KR20230090333A - 조성물 - Google Patents

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KR20230090333A
KR20230090333A KR1020237015719A KR20237015719A KR20230090333A KR 20230090333 A KR20230090333 A KR 20230090333A KR 1020237015719 A KR1020237015719 A KR 1020237015719A KR 20237015719 A KR20237015719 A KR 20237015719A KR 20230090333 A KR20230090333 A KR 20230090333A
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polymer
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antibody
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KR1020237015719A
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신지 사쿠마
타쿠미 토모노
고헤이 미야타
코이치 시게노
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각코호우징 조쇼 가쿠엔
가부시키가이샤 아데카
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Abstract

본 발명의 목적은 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있는 흡수촉진제를 제공하는 것이다. 상기 과제는 본 발명의 일반식 (1) 또는 하기 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물과 분자량 1,000∼1,200,000의 투여화합물을 함유하는 조성물에 의해 해결할 수 있다.
[화학식 1]
Figure pct00011

(식중, X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X3은 수산기, 아미노기, 탄소수 1∼4의 알콕실기 또는 벤질옥시기이고, a는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)
[화학식 2]
Figure pct00012

(식중, X4는 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X5는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X6은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 벤질기, 탄소수 1∼6의 아실기, 아릴술포닐기 또는 옥시카르보닐기이고, b는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)

Description

조성물
본 발명은 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 항체 의약 등의 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있다.
의약 등의 흡수촉진제로서 예를 들어 살카프로제이트나트륨(SNAC: N-(8-[2-히드록시벤조일]아미노)카프릴산)이 알려져 있다(특허문헌 1). SNAC는 의약 등과 공존시켜 투여하는데 고분자량의 화합물을 세포내에 도입하기는 어려웠다.
또한 막투과성 펩티드를 흡수촉진제로서 이용하는 방법이 있다. 예를 들어 막투과성 펩티드와 세포에 도입하고자 하는 목적화합물을 공존시키고, 목적화합물만을 도입하는 방법(특허문헌 2 및 3)이 알려져 있다. 막투과성 펩티드를 사용하는 방법은 간편하지만 고분자량 물질의 도입 효율이 불충분하였다.
일본 특허공표 2010-502667호 공보 국제공개 제2010/134537호 명세서 일본 특허공표 2019-522020호 공보 국제공개 제2016/136708호 명세서
본 발명자들은 고분자화합물의 측쇄에 막투과성 펩티드를 결합시킨 고분자화합물을 이용함으로써 저 막투과성 화합물의 세포에의 도입이 촉진되는 것을 발견하였다(특허문헌 4). 그러나 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있는 흡수촉진제의 개발이 기대되고 있었다.
따라서 본 발명의 목적은 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있는 흡수촉진제를 제공하는 것이다.
본 발명자는 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있는 흡수촉진제에 대하여 열심히 연구한 결과, 놀랍게도 특정 구조의 펩티드를 측쇄에 가지는 고분자화합물과 조합함으로써 효율적으로 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 이러한 지견에 기초하는 것이다.
따라서 본 발명은
[1] 하기 일반식 (1) 또는 하기 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물과 분자량 1,000∼1,200,000의 투여화합물을 함유하는 조성물.
Figure pct00001
(식중, X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X3은 수산기, 아미노기, 탄소수 1∼4의 알콕실기 또는 벤질옥시기이고, a는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)
Figure pct00002
(식중, X4는 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X5는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X6은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 벤질기, 탄소수 1∼6의 아실기, 아릴술포닐기 또는 옥시카르보닐기이고, b는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)
[2] 상기 투여화합물의 분자량이 1,000∼200,000인 [1]에 기재된 조성물,
[3] 상기 고분자화합물의 줄기 고분자(幹高分子)가 비닐계 친수성 고분자인 [1] 또는 [2]에 기재된 조성물,
[4] 상기 투여화합물이 항체인 [1]∼[3] 중 어느 하나에 기재된 조성물,
[5] 상기 항체가 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 혹은 인간 항체 또는 이들의 항원 결합성 단편인 [4]에 기재된 조성물, 및
[6] 상기 고분자화합물 및 투여화합물을 혼합한 후에 세포에 접촉시키기 위한 [1]∼[5] 중 어느 하나에 기재된 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물에 따르면 고분자량의 화합물을 세포내에 도입할 수 있을 수 있다. 특히 항체 의약 등의 약제의 생체내에서의 흡수를 촉진시킬 수 있고, 약효를 높이는 것이 가능하다.
도 1은 투여화합물로서 FITC-INS를 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
도 2는 투여화합물로서 FITC-CTB를 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
도 3은 투여화합물로서 FITC-OVA를 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
도 4는 투여화합물로서 FITC-IgG를 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
도 5는 투여화합물로서 FITC-Tf를 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
도 6은 투여화합물로서 FITC-IgM을 이용한 본 발명의 조성물의 세포에의 수용을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 조성물은 하기 일반식 (1):
Figure pct00003
(식중, X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X3은 수산기, 아미노기, 탄소수 1∼4의 알콕실기 또는 벤질옥시기이고, a는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합부분을 나타낸다.)
또는 하기 일반식 (2):
Figure pct00004
(식중, X4는 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X5는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X6은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 벤질기, 탄소수 1∼6의 아실기, 아릴술포닐기 또는 옥시카르보닐기이고, b는 0∼50의 정수이다. ＊는 결합부분을 나타낸다.)
로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물과 분자량 1,000∼1,200,000의 투여화합물을 함유한다. 상기 투여화합물의 분자량은 예를 들어 1,000∼200,000이어도 된다.
본 발명의 조성물은 고분자화합물 및 투여화합물을 포함하고, 세포에 투여화합물을 효율적으로 도입할 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 한정되는 것은 아니지만, 화합물 도입용 조성물이다. 또한 투여화합물이 약제이고, 인간 또는 동물 등의 치료에 이용되는 경우, 본 발명의 조성물은 의약조성물로서 이용할 수 있다. 본 발명의 조성물은 예를 들어 점막(예를 들어 코점막, 구강점막, 질점막, 직장점막, 눈점막, 위점막, 장관점막 등)을 통해 세포에 도입할 수 있다.
