KR20140098954A - 인슐린 점막 투과 개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변이체 TCTP-PTD를 포함하는 인슐린 점막 투과 개선용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른, 변이체 TCTP-PTD를 포함하는 점막 내 인슐린 전달용 조성물은 고분자인 인슐린의 점막 투과도를 높임으로써, 인슐린을 비 침습적 방식을 통해 체내로 전달하는 효과가 우수하다.
Description
본 발명은 점막을 통해 인슐린이 체내로 효과적으로 전달될 수 있도록 하기 위한 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein protein transduction domain)의 용도 및 이용에 관한 것이다.
약물전달 시스템에서 코 점막을 통한 비강 투여는 빠른 약효 작용 시간, 약 150 cm2로 풍부한 혈관이 분포되어 있어 상대적으로 넓은 흡수 표면적, 비침습, 간에서의 초회통과를 거치지 않으므로 생체이용율을 높일 수 있는 점 등 다양한 장점을 가지고 있어 최근 주사 및 경구 투여의 대체 경로로 주목받고 있다. 그러나 비강 투여는 점액에 의한 점막 상피조직에서의 약물의 제거, 상대적으로 빠른 점액 교체 시간, 반복 투여 시 발생할 수 있는 자극 및 독성 등과 같은 단점이 있으며, 특히 친수성이거나 분자량이 1 kDa 이상인 고분자 약물(단백질 혹은 펩타이드 치료제)은 코 점막을 잘 투과되지 않는 문제점이 있다. 따라서 환자에게 약물투여의 편리성을 높이고, 약물투여에 따른 고통을 덜어주기 위해 지난 수십 년간 다양한 비강흡수 촉진제에 대한 연구가 진행되어 왔다. 그럼에도 불구하고 비강흡수 촉진제는 낮은 분자량의 약물에서만 제한적으로 비강약물전달을 향상시키는 한계가 있으며, 몇몇 비강흡수 촉진제(예: 계면활성제, 지방산, 담즙 산염)는 코 점막을 손상시키는 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 한계점을 극복하기 위해서 최근에는 안전성이 높은 비강흡수 촉진제가 연구 개발되고 있다(Ozsoy etal.,Molecules14(2009)3754-3779).
막투과 단백질 도메인 기능을 갖는 펩타이드(protein transduction domain)는 약자로 PTD(이하 `PTD'라 한다) 혹은 CPP (cell penetrating peptide)라고 불리는 10~20개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로, 특별한 수용체의 도움 없이 세포막을 투과하는 물질을 말한다. PTD는 HIV-1의 TAT 단백질을 세포배양 배지에 첨가하면 이 단백질이 세포 내로 들어가는 것을 발견하면서 처음 알려졌으며(Green et al., 1988, Frankel et al., 1988), 이 이후에 세포막을 건너서 세포 내로 도입하는 능력을 가진 초파리의 안테나피디아 호메오 전사인자(Drosophila Antennapedia (Antp) homeotic transcription factor, Joliot et al., 1991)와 허피스 심플렉스 바이러스-1 DNA 결합단백질 VP22(herpessimplex-virus-1 DNA-binding protein VP22, Elliot et al., 1997)도 밝혀졌다. 또한 TAT 중에서도 단백질 투과를 수행하는 11개 아미노산을 포함하는 벡터를 개발하여 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결함으로써 TAT 융합 단백질을 만들어, 크기나 기능에 영향없이 세포 내로 전체 단백질(full-length protein)의 도입이 가능했음이 보고되었다(Nagahara et al., 1998).
