JPH03505865A

JPH03505865A - 乳化剤

Info

Publication number: JPH03505865A
Application number: JP1500066A
Authority: JP
Inventors: ブロック，ジョン; エンサー，マイケル・ブライアン
Original assignee: アグリカルチュラル・アンド・フード・リサーチ・カウンシル
Priority date: 1987-11-07
Filing date: 1988-11-03
Publication date: 1991-12-19
Also published as: WO1989004209A1; GR1000160B; AU2609488A; ES2016682A6; EP0387285A1; US5330682A; EP0387285B1; DE3887901D1; DE3887901T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】乳化剤本発明は乳化剤に関する。

コロイドは液体中の不混和性物質の粒子の分散体である。エマルジョンはある液体中の別の不混和性液体の分散体であり、フオームは液体中の気泡の分散体であり、そして懸濁体は液体中の固体粒子の分散体である。コロイドは、それらの高い界面エネルギーのために、熱力学的に不安定である。適当な通路がそれらに利用可能であるならば、それらは２つの別々の相（それらの界面の面積は可能な限り最小である）に分離するであろう。乳化剤はコロイド中の２相の界面に作用する物質である。このような分子は両親媒性である（両親媒性とは、たとえ２相が互いに親和性でなくとも、その分子構造の別個の部分が２相のそれぞれに対して親和性をもつことを意味する）、その結果、乳化剤は界面を占有して界面エネルギーを低下させ、こうして乳化剤が存在しないときよりも少ない仕事で２つの別々の相からコロイド分散体を生成することができる。また、効果的な乳化剤は界面で薄膜を形成し、再び相が分離するためにはその構造一体性が破壊されねばならない。こうして、コロイドは熱力学的に不安定な状態にあるが、それは運動の拘束によって破壊に対して安定化される。

乳化剤は食品製造においてしばしば用いられる。この種の乳化剤は大部分が脂肪酸エステルのような脂質誘導体である。これらの乳化剤はエマルジョンの形成を助けることに優れているが、強い界面薄膜を形成しない。その結果、それらは往々にして安定剤と共に使用され、その安定剤は連続相の粘度を高めることにより分散相の粒子を不動化して、それらが凝集するのを妨げる。

はとんどすべての蛋白質はある程度まで表面活性であり、こうしてそれらも食品中で乳化剤として使用されているＣＰｅｔｒｃｔ　＆　Ｋｉａｓｓｌｌａ、　Ｊ、ム（ｒｉｃ、Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｗ、、　ＨＱ）。

７１６−７２３．１９７ｇ）。しかしながら、乳化剤になるように特別に誘導された蛋白質は、たとえあるにしても少数しかなく、はんの２，３種の蛋白質（例えば、カゼイン、リポ蛋白質）が何らかの方法で乳化に関係する天然の機能をもつにすぎない。

すべての蛋白質はある程度まで表面活性であり、この活性は通常、蛋白質の雨親媒性構造部分が界面および他の蛋白質分子と相互作用すべく露出されるように、それらが部分的に（例えば、機械的処理または加熱により）変性される場合に増強される。脂質−極性界面での、親水面および疎水面を有するＣ−ヘリックスの果しうる役割はすてに關示されている（例えば、′ペプチド：構造および機能“ 、　ｐｒｏｅ、ムｍ、ＰｅｐＬｉｄｅ　５ｙｌＰ、　Ｌ、　１０５に記載のＫ１１ｓｅｒ　ｒｔ　ａｌ、　Ｓｐａｒｒｏｗ　ｅｔ　ｓｌ、およびＥｐｒ＋＋ｄ　ｅｔ　ｔｌによるそれぞれの文献を参照されたい）が、主としてレセプター−リガンド相互作用の場合である。、実質的に単離されたｌ−ヘリックスを乳化剤として使用することは以前に誰も提唱していない。

本発明の１つの面はポリペプチドから成る乳化剤を提供し、前記ポリペプチドは軸方向の親水性ドメインおよび疎水性ドメインをもつｌ−へソックスを形成しうる少なくとも１つの領域から実質的に成り、その結果ポリペプチドの前記領域は親水性ドメインが水相にそして疏水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に存在することができ、前記Ｉ−ヘリックスは少なくとも２回転を有する。

Ｃ−へソックスから“実質的に成る”とは、前記ポリペプチドの少なくとも大多数のアミノ酸残基が、ｔ−へソックスを形成する傾向があるような天然のものであって、しかもｌ−ヘリックスを形成するように配置されていることを意味する。明らかに、大部分の残基それら自体がＩ−ヘリックス形成性であるということは、それらが非ヘリックス形成残基と交互に配置される場合に十分ではない。しかしながら、本発明はバックボーン残基の７０％より多くが１−ヘリックスを形成しうる化合物を包含する。

好ま旨＜は、バックボーン残基の少なくとも８０％、９０％または９５％が、もしくはその全部が１−ヘリックスを形成することができる。非ヘリックス形成残基は好ましくはペプチドの岡末端に位置する。こうして、代表的なｌ５−２０個のアミノ酸から成るペプチドの場合、各末端に好ましくはたった２個の非ヘリックス形成残基が存在し、より好ましくは各末端に１個だけ存在し、最も好ましくは１つも存在しない。

好ましくは、全ポリペプチドは親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に沿って存在することが可能である。

親水性ドメインと疎水性ドメインを隔てる中間極性の軸方向ドメインが存在していてもよく、さらに１より多い親水性または疏水性ドメインが存在していてもよいが、親水性ドメインおよび疎水性ドメインはそれぞれ１つだけ存在し、中間極性のドメインは存在しないのが好ましい、疏水性ドメインはへソックスによって規定される円の約８０°〜２８０’を占めることができる。

好ましくは、疎水性ドメイン中のアミノ酸は疎水相互作用による全体的な立体配置の安定化に寄与する。これは、アミノ酸が疎水性の側鎖をもつ場合に、特にそれらがロイシン、アラニン、またはｌ−へソックス中に見いだされる傾向が高いトリプトファンのような大きいｆｆ’Ｉ族グループである場合に、促進される。

同様に、それほど重要ではないが、親水性アミノ酸は３または４残基あいだをおいたアミノ酸間に分子内塩橋（１１１１ｂ目ｄＨ）が形成されるように選択することが望ましい。適当なアミノ酸にはグルタミン酸、リシンおよびセリンが含まれる。

前記の基準をたまたま満たす既知ポリペプチドはどれも本発明のこの面からはっきりと除外されるが、それにもかかわらず我々は、このような活性が以前に開示されていない場合、乳化剤としてのそれらの使用を請求するであろう。