《투여화합물》
본 발명의 조성물은 실시예에 나타내는 바와 같이 고분자의 투여화합물을 세포내에 도입할 수 있다. 투여화합물의 분자량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 효과를 현저하게 발휘하는 관점에서 예를 들어 1,000∼1,200,000이고, 일양태에서는 4,000∼1,100,000이고, 일양태에서는 5,000∼1,000,000이고, 일양태에서는 9,000∼990,000이고, 일양태에서는 20,000∼980,000이고, 일양태에서는 40,000∼950,000이고, 일양태에서는 70,000∼940,000이고, 일양태에서는 85,000∼930,000이고, 일양태에서는 100,000∼920,000이고, 일양태에서는 130,000∼910,000이고, 일양태에서는 140,000∼905,000이고, 일양태에서는 150,000∼900,000이고, 일양태에서는 160,000∼890,000이고, 일양태에서는 170,000∼880,000이고, 일양태에서는 180,000∼870,000이고, 일양태에서는 190,000∼860,000이고, 일양태에서는 200,000∼850,000이고, 일양태에서는 230,000∼830,000이고, 일양태에서는 250,000∼800,000이고, 일양태에서는 300,000∼750,000이고, 일양태에서는 350,000∼700,000이고, 일양태에서는 400,000∼650,000이고, 일양태에서는 450,000∼600,000이고, 일양태에서는 500,000∼550,000이다. 또한 일양태에서는 1,000∼200,000이고, 일양태에서는 5,000∼200,000이고, 일양태에서는 20,000∼180,000이고, 일양태에서는 40,000∼180,000, 일양태에서는 70,000∼170,000, 일양태에서는 85,000∼160,000, 일양태에서는 100,000∼155,000이다. 상기 분자량 범위의 상한과 하한은 예를 들어 1,000∼1,100,000 또는 4,000∼1,200,000 등과 같이 적절히 조합한 범위로 할 수 있다.
투여화합물의 분자량은 물질 1분자의 질량의 통일 원자질량단위에 대한 비이고, 분자중에 포함되는 원자량의 총계를 의미한다. 따라서 각각의 화합물의 화학식으로부터 계산할 수 있다. 또한 달리 언급이 없으면 구성원소의 천연의 핵종조성에 기초한 상대 원자질량(원자량)을 이용하여 산출된다. 투여화합물이 혼합물인 경우에는 혼합된 2종 이상의 화합물의 비로부터 계산할 수 있다.
투여화합물이 폴리머 또는 혼합비가 불명료한 혼합물 등인 경우에는 분자량으로서 중량평균분자량을 이용할 수 있다. 본 명세서에 있어서 “중량평균분자량”이란 수계 용매를 이용하여 GPC 분석을 수행한 경우의 중량평균분자량을 의미한다. 예를 들어 풀룰란 환산의 중량평균분자량 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 혹은 폴리에틸렌옥시드(PEO) 환산의 중량평균분자량을 이용할 수 있다.
투여화합물이 항체, 단백질 등인 경우에는 상기 환산 외에 예를 들어 Thyroglobulin, γ-Globulin, BSA, OVA, Myoglobin, Ribonuclease A, Aprotinin 환산의 중량평균분자량을 이용할 수 있다. 투여화합물이 항체, 단백질 등인 경우, GPC 측정에 있어서의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 이하의 장치 및 컬럼으로 측정한 값을 채택할 수 있다.
·장치 EXTREMA(니혼분코사제)
·컬럼 PROTEIN LW-803(Shodex사제)
투여화합물로서는 한정되는 것은 아니지만, 항체 등의 바이오 의약품, 인슐린 및 인슐린 분비 촉진제(예를 들어 엑센딘-4, GLP-1) 등의 펩티드·단백성 의약품, 스테로이드호르몬, 비스테로이드계 진통항염증제, 정신안정제, 항고혈압약, 허혈성 심질환 치료약, 항히스타민약, 항천식약, 항파킨슨약, 뇌순환 개선약, 항구토제, 항우울약, 항부정맥약, 항응고약, 항통풍약, 항진균약, 항치매약, 쇼그렌 증후군 치료약, 마약성 진통제, 베타차단약, β1 작동약, β2 작동약, 부교감신경 작동약, 항종양약, 이뇨약, 항혈전약, 히스타민 H1 수용체 길항약, 히스타민 H2 수용체 길항약, 항알레르기약, 금연보조약, 비타민 등의 의약품; 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체 또는 유도체(예를 들어 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA 등) 등의 핵산 화합물; 효소, 당단백질, 전사인자 등의 펩티드 화합물; 풀룰란, 아밀로펙틴, 아밀로스, 글리코겐, 사이클로덱스트린, 덱스트란, 히드록시에틸덱스트란, 만난, 셀룰로오스, 전분, 알긴산, 키틴, 키토산, 히알루론산 등의 다당 유도체 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 본 발명의 효과가 현저하게 발휘되는 관점에서 투여화합물로서는 바람직하게는 항체 등의 바이오 의약품, 인슐린 및 인슐린 분비 촉진제(예를 들어 엑센딘-4, GLP-1) 등의 펩티드·단백성 의약품, 디옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이들의 유사체 또는 유도체(예를 들어 펩티드 핵산(PNA), 포스포로티오에이트 DNA 등) 등의 핵산 화합물, 효소, 당단백질, 전사인자 등의 펩티드 화합물 등, 보다 바람직하게는 항체, 단백질, 펩티드 등이다. 본 발명에 이용하는 투여화합물로부터 FITC-BSA를 제외할 수 있다.
(항체)
상기 항체로서는 한정되는 것은 아니지만, 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 혹은 인간 항체 또는 이들의 항원 결합성 단편을 들 수 있다. 인간화 항체는 초가변영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간종(공여자 항체) 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변영역으로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로블린이다. 상기 인간 항체는 인간 면역글로블린으로부터 유래하는 분자이며, 상보성 결정영역, 구조영역을 포함하는 항체를 구성하는 모든 아미노산서열 전체가 인간 면역글로블린의 아미노산서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 인간에 의해 생산시키는 것 외에 파지디스플레이라이브러리를 포함하고, 당업계에 공시된 여러 가지 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 항원 시험접종에 반응하여 항체를 생산하도록 변형되었지만, 그 내인성 로커스(locus)가 기능하지 않는 트랜스제닉 동물 예를 들어 면역 처리된 제노마우스(xenomouse)에 항원을 투여하여 작성할 수도 있다.
항원 결합성 단편으로서는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편 또는 단일쇄 항체 분자(scFv)를 들 수 있다. 또한 항원 결합성 단편으로서 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 도메인 항체, 미니바디, 스캡(スキャップ, single chain antibody, scAb) 또는 상기 항체 단편으로부터 형성된 멀티특이성 항체를 이용할 수도 있다. 이들 항원 결합성 단편은 예를 들어 항체를 상법에 의해 단백질분해효소(예를 들어 펩신 또는 파파인 등)에 의해 소화하고, 계속해서 상법의 단백질의 분리정제의 방법에 의해 정제함으로써 얻을 수 있거나 또는 유전자 재조합에 의해 조제할 수 있다. 예를 들어 상기 scFv(single-chain variable fragment)는 중쇄 가변영역 도메인(VH)과 경쇄 가변영역 도메인(VL)을 링커로 연결함으로써 얻어지는 단쇄 폴리펩티드 항체이다. VH와 VL을 연결하는 순서는 특별히 한정되어 있지 않고 임의의 순서로 배치할 수 있다. 즉, [VH] 링커 [VL]의 순서로 배치되어도 되고 또는 [VH] 링커 [VL]의 순서로 배치되어도 된다.