이렇게 PTD가 다른 펩타이드 또는 단백질과 연결되어 융합 단백질을 이루어 세포 내로 수송이 가능함이 밝혀짐에 따라, PTD를 이용하여 치료목적의 약물, 펩타이드, 단백질 등을 세포 내로 수송하려는 다양한 시도가 이루어지고 있다(Morris etal.,Nat.Biotechnol.19(2001)1173-1176;Jarveretal.,Drug Discov. Today 9(2004)395-402). 특히 그 동안 비침투성 약물전달에 있어 약물로 사용하기 어려웠던 치료용 펩타이드, 단백질 및 유전자와 같은 거대 분자들의 체내 전달 효율을 PTD를 이용하여 높일 수 있을 것으로 기대되어 많은 연구들이 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 특정 서열의 PTD를 이용하여 치료 목적의 거대 약물들을 세포 내로 효과적으로 전달하여 실제로 약물의 효과가 우수하게 나타남을 직접 확인한 연구 결과는 많이 보고되지 않았다.
한편, TCTP 단백질(translationally controlled tumor protein)은 MacDonald et al.(1995)에 의해 히스타민 유리활성이 있는 IgE 의존적 히스타민 방출 인자(IgE-dependent histamine-releasing factor; 이하, HRF)로 보고된 단백질이다. TCTP는 1980년대까지 종양에 관련된 단백질(tumor-specific protein)로 알려져 왔으며, 그 합성은 종양의 증식 단계(proliferative stage)와 관련이 있을 것으로 생각되어 왔다. 마우스 적백혈병(erythroleukemia) 세포에서는 21kDa의 종양 단백질 p21으로 밝혀졌고(Chitpatima et al.,1988), 에를리히 복수암(Ehrlich ascites tumor)에서 세포성장과 관련이 있는 단백질 p23이 역시 TCTP/HRF와 동일한 것으로 밝혀졌다(Bohm et al., 1989).
본 발명자는 TCTP/HRF가 세포막을 투과할 수 있으나, TCTP/HRF의 아미노산 서열에는 대표적인 PTD의 특징인 염기성 아미노산(아리기닌, 리신)이 풍부한 특이적 부위가 없다는 점, 다른 개개의 PTD들과 유사한 아미노산 서열이 없다는 것을 확인하고 TCTP/HRF는 현재까지 알려진 PTD와 구조적으로 전혀 상이한 도메인을 갖는 것을 보고한 바 있다.
한편 당뇨 환자의 치료제로 사용되는 인슐린은 주로 피하주사를 통해서 환자에게 투여되고 있으며, 5.8kDa의 큰 분자량 및 친수성 펩타이드라는 특성상 코 점막을 투과하기 매우 어려워 비강 내 투여는 어려운 것으로 알려져 있다. 그러므로 간단한 방법을 통해 인슐린을 효과적으로 코 점막을 투과할 수 있도록 하는 방법이 필요하였다.
이에 본 발명자들은 PTD 기능을 갖는 TCTP 유래 서열(TCTP-PTD)을 이용한 점막 내 인슐린 전달 효과를 연구하던 중, 변이체 TCTP-PTD 서열과 인슐린을 혼합하여 비강으로 투여하면, 인슐린의 점막 투과율이 높아져 인슐린이 효과적으로 체내로 전달되어 혈당 강하 효과가 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 변이체 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)를 포함하는 인슐린 점막 투과 개선용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 변이체 TCTP-PTD를 이용하여 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 35로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 하나 이상 함유하는, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물을 제공한다.
상기 "펩타이드"는 TCTP(translationally controlled tumor protein)에서 유래된 것으로 막투과 기능을 갖는 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)의 변이체일 수 있다.
상기 "TCTP-PTD의 변이체"는 야생형의 비변형 TCTP-PTD(서열번호 36)와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 갖는 TCTP-PTD를 의미한다. 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 또는 결실 및 이의 임의의 조합일 수 있다.
또한 본 발명의 서열번호 1 내지 서열번호 35로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는, 서열번호 1 내지 서열번호 35의 아미노산 서열에 막투과 기능을 저하시키지 않는 아미노산을 부가하여 포함하는 펩타이드일 수 있다.
상기 변이체 TCTP-PTD는 당업자에게 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법을 통하여 각 펩타이드의 순도가 90% 이상이 되도록 제작할 수 있으며, 펩타이드 제조회사에 제조를 의뢰한 후 구입하여 사용할 수 있다.
