JP2017002039A - 医薬目的のための新規な多官能性化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の特に好適な実施態様では、バインダーは、ホルミルペプチド受容体(FPR)を活性化するエフェクターと操作可能に連結される。この受容体群はまた、シグナル伝達PRRのクラスに属する。FPRは、主に好中球およびマクロファージまたは食細胞系統中の細胞で発現したGタンパク質共役受容体である。これらの受容体に対する最も特徴的なリガンドは、原核生物起源のタンパク質の特徴であるN−ホルミルメチオニン残基を含有するペプチドまたはタンパク質フラグメントである。このように、これらのペプチドは、細菌感染部位に対する強力な免疫ホーミング信号として、化学誘引、免疫シグナル伝達分子(例えば、インターロイキン、サイトカイン等)の産生の刺激および放出、ならびに脱顆粒(外来物質または病原体の破壊を媒介可能な化学(例えば、過酸化水素および他の反応性酸素ラジカル種)および酵素物質(例えば、エラスターゼおよび他の消化酵素)の両方の産生および放出を含む細胞過程)を含む数段階の好中球応答および活性化をシグナル伝達するように作用する。
したがって、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
1つ以上のエフェクター部分および1つ以上のバインダー部分を含む合成二官能性非抗体化合物であって、
このエフェクター部分はリンカーを介してこのバインダー部分と操作可能に連結され、このエフェクター部分は少なくとも1つの病原体パターン認識受容体(PRR)に対するリガンドであり、このバインダー部分は腫瘍細胞のマーカーと結合する、化合物。
(項目2)
上記1つ以上のエフェクター部分はマンノース受容体またはホルミルペプチド受容体(FPR)またはFPRファミリーのメンバーに対するリガンドである、項目1に記載の化合物。
(項目3)
上記1つ以上のエフェクター部分は、N−ホルミルメチオニンペプチド;N−ホルミルMet−Leu−Phe(fMLF);N−ホルミル−MMYALF(fMMYALF);マンノース;フコース;N−アセチルガラクトサミン;ポリグアニル酸(ポリG);C末端D−メチオニンの群から選択される1つ以上の部分であるかまたはその部分を含む、項目1に記載の化合物。
(項目4)
上記1つ以上のエフェクター部分はN−ホルミルMet−Leu−Pheである、項目1に記載の化合物。
(項目5)
少なくとも2つのバインダー部分を含む、項目1〜4のいずれか一項に記載の化合物。(項目6)
上記バインダー部分は、ペプチド、マイクロプロテイン、核酸、PNA、またはペプチド模倣物である、項目1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
(項目7)
上記バインダー部分は3〜20アミノ酸の長さのペプチドであり;かつ/またはこのバインダーは以下のペプチド配列のいずれかを含む、項目1〜6のいずれか一項に記載の化合物:CGLIIQKNEC;CNAGESSKNC;Dhb−pLDIK;Dhb−pLDI;WIFPWIQL;WDLAWMFRLPVG;VVISYSMPD;シクロ(RGDfK);RGDfK;RGDWXE;GGHGRVLWPDGWFSLVGISP;YHWYGYTPQNVI;GYTP;YGYTPQ;WYGYTPQN;HWYGYTPQNV;TACHQHVRMVRP;NLLMAAS;DUP−1;HEWSYLAPYPWF;HTFEPGV;シクロ(SRESPHP);SRESPHP;KCCYSL;LTVXPWY;CSDSWHYWC;CSDxxHxWC;EDYELMDLLAYL;シクロ(CVGNDNSSC);CVGNDNSSC;TTPRDAY;VHLGYAT;CSNRDARRC;CXNXDXR(X)/(R)C;SWKLPPS;IAGLATPGWSHWLAL;AWYPLPP;VPWMEPAYQRFL;EPAYQR;KSLSRHDHIHHH;TNSLP;YYGLAEVDAGGS;MQLPLAT;MXXP。
(項目8)
上記バインダーは、AWYPLPPまたはMQLPLATまたはYHWYGYTPQNVIKである、項目1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
(項目9)
上記リンカーは、共有結合、エステル結合、アミド結合、ペプチド結合、またはエーテル結合である、項目1〜8のいずれか一項に記載の化合物。
(項目10)
上記リンカーは合成または半合成ポリマーであり、かつ/またはこのリンカーは、オリゴペプチド、ポリエチレングリコール、またはポリリジンで構成される、項目1〜9のいずれか一項に記載の化合物。
(項目11)
項目1〜10のいずれか一項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
(項目12)
腫瘍の治療用薬物の製造のための項目1〜11のいずれか一項に記載の化合物の使用。(項目13)
固形腫瘍;リンパ腫;非ホジキンリンパ腫;結腸直腸癌;前立腺癌;結腸癌;甲状腺癌;乳癌;膵臓癌、卵巣癌;濾胞性甲状腺癌腫;未分化甲状腺癌腫、乳癌腫、頸癌腫、前立腺癌腫;腫瘍性血管;肝癌;肝細胞癌;膀胱癌;胃癌の腹膜腫瘍;神経芽細胞腫;黒色腫の群から選択される腫瘍の治療のための項目12に記載の使用。
(項目14)
さらに1つ以上の腫瘍の治療用薬物と組み合わせた、好ましくは、化学療法、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントおよび化学的薬剤を含む融合分子と組み合わせた項目12または13に記載の使用。
本発明で用いるパターン認識受容体(PRR)という用語は、免疫系の細胞により発現するタンパク質のクラスを意味する。PRRは、病原体関連分子パターン(PAMP)により活性化される。病原体パターン認識受容体(PRR)は、一般に、例えば、病原体表面に存在するかまたは病原体またはミトコンドリアの分解中に発達する一般的な構造および分子モチーフを認識し、先天性免疫応答の誘導に寄与する。例えば、MRは、FPRおよびTLRと同様にそのようなPRRと見なされる。
Williams and Wilking Publishers.1999;John E.Coligenら、Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1999を参照されたい。)
「ミメトープ」および「ペプチド模倣物」という用語は、本明細書中では同じ意味で用いられる。化合物Xの「ミメトープ」は、Xの機能活動に必要なXの化学的構造がXの配座を模倣する他の化学的構造と置換された化合物を意味する。ペプチド模倣物の例としては、ペプチド骨格が1つ以上のベンゾジアゼピン分子(例えば、James,G.L.ら(1993)Science260:1937−1942参照)および「レトロインベルソ」ペプチド(Sistoに対する米国特許第4,522,752号参照)と置き換えられたペプチド化合物が挙げられる。「ミメトープ」および「ペプチド模倣物」という用語はまた、ペプチド(例えば、FPRL−1アゴニスト)の機能に対して有意な程度で悪影響を及ぼすような干渉を生じることなく、ペプチド含有化合物内の特定のアミノ酸の置換基として配座的におよび機能的に作用する自然発生アミノ酸以外の部分も意味する。
−単一のバインダー+単一のエフェクター+直鎖リンカー
−2つ以上の同じバインダー(親和力)+単一のエフェクター+直鎖リンカー
−2つ以上の異なるバインダー(親和力/選択力/多価)+単一のエフェクター要素+直鎖リンカー
−1つ以上の同じまたは異なるバインダー+2つ以上の同じエフェクター(効力)+直鎖リンカー
−1つ以上の同じまたは異なるバインダー+2つ以上の異なるエフェクター(効力/選択性)+直鎖リンカー
−1つ以上の同じまたは異なるバインダー+1つ以上の同じまたは異なるエフェクター+分岐リンカー(触手様構造)
本発明のリンカーの例には、直接結合、小型リンカー、ホモオリゴ官能性リンカー、オリゴ−アルコール、オリゴ−アミン、オリゴ−カルボン酸、チオールによる統計的カップリング、ヘテロオリゴ官能性カップリング要素による明確な化学論(defined stochiometry)、ポリマー(親水性および親油性ポリマー)、ホモ多官能性リンカーによる統計的カップリング、HPMA、ポリリジン、ヒドロイエチルセルロース(hydroyethylclellulose)、ヒドロキシエチルスターチ、アミノデキストラン、コプリマー(coplymers)、分岐高分子足場、分岐PEG、デンドリマー、特に、ポリリジンデンドマー(polylysine dendrmers)、ヘテロオリゴ官能性結合による明確な化学論(defined stochiometry)、ポリペプチド、官能化活ポリマー(functionalized ativated polymers)、PEG、ポリウレタンが含まれる。
、2002;US4,064,118;EP1 398 322;EP1 398 327;EP 1 398 328;WO2004/024761を参照されたい;)。ペグ化、ジスルフィド架橋、またはリシン側鎖による分子の二量化がWO96/40772;WO96/40749;WO01/38342;WO01/091780;WO2004/101611;WO2004/100997;WO2004/101600;WO2004/101606、Wrightonら、1997;Johnsonら、1997)に記載されている。上述の方法は、所望の二量体または同等の多量体分子を得るために、リンカー構造を介して単量体ペプチドを結合する。