この種のポリペプチドは乳化剤として作用することが見いだされた。Ｃ−ヘリックスはポリペプチドの全部を構成することができ、機能性を′！に適化するためには往々にしてこれが好ましいが、別の部分が加わってもよい。

ただし、その部分は油／水界面に上記のような状態で位置するｌ−ヘリックス（または、好ましくは、分子全体）の能力を妨げないものである。

こうして、ペプチドのバックボーン中の非ヘリックス形成残基（それについての基準は先に論じた）のほかに、側鎖を形成するヘリックス形成または非ヘリックス形成アミノ酸もしくは他の基が存在してもよい。この種の側基はそれらが結合しているバックボーンアミノ酸と同じ親水性（ｈｙａｔｏｐｈｉ＋１ｃｉｔｙ）をもつべきである。好ましくは、このような側基の分子量は２００ダルトンより小さく、より好ましくは１００ダルトンより小さい。　好ましくは、ペプチドは少なくとも１１債のアミノ酸を含み、そして？−へソックスは少なくとも４．５．６または７回転をもつことが好ましい。非常に長い分子はそれほど移動性でないと思われ、そのエマルジョン形成活性が低いだろう。しかしながら、一般に、分子が長ければ長いほど、そのユマルジ３ン安定化性質は良くなるだろう。

なぜならば、それが界面を去り、これにより界面層を破壊するためには、それど界面との結合相互作用がすべて同時にこわされねばならないからである。はんの２または３回転のペプチドはイ４１より長いペプチドの優れた乳化活性をもＩユないｔ・瓢それでも食品の乳化剤として使用される蛋白質に活性の点で頭領しており、従つτこれらのペプチドも有用でありうる。

ペプチドがＣ−ヘリックスを形成する程度は、アミノ酸の配列ばかりでなく環境にも左右されることに留意すべきである。例えば、トリフルオロエタノールは単純な２５ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ７，０）よりも（−ヘリックスの形成を促進する。従って、“Ｃ−へソックス”または“ｌ−ヘリックスを形成しうる ”なる用語は絶対的でなく相対的であり、同−環境内の他のペプチドとの比較において用いられる。

それにもかかわらず、所定のアミノ酸それ自体がヘリックス促進、ヘリックス不安定化、またはヘリックス破壊のいずれに関与するかを決定するための明白な規則（例えば、ＣｈｏｕおよびＦＩＳｌｌｌΩにより開示されるもの）がある。ヘリックス形成アミノ酸は７ラニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システィン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミンおよびバリンである。ヘリックス不安定化アミノ酸はセリ゛〆、インロイシン、トレオニン、グルタミン酸、アスパラギ゛／酸、リシン、アルギニンおよびグリシンである。２つのへソックス破壊アミノ酸はブロワ〉・とヒドロキシプロリンである。それでも、本発明ペプチドがヘリックス形成性であると見なすに足るヘリックス形成アミ１．′酸を含む場合、そのペプチドにけ＾、ソックス不安定化アミノ酸が存在していてもよい。従って、個々のヘリックス形成アミ２・′酸について言及するよりもヘリックス形成配列について言及するほうがより正確であるｓ　ＣｂｏｇＳよびＦａｓ＋＋ａｎにより提示された規則を月いて、アミノ酸配列がヘリックス形成性であるかどうか決定することができる。これとは別に、当分野で習熟（７た者にはよく知られているように、ｐ■角対ｐｈｉ角のラマチャンドラン（Ｒｚｍ２ｃｈａｎｄｒ＋ｎ）プロット内の所定ペプチドの位置を用いて、“許容しうるｎｔ−ヘリックスが形成されるかどうか決定することができる。

ヘリックス形成の経験的裏付けを得るために円二色性テストを用いることができるが、これは化合物がさらされる環境に大きく影響される。この種のテストでは、疎水−親水界面（例えば、２枚の顕微鏡用スライドガラスにはさんだ化合物の水溶液）が用いられるだろう。しかしながら、先に論じた理論的基準が化合物の性質を決定するのに好適である。

乳化剤の分野でよく知られているように、ペプチドを乳化剤として機能させるためには、それらは十分に水溶性であるべきである。本発明の比較的疎水性の化合物は、少なくとも一方の末端に１個またはそれ以上の親水性アミノ酸（ヘリックス形成性または非ヘリックス形成性）を付加することで利益を受けるであろう。

特に指定しない限り、本発明ポリペプチドのアミノ酸はすべて天然に存在するＬ体である。このポリペプチドをもっばらＤ−アミノ酸から製造することも可能であるが、かなり費用がかかるだろう。

本発明の乳化剤は経口摂取した場合に無害であり、実際のところ栄養的価値を有する：従って、それらは食品乳化剤としての使用に申し分なく適しており、例えばマヨネーズ、アイスクリーム、マーガリン、スプレッド、ビスケットおよび他の無数の近ごろの加工食品の脹造に使用される。Ｌ６ｘＬながら、それらは例えば化粧品（例。

日焼は止め、口紅）、錬り歯磨きおよび他のコロイド系の製造において広く利用される。モデル寅験系でのそれらの挙動は、適当な乳化剤が存在する場合に生成される新規な系においてもそれらが役に立つことを示唆してしする。この種の系には高レベルの脂質を含むフオーム（例。

缶詰クリーム）、過剰処理に敏感なエマルジョン、薬学的製剤、洗浄組成物（例、コンタクトレンズ用）、ノ（イオセンサーおよび熱力学的に安定なミクロエマルレジジンが含まれる。

本発明の第二の面は以下のペプチド：＋’ＬＩ　ＮＨｚ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ・−５ｅｒ−Ｌ７ｉ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌａｕ−、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−ＣＯＯＨ（２１ＮＨｚ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａ、Ｌａ−ＧＬｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｃｏｏ）！ｆ３１　ＮＨｘＪｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌｉ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ＝Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌａｕ−ＧｌｕＪｅｒ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｌｙｇ−，４１ａ−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−ＣＯＯＨ＋４１　　ＮＨｔ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ＬｅｕｉＬａｕ−Ｌａｕ −Ｌ７Ｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｉｍ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｌ＠ｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｉ−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−３ｅｒ　−Ｃｏｏ）！ｔ５１　ＮＨｚ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−ＧＬｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ− ！Ｅｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ −３ｅｒ−ＣＯＯＨｔ６）　　ＮＨｔ　−５ｅｒ−τｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌ＆−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−ＬｅＩ−Ｉ−Ｌｅｕ−３１！ｒ−（７）ＮＴｈ　−３ａｒ−ＴｒＰ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−９ｉｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−ＡｌｙＬ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌａｕ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−＋１３１　　　　　ＭＨｚ−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−Ｌｅｖ−Ｌｅｖ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ− Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｃｏｏｌ＋１４１　　　　　ＮＴ（ｔ−９ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ−５ｅｔ−Ａｒｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−１１８］Ｎ１（ｔ−Ｇｉｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｃｏｏｌ＋１９１　　　Ｎ！’！ｚ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ− Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ− Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ＋２０１　　　ＮＨｔ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌ＋ａｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｉ− Ｌａｕ−Ｌｅｕ　−Ｃｉｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＯＯＨ。

