DE69233695T2 - Gentechnologisch hergestellte glutaminase und ihre verwendung in therapie - Google Patents

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Description

  • FACHGEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die für eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Verwendung von Glutaminase zur Verminderung von Glutamin in Tumortragenden Wirten bietet ein attraktives Verfahren zum Attackieren von Krebszellen. Glutamin nimmt eine bedeutende Rolle bei der Biosynthese zahlreicher Zellmetabolite ein. Im Vergleich zu normalen Geweben ist von einigen Neoplasmen gezeigt worden, dass sie bei einem geringfügigen Level an verfügbarem Glutamin aufgrund einer verminderten Synthese und gesteigerten Verwertung wachsen (Levintow, 1954, J. Nat. Cancer Inst. 15:347-352; Roberts, et al., 1960, Amino Acids, Proteins and Cancer Biochemistry (J.T. Edsall, Hrsg.), Academic Press, New York, NY, Seiten 121-145; Weber, G., 1983, Cancer Res. 43:3466-3492; Sebolt, et al., 1984, Life Sci. 34:301-306). Experimente haben eine negative Korrelation zwischen dem Glutamingehalt und der Wachstumsrate von transplantierten Rattenleber-Tumoren aufgezeigt. Es wurde festgestellt, dass die in vivo Glutaminkonzentration in Hepatom 3924A neunmal niedriger (0,5 mM) als in der Leber (4,5 mM) und niedriger als in allen anderen Rattengeweben (2 bis 5 mM) war (Weber, 1983, Cancer Res. 43:3466-3492). Die in den letzten Jahren gesammelten Daten zeigen, dass Glutamin eine bedeutende stoffliche Quelle für die zelluläre Energie in verschiedenen Neoplasmen, einschließlich hämatopoietischer Tumoren, Hepatomen, Ehrlich-Karzinom und HeLa-Zellen, darstellt (Abou-Khalil, et al., 1983, Cancer Res. 43:1990-1993; Kovacevic, et al., 1972, J. Biol. Cem. 33:326-333; Kovacevic, 1971, Biochem. J. 125:757-763; Reitzer, et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:2669-2676).
  • L-Asparaginase, das erste Enzym, das als ein Antitumormittel im Menschen intensiv untersucht worden ist, ist bei der Behandlung der akuten Lymphoblastenleukämie hoch wirksam. Allerdings zeigt dieses Enzym eine geringe oder keine Aktivität gegen andere Neoplasmen im Menschen. Das Enzym Glutaminase besitzt eine Aktivität gegen ein viel breiteres Spektrum von Krebsen als Asparaginase.
  • Mehrere Glutaminase- und Glutaminase-Asparaginase-Enzyme von Säugetieren und Mikroorganismen sind gereinigt und charakterisiert worden. Von diesen scheint Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase aufgrund ihrer geringen KM für Glutamin (mikromolarer Bereich), ihrer guten Stabilität und Aktivität in einem physiologischen Milieu und einer langen Plasma-Halbwertszeit in Tumor-tragenden Wirten für eine therapeutische Verwendung am geeignetsten zu sein (Roberts, 1976, J. Biol. Chem. 251:2119-2123, und Roberts, et al., 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054).
  • Die bekannten Säuger-Glutaminase-Enzyme sind für eine Verwendung als Therapeutika aufgrund ihrer hohen KM-Werte (millimolarer Bereich) und ihres Bedarfs an Phosphatestern oder Malat für ihre Aktivierung nicht geeignet. Die E. coli Glutaminasen (A und B) sind ebenfalls für eine therapeutische Verwendung aufgrund ihrer hohen KM-Werte (millimolarer Bereich), ihrer geringen Aktivität bei physiologischem pH (Glutaminase A) oder des Bedarfs an speziellen aktivierenden Substanzen (Glutaminase B) nicht geeignet.
  • Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase besteht aus vier identischen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von ungefähr 35.000. Sedimentationsuntersuchungen mit dem aktiven Enzym zeigen, dass die katalytische Aktivität mit dem Tetramer verbunden ist; es werden keine kleineren aktiven Arten beobachtet (Holcenberg, et al., 1976, J. Biol. Chem., 251:5375-5380). Das gereinigte Enzym besitzt ein Verhältnis von Glutaminase- zu Asparaginase-Aktivität von ungefähr 2:1. Bindungsuntersuchungen mit C14-markierten Analoga von Glutamin (6-Diazo-5-oxo-L-norleucin; DON) und Asparagin (6-Diazo-5-oxo-L-norvalin; DONV) lassen vermuten, dass die beiden Analoga bevorzugt mit den Hydroxylgruppen an zwei verschiedenen Stellen auf dem Protein reagieren und dass die beiden Bindungsstellen gemeinsam als Teil der aktiven Stelle wirken (Holcenberg, et al., 1978, Biochemistry 17:411-417).
  • Es wurde gezeigt, dass Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase eine beträchtliche antineoplastische Aktivität gegen verschiedenen Nager-Leukämien (L1210, C1498, EARAD/1), Aszitestumoren (Taper-Leber, Ehrlich-Karzinom, Meth A Sarkom, S 180) und bestimmte feste Tumoren (Walker 256 Karzinosarkom, B16-Melanom) besitzt. Zusätzlich wurde festgestellt, dass ein Antagonismus von Glutamin durch Glutamin-Analoga und Glutaminase stark hemmend auf humane Darm-, Brust- und Lungenkarzinome, die in athymischen Mäusen wachsen, wirkt (McGregor, 1989, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30:578; Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054; Ovejera, 1979, Cancer Res. 39:3220-3224; Houchens, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:473-476; Duvall, 1960, Cancer Chemother. Rep. 7:86-98).
  • Ein wichtiges Charakteristikum der Glutaminase-Therapie ist, dass resistente Stämme sich nach wiederholten Behandlungen mit diesem Enzym nicht entwickeln (Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054). Es wurde ebenfalls gezeigt, dass eine Behandlung mit Glutaminase die Entwicklung einer Resistenz gegen Methotrexat verzögert (Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054).
  • Es ist gezeigt worden, dass eine bioaktive Glutaminase-Asparaginase retrovirale Erkrankungen der Maus hemmt. Eine Glutaminverarmung hemmt stark die Replikation des Rauscher-Maus-Leukämie-Retrovirus (RLV) in vitro. Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase (PGA), das in der Lage ist, Glutamin und Asparagin für längere Zeiträume zu verringern, wurde verwendet, um die therapeutische Wirksamkeit einer Glutaminverarmung in mit RLV oder Friend-Virus infizierten Mäusen zu bestimmen. Während einer PGH-Behandlung virämischer Tiere fiel die Aktivität der reversen Transkriptase auf Kontrolllevels und infizierte Tiere entwickelten keine Splenomegalie. Die mit PGA erhaltenen Therapieresultate sind noch besser als diejenigen, die mit Azidothymidin erhalten werden, das mit 30 mg/kg/Tag intraperitoneal gegeben wird (Roberts, 1991, Journal of General Virology, 72,299-305).
  • Trotz der Hoffnungen, die Glutaminase als Therapeutikum erweckt, sind gegenwärtig keine therapeutisch einsetzbaren Glutaminasen verfügbar, die preiswert und mit geringen oder frei von Verunreinigungen mit anderen Substanzen, zum Beispiel mit Endotoxinen eines Wirtsmikroorganismus, hergestellt werden können. Darüber hinaus ist kein geeignetes Enzym in Mengen verfügbar, die groß genug wären, um umfangreiche klinische Versuche zu ermöglichen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer E. coli-Zelle, die eine therapeutisch geeignete Glutaminase umfasst.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines DNA-Moleküls, das eine therapeutisch geeignete Glutaminase codiert.
