CN111741767A - 抗原-佐剂偶联剂和使用方法 - Google Patents

抗原-佐剂偶联剂和使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及用于将抗原偶联至佐剂的组合物和方法，免疫原性组合物和疫苗。本发明的方法可以用于增加免疫应答，或治疗癌症或传染病。

Description

抗原-佐剂偶联剂和使用方法
政府资金
本发明是在国立卫生研究院授予的拨款号R01 AI125068和UMI AI100663下政府资助下完成。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请
本申请要求美国临时专利申请序列号62/607,691的权益。其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
疫苗接种是旨在诱导针对疫苗中存在的抗原的免疫应答的医学治疗。在过去的一个世纪中，疫苗除了使许多曾经引起世界范围内的高发病率和高死亡率的传染病减少到接近根除外，还已经挽救了数百万人的生命。
限制现有疫苗的活性的一个因素是抗原在宿主中的不充分保留：导致对淋巴结的不良靶向——在那里使免疫应答初免，和针对抗原以免受疾病的不充分应答。在促进抗原免疫原性的策略中的是使疫苗抗原呈颗粒状的策略，使疫苗抗原聚合或乳化的策略，封装疫苗抗原的方法，增加宿主免疫应答的方式，以及将疫苗抗原靶向至抗原呈递细胞的方法(Nossal,1999,In:Fundamental Immunology.Paul(Ed.),Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,Pa.；Vogel and Powell,1995,In:Vaccine Design.The Subunit andAdjuvant Approach.Powell and Newman(Eds.),Plenum Press,NY,N.Y.p.141)。在这些策略中，佐剂在疫苗中的使用是众所周知的。本领域众所周知的常规佐剂在性质上是多种多样的。
佐剂的使用也与不良事件的风险相联系，如在注射部位处的毒性或局部炎症。为了限制这样的不良反应，可以减少免疫原性组合物或疫苗中的表面活性剂和其他组分；然而，该减少则可导致疫苗有效性下降。因此，需要出于有效免疫应答而提供对抗原的充分暴露的新型疫苗组合物组合物和增加所述疫苗的安全性和稳定性的组合物。
发明内容
本公开是至少部分地基于以下令人惊奇的发现：通过抗原与氢氧化铝(alum)之间的相互作用的位点特异性工程化，针对所述抗原的免疫应答得以增强。因此，本公开提供了免疫原性组合物，其用于引发针对感兴趣的抗原的增强的体液免疫，从而提供改进的疫苗。一方面，本公开提供了一种抗原-佐剂复合物，其包含：(a)共价连接至抗原反应性部分的抗原，所述抗原反应性部分偶联至包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分，任选地经由至少一个接头偶联；和(b)金属氢氧化物佐剂(例如，alum)，其中所述抗原经由所述多价佐剂反应性部分的所述羟基置换基团缀合至所述金属氢氧化物佐剂，从而形成抗原-佐剂复合物。在一些方面，抗原经由一个或多个磷酸化氨基酸残基例如一个或多个磷酸丝氨酸(PS)残基缀合至金属氢氧化物佐剂(例如alum)。
因此，在一些方面，本公开提供了一种在受试者中增加对抗原的免疫应答的方法，其中所述抗原被修饰以提供经由一个或多个PS残基与金属氢氧化物佐剂(例如alum)的位点特异性和/或紧密结合。在一些方面，本公开提供了方法和组合物，其包含被修饰以提供经由多价PS肽-聚合物亲和性接头的位点特异性引入与金属氢氧化物佐剂(例如，alum)的紧密结合的抗原，其经历与alum表面的配体交换反应以以位点特异性和/或表面定向方式将抗原锚定在金属氢氧化物佐剂例如alum上。作为这种连接的结果，发现PS-连接的抗原-佐剂复合物在注射部位处存留超过三周，而未经修饰的抗原在数天内被从注射部位清除。本公开的抗原-佐剂复合物提供了相对于在先方法的优点，其依赖于抗原对佐剂的非特异性吸附。抗原与alum颗粒的无规交联也导致对免疫应答不可预测的影响，以及抗原从alum颗粒快速解吸，尽管alum本身在注射部位处保留数周。
虽然不以任何方式被理论束缚，但据信本公开的抗原-佐剂复合物可以以两种方式影响抗原免疫原性：首先，凭借其与alum经由PS连接的紧密结合，本公开的抗原-佐剂复合物随alum颗粒在体内运输，从而使体内疫苗清除的动力学从免疫接种后数天延长至约3周。其次，到达淋巴结的抗原仍然结合alum颗粒，使得B细胞内化，且被alum纳米颗粒上展示的多价阵列的固定化抗原体内刺激。alum通常据信主要起到在注射部位处保留的贮库的作用，并且已知吞噬细胞能够在体外使alum颗粒内化。本公开证明了本公开的颗粒形式的、免疫接种后抗原-佐剂复合物可以在全组织和单细胞水平在淋巴结中检测到。展示抗原的alum颗粒的摄取在增强的B细胞受体交联之外，还对B细胞应答产生多重影响，因为与包含游离蛋白和alum的疫苗组合物的摄取相比，这种抗原获取方式会增加获取的抗原的量。因此，应答性B细胞可以更有能力从滤泡辅助性T细胞接受帮助并表现出增强的细胞内信号传导。因此，本公开提供了通过改变疫苗在淋巴结中的积累的动力学和抗原向免疫细胞的呈递的改变来增强免疫应答的多个方面的组合物和方法。在另一方面，本公开提供了抗原-佐剂复合物，其比吸附至佐剂的未修饰的抗原更缓慢地被体内清除。不受理论的束缚，据信紧密结合的抗原-佐剂复合物形成多价颗粒，其可在体内由B细胞呈递和获得。
如在本文中的工作实施例描述，本公开的抗原-佐剂复合物的施用导致超过20倍的预料不到地增强的生发中心响应，63倍的增加的抗体滴度，以及骨髓中的长寿命浆细胞的增加。
还已经发现，抗原(例如，HIV抗原)经由一个或多个磷酸化氨基酸残基，如一个或多个PS残基，位点特异性缀合至alum，导致alum颗粒上的的定向和展示，以由此增强针对该中和性表位的抗原特异性免疫应答。因此，该发现提供了一种策略以克服引发针对病毒进入受体的充分保护性或广泛中和性免疫的挑战。当前疫苗方法的问题是它们含有可溶形式的env蛋白抗原，其暴露了env蛋白的非天然表面。作为非限制性实例，HIV Env蛋白的三聚体基部是用于引发保护性或中和性免疫的无关靶标。用可溶性env蛋白疫苗组合物进行免疫接种后，免疫显性基础引导的抗体应答干扰保护性、中和性抗体的诱导。本公开的抗原-佐剂复合物提供了通过在抗原上位点特异性引入alum结合PS修饰来克服该挑战的方法。抗原的定向取向确保中和性表位暴露于免疫细胞，从而提供一种引发广泛中和性抗体，同时掩蔽抗原上的非中和性免疫显性表面的策略。
另外，将HIV三聚体定向锚定在alum颗粒上，通过阻断三聚体的免疫原性基部而改变了体液应答的免疫显性模式。因此，本公开提供了增强针对亚单位疫苗的体液免疫的多个方面的普遍适用的策略。
因此，一方面，本公开提供了包含抗原和金属氢氧化物佐剂的抗原-佐剂复合物。所述抗原共价连接至抗原-反应性部分，其偶联至包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分，任选地通过至少一个接头偶联。当多价佐剂反应性部分的羟基置换基团缀合至金属氢氧化物佐剂时，形成抗原-佐剂复合物。
在另一个方面，构成抗原-佐剂复合物的抗原反应性部分是巯基反应性部分。在另一个方面，抗原-佐剂复合物的巯基反应性部分是马来酰亚胺。在另一个方面，抗原-佐剂复合物的多价佐剂反应性结构部分包含3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19、20个或更多个羟基置换基团。另一方面，多价抗原的羟基置换基团选自氟化物基团，柠檬酸根基团，磷酸根基团，碳酸根基团和硫酸根基团。在另一个实施方式中，羟基置换基团是磷酸根基团。在另一个实施方式中，羟基置换基团包含至少一个磷酸化氨基酸残基。在另一个实施方式中，磷酸化氨基酸残基是磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸或磷酸苏氨酸。
在另一个方面，抗原佐剂复合物包含共价连接至抗原反应性部分的抗原，所述抗原反应性部分通过至少一个接头偶联至多价佐剂反应性部分，其包含两个或更多磷酸丝氨酸，于是抗原-佐剂复合物是由经由多价佐剂反应性部分的磷酸丝氨酸残基与金属氢氧化物佐剂偶联的抗原形成。
在又一个实施方式中，形成抗原-佐剂复合物的金属氢氧化物佐剂是氢氧化铝，磷酸铝，氢氧化钙，磷酸钙，氢氧化铁，氢氧化镁，氢氧化钡，氢氧化钙，氢氧化锌或氢氧化锆。
在又一个实施方式中，抗原-佐剂复合物包含具有至少一个包含2-12个磷酸丝氨酸残基的接头的抗原，并且该抗原通过磷酸丝氨酸残基缀合至alum。在又一个实施方式中，抗原包含至少一个包含缀合至alum的2-8个磷酸丝氨酸的接头。在另一个实施方式中，抗原包含至少一个接头，该接头包含缀合至alum的2-4个磷酸丝氨酸。
在另一个方面，形成抗原-佐剂复合物的抗原选自癌抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原，或者真菌抗原。
在另一方面，抗原是病毒抗原。在另一个实施方式中，病毒抗原是HIV抗原，工程化HIV抗原，或工程化HIV包膜蛋白或其片段。
在另一方面，本公开提供了一种免疫原性组合物，其包含所公开的抗原-佐剂复合物和另外的佐剂。
在另一方面，本公开提供了一种通过向受试者施用包含缀合的抗原-佐剂复合物的免疫原性组合物来增加抗原在施用部位处的保留的方法。
在另一个实施方式中，缀合的抗原-佐剂复合物的抗原在注射部位处存留至少一周。在另一个实施方式中，抗原在注射部位处存留至少三周。
在又一个实施方式中，本公开提供了通过向受试者施用包含本文公开的缀合的抗原-佐剂复合物的免疫原性组合物来确保将抗原连续释放至受试者的引流淋巴结的方法。
在本公开的另一方面，抗原-佐剂复合物形成多价颗粒聚集体。在又一个方面，所述多价颗粒聚集体是纳米颗粒或纳米晶体。
在另一方面，抗原-佐剂复合物的施用导致体内免疫细胞摄取抗原-佐剂复合物。
在另一个实施方式中，摄取抗原-佐剂复合物的免疫细胞是抗原特异性B细胞。在本公开的另一方面，抗原-佐剂复合物的施用导致增强的对抗原的免疫应答。在另一个方面中，所述免疫应答是通过增加的抗体滴度增强。在另一个实施方式中，与来自未缀合的抗原-佐剂组合物的施用的抗体滴度相比，抗体滴度增强至少20倍。在另一个实施方式中，通过中和性抗体滴度的增加来测量免疫应答的增强。在本发明的另一方面，抗原-佐剂复合物的施用导致通过抗体分泌B细胞的数量的增加来测量的增强的免疫应答。在另一方面，数量增加的B细胞是骨髓浆细胞。在另一个实施方式中，缀合的抗原-佐剂复合物的施用导致与来自未缀合的抗原-佐剂组合物的施用的抗体分泌B细胞的数量相比，抗体分泌B细胞的数量增加16倍。在另一个实施方式中，缀合的抗原-佐剂复合物的施用导致抗原特异性生发中心B细胞的数量增加。
在另一个实施方式中，抗原-佐剂复合物包含HIV包膜蛋白或其片段，其经由至少一个包含2-12个磷酸丝氨酸残基的接头缀合至alum。在另一方面，HIV包膜抗原-佐剂复合物是经由至少一个包含2-10个磷酸丝氨酸残基，2-6个磷酸丝氨酸残基或2-4个磷酸丝氨酸残基的接头缀合至alum。在另一方面，HIV包膜抗原-佐剂复合物包含通过位点特异性缀合至佐剂表面而固定的HIV包膜蛋白，并且这种固定能够选择性地将HIV包膜表位呈递给免疫细胞。
在另一个方面，本公开提供了通过向受试者施用包含抗原-佐剂复合物的免疫原性组合物，引导在受试者中的免疫应答的特异性的方法，其中所述抗原的一个或多个表位通过所述抗原经由多价佐剂反应性部分上的羟基置换基团而位点特异性缀合至佐剂表面而被掩蔽。
在另一个实施方式中，具有掩蔽的表位的抗原-佐剂复合物的施用导致免疫应答被引导至所述抗原上的未被掩蔽的表位，从而引起一种或多种保护性中和性抗体。在又一个实施方式中，抗原-佐剂复合物的施用，其中HIV包膜三聚体基部通过HIV三聚体在alum颗粒上的位点特异性缀合而被掩蔽，导致引导免疫应答离开引发非中和性抗体。
本公开还提供了可用于将抗原吸附至佐剂的试剂，其中所述试剂提供了包含多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分。另外，本公开至少部分基于以下发现：可以使用包含经由多价佐剂反应性部分吸附至佐剂的抗原的免疫原性组合物来增强抗原的免疫原性。
因此，一方面，本公开提供了抗原-佐剂偶联剂，其中所述抗原-佐剂偶联剂包含抗原反应性部分，包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分，和任选地，具有至少一个接头，其中所述抗原反应性部分任选地通过所述至少一个接头可操作地连接至所述多价佐剂反应性部分，其中所述抗原反应性部分与抗原上存在的反应性基团共价结合，并且其中所述多价佐剂反应性部分与佐剂中存在的两个或更多个羟基基团相互作用，从而将抗原偶联至佐剂。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含巯基反应性部分。在一些实施方式中，巯基反应性部分是马来酰亚胺。
在一些实施方式中，反应性基团是巯基。
在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含3-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13，12-14、13-15、14-17、15-18、16-20或更多个羟基置换基团。在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个羟基置换基团。在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含约3-10，约3-15或约3-20个羟基置换基团。在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含3个羟基置换基团。在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含4个羟基置换基团。在一些实施方式中，多价佐剂反应性部分包含5个羟基置换基团。
在一些实施方式中，羟基置换基团选自氟化物基团，柠檬酸根基团，磷酸根基团，碳酸根基团和硫酸根基团。在一些实施方式中，羟基置换基团是磷酸根基团。在一些实施方式中，羟基置换基团包含磷酸化氨基酸残基。在一些实施方式中，磷酸化氨基酸残基选自磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸。在一些实施方式中，磷酸化氨基酸残基是磷酸丝氨酸。
在一些实施方式中，抗原-佐剂偶联剂包含至少一个接头。在一些实施方式中，所述至少一个接头是聚乙二醇。
在一些实施方式中，佐剂是金属氢氧化物佐剂。在一些实施方式中，金属氢氧化物佐剂选自氢氧化铝，磷酸铝，氢氧化钙，磷酸钙，氢氧化铁，氢氧化镁，氢氧化钡，氢氧化钙，氢氧化锌和氢氧化锆。
在另一方面，本公开提供了一种免疫原性组合物，其包含抗原-佐剂偶联剂，抗原，和任选地，金属氢氧化物佐剂，其中所述试剂共价连接至抗原，并且其中所述抗原经由所述试剂偶联至当存在时的所述金属氢氧化物佐剂，从而形成抗原-佐剂复合物。在一些实施方式中，抗原经由试剂吸附至金属氢氧化物佐剂的表面，从而形成抗原-佐剂复合物。在一些实施方式中，佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
在一些实施方式中，抗原选自癌症抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原和真菌抗原。在一些实施方式中，抗原是病毒抗原。在一些实施方式中，病毒抗原是HIV抗原。在一些实施方式中，HIV抗原是gp120或gp140。在一些实施方式中，病毒抗原是工程化HIV抗原。在一些实施方式中，工程化HIV抗原是eOD。在一些实施方式中，工程化HIV抗原是SOSIP。
在一些实施方式中，抗原相对于佐剂表面定向，并且其中抗原的定向阻断或抑制免疫系统对一种或多种表位的识别。在一些实施方式中，抗原相对于佐剂的定向广泛增加中和性抗体滴度。
在另一方面，本公开提供了疫苗，其包含本文所述的免疫原性组合物，和任选地，第二或另外的佐剂。
在一些方面，本公开的抗原-佐剂复合物以颗粒形式递送。本公开的复合物和方法广泛地适用于多样化的亚单位疫苗并提供颗粒状疫苗制剂。当前策略将抗原配制成多价、亚微米颗粒形式以增强B细胞受体交联。然而，候选疫苗的颗粒制剂通常采用病毒样颗粒的形式，其必须针对每种抗原进行专门设计。因此，本公开提供了以多价、颗粒形式配制抗原-佐剂复合物的改进的组合物和方法。在另一方面，本公开提供了获得亚微米、多价颗粒疫苗的方法。
在另一方面，本公开提供了包含经由PS连接结合的抗原-佐剂复合物的多价颗粒疫苗，其被呈递给免疫细胞并被其内化。在一些实施方式中，抗原-佐剂复合物包含为纳米颗粒或纳米晶体的多价颗粒聚集体。
在另一方面，本公开提供了用于增加抗原在受试者中在施用部位处的保留的方法，所述方法包括施用本文所述的疫苗。在另一方面，本公开提供了一种用于将抗原连续释放至受试者的引流淋巴结的方法，所述方法包括施用本文所述的疫苗。在一个实施方式中，抗原佐剂以多价、颗粒状聚集体形式呈递给B细胞。在另一个实施方式中，抗原佐剂在施用部位处的保留持续数周。在另一方面，本公开提供了一种用于在有需要的受试者中治疗癌症或传染性疾病的方法，所述方法包括施用本文所述的疫苗，从而治疗所述受试者。在另一方面，本公开提供了一种用于增加受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括施用本文所述的疫苗。在另一方面，本公开提供了一种用于增加受试者中的抗原特异性抗体分泌B细胞的方法，所述方法包括施用本文所述的疫苗。在另一方面，本公开提供了一种用于增加骨髓浆细胞的方法。在另一方面，本公开提供了用于增加生发中心B细胞的方法。
在另一方面，本公开提供了编码本文所述抗原的核酸分子。在另一方面，本公开提供了重组表达载体，其包含编码本文所述抗原的核酸分子。在另一方面，本发明提供了用重组表达载体转化的宿主细胞，所述重组表达载体包含编码本文所述抗原的核酸分子。
在另一个方面，本发明提供了一种制造本文所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：提供包含编码抗原的核酸序列的宿主细胞；在其中表达所述抗原的条件下维持所述宿主细胞；获得所述抗原；在试剂共价连接至所述抗原的条件下，使所述抗原与抗原-佐剂偶联剂接触；获得共价连接至所述试剂的所述抗原；任选地，将所述抗原偶联或吸附至佐剂。
附图说明
本专利或申请文件包含以彩色执行的至少一个附图。专利局将在请求和支付必要费用时，提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本。
图1A提供了描述包含磷酸丝氨酸的马来酰亚胺-磷酸丝氨酸偶联剂的化学结构的示意图，以及包含溶剂暴露的游离巯基(-SH)的蛋白质抗原的示意图。图1B提供了描述马来酰亚胺-磷酸丝氨酸偶联剂的化学结构的示意图，其中马来酰亚胺部分经由硫醚键与包含蛋白质抗原的巯基共价连接。图1C提供了大体上描绘当偶联或吸附至alum时偶联剂-抗原缀合物的结合和定向的示意图。图1D提供了线图，其显示了模型蛋白细胞色素c在alum上的吸附，作为蛋白浓度的函数，如通过280nm处的蛋白UV吸收所确定的。
图2A提供了具有相等肽长度的肽接头的图示，其包含连接至4个磷酸丝氨酸或3个丝氨酸和1个磷酸丝氨酸的叠氮化物官能团。图2B提供了描绘结合至alum的蛋白质的荧光光谱的线图。肽接头通过无铜点击化学以一定范围的每蛋白质总接头与DBCO修饰的藻红蛋白(PE)偶联。将PS/Ser缀合的PE(5μg/mL)与铝胶(50μg/mL)混合30分钟，然后添加含有10％小鼠血清的培养基24小时。通过荧光光谱法评估该孵育后结合至alum的蛋白质。(n＝3个样品/组)。
图3提供了条形图，显示了荧光光谱，用于测量在未修饰的或PS缀合的荧光eOD蛋白(10μg/mL)与铝胶(100μg/mL)混合30分钟，然后在含10％小鼠血清的PBS中孵育24小时后，保持结合至alum的蛋白。
图4提供了描绘在基部处与包含磷酸丝氨酸的多价偶联剂缀合的SOSIP三聚体的示意图。
图5提供了柱状图，其显示了通过ELISA测定的在24小时后在血清存在下从alum中释放的SOSIP抗原的分数。
图6A提供了游离抗原的潜在释放相比于抗原展示alum颗粒在注射部位处的释放的示意图。图6B提供了在存在或不存在alum(10μg/mL)的情况下，在与eOD(50nM)一起孵育后约50秒，荧光报告基因在表达glVRC01的人B细胞中的钙信号传导测量的线图。图6C提供了表达glVRC01的B细胞的荧光图像，所述B细胞与荧光Ser4-eOD(50nM)和荧光团标记的alum一起孵育1小时，然后通过共聚焦显微镜成像。(比例尺＝10μm)。图6D提供了表达glVRC01的B细胞的荧光图像，所述B细胞与荧光PS8-eOD(50nM)和荧光团标记的alum一起孵育1小时，然后通过共聚焦显微镜成像。(比例尺＝10μm)。图6E提供了与alum和PS8-eOD一起孵育1小时后Ramos B细胞的TEM截面图(比例尺为200nm)。
图7A提供了在注射吸收至佐剂的荧光标记的eOD抗原后，由IVIS确定的小鼠的假彩色图像。将荧光团标记的eOD或PS4-eOD(10μg蛋白)与铝胶(alum，100μg)或磷酸铝佐剂(alumP，100μg)混合，并皮下注射到BALB/c小鼠中(n＝4只动物/组)，然后在注射部位处对荧光进行纵向全动物IVIS成像。图7B提供了线图，其显示在注射吸收至佐剂alum(Al-OH3)或磷酸铝(Al-P)的荧光标记的eOD抗原后跟踪24天的来自小鼠的荧光信号，如通过IVIS测定并表达作为标准化总辐射。
图8A提供了条形图，显示了在25天内测量的曲线下的总荧光面积。将与含有2-8个PS残基的接头缀合的荧光团标记的eOD蛋白与铝胶混合，注射到BALB/c小鼠中，然后如图7A那样随时间对注射部位进行IVIS成像(n＝4只动物/组)。***，p<0.001，通过单向方差分析，然后是Tukey的后检验。图8B提供了如图7那样来自注射有PS4-eOD/alum的BALB/c小鼠(n＝3只动物/组)的代表性组织学切片。注射后8天将小鼠处死，并通过组织学和morin染色分析免疫接种部位以检测alum。显示的是来自接受PS4-eOD的动物的代表性注射部位横截面。Morin为紫色，eOD-AF647为青色，明场为灰色(比例尺：1mm)。
图8C提供了如图7A那样来自注射eOD/铝的BALB/c小鼠的代表性组织学切片。显示的是来自接受eOD的动物的代表性注射部位横截面。Morin为紫色，eOD-AF647为青色，明场为灰色(比例尺：1mm)。
图9A提供了通过无铜点击化学合成的IR680-PS4缀合物的结构。图9B显示了将IR680-PS4缀合物单独或与alum一起孵育30分钟，然后添加10％小鼠血清，并将溶液在37℃孵育72小时后的上清液荧光的条形图。数据表示离心去除结合alum的任何残留染料后上清液的荧光测量结果。其他染料(Cy3-DBCO和AlexaFluor488-DBCO)以相同的方式缀合。
图10A提供了显示在连续时间点在切除的dLN中测得的总荧光的线图。用与50μgIR680标记的alum混合的5μg IR800染料标记的Ser4-eOD去免疫BALB/c小鼠组(n＝5/组)。图10B提供了显示在连续时间点在切除的dLN中测得的总荧光的线图。用与50μg IR680标记的alum混合的5μg IR800染料标记的PS8-eOD去免疫BALB/c小鼠组(n＝5/组)。图10C提供了条形图，其反映了幼稚小鼠和经皮下免疫的小鼠的腹股沟淋巴结中铝的ICP-MS测量。从免疫接种后第3天和第8天收集的淋巴结进行测量。
图11A提供了过继转移实验的时间表。用1×106GFP+CTV+VRC01gHL B细胞过继转移C57BL/6小鼠(n＝5-6/组)，然后用5μg AF647标记的Ser4-eOD5或PS8-eOD5与100μgalum一起进行腹膜内免疫。图11B提供了来自脾脏的VRC01gHL B细胞的流式细胞术分析，显示了AF647标记的eOD-GT5的摄取。虚线表示未免疫对照中的背景信号。图11C提供了反映VRC01gHL细胞上的eOD-AF647荧光定量的线图。图11D提供了通过CD86表达评估的VRC0gHL细胞激活的流式细胞术分析。图11E提供了反映VRC01gHL细胞的eOD-AF647荧光强度的条形图。来自两个独立实验的合并结果(或代表性数据)。图11F提供了反映VRC01gHL细胞的alum-AF488荧光强度的条形图。来自两个独立实验的合并结果(或代表性数据)。
图12A提供了用10μg AF647标记的PS8-eOD-GT8和100μg Cy3-PS4标记的alum进行腹膜内免疫的小鼠的脾脏切片的荧光分析(左比例尺＝1mm，中比例尺和右比例尺＝100μm)。图12B提供了用10μg AF647标记的Ser4-eOD-GT8和100μg Cy3-PS4标记的alum进行腹膜内免疫的小鼠的脾脏切片的荧光分析(左比例尺＝1mm，中间和右侧比例尺＝100μm)。图12C提供了用1×106CTV+VRC01gHL细胞过继转移并用5μg AF647标记的Ser4-eOD-GT8或PS8-eOD-GT8和100μgalum免疫的C57BL/6小鼠(n＝4-8/组)的CD86表达的线图。图12D提供了用1×106CTV+VRC01gHL细胞过继转移并用5μg AF647标记的Ser4-eOD-GT8或PS8-eOD-GT8和100μgalum免疫的C57BL/6小鼠(n＝4-8/组)的分开的CTVlo VRC01gHL细胞的线图。
图13A提供了用10μg AF647标记的PS8-eOD-GT8与alum进行腹膜内免疫后第2天的脾B细胞的TEM切片。从脾脏中分选GFP+AF647+VRC01gHL B细胞，固定，染色和切片用于TEM成像。(比例尺为200nm)。陈述分析的实验和细胞的数量。图13B提供了用10μg AF647标记的PS8-eOD-GT8与alum进行腹膜内免疫后第2天的脾B细胞的TEM切片。从脾脏分选GFP–AF647–内源性B细胞，固定，染色并切片用于TEM成像。(比例尺为200nm)。
图14A提供了显示在第0天初次注射和在第21天二次注射吸收有单独或与包含四种磷酸丝氨酸(SOSIP-PS4)的偶联剂缀合的SOSIP抗原的alum后第63天，小鼠中抗SOSIP抗体滴度的图，如通过ELISA测定的。图14B提供了线图，显示了在0和21天注射吸收有单独或与包含四种磷酸丝氨酸(SOSIP-PS4)的偶联剂缀合的SOSIP抗原的alum的小鼠中随时间的抗SOSIP抗体滴度，如通过ELISA法测定的。
图15A提供了注射吸收到佐剂(铝)并结合另外的佐剂
Figure BDA0002640845780000131
的荧光标记的SOSIP抗原后，小鼠的假彩色图像，如通过IVIS确定的。图15B提供了线图，其显示了来自在注射吸收至佐剂的荧光标记SOSIP抗原后25天跟踪的小鼠的荧光信号，如通过IVIS确定并表示为标准化总辐射。图15C提供了显示单次初次注射吸收有单独或与包含四种磷酸丝氨酸(SOSIP-PS4)的偶联剂缀合或与另外的佐剂
Figure BDA0002640845780000132
组合的SOSIP抗原的alum后第56天小鼠中抗SOSIP抗体滴度如所示随时间的图，如通过ELISA确定的。
