物を10〜20μ
lの特異的分画と共にインキュベートした。放射性標識
したプレ−IL−1βを以下の手順で調製した。プレ−
IL−1βの完全コード配列を含む1.5キロ塩基(k
b)のcDNAクローンを、EcoRI/PstI開裂
したpGEM−3プラスミドDNA(Promega
Biotec)に挿入し、当業界で公知の標準法によっ
て大腸菌中で増殖させた。標準法に概略に関しては、例
えば、Maniatis他、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manua
l、Cold Spring Harbor La
b.、Cold Spring Harbor、NY、
(1982)を参照するとよい。精製したプラスミドを
PstIで直鎖化し、次いで、T7 RNAポリメラー
ゼin vitro転写系(Promega Biot
ec)を用いて転写し、次に、製造業者の指示に従って
mRNAを処理した。ミクロコッカスヌクレアーゼ処理
したウサギ網状赤血球抽出物(Promega Bio
tec)を、in vitro合成したmRNAと共
に、25uCiの〔35S〕メチオニン(1Ci=37G
Bq;Amersham)の存在下で、製造業者の指示
通りにプログラミングすることによって翻訳を行なわせ
た。この結果、SDS−PAGE上でダブレットとして
泳動した見掛け分子量34及び31kDaの標識プレ−
IL−1βが得られた。双方のバンドはIL−1βのカ
ルボキシ末端に特異的な抗血清と免疫沈降し得る。イン
ターロイキン−1β変換酵素活性、17.5kDaの成
熟IL−1βを産生させる標識プレ−IL−1βの開裂
をSDS−PAGEによってモニタした。
IL−1βを開裂するために、放射性標識した前駆物質
を含む1μlのウサギ網状赤血球抽出物を10〜20μ
lの特異的分画と共にインキュベートした。放射性標識
したプレ−IL−1βを以下の手順で調製した。プレ−
IL−1βの完全コード配列を含む1.5キロ塩基(k
b)のcDNAクローンを、EcoRI/PstI開裂
したpGEM−3プラスミドDNA(Promega
Biotec)に挿入し、当業界で公知の標準法によっ
て大腸菌中で増殖させた。標準法に概略に関しては、例
えば、Maniatis他、Molecular Cl
oning:A Laboratory Manua
l、Cold Spring Harbor La
b.、Cold Spring Harbor、NY、
(1982)を参照するとよい。精製したプラスミドを
PstIで直鎖化し、次いで、T7 RNAポリメラー
ゼin vitro転写系(Promega Biot
ec)を用いて転写し、次に、製造業者の指示に従って
mRNAを処理した。ミクロコッカスヌクレアーゼ処理
したウサギ網状赤血球抽出物(Promega Bio
tec)を、in vitro合成したmRNAと共
に、25uCiの〔35S〕メチオニン(1Ci=37G
Bq;Amersham)の存在下で、製造業者の指示
通りにプログラミングすることによって翻訳を行なわせ
た。この結果、SDS−PAGE上でダブレットとして
泳動した見掛け分子量34及び31kDaの標識プレ−
IL−1βが得られた。双方のバンドはIL−1βのカ
ルボキシ末端に特異的な抗血清と免疫沈降し得る。イン
ターロイキン−1β変換酵素活性、17.5kDaの成
熟IL−1βを産生させる標識プレ−IL−1βの開裂
をSDS−PAGEによってモニタした。
【0084】実施例12で得られたペプチド基質のタン
パク質分解開裂を以下の手順で行なった。ジメチルスル
ホキシド中で濃度10mMのペプチドサンプルを調製し
た。これらの研究で使用した酵素をスルホプロリルカチ
オン交換クロマトグラフィーで精製した。反応混合物
は、約0.2mg/mlの酵素と、0.2mMのペプチド
と、10%のショ糖と、0.1%のCHAPS(3−
〔(3−コラミドプロリル)ジメチル−アンモニオ〕−
1−プロパンスルホナト)と、10mMのHEPES
(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エ
タンスルホン酸) pH7.5とを50μlの反応容量
中に含んでいた。25℃で種々の時間のインキュベーシ
ョン後に、450μlの0.1%トリフルオロ酢酸を添
加して反応を停止させた。流速1ml/分の5%アセト
ニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡させたVy
dac C−18カラム(4.6mm×25cm、粒度
5μm、ポアサイズ300)を使用してサンプルを逆相
高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。5〜
30%のアセトニトリル直線勾配を10分間使用してペ
プチドを溶出させ、280nmのカラム溶出液をモニタ
することによってペプチドを定量した。これらの条件下
に、どの場合にも基質及びチロシン含有物質をベースラ
イン法(baseline resolution)で
分離した。ペプチド標準を用いて開裂産物を同定した。
パク質分解開裂を以下の手順で行なった。ジメチルスル
ホキシド中で濃度10mMのペプチドサンプルを調製し
た。これらの研究で使用した酵素をスルホプロリルカチ
オン交換クロマトグラフィーで精製した。反応混合物
は、約0.2mg/mlの酵素と、0.2mMのペプチド
と、10%のショ糖と、0.1%のCHAPS(3−
〔(3−コラミドプロリル)ジメチル−アンモニオ〕−
1−プロパンスルホナト)と、10mMのHEPES
(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エ
タンスルホン酸) pH7.5とを50μlの反応容量
中に含んでいた。25℃で種々の時間のインキュベーシ
ョン後に、450μlの0.1%トリフルオロ酢酸を添
加して反応を停止させた。流速1ml/分の5%アセト
ニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸で平衡させたVy
dac C−18カラム(4.6mm×25cm、粒度
5μm、ポアサイズ300)を使用してサンプルを逆相
高性能液体クロマトグラフィーによって分析した。5〜
30%のアセトニトリル直線勾配を10分間使用してペ
プチドを溶出させ、280nmのカラム溶出液をモニタ
することによってペプチドを定量した。これらの条件下
に、どの場合にも基質及びチロシン含有物質をベースラ
イン法(baseline resolution)で
分離した。ペプチド標準を用いて開裂産物を同定した。
【0085】実施例5 サイズ排除クロマトグラフィー 実施例3で得られたICEをサイズ排除クロマトグラフ
ィーによって更に精製した。バッファAで平衡させた
7.5×600mmのTSK G3000SWゲル排除
カラムに0.5mlのタンパク質を充填した。カラムを
同じバッファで溶出させ、280nmの吸光度によって
モニタした夫々の分画の変換酵素活性を検定した。イン
ターロイキン−1β変換酵素活性はカラムから見掛け分
子量30,000で溶出した。TSK G2000カラ
ムを用いた同様の実験では、見掛け分子量23,000
が得られた。従って、天然型活性ICEの見掛け分子量
は23,000〜30,000である。
ィーによって更に精製した。バッファAで平衡させた
7.5×600mmのTSK G3000SWゲル排除
カラムに0.5mlのタンパク質を充填した。カラムを
同じバッファで溶出させ、280nmの吸光度によって
モニタした夫々の分画の変換酵素活性を検定した。イン
ターロイキン−1β変換酵素活性はカラムから見掛け分
子量30,000で溶出した。TSK G2000カラ
ムを用いた同様の実験では、見掛け分子量23,000
が得られた。従って、天然型活性ICEの見掛け分子量
は23,000〜30,000である。
【0086】上記のごとき独特の分離及び精製プロセス
を以下の第1表にまとめる。
を以下の第1表にまとめる。
【0087】
【表1】
【0088】実施例6 疎水性相互作用クロマトグラフィー 実施例3、5または6で得られたICEを疎水性相互作
用クロマトグラフィーによって更に精製した。固体硫酸
アンモニウムを最終濃度1.5Mまで添加後、20mM
のHEPES pH7.4と1.5Mの(NH4)2SO4
と10%のグリセロールと5mMのEDTAと1mMの
PMSFと2mMのDDTとを含むバッファ中で平衡さ
せたシリカベースの疎水性相互作用カラム(Synch
romSynchropak propyl、4.6×
250mm)にタンパク質(1.5ml)を充填した。
1.5Mから0.0Mまで減少する(NH4)2SO4の連
続的直線勾配でカラムを溶出させた。カラム分画をバッ
ファBに透析し、添加酵素活性を検定した。
用クロマトグラフィーによって更に精製した。固体硫酸
アンモニウムを最終濃度1.5Mまで添加後、20mM
のHEPES pH7.4と1.5Mの(NH4)2SO4
と10%のグリセロールと5mMのEDTAと1mMの
PMSFと2mMのDDTとを含むバッファ中で平衡さ
せたシリカベースの疎水性相互作用カラム(Synch
romSynchropak propyl、4.6×
250mm)にタンパク質(1.5ml)を充填した。
1.5Mから0.0Mまで減少する(NH4)2SO4の連
続的直線勾配でカラムを溶出させた。カラム分画をバッ
ファBに透析し、添加酵素活性を検定した。
【0089】上記の独特の分離及び精製プロセスを以下
の第2表にまとめる。
の第2表にまとめる。
【0090】
【表2】
【0091】実施例7 ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー 実施例5及び6のICEをBio−Rad HPHT分
析カートリッジを用いたヒドロキシルアパタイト吸着ク
ロマトグラフィーによって更に精製した。サンプルはE
DTAを含有してはならないので、通常は透析によって
EDTAを除去する。カラムをバッファB(20mMの
HEPES pH7.4、5%のグリセロール、2mM
のDTT)中で平衡させた。1.5mlのICEを添加
した後で、室温のバッファB中で0〜500mMのリン
酸カリウムの連続的直線勾配でカラムを溶出させた。分
画を収集し、直ちに氷に載せ、各分画のサンプルをバッ
ファBに透析し、ICE活性を測定した。
析カートリッジを用いたヒドロキシルアパタイト吸着ク
ロマトグラフィーによって更に精製した。サンプルはE
DTAを含有してはならないので、通常は透析によって
EDTAを除去する。カラムをバッファB(20mMの
HEPES pH7.4、5%のグリセロール、2mM
のDTT)中で平衡させた。1.5mlのICEを添加
した後で、室温のバッファB中で0〜500mMのリン
酸カリウムの連続的直線勾配でカラムを溶出させた。分
画を収集し、直ちに氷に載せ、各分画のサンプルをバッ
ファBに透析し、ICE活性を測定した。
【0092】実施例8 インターロイキン−1β変換酵素のアミノ酸配列を決定
するための質量分析用精製プロセス 実施例1の上清流体S−3を0.22mの中空繊維フィ
ルターで清澄化し、Amicon YM3スパイラルカ
ートリッジで10〜20倍に濃縮し、20mMのトリス
pH7.8と10%ショ糖と0.1%CHAPSと2m
MのDTTから成るバッファに対して一夜透析した(透
析膜の排除限界分子量8000)。透析した上清(10
00mlのシトソール抽出物に対応する約3〜5gの総
タンパク質)を水で500ミクロ未満のSiemans
導電率に調整し、475mlのベッドボリュームのDE
AE−5PW HPLC(Biorad)カラムに流し
た。同じバッファと0.5Mまで増加するNaCl勾配
と220mMのトリスHClとを用いると、約40mM
NaClにICE活性(実施例4)が溶出した。
するための質量分析用精製プロセス 実施例1の上清流体S−3を0.22mの中空繊維フィ
ルターで清澄化し、Amicon YM3スパイラルカ
ートリッジで10〜20倍に濃縮し、20mMのトリス
pH7.8と10%ショ糖と0.1%CHAPSと2m
MのDTTから成るバッファに対して一夜透析した(透
析膜の排除限界分子量8000)。透析した上清(10
00mlのシトソール抽出物に対応する約3〜5gの総
タンパク質)を水で500ミクロ未満のSiemans
導電率に調整し、475mlのベッドボリュームのDE
AE−5PW HPLC(Biorad)カラムに流し
た。同じバッファと0.5Mまで増加するNaCl勾配
と220mMのトリスHClとを用いると、約40mM
NaClにICE活性(実施例4)が溶出した。
【0093】DEAEカラムから溶出したICE活性分
画をプールし、同量の75mMのHEPES、10%
(v/v)のショ糖、0.1%(v/v)のCHAP
S、2mMのDTTバッファで希釈し、pH7.0に調
整した150mlのベッドボリュームのSP−5PW
HPLC(Biorad)カラムに流し、同じバッファ
中のKCl勾配(0〜0.5M)で溶出させた。ICE
活性分画(約75mM塩)をSDS−PAGE(10〜
20%、17〜27%、16%または18%ゲル)によ
ってクロマトグラフィー処理し、活性が検出されたバン
ドを決定するために銀染色した。実施例9参照。これら
のSP−HPLC分画を更に、口径の小さいC4(AB
I)HPLCカラムでクロマトグラフィー処理し、0.
1%TFA中のアセトニトリル勾配で溶出させた。種々
のピーク(214nm)を乾燥させ、SDS−PAGE
でクロマトグラフィー処理し、銀染色して、図1(実施
例8)に示すような20〜22及び10kDaタンパク
質の相対移動速度を確認した。
画をプールし、同量の75mMのHEPES、10%
(v/v)のショ糖、0.1%(v/v)のCHAP
S、2mMのDTTバッファで希釈し、pH7.0に調
整した150mlのベッドボリュームのSP−5PW
HPLC(Biorad)カラムに流し、同じバッファ
中のKCl勾配(0〜0.5M)で溶出させた。ICE
活性分画(約75mM塩)をSDS−PAGE(10〜
20%、17〜27%、16%または18%ゲル)によ
ってクロマトグラフィー処理し、活性が検出されたバン
ドを決定するために銀染色した。実施例9参照。これら
のSP−HPLC分画を更に、口径の小さいC4(AB
I)HPLCカラムでクロマトグラフィー処理し、0.
1%TFA中のアセトニトリル勾配で溶出させた。種々
のピーク(214nm)を乾燥させ、SDS−PAGE
でクロマトグラフィー処理し、銀染色して、図1(実施
例8)に示すような20〜22及び10kDaタンパク
質の相対移動速度を確認した。
【0094】20kDAサブユニット及び10kDaサ
ブユニットのNH2末端アミノ酸配列を第3表に示す。
ブユニットのNH2末端アミノ酸配列を第3表に示す。
【0095】
【表3】
【0096】実施例9 インターロイキン−1β変換酵素のドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動及び染色 実施例2、3、5、6、7、8、10で得られた精製I
CEのドデシル硫酸ナトリウムポアクリルアミドゲル電
気泳動を、Laemmli、Nature 227:6
80〜685(1970)の方法にほぼ従って実施し
た。0.15cm×10cm×10cmのBio−Ra
dミニゲルを使用し、15%アクリルアミド−0.4%
ビス−アクリルアミドのSDS−PAGE分解ゲルを流
込んだ。次いで、分解ゲルの上に、5%アクリルアミド
−0.14%ビス−アクリルアミドから成る不連続な第
2の層を流込みによって形成した。重合後に、追跡染料
としてブロモフェノールブルーを含むLaemmlis
バッファに溶解した50μg以下のタンパク質をゲルに
充填した。次いで、ゲルを50Vで1/2〜1時間電気
泳動させ、次いで150Vでブロモフェノールブルー染
料がゲルから溶出し始めるまで電気泳動させた。ここで
電気泳動を停止させ、ゲルを銀染色用に処理する。
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動及び染色 実施例2、3、5、6、7、8、10で得られた精製I
CEのドデシル硫酸ナトリウムポアクリルアミドゲル電
気泳動を、Laemmli、Nature 227:6
80〜685(1970)の方法にほぼ従って実施し
た。0.15cm×10cm×10cmのBio−Ra
dミニゲルを使用し、15%アクリルアミド−0.4%
ビス−アクリルアミドのSDS−PAGE分解ゲルを流
込んだ。次いで、分解ゲルの上に、5%アクリルアミド
−0.14%ビス−アクリルアミドから成る不連続な第
2の層を流込みによって形成した。重合後に、追跡染料
としてブロモフェノールブルーを含むLaemmlis
バッファに溶解した50μg以下のタンパク質をゲルに
充填した。次いで、ゲルを50Vで1/2〜1時間電気
泳動させ、次いで150Vでブロモフェノールブルー染
料がゲルから溶出し始めるまで電気泳動させた。ここで
電気泳動を停止させ、ゲルを銀染色用に処理する。
【0097】電気泳動後に、Oakley他(Anal
ytical Biochemistry、105:3
61〜363、1980)によって開発された方法の修
正方法を行なうようにDaiichiから販売されてい
るキットを用いた銀染色によって分離タンパク質を可視
化し得る。簡単に説明すると、ゲルをまず200mlの
50%メタノール:水混合物に30分間浸漬させ、次い
で各200mlの脱イオン水で10分間ずつ3回洗浄す
る。これらの初期洗浄後のゲルを、40%メタノール;
10%エタノール;0.5%グルタルアルデヒド;49.
5%水の溶液に15分間浸漬させ、次いで、各200m
lの脱イオン水を4回交換して10分間ずつ完全に洗浄
する。最後に、Oakleyの手順でタンパク質の染色
及び可視化を行なう。
ytical Biochemistry、105:3
61〜363、1980)によって開発された方法の修
正方法を行なうようにDaiichiから販売されてい
るキットを用いた銀染色によって分離タンパク質を可視
化し得る。簡単に説明すると、ゲルをまず200mlの
50%メタノール:水混合物に30分間浸漬させ、次い
で各200mlの脱イオン水で10分間ずつ3回洗浄す
る。これらの初期洗浄後のゲルを、40%メタノール;
10%エタノール;0.5%グルタルアルデヒド;49.
5%水の溶液に15分間浸漬させ、次いで、各200m
lの脱イオン水を4回交換して10分間ずつ完全に洗浄
する。最後に、Oakleyの手順でタンパク質の染色
及び可視化を行なう。
【0098】ICEの段階的精製で得られた電気泳動パ
ターンを図1に示す。銀染色をパネルAに示し、パネル
Bのプレ−IL−1β開裂活性と比較し得る。上記変換
酵素精製手順の途中で各200ngのアリコートを分離
した。各精製段階を以下の略号で示す:A.S;硫酸ア
ンモニウム分画、DE−FT;DEAE通過物、S.
P.;SPカチオン交換段階、HIC;プロピル疎水性
相互作用クロマトグラフィー、TSK;TSK−125
サイズ排除クロマトグラフィー、HAP;ヒドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー。最後のTSK及び
HAP段階の22及び10kDのタンパク質の出現は、
ICE活性と相関関係を有することに注目されたい。代
替精製スキーム(A.S.、DEAE、SP、HAP、T
SK)によって精製されたICE活性を、実施例7に記
載のごとくプロピル疎水性相互作用カラムで処理した。
タンパク質は実施例7の方法で記載したように逆塩勾配
で溶出した。溶出したタンパク質を透析し、SDS−P
AGE及び銀染色(パネルA)によって分析しICE活
性(パネルB)を測定した。22及び10kDのタンパ
ク質(矢印)の溶出とICE活性との間の相関関係に注
目されたい。
ターンを図1に示す。銀染色をパネルAに示し、パネル
Bのプレ−IL−1β開裂活性と比較し得る。上記変換
酵素精製手順の途中で各200ngのアリコートを分離
した。各精製段階を以下の略号で示す:A.S;硫酸ア
ンモニウム分画、DE−FT;DEAE通過物、S.
