ES2287926T3 - Glutaminasa manipulada geneticamente y su uso en terapia. - Google Patents

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Abstract

SE HA CLONADO MOLECULARMENTE UN ADN QUE CODIFICA UNA GLUTAMINASA TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA. ESTO PERMITE OBTENER UN POLIPEPTIDO QUE ES UNA GLUTAMINASA TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA Y QUE NO CONTIENE ENDOTOXINAS CONTAMINANTES. SE HA DESCUBIERTO QUE ESTE POLIPEPTIDO ES UN POTENTE AGENTE ANTIVIRAL Y CUANDO SE ACOPLA A UN ANTICUERPO MONOCLONAL ANTITUMORAL ES UN POTENTE AGENTE ANTICANCER. LA GLUTAMINASA DE LA PRESENTE INVENCION ES PARTICULARMENTE UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE LAS CELULAS CANCERIGENAS DEL PULMON, MAMA Y COLON Y PARA EL TRATAMIENTO DE CELULAS INFECTADAS CON EL VIH.

Description

Glutaminasa manipulada genéticamente y su uso en terapia.
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere a un ADN que codifica una glutaminasa terapéuticamente adecuada.
Antecedentes de la invención
El uso de glutaminasa para agotar la glutamina en hospedadores que tienen tumores ofrece un procedimiento atractivo para atacar a las células cancerosas. La glutamina ocupa un papel importante en la biosíntesis de un gran número de metabolitos celulares. En comparación con los tejidos normales, algunos neoplasmas han demostrado funcionar a un nivel marginal de disponibilidad de glutamina a causa de la síntesis reducida y su utilización aumentada por etapas (Levintow, 1954, J. Natl. Cancer Inst. 15:347-352; Roberts, y col., 1960, Amino Acids, Proteins and Cancer Biochemistry (J. T. Edsall, ed.) Academic Press, New York, NY pág. 121-145; Weber G. 1983, Cancer Res. 43:3466-3492; Sebolt, y col., 1984, Life Sci. 34:301-306). Los experimentos han revelado una correlación negativa entre el contenido de glutamina y la tasa de crecimiento de tumores de hepatoma de rata transplantados. Se descubrió que la concentración in vivo de glutamina en el hepatoma 3924A era 9 veces inferior (0,5 mM) que en el hígado (4,5 mM) e inferior que en cualquier otro tejido de rata (2 a 5 mM) (Weber, 1983, Cancer Res. 43:3466-3492). En los últimos años los datos acumulados indican que la glutamina puede ser una importante fuente de suministro de energía celular en diversos neoplasmas incluyendo tumores hematopoyéticos, hepatomas, carcinoma de Ehrlich, y células HeLa (Abou-Khalil, y col., 1983, Cancer Res. 43:1990-1993; Kovacevic, y col., 1972, J. Biol. Chem. 33: 326-333; Kovacevic, 1971, Biochem. J. 125: 757-763; Reitzer, y col., 1979, J. Biol. Chem. 254: 2669-2676).
La L-asparaginasa, la primera enzima que se estudió intensamente como agente antitumoral en el ser humano, es muy eficaz en el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda. Sin embargo esta enzima tenía poca o ninguna actividad contra cualquier otro neoplasma en el ser humano. La enzima glutaminasa tiene actividad contra un intervalo mucho más amplio de cánceres que la asparaginasa.
Se han purificado y caracterizado varias enzimas glutaminasa y glutaminasa-asparaginasa de mamífero y microbianas. De estas la glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A parece ser la más adecuada para el uso terapéutico a causa de su baja K_{M} por la glutamina (intervalo micromolar), buena estabilidad y actividad en medio fisiológico y una semivida prolongada en el plasma en los hospedadores que tienen tumores (Roberts, 1976, J. Biol. Chem. 251: 2119-2123, y Roberts, y col., 1979, Cancer Treat. Rep. 63: 1045-1054).
Las enzimas glutaminasa de mamífero conocidas no son adecuadas para uso como agentes terapéuticos a causa de sus altos valores de K_{M} (intervalo milimolar) y sus requerimientos de ésteres de fosfato o de malato para la activación. Las glutaminasas de E. coli (A y B) también son inadecuadas para uso terapéutico a causa de sus altos valores de K_{M} (intervalo milimolar), baja actividad a pH fisiológico (glutamina A), o requerimientos de sustancias activadoras especiales (glutaminasa B).
La glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A está compuesta por cuatro subunidades idénticas con un peso molecular de aproximadamente 35.000. Los estudios de sedimentación de la enzima activa indican que la actividad catalítica se asocia con el tetrámero, ya que no se observan especies activas más pequeñas (Holcenberg, y col., 1976, J. Biol. Chem., 251:5375-5380). La enzima purificada tiene una proporción de glutaminasa respecto a actividad asparaginasa de aproximadamente 2:1. Los estudios de unión con análogos de glutamina marcados con C-^{14} (6-diazo-5-oxo-L-norleucina; DON) y asparagina (6-diazo-5-oxo-L-norvalina; DONV) sugieren que los dos análogos pueden reaccionar preferiblemente con grupos hidroxilo en dos sitos diferentes de la proteína y que los dos sitios de unión actúan de forma cooperativa como parte del sitio activo (Holcenberg, y col., 1978., Biochemistry 17:411-417).
La glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A, demostró tener una actividad anti-neoplásica considerable contra diversas leucemias de roedor (L1210, C1498, EARAD/1), tumores ascíticos (hígado de Taper, carcinoma de Ehrlich, sarcoma meth A, S180) y algunos tumores sólidos (carcinoma de Walker 256, melanoma B16). Además, se descubrió que el antagonismo de la glutamina por parte de análogos de glutamina y glutaminasa era fuertemente inhibidor de los carcinomas de colon, de mama y de pulmón humanos que crecían en ratones atímicos (McGregor, 1989, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30:578; Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054; Ovejera, 1979, Cancer Res. 39:3220-3224; Houchens, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:473-475; Duvall, 1960, Cancer Chemother. Rep. 7:86-98).
Una característica importante de la terapia con glutamina es que las cepas resistentes no se desarrollan después de tratamiento repetidos con esta enzima (Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054). El tratamiento con glutaminasa también demostró retrasar el desarrollo de la resistencia contra metotrexato (Roberts, 1979, Cancer Treat. Rep. 63:1045-1054).