および（ｉ）ＧｉｎをＧｌｕにまたはＱｌｕをＧｉｎに置き換えるおよび／または（ｉｉ）ＡｓｎをＡｓｐにまたはＡｓｐをＡ　ｓ　ｎ　＋：置き換えるおよび／または（ｉｉｉ）ペプチドの各末端に２個までの非ヘリックス形成アミノ酸が存在する前記ペプチドの変異型より成る詳から選ばれるポリペプチドを提供する。

これらのポリペプチドはペプチド合成により、例えばＭａｒ（ｆｉｎおよびＭｅｒｒｉｌｉｅｌｄ　（ムａ＋＋、Ｒｅｖ、Ｂｉａｃｈｅｍ、、　３９゜８４１− ０８．　＋９７０）の一般方法により、またはムｔｈｅｒｔｏｌ。

５ｈｅｐｐｘｒｄおよび彼らの共同研究者のＦｍｏ　ｃ−ポリアミド法により、あるいはこれらの方法のその後の改良法により製造される。また、それらは適切に形質転換された宿主により生合成的に、あるいは天然、非天然蛋白質またはポリペプチドの加水分解により製造することができる。長い鎖長の反復ポリペプチドを製造し、その後それを化学的にまたは蛋白質加水分解により切断して本発明による多くの分子を得るように、ｒＤＮＡ構築物を設計することが特に有利であるかも知れない。化学的切断は、例えばＡｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ結合の、臭化シアン切断が用いられる。また、はんの短い非ヘリックス形成配列がヘリックス彩度配列の間に存在する場合は、切断を必要としないかも知れない。このような場合に、連続へワックスがすべて油−水界面で１６−ｉｎ−マａｔｅｒ方向をとることができるように、非ヘリックス形成配列はできるだけ柔軟であるべきである。

実施例ペプチド設計のプロセスは２つの模式図の助けを借りて紙上で行った。１つはヘリカルホイール（ｈｓｌｉｃａｌｖｈｅ！ｌ；　５ｃｂｉｌｆｅｒ　ｉｎｄ　Ｅｄｍａｎｄｓｏｎ、　１９６７）であり、これは軸方向に見下ろしたときのｌ− へソックスの二次元表示である（′Ｍ１図参照）、これはアミノ酸側鎖がヘリックスから放射状に広がってその円筒面を構成する様子を例示している。この模式図の作成により、構造の異なる要素（特に、疎水面および親水面の構造要素）間のらせん軸に対して平行に走る境界を定めることができた。もう１つの表示はヘリカルネット（ｂｅｌｉｃ＊ｌ　ｍｅｔ；　Ｄ＋＋ｏｎｉｌｌ。

１９６りであり、これはあたかもアミノ酸がヘリックスに巻き付いた円＠（らせん軸と平行な一本の線に沿って切り開き、平らな状態にした）に投影されるかのようにアミノ酸を表示している（第２図参照）。この模式図の作成により、ヘリックスの隣接回転上のアミノ酸間の相互作用（特に、分子内塩橋）をプロットすることができた。

いくつかのペプチドを設計して合成した。その際、１つの構造的特徴を体系的に変えて、それが機能性に及ぼす影響を調べた。こうすることにより、有用な表面活性剤でありうる数組の構造が同定された。

ペプチドはＣＲＢペプシンセサイザーＩＩ　（ＣｘｍｂｒｉｄにＣＲ＊５ｔｓｒｃｈ　Ｂｉｏｅｂｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｉｄ、　ＣａａｂｒｉｄＫ！、　Ｕ、に、）を使って半自動固相ペプチド合成により研究用に製造した。ペプチドはこの装置の艮造元の標準方法を用いて、９−フルオレニルメトキシカルボニルアミノ酸の活性型エステル（または時々、対称酸無水物）から合成した。カップリングおよび脱保護反応の進行は、反応塔を去る液体の３６５　ｎｍでの吸光度を監視することにより追跡した。

また、カップリング反応の完了は、２．３粒の担体上でカイザー試験（Ｋｚｉｓｅｒ　Ｎ　！＋、　１９７０）を実施することにより、または活性化アミノ酸と共に加えられた３、４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３− ベンゾトリアジンの陰イオン体による黄色が反応塔から消失するのを観察することにより決定した。

ペプチド同士とおよび標準蛋白質と比較したペプチドのエマルジョン形成能は、ＰｅａｔＣｔ　ａｎｄ　Ｋ１ｍ５ｅｌｌｉ　（１９７１）の比濁法の変法を用いて測定した。標準乳化条件は２５ｍ１のパイレックス（Ｐｙｒｅｘ　：登録商標）ガラス計量シリンダー中のグリセロールトリオレエート５ｍｌおよび０．２ｍｇ／ｍｌペプチドまたは蛋白質水溶液５ｍｌを、氷冷しながら速度５に設定したポリトロン（Ｆ’ｏ１７ｔｒｏｎ　：Ｋｉｎｅａｓｔｉｃａ　ＧｍｂＨ，Ｌｕｘｔｒｎ、　５ｖｉＨ！ｒｆｃ＋＋ｄ）を使って２０秒間乳化した。水相および新たに生成したエマルシヨンは両方とも真空中で注意しながらガス抜きして気泡を取り除いた。−晩装置して非乳化油滴を凝集させかつエマルジョン相を残留油および水相かも分離させた後、エマルジョンの分散相休演画分を、計量シリンダー中のエマルジョン相の界面レベルから概算した。シリンダーの内容物はそれらが均一に分散されるまでスパチュラで穏やかに混合し、直ちにサンプルを採取して水または０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で１０００倍に希釈した。

これらの希釈エマルジョンの５００ｎｍでの光学密度は、乳化剤の相対的エマルシコン形成能の概算を与えた混濁度に比例していた。混濁度が水よりも０．１％ＳＤＳの場合に寓いことは、乳化粒子が水の中で集合することを示す。混濁度が水よりも０．１％ＳＤＳの場合に低いことは、そのエマルシコンが添加界面活性剤により不安定にされることを示し、乳化剤のエマルジョン安定化能が小さいことを暗に意味している。