P.;SPカチオン交換段階、HIC;プロピル疎水性
相互作用クロマトグラフィー、TSK;TSK−125
サイズ排除クロマトグラフィー、HAP;ヒドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー。最後のTSK及び
HAP段階の22及び10kDのタンパク質の出現は、
ICE活性と相関関係を有することに注目されたい。代
替精製スキーム(A.S.、DEAE、SP、HAP、T
SK)によって精製されたICE活性を、実施例7に記
載のごとくプロピル疎水性相互作用カラムで処理した。
タンパク質は実施例7の方法で記載したように逆塩勾配
で溶出した。溶出したタンパク質を透析し、SDS−P
AGE及び銀染色(パネルA)によって分析しICE活
性(パネルB)を測定した。22及び10kDのタンパ
ク質(矢印)の溶出とICE活性との間の相関関係に注
目されたい。
【0099】実施例11 ICEのプロテアーゼインヒビター感受性 THP.1 S−300にインヒビターを添加し実施例
4に記載のごとくIL−β開裂を測定することによって
種々のインヒビターによるICE変換酵素活性の阻害能
を測定した。第4表は試験インヒビターの一覧及びその
阻害活性の有無を示す。
4に記載のごとくIL−β開裂を測定することによって
種々のインヒビターによるICE変換酵素活性の阻害能
を測定した。第4表は試験インヒビターの一覧及びその
阻害活性の有無を示す。
【0100】
【表4】
【0101】
【表5】
【0102】スルフヒドリルアルキル化試薬だけがIC
E活性を阻害した。阻害がICE活性に機械論的関係を
有するか否かは判明していない。もっと後の精製段階で
更に試験すると、すべての場合に同様の結果が得られ
た。どの場合にも、完全阻害(+)または観察可能な阻
害無し(−)のいずれかによって阻害結果を判定した。
E活性を阻害した。阻害がICE活性に機械論的関係を
有するか否かは判明していない。もっと後の精製段階で
更に試験すると、すべての場合に同様の結果が得られ
た。どの場合にも、完全阻害(+)または観察可能な阻
害無し(−)のいずれかによって阻害結果を判定した。
【0103】実施例12 ペプチド基質の合成 フェニルアセトアミドメチル樹脂及びtBocアミノ酸
を使用しMerrifield固相法によってペプチド
を合成した。Applied Biosystems
430Aペプチドシンセサイザーを製造業者の指示手順
通りに用いて合成を実施した。90%無水HF、10%
アニソールで0℃で1時間処理して樹脂からペプチドの
脱保護及び開裂を同時に生じさせ、次いで10%酢酸で
樹脂からペプチドを抽出し凍結乾燥した。得られた粗ペ
プチドを、Waters C18DeltaPakカラ
ムの逆相HPLCを用い、水性0.2%トリフルオロ酢
酸(TFA)中の5〜70%のアセトニトリル勾配で精
製した。精製したペプチドの構造を質量分析によって確
認した。
を使用しMerrifield固相法によってペプチド
を合成した。Applied Biosystems
430Aペプチドシンセサイザーを製造業者の指示手順
通りに用いて合成を実施した。90%無水HF、10%
アニソールで0℃で1時間処理して樹脂からペプチドの
脱保護及び開裂を同時に生じさせ、次いで10%酢酸で
樹脂からペプチドを抽出し凍結乾燥した。得られた粗ペ
プチドを、Waters C18DeltaPakカラ
ムの逆相HPLCを用い、水性0.2%トリフルオロ酢
酸(TFA)中の5〜70%のアセトニトリル勾配で精
製した。精製したペプチドの構造を質量分析によって確
認した。
【0104】また、ICEのキャラクタリゼーションの
ためには、全体配列: Asn−Glu−Ala−Tyr−Val−His−A
sp−Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Le
u−Asn(以後P14merと呼ぶ) を有するペプチドを使用した。このペプチドを上記と同
様に合成し、精製し、特性決定した。ペプチド配列Ac
−Tyr−Val−Ala−Asp−7−アミノクマリ
ン(Ac−Tyr−Val−ALa−Asp−AM
C),N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−ア
ラニニル)−アスパラギン酸a−7−アミノ−4 メチ
ルクマリンアミドを以下のプロセスで合成した。
ためには、全体配列: Asn−Glu−Ala−Tyr−Val−His−A
sp−Ala−Pro−Val−Arg−Ser−Le
u−Asn(以後P14merと呼ぶ) を有するペプチドを使用した。このペプチドを上記と同
様に合成し、精製し、特性決定した。ペプチド配列Ac
−Tyr−Val−Ala−Asp−7−アミノクマリ
ン(Ac−Tyr−Val−ALa−Asp−AM
C),N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−ア
ラニニル)−アスパラギン酸a−7−アミノ−4 メチ
ルクマリンアミドを以下のプロセスで合成した。
【0105】ステップA: N−アリルオキシカルボニルアスパラギン酸b−t−ブ
チルエステルa−7−アミノ−4−メチルクマリンアミ
ド
チルエステルa−7−アミノ−4−メチルクマリンアミ
ド
【0106】
【化1】
【0107】15mLの無水ジオキサン中のN−アリル
オキシカルボニルアスパラギン酸b−t−ブチルエステ
ル(3.44g、12.6mmol)及び7−アミノ−4
−メチルクマリン(2.00g、11.42mmol)の
溶液に、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド
(2.66g、13.86mmol)を添加した。75分
間還流後に、混合物を酢酸エチルで希釈し、1N塩酸で
3回及び飽和炭酸水素ナトリウムで3回洗浄した。溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合物
をシリカ−ゲルを用いたHPLC(35×300mmカ
ラム、溶出剤としてジクロロメタン中の10%酢酸エチ
ル)によって精製し、無色泡状の標題化合物を得た:1
H NMR(200MHz、CD3OD)d 7.77
(d、1H、J=2.39Hz)、7.68(d、1H、
J=9.06Hz)、7.49(dd、1H、J=2.3
6、9.10Hz)、6.21(q、1H、J=1.30
Hz)、5.95(m、1H)、5.4〜5.15(m、
2H)、4.72〜4.58(m、3H)、2.85(d
d、1H、J=6.17、15.73Hz)、2.65
(dd、1H、J=7.62、16.37Hz)、2.4
3(d、3H、J=1.44Hz)、1.43(s、9
H)。
オキシカルボニルアスパラギン酸b−t−ブチルエステ
ル(3.44g、12.6mmol)及び7−アミノ−4
−メチルクマリン(2.00g、11.42mmol)の
溶液に、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド
(2.66g、13.86mmol)を添加した。75分
間還流後に、混合物を酢酸エチルで希釈し、1N塩酸で
3回及び飽和炭酸水素ナトリウムで3回洗浄した。溶液
を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合物
をシリカ−ゲルを用いたHPLC(35×300mmカ
ラム、溶出剤としてジクロロメタン中の10%酢酸エチ
ル)によって精製し、無色泡状の標題化合物を得た:1
H NMR(200MHz、CD3OD)d 7.77
(d、1H、J=2.39Hz)、7.68(d、1H、
J=9.06Hz)、7.49(dd、1H、J=2.3
6、9.10Hz)、6.21(q、1H、J=1.30
Hz)、5.95(m、1H)、5.4〜5.15(m、
2H)、4.72〜4.58(m、3H)、2.85(d
d、1H、J=6.17、15.73Hz)、2.65
(dd、1H、J=7.62、16.37Hz)、2.4
3(d、3H、J=1.44Hz)、1.43(s、9
H)。
【0108】ステップB; アスパラギン酸b−t−ブチルエステルa−7−アミノ
−4−メチルクマリンアミド
−4−メチルクマリンアミド
【0109】
【化2】
【0110】10mLの無水テトラヒドロフラン中のN
−アリルオキシカルボニルアスパラギン酸b−t−ブチ
ルエステルa−7−アミノ−4−メチルクマリンアミド
(435mg、1.01mmol)及びDimedon
e(1.13g、8.08mmol)の溶液に、テトラキ
ストリフェニルホスフィンパラジウム(117mg、
0.1mmol)を添加した。45分後に、混合物を酢
酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで5回洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合
物を1%アンモニア及び10%メタノールを含む少量の
ジクロロメタン溶液に溶解させ、0.22mmフィルタ
ーで濾過した。次に混合物をシリカーゲルを用いたHP
LC(22×300mmカラム、ジクロロメタン中の
0.25%アンモニア及び2.5%メタノールまでのジク
ロロメタン勾配で溶出)によって精製し、無色泡状の標
題化合物を得た:1H NMR(200MHz、CD3O
D)d 7.93(d、1H、J=1.76Hz)、7.
82(d、1H、J=8.50Hz)、7.63(dd、
1H、J=2.40、9.10Hz)、6.34(q、1
H、J=1.31Hz)、3.89(t、1H、J=6.
35Hz)、2.88(dd、1H、J=6.03、1
6.72Hz)、2.75(dd、1H、J=6.77、
16.72Hz)、2.56(d、3H、J=1.37H
z)、1.54(s、9H)。
−アリルオキシカルボニルアスパラギン酸b−t−ブチ
ルエステルa−7−アミノ−4−メチルクマリンアミド
(435mg、1.01mmol)及びDimedon
e(1.13g、8.08mmol)の溶液に、テトラキ
ストリフェニルホスフィンパラジウム(117mg、
0.1mmol)を添加した。45分後に、混合物を酢
酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで5回洗浄
し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下に濃縮した。混合
物を1%アンモニア及び10%メタノールを含む少量の
ジクロロメタン溶液に溶解させ、0.22mmフィルタ
ーで濾過した。次に混合物をシリカーゲルを用いたHP
LC(22×300mmカラム、ジクロロメタン中の
0.25%アンモニア及び2.5%メタノールまでのジク
ロロメタン勾配で溶出)によって精製し、無色泡状の標
題化合物を得た:1H NMR(200MHz、CD3O
D)d 7.93(d、1H、J=1.76Hz)、7.
82(d、1H、J=8.50Hz)、7.63(dd、
1H、J=2.40、9.10Hz)、6.34(q、1
H、J=1.31Hz)、3.89(t、1H、J=6.
35Hz)、2.88(dd、1H、J=6.03、1
6.72Hz)、2.75(dd、1H、J=6.77、
16.72Hz)、2.56(d、3H、J=1.37H
z)、1.54(s、9H)。
【0111】ステップC: N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニニ
ル)−アスパラギン酸b−t−ブチルエステル−a−7
−アミノ−4−メチルクマリン
ル)−アスパラギン酸b−t−ブチルエステル−a−7
−アミノ−4−メチルクマリン
【0112】
【化3】
【0113】2mLのジメチルホルムアミド中のN−
(N−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニン(2
88mg、0.733mmol)、アスパラギン酸b−
t−ブチルエステル−a−7−アミノ−4−メチルクマ
リン(242mg、0.698mmol)及びヒドロキ
シベンゾトリアゾール(149mg、1.10mmo
l)の溶液に、0℃で、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(151mg、0.733)を添加した。周囲温度で
16時間維持後に、混合物を濾過し、Sephade
x″LH−20クロマトグラフィー(1M×50mmカ
ラム、溶出剤メタノール)によって精製した。得られた
生成物をメタノールと混和(triturate)し、
無色固体状の標題化合物を得た:1H NMR(200
MHz、DMF−d7)d 8.3〜7.5(m、7
H)、7.09(br、d、2H、J=8.61Hz)、
6.72(br、d、2H、J=8.64Hz)、6.2
7(q、1H、J=1.31Hz)、4.84(m、1
H)、4.62(m、1H)、4.44−4.14(m、
2H)、3.15−2.7(m、4H)、2.45(d、
3H、J=1.37Hz)、2.13(m、1H)、1.
87(s、3H)、1.41(s、9H)、1.37
(d、3H、J=7.38Hz)、0.94(d、3H、
J=7.12Hz)、0.93(d、3H、J=7.12
Hz)。
(N−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニン(2
88mg、0.733mmol)、アスパラギン酸b−
t−ブチルエステル−a−7−アミノ−4−メチルクマ
リン(242mg、0.698mmol)及びヒドロキ
シベンゾトリアゾール(149mg、1.10mmo
l)の溶液に、0℃で、ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド(151mg、0.733)を添加した。周囲温度で
16時間維持後に、混合物を濾過し、Sephade
x″LH−20クロマトグラフィー(1M×50mmカ
ラム、溶出剤メタノール)によって精製した。得られた
生成物をメタノールと混和(triturate)し、
無色固体状の標題化合物を得た:1H NMR(200
MHz、DMF−d7)d 8.3〜7.5(m、7
H)、7.09(br、d、2H、J=8.61Hz)、
6.72(br、d、2H、J=8.64Hz)、6.2
7(q、1H、J=1.31Hz)、4.84(m、1
H)、4.62(m、1H)、4.44−4.14(m、
2H)、3.15−2.7(m、4H)、2.45(d、
3H、J=1.37Hz)、2.13(m、1H)、1.
87(s、3H)、1.41(s、9H)、1.37
(d、3H、J=7.38Hz)、0.94(d、3H、
J=7.12Hz)、0.93(d、3H、J=7.12
Hz)。
【0114】ステップD: N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−アラニニ
ル)−アスパラギン酸a−7−アミノ−4−メチルクマ
リンアミド
ル)−アスパラギン酸a−7−アミノ−4−メチルクマ
リンアミド
【0115】
【化4】
【0116】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−アラニニル)−アスパラギン酸b−t−ブチルエス
テル−a−7−アミノ−4−メチルクマリンアミドをト
リフルオロ酢酸に溶解させた。15分後に混合物を減圧
下に濃縮して無色固体状の標題化合物を得た:1H N
MR(200MHz、DMF−d7)d 8.3−7.5
(m、7H)、7.09(br、d、2H、J=8.61
Hz)、6.72(br、d、2H、J=8.64H
z)、6.27(q、1H、J=1.31Hz)、4.8
4(m、1H)、4.62(m、1H)、4.44−4.
14(m、2H)、3.15−2.7(m、4H)、2.
45(d、3H、J=1.37Hz)、2.13(m、1
H)、1.87(s、3H)、1.41(s、9H)、
1.37(d、3H、J=7.38Hz)、0.94
(d、3H、J=7.12Hz)、0.93(d、3H、
J=7.12Hz)。
ル−アラニニル)−アスパラギン酸b−t−ブチルエス
テル−a−7−アミノ−4−メチルクマリンアミドをト
リフルオロ酢酸に溶解させた。15分後に混合物を減圧
下に濃縮して無色固体状の標題化合物を得た:1H N
MR(200MHz、DMF−d7)d 8.3−7.5
(m、7H)、7.09(br、d、2H、J=8.61
Hz)、6.72(br、d、2H、J=8.64H
z)、6.27(q、1H、J=1.31Hz)、4.8
4(m、1H)、4.62(m、1H)、4.44−4.
14(m、2H)、3.15−2.7(m、4H)、2.
45(d、3H、J=1.37Hz)、2.13(m、1
H)、1.87(s、3H)、1.41(s、9H)、
1.37(d、3H、J=7.38Hz)、0.94
(d、3H、J=7.12Hz)、0.93(d、3H、
J=7.12Hz)。
【0117】C33H39N5O10?1.65H2Oのマイクロ分
析: 計算値:C57.00;H6.13;N10.07 測定値:C56.97;H5.84;N10.16。
析: 計算値:C57.00;H6.13;N10.07 測定値:C56.97;H5.84;N10.16。
【0118】実施例13 インターロイキン−1β変換酵素の塩及び最適pH THP−1 S−3(実施例1)変換酵素活性の最適p
Hを測定した。S−3抽出物のサンプルを5〜9の範囲
のpH値を有する一連のバッファに透析した。
Hを測定した。S−3抽出物のサンプルを5〜9の範囲
のpH値を有する一連のバッファに透析した。
【0119】透析サンプルからアリコートを採取し、残
りをpH7.4のHEPESバッファに再度透析した。
次に、透析サンプルの変換酵素活性を再度試験した。プ
レ−IL−1β変換酵素はpH7.0〜8.0の範囲の狭
い最適pHを有し、酸性pHに耐性でない。プレ−IL
−1β変換酵素のイオン要件を塩滴定によって測定し
た。プレ−IL−1β変換酵素(THP−1由来)を反
応液中の増加する種々の濃度のKClと共にインキュベ
ートした。結果は、KClが低濃度(<50mM)のと
きに変換酵素活性が最適であることを示した。Laem
mli、Nature 227:680〜685(19
70)によるSDS/PAGE(実施例9参照)及びフ
ルオログラフィーを順次行なって開裂の程度を検定し
た。
りをpH7.4のHEPESバッファに再度透析した。
次に、透析サンプルの変換酵素活性を再度試験した。プ
レ−IL−1β変換酵素はpH7.0〜8.0の範囲の狭
い最適pHを有し、酸性pHに耐性でない。プレ−IL
−1β変換酵素のイオン要件を塩滴定によって測定し
た。プレ−IL−1β変換酵素(THP−1由来)を反
応液中の増加する種々の濃度のKClと共にインキュベ
ートした。結果は、KClが低濃度(<50mM)のと
きに変換酵素活性が最適であることを示した。Laem
mli、Nature 227:680〜685(19
70)によるSDS/PAGE(実施例9参照)及びフ
ルオログラフィーを順次行なって開裂の程度を検定し
た。
【0120】粗THP−1 S−3または部分精製酵素
をICE活性のソースとして使用し、上記のごときゲル
ベースの開裂アッセイまたはP14mer開裂アッセイ
によって測定される最適アッセイ条件を決定するため
に、塩及びpH滴定を実施した。粗THP−1 S−3
を使用した実施例では、塩及びpH滴定の双方が含まれ
る。データ(図3A)は、ゲルベースの開裂アッセイで
はICE活性がKClの含有によって用量依存的に阻害
されることを示す。ゲルベースの開裂アッセイにおける
ICEの最適pHは約7.4である。同じ実験は、IC
E活性が酸性pHに不安定であるが、塩基性pH環境で
は安定であることを示す。P14mer及びAc−YV
AD−AMC開裂アッセイは、最適pH及び安定性に関
して同様のプロフィルを示す。
をICE活性のソースとして使用し、上記のごときゲル
ベースの開裂アッセイまたはP14mer開裂アッセイ
によって測定される最適アッセイ条件を決定するため
に、塩及びpH滴定を実施した。粗THP−1 S−3
を使用した実施例では、塩及びpH滴定の双方が含まれ
る。データ(図3A)は、ゲルベースの開裂アッセイで
はICE活性がKClの含有によって用量依存的に阻害
されることを示す。ゲルベースの開裂アッセイにおける
ICEの最適pHは約7.4である。同じ実験は、IC
E活性が酸性pHに不安定であるが、塩基性pH環境で
は安定であることを示す。P14mer及びAc−YV
AD−AMC開裂アッセイは、最適pH及び安定性に関
して同様のプロフィルを示す。
【0121】しかしながら、P14merアッセイはゲ
ルベースアッセイと同様の感度を示すが、Ac−YVA
D−AMCアッセイは本質的に塩に感受性でないため、
塩の影響が多少異なる。データは、ICEが中性プロテ
イナーゼであり、一価イオンを要求しないことを示す。
ルベースアッセイと同様の感度を示すが、Ac−YVA
D−AMCアッセイは本質的に塩に感受性でないため、
塩の影響が多少異なる。データは、ICEが中性プロテ
イナーゼであり、一価イオンを要求しないことを示す。
【0122】図3Aは、THP−1 S−3変換酵素活
性の最適pHの測定結果を示す。S−3抽出物を5〜9
の範囲のpH値を有する種々のバッファに透析した。透
析物からアリコートを採取し、残りをpH7.4のHE
PESバッファに再透析した。次に、全部の透析物の変
換酵素活性を試験した:(−);前記pHのS−30
0、(+);pH7.4のHEPESバッファに再透析
したS−300。結果は、ICEがpH7.0〜8.0の
狭い最適pHを有し、酸性pHに耐性でないことを示
す。
性の最適pHの測定結果を示す。S−3抽出物を5〜9
の範囲のpH値を有する種々のバッファに透析した。透
析物からアリコートを採取し、残りをpH7.4のHE
PESバッファに再透析した。次に、全部の透析物の変
換酵素活性を試験した:(−);前記pHのS−30
0、(+);pH7.4のHEPESバッファに再透析
したS−300。結果は、ICEがpH7.0〜8.0の
狭い最適pHを有し、酸性pHに耐性でないことを示
す。
【0123】図3Bは変換酵素活性の塩滴定の結果を示
す。ゲルベースの開裂アッセイでTHP−1 S−30
0抽出物を増加する種々の濃度のKClと共にインキュ
ベートした。結果は、KClが低濃度(<50mM)の
ときにICE活性が最適であることを示す。
す。ゲルベースの開裂アッセイでTHP−1 S−30
0抽出物を増加する種々の濃度のKClと共にインキュ
ベートした。結果は、KClが低濃度(<50mM)の
ときにICE活性が最適であることを示す。
【0124】実施例14 チオールプロテアーゼとしてのインターロイキン−1β
のキャラクタリゼーション 実施例11の表4に示すように、チオール残基を修飾し