  • In einer Anwendungsform stellt die Erfindung eine E. coli-Zelle bereit, die ein Gen umfasst, welches die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
  • Eine weitere Anwendungsform der Erfindung stellt ein isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül bereit, das die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
  • Die Erfindung stellt ebenfalls einen Vektor bereit, der ein DNA-Molekül umfasst, das die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
  • Die Erfindung stellt außerdem die Verwendung eines DNA-Moleküls, das die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs bereit.
  • Die vorliegende Erfindung liefert folglich der Technik neue und zweckdienliche Antitumor-Therapeutika sowie auch Werkzeuge für ihre Herstellung und Verfahren für ihre Verwendung.
  • Die Klonierung und Expression des Gens, das die Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase in E. coli codiert, steigert die pro Liter Kultur produzierte Glutaminase auf wenigstens das 12-fache, bezogen auf die Ausbeute in Pseudomonas 7A. Dies senkt deutlich die Produktionskosten von Glutaminase und ermöglicht ausgedehnte klinische Versuche. Außerdem wird durch die Produktion von Glutaminase in E. coli eine Kontamination des Antitumormedikaments mit hoch toxischem Pseudomonas Endotoxin vermieden.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • 1 zeigt die Nukleotidsequenz und davon abgeleitete Aminosäuresequenz des Pseudomonas 7A Glutaminase-Gens. Der obere Strang der codierenden DNA-Sequenz ist von 5' → 3' gezeigt. Die angeführten Nummern bezeichnen die Nukleotid-Basenpaare. Die abgeleitete Peptidsequenz steht unter der DNA-Sequenz. Der veränderte N-terminale Methioninrest ist nicht gezeigt.
  • 2 veranschaulicht die Sequenzierungsstrategie für das Pseudomonas 7A Glutaminase-Gen. 2A: Karte der P7A-Glutaminase, welche die ausgewählten Restriktionsstellen zeigt, wobei der schattierte Bereich die Region darstellt, die das tatsächliche Genprodukt codiert. Der schattierte Bereich stellt 100 bp dar. Die Pfeile in der Figur unten zeigen die ungefähren Positionen und Richtungen der Sequenzierungsprimer mit ihren mitangeführten Bezeichnungen. Die Pfeile mit Endmarkierungen geben den Umfang und die Richtung der einzelnen Sequenzierungsexperimente wieder. 2B: Bezeichnungen, Sequenzen und Koordinaten der Sequenzierungsprimer werden gezeigt. Die Nummerierung geht von dem AAG aus, das den N-terminalen Lysinrest codiert.
  • 3A zeigt rekombinante Konstrukte mit P7A-Glutaminase. „Apr" ist ein β-Lactamase-Gen, das eine Ampicillin-Resistenz verleiht. „T" steht für einen Transkriptionsterminator. „Ptac" ist der Promotor. „ori" ist der pBR322 Replikationsursprung.
  • 3B zeigt die Konstruktion eines die P7A-Glutaminase überexprimierenden Plasmids.
  • 4 zeigt eine denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Rohextrakten. Spur 1 zeigt eine nicht-induzierte Kontrolle und Spuren 2-4 zeigen Induktionen in Gesamtzellextrakten. Der Pfeil deutet auf die Position der induzierten Glutaminase-Bande.
  • 5 veranschaulicht die Induktion durch IPTG einer PGH-Expression in E. coli, das pME18 enthält.
  • 6 zeigt eine Hybridisierung heterologer DNA an Pseudomonas 7A Glutaminase-Sequenzen. Spur 1, Pseudomonas 7A; Spur 2, Pseudomonas aeruginosa; Spur 3, Achromobacter sp.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Entdeckung der vorliegenden Erfindung ist, dass Glutaminase-Enzyme in Wirtsorganismen trotz der hinderlichen Wirtszell-Toxizität molekular kloniert werden können. Die Glutaminase-Aktivität muss, aufgrund ihrer Toxizität für die Wirtszellen, in diesem Prozess streng reguliert werden. Die Anmelder haben festgestellt, dass mit Hilfe eines Promotors, der für die Expression eines stromabwärts liegenden Gens induziert werden muss, wie auch durch die Verwendung von Transkriptionsterminatoren, die sowohl 5' als auch 3' zu dem Gen liegen, die Glutaminase-Aktivität in der Wirtszelle auf ein hinreichendes Ausmaß für die Wirtszellen kontrolliert werden kann, um ohne einen Verlust der DNA, welche Glutaminase codiert, zu überleben. Wenn die molekularen Klone in den erwünschten Wirtszellen exprimiert werden, kann Glutaminase ohne eine Kontamination mit Endotoxinen produziert werden. Eine weitere Entdeckung der vorliegenden Erfindung ist, dass Glutaminase eine hemmende Aktivität auf die Replikation des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) in infizierten Zellen besitzt. Darüber hinaus ist festgestellt worden, dass, wenn Glutaminase mit Antitumor-Antikörper komplexiert und an Tumorzellen verabreicht wird, das Wachstum der Tumorzellen in einem Ausmaß gehemmt wird, das die Hemmung entweder durch Glutaminase oder Antikörper allein weit übertrifft.
  • Glutaminase-Enzyme sind therapeutisch geeignet, wenn sie eine hohe Enzymaktivität bei physiologischem pH, d.h. zwischen etwa pH 6,5 und 8,5, zeigen. Therapeutisch geeignete Glutaminase-Enzyme müssen eine niedere KM, d.h. zwischen 10-6 und 10-4 M, aufweisen. Weitere erwünschte Eigenschaften der Glutaminase-Enzyme für eine therapeutische Verwendung umfassen:
    • 1. Hohe Stabilität bei physiologischem pH.
    • 2. Beibehaltung der hohen Aktivität und Stabilität in Blut und Serum von Tier und Mensch.
    • 3. Langsame Elimination aus dem Kreislauf, wenn es in Mensch und Tier injiziert wird. Eine Plasma-Halbwertszeit (t1/2) für Glutaminase von mehr als sechs Stunden in Mäusen und sechzehn Stunden in Menschen ist erwünscht.
    • 4. Keine starke Hemmung durch die Produkte, deren Reaktion sie katalysiert, oder durch andere Bestandteile, die normalerweise in Körperflüssigkeiten vorgefunden werden.
    • 5. Cofaktoren oder prosthetische Gruppen, die leicht von dem Enzym dissoziieren können, sind nicht erforderlich.
    • 6. Enge Substratspezifität.
    • 7. Wirksame Irreversibilität der Enzymreaktion unter physiologischen Bedingungen.
    • 8. Ist von einem Organismus verfügbar, der geringe Endotoxinlevels enthält.
    • 9. Geringe Immunogenität.
  • Mehrere Aminosäure-abbauende Enzyme, die keine Antitumor-Aktivität zeigen, versagen ebenfalls darin, wenigstens eines dieser Kriterien zu erüllen. Zum Beispiel besitzt E. coli Glutaminase ein pH-Optimum von 5 und weist im Wesentlichen keine Aktivität bei einem physiologischen pH auf. Eine unwirksame Form von E. coli Asparaginase besitzt eine KM über 1 mM. Asparaginase-Enzyme von Hefe, Bacillus coagulans und Fusarium tricinctum weisen alle übermäßig hohe Clearance-Raten in Mäusen auf.