水溶液中のポリペプチド乳化剤のフンホメーシジンは、Ｊｓｓｃｏ　Ｊ−６００分光偏光計（Ｊｘｓｅａ　ｌｉｅ、、　Ｅｘｘｔｏｎ、　Ｍｄ、。

ＵＳ人）を使って記録した遠紫外線円二色性スペクトルから判定した。スペクトルは２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７，ｏ＞中の０．１−１、Ｏｍｇ／ｍ＋ペプチド溶液から記録した。ペプチドのコンホメーションはＣ０ＮＴＩＩに次構造解析コンピュータプログラム（Ｐｒｏマｅａｃｈｅｒ　５ａｄＧｌｏｃｋｎｅｒ、　１９Ｎ；　Ｐｒａｖｅａｃｂｔｒ、　１９０）を使ってスペクトルから判定した。

有用なポリペプチド乳化剤の同定およびそれらの構造と機能の関係を調べる研究は、１８−アミノ酸ペプチド、すなわち配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａ、Ｉａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓ　ｅ　ｒ　 −Ｌ　ａ　ｕ　−Ａ　Ｉ　ａ　−’　Ｌ　ｙ　ｓ　−Ａ　ｌ　ａ　−Ｌ　ｅ　ｕ　−・Ｓｅｒを有するペプチド１から始めた。この構造のヘリカルホイール表示（第１図）は、大きい疎水性側鎖（Ｌｅｕ８よびＴｒｐ）の両側により小さい疎水性側＠（Ａｌａ）が隣接した２００”の弧にわたってヘリックスの疎水面が存在するように設計された状態を表している。

親水面は１６０’の弧にわたっており、等しい数の正および負に荷電したアミノ酸（それらが保宵する電荷符号を示す上付き文字から図面中で確認した）の両側にセリンの小さい橿性（しかし電荷をもたない）−側鎖が存在している。このような分子が界面でそれ自体を配向させる場合、大きい疎水性側鎖は無極性相へ深く延びるが、荷電アミノ酸はＩ；いてい水相にさらされる。アラニンおよびセリンは相界面に接近して存在する。この構造のヘリカルネット表示（第２図）は、正電荷および負電荷が可能な分子内塩橋相互作用の数を最大とするように配置されＩ；状態を表している。また、それはこの２列が、３゜６残基／回転と仮定して、５回転までのぽ−へソックスを形成しうろことを示している。

このペプチドに対する円二色性の測定値から、そのコンホメーションは自由溶液中で笑質的にらせん状である（２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，０中でヘリックス４３％、ヘリックス促進溶媒の２５％トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）中では５９％に上昇）ことが確認された。このペプチドのエマルジー／形成能は、比濁法により判定して、非常に優れていた。その乳化活性指数は、ＰｅａｔＣｔ　ｓａｄ　Ｋｉａｓｅｌｌａ　（１９Ｎ）により研究された最も活性な天然蛋白質であるウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の１．９倍であった。また、この値は彼らが研究したすべての乳化剤のうちで最も効果的なスクシニル化醇母蛋白質にそれがまさっていることを示すであろう、ベブチドフを用いて調製した水中油型エマルジョンも非常に安定していた。室温において、個々の調製物は５〜１１０間分離しなかった。いったん分離しても、ポリトロンで再生することによりエマルシコンが再形成され、天然蛋白質と比較して過剰処理に対し著しい耐性を示した。９０℃では、その安定性が、水相のかなり少ないゲル化により達成されたにもかかわらず、ＢＳＡを用いて調製したエマルジョンと同様であった。ペプチド１の優れた表面活性は、ポリトロンでの乳化の際にたくさんの気泡が生じ、この気泡が５０％の油の存在にもかかわらず十分に安定であって、それをこわすためには数分間にわたる細心の排気を必要としたことによりさらに立証された。相分離の時間を考慮した後で、水相は透明でなく半透明であり、数カ月間にわたってそのままであった。このことは熱力学的に安定したミクロエマルジョン粒子が存在しうろことを示唆している。笑味に、この研究に関連してこれまでに合成されたペプチドはすべて、この性質と過剰処理に対する耐性（ペプチド１に関連して先に述べた）の両方を示した。

ポリペプチド鎖の長さを変えることがその構造および機能に及ぼす影響を調べるために、ペプチド１と同族の次の一連のペプチドを合成して、研究した。ペプチド２はちょうど８個のアミノ酸から成り、ペプチド１のアミノ末端の８残基と同じ配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｙｓをもっていた。

その結果、軸方向の眺めはペプチド１と同じであるが、そのヘリカルホイール（第３図）の多くの位置が占有されていない。ヘリカルネット（第４図）として表示した場合、ペプチド２は、最高２回転のヘリックスを形成できるにすぎないとしても、ペプチド１の相当部分に分子内塩橋の類似した配置をもち得ることが明らかである。

特表平３−５０５８６５　（６）同様に、ペプチド６および７はそれぞれ配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ａｌａ−Ｌｅｕ−５ａｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ｅｒおよび５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−’Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＬｙＳをもつ１１個および１５個のアミノ酸から成って５％な。

これらも非占有位置を別にすればペプチド１と類似した軸方向の眺めを有しく第１１．１３図）、さらに３回転および４回転しうるそれらのヘリックスの内部に類似した塩橋ネットワークをもっていた（第１２．１４図）。

ペプチド３は配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ −Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ａｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒをもつ２６個のアミノ酸力）ら成っていた。この場合、アミン末端の１７！！基はペプチド１と同一であり、ペプチド３のヘリカルホイール示（第５図）は、この設計がどのようにしてその構造の軸方向眺めをほぼ完全に保存した状態で延長されたかを示している。唯一の相違は荷電アミノ酸により占有される弧のわずかな広がりで・ある、もつともこの弧はへリツクスの親水面の内部に完全にとどまったままであり、ペプチド１と同じ範囲のその面にわたっている。ペプチド３のヘリカルネット表示（第６図）は、可能な分子内塩橋の配置が保存され、しかもこのペプチド１２おｌ／１て可能な７回転全部に対して同様に延長されることを示してしする。