得る試薬だけがICEを阻害し得る。表4のデータは、
部分精製酵素即ちTHP−1 S−3をICE活性の指
標としたゲルベースの開裂アッセイによって得られたも
のである。Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−A
MCを基質としたP14merアッセイではこのデータ
が確認されその範囲が拡張された。この表の結果に対す
る唯一の例外は、1,10フェナントロリン(OP)を
インヒビターとして試験したときに生じた。元来、この
化合物はゲルベースの開裂アッセイでICE活性を阻害
しなかった。P14merを基質(実施例12)とした
不連続な反応動力学的アッセイ(discontinu
ous kinetic assay)において、OP
が時間及び濃度依存的にICE活性を阻害し得ることが
判明した。失活の速度定数(8×10-2s-1M-1)は小
さく、ZnCl2を添加し次いでキレート剤で処理する
ことによってICE活性を回復させることができない。
追加の試験によれば、OPはフェナントロリン−金属錯
体を介してICEを酸化することによってインヒビター
として機能することが実際に証明された。これは、以下
のいくつかの現象によって確認された:(1)高濃度
(10mM)の還元剤の存在がICEをOPの作用から
保護することが判明した。これは、OPによるICE失
活の主な原因が必要な成分の酸化にあることを示唆す
る;(2)2種類の金属キレート剤EDTA及びOPに
よって同時にICEを処理するとICEが阻害されな
い。これは、観察されたOPによるICEの活性阻害の
主因がタンパク質結合金属のキレート化にあるという仮
説と矛盾する;(3)1.0mMのOPを含むICEア
ッセイに10mMのCuSO4を添加すると、化合物に
よるICE阻害速度が17倍に増加する。これは、金属
−フェナントロリン錯体がOPによるICE阻害の主因
であることを示唆する。これらのデータは、ICEがそ
の構造中に還元チオール残基を含有し、この残基が種々
の手段によって酸化またはアルキル化されると、酵素が
失活するという仮説と一致する。データはICEがメタ
ロプロテアーゼであるという仮説とは矛盾する。
のキャラクタリゼーション 実施例11の表4に示すように、チオール残基を修飾し
得る試薬だけがICEを阻害し得る。表4のデータは、
部分精製酵素即ちTHP−1 S−3をICE活性の指
標としたゲルベースの開裂アッセイによって得られたも
のである。Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−A
MCを基質としたP14merアッセイではこのデータ
が確認されその範囲が拡張された。この表の結果に対す
る唯一の例外は、1,10フェナントロリン(OP)を
インヒビターとして試験したときに生じた。元来、この
化合物はゲルベースの開裂アッセイでICE活性を阻害
しなかった。P14merを基質(実施例12)とした
不連続な反応動力学的アッセイ(discontinu
ous kinetic assay)において、OP
が時間及び濃度依存的にICE活性を阻害し得ることが
判明した。失活の速度定数(8×10-2s-1M-1)は小
さく、ZnCl2を添加し次いでキレート剤で処理する
ことによってICE活性を回復させることができない。
追加の試験によれば、OPはフェナントロリン−金属錯
体を介してICEを酸化することによってインヒビター
として機能することが実際に証明された。これは、以下
のいくつかの現象によって確認された:(1)高濃度
(10mM)の還元剤の存在がICEをOPの作用から
保護することが判明した。これは、OPによるICE失
活の主な原因が必要な成分の酸化にあることを示唆す
る;(2)2種類の金属キレート剤EDTA及びOPに
よって同時にICEを処理するとICEが阻害されな
い。これは、観察されたOPによるICEの活性阻害の
主因がタンパク質結合金属のキレート化にあるという仮
説と矛盾する;(3)1.0mMのOPを含むICEア
ッセイに10mMのCuSO4を添加すると、化合物に
よるICE阻害速度が17倍に増加する。これは、金属
−フェナントロリン錯体がOPによるICE阻害の主因
であることを示唆する。これらのデータは、ICEがそ
の構造中に還元チオール残基を含有し、この残基が種々
の手段によって酸化またはアルキル化されると、酵素が
失活するという仮説と一致する。データはICEがメタ
ロプロテアーゼであるという仮説とは矛盾する。
【0125】実施例15 ICE成分である22kDタンパク質の活性部位標識に
よる同定 チオールアルキル化試薬及び金属−フェナントロリン錯
体はICEを阻害できるので、必要なチオール基が活性
部位またはその近傍に存在することは予想される。しか
し、(例えば、遠隔チオールを介したアロステリック効
果のような)別の理論でその効果を説明することも考え
られる。次に必要な実験は、チオール基がICE基質と
競合し得る位置に存在することを実証することである。
この結果を得るための1つの方法として、チオール基の
共有結合修飾を介してICEを阻害して酵素を失活させ
る試薬を用い、この試薬が飽和レベルの基質の存在によ
ってブロックされ得ることを証明するとよい。モデル試
薬としてヨードアセテートを選択した。その理由は、こ
の試薬によるICEの失活速度定数(24M-1s-1)が
単なるシステイン残基のカルボキシメチル化よりもはる
かに大きいからである。100mM(1*Km)のヨー
ドアセテートは9.13分の半阻害時間を与えることが
測定されている。反応液中に飽和レベルの基質Ac−T
yr−Val−Ala−Asp−AMC(200*Km
または2.8mM)が含まれると、その結果として、酵
素の失活が理論的に防御される。アルキル化試薬として
14C−ヨードアセテートを使用し同様の手順を使用し
て200×Km基質の存在下または不在下に標識された
タンパク質を同定した。100mMの放射性標識ヨード
アセテートの濃度で、反応進行中に有意数のタンパク質
が標識された。反応液中に2.8mMのAc−Tyr−
Val−Ala−Asp−AMCが含まれるとき、2%
未満のICE失活が生じたが、これは予想値に近い値で
あった。標識タンパク質の数及び程度をSDS−PAG
E及びフルオログラフィーによって評価すると、分子量
22kDaのタンパク質の標識だけが有意に減少してい
ることが判明した(図4)。混合物中のその他のタンパ
ク質の標識は変化していなかった。これは、22kDa
タンパク質がヨードアセテートでアルキル化され得るチ
オール基を含み、このチオール基がICE基質と競合し
得る位置に存在することを示唆する。このチオールのア
ルキル化はICE活性の有無と相関関係を有するので、
22kDaタンパク質がICE酵素の少なくとも一部を
含むと判断できる。ICE及び100mMの14C−ヨ
ードアセテートを2.8mMのAc−Tyr−Val−
Ala−Asp−AMCの存在(+S)または不在(−
S)下に1時間インキュベートした。1時間後に、10
mMの非標識ヨードアセテートと10mMのDTTとを
添加して反応を停止させた。反応液のアリコートをSD
S−PAGE及びクーマシーブルー染色またはオートラ
ジオグラフィーを順次用いて分析した。クーマシーブル
ー染色に基づくデータは、反応の進行中にタンパク質組
成の観察可能な変化が生じなかったことを示す。しかし
ながら、オートラジオグラフィーでは、22kDaタン
パク質はICE基質が存在しないときは標識されるが存
在するときは標識されないことを示す。
よる同定 チオールアルキル化試薬及び金属−フェナントロリン錯
体はICEを阻害できるので、必要なチオール基が活性
部位またはその近傍に存在することは予想される。しか
し、(例えば、遠隔チオールを介したアロステリック効
果のような)別の理論でその効果を説明することも考え
られる。次に必要な実験は、チオール基がICE基質と
競合し得る位置に存在することを実証することである。
この結果を得るための1つの方法として、チオール基の
共有結合修飾を介してICEを阻害して酵素を失活させ
る試薬を用い、この試薬が飽和レベルの基質の存在によ
ってブロックされ得ることを証明するとよい。モデル試
薬としてヨードアセテートを選択した。その理由は、こ
の試薬によるICEの失活速度定数(24M-1s-1)が
単なるシステイン残基のカルボキシメチル化よりもはる
かに大きいからである。100mM(1*Km)のヨー
ドアセテートは9.13分の半阻害時間を与えることが
測定されている。反応液中に飽和レベルの基質Ac−T
yr−Val−Ala−Asp−AMC(200*Km
または2.8mM)が含まれると、その結果として、酵
素の失活が理論的に防御される。アルキル化試薬として
14C−ヨードアセテートを使用し同様の手順を使用し
て200×Km基質の存在下または不在下に標識された
タンパク質を同定した。100mMの放射性標識ヨード
アセテートの濃度で、反応進行中に有意数のタンパク質
が標識された。反応液中に2.8mMのAc−Tyr−
Val−Ala−Asp−AMCが含まれるとき、2%
未満のICE失活が生じたが、これは予想値に近い値で
あった。標識タンパク質の数及び程度をSDS−PAG
E及びフルオログラフィーによって評価すると、分子量
22kDaのタンパク質の標識だけが有意に減少してい
ることが判明した(図4)。混合物中のその他のタンパ
ク質の標識は変化していなかった。これは、22kDa
タンパク質がヨードアセテートでアルキル化され得るチ
オール基を含み、このチオール基がICE基質と競合し
得る位置に存在することを示唆する。このチオールのア
ルキル化はICE活性の有無と相関関係を有するので、
22kDaタンパク質がICE酵素の少なくとも一部を
含むと判断できる。ICE及び100mMの14C−ヨ
ードアセテートを2.8mMのAc−Tyr−Val−
Ala−Asp−AMCの存在(+S)または不在(−
S)下に1時間インキュベートした。1時間後に、10
mMの非標識ヨードアセテートと10mMのDTTとを
添加して反応を停止させた。反応液のアリコートをSD
S−PAGE及びクーマシーブルー染色またはオートラ
ジオグラフィーを順次用いて分析した。クーマシーブル
ー染色に基づくデータは、反応の進行中にタンパク質組
成の観察可能な変化が生じなかったことを示す。しかし
ながら、オートラジオグラフィーでは、22kDaタン
パク質はICE基質が存在しないときは標識されるが存
在するときは標識されないことを示す。
【0126】実施例16 チオールプロテアーゼとしてのICEのキャラクタリゼ
ーション 最後に、プロテアーゼクラスに関するICEのキャラク
タリゼーションを完結するために、Ac−Tyr−Va
l−Ala−Aspペプチドから双方が構築された2種
類のメカニズムベースのチオールプロテアーゼインヒビ
ター、即ちジアゾメチルケトン及びペプチドアルデヒド
を合成した。ペプチジルジアゾメチルケトン(Ac−T
yr−Val−Ala−Asp−CHN2)とペプチド
アルデヒド(Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−
CHO)との双方を併願特許に記載の方法で合成した。
Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−CHN2は時
間及び用量依存的にICE活性を不可逆的に阻害するこ
とを示し、これは活性部位チオールの不可逆的アルキル
化と一致する。過剰量の基質の添加はこの失活に有効に
競合し、これもまた活性部位チオールが修飾されること
を示す。
ーション 最後に、プロテアーゼクラスに関するICEのキャラク
タリゼーションを完結するために、Ac−Tyr−Va
l−Ala−Aspペプチドから双方が構築された2種
類のメカニズムベースのチオールプロテアーゼインヒビ
ター、即ちジアゾメチルケトン及びペプチドアルデヒド
を合成した。ペプチジルジアゾメチルケトン(Ac−T
yr−Val−Ala−Asp−CHN2)とペプチド
アルデヒド(Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−
CHO)との双方を併願特許に記載の方法で合成した。
Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−CHN2は時
間及び用量依存的にICE活性を不可逆的に阻害するこ
とを示し、これは活性部位チオールの不可逆的アルキル
化と一致する。過剰量の基質の添加はこの失活に有効に
競合し、これもまた活性部位チオールが修飾されること
を示す。
【0127】Ac−Tyr−Val−Ala−Asp−
CHOは用量依存的に且つ基質と競合的にICEを可逆
的に阻害する。しかしながら、化学的に同様のペプチド
アルデヒドAc−Tyr(dAla)−Val−Ala
−Asp−CHOを合成することによって、該ベプチド
アルデヒドのICEに対する作用の特異性は決定されて
おり、競合的及び可逆的なそのICE阻害能も試験され
ていた。この化合物のICE阻害活性能は1/300で
ある。このことは、阻害がAc−Tyr−Val−Al
a−Asp−CHOによって示される特定のペプチド構
造の認識に依存するものであって、単にペプチドのC末
端にアルデヒド基が存在するからではないことを示す。
CHOは用量依存的に且つ基質と競合的にICEを可逆
的に阻害する。しかしながら、化学的に同様のペプチド
アルデヒドAc−Tyr(dAla)−Val−Ala
−Asp−CHOを合成することによって、該ベプチド
アルデヒドのICEに対する作用の特異性は決定されて
おり、競合的及び可逆的なそのICE阻害能も試験され
ていた。この化合物のICE阻害活性能は1/300で
ある。このことは、阻害がAc−Tyr−Val−Al
a−Asp−CHOによって示される特定のペプチド構
造の認識に依存するものであって、単にペプチドのC末
端にアルデヒド基が存在するからではないことを示す。
【0128】実施例17 インターロイキン−1β変換酵素の分子量決定 実施例8の方法で均質になるまで精製した22及び10
kDのタンパク質各5ピコモルを毛管液体クロマトグラ
フィー、エレクトロスプレーイオン化、質量分析によっ
て処理した。Finnigan Triple−Sec
tor Quadropole Mode l700質
量分析計で質量を決定した。機械の精度を決定するため
に標準タンパク質、ウシシトクロムcを使用すると、質
量決定の標準誤差が0.01〜0.02%であることが判
明した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルの
バイオマスデコンボリュージョン後に、単離「10kD
a」成分の分子量は、10,248原子質量単位の平均
質量を有し、「22kDa」タンパク質は19,866
原子質量単位の平均質量を有していることが判明した。
kDのタンパク質各5ピコモルを毛管液体クロマトグラ
フィー、エレクトロスプレーイオン化、質量分析によっ
て処理した。Finnigan Triple−Sec
tor Quadropole Mode l700質
量分析計で質量を決定した。機械の精度を決定するため
に標準タンパク質、ウシシトクロムcを使用すると、質
量決定の標準誤差が0.01〜0.02%であることが判
明した。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルの
バイオマスデコンボリュージョン後に、単離「10kD
a」成分の分子量は、10,248原子質量単位の平均
質量を有し、「22kDa」タンパク質は19,866
原子質量単位の平均質量を有していることが判明した。
【0129】実施例18 インターロイキン−1β変換酵素の等電点電気泳動 Bio−Rad Rotofor溶液相等電点電気泳動
装置を使用してICEの等電点を評価した。約1,26
0単位のICE(1単位は、10%のショ糖、0.1%
のCHAPS、20mMのHEPES pH7.4を含
むバッファ中で、200mMのP14mer基質を25
℃で2時間インキュベートしたときに毎分40ピコモル
のP14mer基質を開裂するために必要な酵素の量と
定義される)を含む10mlの部分精製ICE酵素を、
40mlの10%ショ糖、0.1%のCHAPS、0.2
%の両性電解質(Bio−Lyte pH5〜8)バッ
ファに希釈し、次いで、Bio−Rad Rotofo
r等電点電気泳動装置を使用して等電点電気泳動処理し
た。製造業者の指示通りに電気泳動を実施した。等電点
電気泳動勾配を溶出させ、P14merペプチドベース
のアッセイ、及び、基質として真正プレ−IL−1βを
用いたゲルベースの開裂アッセイで前記と同様にして分
画のICE活性を試験した。双方のアッセイで、ICE
活性のピークは、測定pH6.3の単位の勾配の一部分
に集中していた。図5参照。
装置を使用してICEの等電点を評価した。約1,26
0単位のICE(1単位は、10%のショ糖、0.1%
のCHAPS、20mMのHEPES pH7.4を含
むバッファ中で、200mMのP14mer基質を25
℃で2時間インキュベートしたときに毎分40ピコモル
のP14mer基質を開裂するために必要な酵素の量と
定義される)を含む10mlの部分精製ICE酵素を、
40mlの10%ショ糖、0.1%のCHAPS、0.2
%の両性電解質(Bio−Lyte pH5〜8)バッ
ファに希釈し、次いで、Bio−Rad Rotofo
r等電点電気泳動装置を使用して等電点電気泳動処理し
た。製造業者の指示通りに電気泳動を実施した。等電点
電気泳動勾配を溶出させ、P14merペプチドベース
のアッセイ、及び、基質として真正プレ−IL−1βを
用いたゲルベースの開裂アッセイで前記と同様にして分
画のICE活性を試験した。双方のアッセイで、ICE
活性のピークは、測定pH6.3の単位の勾配の一部分
に集中していた。図5参照。
【0130】実施例19 インターロイキン−1β変換酵素のオリゴマー構造の反
応動力学的証明 部分精製ICEに関する初期力価試験は、低酵素レベル
ではICE開裂活性が酵素濃度の厳密な直線状関数では
ないことを示唆した。この知見はオリゴマー酵素構造と
一致する。同様に、ICE活性はバッファに希釈した後
で時間依存的に減少することが知られており、最終的に
安定な定常状態酵素速度に達するであろう。この定常状
態が得られた後は、酵素を初期容量に再濃縮でき、24
時間のインキュベーション後に、同様の初期酵素活性を
有することを証明し得る(図6)。この曲線は、部分精
製ICEの標準原液(4単位/μl)を標準アッセイ混
合物(50uM(1*Km)の基質、100mMのHE
PES、10%ショ糖、0.1%CHAPS、10mM
のDTT、1mg/mlのBSA)で1000倍に希釈
することによって得られた。実線は、反応動力学モデル
で、25℃の半減期2.8時間のに対応する速度定数k
obs=0.004min-1の酵素活性の一次損失を示
す理論的グラフである。モデルはまた、初期反応速度の
値(vo=0.0068uM AMC/分)及び無限時
間で得られた速度の値(vs=0.00048uM A
MC/分)を決定する。これらのパラメータはまた、図
6の挿入部の棒グラフによって示される。飽和レベルの
基質(1mM、20*Km)を使用して実験を繰り返す
と、時間依存性失活は全く観察されない。これは、酵素
−基質複合体が反応動力学的に安定していることを示
す。この解離は100%可逆性であり、希釈酵素を10
00倍希釈から初期容量まで再濃縮すると複合体の完全
な再結合が得られる。これらのデータは、ICE活性の
喪失が完全に可逆的であり、希釈に対するICEの感受
性は、解離可能な2つの種の間に新しい平衡が成立する
ためであり、この結合が飽和レベルの基質によって安定
することを示唆する。
応動力学的証明 部分精製ICEに関する初期力価試験は、低酵素レベル
ではICE開裂活性が酵素濃度の厳密な直線状関数では
ないことを示唆した。この知見はオリゴマー酵素構造と
一致する。同様に、ICE活性はバッファに希釈した後
で時間依存的に減少することが知られており、最終的に
安定な定常状態酵素速度に達するであろう。この定常状
態が得られた後は、酵素を初期容量に再濃縮でき、24
時間のインキュベーション後に、同様の初期酵素活性を
有することを証明し得る(図6)。この曲線は、部分精
製ICEの標準原液(4単位/μl)を標準アッセイ混
合物(50uM(1*Km)の基質、100mMのHE
PES、10%ショ糖、0.1%CHAPS、10mM
のDTT、1mg/mlのBSA)で1000倍に希釈
することによって得られた。実線は、反応動力学モデル
で、25℃の半減期2.8時間のに対応する速度定数k
obs=0.004min-1の酵素活性の一次損失を示
す理論的グラフである。モデルはまた、初期反応速度の
値(vo=0.0068uM AMC/分)及び無限時
間で得られた速度の値(vs=0.00048uM A
MC/分)を決定する。これらのパラメータはまた、図
6の挿入部の棒グラフによって示される。飽和レベルの
基質(1mM、20*Km)を使用して実験を繰り返す
と、時間依存性失活は全く観察されない。これは、酵素
−基質複合体が反応動力学的に安定していることを示
す。この解離は100%可逆性であり、希釈酵素を10
00倍希釈から初期容量まで再濃縮すると複合体の完全
な再結合が得られる。これらのデータは、ICE活性の
喪失が完全に可逆的であり、希釈に対するICEの感受
性は、解離可能な2つの種の間に新しい平衡が成立する
ためであり、この結合が飽和レベルの基質によって安定
することを示唆する。
【0131】実施例20 混合ジスルフィドによる処理後のインターロイキン−1
β変換酵素オリゴマーの安定化または不安定化 酵素の精製及びキャラクタリゼーションを容易にする可
逆的活性部位修飾試薬を生成するために、種々の混合ジ
スルフィドについて、活性部位チオールを介して混合ジ
スルフィドを形成することによってICE活性を可逆的
に阻害する能力を試験した。試験した2種類はDTT可
逆的にICEを阻害する能力の顕著な違いを示した。酸
化グルタチオン(GSSS)及びシスタミン(2−アミ
ノエタンジチオール)のICE阻害能力を連続蛍光定量
アッセイで試験した。1mMのGSSSで処理したIC
Eを8分間の半阻害時間で阻害した。酵素がその失活域
に達した後で10mMのDTTを変換すると、酵素が直
ちに再活性化されて初期活性の98%を回復した。これ
は、プロセスが完全に可逆的であることを示す(図
7)。希釈の際に観察されるICE解離に対するGSS
S処理の効果を試験するために、濃縮ICEをGSSS
で処理し、次いで基質を含まないICEアッセイバッフ
ァに希釈した。処理した酵素を室温で平衡させ、残留I
CE活性を検定した。意外にも、GSSSはICE活性