  • Die Nukleotidsequenz eines derartigen therapeutisch geeigneten Glutaminase-Gens, das kloniert wurde, ist in SEQ ID NR. 1 gezeigt. Es stammt von dem Organismus Pseudomonas 7A (P7A). Die intakte codierende Region umfasst 1008 Rasenpaare und codiert eine zusammenhängende Polypeptidsequenz von 336 Aminosäuren (eine mutmaßliche Signalsequenz von 24 Aminosäuren ist nicht enthalten). Der C-Terminus wird von hintereinander liegenden Stoppcodons und einem mutmaßlichen Transkriptionsterminator durchsetzt.
  • Die P7A Glutaminase-Sequenz, die hier offen gelegt ist, kann zur Identifizierung ähnlicher Sequenzen, die ähnliche Proteine codieren, eingesetzt werden. (Siehe Watson, J.D., et al., in „Molecular Biology of the Gene," Benjamin/Cummings Publishing Company Inc., Menlo Park CA, Bd. I, Seite 608 (1987)). Zum Beispiel können Southern-Hybridisierungsexperimente durchgeführt werden, in denen DNA von prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen mit der gesamten oder einem Teil des Glutaminase-Gens der vorliegenden Erfindung besondet wird. Typische Sonden enthalten wenigstens etwa 15 Basen der Glutaminase-Sequenz, um sicherzustellen, dass andere nichtverwandte Sequenzen nicht hybridisieren. Eine hinreichend hohe Temperatur und geringe Salzkonzentrationen vermindern außerdem eine Hybridisierung nichtverwandter Sequenzen. Bei Anwendung derartiger Techniken sind Gene festgestellt worden, die zu dnaA von E. coli in Pseudomonas putida (Ingmer und Atlung, Mol. Gen. Genet. 232, 431 (1992)) und zu ras in einer Reihe eukaryotischer Organismen (Matsui, Gene 76:313 (1989) und Hori, Gene 105:91 (1991)) homolog sind. Es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass DNA-Sequenzen, die an die P7A-Glutaminase-DNA hybridisieren, Gene repräsentieren, die Enzyme ähnlicher Funktion codieren. Gene, die mit Hilfe dieser Technik isoliert werden, können exprimiert werden, und die Enzyme können getestet werden, um zu bestimmen, ob sie für die P7A-Glutaminase identifizierte erwünschte Charakteristika ebenfalls aufweisen.
  • Die Sonden können, wie es in der Technik bekannt ist, unter Verwendung der genauen Nukleotidsequenzen, die hier für das P7A-Glutaminase-Gen offen gelegt sind, oder basierend auf der Aminosäuresequenz des Enzyms konstruiert werden. So kann es folglich für einige Zwecke erwünscht sein, degenerierte Sonden zu verwenden, d.h. ein Gemisch von Sonden, deren Sequenzen dieselben Aminosäuren codie ren, aber andere Codons enthalten. Die Verwendung derartiger Sonden sollte ein breiteres Spektrum zu identifizierender homologer Gene erlauben.
  • Unter Verwendung der DNA-Sequenz der P7A-Glutaminase (PGA) ist es nun möglich, weitere Glutaminase-Gene von anderen Organismen unter Anwendung der Komplementationsklonierung zu erhalten. Dies ist eine Technik, die selbst dann angewandt werden kann, wenn es keine Kreuzhybridisierung oder immunologische Kreureaktivität zwischen zwei Glutaminase-Genen oder Proteinen gibt. Siehe Kranz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6629 (1990). Im Allgemeinen wird der Zielorganismus mutagenisiert und Mutanten werden nach ihrem Unvermögen selektiert, Glutamin als eine Kohlenstoff- und/oder Stickstoffquelle zu nutzen. Eine Transformation mit der P7A-Glutaminase sollte die Giutaminverwertung bei einigen selektierten Mutanten wieder herstellen. Diese Organismen sollten Mutationen in einem zu PGA homologen Gen enthalten. Eine Reversion dieses mutierten Phänotyps durch Einführung von DNA, die aus Wildtyp-Organismen isoliert ist, kann dann als ein Assay für eine Durchmusterung auf das PGA-Homolog verwendet werden.
  • Bei Bereitstellung der Aminosäuresequenz des Glutaminase-Gens von P7A, wie in SEQ ID NR. 2 gezeigt, können Antikörper einfach erhalten werden. Diese können unter Verwendung von Peptidfragmenten oder des vollständigen Proteins als Immunogene gezüchtet werden. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, wie es für den bestimmten Zweck erwünscht ist. Die Antikörper können für eine Durchmusterung von Stämmen auf verwandte Enzyme, für eine Quantifizierung der in einer Zelle vorhandenen Enzymmenge und für eine Detektion molekularer Klone von einer Klonbibliothek verwendet werden.
  • Die Glutaminase-Gene gemäß der vorliegenden Erfindung können ohne weiteres modifiziert werden, um ihre Kompatibilität mit dem Wirtsorganismus zu erhöhen. Zum Beispiel variiert die Codonverwendung von einem zum anderen Organismus. Um die Expressionseffizienz der Glutaminase zu steigern, kann es deshalb erwünscht sein, die Codons zu verändern, um sie dem Codonverwendungsmuster des Wirts anzugleichen. Derartige Änderungen würden nicht die Aminosäuresequenz der Glutaminase sondern nur die Gensequenz verändern. Derartige Änderungen können mit be liebigen in der Technik bekannten Mitteln erreicht werden, zum Beispiel kann die Oligonukleotid-spezifische Mutagenese eingesetzt werden, um Änderungen in eine Gensequenz einzuführen. Alternativ kann das gesamte Gen synthetisiert werden.
  • Natürliche Glutaminase umfasst ein Sekretionssignal, d.h. eine N-terminale Aminosäuresequenz von etwa 20 Aminosäuren, die für die Sekretion durch die Zellmembran in das Periplasma verantwortlich ist. Unter manchen Bedingungen kann es von Vorteil sein, eine Signalsequenz in ein Glutaminase-Expressionskonstrukt einzufügen. Die natürliche Signalsequenz kann genutzt werden, oder andere Signalsequenzen können auf die reife Glutaminase-Signalsequenz übertragen werden, um die Sekretion des Enzyms zu erreichen. Eine Verwendung einer Signalsequenz kann für die Glutaminase-Expression von Vorteil sein, weil sie die toxische Wirkung auf die Wirtszelle vermindern kann. Eine Signalsequenz, die verwendet werden kann, ist das E. coli ompT-Signal. Dieses Signal, wie auch andere, ist in der Technik gut bekannt. Die Sekretion der Glutaminase aus der Wirtszelle kann eine Reinigung des Enzyms erleichtern und sollte zur Bildung und Wiedergewinnung der authentischen Glutaminase führen.
  • Induzierbare Promotoren sind für eine Glutaminase-Expression aufgrund der inhärenten Enzymtoxizität für lebende Zellen erwünscht. Einige induzierbare Promotoren, die verwendet werden können, sind lac, tac, trp, mal und PL. Die Auswahl eines Promotors liegt im Rahmen der Fachkenntnis.
  • Transkriptionsterminatoren sind ebenfalls sowohl 5' als auch 3' bezüglich des Glutaminase-Gens erwünscht, um ein „Durchlesen" der Expression zu vermeiden. Viele Terminatoren sind bekannt und können eingesetzt werden. Für eine Übersicht siehe Watson, J.D., et al., in „Molecular Biology of the Gene," Benjamin/Cummings Publishing Company Co., Menlo Park, CA, Bd. I, Seiten 377-379 (1987). Ein Terminator, den die Anmelder als zweckdienlich befunden haben, ist derjenige des Phagen T7.