ペプチド８および９はそれぞれ２２個および２９個のアミノ酸から成り、６８よび８回転の−−へリツクスを形成しうる配列：Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ −Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌｔ−ＬｙｓおよびＳｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓを有していた。この場合も荷電された極性または非極性アミノ酸の軸方向分布は保存され（第１５．１７図）、最長ペプチドにおける１つの相互作用の向きを別にすれば、可能な塩橋ネットワークも同様に保存される（第１６．１８図）。この一連のペプチドに対する円二色性の測定値は、それらの溶液のコンホメーションがそれらの鎖長によって決定的影響を受けることを示した。これは第１９図にグラフで例示され、このグラフは、鎖長が約１１アミノ酸より長いこれらのペプチドの場合、純粋に水性の緩衝液中でＩ−ヘリックスのコンホメーシヨンをとる傾向が劇的に増加することを示している。これに付随して、それらの乳化活性指数は良好な天然蛋白質に匹敵する値（例えば、ＢＳＡはこの系で約１ｏｏｏｍ”／ｇ）からペプチドｌで測定された例外的に高い値（より長い同族体ではより高い値）へ等しく劇的に増加する。このことは、界面到達時に再び折りたたまれてこのような構造をとるよりもむしろ、純粋に水性の溶液中で両親媒性コンホメーシヨンをとる能力の方が表面活性を増強することを示す有利な証拠である。さらに、それは、この性質のペプチドを設計する我々の努力が、特に約１１個のアミノ酸（約３回転のｌ−ヘリックスに等しい）より長いこの種のペプチドにおいて効を奏したことを示している。

エマルジョンの安定性は貯蔵条件（例．室１１）の変化に敏感であった。これは、異なる時機に調製したエマルジョンの寿命を厳密には比較できないことを意味する。

しかしながら、具なるペプチドを用いて同じ日にエマルジョンをＩＩ！！Ｌ、− 緒に貯蔵した場合、エマルジョンの安定性はペプチドの長さと一致して増加し、一般的にはペプチド２（８アミノ酸）の場合の１〜３日間からペプチド３および９（２６および２９アミノ酸）の場合の数週間へ増加する。

これらの実験の結果から首尾一貫した事柄が浮かび上がる。ポリペプチド鎖の長さが２回転（ペプチド２）から５回転（ペプチド１）のへリックスに増加すると、ヘリカルコンホメーションおよびエマルジョン形成・安定化能は急速に高まる。７回転（ペプチド３）のヘリックスへ鎖長がさらに増加すると、これらの性質のすべてがよりゆるやかに高まる。ポリペプチド鎖が長くなればなるほど、その乳化活性は良好になるというのが一般原則であるが、ペプチド２８よび３は両方とも、蛋白または脂肪酸から誘導された乳化剤と比較して、特に優れた機能性を有する構造の部類に含まれる。

構造と機能性との関係を調べるために変えるべき次の構造特徴は、疎水表面領域と親水表面領域とのバランスであっｌ；。ペプチド１〜３はすべて２００＠の弧を占をする疎水面および残りの１６００の弧を占有する親水面をもっていた。ペプチド４は配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｉａ−Ａｌｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−３ａｒをもつ２２−３ｉ基ポリペプチドであった。それは２８０＠の弧にわたる広い疎水面および残りの８０″の弧に制限された狭い親水面をもつように設計された（Ｎ７図）、親水面があまりに狭いので、他のペプチドにいずれにしても類似するわずかに残った塩橋ネットワーク（第８図）を保持するために、荷電アミノ酸を完全に親水面に集めることが必要であった（第８図）。この逆は配列：５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−３ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−５ａｒをもつ１８−残基のペプチド５であった。このペプチドの疎水面は８０″の弧に制限され、一方親水面は２８０゜の弧を占有する（第９図）。このように狭い疎水面の場合は、それを大きい疎水性側鎖で満たすことが決定された。しかしながら、このペプチドの最も注目すべき特徴は親水面にあり、そこでは可能な塩橋のネットワークがもう１つの次元に、すなわち他のペプチドにおけるほとんど線状の配置から、面状のネットワークに延びている（第１０図）。これはそのヘリカルコンホメーションを最大限に安定化させるはずである。なぜならば、界面で配向される場合でさえも、この種の分子は十分に溶媒和されると考えられるからである。

ペプチド５（１８アミ刈ｌはペプチドｌ　（１８アミノ酸）とペプチド３（２６アミノ酸）の値の中間のエマルジョン形成能を示した。その円二色性スペクトルは、純粋に水性の溶液中で（−へリックス構造を全く示さなかったが、ヘソックス促進茶件下ではこのようなコンホメーションをとる注目すべき傾向を示した（例えば、５０％ＴＦＥ中で３５％ヘリックス）。これはこの種の溶媒中で他のペプチドよりも一層大きい効果を示し、界面（ヘリックス形成を非常に促進する環境であるだろう）においてその挙動を示すと考えられる。

ペプチド４（２２アミノ酸）はその極端な疎水性のために取り扱いが難しく、こうして円二色性スペクトルをそれに利用することがまだできない、その乳化活性はそれよりやや大きいペプチドの乳化活性と類似し、それはすでに研究したペプチドのうちで最も安定した（約２カ月）エマルジョンを生成した。また、それはより一般的な水中油型エマルジョンだけでなく油中木型エマルジョンを形成する傾向をもっていた。

ペプチド１０〜１３（これらの構造は先に示した）を製造することにより、第１図のように真っ向から見たときの、疎水性および親水性アミノ酸が占める弧をさらにいろいろに変えてみた。ペプチド５．１０，１１．ｌ、１２．４および１３はこれらの弧がそれぞれ８０：２ＢＯ１１２０：２４０．１６０：２００．２００：１６０゜２４０：１２０，２８０：８０および３２０：４０である連続した一系列を形成する。ペプチドの疎水性の増加は、エマルジョン形成能を実質的に低下させずに、エマルジョンを高度に効果的に安定化させることが見いだされＩこ。

しかしながら、疎水性がより大きいこのようなペプチドは第一の系列のペプチド（ペプチド１．２，３．６．７．８および９）よりも、特に油中木型エマルジョンに関連した安定化および有用性に関して、より一層注目すべき界面特性をもっているように思われる。