を安定化し、半解離時間を90分から2800分に延長
した。これは未処理酵素に比べて30倍以上の延長であ
る(図8)。GSSSと比較すると、シスタミンはIC
E活性を安定化しないと考えられた。これは、シスタミ
ン処理の可逆性の程度を評価するように設計された実験
によって証明された。シスタミンで処理後のICEは、
5mMのシスタミンで半減期19分の時間依存性活性減
少を示した。失活域に達した後でDTTを添加しても酵
素活性は23%しか回復しなかった。これは、不可逆的
に失活した酵素が形成されたことを示唆する。高度に濃
縮されたICE(3単位/ml)を5mMのシスタミン
で処理し、次いで4℃で3日間平衡させることによっ
て、見掛けは「不可逆的に」失活した酵素が実際は解離
したモノマーであることが証明された。濃縮酵素にDT
Tを添加後、アリコートを採取し、ICEアッセイバッ
ファに希釈し、反応の初期速度を測定することによって
活性の回収をモニタした。活性の完全な回収が観察さ
れ、半減期36分間であった(図9)。これは、シスタ
ミンがICEをモノマー成分に解離させ、これらのモノ
マー成分は適宜濃縮されDTTによって処理された後に
可逆的に結合し得ることを示唆する。
β変換酵素オリゴマーの安定化または不安定化 酵素の精製及びキャラクタリゼーションを容易にする可
逆的活性部位修飾試薬を生成するために、種々の混合ジ
スルフィドについて、活性部位チオールを介して混合ジ
スルフィドを形成することによってICE活性を可逆的
に阻害する能力を試験した。試験した2種類はDTT可
逆的にICEを阻害する能力の顕著な違いを示した。酸
化グルタチオン(GSSS)及びシスタミン(2−アミ
ノエタンジチオール)のICE阻害能力を連続蛍光定量
アッセイで試験した。1mMのGSSSで処理したIC
Eを8分間の半阻害時間で阻害した。酵素がその失活域
に達した後で10mMのDTTを変換すると、酵素が直
ちに再活性化されて初期活性の98%を回復した。これ
は、プロセスが完全に可逆的であることを示す(図
7)。希釈の際に観察されるICE解離に対するGSS
S処理の効果を試験するために、濃縮ICEをGSSS
で処理し、次いで基質を含まないICEアッセイバッフ
ァに希釈した。処理した酵素を室温で平衡させ、残留I
CE活性を検定した。意外にも、GSSSはICE活性
を安定化し、半解離時間を90分から2800分に延長
した。これは未処理酵素に比べて30倍以上の延長であ
る(図8)。GSSSと比較すると、シスタミンはIC
E活性を安定化しないと考えられた。これは、シスタミ
ン処理の可逆性の程度を評価するように設計された実験
によって証明された。シスタミンで処理後のICEは、
5mMのシスタミンで半減期19分の時間依存性活性減
少を示した。失活域に達した後でDTTを添加しても酵
素活性は23%しか回復しなかった。これは、不可逆的
に失活した酵素が形成されたことを示唆する。高度に濃
縮されたICE(3単位/ml)を5mMのシスタミン
で処理し、次いで4℃で3日間平衡させることによっ
て、見掛けは「不可逆的に」失活した酵素が実際は解離
したモノマーであることが証明された。濃縮酵素にDT
Tを添加後、アリコートを採取し、ICEアッセイバッ
ファに希釈し、反応の初期速度を測定することによって
活性の回収をモニタした。活性の完全な回収が観察さ
れ、半減期36分間であった(図9)。これは、シスタ
ミンがICEをモノマー成分に解離させ、これらのモノ
マー成分は適宜濃縮されDTTによって処理された後に
可逆的に結合し得ることを示唆する。
【0132】実施例21 酸化グルタチオンまたはシスタミン修飾インターロイキ
ン−1βのサイズ排除クロマトグラフィー 実施例20のデータは、ICEオリゴマーの結合がGS
SSまたはシスタミンによる前処理の影響を受け得るこ
とを示唆するので、安定化された酵素と不安定化された
酵素との分子量を見分ける実験を行なった。実施例5で
説明したように、ICEは、DTTの存在下に、TSK
G2000カラムでは見掛け分子量23,000で溶
出し、TSK G3000カラムでは見掛け分子量3
0,000で溶出する。濃縮ICEをまずGSSSまた
はシスタミンで24時間前処理し、次いでTSK G2
000サイズ排除カラムに移すと、酵素活性が分離可能
2つの異なる分子量でカラムから溶出する。GSSS処
理した酵素は見掛け分子量39,000でカラムから溶
出するが、シスタミン処理した酵素は見掛け分子量2
2,000であった(図10)。カラム分画のSDS−
PAGEゲルのタンパク質含量を銀染色によって分析す
ると、ICE活性を有する22及び10kDのタンパク
質が同時に溶出し、これらの2つのタンパク質の溶出位
置は、GSSSまたはシスタミン処理後に観察された分
子量変化に伴って変化する。このデータは、22及び1
0kDのタンパク質がICE分子の2つのサブユニット
を含み、これらのタンパク質の可逆的に見える結合が溶
解ICEのオリゴマー性挙動の原因であることを示す。
ン−1βのサイズ排除クロマトグラフィー 実施例20のデータは、ICEオリゴマーの結合がGS
SSまたはシスタミンによる前処理の影響を受け得るこ
とを示唆するので、安定化された酵素と不安定化された
酵素との分子量を見分ける実験を行なった。実施例5で
説明したように、ICEは、DTTの存在下に、TSK
G2000カラムでは見掛け分子量23,000で溶
出し、TSK G3000カラムでは見掛け分子量3
0,000で溶出する。濃縮ICEをまずGSSSまた
はシスタミンで24時間前処理し、次いでTSK G2
000サイズ排除カラムに移すと、酵素活性が分離可能
2つの異なる分子量でカラムから溶出する。GSSS処
理した酵素は見掛け分子量39,000でカラムから溶
出するが、シスタミン処理した酵素は見掛け分子量2
2,000であった(図10)。カラム分画のSDS−
PAGEゲルのタンパク質含量を銀染色によって分析す
ると、ICE活性を有する22及び10kDのタンパク
質が同時に溶出し、これらの2つのタンパク質の溶出位
置は、GSSSまたはシスタミン処理後に観察された分
子量変化に伴って変化する。このデータは、22及び1
0kDのタンパク質がICE分子の2つのサブユニット
を含み、これらのタンパク質の可逆的に見える結合が溶
解ICEのオリゴマー性挙動の原因であることを示す。
【0133】実施例22 インターロイキン−1β変換酵素のアフィニティクロマ
トグラフィー 化合物Aからのクロマトグラフィーマトリックスの調製 12原子のビス−オキシランスペーサーを介してSEP
HAROSE CL−4Bにリシン残基によって結合さ
れた有力なペプチドアルデヒド型インヒビターであるア
セチル−Tyr−Val−Lys−Asp−CHO(化
合物A)から、インターロイキン−1β変換酵素用のア
フィニティカラムを調製した。
トグラフィー 化合物Aからのクロマトグラフィーマトリックスの調製 12原子のビス−オキシランスペーサーを介してSEP
HAROSE CL−4Bにリシン残基によって結合さ
れた有力なペプチドアルデヒド型インヒビターであるア
セチル−Tyr−Val−Lys−Asp−CHO(化
合物A)から、インターロイキン−1β変換酵素用のア
フィニティカラムを調製した。
【0134】
【化5】
【0135】アフィニティマトリックスの合成ステップA :エポキシで活性化されたSEPHAROS
E CL−4B: 文献(Sundberg、L.& Porath、J.
(1974)J.Chromatogr.90、87〜9
8)に記載の方法を用い、エポキシで活性化されたSE
PHAROSE CL−4Bを調製した。詳細には、1
0gmの吸引乾燥SEPHAROSE CL−4Bと1
00mlの1、4−ブタンジオールジグリシジルエーテ
ル(公称70%溶液)と2mg/mlのNaBH4を含
む100mlの0.6MのNaOHとから成るスラリー
をオーバーヘッド攪拌機で室温で16時間攪拌した。得
られたエポキシで活性化されたSEPHAROSE C
L−4Bを目の荒い焼結ガラス漏斗を用いて10リット
ルの水で十分に洗浄し、4℃の水中に保存した。
E CL−4B: 文献(Sundberg、L.& Porath、J.
(1974)J.Chromatogr.90、87〜9
8)に記載の方法を用い、エポキシで活性化されたSE
PHAROSE CL−4Bを調製した。詳細には、1
0gmの吸引乾燥SEPHAROSE CL−4Bと1
00mlの1、4−ブタンジオールジグリシジルエーテ
ル(公称70%溶液)と2mg/mlのNaBH4を含
む100mlの0.6MのNaOHとから成るスラリー
をオーバーヘッド攪拌機で室温で16時間攪拌した。得
られたエポキシで活性化されたSEPHAROSE C
L−4Bを目の荒い焼結ガラス漏斗を用いて10リット
ルの水で十分に洗浄し、4℃の水中に保存した。
【0136】ステップB:ペプチドアルデヒドジメチル
アセタールの結合:
アセタールの結合:
【0137】
【化6】
【0138】活性アルデヒドである化合物Aのブロック
されたアスパルチル−t−ブチルエステル、ジメチルア
セタール(化合物A′)をメタノールに10mM溶液と
して溶解し、新しいメタノールと水とHClでpH1
1.00に調整した400mMの炭酸ナトリウム溶液と
合わせて、2mMのインヒビターと200mMの炭酸塩
バッファとを含む50%メタノール溶液とした。この溶
液(10ml)をエポキシで活性化したSEPHARO
SE CL−4Bの吸引乾燥ケーキ(10gm)と混合
し、得られたスラリーを回転によって37℃で3日間攪
拌した。得られたアフィニティマトリックスを1MのK
Cl及び水で完全に洗浄し、スラリーの状態で4℃で保
存した。〔14−C〕−リシノプリル(Bull、H.
G.、Thornberry、N.A.& Corde
s、E.H.(1985)J.Biol.Chem.26
0、2963〜2972)による結果に基づいて、取込
み量は充填アフィニティカラム1mlあたり1umol
/mlであると評価される。
されたアスパルチル−t−ブチルエステル、ジメチルア
セタール(化合物A′)をメタノールに10mM溶液と
して溶解し、新しいメタノールと水とHClでpH1
1.00に調整した400mMの炭酸ナトリウム溶液と
合わせて、2mMのインヒビターと200mMの炭酸塩
バッファとを含む50%メタノール溶液とした。この溶
液(10ml)をエポキシで活性化したSEPHARO
SE CL−4Bの吸引乾燥ケーキ(10gm)と混合
し、得られたスラリーを回転によって37℃で3日間攪
拌した。得られたアフィニティマトリックスを1MのK
Cl及び水で完全に洗浄し、スラリーの状態で4℃で保
存した。〔14−C〕−リシノプリル(Bull、H.
G.、Thornberry、N.A.& Corde
s、E.H.(1985)J.Biol.Chem.26
0、2963〜2972)による結果に基づいて、取込
み量は充填アフィニティカラム1mlあたり1umol
/mlであると評価される。
【0139】ステップC:アルデヒドの活性化 上記手順でスペーサーアームに結合したアセチル−Ty
r−Val−Lys−Asp−CHOのジメチルアセタ
ールが得られた。アスパルテート残基のt−ブチル保護
基は結合条件で消失する。アフィニティカラムにおいて
このマトリックスをアルデヒドに対して活性化するため
に、使用直前にマトリックスを0.01NのHClで平
衡させ、25℃で2時間静置した。トレーサーとして使
用した〔14−C〕グリシンを含む対照マトリックスは
これらの条件下にリガンドの損失を全く示さなかった
(<1%)。
r−Val−Lys−Asp−CHOのジメチルアセタ
ールが得られた。アスパルテート残基のt−ブチル保護
基は結合条件で消失する。アフィニティカラムにおいて
このマトリックスをアルデヒドに対して活性化するため
に、使用直前にマトリックスを0.01NのHClで平
衡させ、25℃で2時間静置した。トレーサーとして使
用した〔14−C〕グリシンを含む対照マトリックスは
これらの条件下にリガンドの損失を全く示さなかった
(<1%)。
【0140】
【化7】
【0141】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールb−t−ブチルエステルの合成ステップA : N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ヒドロ
キシブタン酸tert−ブチルエステル
ル−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメ
チルアセタールb−t−ブチルエステルの合成ステップA : N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ−4−ヒドロ
キシブタン酸tert−ブチルエステル
【0142】
【化8】
【0143】0℃の50mLのテトラヒドロフラン(T
HF)中のN−アリルオキシカルボニル(S)−アスバ
ラギン酸b−tert−ブチルエステル(2.00g、
7.32mmol)の溶液に、N−メチルモルフォリン
(NMM、885mL、8.05mmol)、イソブチ
ルクロロホーメート(IBCF、997mL、7.68
mmol)を順次添加した。15分後にこの混合物を、
−45℃で、50mLのTHFと12.5mLのメタノ
ール中のホウ水素化ナトリウム(550mg、14.5
5mmol)の懸濁液に添加した。−45℃に30分間
維持した後、混合物を0℃に温め、この温度で30分間
維持した。酢酸を加えて反応を停止させ、1:1酢酸エ
チル:ヘキサンに希釈し、希炭酸水素ナトリウムで3回
洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
濃縮した。残渣をシリカ−ゲルを用いたMPLC(35
×350mmカラム、30%酢酸エチル/ヘキサン)で
精製し、所望の生成物を得た:1H NMR(200M
Hz、CD3OD)d 59(m、1H)、5.28(b
r d、1H、J=17Hz)、5.15(br d、
1H、J=9Hz)、4.52(br d、2H、J=
6Hz)、3.98(m、1H)、3.48(ABX、2
H、J=5、6、11Hz)、2.53(dd、1H、
J=5.16Hz)、2.32(dd、1H、J=9.1
6Hz)、1.43(s、9H)。
HF)中のN−アリルオキシカルボニル(S)−アスバ
ラギン酸b−tert−ブチルエステル(2.00g、
7.32mmol)の溶液に、N−メチルモルフォリン
(NMM、885mL、8.05mmol)、イソブチ
ルクロロホーメート(IBCF、997mL、7.68
mmol)を順次添加した。15分後にこの混合物を、
−45℃で、50mLのTHFと12.5mLのメタノ
ール中のホウ水素化ナトリウム(550mg、14.5
5mmol)の懸濁液に添加した。−45℃に30分間
維持した後、混合物を0℃に温め、この温度で30分間
維持した。酢酸を加えて反応を停止させ、1:1酢酸エ
チル:ヘキサンに希釈し、希炭酸水素ナトリウムで3回
洗浄した。有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、
濃縮した。残渣をシリカ−ゲルを用いたMPLC(35
×350mmカラム、30%酢酸エチル/ヘキサン)で
精製し、所望の生成物を得た:1H NMR(200M
Hz、CD3OD)d 59(m、1H)、5.28(b
r d、1H、J=17Hz)、5.15(br d、
1H、J=9Hz)、4.52(br d、2H、J=
6Hz)、3.98(m、1H)、3.48(ABX、2
H、J=5、6、11Hz)、2.53(dd、1H、
J=5.16Hz)、2.32(dd、1H、J=9.1
6Hz)、1.43(s、9H)。
【0144】ステップB: N−アリルオキシカルボニル−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸b−tert−ブチルエステルジメチルアセタ
ール
ブタン酸b−tert−ブチルエステルジメチルアセタ
ール
【0145】
【化9】
【0146】−45℃で、10mLのジクロロメタン中
のジメチルスルホキシド(757mL、10.67mm
ol)の溶液に、オキサリルクロリド(508mL、
5.82mmol)を添加した。5分後に、10mLの
ジクロロメタン中のN−アリルオキシカルボニル−3−
アミノ−4−ヒドロキシブタン酸tert−ブチルエス
テル(1.25g、4.85mmol)の溶液を添加し
た。15分後に、トリエチルアミン(2.03mL、1
4.55mmol)を添加した。30分後に、混合物を
−23℃に温め、30分間攪拌した。混合物を1:1酢
酸エチル/ヘキサンで希釈し、水及び1Nの硫酸水素ナ
トリウムで洗浄し、水で2回洗浄した。有機物を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油状物
質を200mLのメタノールと20mLのトリメチルオ
ルトホーメートに溶解し、100mgのp−トルエンス
ルホン酸を添加した。16時間後に、飽和炭酸水素ナト
リウムで反応を停止させ、減圧下に濃縮した。混合物を
エーテルで希釈し、希炭酸水素ナトリウム溶液で5回洗
浄した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、濃縮して無色油状の標題化合物を得た:1H NM
R(200MHz、CD3OD)d 5.9(m、1
H)、5.26(br d、1H、J=17Hz)、5.
14(br d、1H、J=10Hz)、4.51(b
r d、2H、J=5.33Hz)、4.25(d、1
H、J=4.79Hz)、4.11(m、1H)、3.4
0(s、3H)、3.39(s、3H)、2.52(d
d、1H、J=4.86、15.27Hz)、2.30
(dd、1H、J=9.00、15.28Hz)、1.4
3(s、9H)。
のジメチルスルホキシド(757mL、10.67mm
ol)の溶液に、オキサリルクロリド(508mL、
5.82mmol)を添加した。5分後に、10mLの
ジクロロメタン中のN−アリルオキシカルボニル−3−
アミノ−4−ヒドロキシブタン酸tert−ブチルエス
テル(1.25g、4.85mmol)の溶液を添加し
た。15分後に、トリエチルアミン(2.03mL、1
4.55mmol)を添加した。30分後に、混合物を
−23℃に温め、30分間攪拌した。混合物を1:1酢
酸エチル/ヘキサンで希釈し、水及び1Nの硫酸水素ナ
トリウムで洗浄し、水で2回洗浄した。有機物を硫酸ナ
トリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油状物
質を200mLのメタノールと20mLのトリメチルオ
ルトホーメートに溶解し、100mgのp−トルエンス
ルホン酸を添加した。16時間後に、飽和炭酸水素ナト
リウムで反応を停止させ、減圧下に濃縮した。混合物を
エーテルで希釈し、希炭酸水素ナトリウム溶液で5回洗
浄した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過
し、濃縮して無色油状の標題化合物を得た:1H NM
R(200MHz、CD3OD)d 5.9(m、1
H)、5.26(br d、1H、J=17Hz)、5.
14(br d、1H、J=10Hz)、4.51(b
r d、2H、J=5.33Hz)、4.25(d、1
H、J=4.79Hz)、4.11(m、1H)、3.4
0(s、3H)、3.39(s、3H)、2.52(d
d、1H、J=4.86、15.27Hz)、2.30
(dd、1H、J=9.00、15.28Hz)、1.4
3(s、9H)。
【0147】ステップC: 3−アミノ−4−オキソブタン酸b−tert−ブチル
エステルジメチルアセタール
エステルジメチルアセタール
【0148】
【化10】
【0149】10mLのTHF中のN−アリルオキシカ
ルボニル−3−アミノ−4−ヒドロキシブタン酸b−t
ert−ブチルエステルジメチルアセタール(312m
g、1.03mmol)の溶液に、モルフォリン(89
7mL、10.3mmol)とテトラキストリフェニル
ホスフィンパラジウム(100mg)とを添加した。3
時間後、混合物を1:1酢酸エチル/ヘキサンで希釈
し、希炭酸水素ナトリウムで5回洗浄した。有機物を硫
酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油
状物をシリカ−ゲルを用いたMPLC(22×300m
mカラム、ジクロロメタン中の1%アンモニア及び10
%メタノールまでのジクロロメタンの直線勾配)によっ
て精製し、淡黄色油状の標題化合物を得た:1H NM
R(200MHz、CD3OD)d 4.15(d、1
H、J=5.67Hz)、3.41(s、3H)、3.4
0(s、3H)、3.19(m、1H)、2.47(d
d、1H、J=4.88、16.06Hz)、2.22
(dd、1H、J=7.86、16.16Hz)、1.4
5(s、9H)。
ルボニル−3−アミノ−4−ヒドロキシブタン酸b−t
ert−ブチルエステルジメチルアセタール(312m
g、1.03mmol)の溶液に、モルフォリン(89
7mL、10.3mmol)とテトラキストリフェニル
ホスフィンパラジウム(100mg)とを添加した。3
時間後、混合物を1:1酢酸エチル/ヘキサンで希釈
し、希炭酸水素ナトリウムで5回洗浄した。有機物を硫
酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、濃縮した。得られた油
状物をシリカ−ゲルを用いたMPLC(22×300m
mカラム、ジクロロメタン中の1%アンモニア及び10
%メタノールまでのジクロロメタンの直線勾配)によっ
て精製し、淡黄色油状の標題化合物を得た:1H NM
R(200MHz、CD3OD)d 4.15(d、1
H、J=5.67Hz)、3.41(s、3H)、3.4
0(s、3H)、3.19(m、1H)、2.47(d
d、1H、J=4.88、16.06Hz)、2.22
(dd、1H、J=7.86、16.16Hz)、1.4
5(s、9H)。
【0150】ステップD: N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−(e−C
BZ−リシニル))−3−アミノ−4−オキソブタン酸
b−tert−ブチルエステルジメチルアセタール
BZ−リシニル))−3−アミノ−4−オキソブタン酸
b−tert−ブチルエステルジメチルアセタール
【0151】
【化11】
【0152】0℃で、5mLのDMF中の3−アミノ−
4−オキソブタン酸b−tert−ブチルエステルジメ
チルアセタール(238mg、1.09mmol)の溶
液に、N−メチルモルフォリン(599mL、5.45
mmol)を添加し、次いで、N−アセチル−チロシニ
ル−バリニル−e−CBZ−リシン(735mg、1.
