JP2019522020A - 細胞膜に浸透する能力を有するペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、細胞膜に浸透する能力を有する、新規の転写制御型腫瘍タンパク質由来タンパク質形質導入ドメイン（translationally controlled tumor protein derived-protein transduction domain：ＴＣＴＰ−ＰＴＤ）、およびその使用に関する。本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、標的物質の細胞膜に浸透する能力を改善することができ、それにより、細胞、組織および血液を含む生体内に、標的物質を効果的に送達することができる。したがって、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、in vitroでの研究目的のために用いることができ、ならびに多様な疾患の処置、造影剤の送達などを含む臨床的な目的のために用いることができ、ならびにまた診断目的のために、および化粧品用途において用いることができる。

Description

本発明は、細胞膜に浸透する能力を有する、新規の転写制御型腫瘍タンパク質由来タンパク質形質導入ドメイン（translationally controlled tumor protein-derived protein transduction domain：ＴＣＴＰ−ＰＴＤ）、および細胞膜を通して体内に標的物質を有効に送達するためのＴＣＴＰ−ＰＴＤの使用に関する。
膜貫通型タンパク質ドメインとして機能するタンパク質形質導入ドメイン（protein transduction domain）（本明細書において以後「ＰＴＤ」として言及される）は、細胞浸透性ペプチド（CPP）として知られるペプチドである。
近年、ＰＴＤは、多様な物質（例えばDNA、siRNA、ペプチド、タンパク質など）を細胞中に効率的に送達するためにしばしば用いられてきた（Morris et al., Nat. Biotechnol. 19 (2001) 1173-1176；Jarver et al., Drug Discov. Today 9 (2004) 395-402）。ＰＴＤベースの薬物送達は、非浸透性の薬物の送達により薬物として使用することは困難であった治療用のペプチド、タンパク質および遺伝子などのマイクロカプセルのin vivoでの送達効率を増大させることができるので、多大な注目を集めてきた。本発明は、先に見いだされ、報告されたヒト転写制御型腫瘍タンパク質（translationally controlled tumor protein：TCTP）由来ＰＴＤ（本明細書において以後「ＴＣＴＰ−ＰＴＤ」として言及される）である（韓国特許第10-0859972号）。
発明の開示
技術的課題
本発明は、in vivoで物質を有効にターゲティングすることができる細胞膜浸透性ペプチドを開発するために広範な努力を行い、結果として、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの多くのバリアントを得、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよびそのバリアントが、多様な用途を有することを見出し、それにより、本発明を完成した。
課題の解決
新規のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドを提供することは、本発明の目的である。
本発明の別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドを含む複合体を提供することである。
本発明のなお別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質を含む複合体を提供することである。
本発明のなお別の目的は、標的疾患を予防または処置するための方法を提供することであって、該方法は、ペプチドおよび標的物質の複合体を対象に投与することを含む。
本発明のなお別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質を含む遺伝子導入キットを提供することである。
本発明のなお別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドをコードする核酸を提供することである。
本発明のなお別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドを含む組成物を提供することである。
本発明のさらに別の目的は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドを含む処方物を提供することである。
発明の有利な効果
本発明によるＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、標的物質が細胞膜に浸透する能力を改善することができ、それにより、細胞、組織および血液を含む生体内に標的物質を有効に送達することができる。
図１は、ＦＩＴＣ標識ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチド（配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４、および配列番号２７）で処置された子宮頸癌ＨｅＬａ細胞におけるin vitroでのＴＣＴＰ−ＰＴＤの膜浸透を試験した結果を示す。 図２は、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞（気管支上皮細胞）におけるＬ−ＰＴＤ１３およびＤ−ＰＴＤ１３の細胞膜浸透を試験した結果を示す。 図３は、インスリンと配列番号１との混合物の鼻内投与の後の非糖尿病マウスの血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。 図４は、インスリンとＴＣＴＰ−ＰＴＤ（配列番号１２、１７または２２）との混合物の鼻内投与の後の非糖尿病マウスの血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。 図５は、インスリンと配列番号１８との混合物の鼻内投与の後の非糖尿病マウスの血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。
図６は、インスリンのみを鼻内投与された１型糖尿病モデルマウス（インスリンのみ）、インスリンと各ＴＣＴＰ−ＰＴＤとの混合物を鼻内投与された同モデルマウス（インスリン／配列番号２７、インスリン／配列番号２２、インスリン／配列番号２４、インスリン／配列番号１８）、およびインスリンを皮下投与された同モデルマウス（皮下注射）の血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。 図７は、インスリンのみを鼻内投与されたラット（インスリンのみ）、インスリンと各バリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤとの混合物を鼻内投与されたラット（インスリン／配列番号２７、インスリン／配列番号２２、インスリン／配列番号２４、インスリン／配列番号１８）、およびインスリンを皮下投与されたラット（皮下注射）の血中インスリン濃度の変化を示すグラフである。 図８は、マウスへのＥｘ−４と本発明のバリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤと混合物（配列番号２７、１、４２、４６または１８）の投与後、およびグルコースの腹腔内投与後の、非糖尿病マウスの血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。 図９は、マウスへのＥｘ−４と本発明のバリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤ（配列番号２７、１８、２２または２４）との混合物の投与の後、およびグルコースの腹腔内投与の後、４時間にわたり測定された、２型糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）の血中グルコースレベルの変化を示すグラフである。 図１０は、図９において示される血中グルコースレベルのＡＵＣを計算した結果を示すグラフである（データは、平均値±ＳＥＭとして表す。エキセンディン−４に対して、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、およびエキセンディン−４／ＰＴＤ１３に対して、†ｐ＜０．０５）。
図１１は、Ｅｘ−４を単独で鼻内投与されたラット群（Ｅｘ−４）、Ｅｘ−４と各バリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤ（Ｅｘ−４／配列番号２７、Ｅｘ−４／配列番号２２、Ｅｘ−４／配列番号２４、またはＥｘ−４／配列番号１８）との混合物を投与されたラット群、およびＥｘ−４を皮下投与されたラット群の各々の、血中エキセンディン−４濃度を測定した結果を示すグラフである。 図１２は、ＦＩＴＣ標識ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチド（配列番号１、２２、２４、１２、１７および１８）が、毛包および皮膚の真皮に到達したことを示す画像を表す。 図１３は、ＦＩＴＣ標識Ｄ−ＰＴＤ１３およびＬ−ＰＴＤ１３が、毛包および皮膚の真皮に到達したことを示す画像を表す。 図１４は、ＯＶＡとＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３との混合物の鼻腔中への投与後に採取した鼻腔組織の蛍光顕微鏡観察の結果を示す。（ａ）ＯＶＡの単独での鼻空中への投与。（ｂ）ＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３混合物の鼻腔中への投与。（ｃ）ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物の鼻腔中への投与。
図１５は、ＯＶＡとＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３との混合物の鼻腔中への投与の後の、血漿中の抗原（ＯＶＡ）特異的ＩｇＧ力価を測定した結果を示すグラフである。−ＯＶＡ単独：ＯＶＡを単独で鼻内投与された群；−ＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３（１：１５および１：３０）：それぞれ１：１５および１：３０のモル比で混合された、ＯＶＡおよびＬ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：１５および１：３０）：それぞれ１：１５および１：３０のモル比で混合された、ＯＶＡおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ ｉ．ｍ：ＯＶＡを筋肉内注射された群。
図１６は、ＯＶＡとＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３との混合物を鼻腔中に投与した後で得られた鼻洗浄液中の、抗原（ＯＶＡ）特異的分泌型ＩｇＡ分泌（ＯＤ値）を測定した結果を示すグラフである。−ＯＶＡ単独：ＯＶＡを単独で鼻内投与された群；−ＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３（１：１５および１：３０）：それぞれ１：１５および１：３０のモル比で混合された、ＯＶＡおよびＬ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：１５および１：３０）：それぞれ１：１５および１：３０のモル比で混合された、ＯＶＡおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ ｉ．ｍ：ＯＶＡを筋肉内注射された群;−対照：未処置群。
図１７は、ＯＶＡとＤ−ＰＴＤ１３との混合物またはＯＶＡ、Ｄ−ＰＴＤ１３およびＣｐＧの混合物を鼻腔中に投与した後の、血漿中の抗原（ＯＶＡ）特異的ＩｇＧ力価を測定した結果を示すグラフである。−ＯＶＡ単独：ＯＶＡを単独で投与された群；−ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：３０）：１：３０のモル比で混合されたＯＶＡおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ／ＣｐＧ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：１：３０、１：３：３０および１：６：３０）：それぞれ、１：１：３０、１：３：３０、および１：６：３０のモル比で混合された、ＯＶＡ、ＣｐＧおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ ｉ．ｍ：ＯＶＡを筋肉内投与された群。
図１８は、ＯＶＡとＤ−ＰＴＤ１３との混合物またはＯＶＡ、Ｄ−ＰＴＤ１３およびＣｐＧの混合物を鼻腔中に投与した後の鼻洗浄液中の抗原（ＯＶＡ）特異的分泌型ＩｇＡ分泌（ＯＤ値）を測定した結果を示すグラフである。−ＯＶＡ単独：ＯＶＡを単独で投与された群；−ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：３０）：１：３０のモル比で混合されたＯＶＡおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ／ＣｐＧ／Ｄ−ＰＴＤ１３（１：１：３０、１：３：３０および１：６：３０）：それぞれ、１：１：３０、１：３：３０、および１：６：３０のモル比で混合された、ＯＶＡ、ＣｐＧおよびＤ−ＰＴＤ１３を投与された群；−ＯＶＡ ｉ．ｍ：ＯＶＡを筋肉内投与された群；−対照：未処置群。
図１９は、単独での、またはＤ−ＰＴＤ１３もしくはＬ−ＰＴＤ１３と組み合わせての、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の鼻内投与の後の、時間の関数としての体重の変化を示すグラフである。−体重の変化（％）：初期体重を１００％としての相対的な体重変化。
図２０は、単独での、またはＤ−ＰＴＤ１３もしくはＬ−ＰＴＤ１３と組み合わせての、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の鼻内投与の１０日後に測定された体重を示すグラフである（*：ｐ＜０．０５）。−体重（初期値の％）：初期体重を１００％としての相対的な１０日後の体重。 図２１は、単独での、またはＤ−ＰＴＤ１３もしくはＬ−ＰＴＤ１３と組み合わせての、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の鼻内投与の後の累積摂食量を時間の関数として示すグラフである。 図２２は、単独での、またはＤ−ＰＴＤ１３もしくはＬ−ＰＴＤ１３と組み合わせての、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の鼻内投与の後１０日間にわたる総摂食量を示すグラフである（*：ｐ＜０．０５）。
図２３は、２ｍｇ／ｋｇの［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を、Ｄ−ＰＴＤ１３、Ｄ−ＰＴＤ１３Ｍ１、Ｄ−ＰＴＤ１３Ｍ２またはＤ−ＰＴＤ１３Ｍ３と組み合わせてマウスに１０日間にわたり鼻内投与した後で測定された体重の変化を示す（１群あたり６〜７個体のマウス；ＰＢＳに対して、*：ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１、Ｄ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３（#）、Ｄ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ１（*）、ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ２（$）、ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ３（†））。 図２４は、２ｍｇ／ｋｇの［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を、Ｄ−ＰＴＤ１３、Ｄ−ＰＴＤ１３Ｍ１、Ｄ−ＰＴＤ１３Ｍ２またはＤ−ＰＴＤ１３Ｍ３と組み合わせてマウスに１０日間にわたり鼻内投与した後で測定された摂食量を示す（１群あたり６〜７個体のマウス；*：ＰＢＳに対して、ｐ＜０．０５、**：ｐ＜０．０１、***：ｐ＜０．００１、Ｄ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３（#）、Ｄ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ１（*）、ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ２（$）、ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ３（†））。
図２５は、正常白色ラットにおける経鼻用インスリン処方物のＰＤを評価した結果を示す。 図２６は、経鼻用インスリン処方物の単一用量毒性を評価した結果を示す。 図２７は、経鼻用インスリン処方物のＰＫを評価した結果を示す。 図２８は、１型糖尿病ラットにおける経鼻用インスリン処方物のＰＤを評価した結果を示す。 図２９は、経鼻用インスリン処方物の繰り返し用量の毒性を評価した結果を示す（鼻粘膜の組織学的評価）。 図３０は、経鼻用インスリン処方物の繰り返し投与の後での鼻洗浄液中のＬＤＨレベルを測定した結果を示す。
図３１は、経鼻用インスリン処方物の繰り返し用量の毒性を評価した結果を示す（血清生化学的検査）。 図３２は、経鼻用インスリン処方物の繰り返し用量の毒性を評価した結果を示す（組織病理学的検査）。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において以後、本発明を詳細に記載する。一方、本発明において開示される特徴および態様はまた、他の特徴および態様に適用することができる。すなわち、本発明において開示される多様な要素の全ての組み合わせは、本発明の範囲内に該当する。さらに、本発明の範囲は、以下の詳細な説明により限定されるものとは考えられない。
上記の課題を達成するための本発明の一側面は、新規のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドである。本発明のペプチド配列は、当該ペプチドを含む複合体の特徴、浸透能力、効力および溶解度に対する、ペプチド配列の各々の位置におけるアミノ酸の効果を同定して、これらの特徴を最適化することにより決定される、アミノ酸からなる。具体的には、本発明の新規のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、各々の位置におけるアミノ酸の重要な特徴を示すことにより、各々の位置におけるアミノ酸の特性と機能との間の情報に基づいて決定される、配列の組み合わせとして現れる。例えば、ある特定のアミノ酸配列は、標的物質の経粘膜送達において非常に重要な領域であり、各々のアミノ酸置換基は、標的物質（例えば、インスリン、エキセンディン−４、ワクチンなど）を送達する能力を増大することができる。
したがって、本発明の一側面は、以下のアミノ酸配列：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、ＬまたはＰから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ５は、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、ＨまたはＬから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ９は、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＰまたはＬから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＫＫ、ＫＫＫ、およびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
ただし、配列は、ＭＩＩＦＲＩＡＡＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＡＬＩＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＡＡＡＳＨＫＫ、ＬＩＩＦＲＩＡＡＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＩＡＡＹＨＫＫ、ＭＩＩＦＫＩＡＡＳＨＫＫ、ＬＩＩＦＲＩＬＩＳＨＫＫ、またはＭＩＩＦＲＩＬＩＳＨＫＫではない、
からなる、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドである。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１〜２６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドであってよい。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１、１２、１７、１８、２２および２４からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドであってよい。
特に、本発明のペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列からなるペプチドのバリアントを含み、ここで、当該バリアントは、共通して「ＭＩＩＦＲ」配列を含むペプチドであり、ここで、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６〜１０におけるアミノ酸のうちの１つ以上は、置換されている。具体的には、バリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６におけるＡがＬまたはＩで置換されているか、当該アミノ酸配列の位置７におけるＬがＡで置換されているか、当該アミノ酸配列の位置８におけるＩがＡであるか、当該アミノ酸配列の位置９におけるＳがＹで置換されているか、当該アミノ酸配列の位置１０におけるＨが、Ｐで置換されているものであってよい。より具体的には、ペプチドは、配列番号１２、１７、１８、２２または２４のアミノ酸配列からなるペプチドであってよいが、これらに限定されない。
本発明のペプチドは、細胞膜に浸透する能力を有する新規のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドである。本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、細胞膜に浸透する優れた能力を有し、生きている組織中に標的物質を送達する優れた効果を有する。