1.単一のバインダー+単一のエフェクター;直鎖リンカー
本発明の1つの実施態様では、本発明の多官能化合物は、直鎖リンカーを介して連結される単一の結合要素(バインダー)および単一のエフェクターを含む。この結合要素は、1つ以上の標的分子、標的細胞、または標的組織に対して結合親和性を有するオリゴペプチドである。標的分子は、細胞の表面で発現した分子であることが好ましい。
A Ala アラニン
C Cys システイン
D Asp アスパラギン酸
E Glu グルタミン酸
F Phe フェニルアラニン
G Gly グリシン
H His ヒスチジン
I Ile イソロイシン
K Lys リシン
L Leu ロイシン
M Met メチオニン
N Asn アスパラギン
P Pro プロリン
Q Gln グルタミン
R Arg アルギニン
S Ser セリン
T Thr トレオニン
V Val バリン
W Trp トリプトファン
Y Tyr チロシン
X Xxx 任意のアミノ酸。
本発明のリンカーは、上記2つのドメイン、すなわち、バインダーとエフェクター間に物理的分子連結部を設ける。
本発明の1つの実施態様では、バインダーおよびエフェクターは、共有結合によって直接連結される。これは、相互反応基を両方のドメイン(すなわち、それぞれ、バインダーおよびエフェクター)に組み込むことにより確立することができる。このような相互反応選択基は、バインダーおよびエフェクターに容易に組み込むことができる。そのような相互反応基の例としては、両方の要素中において酸化条件下でドメイン間に安定したジスルフィド架橋を形成する遊離システイン残基がある。これらの相互反応の他の例としては、一方のドメイン中のカルボニル基および他方のドメイン中のアミノ基により加水分解に不安定なイミン連結部を、シアノドリド化合物とのイミン反応(reaction with imine with cyanohdride compounds)により低減可能な濃度によって形成し、それらの化合物間に加水分解に安定なアミン連結部を生じることが挙げられる。
本発明の他の実施態様では、上記バインダーまたはエフェクターは、低分子量リンカーによって接続される。好適な実施態様では、このリンカーは、1000ダルトン未満の分子量を有する。さらに好適な実施態様では、上記低分子量リンカーは、100ダルトン未満の分子量を有する。バインダーおよびエフェクターは、リンカーとの反応が同時であっても連続したものであってもいずれでもよい。
本発明の他の実施態様では、上記バインダーまたはエフェクターは、例えば、セバシン酸ビス(N−スクシンイミジル)エステル、1,4−ビス[3−(2−ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ブタン、ビス[2−(N−スクシンイミジル−オキシカルボニルオキシ)エチル]スルホン、ビス[2−(4−アジドサリシルアミド)エチル]ジスルフィド、ジメチル3,3’−ジチオプロピオンイミダートジヒドロクロリド、またはエチレングリコールジスクシナートジ(N−スクシンイミジル)エステル等のホモオリゴ官能性リンカーにより統計的にカップリングする。
好適な実施態様では、上記のような低分子量リンカーは、上記バインダーおよびエフェクターに対して統計的にカップリング可能な反応基を一種類だけ持ち、本発明において説明するようなエフェクターと連結したバインダーの混合物を生じる。これは、バインダーの二量体、およびエフェクターの二量体をさらに生じる。これらの二量体は、当業者に公知の物理化学的方法により分離することができる。
他の好適な実施態様では、ヘテロオリゴ官能性リンカーを用いてバインダーとエフェクターをカップリングする。これらのヘテロオリゴ官能性リンカーは、2つ以上の異なる反応性化学物質を有することを特徴とする。これらのリンカーは、バインダーまたはエフェクターの二量体の形成を回避するため、カップリング反応の選択性および収率を増大する。
他の好適な実施態様では、ポリマーリンカーが選ばれ、このリンカーの分子量は、好ましくは、1kD〜100kD、より好ましくは、5〜50kD、最も好ましくは、10〜30kDである。このリンカーポリマーは、任意の生理的に許容される天然、改質天然、または合成ポリマーである。
例としては、HPMA(N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリリジン、ヒドロイエチルセルロース(hydroyethylclellulose)、ヒドロキシエチルスターチ、アミノデキストランが挙げられる。
他の好適な実施態様では、上述のポリマーの共ポリマー(規則性、ランダム、ブロック、またはグラフト)がリンカーとして用いられる。上記ポリマーの粘性、親水性、可溶性等の物理的生理的性質は、そのような個々のポリマーの物理的に組み合わせによる。そのような共ポリマーの一例としては、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド(「Pluronic」)の重合がある。
他の好適な実施態様では、他の好適な実施態様では、上述のポリマーの共ポリマー(規則性、ランダム、ブロック、またはグラフト)がリンカーとして用いられる。リンカーとして用いられる。
本発明では直鎖および分岐ポリマーおよび共ポリマーを用いることができる。分岐ポリマーは、グラフト共ポリマーとして用意するか、または小数価開始剤(oligovalent starter)によって開始された直接重合によって用意することができる。好適な実施態様では、後者の方法で用意した分岐ポリエチレングリコール(マルチアームPEG)が用いられる。これらのマルチアームPEGはともに、遊離ヒドロキシル部分を連鎖停止剤として用いて用意されるか、その後に修飾されて官能化活性マルチアームPEGを生じる。そのような修飾の例としては、アクリレート、アミン、エポキシド、イソシアネート、スクシンイミジルグルタラート、スクシンイミジルスクシナートの組み込みがある。これらは、上記バインダーおよびエフェクターの反応基と反応して分子を生じる
デンドリマー
特に好適な実施態様では、デンドリマーがリンカーとして用いられる。
先天性免疫系のエフェクター
PAMP(病原体関連分子パターン)−ウイルス、菌類、および細菌に関する(1.LPS、2.凝集物、3.CpG−DNA、4.N−ホルミルメチオニンペプチド、5.dsRNA、6.マンナンおよび/またはマンノース残基(フコース)、マンノース含有多糖類、7.ホスホコリン、8.糖脂質様分子、9.フラジェリン、10.ペプチドグリカン)。
グラム陰性(桿菌様)の細菌の細菌細胞壁由来のLPS
未修飾LPS
LPS由来の少なく1つの未修飾または修飾モノマー(t least one unmodified or modified monomer)
Mindin/ECMおよび/またはTLR4と結合するLPS模倣薬分子
細菌由来の凝集物
未修飾凝集物 凝集物配列の少なくとも一部と相同性を有するペプチド
凝集物配列の少なくとも一部と相同性を有するペプチド模倣物
Mindin/ECMと結合する凝集物模倣薬
Mindin/ECMと結合するペプチド
Mindin/ECMと結合するペプチド模倣物
Mindin/ECMと結合する任意の分子/小分子
CpG含有DNA配列
CpGリピートを有する非メチル化または低頻度メチル化細菌DNA配列
CpGリピートを有する非メチル化または低頻度メチル化細菌チオホスファトDNA配列(thiophoshphat−DNA−sequence)
TLR9を結合するCpGリピート模倣薬分子を有するDNA配列
N−ホルミルメチオニン
N−ホルミルメチオニンから始まるペプチド
N−ホルミルメチオニンから始まるペプチド模倣物
C末端にD−メチオニンを有するペプチド
C末端にD−メチオニンを有するペプチド模倣物
FPR、FPRL1、またはFPRL2を含むペプチド
FPR、FPRL1、またはFPRL2を含むペプチド模倣物
FPR、FPRL1、またはFPRL2を誘導する任意の分子/小分子
N−ホルミルメチオニンを含有する分子
ウイルスのdsRNA
ウイルスの未修飾dsRNA
ウイルスのチオホスホ−dsRNA
TLR3を結合するウイルス模倣薬分子のdsRNA
マンナン/マンノース含有オリゴマーまたはポリマー
酵母および細菌細胞壁由来の未修飾マンナンおよび/またはマンノース残基(フコース)
酵母および細菌細胞壁由来のマンナンおよび/またはマンノース残基(フコース)由来の少なくとも1つの未修飾または修飾モノマー
結合マンナン結合レクチン(MBL)に結合する酵母および細菌細胞壁模倣薬分子由来のマンナンおよび/またはマンノース残基(フコース)
細菌および菌類由来の未修飾マンノース含有多糖類
細菌および菌類由来のマンノース含有多糖類由来の少なくとも1つの未修飾または修飾モノマー
MMR(マクロファージマンノース受容体)に結合する細菌および菌類模倣薬分子由来のマンノース含有多糖類
細菌細胞壁由来のホスホコリン
細菌細胞壁由来の未修飾ホスホコリン