09mmol)、ヒドロキシベンズトリアゾール(22
1mg、1.64mmol)及びジシクロヘキシルカル
ボジイミド(225mg、1.09mmol)を順次添
加した。室温で16時間維持後に、混合物を濾過し、S
ephadex″LH−20クロマトグラフィー(1M
×50mmカラム、メタノール溶出剤)によって精製し
た。得られた生成物をシリカ−ゲルを用いたMPLC
(22×300mmカラム、ジクロロメタン中の1%ア
ンモニア及び10%メタノールまでのジクロロメタンの
直線勾配で溶出)によって更に精製して無色固体状の標
題化合物を得た:1H NMR(200MHz、CD3O
D)d 7.31(br s、5H)、7.04(br
d、2H、J=8.35Hz)、6.67(br、d、2
H、J=8.45Hz)、5.04(s、2H)、4.6
1(m、1H)、4.44−4.25(m、3H)、4.
17(d、1H、J=7.27Hz)、3.39(s、3
H)、3.1−2.9(m、3H)、2.75(dd、1
H、J=9.28、14.12Hz)、2.53(dd、
1H、J=5.47、15.58Hz)、2.33(d
d、1H、J=7.96、15.53Hz)、2.04
(m、1H)、1.88(s、3H)、1.8−1.2
(m、6H)、1.41(s、9H)、0.94(d、6
H、J=6.74Hz)。
4−オキソブタン酸b−tert−ブチルエステルジメ
チルアセタール(238mg、1.09mmol)の溶
液に、N−メチルモルフォリン(599mL、5.45
mmol)を添加し、次いで、N−アセチル−チロシニ
ル−バリニル−e−CBZ−リシン(735mg、1.
09mmol)、ヒドロキシベンズトリアゾール(22
1mg、1.64mmol)及びジシクロヘキシルカル
ボジイミド(225mg、1.09mmol)を順次添
加した。室温で16時間維持後に、混合物を濾過し、S
ephadex″LH−20クロマトグラフィー(1M
×50mmカラム、メタノール溶出剤)によって精製し
た。得られた生成物をシリカ−ゲルを用いたMPLC
(22×300mmカラム、ジクロロメタン中の1%ア
ンモニア及び10%メタノールまでのジクロロメタンの
直線勾配で溶出)によって更に精製して無色固体状の標
題化合物を得た:1H NMR(200MHz、CD3O
D)d 7.31(br s、5H)、7.04(br
d、2H、J=8.35Hz)、6.67(br、d、2
H、J=8.45Hz)、5.04(s、2H)、4.6
1(m、1H)、4.44−4.25(m、3H)、4.
17(d、1H、J=7.27Hz)、3.39(s、3
H)、3.1−2.9(m、3H)、2.75(dd、1
H、J=9.28、14.12Hz)、2.53(dd、
1H、J=5.47、15.58Hz)、2.33(d
d、1H、J=7.96、15.53Hz)、2.04
(m、1H)、1.88(s、3H)、1.8−1.2
(m、6H)、1.41(s、9H)、0.94(d、6
H、J=6.74Hz)。
【0153】ステップE: N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−リシニ
ル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメチルアセタ
ールb−t−ブチルエステル
ル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸ジメチルアセタ
ールb−t−ブチルエステル
【0154】
【化12】
【0155】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CEZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸b−tert−ブチルエステルジメチルアセタ
ール(15.6mg)の溶液を2mLのメタノールに溶
解し、10mgのPearlman触媒(カーボンに付
けたPd(OH)2)を添加した。水素下に30分維持
後に、混合物を濾過し、濃縮して標題化合物を得た: 1
H NMR(200MHz、CD3OD)d 7.04
(br d、2H、J=8.44Hz)、6.67(br
d、2H、J=8.54Hz)、4.57(dd、1
H、J=5.23、9.04Hz)、4.5−4.0(m、
4H)、3.38(s、3H)、3.34(s、3H)、
3.02(dd、1H、J=5.17、13.81H
z)、2.75(dd、1H、J=9.23、14.06
Hz)、2.66(t、2H、J=7.08Hz)、2.
53(dd、1H、J=5.47、15.58Hz)、
2.34(dd、1H、J=7.91、15.57H
z)、2.03(m、1H)、1.88(s、3H)、
1.9−1.2(m、6H)、1.41(s、9H)、0.
94(d、6H、J=6.69Hz)、0.93(d、3
H、J=6.64Hz)。
ル−e−CEZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸b−tert−ブチルエステルジメチルアセタ
ール(15.6mg)の溶液を2mLのメタノールに溶
解し、10mgのPearlman触媒(カーボンに付
けたPd(OH)2)を添加した。水素下に30分維持
後に、混合物を濾過し、濃縮して標題化合物を得た: 1
H NMR(200MHz、CD3OD)d 7.04
(br d、2H、J=8.44Hz)、6.67(br
d、2H、J=8.54Hz)、4.57(dd、1
H、J=5.23、9.04Hz)、4.5−4.0(m、
4H)、3.38(s、3H)、3.34(s、3H)、
3.02(dd、1H、J=5.17、13.81H
z)、2.75(dd、1H、J=9.23、14.06
Hz)、2.66(t、2H、J=7.08Hz)、2.
53(dd、1H、J=5.47、15.58Hz)、
2.34(dd、1H、J=7.91、15.57H
z)、2.03(m、1H)、1.88(s、3H)、
1.9−1.2(m、6H)、1.41(s、9H)、0.
94(d、6H、J=6.69Hz)、0.93(d、3
H、J=6.64Hz)。
【0156】アフィニティクロマトグラフィー手順 実施例2、3、5〜8及び/または10に記載のごとき
アニオン交換クロマトグラフィーによって、出発酵素調
製物をTHP−1細胞溶解液から約100倍に精製し
た。
アニオン交換クロマトグラフィーによって、出発酵素調
製物をTHP−1細胞溶解液から約100倍に精製し
た。
【0157】ステップA:ICEの結合 等しい寸法の活性化アフィニティカラム(5ml、1c
m×6.5cm)及び基本型(native)SEPH
AROSE CL−4Bのガードカラムを、1mMのジ
チオトレイトールを加えた10カラム容量のクロマトグ
ラフィーバッファ(100mMHEPES、10%ショ
糖、0.1%の3−〔(3−コラミドプロピル)−ジメ
チルアンモニオ〕−1−プロパンスルホネート(CHA
PS)pH7.50)で平衡させた。酵素溶液(15m
l、150,000単位、150mgタンパク質)を、
4℃で0.022ml/分の流速でガードカラムを介し
てアフィニティカラムに流し、次いで同じ流速の追加量
の10mlのクロマトグラフィーバッファで洗浄した。
充填中に、8%の酵素活性が維持されなかった。その理
由は、結合速度定数が小さいためであろうと推測され
る。充填後に、ガードカラムを除去し、25カラム容量
のバッファを用い4℃で流速を0.5ml/分に増加し
てアフィニティカラムを洗浄した。洗浄分画中に酵素活
性は全く検出されなかった。
m×6.5cm)及び基本型(native)SEPH
AROSE CL−4Bのガードカラムを、1mMのジ
チオトレイトールを加えた10カラム容量のクロマトグ
ラフィーバッファ(100mMHEPES、10%ショ
糖、0.1%の3−〔(3−コラミドプロピル)−ジメ
チルアンモニオ〕−1−プロパンスルホネート(CHA
PS)pH7.50)で平衡させた。酵素溶液(15m
l、150,000単位、150mgタンパク質)を、
4℃で0.022ml/分の流速でガードカラムを介し
てアフィニティカラムに流し、次いで同じ流速の追加量
の10mlのクロマトグラフィーバッファで洗浄した。
充填中に、8%の酵素活性が維持されなかった。その理
由は、結合速度定数が小さいためであろうと推測され
る。充填後に、ガードカラムを除去し、25カラム容量
のバッファを用い4℃で流速を0.5ml/分に増加し
てアフィニティカラムを洗浄した。洗浄分画中に酵素活
性は全く検出されなかった。
【0158】ステップB:結合ICEの溶出 酵素を溶出させるために、次に、200mMのアセチル
−Tyr−Val−Lys)CBZ)−Asp−CHO
(化合物B)を含む1カラム容量のバッファでカラムを
洗い、マトリックス結合酵素を解離させるために室温で
24時間維持した。流速0.022ml/分の2カラム
容量のバッファでカラムを洗浄することによって、遊離
酵素−インヒビター複合体をカラムから回収した。新し
いインヒビターで交換を繰り返したとき、新しく回収さ
れた酵素は5%未満であった。これは最初の交換が適切
であったことを示す。
−Tyr−Val−Lys)CBZ)−Asp−CHO
(化合物B)を含む1カラム容量のバッファでカラムを
洗い、マトリックス結合酵素を解離させるために室温で
24時間維持した。流速0.022ml/分の2カラム
容量のバッファでカラムを洗浄することによって、遊離
酵素−インヒビター複合体をカラムから回収した。新し
いインヒビターで交換を繰り返したとき、新しく回収さ
れた酵素は5%未満であった。これは最初の交換が適切
であったことを示す。
【0159】ステップC:ICEの再活性化 2つの相乗的化学的手法によって溶出ICEを再活性化
した。インヒビターをそのオキシムに変換し、チオール
−ジスルフィド互換によって活性部位チオールをグルタ
チオンとの混合ジスルフィドに酸化する。
した。インヒビターをそのオキシムに変換し、チオール
−ジスルフィド互換によって活性部位チオールをグルタ
チオンとの混合ジスルフィドに酸化する。
【0160】再活性化のために、アフィニティカラムか
ら回収した酵素−インヒビター溶液を、100mMの中
性ヒドロキシルアミン及び10mMのグルタチオンジス
ルフィドを含むように調整した。これらの条件下に、余
剰の遊離インヒビターの消費に要する半減期100秒の
多少の遅延の後で、E−I複合体の解離が完全に速度決
定的に生じ、25℃の半減期は約100分である。10
半減期の時間交換を維持した後で、インヒビターオキシ
ム及び余剰の試薬を、AMIBON CENTRICO
N−10限外濾過セル中で4℃のクロマトグラフィーバ
ッファを用いた完全脱塩によって除去した。所望の場
合、酵素−グルタチオン結合体を10mMのジチオトレ
イトール(半減期<1分)で還元して活性酵素を与え
た。精製した酵素は−80℃で無期限に安定である。ア
フィニティクロマトグラフィーによる酵素活性の回収率
は>90%であり、得られた最終純度はSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で測定して約75,000倍
であった。結果を第5表にまとめる。
ら回収した酵素−インヒビター溶液を、100mMの中
性ヒドロキシルアミン及び10mMのグルタチオンジス
ルフィドを含むように調整した。これらの条件下に、余
剰の遊離インヒビターの消費に要する半減期100秒の
多少の遅延の後で、E−I複合体の解離が完全に速度決
定的に生じ、25℃の半減期は約100分である。10
半減期の時間交換を維持した後で、インヒビターオキシ
ム及び余剰の試薬を、AMIBON CENTRICO
N−10限外濾過セル中で4℃のクロマトグラフィーバ
ッファを用いた完全脱塩によって除去した。所望の場
合、酵素−グルタチオン結合体を10mMのジチオトレ
イトール(半減期<1分)で還元して活性酵素を与え
た。精製した酵素は−80℃で無期限に安定である。ア
フィニティクロマトグラフィーによる酵素活性の回収率
は>90%であり、得られた最終純度はSDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動で測定して約75,000倍
であった。結果を第5表にまとめる。
【0161】
【表6】
【0162】純度4700倍でICEの回収率は93%
であった。
であった。
【0163】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸の合成 ステップA
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸の合成 ステップA
【0164】
【化13】
【0165】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−(e−CBZ−リシニル))−3−アミノ−4−オ
キソブタン酸β−tert−ブチルエステルジメチルア
セタール 0℃で、5mLのDMF中の3−アミノ−4−オキソブ
タン酸β−tert−ブチルエステルジメチルアセター
ル(238mg、1.09mmol)の溶液に、N−メ
チルモルフォリン(599mL、5.45mmol)、
N−アセチル−チロシニル−バリニル−e−CBZ−リ
シン(735mg、1.09mmol)、ヒドロキシベ
ンズトリアゾール(221mg、1.64mmol)、
ジシクロヘキシルカルボジイミド(225mg、1.0
9mmol)を順次添加した。室温で16時間維持後
に、混合物を濾過し、SEPHADEX LH−20ク
ロマトグラフィー(1M×50mmカラム、溶出剤メタ
ノール)によって精製した。得られた生成物をシリカ−
ゲルを用いたMPLC(22×300mmカラム、ジク
ロロメタン中の1%アンモニア及び10%メタノールま
でのジクロロメタンの直線勾配で溶出)で更に精製し、
無色固体状の標題化合物を得た:1H NMR(200
MHz、CD3OD) d 7.31(br、s、5
H)、7.04(br d、2H、J=8.35Hz)、
6.67(br d、2H、J=8.45Hz)、5.0
4(s、2H)、4.61(m、1H)、4.44−4.
25(m、3H)、4.17(d、1H、J=7.27H
z)、3.39(s、3H)、3.38(s、3H)、
3.1−2.9(m、3H)、2.75(dd、1H、J
=9.28、14.12Hz)、2.53(dd、1H、
J=5.47、15.58Hz)、2.33(dd、1
H、J=7.96、15.53Hz)、2.04(m、1
H)、1.88(s、3H)、1.8−1.2(m、6
H)、1.41(s、9H)、0.94(d、6H、J=
6.74Hz)。
ル−(e−CBZ−リシニル))−3−アミノ−4−オ
キソブタン酸β−tert−ブチルエステルジメチルア
セタール 0℃で、5mLのDMF中の3−アミノ−4−オキソブ
タン酸β−tert−ブチルエステルジメチルアセター
ル(238mg、1.09mmol)の溶液に、N−メ
チルモルフォリン(599mL、5.45mmol)、
N−アセチル−チロシニル−バリニル−e−CBZ−リ
シン(735mg、1.09mmol)、ヒドロキシベ
ンズトリアゾール(221mg、1.64mmol)、
ジシクロヘキシルカルボジイミド(225mg、1.0
9mmol)を順次添加した。室温で16時間維持後
に、混合物を濾過し、SEPHADEX LH−20ク
ロマトグラフィー(1M×50mmカラム、溶出剤メタ
ノール)によって精製した。得られた生成物をシリカ−
ゲルを用いたMPLC(22×300mmカラム、ジク
ロロメタン中の1%アンモニア及び10%メタノールま
でのジクロロメタンの直線勾配で溶出)で更に精製し、
無色固体状の標題化合物を得た:1H NMR(200
MHz、CD3OD) d 7.31(br、s、5
H)、7.04(br d、2H、J=8.35Hz)、
6.67(br d、2H、J=8.45Hz)、5.0
4(s、2H)、4.61(m、1H)、4.44−4.
25(m、3H)、4.17(d、1H、J=7.27H
z)、3.39(s、3H)、3.38(s、3H)、
3.1−2.9(m、3H)、2.75(dd、1H、J
=9.28、14.12Hz)、2.53(dd、1H、
J=5.47、15.58Hz)、2.33(dd、1
H、J=7.96、15.53Hz)、2.04(m、1
H)、1.88(s、3H)、1.8−1.2(m、6
H)、1.41(s、9H)、0.94(d、6H、J=
6.74Hz)。
【0166】ステップB:
【0167】
【化14】
【0168】N−(N−アセチル−チロシニル−バリニ
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−e−CB
Z−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸β−
tert−ブチルエステルジメチルアセタール(14.
9mg)の溶液を、1mLのトリフルオロ酢酸で処理
し、15分間熟成し、減圧下に濃縮した。残渣を1.0
mLのメタノールに溶解させ、20μlのチオニルクロ
リドを含む1.0mLの水を添加した。1時間後、酢酸
ナトリウムで溶液のpHを約5に調整すると標題化合物
の溶液が得られた:1H NMR(200MHz、CD3
OD) d 7.33(br s、5H)、7.05(b
rd、2H、J=8.35Hz)、6.74(br d、
2H、J=8.35Hz)、4.6−3.9(m、5
H)、3.1−2.3(m、6H)、1.98(m、1
H)、1.92(s、3H)、1.8−1.2(m、6
H)、0.89(d、6H、J=6.60Hz)。
ル−e−CBZ−リシニル)−3−アミノ−4−オキソ
ブタン酸 N−(N−アセチル−チロシニル−バリニル−e−CB
Z−リシニル)−3−アミノ−4−オキソブタン酸β−
tert−ブチルエステルジメチルアセタール(14.