상기 "점막"은 인체의 외부와 직접 맞닿아 있는 신체기관들의 내벽을 덮고 있는 부드러운 조직으로 모든 점액질-분비 막들을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 비강, 폐강, 질, 항문, 요도, 설하 및 구강 점막일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 인슐린의 "점막 투여"는 인슐린이 비강, 폐강, 질, 항문, 요도, 설하 및 구강을 포함하는 점막 표면으로 투여되는 것을 말하며, 인슐린과 TCTP-PTD 혼합물을 점막 표면에 접촉시킴으로써 점막 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 인슐린의 "점막 전달"은 인슐린이 선택된 점막 표면을 통하여 점막 내로 흡수됨으로써 체내로 전달되는 것을 말한다.
본 발명에 따른 서열번호 1 내지 서열번호 35로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 하나 이상 함유하는 조성물은 인슐린을 점막을 통하여 전달하는 효과가 우수하다. 따라서 상기 조성물을 사용하여 인슐린을 점막 투여 하는 경우, 인슐린의 점막 투여가 증가하여 혈중 당 농도를 효과적으로 낮출 수 있다.
본 발명의 실시예로써, TCTP-PTD는 서열번호 1 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열을 포함하는 TCTP-PTD는 세포 독성이 적으며, 인슐린의 점막 투과율을 높이는 효과가 우수하다.
상기 서열번호 1 내지 35로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 서열을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 37 내지 71의 서열을 포함하는 염기서열에 의해서 암호화되는 서열임이 바람직하다.
상기 서열번호 3을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 39를 포함하는 염기서열에 의하여 암호화될 수 있으며, 서열번호 8을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 44를 포함하는 염기서열에 의하여, 서열번호 13을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 49를 포함하는 염기서열에 의하여 각각 암호화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 점막 전달의 유효성분으로 인슐린을 추가적으로 더 포함할 수 있으며, TCTP-PTD 펩타이드 서열을 인슐린과 혼합하여 점막 투여하면 인슐린의 점막 투과율을 높여 점막 내로 인슐린을 효과적으로 전달할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 인슐린과 TCTP-PTD 펩타이드 서열은 1:1 내지 1:5 몰비(molar ratio)로 혼합될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:3의 몰비로 혼합될 수 있다.
상기 TCTP-PTD와 인슐린의 혼합은 TCTP-PTD와 인슐린이 점막 투여를 위한 복합체인 인슐린/TCTP-PTD로 제조되는 것을 말하며 바람직하게는, 인슐린 용액에 TCTP-PTD를 첨가한 후 인슐린과 TCTP-PTD가 결합을 형성할 수 있도록 혼합하는 것을 말한다. 더욱 바람직하게는 완충액에 인슐린과 TCTP-PTD를 일정 몰비로 용해시키고 결합이 형성되도록 혼합하는 것을 말한다.
혼합된 인슐린/TCTP-PTD는 상온에서 방치하여 분자가 안정화되도록 할 수 있으며, 바람직하게는 상온에서 10분간 방치할 수 있다.
상기 혼합은 TCTP-PTD와 인슐린 외에 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하여 이루어질 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 예를 들어 물, 식염수, 인산 완충액, 덱스트린, 글리세롤, 에탄올이나 이들의 조합을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 인산 완충액을 포함할 수 있다. 의약의 제조를 위해 약학적으로 허용되는 담체는 인슐린의 점막 투과를 위하여 적합한 것으로 당업자에 의하여 적절히 선택될 수 있다. 일반적으로 경구투여 경로 외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약학적으로 이용 가능한 담체는 D5W, 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액일 수 있다. 또한 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 성분을 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 인슐린 점막 투과 개선용 조성물은, 점막에서의 인슐린 전달을 촉진하기 위한 점막 송달 증강제(mucosal delivery enhancing agents)를 추가적으로 포함할 수 있다. 점막 송달 증강제는 물, 염들, 및/또는 일반적인 완충제들 그리고 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을 포함하는 제형에 첨가될 때, 최대혈액, 혈청, 또는 뇌척수액 농도(Cmax)에 의하여 혹은 농도대 시간의 플로트에서 곡선하의 면적, AUC에 의하여 측정되는 점막에서의 인슐린 점막 투과의 효과적인 증가를 나타내는 제형을 생성하는 화학물질들 및 기타 부형제들로서 정의될 수 있다.