Una glutaminasa-asparaginasa bioactiva ha demostrado inhibir la enfermedad retroviral de ratón. El agotamiento de la glutamina inhibe fuertemente la replicación del retrovirus de la leucemia de ratón de Rauscher (RLV) in vitro. La glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A (PGA), capaz de agotar la glutamina y asparagina durante periodos prolongados, se usó para determinar la eficacia terapéutica del agotamiento de glutamina en ratones infectados con RLV o virus de Friend. Durante el tratamiento con PGA de animales virémicos, la actividad de la transcriptasa inversa del suero cayó hasta niveles de control y los animales infectados no desarrollaron esplenomegalia. Los resultados terapéuticos obtenidos con PGA se comparan de forma favorable con los de la azidotimidina administrada por vía intraperitoneal a 30 mg/kg/día (Roberts, 1991, Journal of General Virology, 72:299-305).
A pesar de la promesa de la glutaminasa como agente terapéutico, actualmente no hay glutaminasas terapéuticamente útiles disponibles que puedan producirse de forma económica y con poca o ninguna contaminación por otras sustancias, por ejemplo por endotoxinas de un microorganismo hospedador. Además, una enzima adecuada no está disponible en cantidades que sean lo suficientemente grandes para permitir ensayos clínicos de amplia extensión.
Resumen de la invención
Es uno objeto de la invención proporcionar una célula de E. coli que comprenda una glutaminasa terapéuticamente adecuada.
Es otro objeto de la invención proporcionar una molécula de ADN que codifique una glutaminasa terapéuticamente adecuada.
En una realización de la invención se proporciona una célula de E. coli que comprende un gen que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
Otra realización de la invención proporciona una molécula de ADN aislada y purificada que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
La invención también proporciona un vector que comprende una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
La invención proporciona además el uso de una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1 en la fabricación de un medicamento para tratar el cáncer.
La presente invención proporciona por lo tanto a la técnica nuevos y útiles agentes terapéuticos antitumorales así como herramientas para fabricarlos y procedimientos para usarlos.
La donación y la expresión del gen que codifica la glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A en E. coli aumenta la glutaminasa producida por litro de cultivo al menos 12 veces, en relación con el rendimiento de Pseudomonas 7A. Esto reduce drásticamente el coste de producción de la glutaminasa y permite ensayos clínicos de amplia difusión. Además, produciendo la glutaminasa en E. coli se evita la contaminación del fármaco antitumoral por endotoxina de Pseudomonas altamente tóxica.
Breve descripción de la invención
La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del gen de la glutaminasa de Pseudomonas 7A. La cadena superior de la secuencia de ADN codificante se muestra de 5' a 3'. Las cifras que se muestran indican los pares de bases de nucleótidos. La secuencia peptídica deducida se muestra debajo de la secuencia de ADN: El resto de metionina N-terminal manipulado no se muestra.
La Figura 2 representa la estrategia de secuenciación para el gen de la glutaminasa de Pseudomonas 7A. Figura 2A: Mapa de la glutaminasa de P7A que muestra los sitios de restricción seleccionados, el área sombreada representa la región que codifica el verdadero producto génico. Las marcas de rayas representan 100 pb. Las flechas por debajo de esta figura muestran las posiciones aproximadas y la orientación de los cebadores de secuenciación con sus nombres adjuntos. Las flechas con topes indican el grado y dirección de experimentos de secuenciación individuales. Figura 2B: se muestran los nombres secuencias y coordinación de los cebadores de secuenciación. La numeración es a partir del AAG que codifica el resto lisina N-terminal.
La Figura 3A representa construcciones recombinantes con glutaminasa de P7A. "Ap^{r}" es un gen de \beta-lactamasa, que otorga resistencia ampicilina. "T" representa un terminador transcripcional; "Ptac" es el promotor. "ori" es el origen de replicación pBR322.
La Figura 3B muestra la construcción de un plásmido que sobre- expresa glutaminasa de P7A.
La Figura 4 muestra electroforesis en gel de poliacrilmida desnaturalizante de extractos en bruto. La pista 1 muestra un control no inducido y las pistas 2-4 muestra inducciones en extractos de células completas. La flecha indica la posición de la banda de glutaminasa inducida.
La Figura 5 representa la inducción de la expresión de IPTG de PGA en E. coli que contiene pME18.
La Figura 6 muestra la hibridación de ADN heterólogo a secuencias de glutaminasa de Pseudomonas 7A. Pista 1, Pseudomonas 7A: pista 2, Pseudomonas aeruginosa; pista 3, Achromobacter sp.
Descripción detallada de la invención
Es un descubrimiento de la presente invención que las enzimas glutaminasa pueden clonarse molecularmente en organismos hospedadores, a pesar del obstáculo de la toxicidad celular para el hospedador. La actividad de la glutaminasa debe regularse estrictamente en este proceso, ya que es tóxica para las células hospedadoras. Los solicitantes han descubierto que por medio de un promotor que debe inducirse a expresar un gen cadena abajo, así como usando terminadores transcripcionales tanto 5' como 3' respecto al gen, la actividad glutaminasa en la célula hospedadora puede controlarse hasta un grado suficiente para que las células hospedadoras sobrevivan sin la pérdida del ADN que codifica la glutaminasa. Cuando los clones moleculares se expresan en células hospedadoras deseables, la glutaminasa puede producirse sin contaminación por endotoxinas. Es un descubrimiento adicional de la presente invención que la glutaminasa tiene actividad inhibidora contra la replicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en células infectadas. Además, se ha descubierto que cuando la glutaminasa se compleja con anticuerpos antitumorales y se administra a células tumorales, el crecimiento de las células tumorales se inhibe hasta un grado que supera ampliamente la inhibición por glutaminasa o anticuerpo en solitario.
Las enzimas glutaminasa son terapéuticamente adecuadas si exhiben alta actividad enzimática a pH fisiológico, es decir entre aproximadamente pH 6,5 y 8,5. Las enzimas glutaminas terapéuticamente adecuadas deben tener un K_{M}, es decir entre 10^{-6} y 10^{-4} M. Además, las propiedades deseables de las enzimas glutaminasa para su uso terapéutico incluyen:
1.
Alta estabilidad a pH fisiológico.