상기 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 의약으로서 이용할 수 있다. 구체적인 항체 의약으로서는 베바시주맙, 리툭시맙, 트라스투주맙, 파니투무맙, 세툭시맙, 퍼투주맙, 트라스투주맙-엠탄신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙, 메폴리주맙, 젬투주맙 오조가마이신, 모가물리주맙, 알렘투주맙, 이노투주맙, 오파투무맙, 이필리무맙, 라무시루맙, 니볼루맙 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서의 투여화합물의 함유량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 0.00001∼40 질량%인 것이 바람직하고, 0.0001∼30 질량%인 것이 보다 바람직하고, 0.0001∼20 질량%인 것이 가장 바람직하다.
《고분자화합물》
상기 고분자화합물은 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 그래프트형 고분자화합물이다.
(일반식 (1)의 기)
일반식 (1)에 있어서 X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기를 나타내고, a는 0∼50의 수를 나타낸다. 중성 아미노산으로서는 예를 들어 알라닌, 아스파라긴, 시스테인, 글루타민, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, 히드록시프롤린 등을 들 수 있고, ω-아미노알칸산으로서는 3-아미노프로판산, 4-아미노부탄산, 5-아미노펜탄산, 6-아미노헥산산, 7-아미노헵탄산, 8-아미노옥탄산, 9-아미노노난산, 10-아미노데칸산, 11-아미노운데칸산 등을 들 수 있다. X1에 적용되는 중성 아미노산으로서는 투여화합물의 도입 효율이 오르는 점에서 글리신, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌이 바람직하고, 글리신, 알라닌, 세린이 더 바람직하고, 글리신이 가장 바람직하다. a는 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 0∼30의 수가 바람직하고, 0∼20의 수가 더 바람직하고, 0∼10의 수가 가장 바람직하다. 일실시형태로서는 a가 0이고, 일실시형태로서는 a가 4이다.
일반식 (1)에 있어서 X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기를 나타낸다. 본 발명에 있어서의 고분자화합물의 막투과성 펩티드 잔기는 세포나 점막, 도입하고자 하는 투여화합물에 따라 적절히 선택되어도 되지만, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산의 적어도 하나는 염기성 아미노산인 것이 바람직하다. 또한 염기성 아미노산은 L체 또는 D체 중 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 D체이다. D체의 아미노산은 통상 생체내에 존재하지 않기 때문에 분해되기 어려워 본 발명의 조성물의 효과를 유지할 수 있을 가능성이 있다.
염기성 아미노산으로서는 본 발명의 효과를 더 발휘하는 관점에서 아르기닌, 오르니틴, 리신, 히드록시리신, 히스티딘 등을 들 수 있고, 그 중에서도 구아니디노기 함유 아미노산이 바람직하고, 아르기닌이 더 바람직하다. 막투과성 펩티드 잔기 중의 염기성 아미노산의 비율이 높을수록 투여화합물의 도입 효율이 오르는 점에서 막투과성 펩티드를 구성하는 전체 아미노산에 대한 염기성 아미노산의 비율은 몰 기준으로 50% 이상인 것이 바람직하고, 70% 이상인 것이 더 바람직하다. 막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산 중 염기성 아미노산 이외의 아미노산은 중성 아미노산인 것이 바람직하다. 또한 본 명세서 중에서 아미노산이라고 기재하는 경우, 달리 언급이 없으면 α-아미노산을 의미한다.
막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산의 수는 투여화합물의 도입 효율이 오르는 점에서 5∼30인 것이 바람직하고, 6∼20인 것이 더 바람직하고, 7∼15인 것이 가장 바람직하다.
막투과성 펩티드의 바람직한 구체예로서는 7∼30개의 아르기닌이 펩티드 결합한 아르기닌올리고머, GRKKRRQRRRPPQ인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 HIV-1 Tat: 서열번호 1), TRQARRNRRRRWRERQR인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 HIV-1 Rev: 서열번호 2), RRRRNRTRRNRRRVR인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 FHV Coat: 서열번호 3), TRRQRTRRARRNR인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 HTLV-II Rex: 서열번호 4), KLTRAQRRAAARKNKRNTR인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 CCMV Gag: 서열번호 5) 등의 친수성의 염기성 펩티드; RQIKIWFQNRRMKWKK인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 안테나페디아: 서열번호 6), KMTRAQRRAAARRNRWTAR인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 BMW Gag: 서열번호 7), RQIKIWFQNRRMKWKK인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 페네트라틴: 서열번호 8), NAKTRRHERRRKLAIER인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 P22N: 서열번호 9), DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPDDPVD인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 VP22: 서열번호 10) 등의 양친매성의 염기성 펩티드; GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 트랜스포탄: 서열번호 11), AGYLLGKINLKALAALAKKIL인 아미노산서열을 가지는 펩티드(통칭 TP-10: 서열번호 12) 등의 소수성의 염기성 펩티드를 들 수 있다. 이들 중에서 투여화합물의 도입 효율이 뛰어난 점에서 친수성의 염기성 펩티드가 바람직하고, 아르기닌올리고머가 더 바람직하다. 아르기닌올리고머 중에서도 아르기닌의 반복수는 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 7∼20이 바람직하고, 7∼15가 더 바람직하고, 7∼10이 가장 바람직하다. 일실시형태로서는 아르기닌의 반복수는 8이다.
일반식 (1)에 있어서 X3은 수산기, 아미노기, 탄소수 1∼4의 알콕실기 또는 벤질옥시기를 나타낸다. 탄소수 1∼4의 알콕실기로서는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 이소프로폭시기, 부톡시기, 이소부톡시기, 1-메틸프로폭시기, t-부톡시기 등을 들 수 있다. 투여화합물의 도입 효율의 점에서 X3으로서는 수산기, 아미노기, t-부톡시기, 벤질옥시기가 바람직하고, 수산기, 아미노기가 더 바람직하고, 아미노기가 가장 바람직하다.
일반식 (1)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물 중 일반식 (1)로 표시되는 기가 복수 존재하는 경우, 각각의 일반식 (1)로 표시되는 기의 X1, X2, X3 및 a는 동일하여도 되고 상이하여도 된다.