9mg)の溶液を、1mLのトリフルオロ酢酸で処理
し、15分間熟成し、減圧下に濃縮した。残渣を1.0
mLのメタノールに溶解させ、20μlのチオニルクロ
リドを含む1.0mLの水を添加した。1時間後、酢酸
ナトリウムで溶液のpHを約5に調整すると標題化合物
の溶液が得られた:1H NMR(200MHz、CD3
OD) d 7.33(br s、5H)、7.05(b
rd、2H、J=8.35Hz)、6.74(br d、
2H、J=8.35Hz)、4.6−3.9(m、5
H)、3.1−2.3(m、6H)、1.98(m、1
H)、1.92(s、3H)、1.8−1.2(m、6
H)、0.89(d、6H、J=6.60Hz)。
【0169】実施例23 PCRによるICE特異的DNA産生物の生成 20kDa及び10kDaの双方のタンパク質(図17
及び図18)のアミノ末端及び内部領域に由来のアミノ
酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを設計した。
20kDaのタンパク質の場合には、アミノ末端プライ
マーGAYCCNGCNATGCCNAC(配列番号
3)は128通りに縮重し、内部プライマー3’ATR
GGNTADTACCTRTT5’(配列番号4)は4
8通りに縮重した。10kDaのタンパク質の場合は、
アミノ末端プライマーGCNATHAARAARGCN
CA(配列番号5)は192通りに縮重し、内部プライ
マーGTYTACGGNTGNTGNCT(配列番号
6)は128通りに縮重した。
及び図18)のアミノ末端及び内部領域に由来のアミノ
酸配列に基づいて縮重オリゴヌクレオチドを設計した。
20kDaのタンパク質の場合には、アミノ末端プライ
マーGAYCCNGCNATGCCNAC(配列番号
3)は128通りに縮重し、内部プライマー3’ATR
GGNTADTACCTRTT5’(配列番号4)は4
8通りに縮重した。10kDaのタンパク質の場合は、
アミノ末端プライマーGCNATHAARAARGCN
CA(配列番号5)は192通りに縮重し、内部プライ
マーGTYTACGGNTGNTGNCT(配列番号
6)は128通りに縮重した。
【0170】一本鎖THP.1 cDNAをTHP.1細
胞性ポリA+mRNAから合成しPCR鋳型として使用
した。MOPAC手順(Lee他、Science 2
39、1288(1988))の修正法に基づいてPC
Rを実施した。各PCR毎に、反応バッファ中で、10
pmolの各プライマーを0.4μgのポリA+mRN
Aを合成できる量のcDNAに添加した。反応バッファ
は、50mMのKCl、10mMのTris−HCl
(pH8.3)、1.5mMのMgCl2、0.01%w/
vのゼラチン、200uMの各dNTPを最終容量10
μlに含んでいた。
胞性ポリA+mRNAから合成しPCR鋳型として使用
した。MOPAC手順(Lee他、Science 2
39、1288(1988))の修正法に基づいてPC
Rを実施した。各PCR毎に、反応バッファ中で、10
pmolの各プライマーを0.4μgのポリA+mRN
Aを合成できる量のcDNAに添加した。反応バッファ
は、50mMのKCl、10mMのTris−HCl
(pH8.3)、1.5mMのMgCl2、0.01%w/
vのゼラチン、200uMの各dNTPを最終容量10
μlに含んでいた。
【0171】PCRプログラムでは、100℃で10分
間の変性と2単位のTaqポリメラーゼの添加とから成
る1サイクルの処理後に、95℃で30秒間、48℃で
30秒間、70℃で1分間から成るサイクルを30回繰
返す。20kDaのタンパク質の場合には、116bp
のPCR産生物が合成され、内部イノシン置換オリゴヌ
クレオチド〔ATIGGRTAIATYTCIGCR〕
(配列番号7)とのハイブリダイゼーションによって同
定した。10kDaのタンパク質の場合には、221b
pのPCR産生物が合成され、同様のタイプのプローブ
〔ATIGARAARGAYTTYATIGC〕(配列
番号8)によって同定した。双方のPCR産生物をBl
uescriptベクター(Stratagene)に
クローニングし、チェーンターミネーション法(San
ger他、PNAS 74、5463(1977)によ
って配列決定した。
間の変性と2単位のTaqポリメラーゼの添加とから成
る1サイクルの処理後に、95℃で30秒間、48℃で
30秒間、70℃で1分間から成るサイクルを30回繰
返す。20kDaのタンパク質の場合には、116bp
のPCR産生物が合成され、内部イノシン置換オリゴヌ
クレオチド〔ATIGGRTAIATYTCIGCR〕
(配列番号7)とのハイブリダイゼーションによって同
定した。10kDaのタンパク質の場合には、221b
pのPCR産生物が合成され、同様のタイプのプローブ
〔ATIGARAARGAYTTYATIGC〕(配列
番号8)によって同定した。双方のPCR産生物をBl
uescriptベクター(Stratagene)に
クローニングし、チェーンターミネーション法(San
ger他、PNAS 74、5463(1977)によ
って配列決定した。
【0172】20kDa及び10kDaのサブユニット
の推定アミノ酸配列を第6表のパネルA及びパネルBに
夫々示す。
の推定アミノ酸配列を第6表のパネルA及びパネルBに
夫々示す。
【0173】
【表7】
【0174】実施例24 λ cDNAライブラリイに由来のICE cDNAク
ローンの単離 PCR由来の10kDa及び20kDaのICEサブユ
ニットの産生物を、λgt10 cDNAライブラリイ
をTHP.1細胞(Clontech)からスクリーニ
ングするためのハイブリダイゼーションプローブとして
使用した。標準法(T.Maniatis、E.F.Fi
rtsch、J.Sambrook、Molecula
r Cloning:A Laboratory Ma
nual(Cold Spring Harbor L
aboratory、ColdSpring Harb
or、New York、1982)によってライブラ
リイのプレーティング及びプラークリフトを実施した。
プローブをランダムプライマー化し、32P−dCTPで
高比活性に標識し、各プローブで別々にライブラリイの
スクリーニングを実施した(スクリーンあたり600,
000プラーク)。プローブをハイブリダイゼーション
バッファ(50%ホルムアミド、5×Denhardt
s、6×SSC(1×SSC=0.15M)、0.5%S
DS、100μg/mlのサケ精子DNA)に1×10
6cpm/mlで添加した。10kDaの特異的プロー
ブを用いたときには陽性にハイブリダイズした11のフ
ァージを検出し、20kDaのプローブを用いたときに
は陽性にハイブリダイズした7つのファージを観察し
た。
ローンの単離 PCR由来の10kDa及び20kDaのICEサブユ
ニットの産生物を、λgt10 cDNAライブラリイ
をTHP.1細胞(Clontech)からスクリーニ
ングするためのハイブリダイゼーションプローブとして
使用した。標準法(T.Maniatis、E.F.Fi
rtsch、J.Sambrook、Molecula
r Cloning:A Laboratory Ma
nual(Cold Spring Harbor L
aboratory、ColdSpring Harb
or、New York、1982)によってライブラ
リイのプレーティング及びプラークリフトを実施した。
プローブをランダムプライマー化し、32P−dCTPで
高比活性に標識し、各プローブで別々にライブラリイの
スクリーニングを実施した(スクリーンあたり600,
000プラーク)。プローブをハイブリダイゼーション
バッファ(50%ホルムアミド、5×Denhardt
s、6×SSC(1×SSC=0.15M)、0.5%S
DS、100μg/mlのサケ精子DNA)に1×10
6cpm/mlで添加した。10kDaの特異的プロー
ブを用いたときには陽性にハイブリダイズした11のフ
ァージを検出し、20kDaのプローブを用いたときに
は陽性にハイブリダイズした7つのファージを観察し
た。
【0175】実施例25 ICE cDNAクローンのサブクローニング及び配列
決定 長さ1.0kb〜1.6kbのサイズを有し404個のア
ミノ酸から成る1つの読取枠を含むいくつかのcDNA
クローンをpGEMベクター(Promega)にサブ
クローニングし、Sangerの方法で全体を両方向に
配列決定した。第7表は、ICEをコードする全長cD
NA配列(A)を、24kDa(B)、20kDa
(C)及び10kDa(D)コード領域と共に示す。第
8表は、全長クローンをクローンOCP9と命名した。
クローンcDNAに由来の全長ICEの推定されたアミ
ノ酸配列(A)を、24kDa(B)、20kDa
(C)及び10kDa(D)のサブユニットの推定アミ
ノ酸配列と共に示す。
決定 長さ1.0kb〜1.6kbのサイズを有し404個のア
ミノ酸から成る1つの読取枠を含むいくつかのcDNA
クローンをpGEMベクター(Promega)にサブ
クローニングし、Sangerの方法で全体を両方向に
配列決定した。第7表は、ICEをコードする全長cD
NA配列(A)を、24kDa(B)、20kDa
(C)及び10kDa(D)コード領域と共に示す。第
8表は、全長クローンをクローンOCP9と命名した。
クローンcDNAに由来の全長ICEの推定されたアミ
ノ酸配列(A)を、24kDa(B)、20kDa
(C)及び10kDa(D)のサブユニットの推定アミ
ノ酸配列と共に示す。
【0176】推定アミノ酸配列を検討し精製された天然
型ICE 20kDa及び10kDaサブユニットに由
来のアミノ酸配列(図19及び図20)と比較すると、
発生した全長ICEタンパク質の120位に検出される
1つのアミノ酸以外はアミノ酸配列の相同が判明した。
cDNA配列によれば、全長タンパク質の120位にA
snがコードされている。このアミノ酸位置は20kD
aサブユニットのNH2末端に対応する。精製された天
然型20kDaサブユニットに由来のアミノ酸配列で
は、NH2末端アミノ酸がAspであることが決定され
た。推定されたアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列との
間で観察された唯一のこの違いが生じた理由は、20k
DaサブユニットのNH2末端Asnの脱アミド化によ
ってAspが形成されるためであろう。AsnがNH2
末端に存在するときにこの種の脱アミド化が生じること
はよく知られている。20kDaサブユニットのNH2
末端にAsnまたはAspのいずれが検出されるか、あ
るいはICEポリペプチド内部の全長タンパク質または
ポリペプチドフラグメントの120位にAsnまたはA
spのいずれが検出されるかは、ICE活性に全くでは
ないにしても有意な影響は与えないと予測される。
型ICE 20kDa及び10kDaサブユニットに由
来のアミノ酸配列(図19及び図20)と比較すると、
発生した全長ICEタンパク質の120位に検出される
1つのアミノ酸以外はアミノ酸配列の相同が判明した。
cDNA配列によれば、全長タンパク質の120位にA
snがコードされている。このアミノ酸位置は20kD
aサブユニットのNH2末端に対応する。精製された天
然型20kDaサブユニットに由来のアミノ酸配列で
は、NH2末端アミノ酸がAspであることが決定され
た。推定されたアミノ酸配列と既知のアミノ酸配列との
間で観察された唯一のこの違いが生じた理由は、20k
DaサブユニットのNH2末端Asnの脱アミド化によ
ってAspが形成されるためであろう。AsnがNH2
末端に存在するときにこの種の脱アミド化が生じること
はよく知られている。20kDaサブユニットのNH2
末端にAsnまたはAspのいずれが検出されるか、あ
るいはICEポリペプチド内部の全長タンパク質または
ポリペプチドフラグメントの120位にAsnまたはA
spのいずれが検出されるかは、ICE活性に全くでは
ないにしても有意な影響は与えないと予測される。
【0177】第7表
【0178】
【表8】
【0179】
【表9】
【0180】
【表10】
【0181】
【表11】
【0182】第8表
【0183】
【表12】
【0184】
【表13】
【0185】
【表14】
【0186】実施例26 大腸菌発現ベクター中のICE cDNAのクローニン
グ 例えばpEGシリーズ(Novagen)のような大腸
菌発現ベクターにICE発現カセットを転移させた後、
組換えICEを大腸菌中で産生させた。pETベクター
はICE発現を厳密に調節されたバクテリオファージT
7プロモーターのコントロール下に維持する。この構築
物を、誘発性lacプロモーターによって推進されるT
7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大
腸菌宿主に転移させた後、適当なlac基質(IPT
G)を培養物に添加すると、ICEの発現が誘発され
る。発現されたICEのレベルを上記アッセイによって
測定した。
グ 例えばpEGシリーズ(Novagen)のような大腸
菌発現ベクターにICE発現カセットを転移させた後、
組換えICEを大腸菌中で産生させた。pETベクター
はICE発現を厳密に調節されたバクテリオファージT
7プロモーターのコントロール下に維持する。この構築
物を、誘発性lacプロモーターによって推進されるT
7 RNAポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含む大
腸菌宿主に転移させた後、適当なlac基質(IPT
G)を培養物に添加すると、ICEの発現が誘発され
る。発現されたICEのレベルを上記アッセイによって
測定した。
【0187】p45の完全読取枠をコードするcDNA
をpET 11aのNdeI部位に挿入した。正の配向
の構築物を配列解析によって同定し、発現宿主菌株BL
21の形質転換に使用した。次いで形質転換体をICE
タンパク質産生用培養物に接種した。当業界でよく知ら
れた配合組成のM9またはZB培地中で培養物を増殖さ
せ得る。OD600=1.5まで増殖させた後、1mMのI
PTGによってICEの発現を37℃で3時間誘発し
た。これらの細胞に由来の不溶封入体分画中で真正IC
E酵素活性が検出された。50mMのTris−HCl
(pH8)と10mMのジチオトレイトールを含むバッ
ファ中で5Mのグアニジン−HClによって封入体分画
から可溶性ICEを抽出した。100倍容量の25mM
のHEPES(pH7.5)、5mMのジチオトレイト
ール、10%ショ糖に対して透析することによってこの
抽出物から活性ICEを回収した。
をpET 11aのNdeI部位に挿入した。正の配向
の構築物を配列解析によって同定し、発現宿主菌株BL
21の形質転換に使用した。次いで形質転換体をICE
タンパク質産生用培養物に接種した。当業界でよく知ら
れた配合組成のM9またはZB培地中で培養物を増殖さ
せ得る。OD600=1.5まで増殖させた後、1mMのI
PTGによってICEの発現を37℃で3時間誘発し
た。これらの細胞に由来の不溶封入体分画中で真正IC
E酵素活性が検出された。50mMのTris−HCl
(pH8)と10mMのジチオトレイトールを含むバッ
ファ中で5Mのグアニジン−HClによって封入体分画
から可溶性ICEを抽出した。100倍容量の25mM
のHEPES(pH7.5)、5mMのジチオトレイト
ール、10%ショ糖に対して透析することによってこの
抽出物から活性ICEを回収した。
【0188】実施例27 アフリカツメガエル卵母細胞マイクロインジェクション
ベクターによるICEmRNAのin vitro翻訳
及び哺乳類細胞中での発現 合成mRNA産生用のin vitro転写ベクター
(pGEMシリーズ、Promega)にICE cD
NAを結合した。
ベクターによるICEmRNAのin vitro翻訳
及び哺乳類細胞中での発現 合成mRNA産生用のin vitro転写ベクター
(pGEMシリーズ、Promega)にICE cD
NAを結合した。
【0189】バクテリオファージプロモーターを含むプ
ラスミドベクターにICE mRNAをコードする二重
鎖DNAをクローニングし、クローンICE−コードD
NAを含むベクターを直鎖化し、プラスミドベクターの
バクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバ
クテリオファージに由来のDNA依存性RNAポリメラ
ーゼを使用してクローンDNAをin vitro転写
することによって、十分な量の合成mRNAをin v
itroで産生する。
ラスミドベクターにICE mRNAをコードする二重
鎖DNAをクローニングし、クローンICE−コードD
NAを含むベクターを直鎖化し、プラスミドベクターの
バクテリオファージプロモーターを特異的に認識するバ
クテリオファージに由来のDNA依存性RNAポリメラ
ーゼを使用してクローンDNAをin vitro転写
することによって、十分な量の合成mRNAをin v
itroで産生する。
【0190】バクテリオファージDNA依存性RNAポ
リメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロ
モーターを含む種々のプラスミドベクターが入手可能で
ある。これらの非限定例として、プラスミドpSP6
4、pSP65、pSP70、pSP71、pSP7
2、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、p
GEM−3Zf、pGEM−5Zf、pGEM−9Zf
及びpGEM−11Zfがある。プラスミドの全シリー
ズがPromegaから市販されている。
リメラーゼによって認識されるバクテリオファージプロ
モーターを含む種々のプラスミドベクターが入手可能で
ある。これらの非限定例として、プラスミドpSP6
4、pSP65、pSP70、pSP71、pSP7
2、pSP73、pGEM−3Z、pGEM−4Z、p
GEM−3Zf、pGEM−5Zf、pGEM−9Zf
及びpGEM−11Zfがある。プラスミドの全シリー
ズがPromegaから市販されている。
【0191】ICE DNAクローニングに有利な適当
なベクター上の1つまたは複数の有効な制限エンドヌク
レアーゼクローニング部位を利用し、バクテリオファー
ジプロモーターを含むベクターに二重鎖ICE−コード
DNAを適正配向でクローニングする。ICE DNA
が結合したベクターで細菌を形質転換させ、クローナル
単離物中で、適正配向のICE DNAを含むベクター
の存在を分析する。
なベクター上の1つまたは複数の有効な制限エンドヌク
レアーゼクローニング部位を利用し、バクテリオファー
ジプロモーターを含むベクターに二重鎖ICE−コード
DNAを適正配向でクローニングする。ICE DNA
が結合したベクターで細菌を形質転換させ、クローナル
単離物中で、適正配向のICE DNAを含むベクター
の存在を分析する。
【0192】適正配向のICEコードDNAを含むベク
ターを同定し単離した後で、ICE転写ユニットを破壊
しないように該ユニットよりも下流の部位を制限エンド
ヌクレアーゼで開裂することによってこのベクターを直
鎖化する。直鎖化したプラスミドを単離して精製し、I
CE mRNAのin vitro転写用鋳型として使
用する。
ターを同定し単離した後で、ICE転写ユニットを破壊
しないように該ユニットよりも下流の部位を制限エンド
ヌクレアーゼで開裂することによってこのベクターを直
鎖化する。直鎖化したプラスミドを単離して精製し、I
CE mRNAのin vitro転写用鋳型として使
用する。
【0193】次に、ICE mRNAを形成するDNA
鋳型の転写を許容する反応混合物中で、鋳型DNAをバ
クテリオファージ特異的DNA依存性ポリメラーゼと混
合する。数種のバクテリオファージ特異的DNA依存性
RNAポリメラーゼが入手可能である。その非限定例と
して、T3、T7及びSP6 RNAポリメラーゼがあ
る。次に合成ICE mRNAを単離して精製する。
鋳型の転写を許容する反応混合物中で、鋳型DNAをバ
クテリオファージ特異的DNA依存性ポリメラーゼと混
合する。数種のバクテリオファージ特異的DNA依存性
RNAポリメラーゼが入手可能である。その非限定例と
して、T3、T7及びSP6 RNAポリメラーゼがあ
る。次に合成ICE mRNAを単離して精製する。
【0194】mRNAの安定性を改善するために、5′
末端キャップ構造と3′ポリAテイルとを含むmRNA
を合成するのが有利であろう。キャップ構造または7−
メチルグアノシンは、DNA鋳型との反応混合物に7−
メチルグアノシンを添加するだけでmRNAの5′末端
に組込まれる。DNA依存性RNAポリメラーゼは、m
RNAを合成するときに5′末端にキャップ構造を取込
む。ポリAテイルは多くのcDNAでは天然に発生する
ことが知見されたが、DNA鋳型の3′末端にポリAテ
イルコードDNAを挿入するだけでmRNAの3′末端
に付加し得る。
末端キャップ構造と3′ポリAテイルとを含むmRNA
を合成するのが有利であろう。キャップ構造または7−
メチルグアノシンは、DNA鋳型との反応混合物に7−
メチルグアノシンを添加するだけでmRNAの5′末端
に組込まれる。DNA依存性RNAポリメラーゼは、m
RNAを合成するときに5′末端にキャップ構造を取込
む。ポリAテイルは多くのcDNAでは天然に発生する
ことが知見されたが、DNA鋳型の3′末端にポリAテ
イルコードDNAを挿入するだけでmRNAの3′末端
に付加し得る。
【0195】単離及び精製されたICE mRNAを無
細胞系または細胞ベース系を用いて翻訳し得る。無細胞
系の非限定例としては、ウサギ網状赤血球溶解液及び小
麦酵母抽出物(双方ともPromega & New
England Nuclearによって市販されてい
る)があり、細胞ベース系の非限定例としては、アフリ
カツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
ある。アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジ
ェクションのほうが好ましい。
細胞系または細胞ベース系を用いて翻訳し得る。無細胞
系の非限定例としては、ウサギ網状赤血球溶解液及び小
麦酵母抽出物(双方ともPromega & New
England Nuclearによって市販されてい
る)があり、細胞ベース系の非限定例としては、アフリ
カツメガエル卵母細胞へのマイクロインジェクションが
ある。アフリカツメガエル卵母細胞へのマイクロインジ
ェクションのほうが好ましい。
【0196】ICEタンパク質を産生する十分な量の合
成ICE mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微
量注射し得る。微量注射された卵母細胞をインキュベー
トしてICE mRNAを翻訳させ、ICEタンパク質
を形成させる。
成ICE mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞に微
量注射し得る。微量注射された卵母細胞をインキュベー
トしてICE mRNAを翻訳させ、ICEタンパク質
を形成させる。
【0197】これらの合成mRNAを、標準手順〔Gu
rdon、J.B.& Wickens、M.D.、Me
thods in Enzymol.101:370〜
386(1983)〕によってアフリカツメガエル卵母
細胞に注射する。後述するごとく卵母細胞を採取しIC
E発現を分析する。
rdon、J.B.& Wickens、M.D.、Me
thods in Enzymol.101:370〜
386(1983)〕によってアフリカツメガエル卵母
細胞に注射する。後述するごとく卵母細胞を採取しIC
E発現を分析する。
【0198】実施例28 哺乳類発現ベクター中のICE cDNAのクローニン
グ 強力な汎用哺乳類プロモーターを含む以下のベクター:
pBC12BI〔Cullen、B.R.、Method
s in Enzymol.152:684〜704
1988〕及びpEE12(CellTech EP0
338,841)並びにその誘導体pAZ9016−
1及びp9019に、ICE cDNA発現カセットを
適当な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合する。p90
19は、SV40早期プロモーターによって推進される
デヒドロ葉酸レダクターゼ(mDHFR)(Simon
sen、C.C. & Levinson、A.D.、Pr
oc.Natl.Acad.Sci USA 80:24
95〜2499(1983))の突然変異遺伝子から成
る選択可能マーカー/増幅系によるhCMVIEpr
m、ポリリンカー及びSV40 ポリAエレメントを含
む哺乳類発現ベクターの構築を代表する。鋳型としてp
D5(Berker & Sharp、Nucl.Ac
id Res.13:841〜857(1985))を
使用し、プライマー13978−120及び13977
8−121によって規定されたPCR反応によってSV
40ポリアデニル化配列を生成した。得られた0.25
Kb PCR産生物をClaI及びSpeIによって消