本明細書において用いられる場合、用語「細胞膜」とは、細胞の内部とその外側の環境との間の境界を形成する膜を指す。本発明の一態様において、細胞膜は、任意の生物、例えば、細菌、古細菌または真核生物に属する単細胞または多細胞生物の細胞膜であってよい。真核生物は、原生生物、真菌、植物界または動物界に属する任意の生物であってよい。動物は、ヒトを含む任意の動物であってよい。
本発明において、「細胞膜」とは、任意の型の細胞の膜であってよい。例えば、「細胞」は、上皮細胞、筋肉細胞、免疫細胞および内皮細胞からなる群より選択される１つ以上の細胞であってよい。細胞は、身体の外部と直接接触する器官の壁を裏打ちする細胞層、例えば内皮、上皮、粘膜など、または体内の任意の器官もしくは血管の表面を被覆する細胞層の中の細胞であってよい。本発明の一態様において、細胞は、皮膚上皮細胞、濾胞上皮細胞、粘膜上皮細胞、角膜上皮細胞、頭皮上皮細胞、角膜内皮細胞、および血管内皮細胞を含む。例えば、粘膜上皮細胞は、鼻、肺、膣、直腸、肛門、尿道、舌下、眼、結膜および口腔の粘膜からなる群より選択される１つ以上の粘膜の上皮細胞であってよい。例えば、血管内皮細胞は、血液脳関門を形成する脳血管を含む多様な動脈、静脈および毛細血管の内皮細胞、リンパ管の内皮細胞、心臓内壁の内皮細胞などであってよい。さらに、細胞は、子宮頸癌、乳癌、肝臓癌、肺癌などを含む多様な癌の細胞であってよい。加えて、細胞は、ホルモン、神経伝達物質、薬物などを含む多様な物質の受容体を有する細胞であってよい。例えば、細胞は、インスリン受容体またはグルカゴン様タンパク質１（ＧＬＰ１）受容体を有する細胞であってよい。しかし、細胞は、上記の例に限定されない。
本発明のペプチドは、９０％またはそれより高いペプチド純度を有するように、当業者に公知の慣用的なペプチド合成方法または調製方法により調製することができる。例えば、本発明のペプチドは、直接合成しても、ペプチド製造会社により生成されてもよい。ペプチドは、Ｄ型またはＬ型ペプチド、またはＤ型もしくはＬ型ペプチドからなる配列の一部のみのペプチド、またはそのラセミ形態として、当業者に公知の慣用的なペプチド合成方法または調製方法により、調製することができる。さらに、ペプチドの安定性を増大させるために、当業者に公知の他の慣用的な修飾を行ってもよい。
本発明の別の側面は、ペプチドを含む複合体である。
本発明のなお別の側面は、ペプチドと標的物質との複合体である。
本発明のなお別の側面は、標的疾患を予防または処置するための方法であって、該方法は、ペプチドと標的物質との複合体を対象に投与することを含む。標的疾患は、複合体中に含まれる標的物質に依存して変化し得る。
本明細書において用いられる場合、用語「複合体」とは、１つ以上のペプチドと、１つ以上の標的物質とを含む材料を意味する。本発明において、「複合体」は、ペプチドと標的物質とを、１：１、１：１より大きい数、１より大きい数：１、または１より大きい数：１より大きい数の比において含み得る。例えば、複合体は、ペプチドと標的物質とを、１：１〜１：１００、または１００：１〜１：１のモル比で含み得る。しかし、モル比は、単なる例であって、これらに限定されるものではない。本発明において、複合体は、ペプチドおよび標的物質の単純な混合により形成される複合体、ペプチドおよび標的物質を混合することにより形成される複合体、またはペプチドおよび標的物質を化学的に連結または抱合させることにより形成される複合体である。さらに、複合体のペプチドおよび標的物質は、物理的結合、化学的結合、共有結合もしくは非共有結合により互いに連結されていても、または、メディエーターにより互いに複合もしくは融合していてもよい。標的物質がタンパク質である場合、ペプチドをコードする配列を、タンパク質をコードする配列に付加してもよく、および、配列をリンカーを介して互いに連結させて、細胞に浸透するか生きている組織または血液中に送達されることができる融合タンパク質を形成させてもよい。しかし、複合体を形成するための方法は、限定されない。
本発明の一態様において、「複合体」とは、ペプチドと標的物質との単純な混合物であってよい。
本発明の別の態様において、「複合体」とは、ペプチドと標的物質との混合により形成される複合体であってよい。例えば、ペプチドおよび標的物質を、バッファー中に溶解して、互いに特定のモル比において混合してもよい。混合した後、安定化のために、混合物を特定の温度、例えば室温または低温（４℃）で、特定の時間、例えば１秒間〜１時間にわたり、静置してもよい。上の温度および時間は、単に説明的なものであり、これらに限定されるものではない。
本発明のなお別の態様において、「複合体」とは、ペプチドと標的物質とが、化学結合により互いに連結している複合体であってよい。例えば、化学結合は、共有結合または非共有結合であってよい。例えば、特定の官能基またはリンカーを、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドと標的物質との各々に結合させて、次いで、ペプチドと標的物質との間に、特定の官能基またはリンカーにより化学結合を形成させてもよい。化学結合は、アミン反応、チオール反応、カルボン酸反応、ヒドロキシル反応、アルデヒド反応、ケトン反応、アクリル酸反応、アジド反応、アルキン反応、カテコール反応およびピロガロール反応から選択されるいずれか１つの反応により形成させることができるが、これらに限定されない。
化学反応がアミン反応により形成される場合、アミン基は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、イソチオシアネート、イソシアネート、アクリルアジド、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド）エステル、塩化アシル、塩化スルホニル、アルデヒド、エポキシド、フルオロベンゼンまたは無水コハク酸が、他方に連結することができる。アミン基とイソチオシアネートとの間の反応は、イソチオウレア結合を形成し得；アミン基とイソシアネートとの間の反応は、イソウレア結合を形成し得；アミン基とアシルアジド、ＮＨＳエステル、塩化アシルまたは無水コハク酸との間の反応は、アミド結合を形成し得；アミン基と塩化スルホニルとの間の反応は、スルホンアミド結合を形成し得；アミン基とアルデヒドまたはエポキシドとの間の反応は、アミン結合を形成し得；アミン基とフルオロベンゼンとの間の反応は、アリールアミン結合を形成し得る；しかし、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。
化学反応がチオール反応により形成される場合、チオール基は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、ヨードアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイル、フルオロベンゼンまたはビニルスルホンが、他方に連結することができる。チオール基と、ヨードアセチル、マレイミド、アジリジン、アクリロイルまたはビニルスルホンとの間の反応は、チオエーテル結合を形成し得、チオール基とフルオロベンゼンとの間の反応は、アリールチオエーテルを形成し得る；しかし、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。
化学反応がカルボン酸反応により形成される場合、カルボン酸基はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、ジアゾ酢酸が他方に連結することができる。この場合、結合は、エステル結合であってよいが、この例に限定されない。
化学反応がヒドロキシル反応により形成される場合、ヒドロキシル基は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、イソシアネートが、他方に連結することができる。この場合、結合は、カルバメート結合であってよいが、この例に限定されない。
化学反応がアルデヒド反応により形成される場合、アルデヒド基はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、ヒドラジドまたはアミンが他方に連結することができる。アルデヒド基とヒドラジドとの間の反応は、ヒドラジン結合を形成し得、アルデヒド基とアミンとの間の反応は、シッフ塩基を形成し得るが、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。
化学反応がケトン反応により形成される場合、ケトン基はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、ヒドラジドまたはアミンが他方に連結することができるが、本発明の範囲は、この例に限定されない。
化学反応がアクリル酸反応により形成される場合、アクリル酸はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、ジアゾ酢酸またはアルケンが、他方に連結することができるが、本発明の範囲は、この例に限定されない。
化学反応がアジド反応により形成される場合、アジド基はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、アルケンが他方に連結することができる。この場合、チアゾリンが形成され得るが、本発明の範囲は、この例に限定されない。
化学反応がアルキン反応により形成される場合、アルキンはＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に結合することができ、アジド基が他方に連結することができる。この場合、トリアゾールが形成され得るが、本発明の範囲は、この例に限定されない。
化学反応がカテコール反応またはピロガロール反応により形成される場合、カテコール反応はＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質のうちのいずれか一方に連結することができ、アミンまたはチオール基が他方に連結することができるが、本発明の範囲は、この例に限定されない。
本発明の一態様において、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドと標的物質との間の結合が共有結合である場合、結合は、ペプチド結合、マレイミドリンカー結合、ジスルフィド結合、またはスルファニル（二官能性）結合であってよい。本発明の別の態様において、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドと標的物質との間の結合が非共有結合である場合、結合は、電荷依存性結合であってよい。しかし、結合は、これらの例に限定されない。
本発明の一態様において、「複合体」中のペプチドおよび標的物質は、リンカーにより互いに連結することができる。リンカーは、当該分野において公知の任意のリンカーであってよい。
しかし、化学結合の種類および用いられるリンカーまたは官能基の種類は、上記の例に限定されない。
本発明の別の態様において、「複合体」は、ペプチドと標的物質との融合体の発現により形成された複合体であってもよい。例えば、ペプチドおよび標的物質を発現する遺伝子が、単一のベクター中に挿入され、次いで、当該ベクター中の遺伝子が発現されるようにベクターにより生体が形質転換される場合、ペプチドおよび標的物質を、融合タンパク質として発現させてもよい。ペプチドおよび標的物質が融合タンパク質として発現される場合、ペプチドと標的物質との間に任意のリンカーを含めることができる。例えば、リンカーは、１つ以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってよい。ペプチドリンカーは、例えば、１〜１００個または２〜５０個の任意のアミノ酸からなるポリペプチドであってよい。ペプチドリンカーは、例えば、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含んでもよく、または、ＴｈｒおよびＡｌａなどの天然のアミノ酸を含んでもよい。ペプチドリンカーに好適なアミノ酸配列は、当該分野において公知である。一方、リンカーは、複合体の機能に影響を及ぼさないように決定された長さを有していてよい。具体的には、リンカーは、合計で１〜１００または２〜５０個の、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＡｌａからなる群より選択される１つ以上の残基を含んでいてよいが、これらに限定されない。
本発明の複合体は、ペプチドおよび標的物質に加えて、特定の細胞または特定の細胞内小器官をターゲティングすることができる部分、ペプチド部分を、ｐＨの変化、特定の酵素のレベル、温度などの特定の環境において活性化され得るようにする部分、ペプチドおよび標的物質を、特定の環境条件下において互いに分離することができるようにする部分、ペプチドおよび標的物質が複合体などを形成する場合に用いられるリンカー部分または化学部分を含む、多様な特定の部分を含んでもよい。例えば、ＰＴＤは、局所疾患環境を有する局所部位（例えば梗塞、がん、炎症など）にマイクロ波、超音波、高周波などを適用する前には、その機能を示さず、次いで、細胞または環境特異的な複数の機能を有する標的物質が送達され得るように標的物質の送達を促進する特定の変化した環境において、ＰＴＤは、その機能を示す。in vivoでの複合体の安定性を増大させるために、および複合体の薬物動態を改善して、それにより効力を最大化するか、副作用を軽減するために、多様な部分を複合体に付加することができる。さらに、標的物質が共にＰＴＤにより細胞質に送達される効率を増大させるために、複合体は、細胞質への標的物質の放出を促進する因子を含んでもよい。複合体中のペプチドおよび標的物質の位置は限定されず、複合体は、特定の機能を示すことができるさらなる部分、複合体の機能を制御すること、または特定の環境において複合体を消化することができる部分を含んでもよい。かかる部分は、上記の例に限定されない。
複合体は、多様なナノキャリアとして形成させてもよい。ナノキャリアとして、リポソームまたはミセルなどの膜脂質ベースのナノキャリアは、疾患の診断および処置のために用いることができるように、特定の細胞または分子をターゲティングすることができるリガンドにより、または、分子イメージングのための官能基により修飾することができる。本発明のペプチドをリガンドとして用いてリポソームまたはミセルが修飾される場合、リポソームまたはミセルにより囲まれた薬物またはナノ粒子の細胞内送達を増大させることができる。
本発明の一態様において、標的物質は、細胞中（細胞質または核）に送達された後で、生理学的活性の制御に関与するか、薬理学的効果を示すことができる物質、または、それが送達されるべき多様な生物学的部分（細胞、組織、細胞内物質または血液を含む）において生物学的活性を有する物質のいずれかを意味する。例えば、本発明における標的物質は、化学化合物、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質、天然の生成物、半合成の物質、ナノ粒子、リポソーム、脂質ベースの処方物、ウイルス、量子ドット、蛍光色素および薬物からなる群より選択される１つ以上であってよい。
本発明の別の態様において、薬物は、化学薬物、生物学的製剤、核酸薬、ペプチド薬、タンパク質薬、天然生成物の薬物、半合成の薬物、脂質薬物、酵素、調節因子、増殖因子、ホルモン、造影剤および抗体からなる群より選択される１つ以上であってよい。
本発明の別の態様において、用語「生物学的製剤（biodrug）」とは、（本来の）生体製剤（biologic）および後発生物製剤（biogeneric）、バイオベター（biobetter）、バイオスーペリア（biosuperior）などを含む、多様な生物学的製剤を意味する。生物学的製剤とは、生物学的ソースから調製、分泌または半合成された任意の薬物を指し、その例として、これらに限定されないが、ワクチン、血液製剤、抗原、細胞製剤、遺伝子治療剤、組織、組み換え治療用タンパク質、幹細胞などが挙げられる。
本発明の別の態様において、「核酸」は、これらに限定されないが、ＤＮＡ、デコイＤＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、オリゴ核酸、アプタマー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、オリゴリボヌクレオチド、およびトランスファーＲＮＡを含み、また、ンチセンスオリゴヌクレオチドをin vivoでの構造的安定性を最大化するために生化学的に修飾することにより得られた、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、およびヘキシトール核酸（ＨＮＡ）をも含む。
本発明の一態様において、標的物質は、インスリンであってよい。したがって、本発明の範囲は、糖尿病を予防または処置するための方法を含み、該方法は、ペプチドとインスリンとの複合体を対象に投与することを含む。しかし、本発明のペプチドにより生きている組織に送達することができる標的物質は、これらに限定されない。
インスリンは、５．８ｋＤａの高分子量を有するので、粘膜に浸透することができず、したがって、皮下注射により投与されてきた。しかし、注射は患者に対して恐怖および疼痛を引き起こし、また、感染のリスクを有し、したがって、非侵襲的な投与方法を開発することが必要である。特に、糖尿病患者に定期的に投与すべきインスリンなどの薬物は、単純かつ簡便な様式において投与することが必要である。本発明のバリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤは、薬物が粘膜に浸透する能力を増強し、それにより、薬物が鼻粘膜を含む粘膜に投与されることを可能にする。さらに、慣用的な鼻吸収促進剤（例えば界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩など）は、粘膜に損傷を引き起こすことが知られており、一方、本発明のバリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤは、粘膜に対してほとんどまたは全く損傷を引き起こさない。本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤは、薬物などの標的物質の浸透能力を大きく増大させることができ、したがって、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤを含む組成物または処方物は、慣用的な鼻吸収促進剤を含まないか、または、鼻吸収促進剤を、粘膜に対して多大な損傷を引き起こすことがない量で含んでもよい。
本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドにより送達することができる別の薬物の例として、骨粗鬆症治療剤が挙げられる。骨粗鬆症治療剤は、重ホスホン酸（biphosphonate）ベースの薬物、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）処方物などであってよい。例えば、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）処方物は、完全な副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）または副甲状腺ホルモンの一部を含む処方物であってよく、例えば、Lily Co., Ltd.により開発された注射可能溶液であるテリパラチド（Forsteo（商標））であってよい。テリパラチドは、副甲状腺ホルモンの一部分のものと同じアミノ酸配列を有する組み換えタンパク質である。しかし、本発明により送達することができる骨粗鬆症治療剤の種類は、これらに限定されない。
本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドにより送達することができる標的物質は、抗体であってもよい。そして、標的物質は、当該分野において公知の多様な治療用抗体のうちのいずれであってもよく、その種類は限定されない。例えば、抗体は、抗がん活性を有する抗体、高脂血症を処置するための抗体、関節リウマチなどの自己免疫疾患を処置するための抗体であってよいが、本発明により送達することができる抗体の種類は、これらに限定されない。
本発明のなお別の側面は、ペプチドおよび標的物質を含む、キットである。キットは、本発明の細胞浸透性ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質を含むので、ペプチドの使用により標的物質を生体または単離された細胞中に送達することを目的として用いることができる任意のキットであってよい。キットは、標的物質の細胞浸透能力をさらに増強することができる付加成分を含んでもよい。
本発明は、ペプチドをコードする核酸を提供する。
一態様において、核酸は、配列番号６２〜８７のいずれか１つのヌクレオチド配列からなっていてよい。しかし、複数のコドンが１つのアミノ酸をコードするため、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６２〜８７のヌクレオチド配列に加えて、本発明のペプチドを他のコドンによりコードする全てのヌクレオチド配列を含む。
本発明のなお別の側面は、ペプチドまたはペプチドと標的物質との複合体を含む組成物である。
本発明において、組成物は、標的物質を生きている組織または血液に送達するため、または標的物質の細胞内浸透を促進するために、用いることができる。組成物は、生きている組織を形成する細胞に送達しても、細胞間接着部位により送達してもよいが、組成物を送達するための方法は、限定されない。
生きている組織とは、１つ以上の上皮組織、筋肉組織、神経組織または結合組織を意味し、各々の器官は、１つ以上の組織を含んでもよい。したがって、器官の例として、これらに限定されないが、粘膜、皮膚、脳、肺、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、胃、大腸、消化管、膀胱、尿管、尿道、卵巣、精巣、生殖器、筋肉、血液、血管、リンパ管、リンパ節、胸腺、膵臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、喉頭、扁桃腺、気管支、肺胞などを含む、多様な生きている器官が挙げられる。
生きている組織を形成する細胞として、これらに限定されないが、上皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、腺細胞、グリア細胞、生殖細胞、幹細胞、間葉系細胞、間葉系幹細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、血液細胞、造血細胞、肺細胞、肝細胞、線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞、脂肪細胞、軟骨細胞などを含む多様な細胞が挙げられる。
上皮細胞として、これらに限定されないが、粘膜上皮細胞、濾胞上皮細胞、消化器上皮細胞、呼吸器上皮細胞、生殖器上皮細胞、泌尿器上皮細胞などが挙げられる。内皮細胞として、これらに限定されないが、血管内皮細胞およびリンパ管内皮細胞が挙げられる。
本発明の一態様において、組成物は、粘膜または皮膚を通して標的物質を送達するためのものであってよいが、これらに限定されない。