图16提供了显示在注射alum(Al-OH3)后4周的小鼠中抗eOD抗体滴度的图，所述alum与用不包含磷酸丝氨酸(eOD-PS0)，一个磷酸丝氨酸(OD-PS1)，两个磷酸丝氨酸(eOD-PS2)和四个磷酸丝氨酸(eOD-PS4)的偶联剂缀合的eOD抗原偶联，如通过ELISA测定的。
图17提供了来自用与5μg eOD(有或没有PS修饰)混合的50μgalum进行免疫的BALB/c小鼠(n＝5/组)的血清IgG滴度的点状图。在第6周通过ELISA分析血清IgG滴度。
图18A提供了从用5μg eOD(有或没有PS接头)，50μgalum和5μg皂苷佐剂免疫的BALB/c小鼠(n＝5/组)随时间分析的IgG滴度。图18B提供了在第6周从通过皮下或肌内途径用50μgalum和5μg eOD进行免疫的BALB/c小鼠(n＝5/组)收集的血清IgG滴度。图18C提供了如图18A中那样在免疫接种后3个月的代表性ELISPOT孔和条形图，通过ELISPOT测定来自骨髓的eOD特异性抗体分泌细胞。图18D提供了通过皮下途径用5μg eOD和50μgalum免疫BALB/c小鼠(n＝5/组)后第9天dLN的生发中心应答的流式细胞术分析。显示的是代表性流式细胞仪图。图18E提供了平均GC B细胞频率的条形图。图18F提供了结合AF647标记的eOD的GC B细胞的代表性直方图。图18G提供了反映结合AF647标记的eOD的GC B细胞的频率的条形图。**，p<0.01；***，p<0.001，通过单向方差分析，然后是Tukey的后检验。
图19A提供了随时间从BALB/c小鼠(n＝5/组)收集的血清IgG滴度，所述小鼠在第0天和第21天用与50μgalum混合的5μg SOSIP(有或没有PS修饰)进行免疫。**p<0.01，*p<0.05，通过双向方差分析，然后是Bonferroni的后检验。图19B提供了来自如图19A所述免疫的个体小鼠的第63天滴度。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过学生t检验。图19C提供了随时间从BALB/c小鼠(n＝10/组，从两次独立免疫接种合并)收集的血清IgG滴度，所述小鼠用与50μgalum和5μg皂苷佐剂混合的5μg SOSIP或SOSIP-PS4进行免疫。**p<0.01，*p<0.05，通过双向方差分析，然后是Bonferroni的后检验。图19D提供了如图19C所述免疫的个体小鼠的第6周滴度。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过学生t检验。图19E提供了来自按图19C所述免疫的个体小鼠在3个月时对抗体分泌细胞的骨髓ELISPOT分析的示例性ELISPOT孔。图19F提供了来自每个免疫接种组的个体和平均三聚体特异性IgG生产细胞。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过学生t检验。
图20A提供了线图，显示了在存在和不存在SOSIP基部结合抗体12N的情况下，来自免疫小鼠血清的SOSIP特异性IgG抗体的ELISA曲线的吸光度值。将用SOSIP包被的ELISA板与12N抗体一起孵育，然后添加来自免疫小鼠的血清，其稀释度如x轴所示。在第72天从小鼠获得血清，所述小鼠在第0天和第28天接受alum，
Figure BDA0002640845780000151
和单独或与包含四个磷酸丝氨酸(SOSIP-PS4)的偶联剂缀合的SOSIP抗原的免疫接种。图20B提供了描述添加12N抗体后剩余的ELISA信号的百分比的柱状图。ELISA信号的百分比表示在存在12N抗体的情况下图19A中来自ELISA信号的曲线下面积(AUC)与在不存在12N的情况下的AUC的比率(***表示p<0.001)。
图21A提供了VRC01包被的ELISA板上捕获的SOSIP三聚体(1)，VRC01包被的ELISA板上捕获的SOSIP-PS4(2)，或alum包被的ELISA板上捕获的SOSIP-PS4(3)的抗原性分析的图示。显示的是以0.1μg/mL添加的指定单克隆抗体的结合的原始ELISA吸光度。BALB/c小鼠在第0和21天用与50μgalum混合的2μg SOSIP或SOSIP-PS4免疫。图21B提供了在存在或不存在20μg/mL竞争性基部结合单克隆抗体Ab的情况下评估的第63天SOSIP特异性IgG的原始ELISA稀释曲线。图21C提供了在基部阻断Ab的存在下的ELISA信号的曲线下面积的柱状图(标准化到在不存在基部阻断Ab的情况下的AUC)。图21D提供了第63天通过ELISA评估的His标记特异性IgG滴度的点图分析。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过学生t检验。图21E提供了第63天通过ELISA评估的SOSIP gp120特异性IgG滴度的点图分析。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001，通过学生t检验。
具体实施方式
本公开提供了用于引起针对感兴趣的抗原的增强的体液免疫的免疫原性组合物，从而提供了改进的疫苗。一方面，本公开提供了一种抗原-佐剂复合物，其包含：(a)共价连接至抗原反应性部分的抗原，所述抗原反应性部分偶联至包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分，任选地经由至少一个接头偶联；和(b)金属氢氧化物佐剂(例如，alum)，其中所述抗原经由所述多价佐剂反应性部分的所述羟基置换基团缀合至所述金属氢氧化物佐剂，从而形成抗原-佐剂复合物。在一些方面，抗原经由一个或多个磷酸化氨基酸残基例如一个或多个磷酸丝氨酸(PS)残基缀合至金属氢氧化物佐剂(例如alum)。
定义
除非另有说明，否则权利要求和说明书中使用的术语定义如下。
必须注意，在说明书和所附权利要求书中使用的单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数对象，除非上下文另外明确指出。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。
如本文中所使用的，“约”将被普通技术人员理解并且将在一定程度上根据其使用的上下文而变化。如果在给定使用上下文的情况下存在对普通技术人员而言不清楚的术语使用，则“约”表示特定值的正负10％。
如本文所用，术语“佐剂”是指当与特定抗原组合使用时起增强和/或引导抗原特异性免疫应答的作用的任何物质。当与疫苗抗原结合时，佐剂与单独疫苗抗原诱导的应答相比增加疫苗抗原的免疫应答。佐剂有助于驱动免疫学机制，并塑造针对疫苗抗原的输出免疫应答。
如本文所用，术语“佐剂-抗原复合物”用于指共价连接至抗原-佐剂偶联剂的抗原，其中与偶联剂连接的抗原通过配体交换被吸附至金属氢氧化物佐剂以形成复合物。
如本文中所使用的，术语“掩蔽(mask)”是指通过将抗原固定到佐剂表面实现的阻断。在一些实施方式中，在抗原与佐剂的定点缀合期间，将PS-接头添加至抗原上的限定残基，并因此控制抗原相对于alum颗粒的定向。因此，位于与alum颗粒表面并置的表位被其与alum的接近程度遮蔽。因此，被掩蔽的表位不展示给免疫系统，也不会引发免疫应答。
确定表位是否被掩蔽的方法是本领域技术人员已知的。例如，这样的方法包括，但不限于，在竞争性ELISA中用结合感兴趣表位的抗体测试从免疫方案得到的血清，或等离振子共振测定法，如Biacore，或者评价与野生型抗原的结合相比，样品与缺少感兴趣的表位的突变抗原的结合。
如本文所用，术语“纳米晶体”是指尺寸小于100nm的亚微米晶体颗粒。在一些实施方式中，当纳米晶体形成聚集体时，聚集体的尺寸可以超过100nm。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指尺寸小于100nm的亚微米颗粒。在一些实施方式中，当纳米颗粒形成聚集体时，聚集体的尺寸可以超过100nm。
如本文中所使用的，术语“聚集体”是指非无定形簇或颗粒的集合，如由电子显微镜确定。
如本文所用，术语“丙氨酸扫描”是指用于确定特定野生型残基对给定蛋白质或多肽的稳定性或功能(例如，结合亲和力)的贡献的技术。该技术包括用丙氨酸残基取代多肽中的野生型残基，然后评估丙氨酸取代的衍生物或突变多肽的稳定性或功能(例如结合亲和力)，并与野生型多肽进行比较。用丙氨酸替代多肽中的野生型残基的技术是本领域已知的。
术语“改善”是指在疾病状态例如癌症的治疗中的任何治疗有益的结果，包括预防，减轻其严重程度或进展，缓解或治愈。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢，羧基，氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然氨基酸相似的方式起作用的化合物。
氨基酸在本文中可以用它们众所周知的三个字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码表示。
如本文所用，“氨基酸置换”是指用第二个不同的“置换”氨基酸残基替换预定氨基酸序列(起始多肽的氨基酸序列)中的至少一个现有氨基酸残基。“氨基酸插入”是指将至少一种另外的氨基酸掺入预定的氨基酸序列中。尽管该插入通常将由一个或两个氨基酸残基的插入组成，但是也可以进行较大的“肽插入”，例如，插入约三至约五个或甚至多达约十，十五或二十个氨基酸残基。如上所述，插入的残基可以是天然存在的或非天然存在的。“氨基酸缺失”是指从预定的氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基。
如本文所用，术语“拮抗剂”是指部分或完全阻断，抑制或中和本文所公开的天然多肽的生物学活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括拮抗剂抗体或抗体片段，天然多肽，肽，反义寡核苷酸，有机小分子等的片段或氨基酸序列变体。在一些实施方式中，在剂量依赖性下观察到在拮抗剂存在下的抑制作用方式。在一些实施方式中，在可比条件下，所测量的信号(例如，生物活性)比用阴性对照测量的信号低至少约5％，至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，至少约30％，至少约35％，至少约40％，至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％或至少约100％。本文还公开了鉴定适用于本公开的方法的拮抗剂的方法。例如，这些方法包括但不限于结合测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)，Forte
Figure BDA0002640845780000191
系统和放射免疫测定(RIA)。这些测定法确定拮抗剂结合感兴趣的多肽(例如，受体或配体)的能力，并因此表明拮抗剂抑制、中和或阻断多肽活性的能力。拮抗剂的功效也可以使用功能测定法来确定，例如拮抗剂抑制多肽或激动剂功能的能力。例如，功能测定可包括使多肽与候选拮抗剂分子接触并测量通常与该多肽相关的一种或多种生物活性的可检测变化。拮抗剂的效力通常由其IC50值(抑制50％的激动剂反应所需的浓度)定义。IC50值越低，拮抗剂的效力越大，抑制最大生物学反应所需的浓度也越低。
如本文所用，术语“抗体”是指包含两个轻链多肽和两个重链多肽的完整抗体。完整抗体包括不同的抗体同种型，包括IgM，IgG，IgA，IgD和IgE抗体。术语“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合或嵌合抗体，人源化抗体，灵长类抗体，脱免疫抗体和全人源抗体。抗体可以在多种物种中制成，或衍生自多种物种，例如哺乳动物，例如人类，非人类灵长类动物(例如猩猩，狒狒或黑猩猩)，马，牛，猪，绵羊，山羊，狗，猫，兔子，豚鼠，沙鼠，仓鼠，大鼠和小鼠。抗体可以是纯化的或重组的抗体。
如本文所用，术语“抗原制剂”或“抗原组合物”或“免疫原性组合物”是指当施用于脊椎动物，尤其是哺乳动物时，将诱导免疫应答的制剂。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞使用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的示例包括但不限于树突状细胞(DC)，外周血单核细胞(PBMC)，单核细胞(例如THP-1)，B淋巴母细胞(例如C1R.A2、1518B-LCL)和单核细胞衍生的树突状细胞(DC)。一些APC通过吞噬作用或受体介导的内吞作用使抗原内化。
术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原并使它们能够被T细胞识别的过程，例如作为MHC-1和/或MHC-II缀合物的组分。
如本文所用，术语“抗原反应性部分”是指包含反应性或官能团的化学部分，其通过自发地或在与催化剂或刺激物(例如光)接触而激活后直接与之反应而靶向包含抗原的多肽的可及反应性或官能性基团或包含连接于包含抗原的多肽的侧基(例如寡糖)的反应性或官能性基团，以产生共价键。
如本文所用，术语“癌症特异性免疫应答”是指由肿瘤，癌细胞或癌症抗原的存在诱导的免疫应答。在某些实施方式中，反应包括癌症抗原特异性淋巴细胞的增殖。在某些实施方式中，应答包括抗体和T细胞受体的表达和上调以及淋巴因子，趋化因子和细胞因子的形成和释放。先天和后天免疫系统都相互作用，以启动针对肿瘤，癌细胞或癌症抗原的抗原反应。在某些实施方式中，癌症特异性免疫应答是T细胞应答。
术语“癌”是本领域公认的，是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌，胃肠道系统癌，泌尿生殖系统癌，睾丸癌，乳腺癌，前列腺癌，内分泌系统癌和黑色素瘤。本文所述的抗CD137抗体和靶向肿瘤抗原的抗体可用于治疗患有，怀疑患有或可能具有发展为包括肾癌或黑素瘤的任何类型的癌症的高风险的患者。示例性癌包括由子宫颈，肺，前列腺，乳腺癌，头颈癌，结肠癌和卵巢癌形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。
如本文所用，术语“竞争物”当用于竞争结合相同表位的抗原结合蛋白(例如，免疫球蛋白，抗体或其抗原结合片段)的上下文中时，是指通过测定法(例如竞争性结合测定法；交叉阻断测定法)确定的抗原结合蛋白质之间的相互作用，其中测试抗原结合蛋白(例如测试抗体)抑制(例如减少或阻断)参考抗原结合蛋白(例如参考抗体)与共同抗原的特异性结合。
如本文所用，术语“交联”是指化学结合或连接两个或更多个分子的过程，涉及其中形成共价键的反应。
“衍生自”指定多肽或蛋白质的多肽或氨基酸序列是指该多肽的来源。优选地，衍生自特定序列的多肽或氨基酸序列具有与该序列或其部分基本上相同的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸，优选地至少20-30个氨基酸，更优选至少30-50个氨基酸组成，或本领域普通技术人员可以确定在序列方面具有其起源。衍生自另一种肽的多肽相对于起始多肽可具有一个或多个突变，例如，一个或多个氨基酸残基已被另一种氨基酸残基取代或具有一个或多个氨基酸残基插入或缺失。
多肽可包含非天然存在的氨基酸序列。这样的变体必然与起始分子具有小于100％的序列同一性或相似性。在某些实施方式中，变体将具有与起始多肽的氨基酸序列约75％至小于100％的氨基酸序列同一性或相似性的氨基酸序列，更优选约80％至小于100％，更优选为约85％至小于100％，更优选为约90％至小于100％(例如91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％)，最优选约95％至小于100％，例如，在变体分子的长度上。
在某些实施方式中，起始多肽序列和从其衍生的序列之间存在一个氨基酸差异。相对于该序列的同一性或相似性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入缺口获得最大的序列同一性百分比之后，候选序列中与起始氨基酸残基相同(即相同残基)的氨基酸残基的百分比。在某些实施方式中，多肽由选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的序列的氨基酸序列组成，基本上由其组成或包含该氨基酸序列。在某些实施方式中，多肽包含与SEQID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，多肽包含与选自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的连续氨基酸序列具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的同一性连续氨基酸序列。在某些实施方式中，多肽包括具有氨基酸序列的至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200，300、400或500(或这些数字内的任何整数)个连续氨基酸的氨基酸序列。
在某些实施方式中，本公开的抗原由核苷酸序列编码。本发明的核苷酸序列可用于许多应用，包括：克隆，基因治疗，蛋白质表达和纯化，突变导入，需要其的宿主的DNA疫苗接种，用于例如被动免疫的抗体产生，PCR，引物以及探针生成等。
本领域普通技术人员还将理解，适用于本文公开的方法的抗原可以被改变，使得它们的序列与它们所衍生的天然存在或天然序列在序列上有所不同，同时保留了天然序列的期望活性。例如，可以进行导致保守置换或“非必需”氨基酸残基改变的核苷酸或氨基酸置换。可以通过标准技术引入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。
适用于本文公开的方法的抗原可以在一个或多个氨基酸残基处，例如在必需或非必需氨基酸残基处包含保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸)，β支链侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，优选将结合多肽中的非必需氨基酸残基置换为来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基。在某些实施方式中，可以用结构上相似的，侧链家族成员的顺序和/或组成不同的字符串代替一串氨基酸。或者，在某些实施方式中，可以沿着编码序列的全部或部分随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以将所得突变体引入本发明的结合多肽中，并筛选其结合所需靶标的能力。
如本文所用，术语抗原“交叉呈递”是指通过APC上的MHC I类和II类分子将外源蛋白抗原呈递给T细胞。
如本文所用，术语“有效剂量”或“有效剂量”定义为足以达到或至少部分达到所需效果的量。术语“治疗有效剂量”定义为足以在已经患有该疾病的患者中治愈或至少部分阻止该疾病及其并发症的量。对于这种用途有效的量将取决于所治疗疾病的严重程度和患者自身免疫系统的一般状态。
如本文所用，术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原结合蛋白(例如，免疫球蛋白，抗体或抗原结合片段)特异性结合的抗原上的决定簇或位点。蛋白质抗原的表位可以划分为“线性表位”和“构象表位”。如本文所用，术语“线性表位”是指由相连接的氨基酸的连续的线性序列形成的表位。蛋白质抗原的线性表位通常在暴露于化学变性剂(例如酸，碱，溶剂，交联剂，离液剂，二硫键还原剂)或物理变性剂(例如热，放射性，机械剪切或应力)后保留。在一些实施方式中，表位是非线性的，也称为间断表位。如本文所用，术语“构象性表位”是指由通过多肽的三级折叠并置的不连续氨基酸形成的表位。构象表位通常在用变性剂处理后丢失。表位通常以独特的空间构象包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。通常，对特定靶分子具有特异性的抗体或其抗原结合片段将优先识别并结合蛋白质和/或大分子的复杂混合物中靶分子上的特定表位。
如本文所用，术语“表位作图”是指鉴定抗体或其抗原结合片段在其靶蛋白抗原上的结合位点或表位的过程或方法。本文提供了表位作图方法和技术。
如本文所用，术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区(如果存在)的抗体。本公开的人抗体可包括未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外或体内特异性突变诱因引入的突变或体内体细胞突变引入的突变)(参见，例如Lonberg et al.,(1994)Nature 368(6474):856-859)；Lonberg,(1994)Handbook ofExperimental Pharmacology 113:49-101；Lonberg&Huszar,(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93,and Harding&Lonberg,(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546)。然而，术语“人抗体”不包括其中衍生自另一哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列已嫁接到人框架序列上的抗体(即人源化抗体)。
如本文所用，术语“异源抗体”是相对于产生这种抗体的转基因非人类生物定义的。该术语是指具有与在不由转基因非人类动物组成的生物中发现的氨基酸序列或编码核酸序列相对应的氨基酸序列或编码核酸序列的抗体，该抗体通常来自于非转基因非人类动物的物种。
如本文所用，术语“羟基置换部分”或“羟基置换部分”是指可有效替代包含金属氢氧化物助剂的表面羟基的化学部分或基团。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并且是指对特定抗原的免疫应答的刺激(即，被动的或适应性的)。就诱导CDC或ADCC而言，术语“诱导”是指刺激特定的直接细胞杀伤机制。
如本文所用，术语“抑制生长”(例如，指细胞)旨在包括细胞生长的任何可测量的降低，例如，细胞生长的抑制至少约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，99％或100％。
如本文所用，“需要预防”，“需要治疗”或“有需要”的受试者是指通过适当的医学从业者(例如，如果是人类，则是医生，护士或护理从业者；如果是非人类哺乳动物，则是兽医)的判断，可以合理地从给定治疗中受益(例如用包含疫苗的复合物治疗)的。
术语“体外”是指在人工环境中例如在试管或反应容器中，在细胞培养中，在培养皿中等中而不是在生物体(例如动物，植物，或微生物)中发生的过程。术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。然而，特异性结合表位的分离的抗体可以对来自不同物种的感兴趣的其他蛋白质或抗原具有交叉反应性。然而，在本文所述的特异性结合测定中，抗体持续显示针对感兴趣的抗原的特异性。另外，分离的抗体通常基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“KD”或“KD”是指抗体和抗原之间的结合反应的平衡解离常数。KD的值是抗体解离速率常数(kd)与抗体解离速率常数(ka)之比的数值表示。KD的值与抗体对抗原的结合亲和力成反比。KD值越小，抗体对其抗原的亲和力越大。亲和力是单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数(KD)进行测量和报告，该平衡解离常数用于评估和排序双分子相互作用的强度。
如本文所用，术语“kd”或“kd”(或者“koff”或“koff”)是指抗体从抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。kd的值是每秒衰减或解离的复合物分数的数字表示，并以sec-1单位表示。
如本文中所使用的，术语“Ka”或“Ka”(或者“Kon”或“Kon”)旨在指抗体与抗原缔合的结合速率常数。ka的值是在1摩尔(1M)抗体和抗原溶液中每秒形成的抗体/抗原复合物数量的数字表示，并以M-1sec-1单位表示。
如本文所用，术语“连接的”，“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括化学缀合或重组手段在内的任何方式将另外两个要素，基团，组分，结构域或部分结合在一起。相关地，如本文所用，术语“接头”是指连接两个或更多个要素，基团，组分，结构域或部分的化学基团或结构域。化学缀合方法(例如，使用异双功能交联剂)在本领域中是已知的。
如本文所用，“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于将组合物或试剂经由血管系统运输至其预期的靶组织或部位的递送。例如，可以通过注射或植入组合物或试剂或通过注射或植入包含该组合物或试剂的装置来递送该组合物。在靶组织或部位附近局部给药后，所述组合物或试剂或其一种或多种组分可扩散至预期的靶组织或部位。
如本文所用，术语“多价佐剂反应性部分”是指包含多个羟基置换基团的反应性部分，其中每个羟基置换基团均有效替代金属氢氧化物佐剂的表面羟基，从而以多价方式与佐剂结合。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指显示对特定表位的单一结合特异性和亲和力的抗体。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性并且具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变和任选恒定区的抗体。在一些实施方式中，人单克隆抗体是由杂交瘤产生的，该杂交瘤包括与永生化细胞融合的获自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物例如转基因小鼠的B细胞。
如本文所用，术语“天然存在”应用于对象是指可以在自然界中发现对象的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中的、可以从自然界中分离出来并且未被人为故意修饰多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
如本文所用，术语“新抗原”是指具有至少一种改变的抗原，所述改变使其例如通过肿瘤细胞中的突变或对肿瘤细胞具有特异性的翻译后修饰而与相应的野生型亲本抗原不同。新抗原可包括多肽序列或核苷酸序列。突变可包括移码或非移码缺失，错义或无义置换，剪接位点改变，基因组重排或基因融合，或产生新抗原开放阅读框的任何基因组或表达选择。突变也可以包括剪接变体。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰可包括异常磷酸化。特异于肿瘤细胞的翻译后修饰还可包括蛋白酶体产生的剪接抗原。参见Liepe et al.,A largefraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides,Science,2016Oct 21；354(6310):354-358。在一些实施方式中，新抗原是“肿瘤新抗原”，其是存在于受试者的肿瘤细胞或组织中而不存在于受试者的相应正常细胞或组织中的新抗原。