(일반식 (2)의 기)
일반식 (2)에 있어서 X4는 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기를 나타내고, b는 0∼50의 수를 나타낸다. 중성 아미노산으로서는 상기 일반식 (1)의 X1에 이용하는 중성 아미노산과 마찬가지의 중성 아미노산을 이용할 수 있다. b는 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 0∼30의 수가 바람직하고, 0∼20의 수가 더 바람직하고, 0∼10의 수가 가장 바람직하다. 일실시형태로서는 b가 0이고, 일실시형태에서는 b가 4이다.
일반식 (2)에 있어서 X5는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기를 나타낸다. 본 발명에 있어서의 고분자화합물의 막투과성 펩티드 잔기는 상기 일반식 (1)의 X2에 이용하는 막투과성 펩티드 잔기와 마찬가지의 막투과성 펩티드 잔기를 이용할 수 있다. 또한 염기성 아미노산은 L체 또는 D체의 어느 것이어도 되지만, 바람직하게는 D체이다. D체의 아미노산은 통상 생체내에 존재하지 않기 때문에 분해되기 어려워 본 발명의 조성물의 효과를 유지할 수 있을 가능성이 있다.
상기 염기성 아미노산으로서는 상기 일반식 (1)의 X2에 기재된 염기성 아미노산과 마찬가지의 염기성 아미노산을 이용할 수 있다.
막투과성 펩티드 잔기를 구성하는 아미노산의 수는 투여화합물의 도입 효율이 오르는 점에서 5∼30인 것이 바람직하고, 6∼20인 것이 더 바람직하고, 7∼15인 것이 가장 바람직하다.
구체적인 막투과성 펩티드로서는 상기 일반식 (1)의 X2에 이용하는 막투과성 펩티드와 마찬가지의 막투과성 펩티드를 들 수 있다. 막투과성 펩티드로서 아르기닌올리고머를 이용하는 경우, 아르기닌의 반복수는 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 7∼20이 바람직하고, 7∼15가 더 바람직하고, 7∼10이 가장 바람직하다. 일실시형태로서는 아르기닌의 반복수는 8이다.
일반식 (2)에 있어서 X6은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 벤질기, 탄소수 1∼6의 아실기, 아릴술포닐기 또는 카르복실기(カルボオキシル基)를 나타낸다. 탄소수 1∼6의 알킬기로서는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, 2급 부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 2급 펜틸기, t-펜틸기, 헥실기, 2급 헥실기 등을 들 수 있다. 탄소수 1∼6의 아실기로서는 포르밀기, 아세틸기, 프로피노일기, 부티노일기, 펜티노일기, 헥시노일기 등을 들 수 있다. 아릴술포닐기로서는 p-톨루엔술포닐기, 2-니트로벤젠술포닐기, 트리플루오로아세틸기 등을 들 수 있다. 옥시카르보닐기로서는 예를 들어 t-부톡시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기, 2, 2, 2-트리클로로에톡시카르보닐기, 알릴옥시카르보닐기 등을 들 수 있다. 투여화합물의 도입 효율의 점에서 X6으로서는 아세틸기, 수소원자, 메틸기, 트리플루오로아세틸기가 바람직하고, 아세틸기, 수소원자가 더 바람직하고, 아세틸기가 가장 바람직하다.
일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물 중 일반식 (2)로 표시되는 기가 복수 존재하는 경우, 각각의 일반식 (2)로 표시되는 기의 X4, X5, X6 및 b는 동일하여도 되고 상이하여도 된다.
《고분자화합물의 줄기 고분자》
상기 고분자화합물의 주쇄 부분을 줄기 고분자라고 칭한다. 본 발명의 그래프트형 고분자의 줄기 고분자는 특별히 한정되지 않지만, 세포나 단백질 등의 수용성 고분자량 물질과의 친화성이 뛰어난 점에서 친수성 고분자인 것이 바람직하다. 여기서 친수성 고분자란 수용성 고분자 또는 수중에서 팽윤하는 고분자를 의미한다. 본 발명에 있어서 수용성 고분자란 상압하에서 25℃의 물에 0.1 질량% 이상의 양으로 균일하게 용해하는 고분자를 말한다.
친수성 고분자로서는 예를 들어 구아검, 아가로오스, 만난, 글루코만난, 폴리덱스트로스, 리그닌, 키틴, 키토산, 카라기난, 풀룰란, 콘드로이친황산, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 전분, 양이온 전분, 덱스트린의 다당류 또는 다당류의 변성물; 알부민, 카제인, 젤라틴, 폴리글루탐산, 폴리리신 등의 수용성 단백질 또는 수용성 폴리펩티드; 폴리(메타)아크릴산, 폴리(아크릴산히드록시에틸), 폴리(메타)아크릴아미드, 폴리N-비닐아세트아미드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐알코올, 폴리(2-아미노에틸(메타)아크릴레이트), (메타)아크릴산/아크릴아미드공중합물, (메타)아크릴산/N-이소프로필아크릴아미드공중합물, (메타)아크릴산/N-비닐아세트아미드공중합물, (메타)아크릴산/말레산공중합물, (메타)아크릴산/푸마르산공중합물, 에틸렌/말레산공중합물, 이소부틸렌/말레산공중합물, 스티렌/말레산공중합물, 알킬비닐에테르/말레산공중합물, 알킬비닐에테르/푸마르산공중합물 등의 비닐계 친수성 고분자; 수용성 폴리우레탄 등을 들 수 있는데, 본 발명의 효과를 현저하게 발휘하는 관점에서 바람직하게는 비닐계 친수성 고분자이다.
줄기 고분자에의 막투과성 펩티드 잔기의 그래프트화가 용이하게 되는 점에서 줄기 고분자로서는 본 발명에 있어서의 고분자화합물이 일반식 (1)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물인 경우에는 카르복실기를 가지는 고분자가 바람직하고, 카르복실기를 가지는 친수성 고분자가 보다 바람직하고, 카르복실기를 가지는 모노머와 카르복실기를 가지지 않는 모노머의 공중합물이 더 바람직하고, (메타)아크릴산/N-비닐아세트아미드공중합물이 가장 바람직하다.
또한 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물인 경우에는 줄기 고분자에의 막투과성 펩티드 잔기의 그래프트화가 용이해지는 점에서 아미노기를 가지는 고분자가 바람직하고, 아미노기를 가지는 친수성 고분자가 보다 바람직하고, 키토산이 가장 바람직하다. 또한 아미노기 또는 카르복실기를 가진다란 일반식 (1) 또는 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지기 전의 줄기 고분자에 해당되는 것이면 된다.
줄기 고분자가 카르복실기를 가지는 경우, 줄기 고분자를 구성하는 모노머 유닛의 수에 대한 카르복실기를 가지는 모노머 유닛의 수의 비율은 본 발명에 있어서의 고분자화합물로서 바람직한 것을 얻기 쉬운 관점 등으로부터 5∼80%가 바람직하고, 10∼60%가 보다 바람직하다.