CPR(C反応性タンパク質)に対するエフェクター結合
病原体上の糖脂質様分子
細菌細胞壁由来の未修飾ホスホコリン
TLR1および/またはTLR2/6二量体を結合
細菌モータータンパク質および毒性因子由来のフラジェリン
未修飾フラジェリン
フラジェリン配列の少なくとも一部と相同性を有するペプチド
フラジェリン配列の少なくとも一部と相同性を有するペプチド模倣物
Mindin/ECMと結合するフラジェリン模倣薬
TLR5と結合するペプチド
TLR5と結合するペプチド模倣物
TLR5と結合する任意の分子/小分子
細菌細胞壁、特にグラム+由来のペプチドグリカン
細菌細胞壁、特にグラム+由来の未修飾ペプチドグリカン
細菌細胞壁、特にグラム+由来のペプチドグリカン由来の少なくとも1つの未修飾または修飾モノマー
細菌細胞壁、特にグラム+由来のペプチドグリカン
TLRおよびNOD、特にNODタンパク質(NOD2およびNOD2)と結合する模倣薬分子
ネズミチフス菌トール様受容体(TLR)2/CD14由来の細巻線毛(thin curled fimbriae)(CsgA)の主用線毛サブユニット
蠕虫糖質ラクト−N−フコペンタオースIII(LNFPIII)は、そのマウス樹枝状細胞に対する作用により先天性Th2プロモーターとして機能し、この活性にはα1−3連結フコースを必要とする。ネオ複合糖質ラクト−N−フコペンタオースIII(12〜25個の分子)−デキストラン(LNFPIII−Dex)は、TLR4を介して樹枝状細胞(DC)を活性化する。
酵母ザイモサンは、TLR2/TLR6ヘテロ二量体を活性化する一方、サッカロミセスセルビジエおよびカンジダアルビカンス由来マンナンは、TLR4によって検知されると思われる。カンジダアルビカンスの細胞表面に存在するホスホリポマンナンは、TLR2によって認識されることが示されているが、TLR4は、主に、グルクロンオキシロマンナン(glucuronoxylomannan)(クリプトコックスネオフォルマンスの主用莢膜多糖類)と相互作用する。MyD88は、直鎖(1−−>3)−β−D−グルカン、およびニューモシスティスカリニ由来のβ−グルカンのTLR信号伝達に関係してきた。
表面接着剤として機能する線毛(ポルフィロモナスジンジバリス由来);TLR2およびTLR4は、線毛に反応して細胞活性化を媒介するが、他のPRR(すなわち、CD14およびCD11b/CD18)は、線毛の認識に関与する。
TLR6およびTLR2を結合するマイコプラズマリポタンパク質
アシル化リポペプチド、例えば、ジアシル化マイコプラズマリポペプチド(マクロファージ活性化リポペプチド2kDa(MALP−2)と呼ばれる)またはトリアシル化細菌リポペプチド
スタフィロコッカスエピデルミディスから分泌されるフェノール可溶性モジュリン;スタフィロコッカスエピデルミディスは、マクロファージを刺激するフェノール可溶性モジュリン(PSM)と呼ばれるペプチド基を放出する。3つのペプチド(PSMα、PSMβ、およびPSMγ)の構造は既述である。我々は、fMSIVSTIIEVVKTIVDIVKKFKKという構造を有する23merである第4のペプチド(PSMδ)について報告する。
表3に特に好適な実施態様を示す。
1.バインダーの製造
ペプチド
体外でオリゴペプチドおよタンパク質(oligopeptides an proteins)を生産する方法は、当業者には公知である。そのようなオリゴペプチドを提供する元々の手順は、1963年にMerrifieldによって公開されている[R.B.Merrifield,J.Am.Chem.Soc.85,2149(1963);B.D.Larsenら、J.Am.Chem.Soc.115,6247(1993);D.D.Smithら、J.Peptide Protein Res.44,183(1994);M.J.O’Donnellら、J.Am.Chem.Soc.118,6070(1996)。
上記手順に多くの改良および拡張が行うことによりこの方法に高い柔軟度を持たせた。それらの改良には、非天然アミノ酸の組込み[Ishida,H.、およびInoue,Y.(1999)Peptides that contain unnatural amino acids:Toward artificial proteins.Reviews on Heteroatom Chemistry,19,79−142;O’Donnell,M.J.,Lugar,C.W.,Pottorf,R.S.,Zhou,C.,Scott,W.L.、およびCwi,C.L.(1997)Solid−phase synthesis of unnatural amino acids using unactived alkyl halides.Tetrahedron Lett.,38,7163−7166;Scott,W.L.,Zhou,C.,Fang,Z.、およびO’Donnell,M.J.(1997)The solid synthesis of alpha,alpha−disubstituted unnatural amino acids and peptides(di−UPS).Tetrahedron Lett.,38,3695−3698.]および環状ペプチドの産生[Zhang,L.S.、およびTam,J.P。(1997)Synthesis and application of unprotected cyclic peptides as building blocks for peptide dendrimers.J.Amer.Chem.Soc.,119,2363−2370.;Koppitz,M.,Huenges,M.,Gratias,R.,Kessler,H.,Goodman,S.L.、およびJonczyk,A.(1997)Synthesis of unnatural lipophilic N−(9H−fluoren−9−yl−methoxy)carbonyl−substituted alpha−amino acids and their incorporation into cyclic RGD−peptides:A structure activity study.Helv.Chim.Acta,80,1280−1300.;Gobbo,M.,Biondi,L.,Cavaggion,F.,Filira,F.,Piek,T.,Mantel,P.、およびRocchi,R.(1997)Synthesis and biological activities of head−to−tail cyclic bradykinin analogues of varying ring size.Int.J.Peptide Prot.Res.,50,336−341;Eichler,J.、およびHoughten,R.A.(1997)Synthesis of cyclic disulfide peptides:Comparison of oxidation
methods.Protein Peptide Lett.,4,157−164;Blackburn,C.、およびKates,S.A.(1997)Solid−phase synthesis of cyclic homodetic peptides.Methods Enzymol.,289,175−198,Tam,J.P.、およびLu,Y.A.(1998)A biomimetic strategy in the synthesis and fragmentation of cyclic protein.Protein Sci.,7,1583−1592が含まれる。
.Fernandez,Philip E.Dawson,Stephen B.H.K
ent,John H.Griffin]。
ペプチドリピートは、上記の方法を用いて産生および精製することができる。
マイクロプロテインは、固相合成によって効率よく産生することができ[Olga Avrutina,Hans−Ulrich Schmoldt,Harald Kolmar,Ulf Diederichsen、Fmoc−Assisted Synthesis of a 29−Residue Cystine−Knot Trypsin
Inhibitor Containing a Guaninyl Amino Acid at the P1−Position,European Journal of Organic Chemistry,2004,23,4931−4935]、さらに、システインノットタンパク質等のマイクロタンパク質を産生する方法が公知である[Schmoldt HU,Wentzel A,Becker S,Kolmar H.A fusion protein system for the recombinant production of short disulfide bond
rich cystine knot peptides using barnase as a purification handle.Protein Expr Purif.2005 Jan;39(1):82−9.]。
ヒトまたは動物免疫グロビンタンパク質(Human or animal immunoglobin proteins)は、哺乳動物細胞株[Curr Opin Biotechnol.1995 Oct;6(5):553−60.Production