本発明の組成物は、ペプチドと一緒に組成物中に含まれる標的物質の種類に依存して、多様な用途において用いることができる。例えば、本発明の組成物は、ヒトまたは動物における疾患を処置するために用いることができる。疾患は、限定されず、薬物を細胞、組織または血液に高濃度で送達するか、薬物の送達を増大することが必要とされる疾患であってよい。例えば、疾患は、高分子量を有する遺伝子治療薬またはタンパク質治療薬で処置することができるか、または治療剤が別の経路により投与される、多様な疾患であってよい。疾患の例として、これらに限定されないが、乳癌、肝臓癌、脳癌、前立腺癌、子宮癌、卵巣癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、直腸癌、甲状腺癌、血液癌、皮膚癌、肺癌などを含むがん、糖尿病、肥満、喘息、脱毛症などが挙げられる。さらに、組成物は、ペプチドの使用による薬物のin vitroでの細胞浸透能力または膜を越える細胞内送達を観察するための研究目的のために用いることができ、また、高分子量を有する遺伝子治療薬またはタンパク質治療薬で処置される、がんまたは糖尿病などの疾患の処置のために用いることができる。ペプチドは、造影剤、診断試薬およびキットを含む診断製品として用いることができるように、多様な分子に適用することができる。加えて、ペプチドはまた、機能的保健食品（機能的保健食品組成物）、化粧品材料（化粧品組成物）などに適用することができるが、本発明の範囲は、上記の例に限定されない。
本明細書において用いられる場合、用語「機能的保健食品」は、ヒトの身体のために有用な機能性を有する原材料または成分を用いて調製（または処理）された食品を指し、ヒトの身体の構造および機能に関して栄養を調節すること、または生理学的活性などの健康上の目的のために有用な効果を得ることを指す。本発明の機能的保健食品組成物は、慣用的な方法に従って調製される。
本明細書において用いられる場合、用語「化粧品材料」とは、化粧品または医薬部外品を提供することができる材料を指す。用語「化粧品」とは、ヒトの身体に適用して、ヒトの身体を清浄かつ美しく保ち、魅力を増大させ、造作を明るくさせるか、皮膚および髪の健康を維持または増強するために適用される物品であって、ヒトの身体に対してわずかな影響を有するものを指す。用語「機能的化粧品」とは、皮膚の美白または皮膚のしわの軽減において役立つか、または、紫外線から皮膚を保護することにおいて役立つ製品を指す。用語「機能的化粧品」は、「韓国保健福祉家事省省令（Ministerial Decree of the Korean Ministry for Health, Welfare and Family Affairs）」により定義されるものを包含することを意図され、皮膚の状態を改善する全ての製品を集合的に指す。用語「医薬部外品」とは、韓国保健福祉家事省（Korean Ministry for Health and Welfare）により提供される分類系に従って、疾患を処置または予防するために用いられる医薬ではなく、ヒトの身体に対してわずかな影響を有する物品の中から分類される薬物であって、韓国薬事法によれば、医薬部外品は、医薬として用いられる物品を除外し、医薬部外品は、ヒトおよび動物の処置または予防のために用いられる繊維またはゴム製品、ヒトの身体に対してわずかな影響を有するか、ヒトの身体に対して直接作用することがない物品であって、デバイスまたは器具、ならびに感染性疾患を予防するための殺菌剤および殺虫剤を除外するものを含む。本発明の化粧品組成物は、化粧品組成物において一般的に用いられる成分さらに含んでもよい。
本発明の一態様において、組成物は、経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻内投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物、および坐剤からなる群より選択される１つ以上の形態として用いてもよいが、これらに限定されない。
本発明の一態様において、組成物は、標的物質を特定の器官または特定の細胞内小器官に送達することを可能にするシグナルペプチドを、さらに含んでもよい。シグナル配列は、５〜３０個のアミノ酸を有する短いペプチドであり、特定の細胞内小器官（ＥＲ、ゴルジ体、エンドソーム）に残存し、細胞から分泌されるか、細胞膜中に挿入される。本発明の組成物は、任意の公知のシグナル配列を含んでもよく、標的物質は、シグナル配列により特定の細胞内部位に移動することができるが、本発明の範囲は、これらに限定されない。
本発明の一態様において、組成物は、標的物質が特定の器官または特定の細胞に送達されるように、当該特定の器官または特定の細胞をターゲティングすることができるようにする、物質または部分をさらに含んでもよい。例えば、組成物は、特定の細胞において存在する受容体に特異的に結合する抗体を、さらに含んでもよい。例えば、乳癌細胞におけるＨＥＲ−２受容体に特異的に結合する抗体（ハーセプチン）が、本発明の組成物におけるペプチド／標的物質複合体にさらに連結されている場合、ペプチド／標的物質複合体は、抗体を通して乳癌細胞に特異的に結合することができ、細胞中に送達されることができる。ペプチド／標的物質複合体が上記のような特定の器官または特定の細胞中に送達されることを可能にする物質の種類は、限定されないが、当該分野において公知の任意のターゲティング分子を、本発明において用いることができる。
本発明の一態様において、組成物は、ＰＴＤが特定のｐＨ、酵素活性、光または酸素環境に依存して、ｐＨ感受性の系、酵素感受性の系、光感受性の系、または酸素感受性の系の使用によりその細胞浸透能力を示すことができるようにする部分または物質を、その細胞浸透能力が細胞の外部または内部においてのみ活性化される活性化可能細胞浸透性ペプチドの一部として、さらに含んでもよいが、本発明の範囲は、上の例に限定されない。
本発明の一態様において、上記の組成物または処方物は、ペプチドおよび標的物質が細胞内エンドソームからより容易に放出され得るようにする物質を、さらに含んでもよい（エンドソーム脱出（endosomal escape））。例えば、この物質は、膜破壊ペプチド、膜破壊ポリマー、リソソーム志向性（lysosomotropic）の剤などであってよく、ペプチドに、ｐ５３タンパク質の四量体化ドメイン（ｐ５３ｔｅｔ）を連結するか、またはＰＭＡＰ（ｐＨ依存性膜活性ペプチド）を連結する戦略を用いてもよいが、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。
本発明の一態様において、上記の組成物または処方物は、ペプチドまたは標的物質の半減期を延長することができる物質または部分をさらに含んでもよい。
本発明の一態様において、上記の組成物または処方物は、ペプチドおよび標的物質が、所望される細胞に送達される前にin vivoで分解されないように処方することができる。例えば、標的物質が小腸の上皮において吸収されるべき場合、組成物または処方物は、ペプチドおよび標的物質が、消化管内の小腸の上皮に到達する前に、分解されることがないように、または任意の他の細胞中に吸収されないように、処方することができる。別の例として、本発明の組成物が、標的物質が血管に入るように皮下でまたは筋肉内で注射されるべき場合、組成物は、皮膚細胞、筋肉細胞または脂肪細胞中に吸収される程度を低減するために処方することができる。上述の例は、単に説明的なものであって、本発明の範囲は、これらに限定されない。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、ペプチドに対する免疫応答を阻害する任意の物質をさらに含んでもよい。例えば、本発明の組成物は、免疫抑制剤をさらに含んでもよい。
本発明のなお別の側面は、以下のアミノ酸配列：
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＲ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
からなるペプチド、すなわち、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの使用に関する。
特に、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、細胞膜に浸透する能力を有し、したがって、多様な標的物質と組み合わせて用いることができる。さらに、ペプチドは、毛包および脳中に送達することができ、したがって、多様な用途において用いることができる。
本発明の１つの特定の側面は、エキセンディン−４の送達のための組成物であって、該組成物は、以下のアミノ酸配列；
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＲ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫの中から選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
からなるペプチド、ならびにエキセンディン−４を含む。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。具体的には、ペプチドは、配列番号１、１８、２２、２４、２７、４２および４６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてよい。特に、本発明によるペプチドの範囲は、配列番号２７のアミノ酸配列からなるペプチドのバリアントを含み、ここで、バリアントは、共通して「ＭＩＩＦＲ」配列を含み、および位置１０においてＨを含むペプチドであって、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６〜９におけるアミノ酸のうちの１つ以上が置換されているペプチドである。具体的には、バリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６におけるＡが、ＬまたはＩで置換され、アミノ酸配列の位置７におけるＡがＡで置換され、アミノ酸配列の位置８におけるＩがＡであるか、またはアミノ酸配列の位置９におけるＳがＹで置換されているものである。より具体的には、バリアントは、配列番号１８、２２、２４、２７または４６のアミノ酸配列からなるペプチドであってよいが、これらに限定されない。
本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、細胞膜に浸透する優れた能力を有し、また、細胞膜を通してエキセンディン−４を生きている組織または血液中に送達する優れた効果を有する。
本発明において、「エキセンディン−４」とは、糖尿病を処置するためのＧＬＰ−１ベースのペプチドであり、その高い分子量に起因して粘膜に浸透する能力が低いために、現在は注射により投与されている。エキセンディン−４は、３９個のアミノ酸からなるグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）ベースのペプチドであり、糖尿病を処置するための剤として用いられる。それは、インスリン分泌を刺激する物質であり、ＧＬＰ−１のものよりも長い半減期を有し、糖尿病を処置する剤として用いられる。エキセンディン−４は、粘膜に浸透する能力が低く、したがって、皮下注射により主に投与される。本発明において用いられるエキセンディン−４に関して、エキセンディン−４の合成形態であるエキセナチドおよびエキセナチドＬＡＲ（長期作用放出）、ならびに他のエキセナチドベースの薬物が、開発されており、糖尿病を処置するための剤として用いられてきた。本発明において、エキセンディン−４として、当業者に公知の慣用的な抽質、またはエキセナチドなどの合成生成物は、購入して使用することができる。本発明において用いられるエキセンディン−４は、慣用的な抽質（天然から分離された形態）または合成形態（エキセナチドまたはエキセナチドＬＡＲ）であってよい。本発明は、ペプチドおよびエキセンディン−４を含む複合体、ならびに当該複合体を含むエキセンディン−４の送達のための組成物を提供する。
ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質を含む組成物は、上記のとおりである。
本発明は、ペプチドをコードする核酸を提供する。
本発明の一態様において、核酸は、配列番号６２〜１２２から選択されるいずれか１つのヌクレオチド配列からなっていてよい。しかし、複数のコドンが１つのアミノ酸をコードするために、本発明のペプチドをコードする核酸配列は、配列番号６２〜１２２のヌクレオチド配列に加えて、本発明のペプチドを他のコドンによりコードする全てのヌクレオチド配列を含む。
本発明の一態様において、本発明の組成物は、エキセンディン−４で処置することができる任意の疾患の処置のために用いてもよい。例えば、本発明の組成物は、糖尿病および肥満を含む多様な代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢および末梢神経疾患、ならびに上の疾患と共に起こる多様な合併症、例えば、末梢ニューロパシー、糖尿病性高血圧、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖症候群（hyperosmolar hyperglycemic syndrome）、および多様な血管疾患の合併症、例えば高血圧、網膜症、腎障害、ニューロパシー、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、中枢血管疾患などの処置のために用いてもよい。例えば、本発明の組成物は、アルツハイマー病およびパーキンソン病の処置のために用いてもよいが、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。したがって、本発明の範囲は、糖尿病、肥満、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢および末梢神経疾患、末梢ニューロパシー、糖尿病性高血圧、糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性高血糖症候群、高血圧、網膜症、腎障害、ニューロパシー、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、中枢血管疾患を含む疾患を予防または処置するための方法を含んでもよく、該方法は、ペプチドおよびエキセンディン−４を含む組成物を投与することを含むが、これらに限定されない。
本発明の一態様において、本発明のペプチドは、エキセンディン−４を脳中に送達する優れた効果を有するので、エキセンディン−４で処置することができる任意の脳関連疾患の処置のために用いてもよい。
本発明のなお別の側面は、ペプチドおよびエキセンディン−４を含むキットである。ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドおよび標的物質を含むキットは、上記のとおりである。
本発明のなお別の側面は、標的物質を毛包中に送達するための組成物であって、該組成物は、以下のアミノ酸；
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、および、Ｒ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
からなるペプチド、ならびに標的物質を含む。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。具体的には、ペプチドは、配列番号１、１２、１７、１８、２２、２４および２７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。特に、本発明によるペプチドの範囲は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチドのバリアントを含み、ここで、バリアントは、共通して「ＭＩＩＦＲ」配列を含むペプチドであって、ここで、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６〜１０におけるアミノ酸のうちの１つ以上は、置換されている。具体的には、バリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６におけるＡがＬまたはＩで置換されており、アミノ酸配列の位置７におけるＬがＡで置換されており、アミノ酸配列の位置８におけるＩがＡであり、アミノ酸配列の位置９におけるＳがＹで置換されているか、またはアミノ酸配列の位置１０におけるＨがＰで置換されているものである。より具体的には、ペプチドは、配列番号１２、１７、１８、２２、２４または２７のアミノ酸配列からなるペプチドであってよいが、これらに限定されない。ペプチドの合成、調製および修飾、ならびにペプチドを含む組成物は、上記のとおりである。
組成物中の標的物質は、育毛促進薬、育毛阻害薬、抗生物質および抗炎症薬から選択されるいずれか１つ以上であってよいが、これらに限定されない。
「育毛促進薬」とは、育毛を促進する任意の薬物であってよい。育毛促進薬は、フィナステリド、デュタステリド、ミノキシジルまたは当該分野において公知の他の多様な育毛促進薬であってよいが、これらに限定されない。
「育毛阻害薬」とは、育毛を阻害する任意の薬物であってよい。育毛阻害薬は、抗アンドロゲン薬、スピロラクトン、避妊薬、またはエフロルニチンであってよいが、これらに限定されない。
「抗生物質」は、細菌またはウイルスの増殖を阻害するか、細菌またはウイルスを殺傷するための任意の物質である。
「抗炎症薬」は、炎症を全身性または局所性に阻害するための任意の薬物である。
したがって、本発明の範囲は、育毛を促進または阻害するための方法を含んでもよく、該方法は、ペプチドと育毛促進薬との複合体を投与することを含む。本発明の範囲は、細菌またはウイルスの増殖を阻害する；または細菌またはウイルスを殺傷するための方法を含んでもよく、該方法は、ペプチドおよび抗生物質を含む組成物を含む。本発明の範囲は、炎症を阻害するための方法を含んでもよく、該方法は、ペプチドと抗炎症薬との複合体を含む。
本発明のなお別の側面は、以下のアミノ酸配列；
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、および、Ｒ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
からなるペプチド、ならびにワクチンを含む、ワクチン送達のための組成物である。
本発明のなお別の側面は、疾患を予防または処置するための組成物であって、ペプチドおよびワクチンを含む組成物を投与することを含む。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。特に、本発明によるペプチドの範囲は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチドのバリアントを含み、ここで、バリアントは、共通して「ＭＩＩＦＲ」配列、位置７においてＬ、および位置１０においてＨを含むペプチドであって、ここで、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６、８および９におけるアミノ酸のうちの１つ以上は、置換されている。具体的には、バリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６におけるＡがＬで置換されており、アミノ酸配列の位置８におけるＩがＡであるか、またはアミノ酸配列の位置９におけるＳがＹで置換されているものである。より具体的には、バリアントは、配列番号２２、２４、１８または２７のアミノ酸からなるペプチドであってよいが、これらに限定されない。本発明において、配列番号２２、２４および１８のアミノ酸配列からなるペプチドは、それぞれ、「ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ１」、「ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ２」、および「ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ３」と命名される。ペプチドの合成、調製および修飾、およびペプチドを含む組成物は、上記のとおりである。
本発明において、ペプチドは、Ｄ型またはＬ型ペプチド、またはＤ型もしくはＬ型ペプチドからなる配列の一部のみのペプチド、またはそのラセミ形態であってよい。
本発明において、用語「ワクチン」とは、ヒトまたは動物に免疫を提供するために用いられる抗原を意味する。ワクチンに関して、対象が病原体に感染する前に、人工的に不活化または弱毒化された病原体の一部または全体を、対象に注射して免疫系を活性化する。この場合、病原体により引き起こされる損傷は、対象が病原体に感染している場合であってすら、予防または最少化され得る。本発明のペプチドの標的物質であってよいワクチンの種類は、限定されない。本発明の一態様において、ワクチンは、粘膜免疫応答により予防することができる呼吸器疾患に対するワクチンであってよい。例えば、呼吸器疾患ワクチンは、インフルエンザウイルスワクチン、肺炎球菌ワクチン、結核ワクチン、ＭＥＲＳワクチン、ＳＡＲＳワクチン、アデノウイルスワクチンなどであってよい。本発明により送達することができるワクチンは、呼吸器疾患ワクチンに限定されず、その例として、子宮頸癌、日本脳炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、腸チフス、水痘、ポリオ、麻疹、風疹、流行性耳下腺炎、黄熱病、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、髄膜炎菌性疾患、帯状疱疹などに対するワクチンが挙げられるが、上の例に限定されない。
本発明により送達することができる動物ワクチンとして、ブタワクチンについては、オーエスキー病、ブタ丹毒、ブタコレラ、日本脳炎、ブタパルボウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤ）、（伝染性胃腸炎（ＴＧＥ）、ブタロタウイルス感染、ブタ萎縮性鼻炎、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、胸膜肺炎、大腸菌病などに対するワクチン；ウシワクチンについては、ロタウイルス、コロナウイルス、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤ）、ウシ呼吸器多核体ウイルス（ＢＲＳＶ）、アカバネ病、イバラキ病、流行熱、ウシ肺炎性パスツレラ症、炭疽病、黒脚病、乳癌（Staphylococcus aureus）などに対するワクチン；ニワトリウイルスについては、ニューカッスル病、マレック病、伝染性ファブリキウス嚢病、伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢ）、トリ脳脊髄炎、トリインフルエンザ、トリコレラなどに対するワクチン；イヌワクチンについては、麻疹、肝炎、パルボウイルス、パラインフルエンザ、コロナウイルス腸炎、伝染性気管支炎（ケンネルコフ（Kennel cough））、イヌインフルエンザ、狂犬病などに対するワクチン；およびネコワクチンについては、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）、ネコウイルス性気管鼻炎（ＦＶＲ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、クラミジア（ＣＨ）、狂犬病、感染性腹膜炎などに対するワクチンを挙げることができるが、上の例に限定されない。