줄기 고분자가 아미노기를 가지는 경우, 줄기 고분자를 구성하는 모노머 유닛의 수에 대한 아미노기를 가지는 모노머 유닛의 수의 비율은 본 발명에 있어서의 고분자화합물로서 바람직한 것을 얻기 쉬운 관점 등에서 5∼100%가 바람직하고, 10∼100%가 보다 바람직하다. 또한 상기에서 말한 아미노기 또는 카르복실기를 가지는 유닛의 비율은 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지기 전의 줄기 고분자에 해당되는 것이 바람직하다.
상기 고분자화합물은 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 점에 특징이 있다. 본 발명의 고분자화합물에 있어서의 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기의 비율이 너무 낮은 경우 및 너무 높은 경우, 투여화합물의 도입 효율이 낮아지는 것을 막는 관점에서 본 발명에 있어서의 고분자화합물 중의 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기의 수가 줄기 고분자를 구성하는 모노머 유닛(다당류 또는 다당류의 변성물의 경우에는 단당 유닛, 수용성 단백질 또는 수용성 폴리펩티드의 경우에는 아미노산 유닛)의 수에 대하여 0.001∼0.9인 것이 바람직하고, 0.005∼0.8인 것이 더 바람직하고, 0.01∼0.7인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에 있어서의 고분자화합물의 특성을 살려 후술하는 바와 같이 우발적 또한 계속적으로 투여화합물이 세포에 수용되기 쉬워지는 관점에서 또한 본 발명에 있어서의 고분자화합물이 너무 큰 경우에 도입하고자 하는 투여화합물의 도입 효율이 저하되는 것을 막는 관점에서 본 발명에 있어서의 고분자화합물의 중량평균분자량은 2만∼5000만이 바람직하고, 10만∼3000만이 보다 바람직하고, 20만∼1000만이 더 바람직하고, 25만∼100만이 가장 바람직하다. 상기 하한과 상한은 적절히 조합할 수 있다. 또한 본 발명에 있어서 중량평균분자량이란 수계 용매를 이용하여 GPC 분석을 수행한 경우의 중량평균분자량이며, 줄기 고분자가 다당류 혹은 다당류의 변성물 또는 수용성 단백질인 경우에는 풀룰란 환산의 중량평균분자량, 줄기 고분자가 비닐계 친수성 고분자인 경우에는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 혹은 폴리에틸렌옥시드(PEO) 환산의 중량평균분자량을 말한다.
GPC 측정에 있어서의 분자량은 예를 들어 이하의 장치 및 컬럼으로 측정한 값을 채택할 수 있다.
·장치 EXTREMA(니혼분코사제)
·컬럼 TSKgel G4000 PWXL×2 또는 TSKgel G6000 PWXL-CP＋G3000 PWXL-CP(도소사제)
상기 고분자화합물의 제조방법은 특별히 한정되지 않고, 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 가지는 중합성 모노머를 중합하여 제조하여도 되고, 줄기 고분자에 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 도입하여 제조하여도 되지만, 제조의 용이함의 점에서 줄기 고분자에 일반식 (1) 또는 일반식 (2)로 표시되는 기를 도입하여 제조하는 것이 바람직하다. 줄기 고분자가 카르복실기를 가지는 친수성 고분자인 경우에는 카르복실기에 하기 일반식 (1b)로 표시되는 펩티드 화합물의 아미노기를 펩티드 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 카르복실기와 아미노기의 반응은 공지의 방법을 이용하면 되고, 예를 들어 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드에 의해 숙신이미드에스테르화한 후 아미노기를 반응시키는 방법 등을 들 수 있다. 또한 줄기 고분자가 아미노기를 가지는 친수성 고분자인 경우에는 아미노기에 하기 일반식 (2b)로 표시되는 펩티드 화합물의 카르복실기를 펩티드 반응시킴으로써 얻을 수 있다. 이 방법에 의하면 줄기 고분자의 측쇄로서 아미드 결합을 통해 일반식 (1) 또는 (2)로 표시되는 기를 가장 간단하게 도입할 수 있다. 단, 일반식 (1) 또는 (2)로 표시되는 기의 고정법은 본 법에 한정하는 것은 아니고, 일반적으로 알려져 있는 화학반응을 이용하여 고정화할 수 있다.
Figure pct00005
(식중, X1, X2, X3 및 a는 일반식 (1)과 동의이다.)
Figure pct00006
(식중, X4, X5, X6 및 b는 일반식 (2)와 동의이다.)
막투과성 펩티드가 세포에 수용되는 기구는 일반적으로는 막투과성 펩티드가 세포의 매크로피노사이토시스를 유발하여 수용되는 것으로 주위에 화합물이 존재하는 경우에는 막투과성 펩티드와 함께 이들 화합물이 수용되는 것이라고 생각되고 있다. 본 발명에 있어서의 고분자화합물에서는 막투과성 펩티드 잔기에 의해 세포의 복수의 개소에서 매크로피노사이토시스가 유발되지만, 본 발명에 있어서의 고분자화합물은 거대분자이고, 또한 본 발명의 고분자화합물의 1분자를 세포가 복수의 개소로부터 수용하기도 어렵다. 이 때문에 본 발명에 있어서의 투여화합물은 본 발명의 조성물에 의해 매크로피노사이토시스가 유발된 세포에 의해 우발적으로 또한 계속적으로 수용되게 된다. 또한 본 발명의 조성물에 있어서는 고분자화합물과 투여화합물을 조합함으로써 고분자화합물과 투여화합물이 상호작용하기 때문에 항체 의약과 같은 고분자량의 투여화합물이어도 세포에 의해 효율적으로 도입된다.
본 발명의 조성물에 있어서의 고분자화합물의 함유량은 특별히 제한되는 것은 아니지만, 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 0.00001∼20 질량%인 것이 바람직하고, 0.0001∼15 질량%인 것이 보다 바람직하고, 0.0001∼10 질량%인 것이 보다 더 바람직하고, 0.0001∼5 질량%인 것이 가장 바람직하다.