of monoclonal antibodies in COS and CHO
cells.Trill JJ,Shatzman AR,Ganguly S.]および原核生物[Curr Opin Biotechnol.2004 Aug;15(4):364−73.Prokaryotic expression of antibodies and affibodies.Fernandez LA.]において産生することができる。
DNAオリゴヌクレオチオド(DNA oligonucleotiodes)および修飾誘導体(例えば、ホスホチエートDNA/RNA(phosphotiate DNA/RNA))は、固相方法により体内において優れた収率および純度で任意の配列を有するとともに、最大で30〜80個のヌクレオチドに相当する長さに合成することができる。専門家にはいくつかの方法が公知である[Caruthers MH,Beaton
G,Wu JV,Wiesler W.Chemical synthesis of
deoxyoligonucleotides and deoxyoligonucleotide analogs.Methods Enzymol.1992;211:3−20.;Caruthers MH,Beaton G,Cummins L,Graff D,Ma YX,Marshall WS,Sasmor H,Norris
P,Yau EK.Synthesis and biochemical studies of dithioate DNA.;Ciba Found Symp.1991;158:158−66;discussion 166−8.;Caruthers MH,Beaucage SL,Becker C,Efcavitch JW,Fisher EF,Galluppi G,Goldman R,deHaseth P,Matteucci M,McBride Lら、Deoxyoligonucleotide synthesis via the phosphoramidite method.Gene Amplif Anal.1983;3:1−26.]。
直線リンカー
上記バインダーおよびエフェクターは、共有結合することができる。各種の機能を共有結合するための適切な反応条件は当業者に公知である[Henson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996]。これらは、通常、ある要素(ドメイン)と他の要素(ドメイン)とを直接反応させる前に活性化を行うことを必要とする。そのような反応スキームの例としては、カルボジイミドによる一方のパートナーのカルボキシ部分の活性化、および反応中間体とアミノ基を持つ第2の要素との接触が挙げられる[Hoare DG,Koshland DE,J.Am.Chem.Soc.88,2057;Chu,BCF,Kramer FR,Orgel LE,Nuc.Ac.Res.14,5591−5603]。
ホモオリゴ官能性リンカー、オリゴ−アルコール、オリゴ−アミン、オリゴ−カルボン酸、チオールによる統計的カップリング
ジオール、トリオール、ジアミン、ジカルボイキシリック酸(dicarboyxylic acids)のような低分子物質は、バインダーおよびエフェクターのカップリングのための反応性足場として用いることができる。そのような低分子量足場の例としては、例えば、ギルセロール(gylcerol)、ヘキサンジアミン、コハク酸がある。通常、反応基の活性化の後に、バインダーおよびエフェクターと反応させて反応生成物の統計的混合物を得ることができる。
groups)を利用することができる(これらの例としては、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)、ジスクシンイミジルスベラート、ジスクシンイミジルトラトレート(Disuccinimidyl tratrate)がある[Henson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996]。
ヘテロオリゴ官能性リンカーは、化学論的に(stochiometrically)明確なバインダーとエフェクターの組み合わせの形成のための反応性足場として用いることができる。そのような足場は、バインダーおよびエフェクターに対して個別にカップリング可能な2つの直交官能基を特徴とする。
ホモ多官能性リンカーによる統計的カップリング
HPMA
ポリリジン
ヒドロイエチルセルロース(hydroyethylclellulose)、ヒドロキシエチルスターチ
アミノデキストラン
コプリマー(Coplymers)
高分子量高分子足場を用いて、結合およびエフェクター要素を統計的方法でカップリングすることができる。高分子足場の活性化により、結合および反応との足場の反応。分岐高分子足場
分岐PEG
デンドリマー
ヘテロオリゴ官能性カップリングによる明確な化学論(defined stochiometry)
ポイルペプチド(Poylpeptides)
官能化活性ポリマー
PEG
ポリウレタン
最も好適な実施態様では、上記リンカーはポリテヒレングリコール(polytehylenglycol)である。
3.エフェクターの製造
ペプチドおよび免疫刺劇要素(Immunostimutating element)
先天性免疫系を刺激するオリゴマー
オリゴペプチドおよびポリペプチド
ペプチド
未修飾ペプチド
fM−ペプチド
上述の方法は、ペプチドの産生に適用することができる。ペプチドの合成において非天然アミノ酸をモノマーとして用いることにより当該ペプチドの改変を行うことができる。
リポペプチド
例えば、アシル化リポペプチド、例えば、ジアシル化マイコプラズマリポペプチドまたはトリアシル化細菌リポペプチドおよびトライアシルリポペプチド(tryacyl lipopeptide)(Pam3CSSNA)、ジアミノピメリン酸含有デスムラミールペプチド(desmuramyl peptide)(γ−D−グルタミル−メソ−DAP;iE−DAP)、およびムラミールジペプチド(MDP)
細菌由来のタンパク質
細菌由来の凝集物/アドヘシネ(adhesines)、例えば、表面接着剤として機能するネズミチフス菌由来の線毛サブユニット(CsgA)または(ポルフィロモナスジンジバリス由来の)線毛
細菌由来のフラジェリン
細菌由来のNアセチル化伸長因子、例えば、大腸菌由来のTu(EF−Tu)
細菌由来の外膜タンパク質、例えば、肺炎桿菌(KpOmpA)
細菌タンパク質は、当業者に公知の生物工学的生産およびタンパク質精製法の標準的な方法により高い収率および純度で産生することができる[Sambook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition−Cold Spring Harbor Laboratory Press(Januar 2001)]。N−ホルミル化細菌または異種タンパク質のような免疫刺激効果を与える修飾タンパク質は、[Protein Expr Purif.2003 Dec;32(2):317−22.Expression of N−formylated proteins in Escherichia coli.Spector S,Flynn JM,Tidor B,Baker TA,Sauer RT]に記載されるよう産生することができる。
抗体のFc部
抗原由来のタンパク質
中和抗体由来の抗原
補体カスケードを誘導する抗原
自己免疫版応(autoimmune reations)由来の抗原
このようなタンパク質を原核および真核宿主における異種発現により産生する多数の方法が公知である。
細菌由来のCpG含有DNA
上述のような固相合成法を適用することができる。
オリゴ糖質または多糖質
マンノース含有オリゴ糖質または多糖質
酵母および細菌細胞壁由来のマンナンおよび/またはマンノース残基(フコース)
蠕虫由来のラクト−N−フコペンタオースIII(LNFPIII)
修飾オリゴ糖質または多糖質
細菌由来のLPS
病原体上の糖脂質様分子
先天性免疫系を刺激する小分子
イミダゾキノリン
ホスホコリン
4.表3に示す実施態様のリストの作成
好適な実施態様のリストの作成を以下に説明する。下記の各項目は、表3の対応項目に関する。下記に示すバインダーおよびエフェクター部分は単に例示を目的とするものであり、本発明の範囲を限定するためのものではない。バインダーの他の例については表1に示している。エフェクターの他の例は上記に示している(「3.エフェクターの例」)。当業者は、バインダー部分およびエフェクター部分が他のバインダーおよびエフェクター部分とどのようにして置き換えられるかを理解している。特に、当業者は、他の配列のペプチドを合成するためにどのようにペプチド固相合成条件を適合させればよいか、および各種のペプチド配列を特定の試薬または固形担体にカップリングする場合に、どのように化学的カップリング手順を適合させればよいかを理解している。
固相合成法により、C末端に単一の固有リジン残基を有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Cys残基をC末端に有する配列form−MMYALFCのペプチドのエフェクターを合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。