  • Modifikationen des Glutaminase-Gens wurden zwecks Erleichterung der Produktion des Enzyms in E. coli durchgeführt. In einem derartigen modifiziertem Gen wird Methionin am N-Terminus des reifen Proteins addiert. In einem anderen derartigen modifizierten Gen wurden Methionin, Asparagin und Serin am N-Terminus des reifen Proteins addiert. Keine dieser Additionen zerstörte die Enzymaktivität oder Substratspezifität. Andere ähnliche Änderungen, welche die Enzymfunktion nicht signifikant beeinträchtigen, können im Rahmen der Erfindung erwogen werden.
  • Es kann erwünscht sein, die Struktur der Glutaminase zu modifizieren, um ihre therapeutischen Eigenschaften zu verbessern oder ihre Produktion zu erleichtern. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, Abschnitte des reifen Proteins durch vorzeitiges Abbrechen oder gezielte Deletionen zu eliminieren, und Abschnitte zu eliminieren, die für die Enzymfunktion nicht essentiell sind. Ein kleineres Protein kann zum Beispiel für einen verbesserten therapeutischen Index aufgrund seiner erhöhten Permeabilität in Tumorgeweben sorgen. Ähnlicherweise können ebenfalls Punktmutationen erwogen werden, die Therapie- oder Produktionscharakteristika verbessern. Diese können mit Hilfe einer spezifischen oder zufälligen Mutagenese, wie es in der Technik bekannt ist, oder mit Hilfe der thermozyklischen mutagenen Amplifikation erreicht werden.
  • Zusätzlich kann es erwünscht sein, chimäre Proteine von Glutaminase und anderen Proteinen zu produzieren. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, Antitumor-Antikörper codierende Gene mit dem Glutaminase-Gen der vorliegenden Erfindung zu fusionieren. Wie hier gezeigt, können kovalente Komplexe dieser Proteine zu drastischen Synergieeffekten bei Blockierung des Wachstums von Tumorzellen führen. Es kann für die Produktion von Vorteil sein, derartige Komplexe eher als ein chimäres Protein zu produzieren als die beiden Proteine in vitro posttranslational miteinander zu verknüpfen. Die Fusionierung des Glutaminase-Gens an andere Gene wird auch in der vorliegenden Erfindung erwogen, wie beispielsweise ein Fusionieren an Gene, die Gewebe- oder Tumorspezifische Liganden codieren, um die Glutaminase in eine erwünschte Körperregion leichter zu lenken.
  • Die vorliegende Erfindung bietet die Möglichkeit, eine Asparaginase-freie Glutaminase zu erhalten, die gegenüber Glutaminase-Asparaginase-Enzymen über therapeutische Vorteile verfügt, da L-Asparagin als ein kompetitiver Inhibitor des Glutamin-Abbaus dient. Eine Elimination der Asparaginase-Aktivität von diesem Enzym kann ebenfalls die Toxizität für den Wirt vermindern. Gegenwärtig sind keine therapeutisch zweckdienlichen Glutaminasen verfügbar, die keine Asparaginase-Aktivität besitzen.
  • Eine Inaktivierung der Asparagin-Bindungsstelle von P7A-Glutaminase ohne Beeinträchtigung der Glutamin-Bindungsstelle kann erreicht werden, da Bindungsuntersuchungen mit Glutamin- und Asparagin-Analoga, DON beziehungsweise DONV, zeigen, dass die Glutamin- und Asparaginstellen nicht identisch sind, obwohl sie räumlich eng zusammenliegen. DON bindet irreversibel das Threonin an Aminosäure 20, wohingegen DONV an einen Threonin- oder Serinrest in einer anderen Region des Proteins zu binden scheint. Die entsprechende ortsspezifische Mutagenese der klonierten DNA kann gemäß Standardtechniken ausgeführt werden (Molecular Cloning, a laboratory manual – Sambrook et al. – Buch 2, 2. Ausgabe, 1989, Seiten 15.80-14.113, Site-directed Mutagenis of Cloned DNA).
  • Mit Hilfe von Oligonukleotid- und Deletionsmutagenese kann ein Enzym erhalten werden, das hinreichend klein ist, um eine verbesserte Penetrabilität von Tumoren und Virus-infiziertem Gewebe im extravaskulären Raum zu erreichen. Es kann die gemäß Beispiel 1 erhaltene DNA verwendet werden. Mittels Analyse der Aminosäuresequenz (wie aus der Nukleotidsequenz abgeleitet) und Daten von der Röntgenstruktur-Analyse können Regionen des Glutaminase-Proteins, die nicht für eine Katalyse oder die strukturelle Integrität erforderlich sind, identifiziert und auf DNA-Ebene durch Deletieren der relevanten Nukleotidsequenzen deletiert werden.
  • Das Glutaminase-Gen der vorliegenden Erfindung kann für eine transiente Gentherapie verwendet werden. Im Allgemeinen kann das Gen gezielt und von transformierten Zellen aufgenommen und in diesen Zellen exprimiert werden, sodass die exprimierte Glutaminase das Wachstum der transformierten Zellen hemmt. Diese Therapie besitzt den Vorteil, dass sie eine systemische Exposition an das Therapeutikum vermeidet, was mögliche Nebenwirkungen abschwächt. Zusätzlich ist, falls die Zellen nur vorübergehend transfiziert werden, wie es erwogen wird, die Therapie reversibel.
  • Ein Verfahren, das zur Erreichung dieses Ziels erwogen wird, ist die Verwendung von Poly-L-lysin, das mit einem Gewebespezifischen Liganden modifiziert worden ist, wie von Wu et al., J. Biol. Chem. 266:14338-14342 (1991) beschrieben. Beispiele für derartige Gewebe-spezifische Liganden sind der Galactose-Rezeptor der Leber, der Mannose-Rezeptor von Makrophagen, der CD4-Rezeptor von T-Helferzellen, der epidermale Wachstumsfaktor-(EGF)-Rezeptor und der Thyroid-stimulierendes Hormon-(THS)-Rezeptor. Das Glutaminase-Gen würde unter der Transkriptionskontrolle eines Gewebespezifischen Promotors gestellt werden. Zum Beispiel könnten die Promotoren von c-N-ras und c-myc für eine Expression in Lebertumoren verwendet werden. Diese Promotoren sind in transformierten Zellen im Vergleich zu normalen Zellen aufreguliert und würden deshalb höhere Expressionslevels in Tumorzellen als in normalen Zellen liefern. Plasmide werden mit dem modifizierten Poly-L-lysin beschichtet und in den Blutstrom des Patienten injiziert. Die Zielzellen werden die Komplexe wegen der Gewebespezifischen Liganden spezifisch aufnehmen. Die Zielzellen werden das Glutaminase-Konstrukt wegen der Gewebespezifischen Promotoren spezifisch exprimieren. Da von bestimmten Neoplasmen gezeigt worden ist, dass sie bei einem geringfügigen Level an verfügbarem Glutamin wachsen und dass die Expression von Glutaminase in diesen Zellen außerdem den Glutaminpool in den Tumorzellen erschöpft, wird das Wachstum dieser Zellen spezifisch gehemmt. Eine derartige Behandlung sollte sowohl für vollständig transformierte Zellen wie auch in den frühen Stadien der Neoplasie, wie beispielsweise in frühen Stadien einer Hepatitis-B-Virusinfektion (HBV), zweckdienlich sein. Da HBV die Expression von c-myc aktiviert, wäre ebenfalls eine Aufregulierung dieses Promotors in einem Glutaminase-Konstrukt zu erwarten, das von diesem Promotor kontrolliert wird, was zu einem hohen Expressionslevel von Glutaminase führt, was die Virus-infizierten Zellen abtöten sollte.