《의약 조성물》
본 발명의 조성물은 한정되는 것은 아니지만 의약 조성물로서 이용할 수 있다. 의약 조성물의 유효성분은 상기 투여화합물이다. 의약 조성물에 있어서의 투여화합물의 함유량은 사용하는 투여화합물에 따라 다르지만, 성인의 경우 1일당 10mg∼4g, 보다 바람직하게는 20mg∼2g 섭취할 수 있는 양을 의약 조성물 중에 함유할 수 있으면 된다. 본 발명의 효과를 발휘하는 관점에서 구체적으로는 유효성분은 의약 조성물 중 0.00001∼40 질량%인 것이 바람직하고, 0.0001∼30 질량%인 것이 보다 바람직하고, 0.0001∼20 질량%인 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 조성물에 있어서는 (A) 고분자화합물과 (B) 투여화합물을 이들의 질량비가 (A):(B)=0.1:1∼20:1의 범위로 함유하는 것이 바람직하고, 0.1:1∼10:1의 범위로 함유하는 것이 보다 바람직하고, 0.1:1∼5:1의 범위로 함유하는 것이 보다 더 바람직하고, 0.5:1∼3:1의 범위로 함유하는 것이 더욱더 바람직하고, 0.5:1∼2:1의 범위로 함유하는 것이 가장 바람직하다. 이에 의해 본 발명의 효과를 현저하게 발휘할 수 있다.
의약 조성물의 투여제형으로서는 특별히 한정이 없고, 예를 들어 산제, 세립제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼제, 시럽제, 엑기스제 혹은 환약 등의 경구제 또는 주사제, 외용액제, 연고제, 좌제, 국소투여의 크림 혹은 점안제 등의 비경구제를 들 수 있다. 경구제의 경우, 기능성 식품이나 건강식품(음료도 포함함) 또는 사료로서 음식물의 형태로 주는 것도 가능하다.
의약 조성물은 상기 고분자화합물 및 투여화합물에 더하여 예를 들어 젤라틴, 알긴산나트륨, 전분, 콘스타치, 백당, 유당, 포도당, 만니트, 카복시메틸셀룰로오스, 덱스트린, 폴리비닐피롤리덴, 결정 셀룰로오스, 대두 레시틴, 자당, 지방산에스테르, 탈크, 스테아르산마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 규산마그네슘, 무수규산 또는 합성규산알루미늄 등의 부형제, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 활택제, 유동성 촉진제, 희석제, 보존제, 착색제, 향료, 교미제, 안정화제, 보습제, 방부제 또는 산화방지제 등을 이용하여 상법에 따라 제조할 수 있다.
의약 조성물을 이용하는 경우의 투여량은 예를 들어 사용하는 유효성분의 종류, 질병의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 활기의 정도 또는 투여방법에 따라 적절히 결정할 수 있고, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여하는 것이 가능하다. 의약 조성물은 바람직하게는 약제학적 또는 수의학적으로 허용할 수 있는 통상의 담체 또는 희석제와 함께 대상[예를 들어 동물, 바람직해 포유동물(특히 인간)]에게 유효량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 한정되는 것은 아니지만, 상기 고분자화합물 및 투여화합물을 혼합한 후에 세포에 접촉시키기 위해서 이용할 수 있다. 예를 들어 고분자화합물 및 투여화합물이 분체로 조성물에 포함되어 있는 경우, 용액 또는 현탁액으로서 고분자화합물과 투여화합물이 상호작용할 수 있는 혼합물로 한 후에 세포와 접촉시킬 수 있다. 고분자화합물과 투여화합물이 상호작용함으로써 투여화합물이 효율적으로 세포에 수용될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물은 점막에 사용함으로써 여러 가지 점막내의 세포에 투여화합물을 도입하는 것이 가능하다. 점막으로서는 코점막, 구강점막, 질점막, 직장점막, 눈점막, 위점막, 장관점막 등을 들 수 있다. 점막에 사용하는 경우, 액체, 겔 또는 스프레이에 의해 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물과 세포(점막)의 접촉시간은 특별히 한정되지 않지만 30분∼24시간으로 하는 것이 적합하다.
본 발명의 조성물이 투여되는 세포는 동물, 식물, 세균 등의 어느 세포여도 된다. in vitro에서 세포에 적용하는 경우, 배양액(액체배지라고도 함) 등에 분산된 세포, 고정배지 등에 접착한 세포, 생체조직의 세포 등의 어느 세포에나 투여화합물을 도입하는 것이 가능하다. 세포는 조직세포나 신경세포 등을 형성하는 접착계 세포와 혈구세포 등의 부유계 세포로 크게 나눌 수 있다. 본 발명의 조성물은 접착계 세포뿐만 아니라 부유계 세포에 대해서도 투여화합물을 높은 효율로 도입하는 것이 가능하다.
실시예
이하 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 이용하는 고분자화합물을 하기의 제조예 1-5로 제작하였다.
《제조예 1》
본 제조예에서는 주쇄고분자로서 아크릴산/N-비닐아세트아미드공중합체를 이용하여 D-옥타아르기닌을 측쇄에 가지는 고분자화합물을 조제하였다.
일본 특허공개 평08-081428의 실시예 14를 참고하여 아크릴산나트륨 30 g 및 N-비닐아세트아미드 70 g을 원료로 하여 상법에 따라 공중합체(NVA-AANa 폴리머)를 합성하였다.
계속해서 직경 20 mm의 컬럼관에 양이온교환수지(IR120B, 오르가노제)를 충전하고, 5.0 wt% NVA-AANa 폴리머 수용액 130 g을 2.6 mL/min으로 통액함으로써 NVA-AA 폴리머 수용액을 얻었다. 얻어진 NVA-AA 폴리머 수용액을 동결건조하여 NVA-AA 폴리머를 5.7 g 얻었다.
300 mL의 4개구 플라스크에 5.0 g의 NVA-AA 폴리머를 142 g의 N, N'-디메틸포름아미드(DMF)에 용해하고, 이 용액을 10℃ 이하로 냉각하였다. 이 용액에 N-히드록시숙신이미드의 DMF 용액 58 g(0.2 g/mL)과 N, N'-디시클로헥실카르보디이미드의 DMF 용액 66 g(0.4 g/mL)을 첨가하였다. 빙욕하 1시간 교반한 후 실온으로 승온하여 24시간 교반하였다. 반응용액을 흡인 여과하여 여과액을 회수하고, 아세토니트릴 2 L를 이용하여 재침전하였다. 그 후 침전을 아세톤 2 L로 세정하여 흡인 여과에 의해 고체를 회수하였다. 얻어진 고체를 감압 건조함으로써 숙신이미드에스테르화된 NVA-AA 폴리머(NVA-AA 폴리머 OSu체) 5.4 g을 얻었다.