固相合成法により、C末端に単一の固有リジン残基を有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Lys残基をC末端に有する配列form−MMYALFKのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。リンカー分子として、4−アームPEG−スクシンイミジルグルタラート(アイテム番号P4SG−20、SunBio 57 Claremont Avenue,Orinda,CA94563,USA)を活性リンカーとして用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、ペプチドバインダーおよびペプチドエフェクターを同時に活性リンカーと反応させる。この反応により一般組成が(YHWYGYTPQNVIK)x−PEG−(form−MMYALFK)y(ここで、x+y≦4)の生成物を得る。実験者者(experimentator)は、バインダーペプチドおよびエフェクターペプチドの開始濃度を適切に選ぶことで化学論因子(stochiometric factors)xおよびyを決定することができる。バインダーペプチドのリジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。
[He−Shu Luら、Crystal Structure of Human Epidermal Growth Factor and Its Dimerization、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.276,No。37,Issue of September 14,pp.34913−34917,2001]に記載の方法により、C末端にリジン残基を有するEGFミロタンパク質バインダー(EGF miroprotein binder)を合成する。固相合成法により、Cys残基を有する一般配列form−MMYALFCのミロタンパク質バインダーを合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、バインダーペプチドをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物EGF−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。この反応の終了後、クロマトグラフ法[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物EGF−PEG−MALをエフェクターペプチド(form−MMYALFC)と反応させて所望の反応生成物EGF−PEG−(form−MMYALFC)を得る。
[He−Shu Luら、Crystal Structure of Human Epidermal Growth Factor and Its Dimerization、THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,Vol.276,No。37,Issue of September 14,pp.34913−34917,2001]に記載の方法により、C末端にリジン残基を有するEGFミロタンパク質バインダー(EGF miroprotein binder)を合成する。固相合成法により、リジン残基を有する一般配列form−MMYALFKのミロタンパク質バインダーを合成する。リンカー分子として、4−アームPEG−スクシンイミジルグルタラート(アイテム番号P4SG−20、SunBio 57 Claremont Avenue,Orinda,CA94563,USA)を活性リンカーとして用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、ペプチドバインダーおよびペプチドエフェクターを同時に活性リンカーと反応させる。この反応により一般組成が(EGF)x−PEG−(form−MMYALFK)y(ここで、x+y≦4)の生成物を得る。実験者者(experimentator)は、バインダーペプチドおよびエフェクターペプチドの開始濃度を適切に選ぶことで化学論因子(stochiometric factors)xおよびyを決定することができる。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。
[Nat Chem Biol.2006 Jul;2(7):381−9.Epub
2006 Jun 11,Combinatorial chemistry identifies high−affinity peptidomimetics against alpha(4)beta(1)integrin for in vivo tumor imaging.Peng L,Liu R,Marik J,Wang X,Takada Y,Lam KS.]に示される方法により、α(4)β(1)インテグリンに対するアミノリンカーを有するペプチド模倣高親和性バインダーを合成する。固相合成法により、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Cys残基をC末端に有する配列form−MMYALFCのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、バインダーペプチドをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物バインダー−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。この反応の終了後、クロマトグラフ法[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物バインダー−PEG−MALをエフェクターペプチド(form−MMYALFC)と反応させて所望の反応生成物バインダー−PEG−(form−MMYALFC)を得る。
[Nat Chem Biol.2006 Jul;2(7):381−9.Epub
2006 Jun 11,Combinatorial chemistry identifies high−affinity peptidomimetics against alpha(4)beta(1)integrin for in vivo tumor imaging.Peng L,Liu R,Marik J,Wang X,Takada Y,Lam KS.]に示される方法により、α(4)β(1)インテグリンに対するアミノリンカーを有するペプチド模倣高親和性バインダーを合成する。固相合成法により、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Lys残基をC末端に有する一般配列form−MMYALFKのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。リンカー分子として、4−アームPEG−スクシンイミジルグルタラート(アイテム番号P4SG−20、SunBio 57 Claremont Avenue,Orinda,CA94563,USA)を活性リンカーとして用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、ペプチドバインダーおよびペプチドエフェクターを同時に活性リンカーと反応させる。この反応により一般組成が(バインダー)x−PEG−(form−MMYALFK)y(ここで、x+y≦4)の生成物を得る。実験者者(experimentator)は、バインダーペプチドおよびエフェクターペプチドの開始濃度を適切に選ぶことで化学論因子(stochiometric factors)xおよびyを決定することができる。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。
固相合成法により、3’末端に単一の固有スルフディドリル残基(sulfdydryl residue)を有する一般配列Nx−スペーサー−SHのDNAアプタマーを合成する。この固相合成法を用いて、単一の固有Lys残基をC末端に有する配列form−MMYALFKのN−ホルミル−メチオニンペプチドを合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、エフェクターペプチドのC末端リシンをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物form−MMYALFK−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。この反応の終了後、当業者に公知のクロマトグラフ法により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物form−MMYALFK−PEG−MALをDNAアプタマーNNNNN−スペーサー−SHと反応させて所望の反応生成物form−MMYALFK−PEG−スペーサー−NNNNNを得る。