如本文所用，术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然核苷酸类似的方式被代谢。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子置换可通过产生序列来实现，其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换(Batzer et al.,Nucleic Acid Res.19:5081,1991；Ohtsuka et al.,Biol.Chem.260:2605-2608,1985；andCassol et al,1992；Rossolini et al,Mol.Cell.Probes 8:91-98,1994)。对于精氨酸和亮氨酸，在第二个碱基处的修饰也可以是保守的。术语核酸可与基因，cDNA和基因编码的mRNA互换使用。
本文使用的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸可以由单链和双链DNA，作为单链和双链区域的混合物的DNA，单链和双链RNA，以及作为单链和双链区域的混合物的RNA组成。包含DNA和RNA的杂合分子可以是单链的，或更典型地是双链的，或者是单链和双链区域的混合物。另外，多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。多核苷酸还可以包含一个或多个出于稳定性或其他原因而被修饰的碱基或被修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基例如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰。因此，“多核苷酸”包括化学，酶或代谢修饰的形式。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指第一元件连接到第二元件，使得第一元件和第二元件被放置为功能关系。例如，当第一反应性部分或基团“可操作地连接”至第二反应性部分或基团时，第一和第二部分的功能或反应性被连接。例如，当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸被“有效连接”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地连接至编码序列。关于转录调节序列，可操作地连接是指被连接的DNA序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区时，它们是连续的并且在阅读框中。
如本文所用，术语“互补位”，也称为“抗原结合位点”，是指抗体或其抗原结合片段的一部分，其识别并结合抗原上的表位，包括位于可变重链和轻链中的互补决定区(CDR)组。
如本文所用，“肠胃外施用”，“肠胃外施用”和其他语法上等价的短语是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，包括但不限于静脉内，鼻内，眼内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下腔，脊柱内，硬膜外，脑内，颅内，颈动脉内和胸骨内注射和输注。
如本文所用，术语“患者”包括接受预防或治疗的人和其他哺乳动物受试者。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性百分比”是指当比较并出于最大对应性而比对时，具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或亚序列，如使用下文所述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或本领域技术人员可以使用的其他算法)或通过目测来测量的。取决于应用，“同一性百分比”可以存在于被比较的序列的区域上，例如存在于功能结构域上，或者存在于待比较的两个序列的全长上。为了进行序列比较，通常将一个序列用作与测试序列进行比较的参考序列。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数，计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
可以进行用于比较的序列的最佳比对，例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似方法检索；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics SoftwarePackage中的GAP、BESTFIT、FASTA、和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过目视检查(一般参见Ausubel等人，见下文)。
适合确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个例子是BLAST算法，其描述于Altschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。可通过国家生物技术信息中心网站公开获得进行BLAST分析的软件。
如本文中通常使用的，“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内与合理的获益/风险比相称，适合与人类和动物的组织，器官和/或体液接触使用，而没有过度的毒性，刺激，过敏反应或其他问题或并发症的那些化合物，材料，组合物和/或剂型。
如本文所用，“药学上可接受的载体”是指并且包括生理上相容的任何和所有溶剂，分散介质，包衣，抗菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等。所述组合物可包含药学上可接受的盐，例如酸加成盐或碱加成盐(参见，例如，Berge et al.(1977)J Pharm Sci 66:1-19)。
如本文所用，术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
如本文所用，术语“预防”当与疾病有关使用时，是指相对于没有接受组合物的受试者相比，降低了医学疾病症状的频率或延迟其症状发作的组合物的施用。
如本文所用，应用于本文所述的任何蛋白质(抗体或片段)的术语“纯化的”或“分离的”是指已与自然地伴随它的组分(例如蛋白质或其他天然存在的生物或有机分子)分离或纯化的多肽，例如表达蛋白质的原核生物中的其他蛋白质，脂质和核酸。通常，当多肽构成样品中总蛋白重量的至少60％(例如，至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，92％，95％，97％或99％)时，其是纯化的。
如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已将重组表达载体引入其中的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的对象细胞，而且还指该细胞的后代。因为由于突变或环境影响，某些修饰可能在后代中发生，所以这样的后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
如本文所用，术语“受试者”包括任何人类或非人类动物。例如，本发明的方法和组合物可以用于治疗患有免疫疾病的受试者。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类，绵羊，狗，牛，鸡，两栖动物，爬行动物等。
对于核酸，术语“实质同源性”表示当最佳比对和比较时，两个核酸或其指定的序列在至少约80％的核苷酸中相同，通常至少约90％至95％，更优选至少约98％至99.5％的核苷酸，具有适当的核苷酸插入或缺失。或者，当片段将在选择性杂交条件下与链的互补序列杂交时，存在实质同源性。
两个序列之间的同一性百分比是该序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数x100)，其中考虑了缺口的数量和长度每个缺口，需要引入这些缺口以实现两个序列的最佳比对。序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成，如以下非限制性示例中所述。
两个核苷酸序列之间的同一性百分比可以使用NCGgapdna.CMP矩阵和间隙权重40、50、60，70或80，长度权重1、2、3、4、5或6，使用GCG软件包(可从http://www.gcg.com获得)中的GAP程序确定。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比也可以使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法确定，其已纳入ALIGN程序(2.0版)，使用PAM120重量残基表，空位长度罚分12和空位罚分4。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法确定，其已被并入GCG软件包的GAP程序中(可从http://www.gcg.com获得)，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，间隙权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。
本公开的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索，以例如鉴定相关序列。可以使用Altschul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)执行此类搜索。可以用NBLAST程序进行BLAST核苷酸搜索，得分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul et al.,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389-3402所述利用Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如XBLAST和NBLAST)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
核酸可以完整细胞，细胞裂解物或部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱性/SDS处理，CsCl带，柱层析，琼脂糖凝胶电泳和其他本领域众所周知的方法的标准技术从其他细胞组分或其他污染物，例如其他细胞核酸或蛋白质中纯化出来时，核酸是“分离的”或“呈现为基本纯净的”。参见，F.Ausubel,et al.,ed.Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
根据标准技术，本公开的核酸组合物虽然通常是天然序列(修饰的限制性位点等除外)，但是可以从cDNA，基因组或其混合物中突变，以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可根据需要影响氨基酸序列。特别地，考虑了与本文所述的天然V，D，J，恒定，开关和其他此类序列基本同源或衍生的DNA序列(其中“衍生”表示一个序列与另一个序列相同或修饰)。
如本文所用，“肿瘤抗原”是指(i)肿瘤特异性抗原，(ii)肿瘤相关抗原，(iii)表达肿瘤特异性抗原的细胞，(iv)表达肿瘤相关抗原的细胞，(v)肿瘤上的胚胎抗原，(vi)自体肿瘤细胞，(vii)肿瘤特异性膜抗原，(viii)肿瘤相关膜抗原，(ix)生长因子受体，(x)生长因子配体，(xi)新抗原和(xii)与癌症或肿瘤有关的任何其他类型的抗原或抗原呈递细胞或材料。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”或“TAA”是指免疫原性分子，例如蛋白质，其通常在肿瘤细胞中的表达水平高于在非肿瘤细胞中的表达水平。完全表达或仅以低水平表达。在一些实施方式中，被肿瘤携带宿主的免疫系统识别的肿瘤相关结构被称为肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，如果与肿瘤相关的抗原在大多数肿瘤中广泛表达，则其为通用肿瘤抗原。在一些实施方式中，肿瘤相关抗原是分化抗原，突变抗原，过表达的细胞抗原或病毒抗原。
如本文所用，术语“肿瘤特异性抗原”或“TSA”是指肿瘤细胞特有的免疫原性分子，例如蛋白质。肿瘤特异性抗原仅在肿瘤细胞中表达。
本文所用的术语“治疗”是指本文所述的治疗或预防措施。“治疗”方法采用向需要这种治疗的受试者施用本公开的人抗体，例如，需要增强的针对特定抗原的免疫应答的受试者或最终可能获得这种抗体的受试者。为了预防，治愈，延迟，减轻该疾病或复发性疾病的一种或多种症状或减轻该疾病或复发性疾病的一种或多种症状的严重性，或为了延长受试者的生存期，使其超过在没有这种治疗的情况下所预期的寿命。
如本文所用，“疫苗”是指包含如本文所述的免疫原性组合物和佐剂的制剂，所述佐剂的形式是能够施用于脊椎动物并且诱导足以诱导免疫力的保护性免疫应答。预防和/或改善感染或疾病和/或减少感染或疾病的至少一种症状和/或增强另一剂量的合成纳米颗粒的功效。通常，疫苗包含常规的盐水或缓冲水溶液介质，其中将本文所述的组合物悬浮或溶解在其中。以这种形式，本文所述的组合物用于预防，改善或以其他方式治疗感染或疾病。导入宿主后，疫苗会引发免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞，抗原呈递细胞，辅助性T细胞，树突状细胞和/或的激活其他细胞反应。
如本文所用，“保护性”免疫应答是指将预防或改善疾病或感染的细胞介导的和/或体液(抗体)介导的免疫应答。保护性体液免疫应答或体液免疫通常涉及诱导识别抗原上特定表位的广泛中和性抗体。为了通过疫苗接种激发保护性体液免疫，必须激活B细胞并进入生发中心，在那里它们增殖并突变其抗体基因，以增强对抗原的识别。然后，这些细胞的一部分必须分化为组成型分泌抗体的长寿浆细胞或参与再次暴露于病原体时产生召回反应的记忆B细胞。
如本文所用，术语“载体”旨在指能够转运已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将另外的DNA片段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。可以将其他载体(例如，非流行的哺乳动物载体)引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导与其可操作连接的基因的表达。这样的载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等效功能的其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。下面描述优选的方法和材料，尽管与本文描述的那些方法或材料相似或等同的方法和材料也可以用于实践或测试当前公开的方法和组合物。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。
抗原反应部分
在通过本公开提供的一些实施方式中，所述抗原反应性部分包含选自以下的反应性或官能性基团：胺反应性基团，羧基至胺反应性基团，巯基反应性基团，醛或羰基反应性基团，羟基反应性基团，叠氮化物反应性基团和光反应性基团。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含胺反应性基团。胺反应性基团的非限制性实例包括异硫氰酸酯，异氰酸酯，磺酰氯，醛，碳二亚胺，酰基叠氮化物，酸酐，氟苯，碳酸酯，N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)，酰亚胺酯，环氧化物和氟苯基酯。在一些实施方式中，所述抗原反应性部分包含选自以下的胺反应性基团：N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS酯)，磺基-NHS酯，亚氨酸酯，五氟苯基酯，和羟甲基膦。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含羧基-胺反应性基团，其包含碳二亚胺(carbodiimide)。在一些实施方式中，碳二亚胺是EDC。在其他实施方式中，碳二亚胺是DCC。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含巯基反应性基团。巯基反应性基团的非限制性实例包括马来酰亚胺，卤代乙酰基(溴代或碘代)，吡啶基二硫化物，硫代磺酸盐和乙烯基砜。在一些实施方式中，抗原反应性部分包含具有马来酰亚胺的巯基反应性基团。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含醛或羰基反应性基团。醛或羰基反应性基团的实例包括但不限于酰肼和烷氧基胺。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含羟基反应性基团。羟基反应性基团的非限制性实例是异氰酸酯。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含叠氮化物反应性基团。叠氮化物反应性基团的非限制性实例是膦。
在一些实施方式中，抗原反应性部分包含光反应性基团。光反应性基团的实例包括，但不限于，苯基叠氮化物，邻羟基苯基叠氮化物，间-羟基苯基叠氮化物，叠氮化四氟，邻-硝基苯基叠氮化物，间-硝基苯基叠氮化物，二吖丙因，叠氮基甲基香豆素，补骨脂素和。
在一些实施方式中，所述抗原反应性部分靶向且与选自以下的反应性或官能性基团发生反应：伯胺基团(-NH2)，羧基(-COOH)，巯基(-SH)，羰基(-CHO)，叠氮基(-N3)。
在通过本公开提供的一些实施方式中，抗原反应性部分可以在其中所述多肽保持在折叠状态(例如，生理条件)的条件下与包括感兴趣的多肽的一种或多种反应性或官能性基团反应。在一些实施方式中，抗原反应性部分与抗原的一个或多个反应性或官能性基团反应，例如抗原的Lys，Cys，Ser，Thr，Tyr，His或Arg氨基算残基的侧链基团。抗原反应性部分可以是氨基反应性，硫醇反应性，羟基反应性，咪唑基反应性或胍基反应性的。适用于抗原反应性部分的其他示例性反应性或官能性基团及其使用方法描述于Hermanson“Bioconjugate Techniques”3rd Edition,Academic Press,2013中，其通过引用整体并入本文。
接头
在一些实施方式中，抗原-佐剂偶联剂包含接头。在一些实施方式中，抗原-佐剂偶联剂包含多个接头。在一些实施方式中，接头结构域是多肽接头，乙二醇接头或寡核苷酸接头。在某些方面，期望的是采用接头将抗原偶联至佐剂以形成抗原-佐剂复合物。在一些实施方式中，抗原经由与本文所述的任何接头连接或标记的磷酸丝氨酸残基偶联至佐剂。如本文所用，包含磷酸丝氨酸残基的接头在本文中被称为“磷酸丝氨酸接头”(PS-接头)。在一些实施方式中，PS接头包含含有磷酸丝氨酸残基的多肽接头。在另一个实施方式中，PS-接头包含1-12个连续的PS残基，随后是短的聚(乙二醇)间隔基和N-末端马来酰亚胺官能团。在另一个实施方式中，在PS-接头的N-末端的马来酰亚胺官能团经由硫醚键与抗原上的巯基共价共价。
在又一个实施方式中，多个PS-接头经由叠氮化物官能团缀合至抗原蛋白并偶联至DBCO修饰的抗原。可以使用本发明的接头，例如，以确保抗原相对于佐剂定位，以确保抗原的适当折叠和形成或阻断或暴露特定表位。优选地，与本发明相容的接头将是相对非免疫原性的，并且不抑制结合蛋白(例如抗体)的单体亚基之间的任何非共价缔合。示例性的接头结构域公开于美国专利No.6,660,843，其通过引用并入本文。
在一些实施方式中，接头可以是不可裂解的接头或可裂解的接头。不可裂解的接头可包含酰胺键或磷酸酯键，并且可裂解的接头可包含二硫键，酸可裂解的键，酯键，酸酐键，可生物降解的键或酶可裂解的键。
多肽接头
在一些实施方式中，通过本公开提供的抗原-佐剂偶联剂包含多肽接头以将任何抗原反应性部分连接至本文所述的任何包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分。例如，在一些实施方式中，多肽接头可用于将包含巯基反应性部分的抗原反应性部分与包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分共价连接，其中羟基置换基团包含磷酸根基团。
在一些实施方式中，多肽接头是合成的。如本文中所使用的，关于多肽接头的术语“合成的”包括肽(或多肽)，其包含氨基酸序列(其可以是或可以不是天然存在的)，其以线性氨基酸序列连接至反应性部分。例如，多肽接头可包含非天然存在的多肽，其是天然存在的多肽的修饰形式(例如，包含突变，例如添加，置换或缺失)或包含第一氨基酸序列(可以或可以不可以是自然存在的)。
在一些实施方式中，多肽序列包含Gly-Ser接头或由其组成。如本文所用，术语“Gly-Ser接头”是指由甘氨酸和丝氨酸残基组成的肽。示例性的Gly-Ser接头包含式(Gly4Ser)n的氨基酸序列，其中n是正整数(例如1、2、3、4或5)。在某些实施方式中，Gly-Ser接头是(Gly4Ser)1。在某些实施方式中，Gly-Ser接头是(Gly4Ser)2。在某些实施方式中，Gly-Ser接头是(Gly4Ser)3。在某些实施方式中，Gly-Ser接头是(Gly4Ser)4。在某些实施方式中，Gly-Ser接头是(Gly4Ser)5。在某些实施方式中，可以将gly-ser接头插入多肽接头(例如，本文所述的任何多肽接头序列)的两个其他序列之间。在其他实施方式中，Gly-Ser接头连接在多肽接头(例如，本文所述的任何多肽接头序列)的另一序列的一个或两个末端。在其他实施方式中，两个或更多个Gly-Ser接头串联插入多肽接头中。
适用于本文所述的任何抗原-佐剂偶联剂中的其他接头是本领域已知的，例如，US5,525,491中公开的富含丝氨酸的接头，螺旋形成肽接头(例如，Arai et al.,ProteinEng 2001；14:529-32中公开的A(EAAAK)nA(n＝2-5))和在Chen et al.,Mol Pharm 2011；8:457-65中公开的稳定接头，即二肽接头LE，凝血酶敏感的二硫环肽接头和形成α-螺旋的接头LEA(EAAAK)4ALEA(EAAAK)4ALE。。
其他示例性接头包括GS接头(即(GS)n)，GGSG接头(即(GGSG)n)，GSAT接头，SEG接头和GGS接头(即(GGSGGS)n)，其中n是正整数(例如1、2、3、4或5)。可使用可公开获得的数据库，例如接头数据库(ibi.vu.nl/programs/linkerdbwww)，找到用于抗原-佐剂偶联剂的其他合适的接头。接头数据库是多功能酶中域间接头的数据库，所述多功能酶充当新型融合蛋白中的潜在接头(参见，例如，George et al.,Protein Engineering 2002；15:871-9)。
应当理解，这些示例性多肽接头的变体形式可以通过将一种或多种核苷酸置换，添加或缺失引入编码多肽接头的核苷酸序列中，从而将一种或多种氨基酸置换，添加或缺失引入多肽接头中而产生。可以通过标准技术引入突变，例如定点诱变和PCR介导的诱变。
本发明的多肽接头的长度为至少一个氨基酸，并且可以具有不同的长度。在一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约1至约50个氨基酸。如本文所用，术语“约”表示+/-两个氨基酸残基。由于接头长度必须是正整数，所以长度为约1至约50个氨基酸，是指长度为1至48至52个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约1-5个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约5-10个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约10-20个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约15至约50个氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约20至约45个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头的长度为约15至约25个氨基酸。在另一个实施方式中，本发明的多肽接头是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20，21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45长度为46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或61个或更多个氨基酸。
可以使用本领域已知的技术将多肽接头引入多肽序列。可以通过DNA序列分析确认修饰。质粒DNA可用于转化宿主细胞以稳定产生所产生的多肽。
乙二醇接头
在一些实施方式中，接头是一个或多个乙二醇(EG)单元，更优选2个或更多个EG单元(即聚乙二醇(PEG))。在一些实施方式中，接头包含聚乙二醇(PEG)接头或由其组成。聚乙二醇或PEG是指由重复的乙二醇单元组成的化合物。示例性的“PEG接头”包括下式的化合物：H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中n是正整数(例如1、10、20、50、100、200、300、400，500、600)。在一些实施方式中，PEG接头是PEG1000。在一些实施方式中，PEG接头是PEG2000。在一些实施方式中，PEG接头是PEG3000。
在一些实施方式中，本公开提供的抗原-佐剂偶联剂可包含任何聚乙二醇(PEG)接头，以将任何抗原反应性部分连接至本文所述的包含两个或更多个羟基置换基团的任何多价佐剂反应性部分。例如，在一些实施方式中，聚乙二醇(PEG)接头可用于将包含巯基反应性部分的抗原反应性部分与包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分共价连接，其中羟基-置换基包含磷酸根基团。
在一些实施方式中，构成抗原-佐剂偶联剂的乙二醇(EG)单元的精确数量可以在约1至约100，约20至约80，约30至约70或约40至约60个EG单元的范围内。在一些实施方式中，乙二醇接头具有约45至55个EG单元。例如，在一个实施方式中，乙二醇接头具有45个EG单元。例如，在一个实施方式中，乙二醇接头具有48个EG单元。
寡核苷酸接头
在一些实施方式中，接头是寡核苷酸。接头可以具有任何序列，例如，寡核苷酸的序列可以是随机序列，或针对其分子或生化特性而专门选择的序列。在一些实施方式中，接头包括一个或多个系列的连续腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，尿嘧啶(U)或其类似物。在一些实施方式中，接头由一系列连续的腺嘌呤(A)，胞嘧啶(C)，鸟嘌呤(G)，胸腺嘧啶(T)，尿嘧啶(U)或其类似物组成。
在一个实施方式中，接头是一个或多个鸟嘌呤，例如在1-10个鸟嘌呤之间。在一些实施方式中，ABP缀合物中的接头可以包含0、1或2个鸟嘌呤。在一些实施方式中，寡核苷酸包含硫代磷酸酯亚基间键。