化し、同様に消化しておいたpEE12の6.7Kbフ
ラグメントに結合した。得られたプラスミドをp901
8と命名した。p9018をBglII及びSfiIで消
化するとSV40早期プロモーターの3′部分とベクタ
ーに由来のGScDNAとが遊離した。プラスミドpF
E400(Simonsen、C.C. & Levin
son、A.D、Proc.Natl.Acad.Sci
USA 80:2495〜2499(1983))から
単離した73KbのSfiI−XhoIIフラグメントを
前記の5.6Kbベクターに結合し、SV40早期プロ
モーターを再構築してmdHFR遺伝子を挿入した。こ
のプラスミドをp9019と命名する。pSZ9016
−1は、HIV LTRがhuCMVIEプロモーター
に置換している以外はp9019に等しい。このベクタ
ーは、p9019をXbaI及びMluIで消化してh
uCMVIEプロモーターを除去することによって構築
した。HIV−1 LTRの部分(Cullen、Ce
ll 46:973(1986))を含むベクターpC
D23中で検出されるような残基−117〜+80のH
IV LTRプロモーターを、プラスミドpCD23か
らPCR増幅した。このために、産生物の5′側末端に
MulI及びSpeI制限部位を付加するオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いた。3′側にはHindIII及
びXbaI部位が付加されていた。得られた0.2kb
のPCR産生物を酵素MluI及びXbaIで消化後
に、フラグメントをアガロースゲルで精製し、4.3k
bのプロモーターのないDNAフラグメントに結合し
て、ベクターpSZ9016−1を形成した。
グ 強力な汎用哺乳類プロモーターを含む以下のベクター:
pBC12BI〔Cullen、B.R.、Method
s in Enzymol.152:684〜704
1988〕及びpEE12(CellTech EP0
338,841)並びにその誘導体pAZ9016−
1及びp9019に、ICE cDNA発現カセットを
適当な制限エンドヌクレアーゼ部位で結合する。p90
19は、SV40早期プロモーターによって推進される
デヒドロ葉酸レダクターゼ(mDHFR)(Simon
sen、C.C. & Levinson、A.D.、Pr
oc.Natl.Acad.Sci USA 80:24
95〜2499(1983))の突然変異遺伝子から成
る選択可能マーカー/増幅系によるhCMVIEpr
m、ポリリンカー及びSV40 ポリAエレメントを含
む哺乳類発現ベクターの構築を代表する。鋳型としてp
D5(Berker & Sharp、Nucl.Ac
id Res.13:841〜857(1985))を
使用し、プライマー13978−120及び13977
8−121によって規定されたPCR反応によってSV
40ポリアデニル化配列を生成した。得られた0.25
Kb PCR産生物をClaI及びSpeIによって消
化し、同様に消化しておいたpEE12の6.7Kbフ
ラグメントに結合した。得られたプラスミドをp901
8と命名した。p9018をBglII及びSfiIで消
化するとSV40早期プロモーターの3′部分とベクタ
ーに由来のGScDNAとが遊離した。プラスミドpF
E400(Simonsen、C.C. & Levin
son、A.D、Proc.Natl.Acad.Sci
USA 80:2495〜2499(1983))から
単離した73KbのSfiI−XhoIIフラグメントを
前記の5.6Kbベクターに結合し、SV40早期プロ
モーターを再構築してmdHFR遺伝子を挿入した。こ
のプラスミドをp9019と命名する。pSZ9016
−1は、HIV LTRがhuCMVIEプロモーター
に置換している以外はp9019に等しい。このベクタ
ーは、p9019をXbaI及びMluIで消化してh
uCMVIEプロモーターを除去することによって構築
した。HIV−1 LTRの部分(Cullen、Ce
ll 46:973(1986))を含むベクターpC
D23中で検出されるような残基−117〜+80のH
IV LTRプロモーターを、プラスミドpCD23か
らPCR増幅した。このために、産生物の5′側末端に
MulI及びSpeI制限部位を付加するオリゴヌクレ
オチドプライマーを用いた。3′側にはHindIII及
びXbaI部位が付加されていた。得られた0.2kb
のPCR産生物を酵素MluI及びXbaIで消化後
に、フラグメントをアガロースゲルで精製し、4.3k
bのプロモーターのないDNAフラグメントに結合し
て、ベクターpSZ9016−1を形成した。
【0199】プロモーターに対して正の配向でICE
cDNAを含むカセットを、プロモーターの3′の適当
な制限部位に結合し、制限部位マッピング及び/または
配列決定によって同定する。これらのcDNA発現ベク
ターを、種々の線維芽宿主細胞、例えば〔COS−7
(ATCC# CRL1651)、CV−1 tat
〔Sackevitz他、Science 238:1
575(1987)〕、293、L(ATCC#CRL
6362)〕に、標準法によって挿入する。標準法の非
限定例としては、エレクトロポレーション、または化学
的手順(カチオン性リポソーム、DEAEデキストラ
ン、リン酸カルシウム)がある。トランスフェクトした
細胞及び細胞培養上清を採取し、後述のごとくICE発
現を分析し得る。
cDNAを含むカセットを、プロモーターの3′の適当
な制限部位に結合し、制限部位マッピング及び/または
配列決定によって同定する。これらのcDNA発現ベク
ターを、種々の線維芽宿主細胞、例えば〔COS−7
(ATCC# CRL1651)、CV−1 tat
〔Sackevitz他、Science 238:1
575(1987)〕、293、L(ATCC#CRL
6362)〕に、標準法によって挿入する。標準法の非
限定例としては、エレクトロポレーション、または化学
的手順(カチオン性リポソーム、DEAEデキストラ
ン、リン酸カルシウム)がある。トランスフェクトした
細胞及び細胞培養上清を採取し、後述のごとくICE発
現を分析し得る。
【0200】哺乳類過渡発現(transient e
xpression)に使用した全部のベクターを、I
CEを発現する安定な細胞系の樹立に使用し得る。発現
ベクター中でクローニングされた不変化のICE cD
NA構築物は、細胞内ICEタンパク質を産生させるプ
ログラムを宿主細胞に組込むと予想される。更に、ヒト
成長ホルモンまたはヒトリゾチームのような分泌タンパ
ク質のシグナル配列をコードするDNAにICE cD
NA構築物を結合することによって、ICEが分泌タン
パク質として細胞外で発現され得る。トランスフェクシ
ョン宿主細胞の非限定例は、CV−1−P〔Sacke
vitz他、Science 238:1575(19
87)〕、tk−L〔Wigler他、Cell 1
1:223(1977)〕、NS/O及びdHFr−C
HO〔Kaufman & Sharp、J.Mol.B
iol.159:601(1932)〕である。
xpression)に使用した全部のベクターを、I
CEを発現する安定な細胞系の樹立に使用し得る。発現
ベクター中でクローニングされた不変化のICE cD
NA構築物は、細胞内ICEタンパク質を産生させるプ
ログラムを宿主細胞に組込むと予想される。更に、ヒト
成長ホルモンまたはヒトリゾチームのような分泌タンパ
ク質のシグナル配列をコードするDNAにICE cD
NA構築物を結合することによって、ICEが分泌タン
パク質として細胞外で発現され得る。トランスフェクシ
ョン宿主細胞の非限定例は、CV−1−P〔Sacke
vitz他、Science 238:1575(19
87)〕、tk−L〔Wigler他、Cell 1
1:223(1977)〕、NS/O及びdHFr−C
HO〔Kaufman & Sharp、J.Mol.B
iol.159:601(1932)〕である。
【0201】ICE cDNAを含むベクターのいずれ
かと薬剤選択プラスミド(非限定例は、G418、アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX
〔Miller、A.D.& Rosman G.J. B
iotech News 7:980〜990(198
9)〕;ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Bホスホト
ランスフェラーゼ、pLG90〔Gritz、L. &
Davies、J.、GENE 25:179(19
83)〕;APRT、キサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、pMAM(Clontec
h)〔Murray他、Gene 31:233(19
84)〕、とのコトランスフェクションによって、安定
にトランスフェクトされたクローンの選択を可能にす
る。ICEレベルを前述のアッセイで定量する。
かと薬剤選択プラスミド(非限定例は、G418、アミ
ノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、pLNCX
〔Miller、A.D.& Rosman G.J. B
iotech News 7:980〜990(198
9)〕;ヒグロマイシン、ヒグロマイシン−Bホスホト
ランスフェラーゼ、pLG90〔Gritz、L. &
Davies、J.、GENE 25:179(19
83)〕;APRT、キサンチン−グアニンホスホリボ
シルトランスフェラーゼ、pMAM(Clontec
h)〔Murray他、Gene 31:233(19
84)〕、とのコトランスフェクションによって、安定
にトランスフェクトされたクローンの選択を可能にす
る。ICEレベルを前述のアッセイで定量する。
【0202】可能最大レベルのICEを合成する哺乳類
細胞クローンを産生させるために、ICE cDNA構
築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクターに
結合する。これらの構築物を細胞に導入した後で、適当
な薬品によってプラスミド含有クローンを選択し、薬剤
用量を増加させながら選択することによってプラスミド
コピー数の多い超発現クローン(overexpres
sion clone)を単離する。以下の系を使用す
る:dHFR−CHO細胞にトランスフェクトされメト
トレキセート中で選択された突然変異DHFR遺伝子を
含むプラスミド9016または9019〔Simons
on、C. & Levinson、A.、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 80:2495(1
983)〕;NS/O細胞にトランスフェクトされメチ
オニンスルホキシイミン中で選択されたグルタミンシン
セターゼ遺伝子を含むプラスミドpEE12(Cell
Tech国際特許出願2089/10404);及びA
PRT及びTK欠失L細胞中にチミジンキナーゼ遺伝子
〔Colbere & Garopin、F.Proc.
Natl.Acad.Sci.76:3755(197
9)〕を含むpDLAT−3とコトランスフェクトさ
れ、APRT(0.05mMのアザセリン、0.1mMの
アデニン、4μg/mlのアデノシン)中で選択されH
AT(100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミ
ノプテリン、16μMのチミジン)で増幅された901
6またはその他のCMV prmベクター。
細胞クローンを産生させるために、ICE cDNA構
築物を、増幅可能な薬剤耐性マーカーを含むベクターに
結合する。これらの構築物を細胞に導入した後で、適当
な薬品によってプラスミド含有クローンを選択し、薬剤
用量を増加させながら選択することによってプラスミド
コピー数の多い超発現クローン(overexpres
sion clone)を単離する。以下の系を使用す
る:dHFR−CHO細胞にトランスフェクトされメト
トレキセート中で選択された突然変異DHFR遺伝子を
含むプラスミド9016または9019〔Simons
on、C. & Levinson、A.、Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 80:2495(1
983)〕;NS/O細胞にトランスフェクトされメチ
オニンスルホキシイミン中で選択されたグルタミンシン
セターゼ遺伝子を含むプラスミドpEE12(Cell
Tech国際特許出願2089/10404);及びA
PRT及びTK欠失L細胞中にチミジンキナーゼ遺伝子
〔Colbere & Garopin、F.Proc.
Natl.Acad.Sci.76:3755(197
9)〕を含むpDLAT−3とコトランスフェクトさ
れ、APRT(0.05mMのアザセリン、0.1mMの
アデニン、4μg/mlのアデノシン)中で選択されH
AT(100μMのヒポキサンチン、0.4μMのアミ
ノプテリン、16μMのチミジン)で増幅された901
6またはその他のCMV prmベクター。
【0203】45kDaのICEプレタンパク質(図2
3)の完全ORFを含む全長ICEcDNAを哺乳類宿
主細胞にトランスフェクトすることによって組換えIC
Eを発現させた。全長ICE cDNAを含む1.6k
bのEcoRIフラグメントをベクターpSZ−901
6にクローニングした。6μgのこのDNAを、HIV
のトランス活性化タンパク質(TAT)をSV40早期
プロモーターのコントロール下に維持する哺乳類発現ベ
クターである0.6μgのpX8TATと共に、カチオ
ン性リポソーム法でCOS−7細胞にトランスフェクト
した。48時間後に細胞を採取し、界面活性バッファ
(25mMのHEPES pH7、1%のTriton
−X−100、2mMのEDTA、2mMのDTT、1
0μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイレ
プチン、10μg/mlのペプスタチン及び2mMのP
MSF)に溶解させた。ICE活性を測定するために、
細胞溶解液を、放射性標識したIL−1β前駆体と共に
インキュベートした。IL−1βの開裂産物をIL−1
β抗体による免疫沈降及びSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の分画化によって分析した。IL−1β前駆体は、
ICE cDNAがトランスフェクトされた細胞によっ
て成熟17kDa形態に開裂されたが、発現プラスミド
だけがトランスフェクトされた細胞によって開裂されな
かった。開裂産物は、アフィニティ精製ICEと共に基
質をインキュベートすることによって産生した成熟IL
−1βと同時泳動し、特異的ICEインヒビター(L−
709,049)によって完全に阻害された。発現した
ICE活性の基質特異性は、溶解液を、ICEによって
開裂できないIL−1β前駆体開裂部位突然変異体(A
la116)と共にインキュベートすることによって検証
された。天然型ICEと同様に、トランスフェクタント
に由来の活性は、突然変異タンパク質を28kDaの産
生物に開裂するが17kDa形態には開裂しない(図2
5)。
3)の完全ORFを含む全長ICEcDNAを哺乳類宿
主細胞にトランスフェクトすることによって組換えIC
Eを発現させた。全長ICE cDNAを含む1.6k
bのEcoRIフラグメントをベクターpSZ−901
6にクローニングした。6μgのこのDNAを、HIV
のトランス活性化タンパク質(TAT)をSV40早期
プロモーターのコントロール下に維持する哺乳類発現ベ
クターである0.6μgのpX8TATと共に、カチオ
ン性リポソーム法でCOS−7細胞にトランスフェクト
した。48時間後に細胞を採取し、界面活性バッファ
(25mMのHEPES pH7、1%のTriton
−X−100、2mMのEDTA、2mMのDTT、1
0μg/mlのアプロチニン、10μg/mlのロイレ
プチン、10μg/mlのペプスタチン及び2mMのP
MSF)に溶解させた。ICE活性を測定するために、
細胞溶解液を、放射性標識したIL−1β前駆体と共に
インキュベートした。IL−1βの開裂産物をIL−1
β抗体による免疫沈降及びSDSポリアクリルアミドゲ
ル上の分画化によって分析した。IL−1β前駆体は、
ICE cDNAがトランスフェクトされた細胞によっ
て成熟17kDa形態に開裂されたが、発現プラスミド
だけがトランスフェクトされた細胞によって開裂されな
かった。開裂産物は、アフィニティ精製ICEと共に基
質をインキュベートすることによって産生した成熟IL
−1βと同時泳動し、特異的ICEインヒビター(L−
709,049)によって完全に阻害された。発現した
ICE活性の基質特異性は、溶解液を、ICEによって
開裂できないIL−1β前駆体開裂部位突然変異体(A
la116)と共にインキュベートすることによって検証
された。天然型ICEと同様に、トランスフェクタント
に由来の活性は、突然変異タンパク質を28kDaの産
生物に開裂するが17kDa形態には開裂しない(図2
5)。
【0204】p20またはp10サブユニットを別々に
または一緒に発現する個々の構築物の過渡トランスフェ
クション(transient transfecti
on)では、組換えICE活性が観察されなかった。こ
れらの結果から、p20及びp10はこのようにして発
現されたときに適正に折り畳まれていないのでICEの
活性コンホーメーションがp45プロ酵素のタンパク質
分解のときにのみ生成すると推測される。更に、触媒C
ys(残基285)からAlaへの突然変異はICE活
性を喪失させるが、プレドメイン(p14)の欠失は、
該プレドメインがICE活性に不要であることを示す。
または一緒に発現する個々の構築物の過渡トランスフェ
クション(transient transfecti
on)では、組換えICE活性が観察されなかった。こ
れらの結果から、p20及びp10はこのようにして発
現されたときに適正に折り畳まれていないのでICEの
活性コンホーメーションがp45プロ酵素のタンパク質
分解のときにのみ生成すると推測される。更に、触媒C
ys(残基285)からAlaへの突然変異はICE活
性を喪失させるが、プレドメイン(p14)の欠失は、
該プレドメインがICE活性に不要であることを示す。
【0205】実施例29 昆虫細胞中で発現するためのバキュロウイルス発現ベク
ター中のICE cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルス
ベクターを、昆虫細胞のSf9系(ATCC CRL#
1711)中でcDNAの高レベル発現を与えるように
設計する。ICE cDNAを発現する組換えバキュロ
ウイルスを以下の標準法で産生する(InVitrog
en Maxbac Manual):ICE cDN
A構築物をpAV360及びBlueBacベクター
(InVitrogen)のような種々のバキュロウイ
ルス転移ベクター中の多面体遺伝子に結合する。Sf9
細胞中のバキュロウイルス転移ベクターと直鎖化したA
cNPVゲノムDNA〔Kitts、P.A,、Nuc.
Acid.Res.18:5667(1990)〕とのコ
トランスフェクション後の相同組換え(homolog
ous recombination)によって組換え
バキュロウイルスを生成する。組換えpAC360ウイ
ルスを、感染細胞中の封入体の不在によって同定し、組
換えpBLueBacウイルスをβ−ガラクトシダーゼ
発現に基づいて同定する(Summers、M.D. &
Smith、G.E.、Texas Agricult
ure Exp.Station Bulletin
No.1555))。プラーク精製後に、前記アッセイ
によってICE発現を測定する。
ター中のICE cDNAのクローニング AcNPVウイルスのゲノムに由来のバキュロウイルス
ベクターを、昆虫細胞のSf9系(ATCC CRL#
1711)中でcDNAの高レベル発現を与えるように
設計する。ICE cDNAを発現する組換えバキュロ
ウイルスを以下の標準法で産生する(InVitrog
en Maxbac Manual):ICE cDN
A構築物をpAV360及びBlueBacベクター
(InVitrogen)のような種々のバキュロウイ
ルス転移ベクター中の多面体遺伝子に結合する。Sf9
細胞中のバキュロウイルス転移ベクターと直鎖化したA
cNPVゲノムDNA〔Kitts、P.A,、Nuc.
Acid.Res.18:5667(1990)〕とのコ
トランスフェクション後の相同組換え(homolog
ous recombination)によって組換え
バキュロウイルスを生成する。組換えpAC360ウイ
ルスを、感染細胞中の封入体の不在によって同定し、組
換えpBLueBacウイルスをβ−ガラクトシダーゼ
発現に基づいて同定する(Summers、M.D. &
Smith、G.E.、Texas Agricult
ure Exp.Station Bulletin
No.1555))。プラーク精製後に、前記アッセイ
によってICE発現を測定する。
【0206】p45の完全読取枠をコードするcDNA
をpBlueBacIIのBamHI部位に挿入した。
正の配向の構築物を配列解析によって同定し、直鎖状A
cNPV野性型DNAの存在下にSf9細胞を転写する
ために使用した。
をpBlueBacIIのBamHI部位に挿入した。
正の配向の構築物を配列解析によって同定し、直鎖状A
cNPV野性型DNAの存在下にSf9細胞を転写する
ために使用した。
【0207】真正の酵素活性ICEを感染細胞の細胞質
中で検出した。低張液または界面活性剤で溶菌させるこ
とによって生体条件下に感染細胞から活性ICEを抽出
した。
中で検出した。低張液または界面活性剤で溶菌させるこ
とによって生体条件下に感染細胞から活性ICEを抽出
した。
【0208】実施例30 酵母発現ベクター中のICE cDNAのクローニング 異種タンパク質の細胞内または細胞外発現を導くように
設計された発現ベクターに最適ICE cDNAシスト
ロンを挿入した後で、酵母S.cerevisiae中
で組換えICEを発現させた。細胞内発現の場合には、
EmBLyex4のようなベクターをICEシストロン
に結合させる〔Rinas、U他、Biotechno
logy 8:543〜545(1990):Horo
witzB.他、J.Biol.Chem.265:418
9〜4192(1989)〕。細胞外発現のためには、
ICEタンパク質のNH2末端に分泌シグナル(酵母ま
たは哺乳類ペプチド)を融合させる酵母発現ベクターに
ICEシストロンを結合させる〔Jacobson、
M.A.、Gene 85:511〜516(198
9);Riett L. & Bellon N.、Bi
ochem.28:2941〜2949(198
9)〕。
設計された発現ベクターに最適ICE cDNAシスト
ロンを挿入した後で、酵母S.cerevisiae中
で組換えICEを発現させた。細胞内発現の場合には、
EmBLyex4のようなベクターをICEシストロン
に結合させる〔Rinas、U他、Biotechno
logy 8:543〜545(1990):Horo
witzB.他、J.Biol.Chem.265:418
9〜4192(1989)〕。細胞外発現のためには、
ICEタンパク質のNH2末端に分泌シグナル(酵母ま
たは哺乳類ペプチド)を融合させる酵母発現ベクターに
ICEシストロンを結合させる〔Jacobson、
M.A.、Gene 85:511〜516(198
9);Riett L. & Bellon N.、Bi
ochem.28:2941〜2949(198
9)〕。
【0209】これらのベクターの非限定例としては、発
現されたcDNAにヒト血清アルブミンシグナルを融合
させるpAVE1>6〔Steep O、Biotec
hnology 8:42〜46(1990)〕、発現
されたcDNAにヒトリゾチームシグナルを融合させる
ベクターpL8PL〔Yamamoto、Y.、Bio
chem.28:2728〜2732)〕がある。更
に、ICEは、ベクターpVEP〔Ecker、D.
J.、J.Biol.Chem.264:7715〜771
9(1989)、Sabin、E.A.、Biotech
nology 7:705〜709(1989)、Mc
Donnell、D.P.、Mol.CellBiol.
9:5517〜5523(1989)〕を利用するユビ
キチンに結合した融合タンパク質として酵素中で発現す
る。発現したICEのレベルは前記アッセイによって測
定される。
現されたcDNAにヒト血清アルブミンシグナルを融合
させるpAVE1>6〔Steep O、Biotec
hnology 8:42〜46(1990)〕、発現
されたcDNAにヒトリゾチームシグナルを融合させる
ベクターpL8PL〔Yamamoto、Y.、Bio
chem.28:2728〜2732)〕がある。更
に、ICEは、ベクターpVEP〔Ecker、D.
J.、J.Biol.Chem.264:7715〜771
9(1989)、Sabin、E.A.、Biotech
nology 7:705〜709(1989)、Mc
Donnell、D.P.、Mol.CellBiol.