本発明のペプチドの標的物質であってよいワクチンの例として、これらに限定されないが、ヒト病原体に対して免疫応答を惹起することができ、かつ以下から誘導される、抗原または抗原性組成物が挙げられる：ＨＩＶ−１（ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０またはｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖなど）、ヒトヘルペスウイルス、例えばｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥもしくはｇＤまたはその誘導体、あるいは早期発現タンパク質、例えば、ＨＳＶ１またはＨＳＶ２からのＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、ＩＣＰ３６、サイトメガロウイルス、特にヒトサイトメガロウイルス、（例えばｇＢまたはその誘導体）、エプスタイン・バーウイルス（ｇｐ３５０またはその誘導体）、水痘帯状疱疹ウイルス（例えばｇｐＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＥ６３）、またはＢ型肝炎ウイルス（例えばＢ型肝炎表面抗原または肝炎コア抗原またはｐｏｌ）、Ｃ型肝炎ウイルス抗原およびＥ型肝炎ウイルス抗原などの肝炎ウイルスから、あるいは他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス：呼吸器多核体ウイルス（例えばＦおよびＧタンパク質またはその誘導体）から、あるいは、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えばＨＰＶ６、１１、１６、１８、例えばＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、フラビウイルス（例えば黄熱ウイルス、デングウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）またはインフルエンザウイルス細胞（例えばＨＡ、ＮＰ、ＮＡもしくはＭタンパク質、またはその組み合わせ）からの抗原、あるいは、以下のような細菌性病原体から誘導される抗原：N. gonorrheaおよびN. meningitidisを含むNeisseria sp.（例えばトランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、Pi1C、アドヘシン）；S. pyogenes（例えばＭタンパク質またはそのフラグメント、Ｃ５Ａプロテアーゼ）、S. agalactiae、S. mutans；H. ducreyi：M catarrhalisを含むMoraxella sp.、別名Branhamella catarrhalis（例えば高または低分子量アドヘシンおよびインベイシン）：B. pertussisを含むBordetella sp.（例えばパータクチン、百日咳毒素またはそれらの誘導体、線維状ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、線毛）、B. parapertussisおよびB. bronchiseptica：M. tuberculosisを含むMycobacterium sp.（例えば、ＥＳＡＴ６、抗原８５Ａ、−Ｂまたは−Ｃ、ＭＰＴ４４、ＭＰＴ５９、ＭＰＴ４５、ＨＳＰ１０、ＨＳＰ６５、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ７５、ＨＳＰ９０、ＰＰＤ１９ｋＤａ［Ｒｖ３７６３］、ＰＰＤ３８ｋＤａ［Ｒｖ０９３４］）、M. bovis、M. leprae、M. avium、M. paratuberculosis、M. smegmatis：L. pneumophilaを含むLegionella sp.：腸毒性（enterotoxic）E. coliを含むEscherichia sp.（例えば定着因子、熱不安定性毒素またはそれらの誘導体、熱安定性毒素またはそれらの誘導体）、腸管出血性E. coli、腸病原性（nenteropathogenic）E. coli（例えば志賀毒素様毒素またはそれらの誘導体）：V. choleraを含むVibrio sp.（例えば、コレラ毒素またはそれらの誘導体）：S. sonnei、S. dysenteriae、S. flexneriiを含むShigella sp.：Y. enterocoliticaを含むYersinia sp.（例えば、Ｙｏｐタンパク質）、Y. pestis、Y. pseudotuberculosis：C. jejuniを含むCampylobacter sp.（例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン）およびC. coli：S. typhi、S. paratyphi、S. choleraesuis、S. enteritidisを含むSalmonella sp.：L monocytogenesを含むListeria sp.：H. pyloriを含むHelicobacter sp.（例えばウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素）：P. aeruginosaを含むPseudomonas sp.：S. aureus、S. epidermidisを含むStaphylococcus sp.：E. faecalis、E. faeciumを含むEnterococcus sp.：C. tetaniを含むClostridium spp.（例えば、破傷風毒素およびその誘導体）、C. difficile（例えば、clostridium toxins A or B およびその誘導体）：B. anthracisを含むBacillus spp.（例えばbotulinum toxinおよびその誘導体）：C. diphtheriaeを含むCorynebacterium spp.（例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体）：B. burgdorferiを含むBorrelia spp.（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. garinii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. afzelii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. andersonii（例えば、ＯｓｐＡ、ＯｓｐＣ、ＤｂｐＡ、ＤｂｐＢ）、B. hermsii；E. equiを含むEhrlichia spp.、およびヒト顆粒球性エーリキア症の剤：R. rickettsiiを含むRickettsia spp：C. trachomatisを含むChlamydia spp.（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、C. pneumoniae（例えば、ＭＯＭＰ、ヘパリン結合タンパク質）、C. psittaci：L. interrogansを含むLeptospira spp.：T. pallidum（例えば、希少外膜タンパク質（rare outer membrane protein））、T. denticola、T. hyodysenteriaeを含むTreponema spp.：T. gondiiを含むToxoplasma spp.（例えば、SAG2、SAG3、Tg34）：E. histolyticaを含むEntamoeba spp.：B. microtiを含むBabesia spp.：T. cruziを含むTrypanosoma spp.：G. lambliaを含むGiardia spp.：L majorを含むLeshmania spp.：P. cariniiを含むPneumocystis spp.：T. vaginalisを含むTrichomonas spp.：S. mansoniを含むSchisostoma spp.、または酵母、例えばC. albicansを含むCandida spp.：C. neoformansを含むCryptococcus spp.。
M. tuberculosisについての他の抗原として、例えば、Ｒｖ２５５７、Ｒｖ２５５８、ＲＰＦｓ：Ｒｖ０８３７ｃ、Ｒｖ１８８４ｃ、Ｒｖ２３８９ｃ、Ｒｖ２４５０、Ｒｖ１００９、ａｃｅＡ（Ｒｖ０４６７）、ＰｓｔＳ１、（Ｒｖ０９３２）、ＳｏｄＡ（Ｒｖ３８４６）、Ｒｖ２０３１ｃ１６ｋＤａｌ．、ＴｂＲａ１２、ＴｂＨ９、ＴｂＲａ３５、Ｔｂ３８−１、Ｅｒｄ１４、ＤＰＶ、ＭＴＩ、ＭＳＬ、ｍＴＴＣ２およびｈＴＣＣ１が挙げられる（WO 99/51748）。M. tuberculosisについてのタンパク質はまた、M. tuberculosisの少なくとも２つ、好ましくは３つのポリペプチドがより大きなタンパク質に融合している融合タンパク質およびそのバリアントを含む。好ましい融合体として、これらに限定されないが、Ｒａ１２−ＴｂＨ９−Ｒａ３５、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、Ｅｒｄ１４−ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ、ＤＰＶ−ＭＴＩ−ＭＳＬ−ｍＴＣＣ２、ＴｂＨ９−ＤＰＶ−ＭＴＩが挙げられる（WO 99/51748）。
クラミジアについての 好ましい抗原として、例えば、高分子量タンパク質（ＨＷＭＰ）（WO 99/17741）、ＯＲＦ３（EP 366 412）、および推定膜タンパク質（Ｐｍｐｓ）が挙げられる。ワクチン処方物の他のクラミジア抗原は、WO 99/28475において記載される群から選択することができる。
好ましい細菌ワクチンは、S. pneumoniaeを含むStreptococcus spp.に由来する抗原（ＰｓａＡ、ＰｓｐＡ、ストレプトリジン、コリン結合タンパク質）、およびタンパク質抗原ニューモリシン（Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007；Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342）、および解毒されたその変異体（WO 90/06951；WO 99/03884）を含む。他の好ましい細菌ワクチンとして、これらに限定されないが、インフルエンザ菌（H. influenzae）Ｂ型を含むHaemophilus spp.に由来する抗原（例えば、ＰＲＰおよびその抱合体）、分類不能のインフルエンザ菌、例えば、ＯＭＰ２６、高分子量アドヘシン、Ｐ５、Ｐ６、タンパク質Ｄおよびリポタンパク質Ｄ、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド（US 5,843,464）またはその多重コピーバリアントもしくは融合タンパク質が挙げられる。
本発明において用いてもよい抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫に由来する抗原をさらに含んでもよい。例えば、Plasmodia falciparumに由来する抗原として、ＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰが挙げられる。ＲＴＳは、Ｂ型肝炎表面抗原のｐｒｅＳ２部分の４つのアミノ酸を介してＢ型肝炎ウイルスの表面（Ｓ）抗原に連結されたP. falclparumのスポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の全てのＣ末端部分を実質的に含む、ハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、国際特許出願番号PCT/EP92/02591（番号WO 93/10152下において公開され、ＵＫ特許出願第9124390.7号からの優先権を主張する）において開示される。酵母において発現される場合、ＲＴＳは、リポタンパク質粒子として産生され、それがＨＢＶからのＳ抗原と共発現される場合、ＲＴＳ、Ｓとして公知の混合粒子を産生する。ＴＲＡＰ抗原は、国際特許出願番号PCT/GB89/00895において記載される（WO 90/01496下において公開されている）。本発明の好ましい態様は、抗原性製剤がＲＴＳ、ＳおよびＴＲＡＰ抗原の組み合わせを含む、マラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの成分となる候補である可能性が高い他のマラリア原虫抗原は、P. faciparum、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン（Sequestrin）、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８、ＰＦＳ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、Ｐｆｓ２３０およびPlasmodium spp.におけるそれらのアナログであるが、これらに限定されない。
本発明は、抗腫瘍抗原の使用を企図し、がんの免疫治療処置のために有用である。例えば、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、またはメラノーマ癌の処置において用いられるものなどの、腫瘍拒絶抗原が存在する。例示的な抗原として、ＭＡＧＥ１、３およびＭＡＧＥ４またはWO99/40188において開示されるものなどの他のＭＡＧＥ抗原、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、Ｌａｇｅ（別名ＮＹ Ｅｏｓ１）ＳＡＧＥおよびＨＡＧＥ（WO 99/53061）またはＧＡＧＥ（Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636；Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997)；Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293）が挙げられる。これらの抗原は、メラノーマ、肺の癌腫、肉腫、および膀胱の癌腫などの広範な腫瘍の型において発現される。
本発明において用いられるＭＡＧＥ抗原は、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現させてもよい。特に、Ｍａｇｅタンパク質は、Ｂ型インフルエンザ菌からのタンパク質Ｄに融合していてもよい。とくに、融合パートナーは、タンパク質Ｄの最初の１／３を含んでもよい。かかるコンストラクトは、WO99/40188において開示される。がん特異的エピトープを含み得る融合タンパク質の他の例として、これらに限定されないが、ｂｃｒ／ａｂｌ融合タンパク質が挙げられる。例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＰＳＣＡ（PNAS 95(4) 1735-1740 1998）、ＰＳＭＡまたはプロスターゼ（prostase）として知られる抗原などの、前立腺抗原が用いられる。
プロスターゼは、前立腺特異的セリンプロテアーゼ（トリプシン様）であり、２５４アミノ酸長で、保存されたセリンプロテアーゼ触媒性三連構造Ｈ−Ｄ−Ｓ、およびアミノ末端のpre-proペプチド配列を有し、これは、潜在的な分泌機能を示す（P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand、「Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression, In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96,3114-3119）。推定の糖鎖付加部位は、記載されている。予測された構造は、他の既知のセリンプロテアーゼと非常に似ており、このことは、成熟ポリペプチドが単一のドメインに折りたたまれることを示している。成熟タンパク質は、２２４アミノ酸長であって、自然にプロセッシングされることが示されている１つのＡ２エピトープを有する。
本発明は、プロスターゼタンパク質ならびにそのフラグメントおよび相同体に基づく、プロスターゼタンパク質融合体を含む抗原を提供する（「誘導体」）。かかる誘導体は、前立腺腫瘍の処置のために好適である治療用ワクチン処方物における使用のために好適である。典型的には、フラグメントは、上で参照された特許および特許出願において開示されるような、少なくとも２０、好ましくは少なくとも５０、より好ましくは少なくとも１００個の近接したアミノ酸を含むであろう。
本発明はまた、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、ＥｐＣＡＭ、ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、マンマグロビンなどの乳癌抗原と組み合わせて有用である。Ｈｅｒ２ｎｅｕ抗原は、特段に、米国特許第5,801,005号に開示される。例えば、Ｈｅｒ２ｎｅｕは、全細胞外ドメイン（およそアミノ酸１〜６４５を含む）またはそのフラグメント、および少なくとも全細胞内ドメインの免疫原性部分であるほぼＣ末端の５８０個のアミノ酸を含む。特に、細胞内部分は、リン酸化ドメインまたはそのフラグメントを含むべきであるが、これらに限定されない。
Ｈｅｒ２ｎｅｕは、本明細書において用いられる場合、ラット、マウスまたはヒトに由来するものであってよい。
ワクチンはまた、腫瘍支持機構（例えば血管新生、腫瘍浸潤）と関連する抗原、例えば、ｔｉｅ２、ＶＥＧＦを含んでもよい。
アルツハイマー型神経変性疾患に感受性であるかまたはこれを罹患している患者の予防または処置に関連する抗原は、特に、Ｎ末端の３９〜４３のアミノ酸フラグメント（ＡＢアミロイド前駆体タンパク質およびより小さなフラグメント）である。
自己免疫性障害のためのワクチンとして、または避妊ワクチンとして含めることができる潜在的な自己抗原として、サイトカイン、ホルモン、増殖因子または細胞外タンパク質、例えば、４−らせんサイトカイン、例えばＩＬ１３が挙げられる。サイトカインとして、例えば、ＩＬ１、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２０、ＩＬ２１、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＧＭＣＳＦ、ＭＣＳＦおよびＯＳＭが挙げられる。４−らせんサイトカインとして、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１３、ＧＭＣＳＦおよびＭＣＳＦが挙げられる。ホルモンとして、例えば、黄体ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、ＶＧＦ、グレリン、アグーチ、アグーチ関連タンパク質および神経ペプチドＹが挙げられる。増殖因子として、例えば、ＶＥＧＦが挙げられる。
本発明のワクチンは、慢性の状態およびがんなどの疾患の免疫治療処置のために特に好適であるが、また、持続性感染の処置のためにも好適である。したがって、本発明のワクチンは、結核（ＴＢ）、ＨＩＶ感染（ＡＩＤＳなど）およびＢ型肝炎ウイルス感染などの感染性疾患の免疫治療のために特に好適である。
本発明のペプチドの標的物質であり得るワクチンの種類は、上述のワクチンに限定されない。
本発明の組成物における標的物質がワクチンである場合、組成物は、アジュバントまたは免疫賦活薬をさらに含んでもよい。本明細書において用いられる場合、用語「アジュバント」とは、ワクチンの免疫原性を増強するために添加される任意の物質を指す。アジュバントの例として、これらに限定されないが、多様な油脂、アルミニウム塩、ビロソーム、リポソーム、ＬＰＳ、細菌細胞壁成分、ＲＮＡ、ＤＮＡなどが挙げられる。さらに、アジュバントの例として、金属塩化合物、細菌性アジュバント、サイトカイン、脂質粒子アジュバント、免疫刺激性複合体（Immunostimulating Complex：ＩＳＣＯＭ）、生分解性マイクロスフェアアジュバント、核酸アジュバントなどが挙げられる。例えば、アジュバントは、アルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺において発現されるケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、およびＣＤ８６からなる群より選択され、ＩｇＥからのシグナルペプチドを欠失し、任意にこれを含むシグナル配列を有する、ＩＬ−１５を含む。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子として、これらに限定されないが、以下をコードするものが挙げられる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の変異形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびその機能性フラグメント。いくつかの態様において、アジュバントは、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫまたはＭＥＣから選択される。いくつかの態様において、アジュバントは、遺伝子導入促進剤であり、これは、以下のものを含んでもよい：表面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳアナログ、ムラミルペプチド、キノンアナログ、小胞、例えばスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知の遺伝子導入促進剤。例えば、遺伝子導入促進剤は、ポリアニオン、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。好ましくは、遺伝子導入促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であるが、これに限定されない。
本発明の組成物中に含めることができるアジュバントまたは免疫賦活薬は、物質に従って以下のとおり分類することができるが、これらに限定されない。
Ａ．無機物含有組成物
本発明における免疫賦活薬としての使用のために好適な無機物含有組成物として、アルミニウム塩およびカルシウム塩などの鉱物塩が挙げられる。本発明は、水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などの鉱物塩、または異なる鉱物化合物の混合物を含み、化合物が、任意の好適な形態（例えばゲル、結晶、無水物など）を取り、塩に吸着していることが好ましい。鉱物を含有する組成物はまた、金属塩の粒子として処方することができる。