또한 인슐린의 점막 투과도를 더욱 증진시키기 위하여, 본 발명의 인슐린 점막 투과 개선용 조성물은 흡수증진제인 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 우르소데옥시콜산, 글리코콜산 및 타우로디히드로푸시다산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 담즙산 염을 포함할 수 있다.
본 발명의 인슐린 점막 투과 개선용 조성물은 분무제, 연고제, 겔제, 액제, 좌제, 트로키제, 흡입제, 정제로 이루어진 군에서 선택되는 1종으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 인슐린 점막 투과 개선용 조성물을 투여하는 방법은 특별히 그 구체적 형태에 제한되지 않는다. 예를 들면, 건조 상태의 것 또는 용액상의 것을 그대로 투여하거나, 건조 상태의 것을 물에 일단 용해 분산시킨 후 투여할 수 있다.
본 발명의 인슐린 점막 투과 개선용 조성물을 생체에 투여할 때의 투여량이나, 투여 횟수는 투여 형태, 환자의 연령, 체중, 증상의 중독도(重篤度)에 따라 적당히 선택될 수 있지만, 바람직하게는 성인 1인당 1.0mg 내지 50mg, 바람직하게는 1.0mg 내지 20mg의 범위에서 투여될 수 있다.
또한 본 발명은 1) 서열번호 1 내지 서열번호 35로 표시되는 TCTP-PTD로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 TCTP-PTD와 인슐린을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및 2) 상기 1) 단계의 혼합물을 점막으로 투여하는 단계;를 포함하는 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법을 제공한다.
상기 제1) 단계의 혼합물의 제조는 인슐린 용액에 TCTP-PTD를 첨가한 후 인슐린과 TCTP-PTD가 결합을 형성할 수 있도록 혼합하는 것을 말하며, 더욱 바람직하게는 완충액에 인슐린과 TCTP-PTD를 일정 몰비로 용해시키고 결합이 형성되도록 혼합하는 것을 말한다. 혼합된 인슐린/TCTP-PTD는 상온에서 방치하여 분자가 안정화되도록 할 수 있으며, 바람직하게는 상온에서 10분간 방치할 수 있다.
상기 제2) 단계의 점막 투여는 제조된 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을, 목적으로 하는 점막의 표면으로 비침습적 투여하는 것을 말하며, 점막 표면으로의 투여에 의하여 활성 약물인 인슐린이 선택된 점막을 가로질러 체내로 전달되어 혈당 강하 효과를 나타낼 수 있다.
상기 점막 투과도는 인슐린이 점막 표면에 접촉한 후, 점막을 가로질러 체내로 흡수되는 정도를 말한다.
따라서, 본 발명에 따른 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법은 인슐린과TCTP-PTD를 단순 혼합하는 간단한 공정으로 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을 제조하여 인슐린의 점막 투과도를 높일 수 있으며, 주사 및 경구 투여 방식을 대체할 수 있는 비 침습적인 인슐린 투여에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른, 변이체 TCTP-PTD를 포함하는 점막 내 인슐린 전달용 조성물은 고분자인 인슐린의 점막 투과도를 높임으로써, 인슐린을 비 침습적 방식을 통해 체내로 전달하는 효과가 우수하다.