2.
Conservar alta actividad y estabilidad en suero y sangre animal y humana.
3.
Eliminarse lentamente de la circulación cuando se inyectan en animales y seres humanos. Es deseable una semivida en el plasma (t_{1/2}) para la glutaminasa mayor de seis horas en ratones y dieciséis horas en seres humanos.
4.
No inhibirse fuertemente por los productos de la reacción que cataliza o por otros constituyentes que se encuentran normalmente en fluidos corporales.
5.
No requerir cofactores o grupos prostéticos que puedan disociarse fácilmente de la enzima.
6.
Una estrecha especificidad por el sustrato.
7.
Una irreversibilidad eficaz de la reacción enzimática en condiciones fisiológicas.
8.
Disponible a partir de un organismo que contenga niveles bajos de endotoxina.
9.
Baja inmunogenicidad.
Una serie de enzimas degradantes de aminoácidos que no muestran actividad antitumoral tampoco consiguen satisfacer al menos uno de estos criterios. Por ejemplo, la glutaminasa de E. coli tiene un pH optimo de 5 y no tiene esencialmente actividad a pH fisiológico. Una forma ineficaz de asparaginasa de E. coli tiene un K_{M} por encima de 1 mM: Las enzimas asparaginasa de levadura, Bacillus coagulans y Fusarium tricinctum tienen todas unas tasas de eliminación excesivamente rápida en ratones.
La secuencia de nucleótidos de uno de tales genes de glutaminasa terapéuticamente adecuado que se ha donado se muestra en la ID SEC Nº 1. Se obtiene a partir del organismo Pseudomonas 7A (P7A). La región codificante intacta abarca 1008 pares de bases y codifica una secuencia polipeptídica continua de 336 aminoácidos (no se incluye una supuesta secuencia señal de 24 aminoácidos). El extremo C está interrumpida por codones de finalización en tándem y un supuesto terminador transcripcional.
La secuencia de la glutaminas de P7A que se describe en este documento puede usarse para identificar secuencias similares que codifican proteínas similares. (Véase Watson, J. D. y col., en "Molecular Biology of the Gene", "Benjamin/Cummings Publishing Company Inc"., Menlo Park CA, Vol. I., pág. 608 (1987)). Por ejemplo, pueden realizarse experimentos de hibridación de Southern en los cuales se sondea el ADN de un organismo procariota o eucariota con todo o parte del gen de glutaminasa de la presente invención. Las sondas típicas contienen al menos 15 bases de la secuencia de glutaminasa para asegurar que otras secuencias no relacionadas no hibridan. Las temperaturas lo suficientemente altas y las concentraciones salinas suficientemente bajas reducen adicionalmente la hibridación de secuencias no relacionadas. Usando dichas técnicas, se han descubierto genes homólogos al dnaA de E. coli en Pseudomonas putida (Ingmer y Atlung, Mol. Gen. Genet. 232, 431 (1992)) y a ras en diversos organismos eucariotas (Matsui, Gene 76: 313 (1989) y Hori, Gene 105: 91 (1991)). Hay una alta probabilidad de que las secuencias de ADN que hibridan con el ADN de la glutaminasa de P7A representen genes que codifican enzimas de funciones similares. Los genes que se han aislado mediante esta técnica pueden expresarse y las enzimas pueden ensayarse para determinar si comparten las características deseables identificadas para la glutaminasa de P7A.
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Pueden diseñarse sondas, como se conoce en la técnica, usando las secuencias de nucleótidos precisas que se describen en este documento para el gen de la glutaminasa de P7A, o en base a la secuencia de aminoácidos de la enzima. De este modo para algunos fines puede ser deseable emplear sondas degeneradas, es decir, una mezcla de sondas cuyas secuencias codifican los mismos aminoácidos pero contienen codones diferentes. El uso de dicha sondas podría permitir un intervalo más amplio de genes homólogos a identificar.
Usando la secuencia de ADN de la glutaminasa de P7A (PGA), es posible actualmente obtener otros genes de glutaminasa a partir de otros ) organismos usando clonación de complementación. Esta es una técnica que podría usarse incluso cuando no existe hibridación cruzada o reactividad cruzada inmunológica entre dos genes o proteínas de glutaminasa. Véase Kranz, y col., Proc. Narl. Acad. Sci. 87:6629 (1990). Generalmente, el organismo diana se mutageniza y los mutantes se seleccionan por su incapacidad para utilizar la glutamina como fuente de carbono y/o nitrógeno. La transformación con la glutaminasa de P7A debe restaurar la utilización de glutamina en algunos de los mutantes seleccionados. Estos organismos deben contener mutaciones en un gen homólogo para PGA. La inversión de este fenotipo mutante mediante la introducción de ADN aislado a partir de organismos de tipo silvestre puede usarse después en un ensayo para seleccionar el homólogo de PGA.
Si se proporciona la secuencia de aminoácidos del gen de la glutaminasa de P7A, como se muestra en la ID SEC Nº 2, pueden obtenerse de forma rutinaria anticuerpos. Estos anticuerpos pueden generarse usando fragmentos peptídicos o la proteína completa como inmunógenos. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales, según se desee para el fin particular. Los anticuerpos pueden usarse para seleccionar cepas para enzimas relacionadas, para cuantificar la cantidad de enzima presente en una célula y para detectar clones moleculares de una biblioteca de clones.
Los genes de glutaminasa de acuerdo con la presente invención pueden modificarse fácilmente para aumentar su compatibilidad con el organismo hospedador. Por ejemplo, el uso del codón varía de un organismo a otro. Por lo tanto, puede ser deseable para aumentar la eficacia de expresión de la glutaminasa, alterar los codones para conformar el patrón de uso del codón del hospedador. Dichos cambios no alterarían la secuencia de aminoácidos de la glutaminasa sino solamente la secuencia génica. Dichos cambios pueden realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica, por ejemplo, puede usarse mutagénesis dirigida por oligonucleótidos para introducir cambios en una secuencia génica. Como alternativa, puede sintetizarse el gen completo.