ペプチド１に基づいて、しかし同じ型のアミノ酸の置換を有するペプチドを合皮した。

これらのペプチドは以下の配列を有するニー（１４）　　　　ＮＦｉｘＪｅｒ− Ｔｒｐ−Ａユａ−Ｇｌｕ−ＡＬａ−Ｌａｕ−５ｅｒ−Ａｒｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌａｕ−へユａ−へｒｚ−，Ａｌａ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−ＣＯＯＨ（塩基性ニー　ペプチド１の両方のＬｙｓ！Ｉ基をＡｒｇで置換した）（塩基性ニー　両方のＬｙｓをＨｉｓで置換）（１６）　　Ｎ１（ｚ−５ｅｒ− Ｔｒｐ−，４１ｍ−、Ａｓｐ−Ａｊ、ａ−Ｌａｕ−５ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−５ｅｒ−Ｌａｕ−、Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＡＬａ−Ｌｅｕ−５ａｒ− ＣＯＯＨ（ａ性ニー　両方のＧ　ｌ　１１をＡｓｐでｔ換）Ｇｌｕ−τｈｒ−Ｌｅｕ−、Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌ、ａｕ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（電荷をもたず親木性ニー　４個のＳｅｒ全部を’ｒ　ｂ　ｒで置換）（１ｇ　）　ｓＨｚ−ＧＬｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌａｕ−Ａｉａ−Ｌｙｇ−、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｃｏｏｌ（（電荷をもたず親水性ニー　４個のＳｅｒ全部をＧｌｎで置換）（１９）　Ｎ１（ｔ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｒｌ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−，４ｓｎ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ −Ａｌａ−Ｌｅｕ−、Ａｓｎ−Ｃ００Ｈ（電荷をもたず親水性ニー　４個のＳｅｔ全部をＡｓｎで置換）（２０）　Ｎ）ｉｔ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ａｉｍ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｌ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｌｙ＋−Ａｌｉ −Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｃｏｏｌ（（を荷をもたず親木性ニー　　４１１１のＳｅｔ全部をＭｅｔでＲ換）（２１）ＮＨｔ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−、Ａ１１−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ−Ｃｙｓ −Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ −Ｌａｕ−Ｃｙｓ−ＣＯＯＨ（電荷をもたず親水性ニー　　４＠のＳｅｒ全部をＣｙｓで置換）（２２）ＮＨｚ　−５ｓｒ−てｒｐ−Ｇｌツアー１ｕ−ＧｌアーＬｅｕ−８ｅｒ −Ｌア５−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−０１ｕ−３ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ −Ｌｅｕ−５ｅｒ−ＣＯＯＨ（小さい疎水性ニー　４個のＡｈａ全郁をＧｌｙで置換）（２３）　’ＫＨｚ　−５ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｃ１ｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−３ｅｒ−Ｌｙｉ　−Ｍａｌ　−Ｖａｌ−ＧＬｕ−５ｅｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ− Ｌｙｓ−Ａｌａ−ｖａＬ−８ｅｒ−ＣＯＯＨ（大きい疏水性ニー　５個のＬｅｕ全部をＶａｌでＲ換；Ｔｒｐはそのままにしておいた）（２”　ＮＨｚ−３ｅｒ−Ｔｒｐ−Ａ□ａ−Ｇｌｕ−Ａ□１−エ１ｅ−５ｅｒ− Ｌｙｓ−Ｉｃｅ−１１ｅ−Ｇｌｕ−３ｅｒ−工１ｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ− Ｘ１ｅ−８ｅｒ−Ｃｏｏｌ（大きい疎水性ニー　５＠のＬｅｕ全部をＩｌｅで置換；Ｔｒｐはその′ｆ：まにしχおいた）（２Ｓ　）　Ｎ）ｉｘ７ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−ＣＯＯＨ（大きい疎水性ニー　５個のＬｅｕ全部をＰｈｅで置換：Ｔｒｐはそのままにしておいた）（大きい疎水性ニー　５個のＬｅｕ全部をＴｒｐで置換）（２７）　？ＪＨｔ− Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−０１ｙ−Ａｓｐ７Ｇ１ｙ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｒト１１ｅ−１１ｅ−、Ａｓｐ−Ｔｈｒ−て１°ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒ、ｇ−Ｇ上ｒＪｌｅ−Ｔｈｒ −ＣＯＯＨ（全部の型を変えた）（２８）　ｊ）（ｚ７Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｃｉｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−τ ｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＣＯＯＨ（すべての未変化の側鎖は芳香族）ペプチド２６は特に大量の気泡を生成する。ペプチド１３．２５８よび２６は特に安定したエマルジ２ン（１８〜４１日間）を形成すると思われる。

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略号ＢＳＡ、ウシ血清アルブミンＳＤＳ　、ドデシル硫酸ナトリウムＴＦＥ；　トリフルオロエタノール浄書Ｃ内容に変更なし）ペアせト−７の構造のヘリ方ル本４−）し長示第　２　回マデイドＩのｉｌ造のヘリカルオ・ソ）嫂ホマア斗辷２／）構造０ヘリカルすイー１１．表示子４　ロズブ子ド２の柵迭のへリカルネリ）−＆ホ第５面Ｎデナド３／）構造のへリカルネイール慕贋第　７　凹公フロ＋ド４の４１　Ｌｔｎへリカルホイール兼示第　８　司ベア°＋ド４の構造ｎヘリカルｊ−／）裏示茶　ｑ　凹公プ子）′５の１道ねヘリカルボイー）冒し上第１Ｏ図べ゛フ゛斗ド５のｆｌｌ蓮のヘリガルオ、）（ホ公プ子ドロの揚遣のへ１１力ルホイール兼示第１２図気プＪＩ′ドロの楕遣内ヘリガルネフ１青示第１３回タデ千）−７β構道のへりカル古イール著ｄ１第１４回ゴアチ）−７の構造のヘリガル才・ソ１米示ｖ７１５回イブケｂ”ａｈ槙還０ヘリ刀ルホイール適示第１７凹閣ロロロベフ゛チ）　デ０桿遣の″Ｘ１１男ルホイール（テ。

芋しイと活　性　指数　（ｍ２／ν）０　　　　　　＋　　　　　　　へ〕　　　　　　　乙Ｄ　　　　　　　よ−（７１■３＆　　　　　　　　　　ＯＯ００００＋　φ 補正書の翻訳文提出書（特許法１８４条の８）平成　２年　５月７日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿２、発明の名称乳化剤３、特許出願人住　所　イギリス国バークシャー州アールジー２・９エイテイー。

リー云りグ、シンフィールド（番地なし）７名　称　アグリカルチュラル・アンド・フード・リサーチ・カランシル４、代理人住　所　　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル２０６区５ｏ補正書の提出日平成　２年　２月　８日平成　２年　２月１９日ではない。しかしながら、本発明はバックボーン残基の７０％より多くがｌ−へソックスを形成しうる化合物を包含する。

好ましくは、バックボーン残基の少なくとも８０％、９０％または９５％が、もしくはその金部がＣ−ヘリックスを形成することができる。非ヘリックス形成残基は好ましくはペプチドの両末端に位置する。こうして、代表的なｌ５−２０（１のアミノ酸から成るペプチドの場合、各末端に好ましくはたった２個の非ヘリックス形成残基が存在し、より好ましくは各末端に１債だけ存在し、最も好ましくは１つも存在しない。