アジュバントとして用いられる「水酸化アルミニウム」免疫賦活薬は、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、これらは、通常は少なくとも部分的に結晶性である。式ＡｌＯ（ＯＨ）により表すことができるオキシ水酸化アルミニウムは、赤外線（ＩＲ）分光法により、特に、１０７０ｃｍ−１における吸収帯および３０９０〜３１００ｃｍ−１における強いショルダーの存在により、水酸化アルミニウムなどの他のアルミニウム化合物と区別することができる。
「リン酸アルミニウム」として知られるアジュバントは、典型的には、ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、これはしばしばまた、少量の硫酸（すなわち水酸化リン酸アルミニウム硫酸塩）を含む。それらは、沈殿により得ることができ、沈殿の間の反応条件および濃度が、塩中のヒドロキシルによるリン酸の置換の程度に影響を及ぼす。
リン酸アルミニウムアジュバントのＰＯ４／Ａｌ３＋のモル比は、一般に、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１であろう。リン酸アルミニウムは、水酸化リン酸塩については特に、一般に非晶質である。
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、リン酸によるヒドロキシルの置換の程度と逆に関連し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いられる反応条件および反応物の濃度に依存して変化し得る。
Ｂ．油性エマルジョン
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適な油性エマルジョン組成物として、スクアレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９（５％のスクアレン、０．５％のTween 80、および０．５％のSpan 85、微小流動化剤（microfluidizer）を用いてサブミクロンの粒子中に処方される）が挙げられる。フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）もまた、用いることができる。
本発明におけるエマルジョンは、動物（魚など）または植物ソースからのものなどの油脂を含んでもよい。植物性油脂のためのソースとして、木の実、種子および穀物が挙げられる。最も一般的に入手可能なピーナッツ油、大豆油、ココナッツ油およびオリーブ油が、木の実の油脂を例示する。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いてもよい。種子の油脂として、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが挙げられる。穀物の群においては、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどの他の禾穀類の穀物からの油脂もまた用いることができる。グリセロールと１，２−プロパンジオールとの炭素数６〜１０の脂肪酸エステルは、天然では種子油中には存在しないが、木の実および種子の油脂から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製することができる。哺乳動物乳からの脂質および油脂は、代謝可能であり、したがって、本発明の実施において用いることができる。分離、精製、鹸化、および動物ソースから純粋な油脂を得るために必要な他の手順は、当該分野において周知である。ほとんどの魚類は、容易に回収することができる代謝可能な油脂を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などの鯨油は、本発明において用いることができる魚油のうちのいくつかを例示する。多数の分枝鎖油は、５炭素イソプレン単位において生化学的に合成され、一般にテレペノイドとして言及される。サメ肝油は、スクアレンとして知られる分枝状の不飽和テレペノイド、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含む。他の好ましい油脂は、トコフェロール類である。
Ｃ．サポニン処方物
サポニン処方物もまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてすら見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。キラヤ（Quillaja saponaria Molina）の木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されてきた。サポニンはまた、Smilax ornata（サルサパリラ）、Gypsophilla paniculata（宿根カスミソウ（brides veil））、およびSaponaria officinalis（サボンソウ）から市販で得ることができる。サポニンアジュバント処方物として、ＱＳ２１などの精製処方物、ならびにＩＳＣＯＭなどの液体処方物が挙げられる。
サポニンとコレステロールとの組み合わせは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と称されるユニークな粒子を形成するために用いることができる。ＩＳＣＯＭは、典型的にはまた、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質を含む。任意の既知のサポニンを、ＩＳＣＯＭにおいて用いることができる。例えば、ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）もまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。これらの構造は、一般に、ウイルスからの１つ以上のタンパク質を、任意にリン脂質と組み合わせて含むか、またはこれと共に処方される。それらは、一般に、非病原性、非複製性であり、一般に、ネイティブのウイルスゲノムのうちのいずれかを含まない。ウイルスタンパク質は、組み換えにより産生しても、完全なウイルスから単離してもよい。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために好適なウイルスタンパク質として、インフルエンザウイルスに由来するタンパク質（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアまたはキャプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐｌなど）が挙げられる。
Ｅ．細菌性または微生物性の誘導体
本発明における使用のために好適なアジュバントとして、細菌性または微生物性の誘導体、例えば、腸内細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性の誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、ならびにＡＤＰリボシル化毒素および解毒されたその誘導体が挙げられる。
ＬＰＳの非毒性の誘導体として、モノホルホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３デ−Ｏ−アシル化モノホルホリル脂質Ａと、４、５または６アシル化鎖との混合物である。
脂質Ａ誘導体として、ＯＭ−１７４などのEscherichia coliからの脂質Ａの誘導体が挙げられる。
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適な免疫刺激性オリゴヌクレオチドとして、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンと、その後に続くグアノシンを含み、リン酸結合により連結されているジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。回文構造またはポリ（ｄＧ）配列を含む二本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／アナログを含んでもよく、二本鎖であっても単鎖であってもよい。
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなどのＴＬＲ９に対して志向していてもよい。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどのＴｈＩ免疫応答を誘導するための特異的なものであってよく、または、それは、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答を誘導するためのより特異的なものであってもよい。
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能となるように構築される。任意に、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列を、それらの３’末端において結合させて、「イムノマー」を形成させてもよい。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド周辺に基づく特に有用なアジュバントは、IC-31（商標）として知られる。したがって、本発明により用いられるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（または複数）のＣｐＩモチーフ（すなわちシトシンがイノシンに連結してジヌクレオチドを形成する）を含むオリゴヌクレオチド（例えば１５〜４０ヌクレオチド）、および（ｉｉ）少なくとも１つ（または複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー、例えばオリゴペプチド（例えば５〜２０アミノ酸)の混合物を含んでもよい。
細菌性のＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒された誘導体は、本発明において、アジュバントとして用いてもよい。例えば、タンパク質は、E. coli（すなわち、E. coli熱不安定性腸毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。毒素または類毒素は、例えば、ＡおよびＢサブユニットの両方を含むホロ毒素の形態である。例えば、Ａサブユニットは、解毒変異体を含み、Ｂサブユニットは、変異していない。例えば、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２などの解毒されたＬＴ変異体である。
Ｆ．ヒト免疫モジュレーター
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なヒト免疫モジュレーターとして、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが挙げられる。好ましい免疫モジュレーターは、ＩＬ−１２である。
Ｇ．生体接着剤（bioadhesive）および粘膜接着剤（mucoadhesive）
生体接着剤および粘膜接着剤もまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。好適な生体接着剤として、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア、またはポリ（アクリル酸）の架橋誘導体、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースなどの粘膜接着剤が挙げられる。キトサンおよびその誘導体もまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。
Ｈ．マイクロパーティクル
マイクロパーティクルもまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。生分解性かつ非毒性である材料（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）と共に形成されるマイクロパーティクル（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、および最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、任意に、負に荷電した表面（例えばＳＤＳにより）または正に荷電した表面（例えばＣＴＡＢなどのカチオン性洗剤により）を有するように処理される。
Ｉ．リポソーム
リポソームは、本発明においてアジュバントとして用いることができる。
Ｊ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル処方物
本発明における使用のために好適なアジュバントとして、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。かかる処方物は、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、ならびにオクトキシノールなどの少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤をさらに含む。例えば、ポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ処方物もまた、本発明においてアジュバントとして用いることができる。
Ｌ．ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なムラミルペプチドの例として、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
Ｍ．イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なイミダゾキノロン化合物の例として、イミキモドおよびその相同体（例えば「レシキモド３Ｍ」）が挙げられる。
本発明の組成物は、細胞性免疫応答ならびに体液性免疫応答の両方を惹起することができる。
本発明の一態様において、アジュバントは、ＤＮＡアジュバント、例えば、ＣｐＧ（非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド）であってよい。
本発明において用いることができるアジュバントまたは免疫賦活薬の種類は、上記の例に限定されない。
本発明のなお別の側面は、標的物質を脳内に送達するための組成物であって、当該組成物は、以下のアミノ酸配列；
Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
ここで、
Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに、Ｒ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
からなるペプチド、ならびに標的物質を含む。
本発明の一態様において、ペプチドは、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。特に、本発明によるペプチドの範囲は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むペプチドのバリアントを含み、ここで、バリアントは、共通して「ＭＩＩＦＲ」配列、アミノ酸配列の位置７におけるＬ、および位置１０におけるＨを含むペプチドであって、ここで、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６、８および９におけるアミノ酸のうちの１つ以上は、置換されている。具体的には、バリアントは、配列番号２７のアミノ酸配列の位置６におけるＡがＬで置換されており、アミノ酸配列の位置８におけるＩがＡであるか、またはアミノ酸配列の位置９におけるＳがＹで置換されているものである。より具体的には、バリアントは、配列番号２２、２４、１８または２７のアミノ酸配列からなるペプチドであってよいが、これらに限定されない。ペプチドの合成、調製および修飾およびペプチドを含む組成物は、上記のとおりである。
本発明において、ペプチドは、Ｄ型またはＬ型ペプチド、またはＤ型もしくはＬ型ペプチドからなる配列の一部のみのペプチド、またはそのラセミ形態であってよい。さらに、複合体は、ペプチドと標的物質との融合タンパク質であってよく、この場合、ペプチドと標的物質とは、リンカーにより互いに連結されるが、本発明の範囲は、限定されない。
本発明の一態様において、標的物質は、レプチンまたは［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３であってよい。
「レプチン」は、エネルギーの摂取および消費を制御すること（食欲および飢餓感、代謝および行動を含む）において重要な役割を果たす、１６ｋＤａのタンパク質ホルモンであって、脂肪組織から分泌される。レプチンが脳に到達すると、それは、体脂肪率、食物摂取および血中グルコースレベルの低下をもたらし、代謝の効率および活性の増大をもたらし、体重のゆっくりした減少をもたらす。レプチン分泌の減少は、肥満および糖尿病の発症をもたらす。
［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３は、レプチン様活性を有する合成のペプチドアミドである。［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３は、体重、食物摂取および血中グルコースレベルを減少させる効果を示すことが知られている。さらに、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３は、エネルギーバランスおよび血糖制御に対するエキセナチドおよび酢酸プラムリンチドの効果を増強することが報告されている（Leinung Matthew C, Grasso Patricia, [d-Leu-4]-OB3, a synthetic peptide amide with leptin-like activity, augments the effects of orally delivered exenatide and pramlintide acetate on energy balance and glycemic control in insulin-resistant オスC57BLK/6-m db/db mice, Regulatory Peptides Vol. 179 No. 1-3, 33p-38p. 0167-0115 SCI(E)）。
さらに、標的物質は、糖尿病、肥満、代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢神経疾患、および末梢神経疾患からなる群より選択される１つ以上のための治療剤であってよいが、これらに限定されない。したがって、本発明の範囲は、糖尿病、肥満、代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢神経疾患、または末梢神経疾患を予防または処置するための方法を含んでもよく、該方法は、ペプチド；およびレプチンまたは［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を含む組成物を投与することを含む。
本発明のなお別の側面は、配列番号１〜６１のいずれか１つのアミノ酸配列により表されるペプチド；および標的物質を含む、処方物である。すなわち、本発明は、上記のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドまたはそのバリアントと標的物質との複合体を含む処方物を提供する。標的物質は、例えばインスリンであってよいが、これに限定されない。
処方物は、経口処方物、注射可能処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つ以上であってよい。具体的には、それは、鼻投与のための処方物であってもよいが、これに限定されない。
加えて、本発明の処方物は、ペプチドおよび標的物質に加えて、異なる効果を示す薬物をさらに含んでもよく、薬学的に受入可能なキャリアをさらに含んでもよい。経口投与のために、薬学的に受入範囲なキャリアは、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁剤、色素、芳香剤などから選択される１つ以上であってよい。注射のために、薬学的に受入範囲なキャリアは、バッファー、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などから選択される１つ以上であってよい。局所投与のために、薬学的に受入範囲なキャリアは、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤、抗酸化剤、安定化剤、バッファー、増粘剤、等張化剤、可溶化剤、抗凝固剤、界面活性剤などから選択される１つ以上であってよい。本発明における使用のためのキャリアは、上記の例に限定されない。具体的には、処方物は、タンパク質安定化剤、界面活性剤および抗酸化剤からなる群から選択される１つ以上を含んでもよい。加えて、処方物は、タンパク質凝集阻害剤を含んでも、これを含まなくてもよい。例えば、処方物は、スクロース、ポロキサマーおよびメチオニンを含んでもよいが、これらに限定されない。例えば、処方物は、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドまたはそのバリアントを、０．２３〜０．２７ｍＭの濃度で含んでもよく、処方物中のペプチドまたは複合体、キャリアおよび賦形剤の組成および含有量は、限定されない。
本発明の一態様において、処方物は、バッファーをさらに含んでもよい。加えて、本発明の処方物は、標的物質の細胞膜浸透のために好適な薬学的に受入範囲なキャリアをさらに含んでもよい。加えて、処方物は、保存剤および抗酸化剤などの安定性を増強することができる成分、標的物質の溶解度または凝集を改善することができる成分、薬物のモノマー／マルチマー比を制御する成分、薬物の持続期間または吸収速度を制御することができる成分、等張化剤、増粘剤、バッファー、安定化剤などをさらに含んでもよいが、本発明の範囲は、これらの例に限定されない。
本発明の組成物または処方物のｐＨは、限定されず、標的物質の種類、投与の経路、本発明の組成物または処方物を投与されるべき対象などに依存して変化し得る。例えば、本発明の組成物または処方物のｐＨは、１０以下、例えば、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０．０である。特に、ｐＨは、６．０〜７．５の範囲であってよいが、これらに限定されない。
本発明の組成物または処方物を投与するための方法は、特に限定されない。例えば、乾燥状態または溶液の状態における本発明の組成物または処方物を投与しても、乾燥状態における組成物または処方物を、水中で溶解または分散させた後で投与してもよい。