固相合成法により、3’末端に単一の固有スルフディドリル残基(sulfdydryl residue)を有する一般配列Nx−スペーサー−SHのDNAアプタマーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Lys残基をC末端に有する配列form−MMYALFKのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。リンカー分子として、4−アームPEG−スクシンイミジルグルタラート(アイテム番号P4SG−20、SunBio 57 Claremont Avenue,Orinda,CA94563,USA)を活性リンカーとして用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、ペプチドバインダーおよびペプチドエフェクターを同時に活性リンカーと反応させる。この反応により一般組成が(form−MMYALFK)y−PEG−(スペーサー−Nx)z(ここで、z+y≦4)の生成物を得る。実験者者(experimentator)は、バインダーペプチドおよびエフェクターペプチドの開始濃度を適切に選ぶことで化学論因子(stochiometric factors)xおよびyを決定することができる。
固相合成法により、C末端に単一の固有リジン残基を有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチド模倣物であって、単一の固有Cys残基をペプチド模倣エフェクターのC末端に有する配列form−M−XnCのペプチド模倣物を合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、バインダーペプチドをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。この反応の終了後、クロマトグラフ法[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物(YHWYGYTPQNVIK−)PEG−MALをペプチド模倣エフェクターform−M−XnCと反応させて所望の反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−(form−M−XnC)を得る。
Kantchevら(Biopolymers.2006;84(2):232−40)に詳述されるように、多価エフェクターデンドリマーを得るために、機械による直接Fmoc/TBu固相ペプチド合成を利用した純粋な単分散第3世代マンノシル化ポリ−L−リシンデンドリマー−ペプチド結合体を調製することができる。
[Ulbrich K.ら;Polymeric drugs based on conjugates of synthetic an natural macromolecules,J.of Controlled Release,64,2000,63−79]に示される実験手順を用いて、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)と一般組成MA−(Xn)−oNPのメタクリロイル−ペプチド−4−ニトロフェニルエステルの共重合によりポリマー前駆体を調製する。固相合成法により、単一の固有リジン残基をC末端に有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Lys残基をC末端に有する配列form−MMYALFKのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。次いで、[Ulbrich K.ら;Polymeric drugs based on conjugates of synthetic an natural macromolecules,J.of Controlled Release,64,2000,63−79]に示される方法により、ポリマー前駆体を、アミノ分解により(aminolytically)ポリマーのoNP部分と反応するバインダーペプチドおよびエフェクターペプチドと連続して反応させる。この反応の生成物は、バインダーおよびエフェクター機能の統計分布を有する安定した高MW高子分薬剤(stable high−MW poylmeric drug)であり、ポリマーのバインダーおよびエフェクターの平均置換勾配(mean binder and effector substitution grades)は、ポリマー前駆体の調製時の濃度反応物の実験的選択、バインダーおよびエフェクター群のアミノ分解結合により求められる。
a)[Ulbrich K.ら;Polymeric drugs based on
conjugates of synthetic an natural macromolecules,J.of Controlled Release,64,2000,63−79]に示される実験手順を用いて、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)と一般組成MA−(YHWYGYTPQNVI)のメタクリロイル−バインダーペプチド−4−ニトロフェニルエステルおよび一般組成form−MMYALF−MAのメタクリロイル−エフェクターペプチド−4−ニトロフェニルエステルの共重合によりポリマー前駆体を調製する。この反応の生成物は、バインダーおよびエフェクター機能の統計分布を有する安定した高MW高子分薬剤(stable high−MW poylmeric drug)であり、ポリマーのバインダーおよびエフェクターの平均置換勾配(mean binder and effector substitution grades)は、重合物質の調製時の反応物の濃度の実験的選択により求められる。
peptides into polymeric immunogens,Vaccine,15(15),1697−1705,1997]に示される実験手順を用いて、アクリロイル残基をN末端に有する配列アクリロイル−YHWYGYTPQNVIのペプチドエフェクターを合成する。[Jackson DC,Free radical Polymerisation of synthetic peptides into
polymeric immunogens,Vaccine,15(15),1697−1705,1997]に示される実験手順を用いて、上記ペプチドエフェクターおよびエフェクターペプチドを共重合して上記活性重合物質を得る。
a)[Kantchev EABら、Direct Fmoc/terTBu solid phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer−peptide conjugates,Biopolymers.2006;84(2):232−40]に示される方法を用いて、一般組成YHWYGYTPQNVI−(ポリリジン−デンドリマー)−(マンノシル)8の活性物質であって、YHWYGYTPQNVI部分がバインダーペプチドであり、ポリリジンがリンカー要素であり、マンノシル残基がエフェクター要素である活性物質を合成する。
固相合成法により、単一の固有リジン残基をC末端に有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、N−ホルミル−メチオニンを有するペプチドであって、単一の固有Lys残基をC末端に有する配列form−MMYALFKのペプチドのエフェクターペプチドを合成する。二官能活性N−スクシンイミジルエステル−PEG−N−スクシンイミジルエステル(NHS−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号4K4K0L02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996]に詳述される標準的な生化学的方法により、バインダーペプチドおよびエフェクターペプチドを同時に、用意したリンカー分子と反応させる。この反応の終了後、所望の生成物YHWYGYTPQNVIK−PEG−(form−MMYALFK)を単離するために、当業者に公知の標準的なクロマトグラフ法により、結果生じた分子生成種(YHWYGYTPQNVIK−PEG−(form−MMYALFK)、YHWYGYTPQNVIK−PEG−(YHWYGYTPQNVIK)、form−MMYALFK−PEG−(form−MMYALFK)、YHWYGYTPQNVIK−PEG、form−MMYALFK−PEG)の混合物と過剰抽出物とを分離する。
固相合成法により、単一の固有リジン残基をC末端に有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、単一の固有Cys残基をペプチド模倣物エフェクターのC末端に有する配列(Xn)Cのペプチド模倣物FPRL2バインダー[Migeotte I.ら、Identification and