好ましくは、全ポリペズチドは親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に沿って存在することが可能である。

親水性ドメインと疎水性ドメインを隔てる中間極性の軸方向ドメインが存在していてもよく、さらに１より多い親水性または疎水性ドメインが存在していてもよいが、親水性ドメインおよび疎水性ドメインはそれぞれ１つだけ存在し、中間極性のドメインは存在しないのが好ましい。疏水性ドメインはへす７クスによって規定される円（７）８０”−２８０”　（ｆｌ、ｔｌｆ１８０＠ｔ：たは２４０ ”）を占めることができる。

好ましくは、疎水性ドメイン中のアミノ酸は疏水相互作用による全体的な立体配置の安定化に寄与する。これは、アミノ酸が疎水性の側鎖をもつ場合に、特にそれらがロイシン、アラニン、またはぎ−ヘリックス中に見いだされる傾向が高いトリプトファンのような大きい芳香族グループである場合に、促進される。同様に、それほど１を要ではないが、親水性アミノ酸は３または４残基あいだをおいたアミノ酸間に分子内塩ｗＲ（ｓａＨｂｒｉｄ（ｃ）が形成されるように選択することが望ましい。適当なアミノ酸にはグルタミン酸、リシンおよびセリンが含まれる。

上記の基準を満たす既知ポリペプチドの乳化剤としての使用は本発明の一面を構成する。

この種のポリペプチドは乳化剤として作用することが見いだされた。ｌ−へソックスはポリペプチドの全部を構成することができ、機能性を最適化するためには往々にしてこれが好ましいが、別の部分が加わってもよい。

ただし、その部分は油／水界面に上記のような状態で位置するＩ−へソックス（または、好ましくは、分子全体）の能力を妨げないものである。

こうして、ペプチドのバックボーン中の非ヘリックス形成残基（それについての基準は先に論じた）のほかに、側鎖を形成するヘリックス形成または非ヘリックス形成アミノ酸もしくは他の基が存在してもよい。この種の側基はそれらが結合しているバックボーンアミノ酸と同じ親水性（ｂｙ＋１ｒａｐｈｉｌｉｃｉｔｙ）をもつべきである。好ましくは、このような側基の分子量は２００ダルトンより小さく、より好ましくは１００ダルトンより小さい。

好ましくは、ペプチドは少なくとも１１個のアミノ酸を含み、そしてＩ−ヘリックスは少なくとも４．５．６または７回転をもつことが好ましい。非常に長い分子はそれほど移動性でないと思われ、そのエマルジョン形成活性が低いだろう。

しかしながら、一般に、分子が長ければ長いほど、そのエマルジョン安定化性質は良くなるだろう。なぜならば、それが界面を去り、これにより芥面層を破壊するためには、それと界面との結合相互作用がすべて同時にこわされねばならないからである。はんの２または３回転のペプチドはそれより長いペプチドの優れた乳化活性をもたないが、それでも食品の乳化剤として使用される蛋白質に活性の点で類似しており、従ってこれらのペプチドも有用でありうる。

よ　　　　　　　　　　　　　　請求の範囲と１　　　　１、軸方向の親水性ドメインおよび疎水性ドメインをもつｌ−へソックスを形成しうる少なくとも１つの領域から実質的に成り、これにより前記領域は親水性ドメイン　　　　ンが水相にそして疏水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に存在することができ、前記ｔ−ヘリックスが〉　　　少なくとも２回転を有するポリペプチドの工業的方法または工業製品における乳化剤としての使用。

２、ポリペプチド全体が油／水界面に沿って存在することができ、その際親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある、請求項１記載の使用。

３゜疎水性ドメイン１つ、親水性ドメイン１つがあるだけで、中間圧性のドメインはない、請求項１または２記載の使用。

４、疎水性ドメインはへソックスにより規定される円の８０＠〜２８０’を占める、請求項３記載の使用。

５、疏水性ドメインは円の少なくとも１８ｏ０を占める、請求項４記載の使用。

６、疎水性ドメインは円の少なくとも２４ｏ６を占める、請求項５記載の使用。

７、Ｅｌ水性ドメインは疎水相互作用による全体的な立体配置の安定化に寄与する、請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。