La glutaminasa natural contiene una señal de secreción, es decir, una secuencia de aminoácidos N-terminal de aproximadamente 20 aminoácidos que es responsable de la secreción a través de la membrana celular al espacio periplasmático. En algunas condiciones, puede beneficioso incluir una secuencia señal en una construcción de expresión de glutaminasa. Puede usarse la secuencia señal natural, o pueden injertarse otras secuencias señal en la secuencia de glutaminasa madura, para realizar la secreción de la enzima. El uso de una secuencia señal puede ser ventajoso para la expresión de glutaminasa, porque puede disminuir el efecto tóxico sobre la célula hospedadora. Una secuencia señal que puede usarse es la señal ompT de E. coli. Esta señal, al igual que otras, se conoce bien en la técnica. La secreción de la glutaminasa a partir de la célula hospedadora puede facilitar la purificación de la enzima y debe conducir a la formación y recuperación de auténtica glutaminasa.
Son deseables promotores inducibles para la expresión de glutaminasa a causa de la toxicidad inherente de la enzima para las células vivas. Algunos promotores inducibles que pueden usarse son lac, tac, trp, mal y P_{L}. La elección de un promotor está dentro del alcance de la técnica.
Los finalizadotes transcripcionales también son deseables tanto 5' como 3' respecto al gen de la glutaminasa para prevenir la expresión "completa". Se conocen y pueden usarse muchos terminadores. Para una revisión véase, Watson, J. D. y col., en Molecular Biology of the Gene, Benjamin/Cummings Publishing Co., Menlo Park, CA, Vol. I, pág. 377-379 (1987). Un terminador que los solicitantes han descubierto que es útil es el del fago T7.
Las modificaciones del gen de la glutaminasa se realizaron para facilitar la producción de la enzima en E. coli. En uno de dichos genes modificados se añade metionina en el extremo N terminal de la proteína madura. En otro de dichos genes modificados se añadieron metionina, asparagina y serina en el extremo N terminal de la proteína madura. Ninguna de estas adiciones destruyó la actividad enzimática o la especificidad por el sustrato. Dentro del alcance de la invención se contemplan otros cambios similares que no afectan significativamente a la función enzimática.
Puede ser deseable realizar modificaciones en la estructura de la glutaminasa para mejorar sus propiedades terapéuticas o la facilidad de producción. Por ejemplo, puede ser deseable eliminar porciones de la proteína, mediante truncamientos prematuros o deleciones dirigidas, para eliminar porciones que no son esenciales para la función enzimática. Una proteína más pequeña puede proporcionar un índice terapéutico mejorado en virtud de, por ejemplo, la permeabilidad aumentada en masas tumorales. Análogamente, también se contemplan mutaciones puntuales que pueden mejorar las características terapéuticas o de producción. Esto puede conseguirse mediante mutagénesis dirigida o aleatoria, como se conoce en la técnica, o mediante amplificación mutagénica termocíclica.
Además, puede ser deseable producir proteínas quiméricas entre la glutaminasa y otras proteínas. Por ejemplo, puede ser deseable fusionar genes que codifican anticuerpos antitumorales con el gen de la glutaminasa de la presente invención. Como se muestra en este documento, los complejos covalentes de estas proteínas pueden producir efectos sinérgicos drásticos en la interrupción del crecimiento de células tumorales. Esto puede proporcionar beneficios de producción para producir dichos complejos en forma de proteína quimérica, en lugar de unir de forma post-traduccional las dos proteínas conjuntamente in vitro. La fusión del gen de la glutaminasa con otros genes también se contempla en la presente invención, tal como fusionarlo con genes que codifican ligandos específicos de tejido de tumores, para facilitar la dirección de la glutaminasa hasta una región deseada del cuerpo.
La presente invención ofrece la posibilidad de obtener una glutaminasa libre de asparaginasa que puede tener ventajas terapéuticas sobre las enzimas glutaminasa-asparaginasa, puesto que L-asparaginasa sirve como inhibidor competitivo de la degradación de glutamina. La eliminación de la actividad asparaginasa de esta enzima también puede reducir la toxicidad para el hospedador. Actualmente no hay glutaminasas terapéuticamente útiles disponibles que carezcan de la actividad asparaginasa.
Puede conseguirse inactivar el sitio de unión de la asparagina de la glutaminasa de P7A sin afectar al sitio de unión de la glutamina, puesto que los estudios de unión con análogos de glutamina y asparagina, DON y DONV, respectivamente, indican que los sitios de glutamina y asparagina no son idénticos, aunque espacialmente están cercanos entre sí. DON une irreversiblemente la treonina en el aminoácido 20, mientras que DONV parece unirse a una treonina o serina en una región diferente de la proteína. La mutagénesis sitio dirigida correspondiente del ADN clonado puede realizarse de acuerdo con técnicas convencionales (Molecular Cloning, a laboratory manual - Sambrook y col.,
- Book2, 2ª Ed. 1989, pág. 15.80-14.133, Site-directed Mutagenesis of Cloned DNA).
A través de la mutagénesis de oligonucleótidos y deleción, puede obtenerse una enzima que es exclusivamente glutaminasa y que es lo suficientemente pequeña como para permitir la penetrabilidad mejorada en tumores y tejidos infectados por virus situados en el espacio extravascular. Puede usarse el ADN obtenido de acuerdo con el Ejemplo 1. Mediante análisis de la secuencia de aminoácidos (como se deduce a partir de la secuencia de nucleótidos) y de los datos de cristalografía de rayos X, pueden identificarse regiones de la proteína glutaminasa que no se necesitan para la catálisis o integridad estructural y puede delecionarse a nivel de ADN delecionando las secuencias de nucleótidos relevantes.
El gen de glutaminasa de la presente invención puede usarse para terapia génica transitoria. Generalmente, el gen puede dirigirse a y captarse por células transformadas y expresarse en esas células, de modo que la glutaminasa expresada inhiba el crecimiento de la célula transformada. Esta terapia tiene el beneficio de evitar la exposición sistémica al agente terapéutico, lo que puede mitigar efectos secundarios potenciales. Además, si las células se transfectan solamente de forma transitoria, como se contempla, la terapia es reversible.