characterization of an endogenous chemotactic ligand specific for FPRL2 The Journal of Experimental Medicine Vol.201,No.1,January 3,2005 83−93を参照されたい]を合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、バインダーペプチドをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。この反応の終了後、クロマトグラフ法[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物(YHWYGYTPQNVIK−)PEG−MALをペプチド模倣物FPRL2バインダーと反応させて所望の反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−((Xn)C)を得る。
固相合成法により、単一の固有リジン残基をC末端に有する配列YHWYGYTPQNVIKのペプチドバインダーを合成する。この固相合成法を用いて、D−メチオン(D−Methione)(m)残基をC末端に有するとともに、単一の固有Cys残基をペプチド模倣物エフェクターのN末端に有する配列CWKYMVmのエフェクターペプチド[Yang D,Chen Q,Gertz B,He R,Phulsuksombati M,Ye RD,Oppenheim JJ.,Human dendritic cells express functional formyl peptide receptor−like−2(FPRL2) throughout maturation,J Leukoc Biol.2002 Sep;72(3):598−607を参照されたい]を合成する。多官能活性マレイミド−PEG−N−スクシンイミジルエステル(MAL−PEG−NHS)NEKTAR製品カタログ、アイテム番号2E4M0H02)をリンカー分子として用意する。[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]に詳述される標準的な生化学的方法により、まず、バインダーペプチドをリンカーのNHS部分と反応させ、反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−MALを得ることができる。これらの条件下では、リンカーのMAL部分は、スルフディドリル機能(sulfdydryl functions)がない場合には本質的に安定する。リジン残基のε−アミノ基に対するカップリングに応じて、ペプチドのアミノ末端に対するカップリングが発生し得る。この反応の終了後、クロマトグラフ法[Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996,228−245]により過剰抽出物を除去し、引き続き、精製反応生成物(YHWYGYTPQNVIK−)PEG−MALを配列CWKYMVmのエフェクターペプチドと反応させて所望の反応生成物(YHWYGYTPQNVIK)−PEG−(CWKYMVm)を得る。
固相法を用いて、ポリエチレングリコールスペーサー(Novabiochem,Cat.No.01−63−0150 Fmoc−NH−(PEG)27−COOH)がバインダーペプチドのC末端と接合する配列YHWYGYTPQNVIK−PEG−COOHを有するバインダーペプチドを合成する。このペプチドを脱保護することなく固相担体から切断する。固相法を用いて、ポリエチレングリコールスペーサー(Novabiochem,Cat.No.01−63−0150 Fmoc−NH−(PEG)27−COOH)がエフェクターペプチドのC末端と接合する配列form−MMYALF−PEG−COOHを有するN−ホルミル−メチオニン−エフェクターペプチドを合成する。このペプチドを脱保護することなく固相担体から切断する。
phase synthesis of Octomannosyl Poylylsine dendrimer−peptide conjugates,Biopolymers.2006;84(2):232−40]に示される方法を用いて、ポリリジンデンドリマーを合成する。保護バインダーペプチド(YHWYGYTPQNVIK−PEG−COOH)および保護エフェクターペプチド(form−MMYALF−PEG−COOH)を同時にポリルシンデンドリマー(Polylsine dendrimer)と反応させて、実験条件および用意されたバインダーおよびエフェクターペプチドの濃度の選択による一般化学論係数(general stochiometric coefficients)xおよびyを有する所望の反応生成物(form−MMYALF−PEG)x−COOHポリリジン−(YHWYGYTPQNVIK−PEG−COOH)yを得る。
代替的な手法では、当業者に公知の方法でペプチド結合体を合成することができる。この化合物は、1つ以上のバインダーペプチド、1つのリンカーペプチド、および1つ以上のエフェクターペプチドを含み、全てがペプチド結合で連結される。好適な実施態様では、エフェクターペプチドはform−MMYALFであり、リンカーペプチドはポリリジンK(n)であり、バインダーペプチドはYHWYGYTPQNVIである。好ましくは、配列form−MMYALF−(K)N−YHWYGYTPQNVIを有する直鎖ペプチド結合体が合成されるが、nは0〜50の範囲、好ましくは、0〜10の範囲である。n=0の場合、バインダーおよびエフェクター部分は単一のペプチド結合で連結される。他の好適な実施態様では、エフェクターペプチドはホルミル−Met−Leu−Phe(fMLP)であり、リンカーペプチドはポリリジンK(n)であり、バインダーペプチドはAWYPLPPであり、nは0〜50の範囲、好ましくは、0〜10の範囲である。
代替的な手法では、当業者に公知の方法で、ペプチドおよびアミド結合で連結された1つ以上のバインダーペプチド、1つのリンカーペプチド、および1つ以上のエフェクターペプチドを含むペプチド結合体を合成することができる。エフェクターペプチドform−MMYALF、リンカーペプチドポリリジンK(n)、バインダーペプチドYHWYGYTPQNVIを選んで、配列form−MMYALF−(K)N−YHWYGYTPQNVIを有する直鎖ペプチド結合体を合成するが、nは1〜50の範囲、好ましくは、1〜10の範囲である。第2の基質として、バインダーペプチドYHWYGYTPQNVIを当業者に公知の方法で合成する。続いて、Hermansonら、1996(Hermanson GT.,Bioconjugate techniques,Academic Press 1996)で詳述するように、バインダーペプチドをCDIカップリングによる直鎖ペプチド結合体と反応させてリンカー領域のリジン残基のεアミノ機能とバインダーペプチドのカルボキシ末端間にアミド連結部を生じ、一般組成form−MMYALF−(K)n−(YHWYGYTPQNVI)m−YHWYGYTPQNVI分岐ペプチド結合体を得る(ここで、nは1〜50の範囲、好ましくは、1〜10の範囲であり、mは1〜nの範囲である)。分岐数mは、実験者者(eperimentator)が反応条件を選ぶこと、特に、基質の濃度を変更することにより決定される。
Tamら、1988(Tam,J.P.,PNAS USA 85,5409−5413,1988)に従って3層リシンコア(three level lysine core)とカップリングされた配列NH2−MQLPLATCOOHの8個の結合ペプチドを有する多重ペプチドデンドリマーを固相合成により合成する。固相合成法を用いて、配列form−MLP−COOHを有するエフェクターペプチドを合成する。続いて、Hermansonら、1996(Hermanson GT.,Bioconjugate
techniques,Academic Press 1996)で詳述するように、エフェクターペプチドをCDIカップリングによる分岐ペプチドデンドリマーと反応させてバインダーペプチドデンドリマーのαアミノ基とエフェクターペプチドのカルボキシ末端間にアミド連結部を生じ、一般組成(fMLP)m−(MQLPLATGGG)8−(K)4−(K)2−K−βAの分岐ペプチド結合体を得る。分岐数mは、実験者者(eperimentator)が反応条件を選び、バインダーペプチドデンドリマーに対するエフェクトットペプチド(effectot peptide)の半化学論的カップリング(substochiometric coupling)を生じることにより決定される。
Sheridanら(Sheridan JM、Hayes GM、Austen BM.、Pept Sci。1999 Dec;5(12):555−62)に記載の方法を用いて、固相合成により分岐ペプチドを直接調製する。Dde保護リジン残基をペプチドの合成における分岐点として用いて、エフェクターfMLP−COOHおよび2つのバインダーNH2−MQLPLATCOOHを含む式fMLPK−(NH2−MQLPLAT)−GGGK−(NH2−MQLPLAT)−I−COOHの分岐結合体を合成する。