８、親水性アミノ酸は３または４残基あいだをおいＩ；アミノ酸間に分子内塩橋を形成するようなものである、請求項１〜７のいずれが１項記載の使用。

９、少なくとも８０％のバックボーンアミノ酸はへソックス形成配列中に存在する、請求項１〜８のいずれが１項記載の使用。

１０、ペプチド中に少なくとも１１（１ｉのアミノ酸が存在し、ｌ−ヘリックスは少なくとも４回転を有する、請求項１〜９のいずれかｌｑｌ、記載の使用。

１１、以下のペプチド：（Ｌ）　Ｎ１（２−５ｉｒ−τ巧−λ１ａ−Ｇｌｕ−λ１ａ−Ｌａｕ−５ａｒ− Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｌａｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａ１ａ４ａｕ−５ａｒ−ＣＯＯＨ（５）　ＮＢ２−５ｅｒ−Ｔｑ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−５ａｒ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−（７１Ｎ！（２−３＠ｒ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−λ１ａ−Ｌａｕ−５ｓｒ−Ｌｙｓ＝Ｌａｕ−Ｌａｕ−Ｇｌｕ−（Ｌ’、ｌ　　　　　ＮＢ２−５Ｂｗ−”：；ｐ−λユａ−ｑユＵ−λユ＆−Ｌ６ｕ−５ｅｒ−Ａｒｑ−Ｖａｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌａｕ−ＡＪ上−ＬＹＳ−λ１ａ−Ｌａｕ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（１Ｂ）　　　Ｎ’Ｈ２−Ｇｌｒｘ−Ｔｑ−Ａｕａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｓｕ−に１ｎ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ−Ｌｓｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｌｓｕ−λユａ−Ｌｙｓ−Ａユａ−乙ａｕ−Ｇｌｎ−ＣＯＯＨ（１９）　　　間２−λｓｒ＋−’Ｔ＝ｐ−Ａｌａ−Ｇｉｕ−Ａｌａ−Ｌａｕ−Ａｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌａｕ４ｅｕ−Ｇｉｕ−Ａｓｎ−Ｌａｕ−ノーユａ−Ｌ＋ｙＳ−λｌａ−Ｌｅｕ−Ａｊｎ−Ｃｏ（Ｍ！（２０）　　　Ｎ’ｈ　２ −Ｍｓ　ｅ　−Ｔ″：′ｐ−Ｊ２−Ｇ　１ｕ−Ａｌａ−Ｌ’ａｕ　−Ｍｅ　ｔ　 −Ｌ”１’Ｂ　−ｒ−ｅｕ−、ａ普| Ｇｉｕ＝Ｍａｔ−ＴＪｅｕ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−λｌａ−Ｌａｕ−Ｍｅｔ−Ｃｏｏｌ（２１）　　　冊２−Ｃｙｓ−’Ｋ”ｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｉａ−Ｌｓｕ− Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌａｕ−（２５）　　　ＮＢ２−５ｅｒ−Ｔ；−Ａｊ −ａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−５ａ＝−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｊ、ａ−Ｐｈｅ−５ａｒ−ＣＯＯＨ（２５）　　　　　　’ＭＴＺ２−５＠！ニーＴ二９−Ａユａ−Ｇｌｕ−ＡＪ、ｌ−Ｔ　二Ｐ−５ｅｒ−Ｌ　ＹＳ−Ｔ　ごｐ−Ｔｒｐ−Ｇコ、ｕ−Ｔｑ、ｒ＝−Ｐｈｅ− Ｔｙｒ−乙ｙｓ−’！”、４−Ｐｈａ−Ｔｙｒ−ＣＯＯＨおよび（ｉ）Ｇ＋ｎｆＧｌｕにまｌ；はＧ　Ｉ　ｕをＧ　ｌ　＋ｉに置き換えるおよび／または（ｉｉ）ＡｓｎをＡｓｐにまたはＡｓｐをＡｓｎＩ：ｉｔｇ換えるおよび／′まｔ；は（ｉｉｉ）ペプチドの各末端１７２個までの非ヘリックス形成アミノ酸が存在する前記ペプチドの変異型よう成る群から選ばれるポリペプチド。

１２．乳化剤としての請求項１１記載のポリペプチドの使用。

１３、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドを乳化剤として含む人造コロイド系。

１４、請求項１１記載のポリペプチドを、ペプチド合成により、またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換されかつ前記配列を発現できる宿主細胞を培養することにより、あるいは天然または非天然蛋白質もしくはポリペプチドの化学的切断または蛋白質加水分解切断により製造する方法。

１５、請求項１〜１０のいずれか１９！Ｌ記載のポリペプチドを、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換されかつ前記配列を発現する能力のある宿主細胞を培養することにより製造する方法。

１６、請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。

１７、軸方向の親水性ドメインおよび疎水性ドメインをもつＣ−へソックスを形成しうる少なくとも１つの領域から実質的に成り、これにより前記領域は親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に存在することができ、前記ζ−へソックスが少なくとも２回転を有するペプチドであって、１１〜１４個のアミノ酸残基から成り、少なくとも４回転を有することを特徴とする上記ペプチド。

ＰＣＴ／ＧＢ８８１００９６９２、発明の名称乳化剤３、補正をする者事件との関係　　　特許出願人住所名　称　　アグリカルチュラル・アンド・フード・リサーチ・住　所　　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区電話３２７０−６６４１〜６６４６５、補正命令の日付　　平成　３年　１月２２日　溌送日）６、補正の対象（３）ｆ面翻訳文国際調査報告ｍ−−−−ｎ−ｍＡｓ＊＋ｍ−＋−ｅＩＩＮｅ、ＰＣＴ／ＧＢ　８Ｂ１００９６９国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．軸方向の親水性ドメインおよび疎水性ドメインをもつ■−ヘリックスを形成しうる少なくとも１つの領域から実質的に成り、これにより前記領域は親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある状態で油／水界面に存在することができ、前記■−ヘリックスが少なくとも２回転を有するポリペプチド。２．ポリペプチド全体が油／水界面に沿って存在することができ、その際親水性ドメインが水相にそして疎水性ドメインが油相にある、請求項１記載のポリペプチド。３．疎水性ドメイン１つ、親水性ドメイン１つがあるだけで、中間極性のドメインはない、請求項１または２記載のポリペプチド。４．疏水性ドメインはヘリックスにより規定される円の８０°〜２８０°を占める、請求項３記載のポリペプチド。５．疎水性ドメインは円の少なくとも１８０°を占める、請求項４記載のポリペプチド。６．疎水性ドメインは円の少なくとも２４０°を占める、請求項５記載のポリペプチド。７．疎水性ドメインは疎水相互作用により全体的な立体配置の安定化に寄与する、請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチド。８．親水性アミノ酸は３または４残基あいだをおいたアミノ酸間に分子内塩橋を形成するようなものである、請求項１〜７のいずれか１項記載のポリペプチド。９．少なくとも８０％のバックボーンアミノ酸はヘリックス形成配列中に存在する、請求項１〜８のいずれか１項記載のポリペプチド。１０．ペプチド中に少なくとも１１個のアミノ酸が存在し、■−ヘリックスは少なくとも４回転を有する、請求項１〜９のいずれか１項記載のポリペプチド。１１．以下のペプチド：（１）【配列があります】（２）【配列があります】（３）【配列があります】（４）【配列があります】（５）【配列があります】（６）【配列があります】（７）【配列があります】（８）【配列があります】（９）【配列があります】（１０）【配列があります】（１１）【配列があります】（１２）【配列があります】（１３）【配列があります】（１４）【配列があります】（１５）【配列があります】（１６）【配列があります】（１７）【配列があります】（１８）【配列があります】（１９）【配列があります】（２０）【配列があります】（２１）【配列があります】（２２）【配列があります】（２３）【配列があります】（２４）【配列があります】（２５）【配列があります】（２６）【配列があります】（２７）【配列があります】（２８）【配列があります】および（ｉ）ＧｌｎをＧｌｕにまたはＧｌｕをＧｌｎに置き換えるおよび／または（ｉｉ）ＡｓｎをＡｓｐにまたはＡｓｐをＡｓｎに置き換えるおよび／または（ｉｉｉ）ペプチドの各末端に２個までの非ヘリックス形成アミノ酸が存在する前記ペプチドの変異型より成る群から選ばれるポリペプチド。１２．乳化剤としての請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドの使用。１３．請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドを乳化剤として含む人造コロイド系。１４．請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドを、ペプチド合成により、またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列で形質転換されかつ前記配列を発現できる宿主細胞を培養することにより、あるいは天然または非天然蛋白質もしくはポリペプチドの化学的切断または蛋白質加水分解切断により製造する方法。１５．請求項１〜１１のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。