羟基置换基团
本发明提供了涉及增强向脊椎动物施用抗原而产生的免疫应答的新型组合物和方法。根据本公开，该免疫应答是通过施用由此其向免疫系统的呈递加强应答的形式的抗原而增强。例如，改变抗原可用于淋巴结的持续时间，或促进抗原呈递细胞(例如树突细胞)的内化。本发明源于以下发现：单独通过静电和其他次级力吸附至佐剂颗粒的抗原不在将疫苗递送至皮下或肌内位置后保持高度吸附；通过配体交换吸附至佐剂颗粒的抗原在递送后确实保持高度吸附；并且递送后仍保留吸附至佐剂颗粒的抗原更容易保留在注射部位处并诱导高抗抗原抗体滴度。
包含偶联剂的多价佐剂反应性部分提供至少两个羟基置换基团(例如，磷酸根基团)，其有效替代金属氢氧化物佐剂颗粒(例如alum)的表面羟基基团，从而将抗原偶联或吸收至佐剂。
这样的组合物在本文中称为“抗原-佐剂复合物”。该取代是通过配体交换机制发生的，并且该取代导致形成包含抗原和金属氢氧化物佐剂的内球表面复合物，由此抗原被强烈地吸附至佐剂颗粒。如本文所用，术语“配体交换”定义为表面羟基被另一配体取代或交换，在这种情况下，所述配体是包含羟基置换基团的抗原。
如本文所用，术语“金属氢氧化物佐剂”用于指包含结合至金属的至少一个羟基的物质，该物质能够吸附具有羟基置换部分的抗原，并且能够当递送至脊椎动物时，协助抗原引发免疫应答。金属氢氧化物佐剂也被选择为对人类和非人类生物相容的一种。根据本发明的优选的金属氢氧化物佐剂或用途是含铝佐剂。术语“含铝助剂”定义为包含与铝结合的至少一个羟基的物质。含铝佐剂的实例是氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。
相关领域的技术人员将理解，术语“氢氧化铝佐剂”在该领域中用于识别晶体羟基氧化铝化合物。氢氧化铝佐剂在表面仅具有与铝共价键合的羟基。术语“磷酸铝佐剂”在本领域中用于识别无定形羟基磷酸铝。磷酸铝佐剂在表面具有与铝共价键合的磷酸根基团和羟基。尽管含铝佐剂是最常用的疫苗佐剂，并且氢氧化铝佐剂是目前在美国FDA许可的人类疫苗中使用的唯一佐剂，但本发明的原理类似地适用于除含铝佐剂以外的金属氢氧化物佐剂。作为金属氢氧化物佐剂的另外的非限制性实例，本发明考虑了氢氧化铁佐剂和磷酸钙佐剂适合于根据本发明使用。
本发明还考虑了修饰的金属氢氧化物佐剂，例如修饰的含铝佐剂，在疫苗制剂中用于递送修饰的、羟基取代的抗原的用途。如本文所用，术语“修饰的金属氢氧化物助剂”用于指其中一部分表面羟基已被置换或修饰，使得可用于配体交换的表面羟基的数量减少的金属氢氧化物助剂。根据本发明的修饰金属氢氧化物佐剂的一种示例性方式是通过使佐剂与含磷酸盐的溶液接触一段足以引起表面羟基发生磷酸盐取代的时间(在本文中也称为磷酸化一些表面羟基)。例如，当氢氧化铝佐剂暴露于磷酸盐时，磷酸盐可置换表面羟基并与表面铝形成内球表面复合物(共价键)，从而改变氢氧化铝佐剂的表面结构。磷酸铝佐剂的表面羟基可以类似的方式被磷酸化。
可以如所描述的那样修饰金属氢氧化物佐剂，以改变可用于配体交换的佐剂颗粒表面上羟基的密度。替代地或另外，对于其他原因，以这种方式修饰金属氢氧化物佐剂可能是期望的。例如，本公开设想佐剂颗粒表面上羟基密度的改变将相应地改变免疫原性组合物的吸附或偶联程度。
羟基置换基团的非限制性实例包括氟化物基团，柠檬酸根基团，磷酸根基团，硫酸根基团和碳酸盐基团。铝对磷酸盐具有高亲和力，可以在配体交换反应中取代表面羟基。在一些实施方式中，包含抗原-佐剂偶联剂的羟基置换基团是磷酸根基团。铝对氟具有更高的亲和力。在另一个实施方式中，包含抗原-佐剂偶联剂的羟基置换基团是氟化物基团。
通过提供不包含羟基置换部分的抗原并通过经由抗原-佐剂偶联剂与该抗原的共价连接来添加一个或多个羟基置换部分来修饰该抗原，其中经由该部分，该抗原通过配体交换吸附至金属氢氧化物佐剂，可以修饰抗原以吸附，增加吸附或减少从佐剂的释放。实现该修饰的一种特别适合修饰多肽抗原的方式是，将氨基酸包含在抗原中，其提供反应性部分(例如半胱氨酸，-SH)，并通过使包含反应性部分的修饰抗原进一步接触抗原-佐剂偶联剂。
在一些实施方式中，为了产生或增加抗原与抗原-佐剂偶联剂反应的能力，将本公开提供的抗原修饰为包含不存在于该抗原的天然形式中的一种或多种氨基酸(例如半胱氨酸)。在一些实施方式中，本公开考虑了抗原的位点特异性修饰以相对于佐剂表面定向抗原。因此，选择性地在抗原上呈递表位，同时掩蔽与佐剂表面并置定向的无关表位。
在一些实施方式中，本公开考虑了抗原，其天然形式可包含一个或多个羟基置换部分，其可以根据本发明进行修饰，以增加配体交换吸附的速率或增加抗原与金属氢氧化物佐剂的吸附强度。
抗原
适用于包含在本文所述免疫原性组合物中的抗原可以源自任何病原体(例如细菌病原体，病毒病原体，真菌病原体，原生动物病原体，单细胞或多细胞寄生虫病原体)，过敏原或肿瘤。在一些实施方式中，抗原源自病毒。包含合适抗原的示例性病毒包括但不限于例如呼吸道合胞病毒(RSV)，乙型肝炎病毒(HBV)，丙型肝炎病毒(HCV)，登革热病毒，单纯疱疹病毒(HSV；例如HSV-1，HSV-II)，软体动物感染性牛痘病毒，牛痘病毒，天花病毒，慢病毒，人免疫缺陷病毒(HIV)，人乳头瘤病毒(HPV)，巨细胞病毒(CMV)，水痘带状疱疹病毒(VZV)，鼻病毒，肠病毒，腺病毒，冠状病毒(例如SARS)，流感病毒(流感)，副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，乳头瘤病毒，肝炎病毒，黄病毒，逆转录病毒，沙粒病毒(例如淋巴细胞性脑膜炎病毒，胡宁病毒，马丘波病毒，鸟粪病毒或拉萨病毒)，诺如病毒，黄热病病毒，狂犬病病毒，丝状病毒(例如埃博拉病毒或马布病毒)，丙型肝炎病毒，乙型肝炎病毒，甲型肝炎病毒，麻疹病毒(例如麻疹病毒)，风疹病毒(例如腮腺炎病毒))，风疹病毒(例如风疹病毒)，牛病毒性腹泻病毒。例如，抗原可以是CMV糖蛋白gH或gL；或可以是CMV。细小病毒HIV糖蛋白gp120或gp140，HIV p55gag，pol；或RSV-F抗原。在一些实施方式中，抗原是病毒抗原。在一些实施方式中，病毒抗原是包含gp120或gp140的HIV抗原。在一些实施方式中，工程化HIV抗原是gp120的工程化变体(工程化外部结构域，engineered Outer Domain，eOD)。在一些实施方式中，工程化HIV抗原是gp140(SOSIP)的工程变体。eOD和/或SOSIP的进一步描述由WO201605704A3，US20160185825A1，Georgiev et al.,(2015)J Virol 89(10):5318-5329提供，其全部通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，抗原源自寄生虫。在一些实施方式中，抗原源自来自疟原虫属内的物种，如恶性疟原虫，间日疟原虫，疟原虫或卵形疟原虫。因此，该免疫原性组合物可用于制备用于抗疟疾的疫苗。
在一些实施方式中，抗原源自细菌病原体。示例性细菌病原体包括例如奈瑟氏球菌，包括淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌；链球菌属，包括肺炎链球菌，化脓性链球菌，无乳链球菌，变形链球菌；嗜血杆菌属，包括流感嗜血杆菌B型，非分型流感嗜血杆菌，杜克雷嗜血杆菌；莫拉氏菌属，包括卡他莫拉氏菌，也称为卡他布拉氏菌；博德特氏菌，包括百日咳博德特氏菌，副百日咳博德特氏菌和支气管败血杆菌；分枝杆菌属，包括结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，麻风分枝杆菌，鸟分枝杆菌，副结核分枝杆菌，耻垢分枝杆菌；军团菌属物种，包括嗜肺乳杆菌；大肠杆菌，包括肠毒性大肠杆菌，肠出血性大肠杆菌，肠致病性大肠杆菌；霍乱弧菌，包括霍乱弧菌；志贺氏菌，包括宋内志贺菌，痢疾志贺菌，弗氏链球菌；耶尔森氏菌，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌；弯曲杆菌属，包括空肠弯曲杆菌和大肠杆菌；沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌，副伤寒沙门氏菌，霍乱沙门氏菌，肠炎沙门氏菌；李斯特菌属，包括单核细胞增生李斯特菌；幽门螺杆菌，包括幽门螺杆菌；假单胞菌属物种，包括铜绿假单胞菌；葡萄球菌属物种包括金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌；肠球菌，包括粪肠球菌，粪肠球菌；梭状芽胞杆菌，包括破伤风梭菌，肉毒梭菌，艰难梭菌；芽孢杆菌属，包括炭疽杆菌；棒杆菌属，包括白喉衣原体；伯氏疏螺旋体，包括B.burgdorferi，B.garinii，B.afzelii，B.andersonii，B.hermsii；埃里希氏菌，包括E.equi和人类粒细胞埃希氏菌病的病原体；立克次体属，包括R.rickettsii；衣原体属，包括沙眼衣原体，肺炎衣原体，鹦鹉热衣原体；Leptsira spp.，包括L.interrogans；梅毒螺旋体，包括梅毒螺旋体，齿状螺旋体，猪痢疾螺旋体
在某些实施方式中，抗原源自真菌病原体。示例性的真菌病原体包括，例如，烟曲霉，黄曲霉，黑曲霉，土曲霉，构巢曲霉，炎球菌，新球藻，隐球菌，荚膜肉芽肿，白色念珠菌和肺孢子虫。
在某些实施方式中，抗原源自原生动物病原体。示例性的原生动物病原体包括，例如，刚地弓形虫和粪类圆线虫。
在某些实施方式中，抗原衍生自多细胞寄生病原体。示例性的多细胞寄生性病原体包括例如吸虫(flukes)，绦虫(绦虫)，线虫(蛔虫)和节肢动物。
在某些实施方式中，抗原源自过敏原，例如花粉过敏原(树木，草本，杂草和草花粉过敏原)；昆虫或蜘蛛的过敏原(吸入，唾液和毒液过敏原，例如螨类过敏原，蟑螂和蠓过敏原，鬣狗毒液过敏原)；动物毛发和头皮屑过敏原(例如狗，猫，马，大鼠，小鼠等)；和食物过敏原(例如麦醇溶蛋白)。来自树木，草和草本植物的重要花粉过敏原来自山毛榉目，木樨目，松杉目和悬铃木科的生物分类目，包括但不限于桦木(Betula)，桤木(Alnus)，榛树(Corylus)，角树(Carpinus)和橄榄(Olea)，雪松(Cryptomeria和Juniperus)，梧桐树(Platanus)，禾本目，包括黑麦草属，梯牧草属，早熟禾属，狗牙根属，鸭茅属，绒毛草属，虉草属，黑麦属和高梁属的草，菊目和荨麻目，包括豚草属，艾属和墙草属的草本植物。其他重要的吸入性过敏原是来自尘螨属和嗜霉螨属的屋尘螨，仓储螨如Lepidoglyphys，食甜螨属和食酪螨属的那些，来自蟑螂，蠓和跳蚤例如小蠊属，大蠊属，摇蚊属和Ctenocepphalides的那些，和来自哺乳动物如猫，狗和马的那些，毒液过敏原，包括来源于刺痛或叮咬昆虫的那些，例如膜翅目的分类学目的那些，包括蜜蜂(Apidae)，黄蜂(Vespidea)和蚂蚁(Formicoidae)。
在某些实施方式中，抗原源自选自以下的肿瘤抗原：(a)癌-睾丸抗原，例如NY-ESO-1，SSX2，SCP1以及RAGE，BAGE，GAGE和MAGE家族多肽，例如，GAGE-1，GAGE-2，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-5，MAGE-6和MAGE-12(例如，可用于治疗黑色素瘤，肺，头颈部，NSCLC，乳腺，胃肠道和膀胱肿瘤；(b)突变的抗原，例如p53(与各种实体瘤相关，例如结直肠癌，肺癌，头颈癌)，p21/Ras(与例如，黑色素瘤，胰腺癌和结肠直肠癌)，CDK4(例如与黑色素瘤相关)，MUM1(例如与黑色素瘤相关)，caspase-8(例如与头颈癌相关)，CIA0205(与HLA-A2-R1701，HLA-A2-R1701，β连环蛋白(与例如黑素瘤相关)，TCR(与例如T细胞非霍奇金淋巴瘤相关)，BCR-abl(与例如膀胱相关)，慢性粒细胞白血病)，磷酸三糖异构酶，KIA0205，CDC-27和LDLR-FUT；(c)过度表达的抗原，例如Galectin 4(例如与大肠癌相关)，Galectin9(例如与霍奇金病相关)，蛋白酶3(例如与慢性粒细胞白血病相关)，WT1(例如与各种白血病相关)，碳酸酐酶(例如与肾癌相关)，醛缩酶A(例如与肺癌相关)，PRAME(例如与黑素瘤相关)，HER-2/neu(与乳腺癌，结肠癌，肺癌和卵巢癌有关，乳房珠蛋白，甲胎蛋白(与肝癌有关)，KSA(与结肠直肠癌有关)，胃泌素(与胰腺癌和胃癌有关)，端粒酶催化蛋白，MUC-1(与例如乳腺癌和卵巢癌相关)，G-250(与例如肾细胞癌相关)，p53(与例如乳腺癌，结肠癌相关)和癌胚抗原(与例如乳腺癌，肺癌和胃肠道癌如结直肠癌有关)；(d)共有抗原，例如黑素瘤-黑素细胞分化抗原，例如MART-1/MelanA，gp100，MC1R，刺激黑素细胞的激素受体，酪氨酸酶，酪氨酸酶相关蛋白-1/TRP1和酪氨酸酶相关蛋白-2/TRP2(例如与黑色素瘤有关)；(e)与例如前列腺癌相关的前列腺相关抗原，例如PAP，PSA，PSMA，PSH-P1，PSM-P1，PSM-P2；(f)免疫球蛋白独特型(例如，与骨髓瘤和B细胞淋巴瘤相关)。在某些实施方式中，肿瘤免疫原包括但不限于p15，Hom/Mel-40，H-Ras，E2A-PRL，H4-RET，IGH-IGK，MYL-RAR，爱泼斯坦巴尔病毒抗原，EBNA，人类乳头瘤病毒(HPV)抗原，包括E6和E7，乙型和丙型肝炎病毒抗原，人T细胞淋巴病毒抗原，TSP-180，p185erbB2，p180erbB-3，c-met，mn-23H1，TAG-72-4，CA19-9，CA72-4，CAM17.1，NuMa，K-ras，p16，TAGE，PSCA，CT7、43-9F，5T4、791Tgp72，β-HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA15-3(CA27.29\BCAA)，CA195，CA242，CA-50，CAM43，CD68\KP1，CO-029，FGF-5，Ga733(EpCAM)，HTgp-175，M344，MA-50，MG7-Ag，MOV18，NB/70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA-90(Mac-2结合蛋白/亲环素C相关蛋白)，TAAL6，TAG72，TLP，TPS等。
在一些实施方式中，抗原相对于佐剂表面定向，其中抗原的定向阻断或抑制免疫系统对一个或多个表位的识别。
佐剂
铝盐(“alum(alum)”；氢氧化铝，磷酸铝)和“佐剂系统04”(Adjuvant System 04，AS04)是在美国市售疫苗中使用的两种佐剂。alum是人类疫苗接种中最常用的佐剂。其他佐剂已被批准在欧洲使用，许多其他佐剂正在临床试验中进行测试。佐剂的非限制性例子包括海藻糖-6,6′-二霉酸酯(TDM)，戊二酰二肽(MDP)，普朗尼克嵌段共聚物，alum溶液，氢氧化铝，
Figure BDA0002640845780000461
(聚磷腈)；磷酸铝凝胶；来自海藻的葡聚糖；algammulin；氢氧化铝凝胶(alum)；高蛋白吸附氢氧化铝凝胶；低粘度氢氧化铝凝胶；AF或SPT(角鲨烷(5％)，吐温80(0.2％)，Pluronic L121(1.25％)，磷酸盐缓冲液的乳液，pH7.4)；AVRIDINETM(丙二胺)；BAY R1005TM(((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡萄糖基)-N-十八烷基-十二烷酰基-酰胺基乙酸氢盐)；CALCITRIOLTM(1-α,2S-二羟基维生素D3)；磷酸钙凝胶；CAPTM(磷酸钙纳米颗粒)；霍乱全毒素，霍乱毒素-A1-蛋白-AD-片段融合蛋白，霍乱毒素的亚基B；CRL1005(嵌段共聚物P1205)；含细胞因子的脂质体；DDA(二甲基二甲基溴化铵)；DHEA(脱氢表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰基卵磷脂)；DMPG(二肉豆蔻酰基磷脂酰甘油)；DOC/alum复合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；γ菊糖；GERBU佐剂(以下的混合物：ⅰ)N-乙酰氨基葡萄糖基-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii)二甲基二十八烷基氯化铵(DDA)，iii)锌-L-脯氨酸盐络合物(ZnPro-8)；GM-CSF；GMDP(N-乙酰氨基葡糖基-(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺)；咪喹莫特(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑-4,5-c)喹啉-4-胺)；ImmTher (N-乙酰氨基葡糖基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-甘油二棕榈酸酯)；DRV(由脱水-脱水小泡制备的免疫脂质体)；γ干扰素白介素1β；白介素2；白介素7；白介素12；ISCOMSTM；ISCOPREP 7.0.3.TM；脂质体LOXORIBINETM(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)；LT口服佐剂(大肠杆菌不稳定肠毒素-毒素)；具有任何组成的微球和颗粒；MF59TM；(角鲨烯水乳液)；MONTANIDE ISA 51TM(纯化的不完全弗氏佐剂)；MONTANIDE ISA 720TM(可代谢的油佐剂)；MPLTM(3-Q-去酰基-4'-单磷酰基脂质A)；MTP-PE和MTP-PE脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-(羟基磷酰氧基))-乙酰胺，一钠盐)；MURAMETIDETM(Nac-Mur-L-Ala-D-GCn-OCH3)；MURAPALMITINETM和D-MURAPALMITINETM(Nac-Mur-L-Thr-D-isoCln-sn-甘油基铝棕榈酰)；NAGO(神经氨酸酶-半乳糖氧化酶)；具有任何组成的纳米球或纳米颗粒；NISV(非离子表面活性剂囊泡)；PLEURANTM(β-葡聚糖)；PLGA，PGA和PLA(乳酸和乙醇酸的均聚物和共聚物；微球/纳米球))；PLURONICL121TM；PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；PODDSTM(类蛋白微球)；聚乙烯氨基甲酸酯衍生物；poly-rA：聚rU(聚腺苷酸-多尿苷酸络合物)；聚山梨酯80(吐温80)；蛋白质耳蜗(Avanti Polar Lipids,Inc.,Alabaster,Ala.)；STIMULONTM(QS-21)；Quil-A(Quil-A皂苷)；S-28463(4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1TM(“Syntex佐剂制剂”)；仙台蛋白脂质体和含仙台的脂质基质；Span-85(脱水山梨糖醇三油酸酯)；Specol(Marcol52，Span85和Tween85的乳液)；角鲨烯或
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(2,6,10,15,19,23-六甲基二十四烷和2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四烷己烷)；硬脂酰酪氨酸(十八烷基酪氨酸盐酸盐)；
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(N-乙酰氨基葡糖基-N-乙酰基muramyl-L-Ala-D-isoGlu-L-Ala-二棕榈酰氧丙基酰胺)；Theronyl-MDP(TermurtideTM或[thr1]-MDP；N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺)；Ty颗粒(Ty-VLP或病毒样颗粒)；Walter-Reed脂质体(含有吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)和脂肽，包括Pam3Cys，特别是铝盐，例如Adju-phos，Alhydrogel，Rehydragel；乳液，包括CFA，SAF，IFA，MF59，Provax，TiterMax，Montanide，Vaxfectin；共聚物，包括Optivax(CRL1005)，L121，Poloaxmer4010等)；脂质体，包括Stealth，耳蜗，包括BIORAL；植物来源的佐剂，其包含QS21，QuilA，
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ISCOM；适用于共同刺激的佐剂包括番茄碱，生物聚合物，包括PLG，PMM，菊粉；微生物衍生的佐剂，其包含Romurtide，DETOX，MPL，CWS，甘露糖，CpG核酸序列，CpG7909，人TLR1-10的配体，鼠TLR1-13的配体，ISS-1018，IC31，咪唑并喹啉，Ampligen，Ribi529，IMOxine，IRIV，VLP，霍乱毒素，不耐热毒素，Pam3Cys，鞭毛蛋白，GPI锚，LNFPIII/LewisX，抗菌肽，UC-1V150，RSV融合蛋白，cdiGMP；适合作为拮抗剂的佐剂包括CGRP神经肽。
免疫刺激性寡核苷酸(诸如包括CpG基序或Poly(I：C)的寡核苷酸)可以用作佐剂(例如参见美国专利号6,194,388；美国专利号6,207,646；美国专利号6,214,806；美国专利号6,218,371；和美国专利号6,239,116；美国专利号6,339,068；美国专利号6,406,705；和美国专利号6,429,199)。示例性佐剂还可包括生物分子(“生物佐剂”)，例如共刺激分子。示例性生物佐剂包括STING，IL-2，RANTES，GM-CSF，TNF-α，IFN-γ，G-CSF，LFA-3，CD72，B7-1，B7-2，OX-40L和41BBL。佐剂可以与所公开的组合物组合使用。
抗原-佐剂复合物和免疫原性组合物
本文所述的抗原-佐剂偶联剂，抗原，任选地接头，和佐剂适合用于抗原-佐剂复合物和免疫原性组合物中或用作疫苗中的组分。本文公开的免疫原性组合物可以包含抗原-佐剂复合物，任选地接头，第二助剂，或其组合。本文所述的任何免疫原性组合物均可称为疫苗。当向受试者组合施用时，抗原-佐剂复合物和第二佐剂可以在分开的药物组合物中施用，或者它们可以在相同的药物组合物中一起施用。
适用于本文公开的方法中的免疫原性组合物的可以包含抗原-佐剂复合物，其单独或与一种或多种另外的佐剂组合施用。构成抗原-佐剂复合物的佐剂和/或所述一个或多个另外的或第二助剂可以是任何本文所述的佐剂。佐剂可包括例如但不限于alum(例如氢氧化铝，磷酸铝)；从Q.saponaria树的树皮纯化的皂苷如QS21(糖脂，其用HPLC分馏以第21峰洗脱；Antigenics,Inc.,Worcester,Mass.)；聚[二(羧甲基苯氧基)磷腈(PCPP聚合物；美国病毒研究所)，Flt3配体，利什曼原虫延伸因子(纯化的利什曼原虫蛋白质；CorixaCorporation，西雅图，华盛顿)，ISCOMS(免疫刺激复合物，其含有混合的皂苷，脂质和形成病毒大小的，带有可容纳抗原的孔的颗粒；CSL，澳大利亚墨尔本)，Pam3Cys，SB-AS4(包含alum和MPL的SmithKline Beecham佐剂系统#4；比利时SBB)，形成胶束的非离子嵌段共聚物例如CRL1005(这些含有疏水性聚氧丙烯的线性链，侧链是聚氧乙烯链，Vaxcel，Inc.，Norcross，GA)，和Montanide IMS(例如IMS1312，与可溶性免疫刺激剂结合的水基纳米颗粒，Seppic)。
免疫原性组合物中的抗原-佐剂复合物可包含包含纳米颗粒或纳米晶体的颗粒聚集体。
佐剂或构成免疫原性组合物的佐剂可还包括，例如，但不限于，TLR配体，如上面讨论的那些。通过TLR3起作用的佐剂包括但不限于双链RNA。通过TLR4起作用的佐剂包括但不限于脂多糖的衍生物，例如单磷酰基脂质A(MPLA；RibiImmuno Chem Research，Inc.，汉密尔顿，蒙大拿州)和胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和苏酰基-胞壁酰基二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(与脂质A相关的氨基葡萄糖二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士)。通过TLR5起作用的佐剂包括但不限于鞭毛蛋白。通过TLR7和/或TLR8起作用的佐剂包括单链RNA，寡核糖核苷酸(ORN)，合成的低分子量化合物，例如咪唑并喹啉胺(例如咪喹莫特(R-837)，雷西莫德(R-848))。通过TLR9起作用的佐剂包括病毒或细菌来源的DNA，或合成的寡脱氧核苷酸(ODN)，例如CpGODN。另一类佐剂是含有硫代磷酸酯的分子，例如硫代磷酸酯核苷酸类似物和含有硫代磷酸酯主链的核酸。
包含免疫原性组合物的一种或多种佐剂还可包括例如但不限于油乳剂(例如弗氏佐剂)；油性乳剂。皂苷制剂；病毒体和病毒样颗粒；细菌和微生物衍生物；免疫刺激性寡核苷酸；ADP-核糖基化毒素和解毒衍生物；alum；卡介苗；含矿物的组合物(例如，矿物盐，例如铝盐和钙盐，氢氧化物，磷酸盐，硫酸盐等)；生物粘合剂和/或粘膜粘合剂；颗粒脂质体聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂；聚磷腈鼠酰胺基肽；咪唑并喹诺酮化合物；和表面活性物质(例如溶血卵磷脂，普朗尼克多元醇，聚阴离子，肽，油乳剂，匙孔血蓝蛋白和二硝基苯酚)。
佐剂或构成免疫原性组合物的佐剂还可以包括免疫调节剂如细胞因子，白介素(例如，IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12，等)，干扰素(例如，γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
抗原-佐剂复合物和免疫原性组合物的制备方法
一方面，本公开提供了用于疫苗制剂的抗原-佐剂复合物和免疫原性组合物。本公开提供的抗原可以被修饰或工程化以包括或合成为包括适于与本公开提供的抗原-佐剂偶联剂共价连接的反应性基团。在一些实施方式中，本公开提供了制备本文所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括提供包含编码包含本文所述的反应性基团的抗原的核酸序列的宿主细胞，将宿主细胞维持在表达抗原的条件下，获得抗原，在抗原与抗原佐剂共价连接的条件下，使抗原与本文所述的抗原佐剂接触，获得共价连接至试剂的抗原，任选地将抗原偶联或吸附至佐剂。
在一些实施方式中，抗原-佐剂偶联剂是使用固相肽合成制备的。固相肽合成是已知的方法，其中将氨基酸残基添加至已固定在固相支持物上的肽中。固相肽合成的进一步描述可参见Stawikowski and Fields(2002)Curr Protoc Protein Sci.CHAPTER:Unit-18.1和Behrendt et al.,(2016)J Pept Sci 22(1):4-27，在此通过引用将其全部内容并入本文。