本発明の組成物または処方物は、慣用的な充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤化剤、芳香剤、等張化剤、増粘剤、バッファー、安定化剤、保存剤、抗酸化剤、放出制御剤、乳化剤、および保存剤から選択される１つ以上をさらに含んでもよいが、これらに限定されない。
本発明の組成物または処方物は、経口で投与しても非経口で投与してもよい。経口投与のための固体処方物として、これらに限定されないが、錠剤、丸剤、粉末、顆粒およびカプセルが挙げられる。
経口投与のための液体処方物として、これらに限定されないが、懸濁液、溶液、エマルジョンおよびシロップが挙げられる。
非経口投与のための処方物として、これらに限定されないが、無菌水溶液、非水性の溶液、懸濁液、エマルジョン、フリーズドライ処方物および坐剤が挙げられる。本発明の組成物または処方物が非経口投与される場合、それは、皮下注射、静脈内注射または筋肉内注射いより投与することができるが、投与の経路はこれらに限定されない。
本発明の組成物または処方物の用量および投与の回数は、投与の様式、患者の年齢および体重、ならびに疾患の重篤度を含む多様な要因に依存して好適に選択することができる。好ましくは、それは、体重７０ｋｇの成人について、０．０１μｇ〜１０ｇ、例えば、０．０１ｍｇ〜５０ｍｇの範囲の用量で投与することができる。しかし、用量は単に説明上のものであり、これらに限定されない。
本発明はまた、処方物を調製するための方法を提供し、該方法は、配列番号１〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチドと標的物質との複合体を調製するステップを含む。
本発明はまた、標的物質が細胞膜または組織に浸透する能力を増大させるための方法を提供し、該方法は、対象に、標的物質を、配列番号１〜６１からなる群より選択されるアミノ酸配列により表されるペプチドと一緒に投与することを含む。
本発明はまた、標的物質が細胞膜に浸透する能力を改善するための、配列番号１〜６１からなる群より選択されるアミノ酸配列により表されるペプチドの使用を提供する。
発明の様式
本明細書において以後、本発明は、例を参照して詳細に記載されるであろう。しかし、これらの例は、単に説明を目的とするものであって、本発明の範囲を限定することを意図されないことが、理解されるべきである。
例１：バリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの調製
配列番号２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチド（本明細書において以後、ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３として言及される；韓国特許第10-0859972号）に基づいて、６０個の異なるバリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドを調製した。ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの配列およびその核酸配列を、以下の表１において示す。
ペプチドの各々を、９５％以上の純度で調製し、ペプチドの合成は、PEPTRON Inc.により行われた。加えて、配列番号２２、２４、１８および２７の場合、Ｌ型およびＤ型ペプチドを別々に調製した。
例２：ＴＣＴＰ−ＰＴＤが細胞膜に浸透する能力の評価
２−１：ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドが細胞膜に浸透する能力の評価
子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを調製した。継代後の細胞中に蓄積したＴＣＴＰ−ＰＴＤを細胞膜を通して検出するために、合成されたペプチドのＮ末端をＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で標識した。次いで、子宮頸癌細胞株Ｈｅｌａを、１０μＭの配列番号１８、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２７のＦＩＴＣ標識ＴＣＴＰ−ＰＴＤで、１５分間にわたり処置した。インキュベーションの完了後、細胞をＰＢＳで３回洗浄して、ＨｅＬａ細胞の細胞膜上に残るＦＩＴＣ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤを取り除いた。５００μｌのＰＢＳを添加し、次いで、蛍光リーダーにより４９５ｎｍおよび５１７ｎｍにおいてＦＩＴＣの蛍光強度を測定した。
結果として、全ての処置群において高レベルの蛍光が観察され、このことは、配列番号１８、２２、２４および２７の全てのＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドが、子宮頸癌細胞の細胞膜に容易に浸透したことを示唆している（図１）。
２−２：アミノ酸の型による細胞膜浸透能力の評価
ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂを調製し、フローサイトメトリーによりアミノ酸の型によるＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの細胞膜浸透能力を分析した。具体的には、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、６ウェルプレートに８×１０５細胞／ウェルの密度で播種し、次いで、細胞培養培地（ＢＥＧＭ）中で２４時間にわたり培養した。２４時間の細胞培養の後で、各ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで各ウェルを、各ＴＣＴＰ−ＰＴＤの濃度が２．５μＭとなるように細胞培養培地で希釈したＦＩＴＣ標識Ｌ型ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３（本明細書において以後、Ｌ−ＰＴＤ１３として言及される；配列番号２７）またはＦＩＴＣ標識Ｄ型ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３（本明細書において以後、Ｄ−ＰＴＤ１３として言及される；配列番号２７）で処置した。細胞を２種類のＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３で処置した３０分後に、細胞を各ウェルから０．２５％トリプシンを用いて単離し、次いで、冷たいＰＢＳで６回洗浄して、細胞表面からＴＣＴＰ−ＰＴＤを取り除いた。細胞中に蓄積したＴＣＴＰ−ＰＴＤを、FACSCalibur（ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて分析し、結果として、Ｄ−ＰＴＤ１３およびＬ−ＰＴＤ１３はいずれも細胞膜に浸透する優れた能力を有したことが示された（図２）。
例３：インスリンの細胞膜浸透の改善に対するＴＣＴＰ−ＰＴＤの効果
３−１：非糖尿病マウスにおけるＴＣＴＰ−ＰＴＤ／インスリン混合物の血中グルコース低下効果
体重２０〜２３ｇのオスＢＡＬＢ／ｃマウス（非糖尿病マウス）を実験動物として用いた。マウスを一晩絶食させ、次いで、血中グルコースメーターを用いてマウスにおける血中グルコースレベルを測定した。絶食状態におけるマウスの血中グルコースレベルは、約１００ｍｇ／ｄＬであり。この血中グルコースレベルを、初期血中グルコース値（１００％）として用いた。マウスを、ペンタバルビツールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。
５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ７．８）中で、インスリンを、配列番号１、１２、１７、１８および２２のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々と、１：２のモル比において混合し、混合物を調製した。インスリン／バリアントＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物（インスリン用量：１ＩＵ／ｋｇ）の各々のマウスへの鼻内投与の後６０分および９０分において、、血中グルコースレベルを測定した。
投与の後６０分および９０分における血中グルコースレベルの平均値を、図３（配列番号１）、図４（配列番号１２、１７および２２）および図５（配列番号１８）においてグラフにより示す。図３〜５において理解し得るように、血中グルコースを低下させる効果は、インスリンのみで処置された群よりも、インスリン／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物で処置された群においてより優れていた。これらの効果は、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤが、インスリンが鼻粘膜上皮細胞に浸透する能力を増大させ、それにより、鼻内投与の後でのインスリンの血中グルコース低下効果を増大させることを示唆する。
３−２：１型糖尿病モデルマウスにおけるＴＣＴＰ−ＰＴＤ／インスリン混合物の血中グルコース低下効果の評価
ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を、オスＩＣＲマウス（体重：３３〜３４．５ｇ）に２日間の間隔を空けて４回（用量：１００、５０、５０および５０ｍｇ／ｋｇ）腹腔内注射し、１型糖尿病を誘導した。最後のＳＴＺの投与の７日後に、３００〜３５０ｍｇ／ｄＬの血中グルコースレベルを有したマウスを実験動物として選択した。
５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５）中で、インスリンと、例１において合成された配列番号１８、２２、２４および２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々とを、１：２のモル比において混合して、それぞれ５０μＭおよび１００μＭの最終濃度になるように溶解し、それにより混合物を調製した。インスリン／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物の各々を、マウスに鼻内投与した（インスリン用量：２ＩＵ／ｋｇ）。対照群に、１ＩＵ／ｋｇのインスリンを皮下注射した。投与の後２４０分にわたり、血中グルコースレベルをモニタリングした。
結果を図６において示す。図６において理解し得るように、インスリンと各ＴＣＴＰ−ＰＴＤとの混合物（インスリン／配列番号２２、インスリン／配列番号２４、またはインスリン／配列番号１８）を投与した場合、血中グルコースレベルは減少し、血中グルコースレベルは、インスリンを皮下注射した場合と同じ様式において、投与の９０〜１２０分後において最も低いレベルまで減少した。さらに、配列番号１８、２２および２４がインスリンを送達する能力は、配列番号２７のものよりも優れていた。しかし、インスリンのみを鼻内投与した場合、血中グルコースレベルに顕著な変化は存在しなかった。
３−３：インスリンの鼻内投与後の血漿インスリン濃度の測定
体重１８０〜１９０ｇのオスWistarラットを実験動物として用い、上記と同じ様式において麻酔した。
５ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５）中で、インスリンと、例１において合成した配列番号１８、２２、２４および２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々とを、それぞれ５０μＭおよび１００μＭの最終濃度で混合して、それにより混合物を調製した。インスリン／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物の各々を、麻酔したマウスに鼻内投与した（インスリン用量：０．５ＩＵ／ｋｇ）。対照群には、０．２５ＩＵ／ｋｇのインスリンを皮下注射した。投与の後５、１０、２０、３０、６０、９０、１２０および１８０分において、血液を採取し、次いで、採取した血液から血漿を分離して、市販のＥＬＩＳＡキットを用いて、血漿中のインスリンの濃度を測定した。
測定の結果を、図７において示す。図７において示されるとおり、配列番号１８、２２および２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、全て、配列番号２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤと比較して、インスリンの取り込みを増大させた。しかし、インスリンを単独で鼻内投与した場合、血中インスリン濃度の変化はほとんどまたは全く存在せず、このことは、インスリンが体内にほとんどまたは全く送達されなかったことを示唆している。インスリンの皮下投与の後のバイオアベイラビリティを１００％とすると、ＴＣＴＰ−ＰＴＤを鼻内投与された群における相対的なバイオアベイラビリティは、インスリン／配列番号２７で処置された群においては２５．９％であり、インスリン／配列番号２２で処置された群においては２８．２％であり、インスリン／配列番号２４で処置された群においては７０．９％であり、インスリン／配列番号１８で処置された群においては４３％であった。
例４：エキセンディン−４の細胞膜浸透の改善に対するＴＣＴＰ−ＰＴＤの効果
４−１：非糖尿病マウスにおけるＴＣＴＰ−ＰＴＤ／Ｅｘ−４混合物の血中グルコース低下効果の評価
体重３３〜３５ｇのオスＩＣＲマウス（非糖尿病マウス）を実験動物として用い、麻酔用ペンタバルビツールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。
エキセンディン−４（エキセナチド、Ｅｘ−４）と、例１において合成した配列番号１、１８、２７、４２および４６とのＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々とを、ＰＢＳバッファー中で、１：２のモル比において、それぞれ１４．３μＭおよび２８．６μＭの最終濃度で溶解して、それにより混合物を調製した。
調製したＥｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物の各々を、マウス（Ｅｘ−４用量：２０μｇ／ｋｇ）に鼻内投与し、対照群に、同じ量のＥｘ−４を鼻内投与し、陰性対照群に、同じ量のＰＢＳを鼻内投与した。１５分後、グルコース（２ｇ／ｋｇ）を、腹腔内注射し、６０分後（この時点において、ピーク血中グルコースレベルに達した）、各群におけるＥｘ−４の血中グルコース低下効果を評価した。
結果を図８において示す。図８において理解し得るとおり、血中グルコースを低下させる効果は、Ｅｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物で処置された群において、Ｅｘ−４単独を投与された群よりも良好であった。これらの結果は、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤがＥｘ−４の鼻粘膜上皮細胞中への取り込みを増強し、それによりＥｘ−４の血中グルコース低下効果を増大させることを示唆する。
４−２：２型糖尿病モデルマウスにおけるＴＣＴＰ−ＰＴＤ／Ｅｘ−４混合物の血中グルコース低下効果
体重３１〜３４ｇのオスｄｂ／ｄｂマウスを、実験動物として用いた。マウスを一晩絶食させ、次いで、血中グルコースメーターを用いてマウスにおける血中グルコースレベルを測定した。結果として、絶食状態におけるマウスにおける血中グルコースレベルは、２００〜２３０ｍｇ／ｄＬであることが示された。次に、マウスを、例４−１において記載されるものと同じ様式において麻酔した。
例１において合成した配列番号１８、２２、２４および２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々、ならびにＥＸ−４を、ＰＢＳ中で溶解して、混合物を調製した（ＴＣＴＰ−ＰＴＤおよびＥＸ−４の最終濃度は、それぞれ、２０μＭおよび１０μＭであった）。麻酔の２０分後に、調製したＥｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物の各々を、マウスに鼻内投与し（Ｅｘ−４用量：１０μｇ／ｋｇ）、対照群に、同じ量のＥｘ−４を鼻内投与し、陰性対照群に、同じ量のＰＢＳを鼻内投与した。１５分後、グルコース（２．５ｇ／ｋｇ）を、マウスに腹腔内注射し、マウスにおける血中グルコースレベルを２４０分間にわたりモニタリングした。時間スケジュールは、以下のとおりである：
結果を、図９において示す。図９において理解し得るとおり、ＰＢＳ処置された陰性対照群およびＥｘ−４単独で処置された群は、血中グルコースレベルの著しい増大を示した。しかし、Ｅｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物が投与された場合においては、グルコースを腹腔内投与した場合においてすら、血中グルコースレベルの著しい変化は起こらなかった。特に、配列番号１８、２２および２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、血中グルコースレベルを低下させる優れた効果を示した。
図９において示される結果を用いて、血中グルコースレベルの曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、各処置群の平均値を計算した。台形規則を用いてＡＵＣを計算した（Shen et al., 1999）。
血中グルコースレベルが減少するにつれてＡＵＣは減少し、このことは、鼻粘膜におけるＥｘ−４の取り込み速度が増大することを示している。図１０において理解し得るとおり、ＡＵＣは、Ｅｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤで処置された群において、Ｅｘ−４で処置された群よりも低く、特に、配列番号１８、２２および２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの場合において、ＡＵＣは低かった。
図９および１０における結果から、配列番号１８、２２、２４および２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、Ｅｘ−４が鼻粘膜に浸透する能力を増強し、それにより、Ｅｘ−４が鼻投与の際に血中グルコースを低下させる効果を増大させる。
４−３：Ｅｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物の薬物動態プロフィールの評価
体重１８０〜２００ｇのオスWistarラットを、実験動物として用いた。バッファー（ｐＨ６．４）中で、Ｅｘ−４と、各２００μＭの配列番号１８、２２、２４および２７のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドとを、１：２の分子比において混合した。Ｅｘ−４の鼻内用量は、各々のラットの体重あたり３０μｇであり、ＢＡ％を、Ｅｘ−４を皮下注射した群（１０μｇ／ｋｇ）のものと比較した。全ての値を、平均値±ＳＥＭとして表し、一方向ANOVAを用いてTukeyの多重比較検定により統計学的分析を行った（有意性：ｐ＜０．０５）。結果を、以下の表２において示す。
結果として、Ｅｘ−４／配列番号２２、Ｅｘ−４／配列番号２４またはＥｘ−４／配列番号１８で処置された群は、Ｅｘ−４／配列番号２７で処置された群と比較して改善された結果を示した。ＢＡ％は、Ｅｘ−４単独で処置された群においては１．６％、Ｅｘ−４／配列番号２７で処置された群においては１１．４％、Ｅｘ−４／配列番号２２で処置された群においては２０．７％、Ｅｘ−４／配列番号２４で処置された群においては３１．５％、Ｅｘ−４／配列番号１８で処置された群においては２９．３％であった。Ｅｘ−４／配列番号２４で処置された群におけるＢＡ％は、最良の効果を示し、これは、Ｅｘ−４／配列番号２７で処置された群におけるものよりも、２．７倍高かった（ｐ＜０．０５）（図１１）。
上の結果から、Ｅｘ−４／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物が、Ｅｘ−４の鼻内投与の際のバイオアベイラビリティおよび効力を改善する効果を有することを理解し得る。
例５：ＴＣＴＰ−ＰＴＤが毛包に浸透する能力の評価
５−１：ＴＣＴＰ−ＰＴＤバリアントが毛包に浸透する能力の評価
毛包は、毛髪を作る皮膚の器官であって、真皮において毛根を包み、栄養を供給するように機能する。本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤが毛包に浸透することができるのであれば、毛包中への薬物の送達もまた可能となるであろう。したがって、この例においては、ＴＣＴＰ−ＰＴＤが皮膚の毛包に浸透するか否かを、以下の様式において試験した。
配列番号１、１２、１７、１８、２２および２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの各々のアミノ末端を、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）で標識し、次いで、各ＴＣＴＰ−ＰＴＤを、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．４）中で１００μＭの最終濃度に溶解した。
オスＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢）を準備し、マウスの腹部領域を剪毛した。次に、マウスをウレタンの腹腔内注射（１．２〜１．５ｇ／ｋｇ）により麻酔し、次いで、各１００μｌのＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチド溶液を、経皮投与されるように、各マウスの腹部領域に適用した。ペプチド溶液の各々を、１ｃｍ２の面積に適用した。
経皮投与の２時間後、皮膚組織を採取し、１０％ホルマリンで約２４時間にわたり固定し、次いで、３０％スクロース溶液で４時間にわたり処置した。前処理した皮膚組織を、ＯＣＴコンパウンド中に浸漬し、次いで、液体窒素で処置して凍結ブロックを準備した。皮膚組織を、クライオトーム（cryotome）を用いて２０μｍの厚みに薄切し、スライドグラスに付着させた。皮膚組織が付着したスライドグラスを、ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、核をＤＡＰＩ（青色蛍光）で染色した。蛍光顕微鏡により、皮膚に浸透したＰＴＤを観察した。
結果として、ＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドは、いずれも、毛包および皮膚の真皮に到達したことを観察することができた（図１２）。
５−２：アミノ酸の型によるＴＣＴＰ−ＰＴＤの毛包浸透の評価
Ｌ−ＰＴＤ１３またはＤ−ＰＴＤ１３のアミノ末端を、ＦＩＴＣ（緑色蛍光）で標識し、次いで、各ＰＴＤペプチドを、ＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．４）中で１００μＭの最終濃度に溶解した。
オスＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢）を準備し、マウスの腹部領域を剪毛した。次に、マウスをウレタンの腹腔内注射（１．２〜１．５ｇ／ｋｇ）により麻酔し、次いで、１００μｌのＦＩＴＣ標識Ｌ−ＰＴＤ１３またはＤ−ＰＴＤ１３溶液の各々を、経皮投与されるように、各マウスの腹部領域に適用した。ペプチド溶液の各々を、１ｃｍ２の面積に適用した。
経皮投与の２時間後、皮膚組織を採取し、１０％ホルマリンで約２４時間にわたり固定し、次いで、３０％スクロース溶液で４時間にわたり処置した。前処理した皮膚組織を、ＯＣＴコンパウンド中に浸漬し、次いで、液体窒素で処置して凍結ブロックを準備した。皮膚組織を、クライオトームを用いて２０μｍの厚みに薄切し、スライドグラスに付着させた。皮膚組織が付着したスライドグラスを、ＰＢＳで５回洗浄し、次いで、核をＤＡＰＩ（青色蛍光）で染色した。蛍光顕微鏡により、皮膚に浸透したＰＴＤを観察した。
結果として、Ｌ−ＰＴＤ１３およびＤ−ＰＴＤ１３は、いずれも、毛包および皮膚の真皮に到達したことが理解し得た（図１３）。
例６：ＴＣＴＰ−ＰＴＤによるワクチンの送達
４５ｋＤａの分子量を有するＯＶＡ（卵白アルブミン）を、ワクチン接種のためのモデル抗原として選択し、ＯＶＡが鼻粘膜に浸透する能力がＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３により増大するか試験した。
６−１：ＯＶＡ／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３混合物の調製
第１に、ＯＶＡと、Ｌ−ＰＴＤ１３またはＤ−ＰＴＤ１３とを、ＰＢＳ中で、ＯＶＡおよびＴＣＴＰ−ＰＴＤの濃度が、それぞれ１０μＭおよび３００μＭとなるように溶解し（リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７．４）、それにより混合物を調製した。ここで、ＯＶＡとＴＣＴＰ−ＰＴＤとを、１：３０のモル比において混合した。
６−２：鼻粘膜上皮細胞に浸透する能力の試験
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、５０ｍｇ／ｋｇのZoletilおよび１０ｍｇ／ｋｇのキシラジンの腹腔内注射により麻酔した。
１０μｌのＯＶＡ、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物またはＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３混合物を、麻酔したマウスの各々に鼻内投与した。対照群には、４．５μｇのＯＶＡを単独で投与した。
鼻内投与の１５分後、鼻内組織を採取した。採取した鼻内組織を、１０％ホルマリンで約２４時間にわたり固定し、次いで、４Ｍのギ酸を用いて４℃で３０時間にわたり脱灰した。脱灰後、慣用的な方法に従って鼻内組織をパラフィンに包埋し、５μｍの厚みで薄切し、スライドグラスに付着させた。鼻内組織が付着したスライドグラスを、キシレンおよびアルコールで脱パラフィンおよび脱水し、次いで、１０％ギ酸中に１５分間浸漬して、抗原性を回復させた。スライドグラスをＰＢＳで洗浄し、次いで、非特異的反応をブロッキングするために、２．５％正常ウマ血清中で３０分間にわたりインキュベートし、その後、１：２００希釈の一次抗体（ＯＶＡ特異的ウサギ抗血清、Sigma-Aldrich）と共に４℃で一晩インキュベートした。一次抗体とのインキュベーションの後で、スライドグラスをＰＢＳで洗浄し、次いで、１：１００希釈の二次抗体（緑色蛍光；Alexa 488共役二次抗体、Invitrogen）と共に室温で１時間にわたりインキュベートした。スライドグラスをＰＢＳで洗浄し、次いで、核をＤＡＰＩ（青色蛍光）で染色し、その後、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を、図１４において示す（図１４の上：鼻洞の横断面観察；図１４の下：上図の拡大図）。図１４ａは、ＯＶＡを単独で投与した対照群を示す。図１４ａにおいて、蛍光は、鼻腔においてのみ観察され、鼻粘膜内では実質的に観察されなかった。図１４ｂは、ＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３混合物を投与された群を示す。図１４ｂにおいて、蛍光は、鼻粘膜内で観察された。図１４ｃは、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物を投与された群を示し、図１４ｃにおいて、蛍光は、鼻粘膜内で観察された。上の結果から、本発明のＬ−ＰＴＤ１３およびＤ−ＰＴＤ１３は、鼻粘膜中に浸透して抗原（ＯＶＡ）を送達する効果を有することが理解し得た。
６−３：抗原特異的粘膜免疫応答および全身性免疫応答の評価
ＯＶＡとＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３とを、多様なモル比で混合して、混合物を調製した。混合物の各々を、マウスに投与し、マウスにおいて現われたＯＶＡ特異的粘膜免疫応答および全身性免疫応答を試験した。
（１）ＯＶＡ／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３混合物の調製
第１に、ＯＶＡとＬ−ＰＴＤ１３、またはＤ−ＰＴＤ１３とＯＶＡとを、ＰＢＳ中で、１：１５および１：３０のモル比（ＯＶＡ：Ｌ−ＰＴＤ１３またはＤ−ＰＴＤ１３）において、ＯＶＡの濃度が１０μＭに設定される状態において混合し、それにより混合物を調製した。
（２）粘膜免疫応答および全身性免疫応答の評価
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、各々が５個体のマウスからなるいくつかの群に分けた。マウスを、例６−２において記載されるものと同じ様式において麻酔し、例６−３（１）において調製したＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ１３混合物またはＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物（１：１５〜１：３０のモル比）を、マウスに鼻内投与した。対照群に、４．５μｇのＯＶＡを単独で鼻内投与した。一方、陽性対照群に、４．５μｇのＯＶＡを筋肉内注射した。
投与の３週間後、同じ量のＯＶＡまたはＯＶＡ／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物を、マウスに鼻内で再接種した。再接種の３週間後、全身性免疫応答および粘膜免疫応答を確認するために、各マウスの血漿、およびマウスの鼻腔を２５０μｌのＰＢＳで洗浄して得た鼻洗浄液を採取した。
慣用的なＥＬＩＳＡ法に従って、血漿中のＩｇＧ、および鼻洗浄液中の抗原特異的分泌型ＩｇＡを測定した。具体的には、ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル）の各ウェルを、１００μｌ（ＯＶＡ、１０μｇ／ｍｌ）の５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）で一晩４℃でコーティングした。プレートを、洗浄バッファー（０．０５％（ｖ／ｖ）のTween 20、０．１４ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で３回洗浄した。プレートを洗浄した後、非特異的結合を遮断するために、プレートの各ウェルを、２００μｌのブロッキングバッファー（０．１４ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に１％（ｖ／ｖ）のウシ血清アルブミンを添加したもの）で３０分間ブロッキングした。ブロッキングバッファーの除去の後、血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価を測定するために、１／２倍連続希釈により得た血漿試料を各ウェルに添加して、１時間にわたりインキュベートし、鼻洗浄液中の抗原特異的分泌型ＩｇＡを測定するために、１００μｌの鼻洗浄液を各ウェルに添加して、１時間にわたりインキュベートした。次に、プレートを、洗浄バッファーで３回洗浄し、次いで、１００μｌの１：２０，０００希釈の二次抗体（ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ、Bethyl）を各ウェルに添加して、１時間にわたりインキュベートして、血漿中の抗原特異的ＩｇＧを検出した。鼻洗浄液中の抗原特異的分泌型ＩｇＡを検出するために、１００μｌの１：１０，０００希釈の二次抗体（ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＡ、Sigma）を各ウェルに添加して、１時間にわたりインキュベートした。次に、プレートを、洗浄バッファーで５回洗浄し、次いで、ＨＲＰのための基質である１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに添加してインキュベートし、その後、１００μｌの０．２ＭのＨ２ＳＯ４を各ウェルに添加して、反応を停止させた。次に、ＥＬＩＳＡリーダーで、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
結果として、ＯＶＡ／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ混合物で処置された全ての群の血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価の平均値は、ＯＶＡを単独で鼻内投与された対照群のものよりも高かったことが示された（図１５）。特に、抗原特異的ＩｇＧは、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ混合物（１：１５または１：３０のモル比）を投与された群の血漿において、ＯＶＡを筋肉内注射された陽性対照群よりも多く検出された。
鼻洗浄液中の分泌型ＩｇＧは、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤまたはＯＶＡ／Ｌ−ＰＴＤ混合物を投与された群において、ＯＶＡを筋肉内投与された陽性対照群よりも多く検出された（図１６）。特に、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ混合物（１：１５または１：３０のモル比）で処置された群において、抗原特異的分泌型ＩｇＡは、有意により多く検出された。
図１５および１６における結果から、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３が、抗原を鼻腔中に送達して全身性免疫応答および粘膜免疫応答を誘導する優れた効果を有することを理解し得る。
６−４：ＯＶＡ／ＣｐＧ／ＰＴＤ混合物の鼻内投与の後の抗原特異的粘膜および全身性免疫応答の誘導および評価
ＤＮＡアジュバントＣｐＧをＯＶＡ／ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３混合物に添加することにより得られた混合物を、マウスに鼻内投与し、次いで、抗原特異的粘膜免疫応答および全身性免疫応答を誘導する効果を試験した。
（１）ＯＶＡ／ＣｐＧ／ＰＴＤ混合物の調製
ＣｐＧ（配列番号１２３；５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’）は、InvivoGenから購入した（ODN 2006）。
ＯＶＡの濃度を１０μＭに設定し、ＯＶＡ、ＣｐＧおよびＤ−ＰＴＤ１３を、ＰＢＳ中で、１：１：３０、１：３：３０および１：６：３０のモル比において混合して、それにより、ＯＶＡ／ＣｐＧ／ＰＴＤ混合物を調製した。
（２）粘膜免疫応答および全身性免疫応答の評価
メスＢＡＬＢ／ｃマウス（６〜８週齢）を、各々が５〜６個体のマウスからなるいくつかの群に分けた。マウスを、６−２において記載されるものと同じ様式において麻酔し、４．５μｇのＯＶＡ、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物、または１０μｇのＯＶＡ／ＣｐＧ／ＰＴＤを、各マウスに鼻内投与した。加えて、陽性対照群に、４．５μｇのＯＶＡを筋肉内注射した。
投与の３週間後、同じ量のＯＶＡ、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物またはＯＶＡ／ＣｐＧ／ＰＴＤ混合物を、各マウスに鼻内で再接種した。再接種の３週間後、全身性免疫応答および粘膜免疫応答を確認するために、各マウスの血漿、およびマウスの鼻腔をＰＢＳで洗浄することにより得られた鼻洗浄液を採取した。
例６−２において記載されるものと同じＥＬＩＳＡ法に従って、血漿中のＩｇＧおよび鼻洗浄液中の抗原特異的分泌型ＩｇＡを測定した。
結果として、ＯＶＡ／ＣｐＧ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物（１：１：３０または１：３：３０のモル比において混合することにより得られたもの）で処置された群の血漿中の抗原特異的ＩｇＧの力価の平均値は、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物（１：３０のモル比において混合することにより得られたもの）で処置された群におけるものよりも高いことが示された（図１７）。
加えて、鼻洗浄液中の抗原特異的二次ＩｇＧの分泌は、ＯＶＡ／ＣｐＧ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物（１：１：３０、１：３：３０または１：６：３０のモル比）で処置された群において、ＯＶＡ／Ｄ−ＰＴＤ１３混合物（１：３０のモル比）で処置された群よりも高いことが示された（図１８）。
例７：ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３およびそのバリアントによる標的物質の脳内への送達
脳の毛細血管の内皮細胞は、その間にタイトジャンクションを有し、したがって、高い選択的透過性を有し、タイトジャンクションは、血液脳関門として知られる。血液脳関門は、脳を保護するために役立つが、薬物または他の標的物質を脳内に送達することを困難にする。
この例においては、本発明のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドが薬物を脳内に送達することを確認するために、実験を行った。
実験において、レプチンの有効ドメインに基づいて合成されたペプチド［Ｄ−Ｌｅｕ−４−ＯＢ３］（Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ）を用いた。レプチンは、視床下部に対して作用して、食物摂取、食欲制御、体重および脂肪の制御、エネルギーバランスの制御、グルコース恒常性、神経内分泌機能、免疫、代謝機能などを含む多様なヒトの身体機能に関与するペプチドホルモンである。レプチンは、肥満遺伝子（ｏｂ）により産生され、脂肪細胞において主に合成されて分泌される。レプチンを肥満動物モデルに投与した場合、それは、摂食量を有効に減少させ、エネルギーの消費を増大させ、それにより肥満を処置することが知られている。レプチンの体重減少および食欲阻害機能を用いて、肥満、代謝異常または神経内分泌異常などの疾患を処置するための剤を開発する試みが行われてきた。レプチンは、主に注射により投与されてきた。レプチンの主要な活性を示す有効ドメインは公知であり、当該有効ドメインに基づいて、合成ペプチド配列ＯＢ３（Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ）、および、効果を増強するためにＯＢ３配列の位置４におけるＬｅｕをＤ−Ｌｅｕで置換することにより得られた［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３ペプチドを開発した（OZHAVSKAYA-ARENA et al, 2000）。
７−１：ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の調製
ＧＧリンカーによりＬ−ＰＴＤ１３またはＤ−ＰＴＤ１３に連結した［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を含むペプチド（配列番号１２４）を設計した。さらに、ＧＧリンカーによりＤ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ１、Ｄ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ２またはＤ−ＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３Ｍ３の各々に連結した［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を含むペプチド（それぞれ、配列番号１２５、配列番号１２６および配列番号１２７）を設計した。ペプチドは、Peptron Inc.により、９０％以上の純度で合成された。
７−２：体重減少効果の試験
４週齢のオスＩＣＲマウスを、実験動物として用い、各群が７個体の動物からなる以下の群に分けた：ＰＢＳ、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３、およびＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３群。［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３およびＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３の各々を、２ｍｇ／ｋｇの用量において、毎日１回、１０日間にわたり、均一な時点において、各マウスに鼻内投与しつつ、実験動物の各々の体重の変化を測定した。
図１９は、初期体重を１００％として相対的に計算した体重の変化を示し、図２０は、投与の１０日後の体重の比較の結果を示す。１０日間にわたる体重の増大の割合は、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３またはＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を投与された群において、ＰＢＳまたはＯＢ３を投与された群よりも低かった（図１９）。加えて、１０日後に、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３またはＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を投与された群の体重は、ＰＢＳまたはＯＢ３を投与された群のものと比較して減少したことが示された（図２０）。このことは、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３は、鼻内投与を通してＴＣＴＰ−ＰＴＤにより脳内に送達されると、体重減少効果を示すことを示唆する。
７−３：食欲阻害効果の試験
例７−２において確認された体重減少効果が、摂食量の減少と関連を有するか否かを検討するために、ＰＢＳ、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３またはＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を、２ｍｇ／ｋｇの用量において鼻内投与し、１０日間にわたり毎日摂食量を測定した。
結果として、累積摂食量（ｇ／マウス）は、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３またはＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を投与された群において、ＰＢＳを投与された群と比較して、持続的に減少し（図２１）、１０日間の投与の後の合計の摂食量もまた、Ｌ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３またはＤ−ＰＴＤ１３−［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を投与された群において減少したことが示された（図２２）。このことは、鼻内投与されたＴＣＴＰ−ＰＴＤが、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を脳内に送達し、それにより、食欲阻害効果を示し、それにより摂食阻害効果を示すことを示唆する。
例７−２および７−３の結果をまとめると、Ｌ型およびＤ型のＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３は、いずれも、鼻内投与を通して［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３を脳内に送達して、体重減少および食欲阻害効果を示すことを理解することができ、特に、Ｄ−ＰＴＤ１３は、Ｌ−ＰＴＤ１３よりも良好な効果を示した。
７−４：ＴＣＴＰ−ＰＴＤバリアントが標的物質を脳内に送達する能力の試験
次に、標的物質を脳内に送達する効果を有することが確認されたＴＣＴＰ−ＰＴＤ１３のバリアントである、配列番号２２、２４および１８のＤ型ペプチドについて、標的物質を脳内に送達する能力を試験した。例７−２および７−３において記載されるものと同じ方法により、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］ＯＢ３を、Ｄ−ＰＴＤ１３およびその３つのバリアントの各々に連結して、マウスに鼻内投与し、次いで、体重および摂食量の変化を測定した。
各物質を、２ｍｇ／ｋｇの用量において、１０日間にわたり、マウスに鼻内投与し、体重および摂食量の変化を測定した。結果として、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］ＯＢ３およびＴＣＴＰ−ＰＴＤの全ての複合体が、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］ＯＢ３単独よりも、体重および摂食量に対して、著しく良好な効果を有したことが示された（図２３および２４）。加えて、配列番号２４および配列番号１８のＴＣＴＰ−ＰＴＤペプチドの効果は、Ｄ−ＰＴＤ１３のものよりも良好であり、配列番号２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤで処置された群は、体重および摂食量の最大の減少を示した。
例８：ＴＣＴＰ−ＰＴＤに基づく経鼻インスリン処方物の調製
８−１：経鼻インスリン処方物の設計
ＴＣＴＰ−ＰＴＤを経鼻用インスリンキャリアとして含む処方物を開発するために、配列番号２４のＴＣＴＰ−ＰＴＤは、A & PEP Co., Ltd.により高純度（＞９５％）で調製され、合成されたペプチドのＮ末端およびＣ末端を、それぞれ、アセチル化およびアミド化により修飾した。
インスリンの等電点は、約ｐＨ５．３であり、その溶解度は、等電点付近のｐＨにおいて低下する。インスリンの溶解度および鼻粘膜における平均ｐＨ６．３を考慮して、塩基性バッファー（１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢ））のｐＨを、６．４〜７に設定した。インスリン／ＰＴＤ混合物の凝集形成を阻害し、貯蔵安定性を増強するために、タンパク質安定剤（スクロース）＋タンパク質凝集抑制剤（アルギニン）＋界面活性剤（ポロキサマー１８８）＋抗酸化剤（メチオニン）に基づいて、経鼻用インスリン処方物を設計した（表３）。