52 mg의 NVA-AA 폴리머 OSu체를 2.4 mL의 DMF에 용해하였다. 이 용액에 8개의 D-아르기닌으로 이루어지는 염기성 펩티드(NH2-R8/D, 트리플루오로아세트산염, 시그마알드리치제)(일반식 (1b)에 있어서 a가 0, X2가 D-옥타아르기닌으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기, X3이 아미노기인 화합물)의 DMF 용액(400 mg/mL) 0.50 mL와 트리에틸아민(TCI제) 0.01 mL를 첨가하여 50℃에서 24시간 교반하여 반응을 수행하였다. 그 후 반응용액을 셀룰로오스 투석튜브(심리스 셀룰로오스튜브, 스펙트럼제, MWCO: 3.5 kDa)에 옮기고, 튜브의 양 입구를 묶은 후 초순수를 이용하여 3일간 투석을 수행하였다. 그 후 튜브내의 내용물을 동결건조하여 제조예 1의 고분자화합물(이하 VP-R8/D라고 칭함) 110 mg을 얻었다(일반식 (3)). 제조예 1의 고분자화합물은 일반식 (1)의 a가 0, X2가 D-옥타아르기닌으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기, X3이 아미노기인 화합물이다. GPC 분석에 의해 VP-R8/D의 중량평균분자량은 350000(PEG/PEO 환산)이고, NMR의 적분값으로부터 하기의 구조를 가지는 것을 알았다. 또한 식중 Arg는 아르기닌 잔기를 나타내고, 1H-NMR 분석으로부터 x:y:z=70:21:9(몰 비율)였다.
Figure pct00007
GPC 분석에 있어서의 분자량은 이하의 장치 및 컬럼으로 이하의 조건에 의해 측정한 값을 채택하였다.
·장치 EXTREMA(니혼분코사제)
·컬럼 TSKgel G6000 PWXL-CP＋G3000 PWXL-CP(도소사제)
·용리액 0.1M 인산완충액(pH=2.7) 용출
·유속 0.6 mL/min
·측정온도 60℃
·검출 RI
·분석시간 90분
·시료농도 3 mg/mL
·샘플 주입량 50 μL
《제조예 2》
제조예 1에 있어서 X2를 L-옥타아르기닌으로 변경한 것 이외에는 제조예 1과 마찬가지의 조작(시약류도 동량)을 수행하여 제조예 2의 고분자화합물(이하 VP-R8/L이라고 칭함) 110 mg을 얻었다. GPC 분석(실시예 1과 마찬가지의 조건)에 의해 VP-R8/L의 중량평균분자량은 370000(PEG/PEO 환산)이고, NMR의 적분값으로부터 식 (3)의 구조를 가지는 것을 알았다. 또한 1H-NMR 분석으로부터 x:y:z=70:19:11(몰 비율)이었다.
《제조예 3》
0.8 mL의 디메틸술폭시드(DMSO)에 20 mg의 히알루론산(계관 유래, 도쿄가세이제)을 용해하였다. 이 용액에 0.1 mL의 DMSO에 용해한 18 mg의 N-히드록시숙신이미드를 첨가하고, 0.1 mL의 DMSO에 용해한 33 mg의 N, N'-디시클로헥실카르보디이미드를 더 첨가하여 25℃에서 24시간 교반하여 반응을 수행하였다. 석출한 고체를 필터여과에 의해 여과 분별하고, 0.5 mL의 DMSO를 첨가하여 숙신이미드에스테르화된 히알루론산의 DMSO 용액을 얻었다. 이 용액에 4개의 글리신 및 8개의 L-아르기닌으로 이루어지는 염기성 펩티드(NH2-G4R8/L, 트리플루오로아세트산염, 시그마알드리치제, 말단 카르복실기가 아미드화)의 DMSO 용액(400 mg/mL) 0.40 mL와 트리에틸아민 0.02 mL를 첨가하고, 25℃에서 24시간 교반하여 반응을 수행하였다. 그 후 반응용액을 셀룰로오스 투석튜브(심리스 셀룰로오스튜브, 스펙트럼사제, MWCO: 3.5 kDa)에 옮기고, 튜브의 양 입구를 묶은 후 초순수를 이용하여 7일간 투석을 수행하였다. 그 후 튜브내의 내용물을 동결건조하여 제조예 3의 고분자화합물(이하 HA-G4R8/L이라고 칭함) 100 mg을 얻었다(일반식 (4)). 제조예 3의 고분자화합물은 일반식 (1)(일반식 (4))의 a가 4, X1이 L-글리신으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기, X2가 L-옥타아르기닌으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기, X3이 아미노기이고, d/(c+d)가 1.0(1H-NMR의 적분값)인 화합물이다. GPC 분석에 의해 HA-G4R8/L의 중량평균분자량은 44000(풀룰란 환산)이었다.
Figure pct00008
GPC 분석에 있어서의 분자량은 이하의 장치 및 컬럼으로 이하의 조건에 의해 측정한 값을 채택하였다.
·장치 EXTREMA(니혼분코사제)
·컬럼 TSKgel G4000 PWXL×2(도소사제)
·용리액 0.5M 아세트산＋0.1M 질산나트륨 수용액 용출
·유속 1 mL/min
·측정온도 40℃
·검출 RI
·분석시간 45분
·시료농도 3 mg/mL
·샘플 주입량 50 μL
《제조예 4》
D-옥타아르기닌(이하 NH2-R8/D, 시그마알드리치제)을 제조예 4로 하였다.
《제조예 5》
살카프로제이트나트륨(이하 SNAC, Synchem제)을 제조예 5로 하였다.
《모델약물》
FITC-INS: FITC 표지 인슐린(펩티드·단백성 의약품, 분자량 5,800, 시그마알드리치제, 최종농도 5 μg/mL)
FITC-CTB: FITC 표지 콜레라독소 B 서브유닛(단백질, 분자량 11,000, 시그마알드리치제, 최종농도 5 μg/mL)
FITC-OVA: FITC 표지 오보알부민(단백질, 분자량 45,000, 써모피셔사이언티픽제, 최종농도 5 μg/mL)
FITC-IgG: FITC 표지 인간 면역글로블린 G(인간 항체, 분자량 150,000, 시그마알드리치제, 최종농도 5 μg/mL)
FITC-Tf: FITC 표지 트랜스페린(단백질, 분자량 77,000, 써모피셔사이언티픽제, 최종농도 5 μg/mL)
FITC-IgM: FITC 표지 인간 면역글로블린 M(인간 항체, 분자량 900,000, 자사 합성, 최종농도 5μg/mL)
《세포에의 수용 평가》
실시예 1∼3(제조예 1∼3의 고분자화합물) 또는 비교예 1∼2(제조예 4 및 5의 화합물)를 이용하여 상기 기재된 모델약물의 세포에의 수용 평가를 실시하였다. 24공 플레이트의 각 웰에 차이니즈햄스터 난소유래세포(CHO 세포)를 포함하는 Ham's F-12 배지(후지필름와코쥰야쿠사제)의 현탁액을 2×105 cells/mL로 조제하고, 이것을 500 μL/well로 파종하고, 탄산가스 인큐베이터(37℃, 5% CO2)내에서 24시간 배양을 수행하였다.