在一些实施方式中，使用重组DNA技术在转化的宿主细胞中合成本文描述的用作抗原的多肽。要做到这一点，制备编码该多肽的重组DNA分子。制备此类DNA分子的方法是本领域众所周知的。例如，编码序列的聚肽，可以从DNA用合适的限制酶切除。或者，可以使用化学合成技术，例如氨基磷酸酯方法合成DNA分子。同样，可以使用这些技术的组合。在一些实施方式中，将抗原工程化以包含包含反应性基团(例如，暴露于溶剂的半胱氨酸)的非天然存在的氨基酸。工程改造抗原以包含非天然存在的氨基酸的方法包括但不限于位点特异性突变和基因合成。基因工程的其他方法是本领域普通技术人员通常已知的。
制备多肽的方法还包括能够在合适的宿主中表达肽的载体。载体包含编码与适当的表达控制序列有效连接的肽的DNA分子。在将DNA分子插入载体之前或之后，影响这种有效连接的方法是众所周知的。表达控制序列包括启动子，激活子，增强子，操纵子，核糖体核酸酶结构域，起始信号，终止信号，帽信号，聚腺苷酸化信号和其他与转录或翻译控制有关的信号。
其上具有DNA分子的所得载体用于转化合适的宿主。可以使用本领域众所周知的方法进行该转化。
大量可用的和众所周知的宿主细胞中的任何一种都可以适用于本文公开的方法。特定宿主的选择取决于本领域公认的许多因素。这些包括例如与所选表达载体的相容性，由DNA分子编码的肽的毒性，转化率，肽的回收容易性，表达特性，生物安全性和成本。在理解并非所有宿主对于特定DNA序列的表达可能同样有效的前提下，必须在这些因素之间取得平衡。在这些通用准则中，有用的微生物宿主包括细菌(例如大肠杆菌)，酵母菌(例如酿酒酵母)和其他真菌，昆虫，植物，培养的哺乳动物(包括人类)细胞或本领域已知的其他宿主。
接下来，培养并纯化转化的宿主。可以在常规发酵条件下培养宿主细胞，从而表达所需化合物。这样的发酵条件是本领域众所周知的。最后，通过本领域众所周知的方法从培养物中纯化肽。
该化合物也可以通过合成方法制备。例如，可以使用固相合成技术。合适的技术在本领域中是众所周知的，并且包括Merrifield(1973),Chem.Polypeptides,pp.335-61(Katsoyannis and Panayotis eds.)；Merrifield(1963),J.Am.Chem.Soc.85:2149；Daviset al.(1985),Biochem.Intl.10:394-414；Stewart and Young(1969),Solid PhasePeptide Synthesis；U.S.Pat.No.3,941,763；Finn et al.(1976),The Proteins(3rded.)2:105-253；and Erickson et al.(1976),The Proteins(3rd ed.)2:257-527总描述的那些。固相合成是制备单个肽的首选技术，因为它是制备小肽的最具成本效益的方法。包含衍生化的肽或包含非肽基团的化合物可以通过众所周知的有机化学技术合成。
分子表达/合成的其他方法是本领域普通技术人员通常已知的。
上述核酸分子可以包含在载体中，该载体能够引导其在例如已被该载体转导的细胞中表达。因此，除了多肽突变体之外，某些实施方式中还包括含有编码突变体的核酸分子的表达载体和用这些载体转染的细胞。
适用的载体包括用于细菌的基于T7的载体(参见，例如，Rosenberg et al.,Gene56:125,1987)，用于哺乳动物细胞中的pMSXND表达载体(Lee and Nathans,J.Biol.Chem.263:3521,1988)，和用于昆虫细胞的杆状病毒来源的载体(例如，来自加利福尼亚州帕洛阿尔托市的Clontech的表达载体pBacPAKS)。可以将这样的载体中编码感兴趣的多肽的核酸插入物可操作地连接至启动子，该启动子例如基于寻求表达的细胞类型来选择。例如，可以在细菌中使用T7启动子，在昆虫细胞中使用多面体蛋白启动子，并且在哺乳动物细胞中可以使用巨细胞病毒或金属硫蛋白启动子。同样，在高级真核生物的情况下，组织特异性和细胞类型特异性启动子是广泛可用的。这些启动子因其引导核酸分子在体内给定组织或细胞类型中表达的能力而得名。技术人员熟知许多可用于引导核酸表达的启动子和其他调节元件。
除了促进插入的核酸分子转录的序列外，载体还可以包含复制起点和其他编码选择标记的基因。例如，新霉素抗性(neor)基因向表达它的细胞赋予G418抗性，并因此允许转染细胞的表型选择。本领域技术人员可以容易地确定给定的调节元件或选择标记是否适合用于特定的实验环境。
适合使用的病毒载体包括，例如逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒载体，疱疹病毒，猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见，例如，Gluzman(Ed.),Eukaryotic ViralVectors,CSH Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
含有并表达编码多肽突变体的核酸分子的原核或真核细胞也适用。细胞是转染的细胞，即已经通过重组DNA技术将核酸分子例如编码突变多肽的核酸分子引入细胞中。这种细胞的后代也被认为适合用于本文公开的方法。
表达系统的精确组成部分并不重要。例如，可以在原核宿主(例如大肠杆菌)中或在真核宿主(例如昆虫细胞(例如Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如COS细胞)，NIH3T3细胞或HeLa细胞)。这些细胞可从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(马纳萨斯，弗吉尼亚州)。在选择一种表达系统时，仅重要的是组件之间相互兼容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。此外，如果在选择表达系统时需要引导，技术人员可以查询Ausubelet al.(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1993)和Pouwels et al.(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985Suppl.1987)。
可以使用常规的生化程序从表达系统中纯化表达的多肽，并且可以如本文所述使用，例如缀合至脂质。
在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物包含疫苗。如本领域普通技术人员将理解的，金属氢氧化物佐剂颗粒包含许多可用于配体交换的表面羟基。本公开设想疫苗制剂中的每个金属氢氧化物颗粒能够根据本发明与多种抗原形成多个表面复合物键，因此提供了高效的抗原性颗粒，其在通过抗原呈递细胞例如树突状细胞内化后可有效增强免疫应答。通过提供金属氢氧化物佐剂和包含羟基置换部分的抗原并在适合于实现配体交换的条件下使佐剂与抗原接触，可以容易地制备金属氢氧化物佐剂-抗原复合物。然后可将金属氢氧化物佐剂-抗原复合物有利地用于制备药物疫苗。如上所述，可以将本发明的金属氢氧化物佐剂/抗原复合物制备成每个佐剂颗粒具有大量抗原。在一个实施方式中，金属氢氧化物佐剂抗原复合物可具有的抗原与金属(金属氢氧化物佐剂的)的摩尔比为约1:1至约1:10或甚至更大。
另外，如实施例中所述，经由多价抗原-佐剂偶联剂与金属氢氧化物佐剂复合的抗原保留在注射部位，并且相对于非复合抗原或包含单价抗原-佐剂偶联剂的复合抗原提供更高的抗抗原抗体滴度。因此，预期可以制备本发明的疫苗制剂以比本领域先前已知的疫苗以更少的抗原分子和更少的佐剂颗粒有效地增强免疫应答。
为了配制疫苗，可以将适量的金属氢氧化物佐剂-抗原复合物与一种或多种其他组分例如稀释剂和赋形剂组合。可包含在本发明疫苗制剂中的稀释剂的一个实例是pH缓冲剂。可以使用的缓冲剂的例子是磷酸氢二钠和磷酸二氢钠的组合。其他实例包括这些缓冲剂的钾盐，或乙酸钠和乙酸的混合物。当将磷酸盐缓冲液与本发明的疫苗一起使用时，重要的是认识并说明该缓冲液对金属氢氧化物佐剂的影响。特别地，使用磷酸盐缓冲剂导致佐剂的表面羟基磷酸化，从而潜在地影响佐剂的配体交换吸附性能。因此，在包括佐剂预处理的本发明方案中，应当理解的是，可以通过将佐剂置于磷酸盐缓冲液中来完成预处理，并且修饰的程度将取决于缓冲液中磷酸盐的浓度。另一方面，在不包括佐剂预处理的方案中，即，在需要最大配体交换功能并因此需要最大羟基可用性的情况下，佐剂不应与磷酸盐缓冲液或会在配体交换吸附之前显著减少金属氢氧化物佐剂表面上可用的羟基数量的任何其他可能接触的组合物接触。当然，在通过配体交换吸附抗原后已经发生了磷酸盐缓冲液的使用，甚至在某些情况下甚至可能需要用其他含磷酸盐的组合物对佐剂进行后处理，例如以改变抗原/金属氢氧化物佐剂复合物的等电特性。
药物组合物和施用方式
在一些实施方式中，施用包含本公开提供的免疫原性组合物的药物组合物。在一些实施方式中，将包含免疫原性组合物和第二或另外的佐剂的药物组合物一起(同时或顺序)施用。在一些实施方式中，分别施用包含免疫原性组合物和第二或另外的佐剂的药物组合物。
在一些实施方式中，本公开提供了药物组合物，其包含免疫原性组合物，其具有药学上可接受的稀释剂，载体，增溶剂，乳化剂，防腐剂和/或佐剂。
在一些实施方式中，可接受的制剂材料优选在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施方式中，一种或多种制剂材料用于s.c.和/或I.V.施用。在一些实施方式中，药物组合物可以包含用于改变，维持或保持组合物的例如pH，重量克分子渗透浓度，粘度，澄清度，颜色，等渗性，气味，无菌性，稳定性，溶解或释放速率，吸附或渗透的制剂材料。在一些实施方式中，合适的制剂材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或赖氨酸)；氨基酸；或氨基酸。抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸，亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐，碳酸氢盐，Tris-HCl，柠檬酸盐，磷酸盐或其他有机酸)；填充剂(例如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡因，聚乙烯吡咯烷酮，β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充物单糖二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白)；着色剂，调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐的抗衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵，苯甲酸，水杨酸，硫柳汞，苯乙醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，洗必泰，山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油，丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(如普鲁尼克酸，PEG，脱水山梨糖醇酯，聚山梨酯如聚山梨酯20，聚山梨酯80，triton，三甲胺，卵磷脂，胆固醇，替洛沙泊)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨糖醇)；载体；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。(Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gennaro,ed.,Mack Publishing Company(1995)。在某些实施方式中，所述制剂包含PBS；20mM NaOAC，pH5.2，50mM NaCl；和/或10mM NAOAC，pH5.2，9％蔗糖。在一些实施方式中，最佳药物组合物将由本领域技术人员根据例如预期的给药途径，递送形式和所需剂量来确定，参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences，同上。在一些实施方式中，此类组合物可影响免疫原性组合物的物理状态，稳定性，体内释放速率和体内清除率。
在一些实施方式中，药物组合物中的主要媒介物或载体本质上可以是水性的或非水性的。例如，在一些实施方式中，合适的媒介物或载体可以是注射用水，生理盐水溶液或人工脑脊髓液，可能补充了肠胃外给药组合物中常见的其他物质。在一些实施方式中，盐水包括等渗磷酸盐缓冲盐水。在某些实施方式中，中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其他示例性载体。在一些实施方式中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液，或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，其可以进一步包括山梨糖醇或其合适的替代物。在一些实施方式中，可以通过将具有所需纯度的所选组合物与冻干饼或水溶液形式的任选的制剂试剂(Remington's Pharmaceutical Sciences，同上)混合来制备用于存储的免疫原性组合物。此外，在一些实施方式中，可以使用合适的赋形剂例如蔗糖将免疫原性组合物配制成冻干物。
在一些实施方式中，可以选择药物组合物用于肠胃外递送。在一些实施方式中，可以选择组合物用于吸入或通过消化道例如口服递送。这种药学上可接受的组合物的制备在本领域技术人员的能力范围内。
在一些实施方式中，制剂组分以施用部位可接受的浓度存在。在一些实施方式中，使用缓冲剂将组合物维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。
在一些实施方式中，当考虑肠胃外施用时，治疗组合物可以是在药学上可接受的媒介物中的无热原的、包含免疫原性组合物的肠胃外可接受的水溶液的形式。在一些实施方式中，用于肠胃外注射的载体是无菌蒸馏水，其中将免疫原性组合物配制为适当保存的无菌等渗溶液。在一些实施方式中，制备可包括将所需分子与试剂如可注射微球，生物易蚀颗粒，聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)，珠或脂质体一起配制，以提供产品的受控或持续释放，然后可以通过长效注射进行递送。在一些实施方式中，还可以使用透明质酸，其可以具有促进循环中持续时间的作用。在一些实施方式中，可植入药物递送装置可用于引入所需分子。
在一些实施方式中，可以配制药物组合物用于吸入。在一些实施方式中，可以将免疫原性组合物配制成用于吸入的干粉。在一些实施方式中，可以将包含免疫原性组合物的吸入溶液与用于气雾剂递送的推进剂一起配制。在一些实施方式中，溶液可以被雾化。在PCT申请号为PCT/US94/001875的PCT申请中进一步描述了肺部施用，其描述了经化学修饰的蛋白质的肺部递送。
在一些实施方式中，预期制剂可以口服施用。在一些实施方式中，可以以这种方式施用的免疫原性组合物与或不与通常用于固体剂型例如片剂和胶囊剂的配制的那些载体一起配制。在一些实施方式中，可以设计胶囊，以在生物利用度最大化和全身前降解最小化时在胃肠道的点释放制剂的活性部分。在一些实施方式中，可以包括至少一种另外的试剂以促进免疫原性组合物的吸收。在某些实施方式中，也可以使用稀释剂，调味剂，低熔点蜡，植物油，润滑剂，助悬剂，片剂崩解剂和粘合剂。
在一些实施方式中，药物组合物可以包含与适合于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中的免疫原性组合物的有效量。在一些实施方式中，通过将片剂溶于无菌水或另一种合适的媒介物中，可以将溶液制成单位剂量形式。在一些实施方式中，合适的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，例如碳酸钙，碳酸钠或碳酸氢钠，乳糖或磷酸钙；或诸如此类。或粘合剂，例如淀粉，明胶或阿拉伯胶；或润滑剂，例如硬脂酸镁，硬脂酸或滑石粉。
对于本领域技术人员而言，其他药物组合物将是显而易见的，包括使免疫原性组合物转变为持续或受控递送制剂的制剂。在一些实施方式中，用于配制多种其他持续或受控递送方式的技术，例如脂质体载体，可生物蚀解的颗粒或多孔珠和储库注射剂，也是本领域技术人员已知的。参见例如，PCT申请号PCT/US93/00829，其描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物颗粒的控制释放。在一些实施方式中，缓释制剂可包括呈成形制品形式的半透性聚合物基质，例如薄膜或微胶囊。缓释基质可包括聚酯，铝胶，聚丙交酯(美国专利3,773,919和EP058,481)，L-谷氨酸和γ-L-谷氨酸的共聚物(Sidman et al.,Biopolymers,22:547-556(1983))，聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)(Langer et al.,J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)和Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))，乙烯乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。在一些实施方式中，持续释放组合物还可包含脂质体，其可通过本领域已知的几种方法中的任何一种来制备。参见，例如，Eppstein etal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692(1985)；EP 036,676；EP 088,046和EP 143,949。
用于体内施用的药物组合物通常是无菌的。在一些实施方式中，这可以通过无菌滤膜过滤来完成。在某些实施方式中，在将组合物冻干的情况下，可以在冻干和重构之前或之后使用该方法进行灭菌。在一些实施方式中，用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或溶液形式存储。在一些实施方式中，肠胃外组合物通常被放置在具有无菌进入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。
在一些实施方式中，一旦配制了药物组合物，就可以将其以溶液，悬浮液，凝胶，乳剂，固体或脱水或冻干的粉末形式存储在无菌小瓶中。在一些实施方式中，这样的制剂可以以即用形式或以在施用前重构的形式(例如，冻干的)储存。
在一些实施方式中，提供了用于产生单剂量施用单位的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒既可以包含具有干燥蛋白质的第一容器，也可以包含具有水性制剂的第二容器。在一些实施方式中，包括含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和溶血注射器)的试剂盒。
在一些实施方式中，药物组合物的有效量包括用于治疗的免疫原性组合物将取决于例如治疗背景和目的。本领域技术人员将理解，根据某些实施方式，用于治疗的合适剂量水平将因此部分地取决于递送的分子，使用免疫原性组合物的适应症，施用途径，以及患者的身材(体重，体表或器官尺寸)和/或状况(年龄和总体健康状况)。在一些实施方式中，临床医生可以滴定剂量并改变施用途径以获得最佳治疗效果。
在一些实施方式中，施用频率将考虑所用制剂中免疫原性组合物的药代动力学参数。在一些实施方式中，临床医生将给予组合物直至达到实现所需效果的剂量。因此，在一些实施方式中，该组合物可以随时间推移以单剂量，或以两个或更多个剂量(其可以包含或可以不包含相同量的所需分子)或通过植入装置或导管的连续输注的形式施用。。本领域普通技术人员常规地进一步精炼适当剂量，并且在他们常规执行的任务范围内。在一些实施方式中，可以通过使用适当的剂量反应数据来确定适当的剂量。
在一些实施方式中，药物组合物的施用途径符合已知方法，例如口服，通过静脉内，腹膜内，脑内(实质内)，脑室内，肌内，皮下，眼内，动脉内，门内，或病变内途径；通过持续释放系统或通过植入装置。在某些实施方式中，可以通过推注或连续地通过输注或通过植入装置来施用组合物。在某些实施方式中，可以通过不同途径施用联合疗法的各个要素。
在一些实施方式中，可以通过植入期望的分子已被吸收或封装的膜，海绵或另一种合适的材料来局部施用该组合物。在一些实施方式中，在使用植入装置的情况下，该装置可以被植入任何合适的组织或器官中，并且期望的分子的递送可以通过扩散，定时释放的推注或连续施用来进行。在一些实施方式中，可能期望以离体方式使用包含免疫原性组合物的药物组合物。在这种情况下，将从患者体内取出的细胞，组织和/或器官暴露于包含免疫原性组合物的药物组合物中，然后将细胞，组织和/或器官随后植入患者体内。
在一些实施方式中，可以通过使用例如本文所述的那些方法植入已经遗传工程改造的某些细胞来表达和分泌多肽，从而递送免疫原性组合物。在一些实施方式中，此类细胞可以是动物或人类细胞，并且可以是自体的，异源的或异种的。在一些实施方式中，细胞可以被永生化。在一些实施方式中，为了减少免疫应答的机会，可以将细胞包囊以避免周围组织的浸润。在一些实施方式中，包封材料通常是生物相容的，半透性的聚合物外壳或膜，其允许释放蛋白质产物，但防止患者的免疫系统或周围环境的其他有害因素破坏细胞。组织。
使用方法
在一些方面，本公开考虑使用任何抗原，可以根据本公开提供的免疫原性组合物制备疫苗，所述抗原包括或被修饰，工程化或合成以包括能够与抗原-佐剂偶联剂共价连接的反应基团。
在一些实施方式中，本公开提供了用于增加抗原在受试者中在施用部位处的保留的方法，其包括施用包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗。
确定抗原在受试者中的保留的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施方式中，在用标记的抗原免疫后，使用全身IVIS扫描来评估抗原在施用部位的保留。在其他实施方式中，通过免疫组织化学染色或随时间推移的注射部位组织样品的电子显微镜研究来证实在施用部位的抗原保留。
在一些实施方式中，本公开提供了用于将抗原连续释放至受试者的引流淋巴结的方法，其包括施用包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗。评估抗原释放的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施方式中，在免疫接种后的各个时间收集的dLN活检样品的免疫组织化学染色确定抗原-佐剂复合物是否被保持在淋巴结和连续释放以刺激免疫应答。
描述了免疫系统组织学的标准方法(参见，例如，Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,N.Y.；Hiatt,et al.(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,Pa.；Louis,et al.(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,NewYork,N.Y.)。
在一些实施方式中，本公开提供了用于在受试者中增加免疫应答的方法，其包括施用包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗。引入宿主后，疫苗会引发免疫应答。“免疫应答”是指诱导，增加或持久固有或适应性免疫的激活或效率的应答。免疫应答包括，但是不限于，产生抗体和/或细胞因子和/或细胞毒性T细胞的激活，抗原呈递细胞，辅助性T细胞，树突状细胞和/或其它细胞应答。
在一些实施方式中，免疫原性组合物作为预防性疫苗或免疫原性组合物的一部分施用，预防性疫苗或免疫原性组合物在受试者中赋予对随后暴露于传染剂的抗性，或作为治疗性疫苗的一部分，其可用于引发或增强受试者对以下疾病的免疫应答。被感染物或肿瘤感染的对象中的先前存在的抗原，例如病毒抗原。
预防性或治疗性免疫应答的预期结果可能会根据要治疗的疾病或状况或本领域众所周知的原理而有所不同。例如，针对传染原的免疫应答可以完全阻止传染原的定殖和复制，从而影响“无菌免疫”和不存在任何疾病症状。但是，如果抗感染剂的疫苗减少了症状的数量，严重性或持续时间，减少有症状人群的人数，或减少传染源的传播，则可以认为是有效的。类似地，针对癌症，过敏原或传染原的免疫应答可以完全治疗疾病，减轻症状或可以是针对疾病的整体治疗干预的一个方面。
用于分析受试者中的抗体应答的方法是本领域技术人员已知的。例如，在一些实施方式中，通过ELISA测定法测量免疫应答的增加以确定抗原特异性抗体滴度。
在一些实施方式中，本公开提供了用于在受试者中增加广泛中和性抗体的方法，其包括施用包含本文所述的免疫原性组合物的疫苗。测量中和性抗体的方法是本领域普通技术人员已知的。在一些实施方式中，中和性抗体的引发是在中和测定中测量。
鉴定和测量中和性抗体的方法是本领域技术人员已知的。例如，在HIV疫苗领域中，中和性抗体具有中和大多数被测田间分离株的能力。由多数它是指在野外分离的代表性和多样化的集合，所述抗体能够中和菌株的至少50％，和测试菌株的优选至少75％。在本文中，“中和”是指在所述抗体浓度下在本文所述的体外病毒感染性测定中降低HIV感染性滴度的效果。
中和性抗体是疫苗保护效力的指标，但是直接保护免受病毒的亚致死性或致命性攻击无疑证明了疫苗的效力。在示例性动物模型系统中，进行细菌或病毒攻击，其中对受试者进行免疫，任选地不止一次，并在对疫苗的免疫应答形成后进行攻击。可以通过测量受攻击者的发病率或死亡率来量化消除中和的可能性。
在一些实施方式中，免疫原性组合物的施用在免疫的受试者中诱导改善的B-记忆细胞应答。改善的B记忆细胞反应意在表示通过与抗原的体外分化刺激，在遇到抗原后能够分化为分泌抗体的浆细胞的外周血B淋巴细胞频率增加。在一些实施方式中，本公开提供了用于增加抗体分泌B细胞的数量的方法。在一些实施方式中，所述抗体分泌B细胞是骨髓浆细胞，或生发中心B细胞。在一些实施方式中，测量抗体分泌B细胞的数量的方法，包括，但不限于，抗原特异性ELISPOT测定法和浆细胞，或在免疫接种后的不同时间点收集的生发中心B细胞的流式细胞术研究。
可以使用流式细胞术的方法，包括荧光激活细胞分选(FACS)(参见，例如，Owens,et al.(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,JohnWiley and Sons,Hoboken,N.J.；Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,N.J.；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,N.J.).Fluorescent reagents suitable for modifying nucleic acids,including nucleic acid primers and probes,polypeptides,and antibodies,foruse,e.g.,as diagnostic reagents,are available(Molecular Probes(2003)Catalogue,Molecular Probes,Inc.,Eugene,Oreg.；Sigma-Aldrich(2003)Catalogue,St.Louis,Mo.)