도 1은 일반 마우스의 비강 내로 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 혼합물(인슐린/TCTP-PTD)을 투여한 후, 혈당의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 몰비를 달리하여 혼합된 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 13을 일반 마우스의 비강 내로 투여한 후, 마우스의 혈당 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 제1형 당뇨 마우스에서 인슐린 단독 비강 투여, 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합 비강 투여 및 인슐린 피하주사 후 혈당의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제1형 당뇨 마우스에서 인슐린/TCTP-PTD 13 투여에 따른 점막 손상여부를 Hematoxylin-Eosin 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 몰비를 달리하여 혼합된 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 13을 일반 마우스의 비강 내로 투여한 후, 마우스의 혈당 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 제1형 당뇨 마우스에서 인슐린 단독 비강 투여, 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합 비강 투여 및 인슐린 피하주사 후 혈당의 변화를 관찰한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 제1형 당뇨 마우스에서 인슐린/TCTP-PTD 13 투여에 따른 점막 손상여부를 Hematoxylin-Eosin 염색법으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
변이체
TCTP
-
PTD 의
제조
서열번호 36의 야생형 TCTP-PTD(protein transduction domain-translationally controlled tumor protein)의 1 내지 10번 잔기를 골격으로 변이형 펩타이드를 제작하였다. 제작된 변이체 TCTP-PTD의 서열은 하기 [표 1]과 같다.
[표 1]
각 펩타이드의 순도는 95% 이상이 되도록 제작하였으며, 펩타이드 합성은 PEPTRON 사에 의뢰하여 진행하였다.
실시예
2. 마우스에서
TCTP
-
PTD
에 의한 비강 인슐린
흡수능의
평가
체중이 20~22 g인 수컷 마우스(BALB/c)를 실험동물로 공시하였고, 하룻밤 절식 후 혈당을 혈당 측정기를 이용하여 측정하였다. 공복 상태의 마우스 혈당은 90~125 mg/dL 였고, 이 혈당 수치를 최초의 혈당 100%로 환산하였다. 비강 내에 인슐린과 TCTP-PTD를 혼합한 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을 투여하기 위해 마취제인 펜토바비탈나트륨(sodium pentobarbital)을 복강 주사(투여량: 50~60 mg/kg)로 투여하여 마우스를 마취시켰다. 인슐린과 혼합하기 위한 TCTP-PTD 야생형 및 변이체의 서열은 하기 [표 2]와 같다.
[표 2]
[표 3]
인슐린 용액에 TCTP-PTD를 첨가하고 혼합하여 인슐린과 TCTP-PTD가 결합(bingding)된 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을 제조하였다. 보다 구체적으로, 5mM 인산완충액(phosphate buffer, pH 7.8)에 인슐린과 상기 [표 2]의 TCTP-PTD의 최종 농도가 각각 17.2μM과 34.4μM이 되도록 용해시킨 후, 인슐린과 TCTP-PTD가 1:2 몰비로 결합되도록 하여 인슐린/TCTP-PTD 혼합물을 [표 3]과 같이 제조하였다. 또한, 5mM 완충액에 인슐린을 단독으로 최종 농도가 17.2μM 되도록 용해시켜 대조군을 제조하였다. 혼합된 인슐린/TCTP-PTD는 상온에서 10분간 방치하여 두 분자가 안정화 되도록 하였으며, 혼합된 인슐린과 TCTP-PTD는 복합체를 형성하였다. 인슐린 단독, 인슐린/TCTP-PTD, 인슐린/TCTP-PTD3, 인슐린/TCTP-PTD8, 인슐린/TCTP-PTD13을 각각 마취된 마우스의 비강 내로 투여하였다. 구체적으로, 인슐린 투여량은 마우스의 체중(kg)당 1 IU가 되도록 하였으며, 마우스의 비강 내에 제조한 인슐린과 TCTP-PTD를 혼합한 혼합물을 비강 내 도포한 후, 240분간 혈당 측정기를 통해 혈당 변화를 모니터링 하였다.