  • Eine weitere Technik zur Vermittlung der Aufnahme des PGA-Gens von transformierten oder HIV-positiven Zellen nutzt Liposomen. (Siehe Nicolau et al., Methods in Enzymology, Bd. 149, Seiten 157-176 (1987)). Kationische Liposomen, die einen Vektor enthalten, der zur PGH-Expression fähig ist, werden durch Anlagerung spezifischer Rezeptorliganden oder Antikörper an die Liposomdoppelschicht modifiziert. (Siehe Hashimoto et al., Methods in Enzymology, Bd. 121, Seiten 817-829 (1986)). Wie bei dem oben diskutierten Polylysinverfahren sind Liposomen für eine erfolgreiche Vermittlung der spezifischen Aufnahme von Fremd-DNA in vivo von Leberzellen über den Galactose-Rezeptor verwendet worden.
  • Unter Verwendung der Kombination aus kationischen Liposomen oder Polylysin als Träger eines PGA-exprimierenden Vektors und Gewebespezifischer Reagenzien für das Zielen kann Glutaminase sehr spezifisch und transient in einem beliebigen ausgewählten Gewebe oder Zelle exprimiert werden. Derartige Gewebe-spezifische Reagenzien würden spezifische Antikörper für Oberflächenmarker und alle Arten von Liganden für jeden beliebigen spezifischen Zellrezeptor umfassen. Zum Beispiel kann das Glutaminase-Gen spezifisch an CD4+-T-Zellen (der von HIV infizierte Zelltyp) in AIDS-Patienten unter Verwendung eines Teils des HIV-Hüllproteins, das das CD4-Antigen bindet, als ein Ligand auf einem modifizierten Liposom überbracht werden. Kohlenhydrat-modifizierte Liposomen, die ein PGA-Expressionssystem enthalten, können ebenfalls verwendet werden; der Galactose-Rezeptor der Leber vermittelt die Aufnahme derartiger Liposomen. Zusätzlich zu diesen Liganden für Rezeptoren auf der Zelloberfläche können Antikörper für Zelloberflächenmarker auf ähnliche Weise verwendet werden, um diese Reagenzien praktisch an jeden beliebigen Zelltyp zu überbringen.
  • Eine weitere Technik, die in der Behandlung von Patienten mit PGA zweckdienlich ist, ist die Verwendung von Trägerzellen. (Siehe Rosenberg, Cancer Res. (Suppl.). Bd. 51, Seiten 5074s-5079s (1991)). Diese Technik nutzt vorteilhafterweise die Tatsache, dass bestimmte T-Zellen die Fähigkeit besitzen, Tumoren zu infiltrieren (Tumor-infiltrierende Lymphocyten). Diese Zellen werden Krebspatienten entnommen, mit einem Glutaminase-Expressionsvektor transfiziert und in den Patienten zurückgegeben. Nach Rückgabe an den Patienten und Infiltration in das Neoplasma wird ein hoher lokaler Glutaminase-Level bereitgestellt. Alternativ kann ein bifunktioneller Träger verwendet werden. Anstelle einer Transfektion der infiltrierenden Lymphocyten mit dem PGA-Expressionsvektor, kann der Vektor auf einen spezifischen Oberflächenmarker auf den Lymphocyten, wie es oben genau beschrieben ist, gezielt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers zusammen mit Poly-L-lysin. Das Vorhandensein eines weiteren, an den Vektor gehefteten zie lenden Liganden (der für Tumorzellen spezifisch ist) erlaubt die Aufnahme des PGA-Expressionsvektors von den Tumorzielzellen. Der infiltrierende Lymphocyt wird hauptsächlich als ein Träger verwendet, um den Expressionsvektor zu dem Tumor zu „schleppen".
  • Eine Verabreichung von Glutaminase an einen Körper kann mit beliebigen in der Technik bekannten Mitteln durchgeführt werden. Die Glutaminase kann zu bestimmten Organen und Geweben durch eine Verabreichung an Arterien, welche die Organe oder Gewebe versorgen, oder mit Hilfe eines Organ- oder Gewebe-spezifischen Liganden geleitet werden. Eine direkte Konjugation des PGH-Enzyms an funktionelle zielende Gruppen kann genutzt werden. Diese Gruppen umfassen Antikörper, Lektine, Kohlenhydrate, Hormone, Peptide oder andere Verbindungen, die mit Zelloberflächen Wechselwirken können. Spezifische Beispiele hierfür siehe Methods in Enzymology, Bd. 112, Seiten 238-306 (1985).
  • Glutaminase kann an Antikörper, zum Beispiel an diejenigen, die für Tumor-assoziierte Antigene spezifisch sind, gebunden werden. Eine Reihe an Techniken sind für eine Komplexierung zweier Proteine bekannt, wobei jede beliebige davon mit Glutaminase angewandt werden kann, solange die Enzymaktivität und die Antikörper-Bindungskapazität nicht zerstört werden. Geeignete Techniken umfassen diejenigen Techniken, welche das heterobifunktionelle Reagenz SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) [Carlsson et al., Biochemical Journal, Bd. 173, Seiten 723-737 (1978)] oder SMPT (4-Succinimidyl-oxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridyldithio)toluol) [Thorpe et al., Cancer Research, Bd. 47, Seiten 5924-5931 (1987)] verwenden. Sehr viele Antikörper sind beschrieben worden, die mit Tumorassoziierten Antigenen reagieren. Viele sind von der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland 20852, erhältlich, einschließlich solcher für Brust-, Lungen- und Melanom-Tumorzellen. Für einen Überblick über Tumorspezifische Antikörper siehe Foon, Cancer Research, Bd. 49, Seiten 1621-1631 (1989).
  • Gewebekultur-Experimente mit Pseudomonas 7A Glutaminase (PGH) demonstrieren, dass dieses Enzym die Replikation des humanen Immundefizienz-Virus (HIV) stark hemmt, das in der anfälligen humanen T-Zelllinie H9 wächst. Das Vorhandensein von 0,4 μg PGA/ml Kulturmedium verursachte praktisch eine 100 %ige Hemmung der viralen Replikation und 0,016 μg/ml verursachte eine 50 %ige Hemmung. Eine viel höhere PGH-Konzentration (50 μg/ml) war erforderlich, um eine merkliche Toxizität in den humanen H9-Wirtszellen zu verursachen. Obwohl die Gewebekultur-Hemmung für HIV I-Virus gezeigt worden ist, können andere Stämme ebenfalls gehemmt werden.
  • Diese Gewebekultur-Ergebnisse zeigen, dass PGA viel toxischer für HIV als für die humanen Wirtszellen ist und dass es zu erwarten ist, dass PGA einen hohen therapeutischen Index zeigen wird, wenn es an HIV-infizierte Patienten verabreicht wird. Darüber hinaus erwies sich PGA in Kombination mit dem Glutamin-Antimetaboliten DON besonders erfolgreich in der Behandlung von Lungen-, Brust- oder Darmkrebs. (McGregor, 1989, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30:587).
  • Ein DNA-Molekül, das für eine therapeutisch geeignete Glutaminase und ihr entsprechendes Polypeptid codiert, kann aus einer mikrobiellen, tierischen oder pflanzlichen Zelle unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die gemäß bekannten Glutaminase-Proteinsequenzen hergestellt werden, isoliert werden. Vorzugsweise ist die DNA aus Pseudomonas 7A-Zellen isoliert.
  • Beispiel 1
  • Dieses Beispiel demonstriert die Identifizierung eines Klons, der die für Pseudomonas 7A Glutaminase codierende Sequenz enthält, und Bestimmung ihrer Nukleotidsequenz.