Un procedimiento que se contempla para conseguir este objetivo es el uso de poli-L-lisina que se ha modificado con un ligando específico de tejido, como se describe por Wu y col., J. Biol. Chem. 266: 14338-42 (1991). Los ejemplos de dichos ligandos específicos para tejidos son el receptor de galactosa del hígado, el receptor de manosa de macrófagos, el receptor CD4 de las células T ayudantes, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF), y el receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH). El gen de la glutaminasa se colocaría bajo el control transcripcional de un promotor específico de tejido. Por ejemplo, pueden usarse los promotores de c-N-ras y c-myc para la expresión en tumores hepáticos. Estos promotores que están regulados positivamente en células transformadas, en comparación con células normales, y proporcionarían por lo tanto niveles más altos de expresión en células tumorales que en células normales. Los plásmidos están recubiertos con la poli-lisina modificada y se inyectan en el torrente sanguíneo del paciente. Las células diana captarán específicamente los complejos debido a los ligandos específicos de tejido. Las células diana expresarán específicamente la construcción de glutaminasa debido a los promotores específicos de tejido. Puesto que algunos neoplasmas han demostrado operar a un nivel marginal de disponibilidad de glutamina y la expresión de la glutaminasa en estas células agota adicionalmente la reserva de glutamina en las células tumorales, el crecimiento de estas células se inhibe específicamente. Dicho tratamiento debe ser útil tanto contra células completamente transformadas como con células en los estados tempranos de neoplasia, tal como las etapas tempranas de la infección por el virus de la hepatitis B (VHB). Puesto que el VHB activa la expresión de c-myc, también se esperaría que regule positivamente este promotor en una construcción de glutaminasa controlada por este promotor, conduciendo a un nivel de expresión alto de la glutaminasa, que debería destruir las células infectadas por el virus.
Otra técnica para mediar la captación del gen PGA por las células transformadas o células positivas para VIH utiliza liposomas. (Véase Nicolau y col., Methods in Enzymology, vol. 149, pág. 157-176 (1987). Los liposomas catiónicos que contienen un vector capaz de expresar PGA se modifican mediante la adición de ligandos o anticuerpos específicos del receptor a la bicapa del liposoma (Véase Hashimoto y col., Methods in Enzymology, vol. 121, pág. 817-829 (1986). Como con el procedimiento de la poli-lisina descrito anteriormente, se han usado los liposomas para mediar con éxito la captación específica de ADN extraño in vivo por las células del hígado a través del receptor de la galactosa.
Usando la combinación de liposomas catiónicos o polilisina como vehículos de un vector que expresa PGA y reactivos específicos de tejidos para dirigir, la glutaminasa puede expresarse muy específicamente y transitoriamente en cualquier tejido o célula de elección. Dichos reactivos específicos de tejido para dirigir incluirían anticuerpos específicos para marcadores de superficie y cualquier tipo de ligando para cualquier receptor celular específico. Por ejemplo, el gen de la glutaminasa puede suministrarse específicamente a células T CD4+ (el tipo infectado por VIH) en pacientes de SIDA usando una porción de la proteína de la cubierta del VIH que se une al antígeno CD4, como ligando en un liposoma modificado. También pueden usarse liposomas modificados con carbohidratos que contienen el sistema de expresión de PGA; el receptor de la galactosa del hígado, media la captación de dichos liposomas modificados. Además, de usar ligandos para los receptores en la superficie celular, puede utilizarse anticuerpos para marcadores
de la superficie celular de manera similar para suministrar estos reactivos a virtualmente cualquier tipo celular.
Una técnica adicional que podría ser útil en el tratamiento de pacientes con PGA es el uso de células vehículo. (Véase Rosenberg, Cancer Res. (Suppl.) vol. 51, pág. 5074-5079 (1991)). Esta técnica toma la ventaja del hecho de que ciertas células T tienen la capacidad de infiltrarse en tumores (linfocitos de infiltración tumoral). Estas células se toman del paciente canceroso, transfectado con un vector de expresión de glutaminasa, y se devuelven al paciente. Después de volver al cuerpo y de infiltrarse en el neoplasma, se proporciona un alto nivel local de glutaminasa. Como alternativa, puede utilizarse un vehículo bifuncional. En lugar de la transfección de los linfocitos de infiltración con el vector de expresión de PGA, el vector puede dirigirse a un marcador superficial específico en los linfocitos como se ha detallado anteriormente, por ejemplo usando un anticuerpo monoclonal junto con poli-L-lisina. La presencia de un ligando de dirección adicional (específico para las células tumorales) unido al vector permite la captación del vector de expresión de PGA por las células tumorales diana. Esencialmente, se usa el linfocito de infiltración como un vehículo para "arrastrar" el vector de expresión hasta el tumor.
La administración de glutaminasa a un cuerpo puede realizarse mediante cualquier medio conocido en la técnica. La glutaminasa puede dirigirse a órganos o tejidos particulares mediante la administración a las arterias que alimentan a estos órganos o tejidos o por medio de un ligando específico de órgano o tejido. Puede emplearse la conjugación directa de la enzima PGA con grupos de dirección funcionales. Estos grupos incluyen anticuerpos, lectinas, carbohidratos, hormonas, péptidos u otros compuestos que pueden interaccionar con moléculas de la superficie celular. Para ejemplos específicos de esto véase Methods in Enzymology, vol. 112, pág. 238-306 (1985).
La glutaminasa puede unirse a anticuerpos, por ejemplo, a los específicos para antígenos asociados a tumores. Se conocen diversas técnicas para complejar dos proteínas, cualquiera de las cuales puede usarse junto con la glutaminasa, siempre que no se destruyan la actividad enzimática y la capacidad de unión al anticuerpo. Las técnicas adecuadas incluyen aquellas que emplean los reactivos heterobifuncionales SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridil ditio)propionato [Carisson y col., Biochemical Journal, vol. 173, pág. 723-737 (1978)] o SMPT (4-succinimidil-oxicarbonil-\alpha-metil-\alpha-(2-piridil ditio)tolueno) [Thorpe y col., Cancer Research, vol. 47, pág. 5924-5931 (1987)]. Se han descrito gran cantidad de anticuerpos que son específicamente reactivos con antígenos asociados a tumores. Muchos están disponibles en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, incluyendo los de células tumorales de mama, pulmón y melanoma. Para una revisión de anticuerpos específicos de tumores véase Foon, Cancer Research, vol. 49, pág. 1621-1631 (1989).