결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일반 마우스의 비강 내에 인슐린만 투여한 처리구, 인슐린과 각각의 TCTP-PTD를 혼합하여 투여한 처리구(인슐린/TCTP-PTD, 인슐린/TCTP-PTD 3, 인슐린/TCTP-PTD 8, 인슐린/TCTP-PTD 13)의 혈당 변화를 비교한 결과 인슐린을 단독으로 비강으로 투여한 처리구와 인슐린과 야생형 TCTP-PTD를 혼합하여 비강으로 투여한 처리구는 최초 혈당과 비교하여 뚜렷한 혈당 강하 효과를 나타내지 못하는 것을 확인하였다. 그러나, 인슐린/TCTP-PTD 3, 인슐린/TCTP-PTD 8, 인슐린/TCTP-PTD 13 처리구는 최초 혈당 수치보다 혈당이 낮아졌으며, 인슐린/TCTP-PTD 8, 인슐린/TCTP-PTD 13 처리구는 뚜렷한 혈당 강하 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 특히 인슐린/TCTP-PTD 13 처리구는 비강 내 투여 즉시 혈당이 급격히 낮아지는 결과를 나타냈다. 이를 통해, 변이체 TCTP-PTD는 고분자 물질인 인슐린이 점막을 투과하여 체내로 전달되는 것을 도울 수 있으므로, 고분자 물질의 전달이 어려운 것으로 알려진 비강에서도 점막을 통해 인슐린을 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다.
실시예
3. 인슐린과
변이체
TCTP
-
PTD
13의 최적 혼합비 선정
인슐린과 TCTP-PTD의 혼합비가 점막을 통한 인슐린 전달에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 2에서 비강 내 인슐린 전달에 가장 뛰어난 효과를 보이는 것으로 확인된 변이체 TCTP-PTD 13과 인슐린의 혼합비를 달리하여 비강 점막으로 투여하고 최적의 혼합비를 선정하였다. 구체적으로, 5mM 완충액(phosphate buffer, pH 7.8)에 인슐린의 농도를 17.2μM로 고정하고 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 13의 몰비(molar ratio)를 1:0, 1:1, 1:2, 1:3이 되도록 각각 혼합하여 인슐린/TCTP-PTD13 혼합물을 제조하였다. 제조된 혼합물을 일반 마우스의 비강 내에 투여하고 90분 후(최저 혈당이 되는 시점)에 각각의 처리구의 혈당 변화를 비교하였다. 인슐린의 투여량은 마우스의 체중(kg)당 1 IU가 되도록 하였다.
결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 인슐린을 단독으로 비강으로 투여한 처리구는 투여 90분 후에도 혈당의 변화가 없었으나, 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 13을 혼합하여 비강으로 투여한 처리구에서는 1:1 내지 1:3 혼합 처리구 모두 뚜렷한 혈당 강하 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 또한 인슐린과 TCTP-PTD13가 1:2 몰비로 혼합된 혼합물의 경우, 최초 혈중 당 농도와 비교하여 약 50%의 혈중 당 농도를 나타내어, 가장 강력한 점막 투과 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예
4. 제1형 당뇨병 마우스에서
변이체
TCTP
-
PTD
13에 의한 비강인슐린 흡수 평가
실제 혈당이 높은 당뇨병 실험동물모델에서도 변이체 TCTP-PTD 13에 의한 비강 내 인슐린 전달 효율이 좋은지 판단하기 위해, 스트렙토조토신(streptozotocin)을 마우스의 복강에 주사(투여량: 60~70 mg/kg)하여 제1형 당뇨병을 유발하였다. 당뇨병 유도 시약인 스트렙토조토신 투여 10일 후에 공복상태의 혈당이 300~350 mg/dL인 마우스를 실험동물로 공시하였다. 변이체 TCTP-PTD13에 의한 비강 내 인슐린 전달 효과를 비교하기 위하여, 인슐린을 단독으로 5 IU/kg으로 비강으로 투여한 처리구와 인슐린을 1 IU/kg으로 피하주사한 처리구를 대조군으로 설정하였다. 마우스에 1IU/kg을 초과하는 인슐린을 피하주사로 주사하는 경우 마우스가 저혈당으로 사망에 이르게 되므로 1IU/kg을 인슐린을 피하주사로 주입할 수 있는 최대양으로 설정하고 대조군으로 삼았으며, 비강 투여 시, 피하주사 1IU/kg과 비슷한 정도의 효과를 낼 수 있을 것으로 기대되는 5 IU/kg을 비강 투여 실험 용량으로 삼았다. 인슐린과 변이체 TCTP-PTD 13을 1:2 몰비로 5mM 완충액(phosphate buffer, pH 7.8)에 혼합하여 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합물을 제조하고 마우스 체중(kg)당 5 IU의 인슐린을 비강 내로 투여하였다. 각각의 인슐린 투여 후 240분 동안 혈당의 변화를 확인하였다.