  • Das Glutaminase-Produkt ist ein Enzym, das Glutamin abbaut (eine Aminosäure, die an mehr metabolischen Prozessen als jede andere Aminosäure beteiligt ist) und deshalb das Wachstum behindert. In mehr als zwei Dutzend unabhängigen Experimenten sind wir nicht in der Lage gewesen, die Glutaminase in verschiedenen Zusammenhängen zu klonieren. Wir haben es in High-Copy-Number Plasmide, wie beispielsweise pUC, als nicht klonierbar befunden. Es widerstand ebenfalls einer Klonierung in Abwesenheit eines stromaufwärts liegenden Transkriptionsterminators und eines sehr streng regulierten Promotors.
  • Chromosomale DNA wurde aus Pseudomonas 7A (ein aus dem Erdboden isolierter Organismus, der bei der American Type Culture Collection unter der Hinterlegungsnummer ATCC 29598 hinterlegt worden ist) im Wesentlichen wie beschrieben (Strom, 1986, J. Bacteriol. 165:367-372) isoliert und wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A partiell verdaut. Fragmente dieses Verdaus mit durchschnittlich 5-10 kb wurden mittels einer präparativen Agarosegelelektrophorese isoliert und in die BamHI-Restriktionsschnittstelle des Vektors pBR322 kloniert. Die resultierende genomische Bibliothek (im E. coli Stamm LE392, ATCC Hinterlegungsnr. 33572) wurde mit Hilfe gemischter Oligonukleotidsonden (Wallace, et al., 1981, Nucleic Acids Res. 9:879-89, und Paddock, G.V., 1987, Biotechniques 5:13-16) durchmustert. Teilpeptid-Sequenzinformation wurde erhalten und verwendet, um die drei Oligonukleotidsonden abzuleiten, die in Tabelle 1 gezeigt sind. Oligonukleotidsonden wurden für Peptidsequenzinformation vom Amino-Terminus des Enzyms (Sonde A), vom Carboxyl-Terminus (Sonde C) und von einem Peptid nahe der Mitte des Proteins (Sonde B) ausgewählt. Sonde B wurde für die erste Durchmusterung von 3560 Ampicillinresistenten Transformanten ausgewählt. Aus der ersten Durchmusterung wurden zwei hybridisierungspositive Klone identifiziert. Diese wurden erneut mit Hilfe der Sonden A und C durchmustert. Beide Klone hybridisierten an Sonde A, aber nur einer der Klone, pME0.5, hybridisierte mit Sonde C. Da pME0.5 mit allen drei Sonden hybridisiert hat, wurde er für eine weitere Analyse ausgewählt.
  • Zellrohextrakte von Stamm LE392, transformiert mit Plasmid pME0.5 wurden durch Aufbrechen von Aliquoten einer Übernachtkultur und Zentrifugieren des Homogenisats bei 15 000 rpm, um nicht aufgebrochene Zellen und Zelldebris zu entfernen, präpariert. Der resultierende Überstand wurde auf Glutaminase-Aktivität durch direkte Nessler-Reaktion mit Ammonium (Roberts, J., 1976, J. Biol. Chem. 251:2119-2123) untersucht. Um eine interferierende Aktivität durch irgendwelche E. coli Glutaminase-Enzyme zu minimieren, wurde der Assay bei pH 8,0 und Verwendung von D-Glutamin als Substrat durchgeführt. Kein E. coli Enzym ist unter diesen Bedingungen aktiv, während die Pseudomonas 7A Glutaminase (PGA) 87% ihrer Aktivität (Pruisner, 1976, J. Biol. Chem., 251:3447-3456 und Roberts, 1976, J. Biol. Chem. 251:2119-2123) beibehält. Kontrollexperimente mit Zellrohextrakten bestätigten die Wirksamkeit dieses Assays zur Messung der PGH-Aktivität bei Abwesenheit von E. coli Glutaminase-Aktivität. Es wurde keine Aktivität festgestellt. Tabelle 1 OLIGONUKLEOTIDSONDEN, DIE ZUR DETEKTION DES GLUTAMINASE-GENS VERWENDET WURDEN
    Peptidsequenz (1-5) Sonde A (14-mer × 32) NH2-Lys-Glu-Val-Glu-Asn AA (AG) GA (AG) GT (TCAG) GA (AG) AA
    Peptidsequenz (161-166) Sonde B (18-mer × 48) Met-Asn-Asp-Glu-Ile-Glu ATGGA (TC) GA (TC) GA (AG) AT (TCA) GA (AG) (AG)
    Peptid Sequenz Sonde C (14-mer × 12) Ile-Phe-Trp-Glu-Tyr-COOH AT (TCA) TT (TC) TGGGA (AG) TA
  • Um die Identität des mutmaßlichen PGA-Klons zu bestätigen, wurde der Bereich, der zu den für die Durchmusterung verwendeten Sonden homolog ist, mittels Southern-Blot-Analyse lokalisiert und die geeigneten Fragmente wurden teilweise sequenziert. Diese Analyse identifizierte ein 1,1 kb SalI-Fragment, das an Sonde A hybridisierte, und ein 1,5 kb SalI-Fragment, das an Sonde B hybridisierte. Dies weist darauf hin, dass es eine SalI-Restriktionsschnittstelle innerhalb des Gens gibt, und dass eine Sequenzierung von dieser Stelle unmittelbar die Identität des Gens als PGA durch Vergleich der Nukleotidsequenz mit der bekannten Aminosäuresequenz bestätigen würde. Eine Sequenzierung des 1,1 kb SalI-Fragments zeigte, dass dieses Fragment die N-terminalen 42 Aminosäuren der Glutaminase codiert.
  • Für eine bequeme Sequenzierung wurden verschieden Fragmente der Glutaminase codierenden Region in ein ColE1-basiertes Plasmid mit Hilfe von Standardprotokollen, Sambrook, et al., oben, subkloniert. Diese umfassen das 1,1 kb N-terminale SalI-Fragment (pME1), das 1,5 kb C-terminale SalI-Fragment (pME2), den thermozyklisch Amplifikations-mutagenisierten N-Terminus (pME3) und das 200 bp C-terminale PstI-Fragment (pME11). Zahlreiche Sequenzierungsprimer wurden unter Verwendung der zuvor bestimmten Glutaminase-DNA-Sequenzen (siehe 1) synthetisiert.
  • Unter Verwendung sowohl des vollständigen Klons, pME0.5, als auch der subklonierten Fragmente wurde das Glutaminase-Gen mit Hilfe des Kettenabbruch-DNA-Sequenzierungsverfahrens nach Sanger Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5963 (1977) in beiden Richtungen sequenziert. Die gereinigten doppelsträngigen Templates werden unter Verwendung des alkalischen Standarddenaturierungsverfahren denaturiert.
  • Die intakte codierende Region (SEQ ID NR. 1) umfasst 1008 Rasenpaare und codiert eine zusammenhängende Polypeptidsequenz von 336 Aminosäuren (eine mutmaßliche Signalsequenz von 24 Aminosäuren ist nicht enthalten). Der C-Terminus wird von hintereinander liegenden Stopcodons und einem mutmaßlichen Transkriptionsterminator durchsetzt. Basierend auf der Übereinstimmung dieser Sequenzinformation mit den Daten der Peptidsequenzierung wurde gefolgert, dass das PGA-Gen tatsächlich kloniert worden war.