Los experimentos de cultivo tisular con glutaminasa de Pseudomonas 7A (PGA) demuestran que esta enzima inhibe fuertemente la replicación del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) que crece en la línea de células T humana susceptibles H9. La presencia de 0,4 \mug de PGA/ml de medio de cultivo causó virtualmente el 100% de inhibición de la replicación viral y 0,016 \mug/ml causaron el 50% de la inhibición. Se requería una concentración mucho mayor de PGA (50 \mug/ml) para causar una toxicidad apreciable a las células hospedadoras H9 humanas. Aunque se ha demostrado la inhibición del cultivo tisular para el virus VIH-1, también pueden inhibirse otras cepas variantes.
Estos resultados del cultivo tisular indican que el PGA es mucho más tóxico para el VIH que para las células humanas hospedadoras y se espera que el PGA muestre un índice terapéutico alto cuando se administra a pacientes infectados con VIH. Además, junto con el antimetabolito de glutamina DON, PGA demostró ser particularmente exitoso en el tratamiento de cáncer de pulmón, de mama o de colon (McGregor, 1989, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 30:587).
Una molécula de ADN que codifica una glutaminasa terapéuticamente adecuada y su polipéptido correspondiente puede aislarse a partir de una célula microbiana, animal o vegetal usando sondas de oligonucleótidos preparadas de acuerdo con secuencias proteicas de glutaminasa conocidas. Preferiblemente, el ADN se aísla a partir de células de Pseudomonas 7A.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra la identificación de un clon que contiene la secuencia codificante de glutaminasa de Pseudomonas 7A y la determinación de su secuencia de nucleótidos.
El producto de glutaminasa es una enzima que degrada la glutamina (un aminoácido que participa en más procesos metabólicos que cualquier otro aminoácido) y por lo tanto impide el crecimiento. En más de dos docenas de experimentos independientes, no se ha podido donar la glutaminasa en diversos contextos. Se ha descubierto que es inclonable en trasfondos de altos números de copias tales como pUC. También se mostró refractaria a la donación en ausencia de un terminador transcripcional cadena arriba y un promotor muy estrechamente regulado.
Se aisló el ADN cromosómico de Pseudomonas 7A (un organismo aislado del suelo, que se ha depositado en la American Type Culture Collection con el número de depósito ATCC 29598) esencialmente como se ha descrito (Strom, 1986, J. Bacteriol. 165:367-372), y se digirió parcialmente con la enzima de restricción Sau3A. Los fragmentos de esta digestión que tenían un tamaño medio de 5-10 kb se aislaron mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa, y se clonaron en el sitio BamHI del vector pBR322. La biblioteca genómica resultante (en la cepa de E. coli LE392, ATCC Nº de registro 33572) se exploró usando sondas de oligonucleótidos mixtas (Wallace, y col., 1981, Nucleic Acids. Res. 9:879-89, y Paddock, G. V., 1987, Biotechniques 5:13-16). Se obtuvo la información de la secuencia peptídica parcial y se usó para deducir las tres sondas de oligonucleótidos que se muestran en la Tabla 1. Las sondas de oligonucleótidos se seleccionaron para la información de secuencia peptídica a partir del extremo amino de la enzima (sonda A), a partir del extremo carboxilo (sonda C), y a partir de un péptido cercano al centro de la proteína (sonda B). La sonda B se seleccionó para la selección inicial de 3560 transformantes resistentes a ampicilina. A partir de la selección inicial se identificaron dos clones positivos de hibridación. Estos se reseleccionaron usando la sonda A y la sonda C. Ambos clones hibridaron con la sonda A pero solamente uno de los clones pME0.5, hibridó con la sonda C. Puesto que pME0.5 había hibridado con la tres sondas, se seleccionó para análisis adicionales.
Se prepararon extractos celulares en bruto de la cepa LE392 transformada con el plásmido pME0.5 tomando alícuotas de un cultivo durante una noche y centrifugando el homogenado a 15.000 rpm para retirar las células no rotas y los restos celulares. Se ensayó la actividad glutaminasa del sobrenadante resultante mediante Nesslerización directa del amoniaco (Roberts, J., 1976, J. Biol. Chem. 251: 2119-2123). Para minimizar la actividad de interferencia por cualquiera de las enzimas glutaminasa de E. coli, el ensayo de la enzima se realizó a pH 8,0 y utilizando D-glutamina como sustrato. Ninguna enzima de E. coli es activa en estas condiciones, mientras que la glutaminasa de Pseudomonas 7A (PGA) conserva el 87% de su actividad (Pruisner, 1976, J. Biol. Chem. 251: 3447-3456 y J. Roberts, 1976, J. Biol. Chem. 251:2119-2123). Los experimentos de control con extractos celulares en bruto confirmaron la eficacia de este ensayo para medir la actividad de PGA en ausencia de actividad de glutaminasa de E. coli. No se descubrió actividad.
TABLA 1 Sondas de oligonucleótidos usadas para detectar el gen de la glutaminasa
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Para confirmar la identidad del supuesto clon de PGA, la región de homología de las sondas usada para seleccionar se localizó mediante análisis de transferencia de Southern y los fragmentos apropiados se secuenciaron parcialmente. Este análisis identificó un fragmento SalI de 1,1 Kb que hibrida con la sonda A y un fragmento SalI de 1,5 Kb que hibrida con la sonda B. Esto indicaba que había un sitio SalI dentro del gen y que la secuenciación de este sitio confirmaría inmediatamente la identidad del gen como PGA comparando la secuencia de nucleótidos con la secuencia de aminoácidos conocida. La secuenciación del fragmento SalI de 1,1 Kb mostró que este fragmento codifica los 40 aminoácidos N-terminales de la glutaminasa.
Para la secuenciación conveniente, se subclonaron diversos fragmentos de la región codificante de la glutaminasa en un plásmido basado en ColEl usando los protocolos convencionales de Sambrook y col., supra. Estos incluyen el fragmento SalI de 1,1 Kb N-terminal (pME1), el fragmento SalI de 1,5 kb C-terminal (pME2), el extremo N-terminal mutagenizado por amplificación termocíclica (pME3), y el fragmento PstI C- terminal de 200 pb (pME11). Se sintetizaron numerosos cebadores de secuenciación usando secuencias de ADN de glutaminasa predeterminadas (véase la Figura 1).