결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 제1형 당뇨 마우스 모델에서 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합 처리구는 인슐린 단독 투여와 비교하여 혈당 강하 효과가 우수하게 나타났다. 이를 통해, 변이체 TCTP-PTD는 인슐린의 점막 투과를 효과적으로 도울 수 있음을 확인하였다. 또한, 인슐린/TCTP-PTD 13 처리구는 피하주사 처리구와 동일하게, 투여 후 최초 90분까지 급격한 혈당 강하 효과를 나타냈으며, 투여 90분 후에는 피하주사 처리구와 최저 혈당이 유사하게 나타났다. 도 3에서 나타낸 실험결과를 이용하여, 인슐린의 생체이용률을 계산하였다. 생체이용률은 도 3에 나타난 그래프의 곡선 윗부분의 면적(area above the curve)을 사다리꼴 법칙(trapezoidal rule)을 이용하여 계산하였으며 이용한 식은 다음과 같다.
F%=(AACn .X Doses .c.)/(AACs .c.X Dosen .)X100% (Shen et al., 1999)
F%: 생체이용률(relative pharmacological bioavailability)
AAC: 도 3에 도시된 곡선 윗부분의 면적(area above the curve)
Dose: 투여량
n(nasal): 비강을 통한 인슐린 투여
s.c.(subcutaneous): 피하주사에 의한 인슐린 투여
피하주사 처리구와 비교하여 인슐린 단독 비강 투여시 인슐린의 생체이용률은 약 1%를 나타내었으며, 인슐린/TCTP13의 비강투여시 인슐린의 생체이용률은 약 21.3% 인 것을 확인하였다. 이를 통해, 인슐린을 변이체 TCTP-PTD와 혼합하여 점막으로 투여하는 경우, 인슐린의 점막 투과를 개선할 수 있으므로 인슐린 단독 투여와 비교하여 인슐린의 생체 이용률을 현저하게 증가시켜 비강 투여 시에도 인슐린의 피하주사 투여와 유사한 혈당 강하 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예
5. 인슐린/
TCTP
-
PTD
13 비강 내
투여후
,
비강내
점막의
손상여부
확인
종래 비강흡수 촉진효과를 나타내는 것으로 알려진 계면활성제, 지방산 담즙산염 등은 코 점막을 손상시키는 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 변이체 TCTP-PTD 13의 비강 내 인슐린 전달 촉진도 코 점막의 손상을 수반하는지 여부를 확인하기 위하여 당뇨병을 유발한 마우스의 비강 내에 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합물을 투여하고 코 점막의 손상을 확인하였다. 구체적으로 비중격(septum)으로 나뉘어 있는 두 개의 콧구멍 중 오른쪽 콧구멍에는 인슐린/TCTP-PTD 13 혼합물을 하루에 한번 7일간 반복 투여하였으며, 왼쪽 콧구멍에는 아무것도 투여하지 않았다. 7일간 반복 투여 후, 코 점막의 손상 여부를 조직학적인 평가방법으로 확인하기 위하여 마우스를 희생시키고 머리 조직을 채취하였다. 채취한 조직 샘플은 24 시간 동안 10% 포르말린으로 고정하였고, 고정 후 4M의 개미산(formic aicd)을 이용하여 28 시간 4 ℃에서 탈회작업(decalcification)을 하였다. 탈회작업 후, 통상적인 방법으로 파라핀 포매 후 절편을 5μm 두께로 절단하여 헤마톡실린-에오신(Hematoxylin-Eosin) 염색을 실시하였다. 염색 후, 코 점막의 구조적 변화, 비강 섬모(nasal cilia)의 손상, 코 점막 세포의 손실(nasal epithelial cell loss)등을 광학현미경 이용하여 관찰하여 점막의 손상여부를 확인하였다.