癌症和癌症免疫疗法
在一些实施方式中，本文所述的免疫原性组合物或疫苗可用于治疗与异常细胞凋亡或分化过程相关的疾病(例如，细胞增殖性疾病(例如，过度增殖性疾病)或细胞分化性疾病，例如癌症)。下文描述了适合用本发明的方法治疗的癌症的非限制性实例。
细胞增殖性和/或分化性疾病的实例包括癌症(例如癌，肉瘤，转移性疾病或造血性肿瘤性疾病，例如白血病)。转移性肿瘤可源自多种原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺癌，结肠癌，肺癌，乳腺癌和肝癌。因此，本文所用的包含免疫原性组合物或疫苗的组合物可以施用于患有癌症的患者。
如本文所用，我们可以使用术语“癌”(或“癌性”)，“过度增殖”和“肿瘤性”来指具有自主生长能力(即以快速增殖性细胞生长为特征的异常状态或状况)的细胞。过度增殖和赘生性疾病状态可以分类为病理性(即，表征或构成疾病状态)，或者它们可以分类为非病理性(即，偏离正常状态但不与疾病状态相关联)。该术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化的细胞，组织或器官，而与组织病理学类型或侵入性阶段无关。“病理性过度增殖”细胞发生在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中。非病理性过度增殖细胞的实例包括与伤口修复相关的细胞的增殖。
术语“癌”或“肿瘤”用于指各种器官系统的恶性肿瘤，包括那些影响肺，乳腺，甲状腺，淋巴腺和淋巴组织，胃肠道器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及腺癌。通常认为其包括诸如大多数结肠癌，肾细胞癌，前列腺癌和/或睾丸肿瘤，肺非小细胞癌，小肠癌和食道癌的恶性肿瘤。
术语“癌”是本领域公认的，是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌，胃肠道系统癌，泌尿生殖系统癌，睾丸癌，乳腺癌，前列腺癌，内分泌系统癌和黑色素瘤。该免疫原性组合物可用于治疗患有，怀疑患有或可能具有发展为包括肾癌或黑素瘤或任何病毒性疾病的任何类型的癌症的高风险的患者。示例性癌包括从子宫颈，肺，前列腺，乳腺癌，头颈癌，结肠癌和卵巢癌的组织形成的癌。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺结构的癌。
增殖性疾病的其他例子包括造血性肿瘤疾病。如本文所用，术语“造血性肿瘤性疾病”包括涉及造血起源的增生/肿瘤细胞的疾病，例如源自髓样、淋巴或红系谱系或其前体细胞的疾病。优选地，所述疾病源自分化不良的急性白血病(例如，红细胞白血病和急性巨核细胞白血病)。其他示例性髓样疾病包括但不限于急性髓样白血病(APML)，急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML)(Vaickus,L.(1991)Crit.Rev.in Oncol./Hemotol.11:267-97)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)，包括B谱系ALL和T谱系ALL，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，前淋巴细胞性白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)和沃登斯通巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其他形式包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体，外周T细胞淋巴瘤，成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)，大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)，霍奇金氏病和里德-斯特恩伯格氏病。
本领域技术人员将认识到，足以减少肿瘤生长和大小或治疗有效量的免疫原性组合物或疫苗的量不仅会随所选的特定组合物或疫苗而变化，而且施用途径、所治疗疾病的性质以及患者的年龄和状况，最终将由患者的医师或药剂师决定。在本方法中使用的化合物给出的时间长度会因个人而异。
在一些实施方式中，本公开提供了在有需要的受试者中减少或减小肿瘤大小或抑制肿瘤生长的方法，其包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物或疫苗。在一些实施方式中，本公开提供的方法用于诱导患有癌症的受试者中的抗肿瘤反应，所述方法包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物或疫苗。
在一些实施方式中，本公开提供了刺激免疫应答的方法，包括施用本文所述的免疫原性组合物或疫苗。在一些实施方式中，免疫应答是体液免疫应答。在一些实施方式中，免疫应答是抗肿瘤免疫应答。
本领域技术人员将认识到，本文中提及的治疗扩展到所指出的癌症和症状的预防以及治疗。
传染性疾病
在一些实施方式中，本文公开的免疫原性组合物或疫苗可用于治疗急性或慢性感染性疾病。因此，在一些实施方式中，免疫原性组合物或疫苗被施用用于治疗局部或全身性病毒感染，包括，但不限于，免疫缺陷(例如HIV)，乳头状瘤(例如，HPV)，疱疹(例如HSV)，脑炎，流行性感冒(例如人A型流感病毒)和普通感冒(例如人鼻病毒)病毒感染。在一些实施方式中，将包含免疫原性组合物的药物制剂局部施用以治疗病毒性皮肤病，例如疱疹皮损或带状疱疹或生殖器疣。在一些实施方式中，免疫原性组合物或疫苗被施用以治疗全身性病毒疾病，包括，但不限于，AIDS，流感，普通感冒，或脑炎。
在一些实施方式中，本公开提供了用于减少有需要的受试者中的病毒感染，其包括向所述受试者施用本文描述的免疫原性组合物或疫苗。在一些实施方式中，本公开提供了用于在患有癌症的受试者中诱导抗病毒应答的方法，其包括向受试者施用本文所述的免疫原性组合物或疫苗。
本领域技术人员将认识到，本文中对治疗的引用扩展到所指出的感染和症状的预防以及治疗。
试剂盒
在一些实施方式中，本公开提供了试剂盒，其包含本文所公开的免疫原性组合物或疫苗以及使用说明。试剂盒可在合适的容器中包含免疫原性组合物或疫苗，一种或多种对照以及本领域众所周知的各种缓冲液，试剂，酶和其他标准成分。在一些实施方式中，所述试剂盒进一步包含一种或多种佐剂。因此，在一些实施方式中，免疫原性组合物或疫苗和佐剂在同一小瓶中。在一些实施方式中，免疫原性组合物和佐剂在单独的小瓶中。
该容器可以包括至少一个小瓶，小孔，试管，烧瓶，瓶，注射器或其他容器装置，可以在其中放置免疫原性组合物或疫苗，并且在某些情况下适当地等分。如果提供了其他组件，则该试剂盒可以包含其他可以放置该化合物的容器。试剂盒还可包括用于容纳免疫原性组合物或疫苗的工具，以及密闭封闭的任何其他试剂容器以进行商业销售。这样的容器可以包括将期望的小瓶保留在其中的注射或吹塑塑料容器。容器和/或试剂盒可包括带有使用说明和/或警告的标签。
在一些实施方式中，本公开提供了试剂盒，其包括容器，该容器包含疫苗，该疫苗包含免疫原性组合物，任选的药学上可接受的载体以及包装插页，该包装插页包含用于治疗或延缓受试者癌症进展的疫苗施用说明。在一些实施方式中，试剂盒还包含佐剂和用于治疗或延缓受试者癌症的进展的佐剂施用说明。
在一些实施方式中，本公开提供了一种包括容器的试剂盒，所述容器包含疫苗，所述疫苗包含免疫原性组合物，任选的药学上可接受的载体，和包装插页，所述包装插页包含单独或与佐剂和任选的药学上可接受载体组合施用的说明书，用于治疗或延缓受试者中的感染的进展。
通过以下实施例进一步说明本公开，其不应解释为进一步限制。在本申请中引用的所有附图和所有参考文献，专利和公开的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
尽管已经参考本公开的特定实施方式描述了本公开，但是本领域技术人员应当理解，在不脱离本公开的真实精神和范围的情况下，可以进行各种改变并且可以替换等同方式。另外，可以做出许多修改以使特定情况，材料，物质组成，过程，一个或多个处理步骤适应本公开的目的，精神和范围。所有这些修改旨在落入本公开的范围内。以下是用于实施本发明的具体实施方式的实施例。提供这些实施例仅出于说明性目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，否则本发明的实施将采用本领域技术范围内的蛋白质化学，生物化学，重组DNA技术和药理学的常规方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,currentaddition)；Sambrook,et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2nd Edition,1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick and N.Kaplan eds.,Academic Press,Inc.)；Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry3rd Ed.(Plenum Press)Vols A and B(l992)。
材料和方法
抗体和试剂
对于脾组织切片，对组织进行B220染色(克隆RA3-6B2，Biolegend)，IgD(11-26c.2a，Biolegend)，CD35(克隆8C12，BD)，Ki67(克隆SolA15，ThermoFisher)，B220(克隆RA3-6B2，eBioscience)，GL7(Biolegend)，CD3(克隆17A2，Biolegend)和CD38(克隆90，Biolegend)用于生发中心染色。对于ELISA，使用了抗小鼠山羊IgG-HRP(Bio-rad)。为了在过继转移模型中对VRC01gHL B细胞染色，用CCR7 PE(4B12；Biolegend)，CD86 BV605(GL-1；Biolegend)和链霉亲和素BV711(Biolegend)对细胞染色。除非另有说明，否则肽偶联剂购自EMD Millipore(Novabiochem)。氢氧化铝佐剂(Al-Hydrogel)和磷酸铝(AdjuPhos)佐剂购自InvivoGen。
磷酸丝氨酸肽合成。
通过固相肽合成手动合成肽。低负荷Tentagel Rink Amide树脂(PeptidesInternational，0.2meq/g)用于合成所有肽。在25℃下使用4当量的Fmoc-Ser(PO(OBzl)OH)-OH与3.95当量的HATU(六氟磷酸氮杂苯并三唑四甲基铀)进行肽偶联2小时。使用DMF中的5％DBU(1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯)将磷酸丝氨酸残基(以下称为“PS”)脱保护，而所有其他残基在DMF中的20％哌啶中脱保护。进行双偶联以添加第三种以外的任何PS单体。加入PS单体后，加入6个单元的Fmoc保护的低聚乙二醇接头(PeptidesInternational)以充当反应性接头和PS残基之间的间隔基。为了使PS-接头与蛋白质反应，将马来酰基-β-丙氨酸(MilliporeSigma)偶联至肽的N-末端。将肽在25℃下在95％三氟乙酸(TFA)，2.5％H2O和2.5％三异丙基硅烷(TIPS)中裂解2.5小时。在冰冷的乙醚中沉淀后，将肽干燥，重悬于0.1M TEAA缓冲液(pH7)中，并使用在乙腈梯度中的0.1M TEAA缓冲液，在C18柱上通过HPLC纯化。通过MALDI-TOF质谱法确认肽质量。
将PS接头偶联至蛋白质抗原
使用硫醇-马来酰亚胺反应，用PS-接头修饰抗原。在含1mM EDTA的PBS溶液中，将1mg/mL的蛋白质抗原在10当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP，ThermoFisher)中还原15分钟，然后使用Amicon旋转过滤器(10kDa MWCO)离心过滤除去TCEP。然后使抗原与马来酰亚胺-PS缀合物反应。为了与eOD和细胞色素c偶联，使1mg/mL的抗原与2摩尔当量的马来酰亚胺-PS在4℃下于PBS中反应过夜。为了与SOSIP三聚体反应，将20摩尔当量的马来酰亚胺-PS接头添加到PBS中的1mg/mL SOSIP中，以确保与可用硫醇的完全反应。然后使用离心过滤器(10kDa MWCO)将蛋白质与未反应的肽接头分离。最初使用与包含光谱柄的类似接头(马来酰亚胺-二苯并环辛炔接头)的平行反应监测反应，并使用孔雀石绿测定法(ThermoFisher)确认磷酸丝氨酸与抗原的偶联。使用标准曲线对孔雀石绿测定法进行定量，该标准曲线是使用已知浓度的原始PS接头制备的。使用NHS-AF647(ThermoFisher)或NHS-IRDye 800CW(LI-COR)，通过6当量荧光团与eOD或SOSIP(1mg/mL)在50mM碳酸钠缓冲液中反应2小时，制备标记的蛋白，然后使用离心过滤(10kDa MWCO)纯化。通过使NHS-DBCO(SigmaAldrich)异双功能交联剂与PE在硼酸钠缓冲液(pH8.0)中以不同的接头:蛋白摩尔比(2、4、8、16和32当量)室温反应4小时，制备藻红蛋白(PE)-PS缀合物。通过离心过滤除去未反应的接头，然后将DBCO修饰的PE(1mg/mL)拆成与2摩尔当量的叠氮化物-PS4或叠氮化物-Ser3PS1在PBS中于4℃过夜的两个反应。然后通过离心过滤除去未反应的PS接头。
HIV eOD和SOSIP抗原
为了评估疫苗抗原的PS修饰，生产了具有用于肽标签偶联的游离N端半胱氨酸残基的位点特异性引入的HIV包膜gp120抗原eOD-GT8。eOD-GT8(或“eOD”)是21.5kDa的种系靶向gp120工程化外结构域抗原，旨在引发人类B细胞的启动，其能够发展出一组重要的CD4结合位点特异性广泛中和性抗体(bnAb)，称为VRC01类抗体。Sok,D.et al.,(2016)Science353,1557-1560；Jardine,J.G.et al.(2015)Science 349,156-161；Jardine,J.et al.(2013)Science 340,711-716。eOD的氨基酸序列在SEQ ID NO:1中描述。
SEQ ID NO:1
TGCHHHHHHGGDTITLPCRPAPPPHCSSNITGLILTRQGGYSNDNTVIFRPSGGDWRDIARCQIAGTVVSTQLFLNGSLAEEEVVIRSEDWRDNAKSICVQLNTSVEINCTGAGHCNISRAKWNNTLKQIASKLREQYGNKTIIFKPSSGGDPEFVNHSFNCGGEFFYCDSTQLFNSTWFNSTGSAFKVAAWTLKAAA
除eOD抗原外，还用PS接头在每个启动子的C末端修饰稳定化gp140 HIV Env三聚体，称为SOSIP。半胱氨酸修饰的SOSIP的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:2
TGAENLWVTVYYGVPVWKDAETTLFCASDAKAYETEKHNVWATHACVPTDPNPQEIHLENVTEEFNMWKNNMVEQMHTDIISLWDQSLKPCVKLTPLCVTLQCTNVTNNITDDMRGELKNCSFNMTTELRDKKQKVYSLFYRLDVVQINENQGNRSNNSNKEYRLINCNTSAITQACPKVSFEPIPIHYCAPAGFAILKCKDKKFNGTGPCPSVSTVQCTHGIKPVVSTQLLLNGSLAEEEVMIRSENITNNAKNILVQFNTPVQINCTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYATGDIIGDIRQAHCNVSKATWNETLGKVVKQLRKHFGNNTIIRFANSSGGDLEVTTHSFNCGGEFFYCNTSGLFNSTWISNTSVQGSNSTGSNDSITLPCRIKQIINMWQRIGQAMYAPPIQGVIRCVSNITGLILTRDGGSTNSTTETFRPGGGDMRDNWRSELYKYKVVKIEPLGVAPTRCKRRVVGRRRRRRAVGIGAVFLGFLGAAGSTMGAASMTLTVQARNLLSGIVQQQSNLLRAPEAQQHLLKLTVWGIKQLQARVLAVERYLRDQQLLGIWGCSGKLICCTNVPWNSSWSNRNLSEIWDNMTWLQWDKEISNYTQIIYGLLEESQNQQEKNEQDLLALDGTKHHHHHHC
疫苗抗原合成和PS接头缀合
如前所述合成了eOD gp120和SOSIP三聚体抗原。Jardine,J.et al.(2013)Science 340,711-716；Kulp,D.W.et al.(2017)Nature communications 8,1655。简而言之，具有N端半胱氨酸的eOD在HEK细胞中表达，并在Nickel亲和柱上，然后是Superdex7510/300柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱法纯化。简而言之，合成了三聚体基因并通过Genscript将其克隆到pHLsec中，然后使用293fectin与pcDNA3.1质粒上的人furin以2:1的三聚体与furin DNA比率共转染到FreeStyle 293-F细胞(ThermoFisher)中。转染后五天，通过离心收集三聚体上清液，然后通过使用HisTrap HP柱(GE Healthcare)的亲和色谱，然后是使用S200增加柱(GE Healthcare)的体积排阻色谱(SEC)在PBS中以0.5ml/mL流速纯化。使用DAWN HELEOS II和Optilab T-rEX仪器(Wyatt Technology)通过SEC多角度光散射(SECMALS)来确定三聚体的分子量。
抗原-明胶结合和释放
使用荧光标记的蛋白质或通过ELISA进行alum结合实验。除非另有说明，否则所有结合实验和免疫接种均使用10:1的alum:蛋白质的重量比。为了进行结合测定，首先将蛋白抗原与Al-Hydrogel在25℃的PBS中孵育30分钟以允许结合，然后添加小鼠血清至终浓度为10％(v/v)。将蛋白质，alum和血清混合物在37℃下孵育24小时，并将溶液以10Kxg离心10分钟以沉淀alum。然后通过荧光或ELISA测量上清液中未结合蛋白的浓度。使用TecanInfinite M200 Pro吸光度/荧光板读数器进行荧光测量。将荧光强度标准化至经过相同处理但缺少alum的样品的总荧光。为了进行ELISA测量，将96孔Nunc MaxiSorp板(ThermoFisher)涂布VRC01抗体，用1％BSA封闭，然后将抗原的系列稀释液以2μg/mL的最大浓度加入板中。然后使用抗His标签HRP(1:5000稀释度)检测抗原，洗涤并用TMB底物显影。然后通过与已知浓度的对照抗原的吸光度值比较来定量抗原的量。
B细胞与alum-抗原缀合物的相互作用。
使用由Daniel Lingwood教授(Ragon Institute of MGH，MIT和Harvard)友情提供的表达gl-VRC01的Ramos B细胞进行体外实验。钙通量测量是在37℃的无血清RPMI中，在钙存在下，使用装有10uM Flou-4染料(ThermoFisher)的细胞进行30分钟。将B细胞洗涤一次，并在激活之前加热至37℃。将抗原和alum悬浮在含有10％FBS的完整RPMI中，然后再添加到B细胞中。在添加浓度为1μg/mL eOD的抗原之前，先测量基线荧光1分钟。将alum以10μg/mL的浓度添加到B细胞中。在添加抗原之前，将Fluo-4荧光发射标准化至基线值。对于共聚焦和TEM成像实验，将表达gl-VRC01的Ramos B细胞与eOD/明胶制剂在37℃的含10％FBS的RPMI培养基中一起孵育1小时。对于共聚焦成像，然后将细胞在PBS 1％多聚甲醛中固定15分钟，洗涤，用DAPI和鬼笔环肽染色，安装在载玻片上，并使用倒置Olympus X71显微镜成像。将用于TEM分析的样品固定在含3％多聚甲醛，2％谷氨酸，5％蔗糖的0.1M卡可基酸钠缓冲液(pH7.0)中，制成颗粒，然后固定在佛罗拿-乙酸盐缓冲液中的1％OsO4中。将细胞用在佛罗拿-乙酸盐缓冲液(pH6.0)中的0.5％乙酸铀酰过夜染色，然后脱水并包埋在Embed-812树脂中。在Leica EM UC7超显微镜用薄片切片机上用Diatome金刚石刀在以50nm的厚度设定切割切片，并用2％的乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。使用FEI Tecnai酒精在80KV下对切片进行检查，并使用AMT ccd相机拍摄。
对于过继转移实验，按照制造商的规程，使用抗小鼠CD43(Ly-48)
Figure BDA0002640845780000721
MicroBeads(Miltenyi Biotec)从纯合小鼠VRC01gHL BCR敲入小鼠的脾脏纯化B细胞。在某些实验中，纯化的B细胞随后在37％的温度下，在0.1％BSA-DPBS中用5μM Cell-traceViolet(ThermoFisher)标记9.5分钟。免疫前1-3天，将106个eOD特异性B细胞经眼眶后注射到受体小鼠。
动物和免疫接种。
根据IACUC批准的协议，根据联邦，州和当地准则进行了小鼠实验和处理。六至八周大的雌性BALB/c小鼠购自Jackson Laboratory。为了进行成像实验，将用AF647标记的10μg eOD与100μL PBS中的100μLalum一起皮下注射到剃毛的尾巴基部。除非另有说明，否则使用eOD和SOSIP进行的免疫原性实验使用的是5μg抗原与50μgalum在100μL PBS中混合的免疫制剂。在某些制剂中，以10μg/mL胆固醇的浓度注射含皂苷的纳米颗粒。除非另有说明，否则免疫应答是在单次初次免疫后测量的。每隔一周通过眼眶后出血收集血清以用于ELISA测量。
全小鼠成像和淋巴结运输。
使用IVIS荧光成像系统随时间推移在注射部位测量用AF647标记的抗原的信号。将在第0天、注射后30分钟测量的总辐射度标准化至初始IVIS信号。使用LI-COR Odyssey荧光成像仪测量淋巴结中的抗原积聚。对于这些实验，通过添加0.5nmol PS4-680和5μgIR800染料标记的eOD的混合物标记alum(50μg)。将alum/eOD样品在25℃下混合30分钟，然后皮下注射到BALB/c小鼠组。在各个时间点切除腹股沟淋巴结，并通过LICOR成像系统在700nm和800nm波长下测量全组织荧光。值代表积分荧光强度。对于组织学实验，通过皮下或腹膜内注射10μg AF647标记的抗原和100μgalum来免疫小鼠。
抗体滴度的ELISA分析。
为了用ELISA法测量抗eOD滴度，将Nunc MaxiSorp平板直接涂有未修饰的单体eOD(1μg/mL)，并用含1％BSA的PBS封闭。对于SOSIP ELISA，将板用ST-II抗体(2μg/mL)涂布，然后在用PBS中的1％BSA封闭后，将包含ST-II标签的SOSIP添加到板中。通过用兔抗His标签抗体(Genscript)包被ELISA板，然后封闭，然后添加his标签化SOSIP gp120抗原(2μg/mL)，测量针对SOSIP gp120的应答。在25℃下将血清的系列稀释液添加至封闭的板中2小时，在具有0.05％Tween-20的PBS中洗涤，并与抗小鼠IgG-HRP(BioRad)一起孵育。然后用TMB底物显影ELISA板，并测量450nm的吸光度值。基部封闭ELISA是使用涂有人VRC01(2μg/mL)的板，然后是在PBS中用1％BSA封闭的步骤，然后在25℃下添加SOSIP(2μg/mL)2小时而进行。为了隐藏三聚体的基部，在添加血清稀释液之前，先加入20μg/mL基部结合抗体30分钟。将血清稀释液直接添加到仍保留有基部结合抗体的孔中，并将吸光度值与用PBS中的1％BSA代替基部结合抗体孵育的孔进行比较。使用包被在链霉亲和素(2μg/mL)中的平板，然后加入生物素-H6肽(Genscript)来测量His-tag特异性抗体。对于SOSIP和eOD免疫接种，分别在0.1OD和0.3OD的吸光度截止点测定滴度。