9:5517〜5523(1989)〕を利用するユビ
キチンに結合した融合タンパク質として酵素中で発現す
る。発現したICEのレベルは前記アッセイによって測
定される。
【0210】実施例31 組換えICEの精製 実施例1〜3、5〜7の精製手順の1つまたは組合せを
用い、組換えによって産生されたICEを精製し得る。
更に、組換えによって産生された適当な単一特異的抗体
を用い、組換えによって産生された20kDaのサブユ
ニット、10kDaのサブユニット及び新生全長ICE
ポリペプチドを個々に精製し得る。
用い、組換えによって産生されたICEを精製し得る。
更に、組換えによって産生された適当な単一特異的抗体
を用い、組換えによって産生された20kDaのサブユ
ニット、10kDaのサブユニット及び新生全長ICE
ポリペプチドを個々に精製し得る。
【0211】配列リスト (2)配列番号1に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:14アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号1: Asp Pro Ala Met Pro Tyr Ser Ser Gly Ser Glu Gly Asn Val 1 5 10 (2)配列番号2に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:17アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号2: Ala Ile Lys Lys Ala His Ile Glu Lys Asp Phe Ile Ala Phe Cys Ser Ser 1 5 10 15 (2)配列番号3に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:17塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号3: GAYCCNGCNA TGCCNAC (2)配列番号4に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:17塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号4: ATRGGNTADT ACCTRTT (2)配列番号5に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:17塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号5: GCNATHAARA ARGCNCA (2)配列番号6に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:17塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号6: GTYTACGGNT GNTGNCT (2)配列番号7に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:18塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号7: ATIGGRTAIA TYTCIGCR (2)配列番号8に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:20塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号8: ATNGARAARG AYTTYATNGC (2)配列番号9に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:1490塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号9:
【0212】
【化15】
【0213】
【化16】
【0214】(2)配列番号10に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:404アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:タンパク質 (xi)配列記述:配列番号10:
【0215】
【化17】
【0216】
【化18】
【0217】(2)配列番号11に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:39アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号11:
【0218】
【化19】
【0219】(2)配列番号12に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:74アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号12:
【0220】
【化20】
【0221】(2)配列番号13に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:582塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号13:
【0222】
【化21】
【0223】(2)配列番号14に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:534塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号14:
【0224】
【化22】
【0225】(2)配列番号15に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:264塩基対 (B)種類:核酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:cDNA (xi)配列記述:配列番号15:
【0226】
【化23】
【0227】(2)配列番号16に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:195アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号16:
【0228】
【化24】
【0229】(2)配列番号17に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:178アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号17:
【0230】
【化25】
【0231】(2)配列番号18に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:88アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号18:
【0232】
【化26】
【0233】(2)配列番号19に関する情報: (i)配列特性: (A)長さ:21アミノ酸 (B)種類:アミノ酸 (C)鎖種:一本鎖 (D)トポロジー:直鎖 (ii)分子の種類:ペプチド (xi)配列記述:配列番号19: Ser Gln Gly Val Leu Ser Xaa Phe Pro Ala Pro Gln Ala Gln 1 Asp Asn Pro Ala Met Pro Thr 15
【図1】精製ICE(パネルA)及び関係プレIL−1
β切断(酵素)活性(パネルB)のナトリウムドデシル
スルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る:A.S.=硫酸アンモニウム;DE−F.T.=D
EAE流;S.P.=スルホプロピルカチオン交換;H
IC=プロピル疎水性相互作用クロマトグラフィー;T
SK=TSK−125サイズ排除クロマトグラフィー;
HAP=ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー。
β切断(酵素)活性(パネルB)のナトリウムドデシル
スルフェートポリアクリルアミドゲル電気泳動図であ
る:A.S.=硫酸アンモニウム;DE−F.T.=D
EAE流;S.P.=スルホプロピルカチオン交換;H
IC=プロピル疎水性相互作用クロマトグラフィー;T
SK=TSK−125サイズ排除クロマトグラフィー;
HAP=ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
ー。
【図2】別の精製スキーム(A.S.,DEAE,S
P,HAP,TSK)によって精製したICE活性をプ
ロピル疎水性相互作用カラムに適用した。逆塩濃度勾配
を用いてタンパク質を溶出した。溶出タンパク質を透析
し、SDS−PAGE及び銀染色によって分析し(パネ
ルA)、同様に、変換酵素活性も分析した(パネル
B)。22及び10kDaのタンパク質の溶出液の様相
とICE活性との相関に留意されたい。
P,HAP,TSK)によって精製したICE活性をプ
ロピル疎水性相互作用カラムに適用した。逆塩濃度勾配
を用いてタンパク質を溶出した。溶出タンパク質を透析
し、SDS−PAGE及び銀染色によって分析し(パネ
ルA)、同様に、変換酵素活性も分析した(パネル
B)。22及び10kDaのタンパク質の溶出液の様相
とICE活性との相関に留意されたい。
【図3】図3のAはTHP−1 S−300インターロ
イキン−1β変換酵素活性のpH最適値を示しており、
図3のBはインターロイキン−1β変換酵素活性の塩滴
定を示している。
イキン−1β変換酵素活性のpH最適値を示しており、
図3のBはインターロイキン−1β変換酵素活性の塩滴
定を示している。
【図4】14−C−ヨードアセテートによるICEの活
性部位標識を示す。
性部位標識を示す。
【図5】天然ICEの等電点を示すグラフである。
【図6】インターロイキン−1β変換酵素平衡特性を示
すグラフである。
すグラフである。
【図7】インターロイキン−1β変換酵素ss−グルタ
チオン再活性化を示すグラフである。
チオン再活性化を示すグラフである。
【図8】インターロイキン−1β変換酵素ss−グルタ
チオン安定性を示すグラフである。
チオン安定性を示すグラフである。
【図9】ICE結合の速度定数を示すグラフである。
【図10】GSSG処理またはシスタミン処理した酵素
のサイズ排除クロマトグラフィーによるICEの分子量
推定のグラフである。
のサイズ排除クロマトグラフィーによるICEの分子量
推定のグラフである。
【図11】パネルAは、22kDa及び10kDaのI
CEサブユニットのC−4逆相HPLCのクロマトグラ
ムであり、パネルBは、逆相HPLCのあとの、22k
Da及び10kDa ICEサブユニットのSDS−P
AGE分画化を示す。
CEサブユニットのC−4逆相HPLCのクロマトグラ
ムであり、パネルBは、逆相HPLCのあとの、22k
Da及び10kDa ICEサブユニットのSDS−P
AGE分画化を示す。
【図12】20kDa ICEサブユニットの毛管LC
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。
【図13】10kDa ICEサブユニットの毛管LC
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。
エレクトロスプレーイオン化質量スペクトルである。
【図14】20kDa ICEサブユニットのトリプシ
ン及びAsp.Nの比較マップである。
ン及びAsp.Nの比較マップである。
【図15】10kDa ICEサブユニットのトリプシ
ン及びAsp.Nの比較マップである。
ン及びAsp.Nの比較マップである。
【図16】20kDa ICEサブユニットと24kD
aタンパク質のアミノ末端配列の比較である。
aタンパク質のアミノ末端配列の比較である。
【図17】20kDa ICEサブユニットのDNAフ
ラグメントのPCRのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。
ラグメントのPCRのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。
【図18】10kDa ICEサブユニットのDNAフ
ラグメントのPCRのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。
ラグメントのPCRのための縮重オリゴヌクレオチドの
態様を示す。
【図19】20kDa ICEサブユニットに対するP
CR産物の配列を示す。
CR産物の配列を示す。
【図20】10kDa ICEサブユニットに対するP
CR産物の配列を示す。
CR産物の配列を示す。
【図21】ヒトICE cDNAの構造的編成を示す。
【図22】ヒトICE前駆タンパク質の構造的編成を示
す。
す。
【図23】ウサギ網状赤血球溶解物におけるICE c
DNAのIn vitro翻訳を示す。
DNAのIn vitro翻訳を示す。
【図24】24kDaタンパク質並びに20kDa及び
10kDaのICEサブユニットのICE前駆体におけ
る位置を示す。
10kDaのICEサブユニットのICE前駆体におけ
る位置を示す。
【図25】トランスフェクトしたCOS−7細胞におけ
るICE cDNAの機能的発現を示す。
るICE cDNAの機能的発現を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スーザン・エム・モリノー アメリカ合衆国、ニユー・ヨーク・10003、 ニユー・ヨーク、イースト・ナインス・ス トリート・115、アパートメント・8・エ イ (72)発明者 マイケル・ジエイ・トツチ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 08807、ブリツジウオーター、ボニー・コ ート・102 (72)発明者 ジミー・アール・キヤレイカイ アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07066、クラーク、シエフイールド・ウエ イ・2 (72)発明者 ダグラス・ケイ・ミラー アメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07090、ウエストフイールド、カールト ン・ロード・619
Claims (11)
- 【請求項1】 配列番号10のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドであって、上記ポリペプチドは配列番号16
のアミノ酸配列を有する22kDaサブユニット及び配
列番号17のアミノ酸配列を有する20kDaサブユニ
ットの少なくとも一つのサブユニットと配列番号18の
アミノ酸配列を有する10kDaサブユニットとに開裂
されるようなものであり、但し配列番号17のアミノ酸
配列のN−末端のAspはAsnに置き換ってもよく、
上記22kDaサブユニット及び20kDaサブユニッ
トの少なくとも一つのサブユニットと上記10kDaサ
ブユニットとは一緒になってインターロイキン1β前駆
体を成熟インターロイキン1βに特異的に変換すること
ができる、実質的に純粋な形態のポリペプチド。 - 【請求項2】 請求項1に記載のポリペプチドが配列番
号16のアミノ酸配列を有する22kDaサブユニット
及び配列番号17のアミノ酸配列を有する20kDaサ
ブユニットの少なくとも一つのサブユニットと配列番号
18のアミノ酸配列を有する10kDaサブユニットと
に開裂されて形成され、但し配列番号17のアミノ酸配
列のN−末端のAspはAsnに置き換ってもよく、上
記22kDaサブユニット及び20kDaサブユニット
の少なくとも一つのサブユニットと上記10kDaサブ
ユニットとからなる、インターロイキン1β前駆体を成
熟インターロイキン1βに特異的に変換することができ
る、実質的に純粋な形態のタンパク質。 - 【請求項3】 請求項1に記載のポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を有するDNA分子。 - 【請求項4】 ヌクレオチド配列が配列番号9の塩基配
列を有する請求項3に記載のDNA分子。 - 【請求項5】 請求項3または4に記載のDNA分子を
含有する、組換え宿主中にてクローン化遺伝子を発現す
るための発現ベクター。 - 【請求項6】 請求項5に記載の発現ベクターを含有す
る、請求項1に記載のポリペプチドを生産することがで
きる組換え宿主細胞。 - 【請求項7】 寄託番号ATCC68655を有する請
求項6に記載の組換え宿主細胞。 - 【請求項8】 請求項6または7に記載の組換え宿主細
胞を培養することを含む、請求項1に記載のポリペプチ
ドの製造方法。 - 【請求項9】 ポリペプチドが配列番号16のアミノ酸
配列を有する22kDaサブユニット及び配列番号17
のアミノ酸配列を有する20kDaサブユニットの少な
くとも一つのサブユニットと配列番号18のアミノ酸配
列を有する10kDaサブユニットとに開裂され、但し
配列番号17のアミノ酸配列のN−末端のAspはAs
nに置き換ってもよく、それによって上記22kDaサ
ブユニット及び20kDaサブユニットの少なくとも一
つのサブユニットと上記10kDaサブユニットとから
なり、インターロイキン1β前駆体を成熟インターロイ
キン1βに特異的に変換することができるタンパク質を
形成する請求項8に記載の製造方法。 - 【請求項10】 請求項1に記載のポリペプチドまたは
請求項2に記載のタンパク質と免疫学的に反応性の単一
特異的抗体。 - 【請求項11】 モノクローナル抗体である請求項10
に記載の単一特異的抗体。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US74645491A | 1991-08-16 | 1991-08-16 | |
US746454 | 1991-08-16 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04218039A Division JP3136551B2 (ja) | 1991-08-16 | 1992-08-17 | インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH1169972A true JPH1169972A (ja) | 1999-03-16 |
Family
ID=25000913
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04218039A Expired - Fee Related JP3136551B2 (ja) | 1991-08-16 | 1992-08-17 | インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA |
JP10196222A Pending JPH1169972A (ja) | 1991-08-16 | 1998-07-10 | インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP04218039A Expired - Fee Related JP3136551B2 (ja) | 1991-08-16 | 1992-08-17 | インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0533350B1 (ja) |
JP (2) | JP3136551B2 (ja) |
DE (1) | DE69229252T2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2014028827A (ja) * | 2005-10-27 | 2014-02-13 | W Ahlfors Jan-Eric | 無細胞血液産物をインキュベートすることによって生成される無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス |
JP2016026184A (ja) * | 2005-10-26 | 2016-02-12 | ジャン−エリック ダブリュー. アルフォース, | 無細胞血液産物をインキュベートすることによって生成される無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス |
Families Citing this family (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5874424A (en) * | 1995-12-20 | 1999-02-23 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme |
US6008217A (en) * | 1995-12-20 | 1999-12-28 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme |
US6204261B1 (en) | 1995-12-20 | 2001-03-20 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of interleukin-1β Converting enzyme inhibitors |
US6995141B1 (en) | 1990-04-04 | 2006-02-07 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Interleukin 1β protease and interleukin 1β protease inhibitors |
RU2206611C2 (ru) * | 1991-08-30 | 2003-06-20 | Вертекс Фармасьютикалз Инкорпорейтед | ФРАГМЕНТ ДНК, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА И ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ IL-1β ПРОТЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ |
JPH08500482A (ja) | 1992-06-12 | 1996-01-23 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | Ced−3及び関連蛋白質のインヒビター |
US6939850B2 (en) | 1992-06-12 | 2005-09-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Altered human interleukin-1β convertase (ICE), NEDD-2, and C. elegans ced-3 polypeptides and uses therefor |
US5962301A (en) * | 1992-06-12 | 1999-10-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Relatedness of human interleukin-1β convertase gene to a C. elegans cell death gene, inhibitory portions of these genes and uses therefor |
EP0648128A4 (en) * | 1992-06-24 | 1995-07-26 | Merck & Co Inc | DNA ENCODING THE INTERLEUKIN PRECURSOR 1-g (b) CONVERSION ENZYME. |
US6087160A (en) * | 1993-06-24 | 2000-07-11 | The General Hospital Corporation | Programmed cell death genes and proteins |
EP0711174A4 (en) * | 1993-06-24 | 1997-11-12 | Gen Hospital Corp | REGULATORY GENES OF PROGRAMMED CELL DEATH AND PROTEINS |
US5492824A (en) * | 1994-05-12 | 1996-02-20 | Basf Ag | Ice and ice-like compositions and methods of making same |
US6420522B1 (en) | 1995-06-05 | 2002-07-16 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme |
US5716929A (en) * | 1994-06-17 | 1998-02-10 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme |
US5756466A (en) * | 1994-06-17 | 1998-05-26 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of interleukin-1β converting enzyme |
AU5122196A (en) * | 1995-03-31 | 1996-10-16 | Takeda Chemical Industries Ltd. | Cysteine protease inhibitor |
US5843904A (en) * | 1995-12-20 | 1998-12-01 | Vertex Pharmaceuticals, Inc. | Inhibitors of interleukin-1βconverting enzyme |
US6635738B2 (en) | 1996-03-04 | 2003-10-21 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Compounds which prevent neuronal cell death and uses thereof |
JPH1080270A (ja) * | 1996-07-19 | 1998-03-31 | Hayashibara Biochem Lab Inc | ポリペプチドをプロセッシングする酵素 |
TW515843B (en) * | 1996-07-25 | 2003-01-01 | Hayashibara Biochem Lab | Process for producing an active polypeptide inducing interferon-γ production |
US6376226B1 (en) | 1998-01-09 | 2002-04-23 | Thomas Jefferson University | Recombinant, active caspases and uses thereof |
US6379950B1 (en) | 1998-01-09 | 2002-04-30 | Thomas Jefferson University | Recombinant, active caspases and uses thereof |
ATE296812T1 (de) | 1998-03-09 | 2005-06-15 | Vertex Pharma | 1,2-diazepanderivate als inhibitoren des interleukin-1beta umwandelnden enzyms |
HU227920B1 (en) | 1998-03-19 | 2012-06-28 | Vertex Pharma | Inhibitors of caspases, pharmaceutical compositions comprising thereof and their use |
IL129427A0 (en) * | 1999-04-13 | 2000-02-17 | Yeda Res & Dev | Preparation of biologically active molecules |
PE20011350A1 (es) | 2000-05-19 | 2002-01-15 | Vertex Pharma | PROFARMACO DE UN INHIBIDOR DE ENZIMA CONVERTIDORA DE INTERLEUCINA-1ß (ICE) |
WO2002055478A1 (fr) * | 2001-01-16 | 2002-07-18 | Kaneka Corporation | Procede de preparation de derives d'aminolactone optiquement actifs et intermediaires de ces derives |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IE61353B1 (en) * | 1984-06-19 | 1994-11-02 | Immunex Corp | Purified interleukin 1 |
DE68925935T2 (de) * | 1988-10-01 | 1996-08-14 | Otsuka Pharma Co Ltd | Antikörper gegen Interleukin-1-beta |
WO1991015577A1 (en) * | 1990-04-04 | 1991-10-17 | Black, Roy, A. | INTERLEUKIN 1'beta' PROTEASE |
-
1992
- 1992-08-14 DE DE1992629252 patent/DE69229252T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-08-14 EP EP19920307479 patent/EP0533350B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-08-17 JP JP04218039A patent/JP3136551B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-07-10 JP JP10196222A patent/JPH1169972A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2016026184A (ja) * | 2005-10-26 | 2016-02-12 | ジャン−エリック ダブリュー. アルフォース, | 無細胞血液産物をインキュベートすることによって生成される無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス |
US9314420B2 (en) | 2005-10-26 | 2016-04-19 | Jan-Eric Ahlfors | Acellular bioabsorbable tissue regeneration matrices |
JP2014028827A (ja) * | 2005-10-27 | 2014-02-13 | W Ahlfors Jan-Eric | 無細胞血液産物をインキュベートすることによって生成される無細胞、生体吸収性の組織再生マトリックス |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05227961A (ja) | 1993-09-07 |
JP3136551B2 (ja) | 2001-02-19 |
DE69229252T2 (de) | 1999-12-16 |
DE69229252D1 (de) | 1999-07-01 |
EP0533350A1 (en) | 1993-03-24 |
EP0533350B1 (en) | 1999-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3136551B2 (ja) | インターロイキン1β前駆体変換酵素をコードするDNA | |
WO1992019745A1 (en) | Rfkbp: a novel prolyl isomerase and rapamycin/fk506 binding protein | |
WO1992007068A1 (en) | Amyloidin protease and uses thereof | |
EP0648128A1 (en) | DNA ENCODING PRECURSOR INTERLEUKIN 1$g(b) CONVERTING ENZYME | |
JPH09509160A (ja) | Fk−506細胞質ゾル結合蛋白質 | |
EP1005549A2 (en) | Prostate tumor polynucleotide and antigen compositions | |
CZ305602B6 (cs) | Polypeptidická proteáza štěpící von Willebrandův faktor (vWF), nukleová kyselina kódující tento polypeptid a použití tohoto polypeptidu | |
JP2001228137A (ja) | C3a受容体およびC3aを用いるスクリーニング方法 | |
AU711113B2 (en) | Novel serpin derived from human hypothalamus | |
CA2223077A1 (en) | Thrombin receptor homolog | |
AU718311B2 (en) | A C5a-like seven transmembrane receptor | |
NO314848B1 (no) | Protein for inhibering av kollagenfremkalt blodplateaggregering, DNA som koder for proteinet, vektor som omfatter et slikt DNA, vertscelletransformert medvektoren, fremgangsmåter for fremstilling og rensing avproteinet, farmasöytiskpreparat | |
MXPA97009338A (en) | Transmembrane-seven type receiver | |
US6713283B2 (en) | Tyrosylprotein sulfotransferases | |
US20060009631A1 (en) | Tyrosylprotein sulfotransferases and methods of use thereof | |
US6300093B1 (en) | Islet cell antigen 1851 | |
US5500344A (en) | Serine protease and uses thereof | |
US6207414B1 (en) | Tyrosylprotein sulfotransferases and methods of use thereof | |
CA2076159C (en) | Dna encoding precursor interleukin 1beta converting enzyme | |
US6204016B1 (en) | Tyrosylprotein sulfotransferases and methods of use thereof | |
WO1994007992A9 (en) | Peptides specifically binding to plasminogen and the dna encoding such peptides | |
AU728088B2 (en) | Novel human cysteine protease | |
US6207432B1 (en) | Tyrosylprotein sulfotransferases and methods of use thereof | |
JP2002300880A (ja) | 新規ユビキチン特異プロテアーゼ | |
JPH11239494A (ja) | カスパ―ゼ活性化dnア―ゼ |