결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 인슐린/TCTP-PTD 13을 투여한 오른쪽 콧구멍의 점막(a)과 대조구인 왼쪽 콧구멍의 점막(b)를 비교한 결과, 오른쪽 콧구멍에서도 코 점막의 구조적 변화, 비강 섬모(nasal cilia)의 손상, 코 점막 세포의 손실(nasal epithelial cell loss)등이 발견되지 않았다. 따라서, 변이체 TCTP-PTD 13은 기존 비강 흡수 촉진제와 달리 점막을 손상시키지 않으면서 비강 점막을 통한 인슐린 투과능을 개선시킬 수 있는 효과가 있음을 확인하였다.
<110> University - Industry Collaboration Foundation
<120> A composition for improving of insulin transmucosal ability
<130> p13-001-EHAW
<160> 71
<170> KopatentIn 2.0
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<400> 64
atgattattt ttcgcattct gattagccat aaaaaa 36
<210> 65
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 29
<400> 65
ctgattattt ttcgcattct gattagccat cgccgc 36
<210> 66
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 30
<400> 66
ctgattattt ttcgcattct gattagccat catcat 36
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 31
<400> 67
ctgattattt ttcgcattct gattagccat aaa 33
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 32
<400> 68
ctgattattt ttcgcattct gattagccat cgc 33
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 33
<400> 69
ctgattattt ttcgcattct gattagccat 30
<210> 70
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 34
<400> 70
ctgattattt ttgcgattgc ggcgagccat aaaaaa 36
<210> 71
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TCTP-PTD 35
<400> 71
ctgattattt ttgcgattct gattagccat aaaaaa 36
Claims (14)
- 서열번호 1 내지 서열번호 35로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 하나 이상 함유하는, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 막투과 기능을 갖는 TCTP-PTD(translationally controlled tumor protein-protein transduction domain)인 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 TCTP-PTD는 서열번호 3, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 3을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 39를 포함하는 염기서열에 의해서 암호화되는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 8을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 44를 포함하는 염기서열에 의해서 암호화되는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 서열번호 13을 포함하는 TCTP-PTD는 서열번호 49를 포함하는 염기서열에 의해서 암호화되는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린을 더 포함하는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 인슐린은 펩타이드와 1:1 내지 1:5 몰비(moalr ratio)로 혼합되는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 점막은 비강, 폐, 질, 항문, 요도 및 구강 점막으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 점막인 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 인산완충액(phosphate buffer)을 더 포함하는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분무제, 연고제, 겔제, 액제, 좌제, 트로키제 및 흡입제로 이루어진 군에서 선택되는 1종으로 제형화되는 것인, 인슐린 점막 투과 개선용 조성물.
- 1) 서열번호 1 내지 서열번호 35로 표시되는 TCTP-PTD로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 TCTP-PTD와 인슐린을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 및
2) 상기 1) 단계의 혼합물을 점막으로 투여하는 단계를 포함하는 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법. - 제12항에 있어서, 상기 1) 단계의 TCTP-PTD와 인슐린을 1:1 내지 5:1 몰비(molar ratio)로 혼합하는, 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 2) 단계의 점막은 비강, 폐, 질, 항문, 요도 및 구강 점막으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 점막인, 인슐린의 점막 투과도를 높이는 방법.
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