皂苷佐剂合成
如前所述，制备了由自组装胆固醇，磷脂和Quillaja(Quil-A)皂苷组成的ISCOM样纳米颗粒，用于某些免疫接种。45所有合成均在无菌条件下用无菌试剂进行。简而言之，将胆固醇(Avanti Polar Lipids 700000)和DPPC(Avanti Polar Lipids 850355)各10mg分别溶于20％MEGA-10(SigmaD6277)洗涤剂中，最终浓度为20mg/ml和50mg。将Quil-A皂苷(InvivoGen vac-quil)以100mg/ml的最终浓度溶于MQ H2O中。接下来，将DPPC溶液添加到胆固醇中，然后快速连续添加Quil-A皂苷，并用PBS补足体积，最终浓度为1mg/ml胆固醇和2％MEGA-10。使溶液在25℃下平衡过夜，然后使用10k MWCO膜针对PBS透析5天。然后，将佐剂溶液使用0.2μm Supor针筒式过滤器过滤灭菌，使用50k MWCO中心过滤器浓缩，然后使用Sephacryl S-500HR尺寸排阻色谱柱通过FPLC进一步纯化。最后，通过阴性着色剂TEM和DLS对每个佐剂批次进行表征，以确认均一形态和大小，并通过Limulus Amebocyte Lystae分析(Lonza QCL-1000)验证低内毒素。最终佐剂浓度通过胆固醇定量(Sigma MAK043)确定。
ELISPOT和生发中心分析。
除非另有说明，否则根据制造商的说明在免疫接种后3个月进行骨髓ELISPOT(MabTech)。用抗小鼠IgG抗体包被ELISPOT板，然后在37℃在完全RPMI中将分离的骨髓细胞添加到板中4小时(每孔500k或100k细胞分别用于抗原特异性或总IgG应答)。洗涤板后，通过在25℃下添加生物素化抗原(1μg/mL)2小时，然后加入链霉亲和素-HRP来测量抗原特异性应答。一式三份测量从每只小鼠分离的骨髓细胞。为了测量生发中心应答，在免疫接种9天后处死小鼠，并机械消化淋巴结并使其通过70um过滤器。然后将细胞用针对CD3e，B220，CD38和GL-7以及AF647标记的eOD 60mer纳米颗粒的抗体染色。Jardine,J.et al.(2013)Science 340,711-716。为了识别eOD特异性B细胞。使用BD Canto进行流式细胞仪分析。
注射部位，淋巴结和脾脏的免疫组织化学。
通过皮下或腹膜内注射10μg AF647标记的抗原和100μgalum对小鼠进行免疫。使用来自注射部位的皮肤，脾脏或淋巴结组织制备组织学切片，其在37℃下用4％多聚甲醛固定过夜，洗涤并包埋在3wt％低熔点琼脂糖中，然后在冰上冷却并固化15分钟。使用Vibratome(Leica VT1000S)制备100-200um切片，并悬浮在冰冷PBS中，然后在37℃下转移至含有10％山羊血清，0.2％Triton-X100和0.05％叠氮化钠的封闭溶液中过夜，然后进行免疫染色。对于注射部位切片，将切片在morin(1uM)在0.5％乙酸在乙醇中的溶液中染色。对于淋巴结和脾脏切片，对组织进行B220(克隆RA3-6B2，Biolegend)，IgD(11-26c.2a，Biolegend)，CD35(克隆8C12，BD)，Ki67(克隆SolA15，ThermoFisher)和PS4-Cy3(1:200稀释度，1uM)染色。将抗体以1:100的稀释度在封闭缓冲液中于37℃过夜使用，然后用PBS0.05％Tween洗涤，并用ProLong Diamond防褪色安装介质(Life Technologies)安装在载玻片上。然后使用具有10倍或25倍水物镜的Leica SP8激光扫描共聚焦显微镜采集图像。然后用Fiji软件处理图像。
淋巴结中的铝的ICP-MS。
使用与eOD或PS4-eOD混合的200μgalum的免疫接种，进行电感偶联等离子体质谱(ICP-MS)测量。在指定的时间点切除腹股沟淋巴结，将其溶解在硝酸中，在MilestoneUltraWave微波消化系统中于200℃消化20分钟，然后稀释到水中至2％硝酸，通过Agilent7900ICP-MS进行分析。使用从1μg/ml到1ng/mL的铝的标准曲线以及用于每个样品的铑的内标来定量样品。
结合至alum的三聚体的抗原性。
使用改良夹心ELISA方案测量结合至alum的SOSIP三聚体的抗原性。首先将用PS4接头修饰的无关蛋白(来自酿酒酵母的细胞色素c，Sigma Aldrich)涂在ELISA板上过夜。然后将100μg/mL的alum添加到平板上，以结合存在于细胞色素c上的暴露的PS残基。对照孔用2μg/mL的小鼠VRC01包被。用含有0.05％Tween-20的PBS洗涤板，然后与含有SOSIP-PS(1μg/mL)的1％BSA溶液在25℃孵育2小时。以100ng/mL的浓度加入广泛中和性抗体或基部特异性抗体，并用次级Ab-HRP缀合物检测，然后在TMB底物中显影。
实施例1：经由多价抗原-佐剂偶联剂将蛋白抗原吸附至alum
设计了短肽/聚合物接头，其通过磷酸根基团和alum颗粒表面的羟基之间的配体交换来介导与alum的结合。通过固相合成制备了由1-12个连续磷酸丝氨酸(PS)，之后是短聚(乙二醇)间隔基和N端马来酰亚胺官能团组成的肽。
图1A显示了包含磷酸丝氨酸接头的马来酰亚胺-磷酸丝氨酸偶联剂的化学结构以及包含溶剂暴露的游离巯基(-SH)的蛋白质抗原的示意图。图1B显示了马来酰亚胺-磷酸丝氨酸偶联剂的化学结构，其中马来酰亚胺部分经由硫醚键与包含蛋白质抗原的巯基共价连接。将最终的偶联剂-抗原缀合物与alum在缓冲盐水中混合，由此通过包含磷酸丝氨酸的磷酸根基团和存在于alum表面上的表面羟基之间的配体交换将抗原偶联或吸附至alum。图1C大体描绘了当偶联或吸附至alum时偶联剂-抗原缀合物的结合和定向。
为了评估与单价相比于多价偶联剂缀合的蛋白抗原至alum的吸附，测定了模型蛋白(酵母细胞色素c)至alum的吸附。图1D显示了细胞色素c在alum上的吸附，作为蛋白质浓度的函数。细胞色素c蛋白用偶联剂功能化，该偶联剂通过使偶联剂上的马来酰亚胺与蛋白质上的溶剂暴露的半胱氨酸反应来改变磷酸丝氨酸残基的数量(n)。对于所有偶联剂，细胞色素c的官能化程度均相同(数据未显示)。通过离心除去alum和结合的蛋白质，并测量上清液中未结合的蛋白质，确定结合至alum的蛋白质的量。然后假定结合蛋白的量是从蛋白的总量减去未结合蛋白的量。如图1D所示，与alum佐剂结合的细胞色素随着磷酸丝氨酸残基数量的增加而增加。这些数据证明，与包含两个或四个磷酸丝氨酸的多价偶联剂缀合的蛋白质比包含一个磷酸丝氨酸的单价偶联剂更大程度地结合至alum。
在体内，PS锚定蛋白可被间隙液中存在的血清蛋白或有机磷酸根离子从alum表面置换。为了评估PS价数在实现稳定结合中的作用，用2-20个接头修饰了240KDa的荧光蛋白藻红蛋白(PE)，每个接头含有一个或四个PS残基，图2A。通过叠氮化物-PS4和DBCO-荧光团之间的无铜点击反应，然后进行HPLC纯化，制备了使用染料-PS4缀合物的成像实验。使用上述针对肽的磷酸丝氨酸部分描述的相同方法制备叠氮化物-PS4和叠氮化物-Ser3-PS1肽。这些接头不包括低聚乙二醇接头。在该肽的N端，使用Fmoc-5-叠氮基戊酸(Anaspec)代替马来酰-β-丙氨酸，在20％的哌啶中将该肽脱保护，然后在TFA中裂解。将PS1或PS4修饰的PE与alum混合30分钟以允许结合，然后在含有10％血清的缓冲液中孵育24小时，并通过荧光光谱法测量此两步过程后结合至alum的蛋白质。如图2B所示，未修饰的PE显示在alum上几乎没有保留，但PS接头促进了大部分蛋白是alum结合的，并且仅需要每个蛋白2-4个PS4接头以实现与具有单一PS残基的10-20个接头相同水平的结合。因此，即使对于非常大的蛋白质，在血清存在下，采用少量多价PS接头的修饰也促进与alum的稳定结合。
在下一个实验中，将eOD抗原与包含1-8个磷酸丝氨酸的单个肽接头或包含丝氨酸残基的对照接头偶联，并评估与alum的结合。在缓冲液中，无论肽接头组成如何，添加的eOD中的90％在30分钟内吸附至alum(数据未显示)。然而，当具有吸附的eOD的alum在10％的血清中孵育24小时时，只有约2％的未修饰或对照丝氨酸修饰的eOD保持结合，而PS修饰的抗原显示在alum上的保留随着PS价数增加而增加，对于亲和接头中的4或更多个磷酸丝氨酸，平台为～75％保留，图3。因此，通过引入多价PS接头可以容易地调节免疫原与alum的结合。
另一个HIV抗原，SOSIP，在每个启动子的C-末端用游离半胱氨酸修饰，三个PS接头可以在每个三聚体的基部处缀合至其，如图4所示。进行偶联剂与工程化HIV抗原eOD和SOSIP的共价结合。图5显示了24小时后在10％血清存在下从alum释放的SOSIP的分数。通过ELISA相对于已知浓度的蛋白质标准物测量蛋白质浓度。这些数据证明，在暴露于血清后，经由多价偶联剂偶联至alum的蛋白抗原比单独的蛋白抗原或经由单价偶联剂偶联至alum的蛋白抗原更大程度地保留在alum上。
实施例2：抗原特异性B细胞吞食alum/PS-抗原纳米颗粒，并在体外表现出增强的激活。
alum不是整体固体，而是由氢氧化铝纳米晶体的纤维状聚集体组成。Harris,J.R.et al.(2012)Micron 43,192-200。在免疫原与alum颗粒之间紧密结合的情况下，抗原随时间向淋巴结的递送可以通过在注射部位处游离抗原从alum表面的缓慢释放来介导，或者抗原可以被转运至仍与氢氧化铝纳米晶体或纳米晶体聚集体结合的淋巴结，如图6A所示。如果后一种情况是普遍的，这将对免疫应答产生多种影响，因为(1)B细胞被多价颗粒抗原强烈触发；(2)alum颗粒可能对抗原特异性B细胞发挥直接佐剂活性；和(3)从颗粒表面呈递抗原可影响体液应答的表位特异性。
首先评估了用alum/PS-eOD缀合物相比于alum/eOD刺激抗原特异性B细胞的体外影响。通过单独的eOD，混合有alum的eOD，或混合有alum的PS-eOD，在细胞培养物中刺激表达生殖系推断的VRC01 IgM(glVRC01)的人Ramos B细胞(代表作为在人中的eOD免疫原的理想靶标的B细胞)。B细胞中的钙信号传导通过荧光报告染料Fluo-4进行追踪。与先前的报道相一致，eOD必须被多聚化，用于经由glVRC01受体的强信号传导22，游离单体eOD引起接近基线的应答，与alum混合的eOD也是如此，如图6B所示。相比之下，被alum/PS-eOD刺激的B细胞显示出随磷酸丝氨酸价数增加而稳定增加的钙信号传导，图6B。通过共聚焦显微镜，观察到与alum和eOD一起孵育1小时的B细胞具有结合的alum颗粒，但是几乎没有或没有eOD摄取，图6C。然而，当B细胞与alum/PS8-eOD一起孵育时，alum颗粒与共定位的eOD一起被摄取，图6D。通过TEM成像对这些细胞进行的更高分辨率可视化揭示了当PS-eOD结合至alum时，纳米级alum聚集体被B细胞内化，如图6E所示。这些结果表明，当经由PS连接结合至alum时，eOD可以表现为被B细胞内化的多价颗粒疫苗。
实施例3：经由多价抗原-佐剂偶联剂偶联至alum的抗原保留在施用部位处并增强抗抗原IgG滴度
PS介导的与alum的结合减慢了体内抗原清除。alum在注射部位处保留了数周，Flarend,R.E.et al.(1997)Vaccine 15,1314-1318，但与alum一起施用的抗原的清除通常快得多。Gupta,R.K.,et al.,(1996)Vaccine 14,1412-1416；Noe,S.M.,et al.,(2010)Vaccine 28,3588-3594。
为了测试偶联剂在体内的作用，在存在和不存在包含4种磷酸丝氨酸的多价偶联剂(以下称为“PS4”)的情况下，向小鼠施用与alum一起孵育的AlexaFluor647标记的eOD抗原。作为对照，将eOD抗原和PS4与不结合PS4的另一种基于铝的佐剂Adju-Phos一起孵育。将荧光抗原-佐剂制剂皮下注射到BALB/c小鼠的尾巴基部，并使用体内成像系统(IVIS)进行监控。图7A示出了在第0天(注射日)和第3天后，分别用(1)具有与AlexaFluor647缀合的eOD的Al-Hydrogel(alum；Al-OH3)，(2)具有与AlexaFluor647缀合的eOD-PS4的Al-Hydrogel；(3)具有与AlexaFluor647缀合的eOD-PS4的Adju-Phos(Al-P)注射，和(4)未注射的小鼠的假色IVIS图像。在注射后跟踪来自小鼠的荧光信号24天，通过IVIS确定的标准化荧光信号作为时间的函数示于图7B。
未经修饰的eOD在3天内从注射部位清除，而PS4-eOD存留超过3周；抗原信号以～9天的半衰期衰减，图7B。作为另外的对照，注射了与磷酸铝(alumP)混合的PS4-eOD，其是alum的另一种临床制剂，无法与PS接头进行配体交换结合。在这种情况下，PS4-eOD以与eOD相同的速率清除，图7A，7B。如图8A所示，改变PS接头价数，观察到具有四个或更多个PS残基的最大抗原持久性。在注射后第8天，使用标记alum的morin染料染色在注射部位处的alum结节的组织学，De Boni,U.,et al.,(1974)Histochemistry 40,31-37，显示与alum共定位的PS8-eOD，如图8B所示，而未修饰的eOD是不可检测的，图8C。
这些结果证明，PS-抗原在体内比吸附至alum的未修饰抗原慢得多地被清除。偶联至alum的eOD-PS4抗原在施用部位处保留，程度比与Adju-Phos(A1-P)组合施用的eOD-PS4抗原或与alum(Al-OH3)组合施用的eOD抗原更大。这些结果表明，引流淋巴结经由延长的保留而延长地暴露于eOD-PS4抗原，会增强针对eOD抗原的免疫应答。
实施例4：alum和PS抗原在体内共同运输并积聚在引流LN中
在下一个实验中，接下来评估抗原-佐剂复合物施用后的体内进程。合成如图9A所示的红外染料(IR680)-PS4缀合物以同时追踪抗原和alum。IR680-PS4与alum紧密结合，在血清中孵育72小时后从alum中释放出的可检测染料极少，如图9B所示。将alum与等摩尔量的PS8-eOD(用IR800染料标记)和IR680-PS4混合，或染料标记的Ser4-eOD和IR680-PS4作为对照。通过在连续时间点从动物切除的整个淋巴结的红外成像来测量每个示踪剂在引流淋巴结(dLN)中的总积累。LN中的Ser4-eOD水平在24达到峰值，此后迅速衰减，而alum示踪剂缓慢积累，图10A。相比之下，PS8-eOD和alum在dLN中显示出缓慢积累的匹配模式，如图10B所示。为了确认alum颗粒事实上向dLN迁移，通过电感偶联等离子体质谱法(ICP-MS)直接定量了dLN中的铝含量。如图10C所示，在alum/PS8-eOD和alum/Ser4-eOD免疫接种中都容易在dLN中检测到铝。
实施例5：抗原特异性B细胞在体内获得结合至alum颗粒的PS抗原。
在接下来的实验中，采用体内过继转移模型，其使得能够跟踪eOD-特异性B细胞，以检测用PS-抗原官能化的alum颗粒如何以多价形式递送抗原至B细胞。Abbott,R.K.etal.(2018)Immunity 48,133-146。将表达glVRC01 BCR的小鼠B细胞(VRC01gHL)过继转移至野生型小鼠中，以建立确定的抗原特异性B细胞前体频率，同上，然后用eOD/alum组合腹膜内接种疫苗，图11A。VRC01gHL细胞表达GFP，并用CellTrace Violet(CTV)标记。当小鼠注射标记的Ser-eOD或PS-eOD和alum时，两组的VRC01gHL B细胞在免疫接种后1天获得抗原，但是PS-eOD/alum组在第2天的eOD摄取继续增加，如图11B，11C所示。当eOD和alum都进行了荧光标记(用AF488-PS4标记alum)时，VRC01gHL B细胞显示在第2天同时摄取磷酸丝氨酸连接的抗原和alum，与Ser-eOD/alum免疫接种小鼠中抗原特异性细胞的低水平eOD或alum摄取形成对照，图11D至11F。
在用染料标记的alum和eOD进行腹膜内免疫后两天的脾脏切片的组织学显示alum和PS8-eOD在B细胞卵泡周围共定位，但在对照组中仅观察到alum而很少或没有Ser4-eOD，图12A，12B。用alum/Ser-eOD免疫的动物中的抗原特异性B细胞未显示激活标志物CD86的上调或细胞分裂的迹象，而在alum/PS8-eOD免疫组中观察到了VRC01gHL细胞的稳健激活和分裂，如图12C和12D所示。由于已经将eOD工程化为与VRC01gHL细胞以高亲和力结合，Jardine,J.et al.(2013)Science 340,711-716，通过用PS-或Ser修饰的eOD-GT5(对VRC01gHL BCR具有生理(KD～0.5μM)亲和力的eOD免疫原的替代形式)对过继转移小鼠进行免疫来重复此实验。结果是定性地相似的(数据未显示)。
为了确定抗原特异性B细胞是否摄取结合至alum颗粒的抗原，用与荧光PS-eOD混合的alum来免疫动物。免疫后第2天，收获脾脏。获得脾细胞悬液，分选eOD+抗原特异性B细胞或对照内源B细胞，然后固定并切片以用于TEM成像。如图13A和13B所示，体内已经获得抗原的VRC01gHL B细胞具有alum颗粒聚集物在内体区隔中的容易检测到的积累(计数120个细胞切片中的53％)，而内源性B细胞则不显示alum摄取(计数43个细胞切片中的0％)。这些结果证明，通过工程化紧密结合至alum，PS修饰的抗原是以alum结合的形式被体内递送至B细胞。
实施例6：经由多价抗原-佐剂偶联剂偶联至alum并与另外的佐剂共同施用的抗原保留在施用部位处并增强抗抗原IgG滴度
为了进一步表征包含多价偶联剂的抗原-佐剂复合物的保留与抗体应答之间的关系，在第0天和第21天给小鼠施用2μg SOSIP与50μgalum的组合或偶联至50μgalum的2μgSOSIP-PS4。图4显示了与包含磷酸丝氨酸的多价偶联剂缀合的SOSIP三聚体的示意图。如图14A所示，在初次免疫后63天观察到抗SOSIP抗体滴度的显著增加。此外，如图14B所示，抗SOSIP抗体滴度的这种增加随时间持续。综上所述，这些数据证明，相对于与alum组合施用的未偶联抗原，经由多价偶联剂偶联至alum的抗原的保留诱导了显著增强的体液免疫应答。
为了确定是否可以通过共同施用另外的佐剂来进一步增强通过alum偶联抗原而造成的抗抗原IgG滴度的施用部位保留和增强，用50μg al-hydrogel(alum)，5μg
Figure BDA0002640845780000821
(另一种佐剂)，和5μg的荧光标记SOSIP或荧光标记SOSIP-PS4在尾巴基部的皮下组织中免疫小鼠。用荧光团AlexaFluor647标记SOSIP。图15A显示了在第0天(注射日)和第1天，第6天和第10天后，用
Figure BDA0002640845780000822
Al-Hydrogel(alum；Al-OH3)和缀合有AlexaFluor647的SOSIP(SOSIP)，
Figure BDA0002640845780000823
Al-Hydrogel(alum；Al-OH3)和缀合有AlexaFluor647的SOSIP-PS4(SOSIP-PS4)的组合注射，或未注射(天然)的小鼠的假色IVIS图像，如所示。注射后追踪来自小鼠的荧光信号20天，通过IVIS确定的标准化荧光信号作为时间的函数示于图15B。这些数据证明，缀合至alum并与
Figure BDA0002640845780000824
共同施用的SOSIP-PS4抗原保留在施用部位，程度比与alum和
Figure BDA0002640845780000825
组合施用的SOSIP抗原更大。与图14A-14B中所示的结果一致，这些结果表明经由延长的保留而延长地暴露于SOSIP-PS4抗原会增强针对SOSIP-PS4抗原的免疫应答。在小鼠注射部位处的荧光的定量显示了含有磷酸丝氨酸接头的SOSIP的延长的保留。
为了进一步表征包含多价偶联剂的抗原-佐剂复合物的保留与抗体应答之间的关系，向小鼠施用5μg SOSIP与50μgalum的组合或偶联至50μgalum的5μg SOSIP-PS4。如图15C所示，标记为“+isco”的小鼠也接受了5μg iscomatrix，其是改善免疫应答的另外的佐剂。与图14A和14B中描述的抗原施用相反，小鼠接受了单一免疫接种。如图15C(SOSIP-P4+isco)所示，alum偶联的SOSIP-PS4抗原的延长保留结合来自另外的佐剂的改善的免疫应答，显示出显著增强的抗SOSIP IgG滴度。alum、
Figure BDA0002640845780000831
和alum结合抗原的这种免疫接种组合也潜在地消除了对二次免疫(增强)的需要。
实施例7：alum/PS-eOD免疫接种增强体液免疫应答的多个方面。
为了确定抗原在施用部位的保留是否与增强的体液免疫应答相关，在注射抗原后4周测定注射偶联至eOD抗原(2μg)的50μgalum的小鼠中的抗eOD抗体滴度，所述eOD抗原是未缀合的(eOD-PS0)或者是用包含一个磷酸丝氨酸(OD-PS1)，两个磷酸丝氨酸(eOD-PS2)和四个磷酸丝氨酸(eOD-PS4)抗原的偶联剂缀合的。如图16所示，相对于alum偶联的eOD-PS0和eOD-PS1，在施用alum偶联的eOD-PS2或eOD-PS4的小鼠中，抗eOD抗体滴度显著增加。这些结果确认了在抗原保留和抗体应答之间存在相关性。
PS-抗原免疫接种对免疫应答的影响在图17和18A-18G中表征。用alum/Ser4-eOD或alum/PS-eOD免疫接种BALB/c小鼠揭示了血清IgG滴度随着亲和接头中磷酸丝氨酸的数量增加而增加的明显趋势；与Ser4-eOD抗原相比，PS4-eOD引起63倍更高的血清IgG滴度，图17。下一个实验测试了抗原和alum与ISCOM样皂苷纳米颗粒佐剂一起共同施用是否可以进一步增强对alum/PS抗原的应答，所述ISCOM样皂苷纳米颗粒佐剂非常有效地促进了小鼠、非人灵长类动物、和人类中的体液免疫，Pauthner,M.et al.(2017)Immunity 46,1073-1088；Drane,D.et al.,(2007)Expert Rev Vaccines 6,761-772。皂苷纳米颗粒不干扰PS抗原与alum的结合(数据未显示)。采用皂苷和alum佐剂组合的联合免疫接种引起持久性IgG应答，比单独的alum高约10倍，图18A相比于图17。PS8接头提高滴度，仅略高于PS4接头，如图18A所示，并且无论是皮下还是肌内施用疫苗，磷酸丝氨酸抗原免疫接种都是有效的，如图18B所示。重要的是，未检测到对磷酸丝氨酸接头本身的可测量的抗体应答(未显示)。与随时间检测到的稳定高水平的血清抗体一致，在单次alum/PS抗原免疫接种后3个月骨髓浆细胞的ELISPOT分析显示，通过采用PS4-eOD的免疫接种引发与对照Ser4-EOD相比超过16倍的抗原特异性浆细胞，图18。
体液应答的亲和力成熟发生在生发中心，在那里B细胞周期性地突变其免疫球蛋白基因以进化出更高亲和力的结合剂；促进生发中心(GC)应答的策略因此对于HIV疫苗是非常令人感兴趣的，Havenar-Daughton,et al.(2017)Immunol Rev 275,49-61。虽然在alum/Ser-eOD免疫后，在背景以上几乎检测不到GC B细胞，但是alum/PS-eOD引发了稳健的生发中心应答，图18D，18E。此外，响应于PS-抗原免疫接种，结合eOD的GC B细胞的百分比从～2％急剧增加至～45％，如图18F，18G所示。总体而言，这些结果表明，采用为紧密alum结合而工程化的免疫原的疫苗接种促进了体液免疫应答的早期和晚期事件两者。
实施例8：alum/PS-SOSIP免疫接种增强针对Env三聚体的体液应答。
评估了PS介导的alum结合对针对SOSIP包膜三聚体的总体体液应答的影响。用与alum混合的SOSIP三聚体初免和单次加强小鼠引起了微弱的三聚体特异性IgG应答，但是以相同方案施用的SOSIP-PS4导致加强后7天～20倍更高的滴度，如图19A，19B所示。alum与皂苷佐剂一起的共同施用允许SOSIP三聚体在单次免疫接种后初免可测量的IgG应答，但采用SOSIP-PS4的alum/皂苷疫苗接种引起随时间维持的，实质性更高的三聚体特异性滴度，如图19C，19D所示。与对eOD抗原的发现相似，免疫接种后3个月观察到分泌三聚体特异性IgG抗体的骨髓浆细胞的显著增加，如图19E，19F所示。