  • Beispiel 2
  • Dieses Beispiel demonstriert die Expression des Gens für Pseudomonas 7A Glutaminase
  • Erste Experimente zeigten, dass selbst bei starken, regulierten Promotoren (z.B. λP1) PGA einer Überproduktion widerstand. Um eine kontrollierte Expression mit hohem Level der Pseudomonas 7A (P7A) Glutaminase in Escherichia coli zu erhalten, kon struierten wir zuerst einen neuen Vektor, pME15 (siehe 3A und 3B bezüglich der Klonierung und Tabelle 2). Das Rückgrat des Vektors war pME12 (siehe Tabelle 2) und enthält die folgenden Besonderheiten: β-Lactamase-Gen (verleiht Ampicillinresistenz), lac I(Repressor des Lactose-Operons), einen T7-Transkriptionsterminator und einen Low-Copy-Number ColE1-Typ Replikationsursprung (von pBR322 stammend). Tabelle 2: Plasmide, die zur Konstruktion eines High-Level-Expressionsplasmids verwendet wurden
    pME0.5 genomischer Klon aus einer Sau3A-Fragment-Bibliothek von P7A chromosomaler DNA, kloniert in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pBR322. Dieser Klon enthält das volllange Glutaminase-Gen.
    pME1 – das N-terminale 1,1 kb SalI-Fragment von pME0.5, kloniert in die SalI-Restriktionsschnittstelle eines auf ColE1 basierenden Plasmids.
    pME2 – das C-terminale 1,5 kb SalI-Fragment von pME0.5, kloniert in die SalI-Restriktionsschnittstelle eines auf ColE1 basierenden Plasmids.
    pME3 – das thermozyklische Amplifikations-mutagenisierte vordere Ende der P7A-Glutaminase, das eine BamHI-Restriktionsschnittstelle und eine NdeI-Restriktionsschnittstelle am N-Terminus und eine BamHI-Restriktionsschnittstelle nach der ersten SalI-Restriktionsschnittstelle enthält, kloniert in ein auf ColE1 basierendes Plasmid.
    pME4 – pME3, geschnitten mit EcoRV und KpnI, aufgefüllt mit T4-DNA-Polymerase und religiert. Dies entfernt die SalI-Restriktionsschnittstelle in dem Polylinker und lässt die interne SalI der Glutaminase als einmalige Schnittstelle zurück.
    pME7 – das 90 bp HindIII/BamHI Ptac-haltige Fragment, das aus der Ligation überlappender Oligonukleotide (Tabelle 3) resultiert, kloniert in pUC19.
    pME11 – das 200 bp PstI-Fragment aus pME2, welches das Stopcodon der P7A-Glutaminase flankiert, wurde in die PstI-Restriktionsschnittstelle eines auf ColE1 basierenden Plasmids kloniert.
    pME12 – pBR322 mit dem E. coli lacl-Gen innerhalb des tet-Gens an der SalI-Restriktionsschnittstelle und dem T7-Transkriptionsterminator an der BamHI-Restriktionsschnittstelle.
    pME14 – das 1,5 kb SalI-Fragment aus pME2 wurde in pME4 kloniert, was das volllange Glutaminase-Gen wiederherstellt.
    pME15 – Das HindIII/EcoRI-Fragment aus pME7 (enthält Ptac) wurde in pME12 kloniert.
    pME16 – Die BamHI-Kassette von pME14, die das Glutaminase Gen enthält, wurde in die BamHI-Restriktionsschnittstelle von pME15 kloniert. Dies sollte den tac-Promotor ergeben, welcher die Glutaminase-Expression steuert.
    pME18 – pME16 wurde an der einzigen Ndel-Restriktionsschnittstelle am N-Terminus der Glutaminase geöffnet und mit Hilfe des Klenow-Fragments der E. coli DNA-Polymerase I aufgefüllt. Das Produkt mit stumpfem Ende wurde religiert, was einen Abstand von 9 Basen zwischen der Shine-Delgarno-Sequenz und dem Glutaminase-Startcodon liefert. Dies sollte optimale Expresssionslevels ergeben.
  • Tabelle 3: Oligonukleotide, die zur Konstruktion eines High-Level Expressionsplasmids verwendet wurden
    Figure 00220001
  • Wir wählen als Promotor den tac (Hybrid trp/lac) Promotor, der eine lac-Operatorsequenz (verleiht eine Repressionsempfindlichkeit für lac I) enthält (deBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21 (1983) und Russel, et al., Gene 20:231 (1982). Wir synthetisierten überlappende Oligonukleotide, die ligiert und als ein BamHI/HindIII-Fragment in den Klonierungsvektor pUC19 kloniert wurden und pME17 ergab. Das BamHI/EcoRI-Fragment von pME17 wurde in pME12 geklont, um pME15 zu bilden.
  • Dieses liefert den von lac I kontrollierten tac-Promotor und ist daher mit Isopropyl-β-thio-D-galactosid (IPTG) induzierbar. Dieser Promotor ist in der gleichen Orientierung wie der unidirektionale Replikationsursprung aktiv und interferiert deshalb nicht mit der Plasmidvermehrung. Ein Transkriptionsterminator liegt unmittelbar stromaufwärts des Startpunkts der Transkription und schließt ein „Durchlesen" der Transkription aus. Die Kombination aus einer Kontrolle mit lac I und einem Transkriptionsterminator stromaufwärts liefert einen Vektor, der zur stabilen Vermehrung und sogar Expression der toxischen Glutaminase-Gene fähig ist. Zusätzlich erlaubt das Plasmidcodierte lac I-Gen faktisch eine Unabhängigkeit vom Wirt.
  • Wie wir zuvor beobachtet haben, ist die volllange P7A-Glutaminase auf zwei SalI-Fragmenten vorhanden: einem 1,1 kb Fragment, das den N-Terminus des Gens enthält, und einem 1,5 kb Fragment, das den C-Terminus enthält. Um dieses Gen in ein Expressionssystem zu klonieren, wünschten wir die Sequenz am N-Terminus zu verändern, um geeignete Stellen für die Restriktionsendonuklease bereitzustellen. Dies würde die Klonierung des Gens in zahlreiche etablierte Expressionsvektoren zusätzlich zu unserem Vektor, pME15, erlauben. Aus diesem Grund verwendeten wir mutagene thermozyklische Amplifikationsprimer (siehe Tabelle 3), um eine BamHI-Stelle und NdeI-Stelle am N-terminalen Lysinrest zu erzeugen. Diese Mutagenese fügt ebenfalls einen Methioninrest unmittelbar stromaufwärts des N-terminalen Lysins ein. Wir fügten ebenfalls eine BamHI-Stelle nach der internen SalI-Stelle ein.
  • Das mittels thermozyklischer Amplifikation mutagenisierte N-terminale Fragment des Glutaminase-Gens wurde in einen ColE1-basierten Vektor als ein BamHI-Fragment kloniert (pME3). Der Polylinker zwischen KpnI und EcoRV wurde unter Entfernung der endogenen SalI-Stelle deletiert, was pME4 erzeugte. Die volllange Glutaminase wurde mittels Ligation des 1,5 kb SalI-Fragments, das den C-Terminus codiert, in die einmalige SalI-Stelle von pME4 wiederhergestellt und ergab pME14. Das 1,7 kb BamHI-Fragment von pME14 wurde in den Expressionsvektor pME15 kloniert. Dieser Klon (pME16) liefert die von dem tac-Promotor gesteuerte Glutaminase-Expression. In einem Ansatz zur Erzielung höherer Expressionslevels öffneten wir pME16 an der NdeI-Stelle und füllten sie auf mit Hilfe des Klenow-Fragments von E. coli DNA-Polymerase I. Nach Religation wurde der Abstand zwischen der Shine-Delgarno-Sequenz und der Translationsstartstelle optimal (siehe Tabelle 3).