Usando el clon de longitud completa, pME0.5, y los fragmentos génicos subclonados, se secuenció el gen de la glutaminasa en ambas direcciones mediante el procedimiento de secuenciación de ADN de finalización de la cadena de Sanger Proc. Natl. Acad. Sci: USA 74:5963 (1977). Las plantillas de doble cadena purificadas se desnaturalizaron mediante el procedimiento de desnaturalización alcalina convencional.
La región codificante intacta (ID SEC Nº 1) abarca 1008 pares de bases y codifica una secuencia peptídica continua de 336 aminoácidos (sin incluir una supuesta señal secuencia de 24 aminoácidos). El extremo C se interrumpe por codones de terminación en tándem y un supuesto terminador transcripcional. En base al emparejamiento de esta información de secuencia con los datos de la secuencia peptídica, se concluyó que de hecho se había clonado el gen PGA.
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Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra la expresión del gen de la glutaminasa de Pseudomonas 7A.
Los experimentos iniciales mostraron que incluso entre promotores regulados fuertemente (por ejemplo \lambdaP_{L}) PGA era refractario a la sobreproducción. Para obtener una expresión de alto nivel controlada de la glutaminasa de Pseudomonas 7A (P7A) en Escherichia coli, en primer lugar se diseñó un nuevo vector, pME15 (véase las Figuras 3A y 3B para la clonación y la Tabla 2). La estructura principal de este vector era pME12 (véase la Tabla 2) y contiene los siguientes elementos: gen de \beta-lactamasa (que le otorga resistencia a la ampicilina), lac I(represor del operón lactosa), un terminador transcripcional T7 y un origen de replicación de bajo número de copias de tipo ColEI (obtenido de pBR322).
TABLA 2 Plásmidos usados en la construcción de un plásmido de alto nivel de expresión
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TABLA 3 Oligonucleótidos usados en la construcción de un plásmido de alto nivel de expresión
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Como promotor se seleccionó el promotor tac (híbrido de trpIIac) que contenía una secuencia operadora lac (que otorgaba susceptibilidad a la represión por lac I) (deBoer, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21 (1983), y Russel, y col., Gene 20:231 (1982). Se sintetizaron nucleótidos solapantes que se ligaron y donaron como un fragmento BamHI/HindIII en el vector de donación pUC19, dando como resultado pME7. El fragmento BamHI/EcoRI de pME7 se donó en pM12 para formar pME15. Esto proporciona el promotor tac controlado por lac I y de hecho, es inducible con isopropil-R-tio- D-galactósido (IPTG). Este promotor es activo en la misma orientación que el origen unidireccional de replicación y por lo tanto no interferirá con la propagación del plásmido. Un terminador transcripcional se presenta inmediatamente cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción, eliminando la transcripción "completa". La combinación de control mediante lac I y un terminador transcripcional cadena arriba proporciona un vector la capacidad de propagar de forma estable y expresar incluso los genes tóxicos de la glutaminasa. Además, al tener un gen lac I codificado por el plásmido permite también la independencia del hospedador
virtual.
Como se ha observado previamente, la glutaminasa de P7A de longitud completa está presente en dos fragmentos SalI: un fragmento de 1,1 Kb que contiene el extremo N-terminal del gen y un fragmento de 1,5 Kb que contiene el extremo C. Para donar este gen en un sistema de expresión, se desea manipular la secuencia en el extremo N-terminal para proporcionar sitios convenientes para endonucleasa de restricción. Esto permitiría la donación del gen en numerosos vectores de expresión establecidos además de nuestro vector pME15. Por esta razón se usaron cebadores de amplificación termocíclica (véase la Tabla 3) para generar un sitio BamHI y un sitio NdeI en el resto de lisina N-terminal. Esta mutagénesis también añade un resto metionina inmediatamente cadena arriba de la lisina N-terminal. También se añadió un sitio BamHI después del sitio SalI interno.
El fragmento N-terminal mutagenizado por amplificación termocíclica del gen de la glutamina se clonó en un vector basado en CoIEI tal como un fragmento BamHI (pME3). El polienlazador entre KpnI y EcoRV se delecionó retirando el sitio SalI endógeno, generando pME4. La glutaminasa de longitud completa se reconstituyó mediante ligamiento del fragmento SalI de 1,5 Kb, que codifica el extremo C- en el único sitio SalI de pME4, dando pME14. El fragmento BamHI de 1,7 Kb de pME14 se donó en el vector de expresión pME15. Este clon (pME16) proporciona expresión de glutaminasa dirigida por el promotor NdeltacNdel. En un intento de conseguir niveles mayores de expresión, se abrió pME16 en el sitio NdeI y se llenó usando el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa 1 de E. coli. Después del religamiento, la separación entre la secuencia Shine-Dalgarno y el sitio del inicio de la traducción se volvió óptima (véase la Tabla 3).
Este vector (pME18) es estable y dirige la expresión de glutaminasa de P7A auténtica. Se ha depositado en la American Type Culture Collection bajo los términos del tratado de Budapest el 3 de noviembre de 1992 y se le ha asignado el número de registro 69117. Para los fines de producción de proteínas, se cultivaron las células en una fase semi-logarítmica a 37ºC y se trataron con IPTG 0,4 mM durante 1-6 horas. La producción de proteínas se controló mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (Figura 4) y actividad específica de la glutaminasa. Dicho cultivo ha producido actividades de hasta 4100 U/litro de cultivo, lo que representa aproximadamente el 3% de la proteína celular total. Puesto que Pseudomonas P7A produce solamente 350 U/litro, esto representa un aumento de 12 veces en la producción de enzima.
Para asegurar que la actividad observada era una contribución de la glutaminasa de Pseudomonas en oposición a la glutaminasa de E. coli endógena A y B, se repitió la reacción con D-glutamina pH 8. Sólo la enzima de Pseudomonas funciona en estas condiciones. De hecho, esta enzima convierte la D-glutamina en glutamato con una eficacia del 87% respecto a como convierte L-glutamina. Los resultados demuestran que toda la actividad medible era contribución de PGA. También se realizaron ensayos de proteína de Bradford sobre los extractos celulares en bruto para permitir el cálculo de la actividad enzimática como actividad específica. También se realizaron muestras de cada extracto en geles de SDS-PAGE como se describe por Laemmli (Laemmli, U.K. (1970) Nature (Londres) 227: 680-685). La curva de inducción enzimática resultante se muestra en la Figura 5, donde se muestra el aumento en la actividad de glutaminasa en el extracto celular usando D-glutamina como sustrato. Como puede observarse, la actividad de la enzima que utiliza D-glutamina como sustrato aumenta más de 4000 veces después de la inducción de IPTG, mientras que el cultivo de control no muestra virtualmente un aumento en la actividad de
D-glutaminasa.