다음에 상기 모델약물을 포함하는 Ham's F-12 배지용액 250 μL/well과 제조예를 포함하는 Ham's F-12 배지용액 250 μL/well을 혼합하고, 실시예 또는 비교예의 조성물(표 1-6)을 조제하였다. 제조예의 Ham's F-12 배지용액에 있어서의 최종농도는 CHO 세포에 대하여 상해성을 나타내지 않는 농도를 각각 평가한 후에 아래와 같이 하였다.
제조예 1: 최종농도 5 μg/mL
제조예 2: 최종농도 5 μg/mL
제조예 3: 최종농도 10 μg/mL
제조예 4: 최종농도 170 μg/mL
제조예 5: 최종농도 3000 μg/mL
다음에 전배양 후의 24공 플레이트의 각 웰에 대하여 아스피레이터로 상청을 제거한 후, 인산완충 생리식염수 500 μL/well로 2회 세정하였다. 그 후 전술한 조성물을 가만히 첨가하여 탄산가스 인큐베이터내에서 2시간 배양하였다. 실험수는 n=3으로 실시하였다.
2시간 후 상청의 배지용액을 제거하고, 인산완충 생리식염수 500 μL/well로 2회 세정한 후, 트립신-EDTA 용액(0.25%의 트립신, 1 mmol/L의 EDTA 수용액, Life Technologies사제) 100μL/well을 첨가하여 배양한 CHO 세포를 24공 플레이트로부터 박리하였다.
다음에 트리판블루 용액(후지필름와코쥰야쿠사제) 400 μL/well을 첨가하여 세포를 현탁시키고, 마이크로튜브에 회수하였다. 회수한 세포 현탁액을 셀스트레이너에 통과시키고, 유세포분석기에 제공하여 평균형광강도(MFI)를 측정하였다. 고분자화합물을 사용하지 않은 것(모델약물만을 첨가한 것)을 컨트롤로 하였다.
세포외에 흡착한 FITC 표지 모델약물은 트리판블루에 의해 소광하여 형광을 발하지 않고, 세포내에 도입된 모델약물만이 형광을 발한다. MFI는 세포 1개당 형광강도의 상가평균을 나타내고 있고, MFI의 값이 클수록 모델약물이 고효율로 세포내에 수용된 것을 나타내고 있다.
FITC-INS의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 1 및 도 1에 나타낸다. FITC-CTB의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 2 및 도 2에 나타낸다. FITC-OVA의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 3 및 도 3에 나타낸다. FITC-IgG의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 4 및 도 4에 나타낸다. FITC-Tf의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 5 및 도 5에 나타낸다. FITC-IgM의 세포에의 수용 평가의 결과를 표 6 및 도 6에 나타낸다.
실시예 1∼3은 비교예 1 및 2보다 모델약물의 세포에의 수용이 양호하고, 모델약물이 고분자량인 범위에서 그 결과는 현저해지는 경향이 나타났다. 이로부터 실시예 1∼3의 조성물은 항체와 같은 고분자량의 화합물과의 조합에 있어서도 해당 화합물을 세포내에 양호하게 수용할 수 있음을 알았다. 또한 D체의 고분자화합물을 포함하는 실시예 1측이 L체의 고분자화합물을 포함하는 실시예 2보다 모델약물의 세포에의 수용이 양호하였다. 또한 실시예 1, 2측이 고분자화합물로서 히알루론산을 포함하는 실시예 3보다 모델약물의 세포에의 수용이 양호하였다. 또한 실시예는 비교예보다 낮은 최종농도로 모델약물의 세포에의 수용 효과를 발휘할 수 있음을 알았다.
모델약물: FITC-INS(분자량 5,800)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 6.2±0.4
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 27.4±1.2
비교예 2 SNAC(제조예 5) 19.7±0.2
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 472.2±20.4
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 208.3±29.2
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 112.5±16.6
모델약물: FITC-CTB(분자량 11,000)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 3.4±0.0
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 32.7±4.7
비교예 2 SNAC(제조예 5) 3.7±0.1
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 241.4±52.8
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 163.7±3.6
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 176.6±9.0
모델약물: FITC-OVA(분자량 45,000)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 3.4±0.1
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 14.3±2.5
비교예 2 SNAC(제조예 5) 3.6±0.4
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 946.6±122.3
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 594.5±9.2
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 218.0±29.9
모델약물: FITC-IgG(분자량 150,000)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 3.2±0.1
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 3.3±0.0
비교예 2 SNAC(제조예 5) 3.2±0.1
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 122.1±15.5
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 76.2±35.3
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 17.2±4.2
모델약물: FITC-Tf(분자량 77,000)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 5.2±0.3
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 9.8±0.8
비교예 2 SNAC(제조예 5) 6.7±0.2
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 88.2±2.9
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 43.2±7.7
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 20.7±0.6
모델약물: FITC-IgM(분자량 900,000)
고분자화합물(제조예) MFI±S.D.
컨트롤 미사용 2.9±0.0
비교예 1 NH2-R8/D(제조예 4) 5.9±0.4
비교예 2 SNAC(제조예 5) 3.1±0.2
실시예 1 VP-R8/D(제조예 1) 447.4±3.1
실시예 2 VP-R8/L(제조예 2) 277.2±8.6
실시예 3 HA-G4R8/L(제조예 3) 121.7±12.2
본 발명의 조성물은 항체 의약 등의 고분자량의 화합물의 세포내 투여에 사용할 수 있다.

Claims (6)

  1. 하기 일반식 (1) 또는 하기 일반식 (2)로 표시되는 기를 측쇄에 가지는 고분자화합물과 분자량 1,000∼1,200,000의 투여화합물을 함유하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure pct00009

    (식중, X1은 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X2는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X3은 수산기, 아미노기, 탄소수 1∼4의 알콕실기 또는 벤질옥시기이고, a는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)
    [화학식 2]
    Figure pct00010

    (식중, X4는 중성 아미노산 또는 ω-아미노알칸산으로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X5는 막투과성 펩티드로부터 말단 아미노기 및 말단 카르복실기를 제외한 잔기이고, X6은 수소원자, 탄소수 1∼6의 알킬기, 벤질기, 탄소수 1∼6의 아실기, 아릴술포닐기 또는 옥시카르보닐기이고, b는 0∼50의 정수이다. ＊은 결합개소를 나타낸다.)
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 투여화합물의 분자량이 1,000∼200,000인 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 고분자화합물의 줄기 고분자가 비닐계 친수성 고분자인 조성물.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여화합물이 항체인 조성물,
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 항체가 폴리클로널 항체, 모노클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 혹은 인간 항체 또는 이들의 항원 결합성 단편인 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자화합물 및 투여화합물을 혼합한 후에 세포에 접촉시키기 위한 조성물.
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