实施例9：定向的、位点特异性的固定化阻断alum结合的PS-Env三聚体的基部并使得能够掩蔽表位
PS修饰促进抗原递送至仍与alum颗粒结合的B细胞的发现为塑造B细胞应答开辟了另一种策略，从而通过将抗原固定在alum颗粒表面并排定向的不期望位点来掩蔽不期望的表位。在HIV感染的动物模型中，针对HIV三聚体基部的抗体应答是免疫显性的，但与病毒的中和无关，Havenar-Daughton,et al.(2017)Immunol Rev 275,49-61。为了尽量最小化针对三聚体基部的抗体应答，在每个启动子的C端用游离半胱氨酸修饰SOSIP，三个PS接头可以在每个三聚体的基部处缀合至其，如图4所示。
与未经修饰的SOSIP相比，SOSIP-PS三聚体显示在血清暴露后在alum上增加的保留，如图5B所示。
为了进一步表征蛋白质抗原的哪一部分被来自免疫化血清的抗体结合，使用与蛋白质抗原上已知位置结合的高亲和力抗体进行竞争性ELISA。使用基部特异性抗体12N掩蔽SOSIP的基部区域，并阻断血清抗体结合SOSIP的该部分。在初次(第0天)和第二次(第28天)免疫接种后第72天从小鼠获取血清，所述免疫接种由2μg SOSIP与50μgalum的组合或缀合至50μgalum的2μg SOSIP-PS4组成。对于两种类型的免疫接种，在竞争性基部特异性抗体12N的存在下测得的吸光度值均显示ELISA信号的降低，如图20A所示。然而，通过ELISA的曲线下面积测得的信号的相对减少对于偶联至alum的SOSIP-PS4是显著更低的，如图20B所示。
当将游离三聚体捕获在ELISA板上时，bNAb和非中和性基部特异性mAb均等效地识别了SOSIP和SOSIP-PS，图21A组1和2。然而，当基部修饰的SOSIP-PS与涂在ELISA板上的alum结合时，针对三聚体的基部的非中和性抗体显示出很少的结合，而识别三聚体表面上的各种各样中和位点的bNAb仍然结合，如图21A所示。
与用eOD获得的结果相似，施用荧光SOSIP与alum后的IVIS成像揭示了未修饰的SOSIP的快速清除，但是PS4-SOSIP从免疫接种位点缓慢衰减，如图15A，15B所示。免疫接种后，通过在存在或不存在基部结合mAb的情况下评估IgG与板结合SOSIP的结合来进行ELISA分析。用alum/SOSIP免疫的小鼠的血清显示出适度的SOSIP特异性IgG应答，并且通过添加基部特异性单克隆抗体在很大程度上阻断了该结合，图21B。相比之下，如图21B，21C所示，用alum/SOSIP-PS4免疫的小鼠中的IgG应答更强，并且通过添加基部特异性Ab仅微弱降低。此外，当用SOSIP-PS4免疫动物时，alum/SOSIP-pS4免疫接种导致针对位于三聚体基部的His标签的应答显著降低，并且针对三聚体的gp120部分的应答增加，图21D，21E。
这些数据证明，当与未偶联的SOSIP抗原相比时，SOSIP与alum的位点特异性偶联将免疫注意力从基部转移走，而去向蛋白质的其他部分。抗原的部分的这种受控掩蔽是抗原直接位点特异性缀合至alum表面的结果。因此，这些结果表明，免疫原与PS-接头的定向取向可以改变免疫应答的特异性。
等价方式
仅通过常规实验，本领域技术人员即将认识到或能够确定本文所述的本文描述的具体实施方式的许多等同方式。这样的等同方式旨在由所附权利要求书涵盖。

Claims (77)

1.一种抗原-佐剂复合物，其包含：
(a)共价连接至抗原反应性部分的抗原，所述抗原反应性部分偶联至包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分，任选地经由至少一个接头偶联；和
(b)金属氢氧化物佐剂，
其中所述抗原经由所述多价佐剂反应性部分的所述羟基置换基团缀合至所述金属氢氧化物佐剂，从而形成抗原-佐剂复合物。
2.权利要求1所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原反应性部分包含巯基反应性部分。
3.权利要求1-2中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述巯基反应性部分是马来酰亚胺。
4.权利要求1-3中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述多价佐剂反应性部分包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，16、17、18、19、20个或更多个羟基置换基团。
5.权利要求1-4中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述羟基置换基团选自氟化物基团，柠檬酸根基团，磷酸根基团，碳酸根基团和硫酸根基团。
6.权利要求1-5中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述羟基置换基团是磷酸根基团。
7.权利要求1-6中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述羟基置换基团包含至少一个磷酸化氨基酸残基。
8.权利要求7所述的抗原-佐剂复合物，其中所述磷酸化氨基酸残基选自磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸。
9.权利要求8所述的抗原-佐剂复合物，其中所述磷酸化氨基酸残基是磷酸丝氨酸。
10.权利要求1-9中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述金属氢氧化物佐剂选自氢氧化铝，磷酸铝，氢氧化钙，磷酸钙，氢氧化铁，氢氧化镁，氢氧化钡，氢氧化钙，氢氧化锌和氢氧化锆。
11.一种抗原-佐剂复合物，其包含缀合至alum的抗原，其中所述抗原包含至少一个包含2-12个磷酸丝氨酸残基的接头，并且其中所述抗原经由所述磷酸丝氨酸残基缀合至alum。
12.权利要求11所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原包含至少一个包含2-8个磷酸丝氨酸的接头。
13.权利要求11所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原包含至少一个包含2-4个磷酸丝氨酸的接头。
14.权利要求1至13中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原选自癌抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原和真菌抗原。
15.权利要求14所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原是病毒抗原。
16.权利要求15所述的抗原-佐剂复合物，其中所述病毒抗原是HIV抗原。
17.权利要求16所述的抗原-佐剂复合物，其中所述病毒抗原是工程化HIV抗原。
18.权利要求17所述的抗原-佐剂复合物，其中所述工程化HIV抗原是HIV包膜蛋白或其片段。
19.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1-18中任一项所述的抗原-佐剂复合物，和任选地，另外的佐剂。
20.一种用于增加抗原在受试者中在施用部位处的保留的方法，所述方法包括施用根据权利要求19所述的免疫原性组合物。
21.权利要求20所述的方法，其中所述抗原在注射部位处存留至少一周。
22.权利要求21所述的方法，其中所述抗原在注射部位处存留至少三周。
23.一种用于将抗原持续释放至受试者的引流淋巴结的方法，所述方法包括施用根据权利要求19所述的免疫原性组合物。
24.权利要求23所述的方法，其中所述抗原-佐剂复合物包含多价颗粒聚集体。
25.权利要求24所述的方法，其中所述聚集体包含纳米颗粒或纳米晶体。
26.权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述方法导致体内免疫细胞摄取所述抗原-佐剂复合物。
27.权利要求26所述的方法，其中所述免疫细胞是抗原特异性B细胞。
28.权利要求20-27中任一项所述的方法，其中对所述抗原的免疫应答被增强。
29.权利要求28所述的方法，其中所述免疫应答是通过增加的抗体滴度增强。
30.权利要求29所述的方法，其中与未缀合的抗原-佐剂组合物的施用相比，所述抗体滴度被增强至少20倍。
31.权利要求28所述的方法，其中所述免疫应答是通过增加的中和性抗体滴度增强。
32.权利要求28所述的方法，其中所述免疫应答是通过增加的数量的抗体分泌B细胞增强。
33.权利要求32所述的方法，其中所述B细胞是骨髓浆细胞。
34.权利要求33所述的方法，其中与未缀合的抗原-佐剂组合物的施用相比，抗体分泌B细胞的数量增加至少16倍。
35.权利要求32所述的方法，其中所述B细胞是生发中心B细胞。
36.一种抗原-佐剂复合物，其包含HIV包膜蛋白或其片段，其经由至少一个包含2-12个磷酸丝氨酸残基的接头缀合至alum。
37.权利要求36所述的抗原-佐剂复合物，其中所述HIV包膜蛋白或片段经由至少一个包含2-10个磷酸丝氨酸残基，2-6个磷酸丝氨酸残基，或2-4个磷酸丝氨酸残基的接头缀合至alum。
38.权利要求1-18或36-37中任一项所述的抗原-佐剂复合物，其中所述抗原或HIV包膜蛋白或其片段是通过所述抗原或HIV包膜蛋白或其片段与佐剂表面的位点特异性缀合来固定，从而选择性地将抗原表位呈递给免疫细胞。
39.一种引导受试者中的免疫应答的特异性的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含权利要求38所述的抗原-佐剂复合物的免疫原性组合物，其中所述抗原的一个或多个表位通过所述抗原经由所述多价佐剂反应性部分而位点特异性缀合至佐剂表面而被掩蔽。
40.权利要求39所述的方法，其中所述免疫应答是针对引发一种或多种保护性中和性抗体的抗原上的表位。
41.权利要求39所述的方法，其中HIV包膜三聚体基部的表位通过所述HIV三聚体在alum颗粒上的位点特异性缀合而被掩蔽，从而引导所述免疫应答远离引起非中和性抗体。
42.一种抗原-佐剂偶联剂，其包含：
(a)抗原反应性部分；
(b)包含两个或更多个羟基置换基团的多价佐剂反应性部分；和
(c)任选地，接头；
其中所述抗原反应性部分任选地通过接头与所述多价佐剂反应性部分可操作地连接，其中所述抗原反应性部分与抗原上存在的反应性基团共价结合，并且其中所述多价佐剂反应性部分与佐剂中存在的两个或更多个羟基相互作用，从而将所述抗原偶联至所述佐剂。
43.权利要求42所述的试剂，其中所述抗原反应性部分包含巯基反应性部分。
44.权利要求43所述的试剂，其中所述巯基反应性部分是马来酰亚胺。
45.权利要求42至44所述的试剂，其中所述反应性基团是巯基。
46.权利要求42至45所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含3-4、3-5、4-6、5-7、6-8、7-9、8-10、9-11、10-12、11-13、12-14、13-15、14-17、15-18、16-20或更多个羟基置换基团。
47.权利要求42至46所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个羟基置换基团。
48.权利要求42至47所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含约3-10，约3-15，或约3-20个羟基置换基团。
49.权利要求42至48所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含3个羟基置换基团。
50.权利要求42至48所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含4个羟基置换基团。
51.权利要求42至48所述的试剂，其中所述多价佐剂反应性部分包含5个羟基置换基团。
52.权利要求42至51所述的试剂，其中所述羟基置换基团选自氟化物基团，柠檬酸根基团，磷酸根基团，碳酸根基团和硫酸根基团。
53.权利要求52所述的试剂，其中所述羟基置换基团是磷酸根基团。
54.权利要求53所述的试剂，其中所述羟基置换基团包含磷酸化氨基酸残基。
55.权利要求54所述的试剂，其中所述磷酸化氨基酸残基选自磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸和磷酸苏氨酸。
56.权利要求55所述的试剂，其中所述磷酸化氨基酸残基是磷酸丝氨酸。
57.权利要求42-56所述的试剂，其中所述试剂包含接头。
58.权利要求57所述的试剂，其中所述接头是聚乙二醇。
59.权利要求42-58所述的试剂，其中所述佐剂是金属氢氧化物佐剂。
60.权利要求59所述的试剂，其中所述金属氢氧化物佐剂选自氢氧化铝，磷酸铝，氢氧化钙，磷酸钙，氢氧化铁，氢氧化镁，氢氧化钡，氢氧化钙，氢氧化锌和氢氧化锆。
61.一种免疫原性组合物，其包含：
(a)根据权利要求42-60中任一项所述的试剂；
(b)抗原；和
(c)任选地，金属氢氧化物佐剂；
其中所述试剂共价连接至所述抗原，并且其中所述抗原经由所述试剂偶联至当存在时的所述金属氢氧化物佐剂，从而形成抗原-佐剂复合物。
62.权利要求61所述的免疫原性组合物，其中所述抗原经由所述试剂吸附至所述金属氢氧化物佐剂的表面，从而形成抗原-佐剂复合物。
63.权利要求61和62所述的免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
64.权利要求61至63所述的免疫原性组合物，其中所述抗原选自癌抗原，病毒抗原，细菌抗原，寄生虫抗原和真菌抗原。
65.权利要求64所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是病毒抗原。
66.权利要求65所述的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原是HIV抗原。
67.权利要求66所述的免疫原性组合物，其中所述HIV抗原是gp120或gp140。
68.权利要求65所述的免疫原性组合物，其中所述病毒抗原是工程化HIV抗原。
69.权利要求68所述的免疫原性组合物，其中所述工程化HIV抗原是eOD。
70.权利要求68所述的免疫原性组合物，其中所述工程化HIV抗原是SOSIP。
71.权利要求61-70所述的免疫原性组合物，其中所述抗原是相对于所述助剂的表面定向，并且其中所述抗原的定向阻断或抑制免疫系统对一个或多个表位的识别。
72.一种疫苗，其包含根据权利要求61-71中任一项所述的免疫原性组合物。
73.一种用于增加抗原在受试者中在施用部位处的保留的方法，所述方法包括施用根据权利要求72所述的疫苗。
74.一种用于将抗原连续释放至受试者的引流淋巴结的方法，所述方法包括施用根据权利要求72所述的疫苗。
75.一种用于在有需要的受试者中治疗癌症或传染病的方法，所述方法包括施用根据权利要求72所述的疫苗，从而治疗所述受试者。
76.一种用于增加受试者中的免疫应答的方法，所述方法包括施用根据权利要求72所述的疫苗。
77.一种制备前述权利要求中任一项所述的免疫原性组合物的方法，所述方法包括：提供宿主细胞，所述宿主细胞包含编码包含反应性基团的抗原的核酸序列；在表达所述抗原的条件下维持所述宿主细胞；获得所述抗原；在其中所述试剂共价连接至所述抗原的条件下使所述抗原与所述试剂接触；获得共价连接至所述试剂的所述抗原；任选地将所述抗原偶联或吸附至所述佐剂。
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WO (1) WO2019126371A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023134783A3 (zh) * 2022-01-12 2023-09-14 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 一种铝纳米晶递送系统及其结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200101954A (ko) 2017-12-19 2020-08-28 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 항원-아주반트 커플링 시약 및 사용 방법
EP3990491A1 (en) * 2019-06-26 2022-05-04 Massachusetts Institute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
US20230104171A1 (en) * 2021-10-02 2023-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Engineered Alum-binding SARS-CoV-2 Immunogens
US20230109193A1 (en) * 2021-10-02 2023-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic Combination of Alum and Non-Liposome, Non-Micelle Particle Vaccine Adjuvants
WO2023076832A1 (en) * 2021-10-25 2023-05-04 Singular Genomics Systems, Inc. Manipulating and detecting biological samples
CN116115748A (zh) * 2023-01-17 2023-05-16 大连理工大学 一种基于共价作用形成的Al-Poly(I:C)复合佐剂
CN117003893B (zh) * 2023-08-09 2024-04-09 成都新诺明生物科技有限公司 一种含有IL-2和P2表位的gE融合蛋白及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004097000A2 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Purdue Research Foundation Ligand-exchange functional antigens, and use of same in pharmaceutical vaccine compositions

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
US5525491A (en) 1991-02-27 1996-06-11 Creative Biomolecules, Inc. Serine-rich peptide linkers
CA2194761C (en) 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
WO1998037919A1 (en) 1997-02-28 1998-09-03 University Of Iowa Research Foundation USE OF NUCLEIC ACIDS CONTAINING UNMETHYLATED CpG DINUCLEOTIDE IN THE TREATMENT OF LPS-ASSOCIATED DISORDERS
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
EP1003531B1 (en) 1997-05-20 2007-08-22 Ottawa Health Research Institute Processes for preparing nucleic acid constructs
ES2284247T3 (es) 1998-04-03 2007-11-01 University Of Iowa Research Foundation Metodos y productos para estimular el sistema inmunitario usando oligonucleotidos y citoquinas inmunoterapeuticos.
US6086881A (en) * 1998-05-15 2000-07-11 Children's Medical Center Corp. Spatially aligned conjugated composition having a thioether bond linkage
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
ES2458355T3 (es) 2010-09-01 2014-05-05 Novartis Ag Adsorción de inmunopotenciadores sobre sales metálicas insolubles
WO2013056122A1 (en) 2011-10-12 2013-04-18 University Of Washington Engineered outer domain (eod) of hv gp120 and mutants thereof
JP5782185B2 (ja) 2012-06-01 2015-09-24 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
SG11201808913WA (en) 2016-04-15 2018-11-29 Dynavax Tech Corp Intratumoral administration of particles containing a toll-like receptor 9 agonist and a tumor antigen for treating cancer
KR20200101954A (ko) 2017-12-19 2020-08-28 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 항원-아주반트 커플링 시약 및 사용 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004097000A2 (en) * 2003-04-29 2004-11-11 Purdue Research Foundation Ligand-exchange functional antigens, and use of same in pharmaceutical vaccine compositions

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARRY L. MOREFIELD等人: "Effect of phosphorylation of ovalbumin on adsorption by aluminum-containing adjuvants and elution upon exposure to interstitial fluid", VACCINE, pages 1503 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023134783A3 (zh) * 2022-01-12 2023-09-14 广东粤港澳大湾区国家纳米科技创新研究院 一种铝纳米晶递送系统及其结合疫苗抗原分子自组装颗粒佐剂疫苗

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