Para garantizar la traducción eficaz de la glutaminasa en E. coli se añadió un codón de metionina N-terminal (véase la tabla 3). Existía alguna preocupación sobre si este aminoácido podría alterar o no la actividad de la enzima. Para ensayar esto, se midió la actividad enzimática contra L- y D-glutamina así como L- y D-asparagina. Las proporciones de actividad entre los isómeros de D- y L- eran los mismos para la enzima nativa y la manipulada (por ejemplo, L-: D-glutamina y L-:D-asparagina). Otra preocupación era que esta alteración podría afectar de forma adversa a la semivida in vivo. Para ensayar esto, se realizaron estudios de semivida in vivo en ratones; las dos enzimas mostraron la misma semivida in vivo. En base a estos datos combinados, se concluyó que el resto metionina N-terminal adicional no altera la actividad biológica de la enzima.
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Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra el uso de secuencias de glutaminasa de P7A para identificar secuencias homólogas en otras especies bacterianas.
Se aisló ADN cromosómico de Pseudomonas aeruginosa y Achromobacter sp. usando protocolos convencionales. Después de la digestión completa con EcoRI, los fragmentos de ADN se resolvieron en un gel de agarosa al 1% de 30 cm a 50 V durante 15 horas en Tris-Cl 89 mM; pH 8; borato 98 mM y EDTA 1 mM: La transferencia y la hibridación eran como se han descrito (Maniatis y col., Molecular cloning: A laboratory Manual, pág. 382-389, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. 1982) usando condiciones rigurosas. La sonda era la región codificante del gel de la glutaminasa de P7A marcado con \alpha^{32}P-desoxicitosina trifosfato. Pista 1, Pseudomonas 7A (2 horas de exposición); pista 2, Pseudomonas aeruginosa (6 horas de exposición); pista 3, Achromobacter sp. (24 horas de exposición). Los resultados se muestran en la Figura 6.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra la inhibición in vitro de células de melanoma humano mediante glutaminasa unida a anticuerpo anti-melanoma.
Se incubaron células del melanoma humano (Heatherington) in vitro durante 30 minutos con anticuerpo anti-melanoma R24 libre, glutaminasa libre o el complejo anticuerpo-glutaminasa unido covalentemente. El complejo de anticuerpo-glutaminasa unido covalentemente se preparó utilizando el reactivo heterobifuncional SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridil ditio) propionato [Carlsson y col., Biochemical Journal, vol. 173, pág. 723-737 (1978)]. Las células se lavaron y se colocaron en medios de cultivo tisular recién preparado y se midió la incorporación de ^{3}H-timidina. La incorporación de la célula de melanoma se muestra en la Tabla 4. Ni el anticuerpo libre ni la glutaminasa libre inhibieron la incorporación de timidina. Solamente las células incubadas con el complejo de anticuerpo glutaminasa mostraban inhibición de la incorporación de ^{3}H-timidina. Por lo tanto, los dos componentes anticuerpo y glutaminasa actúan de forma sinérgica para inhibir el crecimiento tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4 
\vskip1.000000\baselineskip
5
8
9
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Roberts, Joseph
\hskip3,9cm MacAllister, Thomas W
\hskip3,9cm Sethuraman, Natarajan
\hskip3,9cm Freeman, Abbie G
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GLUTAMINASA MANIPULADA GENÉTICAMENTE Y SU USO EN TERAPIA ANTIVIRAL Y ANTICANCEROSA
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 10
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Banner, Birch, McKie and Beckett
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1001 G Street N.W.
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Washington, D.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: U.S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 20001
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: DE P4140003.8
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 4-DIC-1991
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Kagan, Sarah A
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 32.141
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 00100.41200
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 202-508-9100
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 202-508-9299
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1014 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: PSEUDOMONAS 7A
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 336 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: SI
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 2:
7 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCCGGATCCA TATGAAGGAA GTGGAGAACC AGCAG 
\hfill
35 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GCGCGGATCC GTCGACGCCA ACCTTGGCAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGATCCATAT GAAGGAAGTG GAGAAC 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCTTACTCC CCATCCCCCT GTTGACAATT AATCATCGGC TC 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 49 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GTATAATGTG TGGAATTGTG AGCGGATAAC AATTTCACAC AGGAAACAG 
\hfill
49 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 47 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCTGTTT CCTGTGTGAA ATTGTTATCC GCTCACAATT CCACACA 
\hfill
47 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TTATACGAGC CGATGATTAA TTGTCAACAG GGGGATGGGG AGTA 
\hfill
44 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTGTGAGC GGATAACAAT TTCACACAGG AAACAGGATC CATATATGAA GGAA 
\hfill
54

Claims (13)

1. Una célula de E. coli que comprende un gen que tiene la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
2. Una célula de E. coli que comprende un gen de glutaminasa-asparaginasa de Pseudomonas 7A y que está depositada en la ATCC como Nº de registro 69117.
3. La célula de la reivindicación 1 que es capaz de expresar dicho gen.
4. Una molécula de ADN aislada y purificada que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
5. Una molécula de ADN según la reivindicación 4, siendo dicha molécula capaz de expresar la glutaminasa codificada por la ID SEC Nº 1 en una célula recombinante.
6. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una glutaminasa, teniendo dicha glutaminasa la secuencia que se muestra en la ID SEC Nº 2.
7. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la expresión de la glutaminasa codificada por la ID SEC Nº 1 está controlada por un promotor inducible.
8. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que la expresión de la glutaminasa codificada por la ID SEC Nº 1 está controlada por un represor.
9. Una molécula de ADN según la reivindicación 7, en la que el promotor es tac.
10. Una molécula de ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, que comprende además un terminador transcripcional 3' y 5' respecto a la ID SEC Nº1.
11. Un ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido codificado por el clon de ADNc contenido en la ATCC Nº de registro 69117.
12. Un vector que comprende una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1.
13. Uso de una molécula de ADN que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la ID SEC Nº 1 en la fabricación de un medicamento para tratar cáncer.
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