  • Dieser Vektor (pME18) ist stabil und steuert die Expression der authentischen P7A-Glutaminase. Er wurde bei der American Type Culture Collection entsprechend den Bestimmungen des Budapester Vertrags vom 3. November 1992 mit der Hinterlegungsnummer 69117 hinterlegt. Für die Proteinproduktion wurden die Zellen bis zur mittleren log-Phase bei 37°C angezogen und mit 0,4 mM IPTG 1 bis 6 Stunden behandelt. Die Proteinproduktion wurde mittels denaturierender Polyacrylamidgelelektrophorese (4) und spezifischer Glutaminase-Aktivität kontrolliert. Eine derartige Kultivierung hat Aktivitäten in Höhe von 4100 U/Liter Kultur ergeben, was ungefähr 3% des Gesamtzellproteins darstellt. Da Pseudomonas P7A nur 350 U/Liter produziert, stellt dies einen 12-fachen Anstieg der Enzymproduktion dar.
  • Um sicherzustellen, dass die beobachtete Aktivität von der Pseudomonas Glutaminase und nicht von endogener E. coli Glutaminase A und B stammte, wurde die Reaktion mit D-Glutamin bei pH 8 wiederholt. Nur Pseudomonas Enzym arbeitet unter diesen Bedingungen; tatsächlich setzt es D-Glutamin zu Glutamat mit 87% genauso effizient um wie L-Glutamin. Diese Ergebnisse demonstrieren, dass die gesamte messbare Aktivität von PGA stammte. Bradford Proteinassays wurden ebenfalls mit Zellrohextrakten durchgeführt, um die Berechnung der Enzymaktivität als spezifische Aktivität zu erlauben. Proben von jedem Extrakt wurden ebenfalls auf SDS-PAGE-Gelen untersucht, wie im Wesentlichen von Laemmli beschrieben (Laemmli, U.K. (1970) Nature (London) 227:680-685). Die resultierende Enzyminduktionskurve ist in 5 gezeigt, wo der Anstieg der Glutaminase-Aktivität in den Zellextrakten unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat gezeigt ist. Daraus ist ersichtlich, dass die Aktivität des Enzyms unter Verwendung von D-Glutamin als Substrat auf über das 4000-fache nach einer IPTG-Induktion ansteigt, wohingegen die Kontrollkultur praktisch keinen Anstieg der Glutaminase-Aktivität zeigt.
  • Um eine effiziente Translation der Glutaminase in E. coli zu erhalten, wurde ein N-terminales Methionin-Codon eingefügt (siehe Tabelle 3). Es war von einer gewissen Bedeutung, ob oder ob nicht diese zusätzliche Aminosäure die Aktivität des Enzyms verändern würde. Um dieses zu testen, maßen wir die Enzymaktivität für L- und D-Glutamin wie auch für L- und D-Asparagin. Die Verhältnisse der Aktivität von L- zu D-Isomeren waren sowohl für das native wie das veränderte Enzym gleich (d.h. L-Glutamin:D-Glutamin und L-Asparagin:D-Asparagin). Eine andere Sache war, dass diese Änderung die in vivo Halbwertszeit nachteilig beeinflussen könnte. Um dieses zu testen, führten wir Halbwertszeituntersuchungen in Mäusen durch; beide Enzyme zeigten dieselbe Halbwertszeit in vivo. Auf Basis dieser zusammengeführten Daten schlussfolgern wir, dass der zusätzliche N-terminale Methioninrest nicht die biologische Aktivität des Enzyms verändert.
  • Beispiel 3
  • Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung von P7A-Glutaminase-Sequenzen für eine Identifizierung homologer Sequenzen in anderen Bakterienspezies.
  • Chromosomale DNA von Pseudomonas aeruginosa und Achromobacter sp. wurde unter Anwendung von Standardprotokollen isoliert. Nach vollständigem Verdau mit EcoRI wurden DNA-Fragmente auf einem 30 cm 1% Agarosegel bei 50 V 15 Stunden in 89 mM Tris-Cl, pH 8; 89 mM Borat und 1 mM EDTA aufgetrennt. Transfer und Hybridisierung wurden, wie beschrieben (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Seiten 382-389, Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982), unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Die Sonde war die codierende Region des P7A-Glutaminase-Gens, das mit α32-P Desoxycytosintriphosphat markiert war. Spur 1, Pseudomonas 7A (2 h Exposition); Spur 2, Pseudomonas aeruginosa (6 h Exposition); Spur 3, Achromobacter sp. (24 h Exposition). Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt.
  • Beispiel 4
  • Dieses Beispiel demonstriert eine in vitro Hemmung humaner Melanomzellen durch einen an Glutaminase gebundenen Antimelanom-Antikörper
  • Humane Melanomzellen (Heatherington) wurden in vitro 30 Minuten entweder mit freiem R24 Antimelanom-Antikörper, freier Glutaminase oder einem kovalent gebundenen Antikörper-Glutaminase-Komplex inkubiert. Der kovalent gebundene Antikörper-Glutaminase-Komplex wurde unter Verwendung des heterobifunktionellen Reagenzes SPDP (N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) [Carlsson et al., Biochemical Journal, Bd. 173, Seiten 723-737 (1978)] hergestellt. Die Zellen wurden gewaschen und in frisches Zellkulturmedium verbracht und der 3H-Thymidin-Einbau wurde gemessen. Der Einbau in die Melanomzellen ist in Tabelle 4 gezeigt. Weder hemmte der freie Antikörper noch Glutaminase den Thymidin-Einbau. Nur mit dem Antikörper-Glutaminase-Komplex inkubierte Zellen zeigten eine Hemmung des 3H-Thymidin-Einbaus. Folglich wirken die beiden Komponenten, Antikörper und Glutaminase, bei einer Hemmung des Tumorzellwachstums synergistisch. TABELLE 4
    BEHANDLUNG % HEMMUNG DES 3H-THYMIDINEINBAUS
    Freie Antikörper Freie Glutaminase (0,06 IU/ml) Antikörper-Glutaminase-Komplex (0,06 IU/ml) 0 0 93
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001
  • Figure 00330001
  • Figure 00340001
  • Figure 00350001
  • Figure 00360001
  • Figure 00370001

Claims (13)

  1. E. coli-Zelle, welche ein Gen umfasst, das die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz aufweist.
  2. E. coli-Zelle, welche ein Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase-Gen umfasst und welche bei der ATCC als Zugriffsnr. 69117 hinterlegt ist.
  3. Zelle nach Anspruch 1, welche zum Exprimieren des Gens fähig ist.
  4. Isoliertes und gereinigtes DNA-Molekül, umfassend die in SEQ ID NR. 1 gezeigte Nukleotidsequenz.
  5. DNA-Molekül nach Anspruch 4, wobei das Molekül zum Exprimieren der Glutaminase, die durch SEQ ID Nr. 1 codiert ist, in einer rekombinierten Zelle fähig ist.
  6. DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die für eine Glutaminase codiert, wobei die Glutaminase die in SEQ ID Nr. 2 gezeigte Sequenz aufweist.
  7. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Expression der Glutaminase, die durch SEQ ID Nr. 1 codiert ist, durch einen induzierbaren Promotor kontrolliert wird.
  8. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Expression der Glutaminase, die durch SEQ ID Nr. 1 codiert ist, durch einen Repressor kontrolliert wird.
  9. DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei der Promotor tac ist.
  10. DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 9, außerdem umfassend einen Transkriptionsterminator 3' und 5' zu SEQ ID Nr. 1.
  11. Nukleinsäure, umfassend ein Polynukleotid, das für das Polypeptid codiert, welches durch den in ATCC Zugriffsnr. 69117 enthaltenen cDNA-Klon codiert ist.
  12. Vektor, umfassend ein DNA-Molekül, welches die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst.
  13. Verwendung eines DNA-Moleküls, welches die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Nukleotidsequenz umfasst, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs.
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