８−２：経鼻インスリン処方物の薬力学的プロフィールの評価
経鼻用インスリン処方物を設計した後、正常白色ラットにおいて、各経鼻用インスリン処方物の薬力学的プロフィールの評価を行った。具体的には、体重１６５〜２００ｇのオスの白色Wistarラットを、実験動物として用いた。評価の正確性のために、マウスを一晩絶食させ、次いで、絶食状態において９０〜１２０ｍｇ／ｄＬの血中グルコースレベルを有する白色ラットを、実験において用いた。ＰＡ（薬理学的アベイラビリティー）を計算するために、初期血中グルコースレベルを１００％とした。経鼻用インスリン処方物を投与するために、マウスを、麻酔用ペンタバルビツールナトリウムの腹腔内投与により麻酔した（用量：６５ｍｇ／ｋｇ）。インスリン処方物（インスリン用量：１ＩＵ／ｋｇ）の各々を、麻酔したラットに鼻内投与し、次いで、血中グルコースレベルの変化を、３時間にわたり検討した。各経鼻用インスリン処方物のＡＡＣを計算し、より優れたインスリン処方物を選択した。皮下インスリン注射（１００％）と比較した経鼻用インスリン処方物のＰＡを計算し、結果として、処方物３−３および処方物３−５の各々を投与した群の相対的ＰＡは、約４０％以上であり。これは、他のインスリン処方物のものよりも高かった（図２５および表４）。
ＡＡＣ：０〜１８０分の血中グルコースレベル−時間曲線の上の面積
ＰＡ（薬力学的アベイラビリティー）は、以下の式を用いて計算した：
ＰＡ％＝（ＡＡＣｎａｓａｌ×用量ｓ．ｃ）／（ＡＵＣｓ．ｃ×用量ｎａｓａｌ）×１００％
８−３：経鼻インスリン処方物の単一用量毒性の評価
インスリンを送達する優れた能力を示した処方物３−３および処方物３−５が鼻内投与の際に鼻粘膜に損傷を引き起こすか否かを検討するために、鼻腔を、インスリン投与の後、１ｍｌのＰＢＳで１５分間洗浄した。次いで、基本の洗浄液において、細胞が破壊された場合に放出されるＬＤＨ（乳酸デヒドロゲナーゼ）を測定し、それにより、鼻粘膜が損傷を受けたか否かを評価した。陽性対照として、５％のタウロデオキシコール酸ナトリウムを、白色ラットに鼻内投与した。
結果として、陽性対照群におけるＬＤＨレベルは、未処置群におけるものと比較して有意に増大した（Ｐ＞０．０５；図２６）。しかし、本発明の経鼻用インスリン処方物を投与された全ての群が、未処置群（陰性対照群）のものと類似の低いＬＤＬレベルを示した。このことは、経鼻用インスリン処方物の単一用量は、取るに足らない毒性を有することを示唆する。
８−４：インスリン処方物の薬物動態プロフィールの評価
この例において、薬力学的評価において優れたＰＡを示した２つの経鼻用インスリン処方物（処方物３−３および３−５）のＢＡ（バイオアベイラビリティ）値を測定した。上記と同じ白色ラットにおいて薬物動態プロフィールの評価を行い、経鼻用インスリン処方物の各々を、麻酔した白色ラットに鼻内投与した。次いで、様々な時点においてマウスから血液を採取し、血漿中のインスリンの濃度を測定した。
インスリンを、１ＩＵ／ｋｇの用量において白色ラットに投与し、ＢＡを、インスリンを皮下注射した群（０．２５ＩＵ／ｋｇ）のものと比較した。インスリンを皮下注射した群のＢＡを１００％とした場合、インスリンのみを鼻内投与した遊離インスリン群（インスリン用量：５ＩＵ／ｋｇ）、およびインスリン溶液とＰＴＤとの単純な混合物を投与した遊離インスリン＋ＰＴＤ群の相対的なＢＡ値は、それぞれ、３．３％および３８．７％であると計算された。しかし、経鼻用インスリン処方物３−３を投与された群および処方物３−５を投与された群の相対的ＢＡ値は、それぞれ、６０．７％および４５．９％であると計算された（図２７および表５）。
したがって、経鼻用インスリン処方物３−３および３−５により得られた相対ＢＡ値は、それぞれ、１．６倍および１．３倍増大した。
８−５：１型糖尿病モデルにおける経鼻インスリン処方物の薬力学的プロフィールの評価
実験用白色ラットに、アロキサンを腹腔内注射して、１型糖尿病を誘導した。アロキサン投与の１週間後に、２３０〜３００ｍｇ／ｄＬの血中グルコースレベルを有する白色ラットを、実験動物として用いた。経鼻用インスリン処方物の各々を、麻酔した糖尿病ラットに投与し、次いで、血中グルコースレベルを４時間にわたりモニタリングした。各処方物を、インスリン用量が２ＩＵ／糖尿病ラットのｋｇとなるように投与した。ＰＡ値を、インスリン（１ＩＵ／ｋｇ）を皮下注射した群のものと比較した。
皮下インスリン注射のもの（１００％）と比較した経鼻用インスリン処方物のＰＡを計算し、結果として、インスリンのみを鼻内投与された遊離インスリン群の相対的ＰＡは、わずか４％であったが、一方、ＰＴＤに基づく処方物３−３を投与された群の相対的ＰＡは４９．３％であり、処方物３−５を投与された群の相対的ＰＡは３７．５％であった（図２８および表６）。
ＡＡＣ：０〜２４０分の血中グルコースレベル−時間曲線の上の面積
ＰＡ（薬力学的アベイラビリティー）は、以下の式を用いて計算した：
ＰＡ％＝（ＡＡＣｎａｓａｌ×用量ｓ．ｃ）／（ＡＡＣｓ．ｃ×用量ｎａｓａｌ）×１００％
８−６：経鼻インスリン処方物の繰り返し用量毒性の評価
鼻内投与の際にインスリンを送達する優れた能力を示した経鼻用インスリン処方物３−３および３−５の各々を、オスＩＣＲマウスに、１日１回、１０日間にわたり鼻内投与した（インスリン用量：２ＩＵ／ｋｇ）。次いで、鼻粘膜および血液を採取し、鼻粘膜が損傷を受けたか否か、および血液学的指標を分析した。
鼻粘膜組織を観察および評価し、結果として、陽性対照群（５％タウロデオキシコール酸ナトリウム）における鼻粘膜組織は破壊されたが、２つの経鼻用インスリン処方物の場合においては有意な組織病理学的変化は存在しなかったことが観察された（図２９）。加えて、繰り返し鼻内投与の１０日後にマウスを安楽死させ、単一用量毒性評価と同じ様式（ＬＤＨ測定）において評価し、結果として、対照群（０．９％のＮａＣｌ）、およびインスリン処方物を鼻内投与された群は、繰り返し投与の後ですら、明確な毒性を示さなかった（図３０）。
次に、血清の生物学的検査のために、繰り返し鼻内投与の１０日後に、実験動物から血液を採取した。採取した血液を遠心分離して血清を単離し、自動血清分析器を用いて、単離された血清を分析した。肝臓の損傷の指標であるＡＬＴ（アラニントランスアミナーゼ）およびＡＳＴ（アスパラギン酸トランスアミナーゼ）のレベルは、対照群（０．９％のＮａＣｌ）と、経鼻用インスリン処方物を投与された全ての群との間で、著しくは異ならなかった。さらに、腎臓の損傷の指標であるＢＵＮ（血中尿素窒素）およびＣＲＥ（クレアチニン）のレベルは、対照群（０．９％のＮａＣｌ）と、経鼻用インスリン処方物を投与された全ての群との間で、著しくは異ならなかった（図３１）。このことは、経鼻用インスリン処方物が短期間にわたり投与された場合に、毒性は観察されないことを示唆する。
加えて、１０日間にわたり経鼻用インスリン処方物の投与を受けた実験動物から、脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、および脾臓を抽出した。抽出された器官の各々を、１０％ホルマリン溶液中で固定した。器官の組織から、パラフィン切片を準備し、次いでＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオジン）で染色した。光学顕微鏡を用いて、染色された組織の組織病理学的試験を行った。結果として、対照群（０．９％のＮａＣｌ）と、経鼻用インスリン処方物を投与された群との間に、著しい病態学的差異は存在しなかった（図３２）。上の結果をまとめると、実験的条件下において２つの経鼻用インスリン処方物が鼻腔内に送達される場合、それらは鼻内組織および主要な組織において毒性学的な変化を誘導しないことを理解し得る。

Claims (56)

  1. 以下のアミノ酸配列：
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
    ここで、
    Ｒ１は、Ｍ、ＬまたはＰから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ５は、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、ＨまたはＬから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ７は、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ９は、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、および
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、ＰまたはＬから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
    ただし、配列は、ＭＩＩＦＲＩＡＡＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＡＬＩＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＡＡＡＳＨＫＫ、ＬＩＩＦＲＩＡＡＳＨＫＫ、ＭＩＩＦＲＩＡＡＹＨＫＫ、ＭＩＩＦＫＩＡＡＳＨＫＫ、ＬＩＩＦＲＩＬＩＳＨＫＫ、またはＭＩＩＦＲＩＬＩＳＨＫＫではない、
    からなるペプチド。
  2. 配列番号１〜２６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
  3. 配列番号１２、１７、１８、２２および２４からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
  4. 配列番号１または１８のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；および標的物質を含む、複合体。
  6. 標的物質が、化学化合物、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ヌクレオチド、核酸、炭水化物、脂質、糖脂質、天然の生成物、半合成の薬物、ナノ粒子、リポソーム、薬物、脂質ベースの処方物、量子ドット、および蛍光色素からなる群より選択される１つ以上である、請求項５に記載の複合体。
  7. 薬物が、化学薬物、生物学的製剤、核酸薬、ペプチド薬物、タンパク質薬、天然の生成物、半合成の薬物、脂質薬物、酵素、調節因子、ホルモン、増殖因子、造影剤および抗体からなる群より選択される１つ以上である、請求項６に記載の複合体。
  8. 薬物がインスリンである、請求項６に記載の複合体。
  9. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；および標的物質を含む、キット。
  10. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、核酸。
  11. 配列番号６２〜８７のいずれか一項に記載のヌクレオチド配列からなる、請求項１０に記載の核酸。
  12. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド；または請求項５に記載の複合体を含む、組成物。
  13. 生きている組織または血液中に標的物質を送達するため；または標的物質の細胞浸透を促進するための、請求項１２に記載の組成物。
  14. 組織が、上皮組織、筋肉組織、神経組織および結合組織からなる群より選択される１つ以上である、請求項１３に記載の組成物。
  15. 粘膜または皮膚を通して標的物質を送達するための、請求項１３に記載の組成物。
  16. 標的物質がインスリンである、請求項１５に記載の組成物。
  17. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの処方物である、請求項１２に記載の組成物。
  18. エキセンディン−４を送達するための組成物であって、以下のアミノ酸配列；
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
    ここで、
    Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＲ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、およびＫＫＫＫより選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
    からなるペプチド、ならびにエキセンディン−４を含む、
    前記組成物。
  19. ペプチドが、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
  20. ペプチドが、配列番号１８、２２、２４、２７および４６からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
  21. ペプチドが、配列番号１または４２のアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
  22. エキセンディン−４を生きている組織または血液中に送達するため；または細胞浸透を促進するための、請求項１８に記載の組成物。
  23. 組織が、上皮組織、筋肉組織、神経組織および結合組織からなる群より選択される１つ以上である、請求項２２に記載の組成物。
  24. 粘膜または皮膚を通してエキセンディン−４を送達するための、請求項１８に記載の組成物。
  25. 糖尿病、肥満、代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢神経疾患、および末梢神経疾患からなる群より選択されるいずれか１つの予防または処置のための、請求項１８に記載の組成物。
  26. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの処方物である、請求項１８に記載の組成物。
  27. 配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるペプチド；およびエキセンディン−４を含む、キット。
  28. 標的物質を毛包中に送達するための組成物であって、以下のアミノ酸配列；
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
    ここで、
    Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、およびＲ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫ、およびＫＫＫＫより選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい
    からなるペプチド、ならびに標的物質を含む、
    前記組成物。
  29. ペプチドが、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の組成物。
  30. ペプチドが、配列番号１２、１７、１８、２２、２４および２７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の組成物。
  31. ペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の組成物。
  32. 標的物質が、育毛促進薬、育毛阻害薬、抗生物質および抗炎症薬から選択される１つ以上である、請求項２８に記載の組成物。
  33. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの処方物である、請求項２８に記載の組成物。
  34. ワクチンを送達するための組成物であって、以下のアミノ酸配列；
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
    ここで、
    Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、
    Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、ならびに
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸であり、および、Ｒ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫからなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
    からなるペプチド、ならびにワクチンを含む、
    前記組成物。
  35. ペプチドが、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３４に記載の組成物。
  36. ペプチドが、配列番号２２、２４、１８および２７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３４に記載の組成物。
  37. ペプチドが、Ｄ型、Ｌ型またはラセミペプチドである、請求項３４に記載の組成物。
  38. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの処方物である、請求項３４に記載の組成物。
  39. 標的物質を脳内に送達するための組成物であって、以下のアミノ酸配列；
    Ｒ１−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｒ６−Ｒ７−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０
    ここで、
    Ｒ１は、Ｍ、Ｌ、Ｐ、Ｑ、Ｃ、ＦまたはＷから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ２は、Ｉ、Ａ、Ｌ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ３は、Ｉ、Ｌ、Ａ、ＰまたはＨから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ４は、Ｆ、Ｅ、Ａ、Ｌ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、ＳまたはＲから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ５は、Ａ、ＲまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ６は、Ａ、Ｍ、Ｉ、Ｐ、Ｈ、Ｌ、ＲまたはＤから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ７は、Ｌ、Ａ、Ｐ、Ｈ、Ｋ、ＲまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ８は、Ｉ、Ｌ、Ａ、Ｐ、ＨまたはＫから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、
    Ｒ９は、Ｔ、Ｓ、ＥまたはＹから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、ならびに
    Ｒ１０は、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｐ、ＬまたはＥから選択されるいずれか１つのアミノ酸配列であり、および、Ｒ１０にアミノ酸は付加されないか、または、Ｒ、ＲＲ、ＨＨ、Ｋ、ＫＫ、ＫＫＫおよびＫＫＫＫの中から選択されるいずれか１つのアミノ酸が、Ｒ１０に付加されていてもよい、
    からなるペプチド、ならびに標的物質を含む、
    前記組成物。
  40. ペプチドが、配列番号１〜６１からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３９に記載の組成物。
  41. ペプチドが、配列番号２２、２４、１８および２７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなる、請求項３９に記載の組成物。
  42. ペプチドが、Ｄ型、Ｌ型またはラセミペプチドである、請求項３９に記載の組成物。
  43. 標的物質が、レプチンまたは［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３である、請求項３９に記載の組成物。
  44. 標的物質が、糖尿病、肥満、代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢神経疾患、および末梢神経疾患を処置するための剤からなる群より選択される１つ以上である、請求項３９に記載の組成物。
  45. ペプチドと標的物質とが、互いに融合している、請求項３９に記載の組成物。
  46. 標的物質が、［Ｄ−Ｌｅｕ−４］−ＯＢ３である、請求項４５に記載の組成物。
  47. ペプチドおよび標的物質が、互いにリンカーにより連結されている、請求項４５に記載の組成物。
  48. 糖尿病、肥満、代謝性疾患、認知症、骨粗鬆症、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳卒中、中枢神経疾患、および末梢神経疾患からなる群より選択されるいずれか１つの予防または処置のための、請求項３９に記載の組成物。
  49. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つの処方物である、請求項３９に記載の組成物。
  50. 配列番号１〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列により表されるペプチド；および標的物質を含む、処方物。
  51. 経口処方物、注射可能処方物、粘膜投与のための処方物、経口粘膜投与のための処方物、鼻投与のための処方物、眼用処方物、膣投与のための処方物、吸入用処方物、外用のための処方物、経皮吸収のための処方物、舌下投与のための処方物、移植のための処方物および坐剤からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項５０に記載の処方物。
  52. 標的物質が、インスリンである、請求項５０に記載の処方物。
  53. タンパク質安定化剤、界面活性剤および抗酸化剤からなる群より選択される１つ以上を含む、請求項５０に記載の処方物。
  54. スクロース、ポロキサマーおよびメチオニンからなる群より選択されるいずれか１つ以上を含む、請求項５０に記載の処方物。
  55. スクロース、ポロキサマーおよびメチオニンを含む、請求項５０に記載の処方物。
  56. 配列番号１〜６１のうちのいずれか１つのアミノ酸配列により表されるペプチドを、０．２３〜０．２７ｍＭの濃度で含む、請求項５０に記載の処方物。
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