ystems)に対して、固相Fmoc:tBu方法論を用いる。Fmoc脱保護を365nmで監視した。必要であれば、結合またはアセチル化の終了をTNBSで判定した。直径1cmの反応カラムにより2%ヒドラジン:DMF(v:v)を3ml:minで用いて連続流中においてLys(Dde)の選択的脱保護を行う。Ddeの除去を365nmで監視し、TNBSで確認した後、ペプチド樹脂をDMFで洗浄する。樹脂からの最終的な切断およびTFAに不安定な保護基の除去に95%TFA:2.5%TIS:2.5%H2O(v:v)の混合物を2時間室温で用いる。切断した樹脂をろ過により除去し、4mlの純TFAで2回洗浄し、複合ろ液を2mlに蒸発する。氷冷ジエチルエーテル(40ml)を加えてペプチドを沈殿させ、混合物を1000rpmで5分間遠心分離機にかける。このエーテル溶液を他の容器に移し、ジエチルエーテルの抽出をさらに4回行う。Nucleosil 5 C8 300(150_4.6mm)カラムに分析用HPLC
を行う(溶媒のグラジエント、A液0.1%aq.TFAおよびB液0.1%TFA:アセトニトリル(v:v)、1ml:minで215nm紫外検出を行う)。同じ溶媒を、分取用HPLCにおいて、225nm紫外検出を行うVydac C4カラム(Hichrom Ltd,UK)に対して用いる。反応が完了した度合いをHPLCエリアから推定する。
1.マンノース受容体の活性化の評価
マンノース、マンナン、マンノース含有分子、フコイダン、ポリグアニル酸(ポリG)化学的修飾および未修飾低密度リポタンパク質(LDL)または任意の他の電位エフェクター分子の活性化電位を測定するために、いくつかのアッセイを採用することができる。それらのいくつかは、MBL(マンノース結合レクチン)、MR(マンノース受容体)またはスカベンジャー受容体(SR)SR−AおよびSR−Bの結合可能性に注目するものである。
国際公開公報WO0031261 A1には、FPRL−1の受容体シグナル伝達を誘導し得るポリペプチドまたは非ペプチド化合物のスクリーニングに適した方法が記載されている。この公報に記載されるアッセイは、FPRL−1受容体とアゴニストの相互作用により生じる誘導応答を増強する試験化合物にスコアをつけることができる。
エフェクター候補の活動を評価するために、先天性免疫系とは異なる細胞型の活性化を監視することができる。
ペプチド配列AWYPLPPは、肝細胞癌細胞を特異的に認識し結合する(Wei−Dong Jiaら、Cancer Lett.2006,Jun 24)。従って、このペプチド配列はバインダーとして用いられる。配列FMLPを有するホルミルメチオニンペプチドはエフェクターとして用いられる。
WYPLPPをバインダーとして含む分岐ペプチド化合物を合成する。この合成により、エフェクターfMLP−COOHおよび2つのバインダーNH2−AWYPLPP−COOHを含む式fMLPK−(NH2−AWYPLPP)−GGGK−(NH2−AWYPLPP)−I−COOHを有する分岐結合体が得られるが、エフェクターのホルミルメチオニン、およびバインダー部分のN末端はともに、それぞれの標的構造と自由に相互作用を行うことができる。
−安価で単純な化学合成
−スケールアップが容易
−薬剤(合成化学物質)の化学的性質による承認時間の短縮
−結合ペプチドの生成に標準的な技術を使用、例えば、ファージ提示法(正しい組み合わせに対しては早く、より柔軟)
−柔軟な結合およびエフェクター機能を有する化合物を合成することができる。
および強度(バインダー)x−(エフェクター)y(xおよびy≧1)
−一価〜多価のエフェクター機能までの柔軟性
−いくつかの多価バインダーを用いた設計が可能である(デンドリマーまたは分岐PEG)
−小型化およびペグ化のため免疫原性がない
−スクリーニングのON/Off比および結合定数に適合するとともに、(i)複雑度が低い小型ペプチドおよび(ii)一価〜多価のバインダーを有する設計用足場を最適化する柔軟性が高い
−標的細胞との結合時にのみ、エフェクターの濃度が免疫応答を誘導する程度に十分に高くなるように化合物ごとにエフェクター数を決定することができる(a:エフェクターと受容体の結合強度;b:多価性)
−異なるサイズのPEGの付着、保持分子に対する結合、および安定性により半減期を変更することができる。
Claims (16)
- 1つ以上のエフェクター部分および1つ以上のバインダー部分を含む合成化合物であって、該エフェクター部分は、リンカーを介して該バインダー部分と操作可能に連結され、
該エフェクター部分は少なくとも1つの病原体パターン認識受容体(PRR)に対するリガンド、すなわち、(i)ホルミルペプチド受容体(FPR)または(ii)FPRファミリーのメンバーに対するリガンドであり、
該バインダー部分は腫瘍細胞のマーカーと結合し、
該バインダー部分は、5〜75アミノ酸の長さを有する、ペプチド、マイクロプロテイン、またはペプチド模倣物である、化合物。 - 前記1つ以上のエフェクター部分は、N−ホルミルメチオニンペプチド;N−ホルミルMet−Leu−Phe(fMLF);N−ホルミル−MMYALF(fMMYALF);マンノース;フコース;N−アセチルガラクトサミン;ポリグアニル酸(ポリG);C末端D−メチオニンの群から選択される1つ以上の部分であるかまたはその部分を含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記1つ以上のエフェクター部分はN−ホルミルMet−Leu−Pheである、請求項1に記載の化合物。
- 少なくとも2つのバインダー部分を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記バインダーは以下のペプチド配列のいずれかを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物:CGLIIQKNEC;CNAGESSKNC;Dhb−pLDIK;Dhb−pLDI;WIFPWIQL;WDLAWMFRLPVG;VVISYSMPD;シクロ(RGDfK);RGDfK;RGDWXE;GGHGRVLWPDGWFSLVGISP;YHWYGYTPQNVI;GYTP;YGYTPQ;WYGYTPQN;HWYGYTPQNV;TACHQHVRMVRP;NLLMAAS;DUP−1;HEWSYLAPYPWF;HTFEPGV;シクロ(SRESPHP);SRESPHP;KCCYSL;LTVXPWY;CSDSWHYWC;CSDxxHxWC;EDYELMDLLAYL;シクロ(CVGNDNSSC);CVGNDNSSC;TTPRDAY;VHLGYAT;CSNRDARRC;CXNXDXR(X)/(R)C;SWKLPPS;IAGLATPGWSHWLAL;AWYPLPP;VPWMEPAYQRFL;EPAYQR;KSLSRHDHIHHH;TNSLP;YYGLAEVDAGGS;MQLPLAT;MXXP。
- 前記バインダーは、AWYPLPPまたはMQLPLATまたはYHWYGYTPQNVIKである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記リンカーは、共有結合、エステル結合、アミド結合、ペプチド結合、またはエーテル結合である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記リンカーは合成または半合成ポリマーであり、かつ/または該リンカーは、オリゴペプチド、ポリエチレングリコール、またはポリリジンで構成される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の化合物。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物を含有する医薬組成物。
- 腫瘍の治療用薬物の製造のための請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物の使用。
- 固形腫瘍;リンパ腫;非ホジキンリンパ腫;結腸直腸癌;前立腺癌;結腸癌;甲状腺癌;乳癌;膵臓癌、卵巣癌;濾胞性甲状腺癌腫;未分化甲状腺癌腫、乳癌腫、頸癌腫、前立腺癌腫;腫瘍性血管;肝癌;肝細胞癌;膀胱癌;胃癌の腹膜腫瘍;神経芽細胞腫;黒色腫の群から選択される腫瘍の治療のための請求項10に記載の使用。
- さらに1つ以上の腫瘍の治療用薬物と組み合わせた請求項10または11に記載の使用。
- 化学療法、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントおよび化学的薬剤を含む融合分子と組み合わせた請求項12に記載の使用。
- 腫瘍の治療のための、請求項1〜8のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
- 固形腫瘍;リンパ腫;非ホジキンリンパ腫;結腸直腸癌;前立腺癌;結腸癌;甲状腺癌;乳癌;膵臓癌、卵巣癌;濾胞性甲状腺癌腫;未分化甲状腺癌腫、乳癌腫、頸癌腫、前立腺癌腫;腫瘍性血管;肝癌;肝細胞癌;膀胱癌;胃癌の腹膜腫瘍;神経芽細胞腫;黒色腫の群から選択される腫瘍の治療のための請求項14に記載の組成物。
- さらに1つ以上の腫瘍の治療用薬物と組み合わせた、化学療法、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、または抗体もしくは抗体フラグメントおよび化学的薬剤を含む融合分子と組み合わせた、請求項14または15に記載の組成物。
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