KR20070029730A

KR20070029730A - 애쥬번트 처리된 시가 독소 ｂ-서브유닛을 기재로 하는 백신

Info

Publication number: KR20070029730A
Application number: KR1020067025212A
Authority: KR
Inventors: 빠뜨리끄 코메즈; 꺄뜨린 빠스칼린 안느 기슬레인 콜리농; 마르쎌 빠울레뜨 반 메쉘렌
Original assignee: 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-19
Publication date: 2007-03-14
Also published as: EP1761275A2; WO2005112991A2; MA28609B1; CN1956729A; BRPI0511185A; US20080069832A1; MXPA06013386A; RU2006139424A; JP2007538044A; GB0411411D0; CA2564778A1; NO20065304L; IL178890A0; WO2005112991A3; AU2005244615A1; ZA200609500B

Abstract

본 발명은 항원과 복합체화된, Gb3 수용체에 결합할 수 있는 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물을 포함하며, 추가로 애쥬번트를 포함하는 백신으로서, 단 애쥬번트가 금속 염인 경우, 항원의 약 50% 이하가 금속 염에 흡착되는 방식으로 제형화되는 백신을 제공한다. 이러한 조성물은 애쥬번트 처리되지 않은 항원과 착물화된 시가 독소 또는 이의 면역학적 작용성 등가물, 또는 애쥬번트 처리된 단독의 항원과 비교하여 개선된 면역반응을 제공한다.

Description

백신 {VACCINES}

본 발명은 개선된 백신 조성물, 이의 제조 방법 및 이의 의약에서의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 시가 독소(Shiga Toxin)의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물을 포함하는 애쥬번트 처리된 백신 조성물, 및 애쥬번트와 제형화된 항원을 제공한다.

US 특허 6613882호에는 화학식 B--X의 키메라 폴리펩티드 (여기서, B는 시가 독소의 B 단편 또는 이의 작용성 등가물이며, X는 치료학적으로 중요한 하나 이상의 폴리펩티드를 나타냄)로서, B에 의해 매개되는 역행성 이동과 상보적이어서 X의 프로세싱을 보장하거나 어드레싱(addressing)을 교정하는 폴리펩티드가 기술되어 있다.

WO 02/060937에는 화학식 STxB-Z(n)-Cys (여기서, StxB는 시가 독소 B 서브유닛이며, Z는 n이 0, 1 또는 2인 설프히드릴 기가 없는 아미노산 링커 또는 폴리펩티드이며, Cys는 시스테인임)을 가지며, Gb3 수용체에 직접적으로 또는 간접적으로 타겟팅하기 위한 공통적인 폴리펩티드 담체가 기술되어 있다.

세포 반응의 우세한 유도가 요망되는 백신 개발이 여전히 요구되고 있다. CD8+ T 세포 즉, 세포 면역 반응의 주요 이펙터 세포가 병원균-감염된 세포에서 합성되는 항원을 인식하기 때문에, 성공적인 백신화에는 백신 접종자의 세포에서의 면역원성 항원의 합성이 요구된다. 이는 약독화된 생백신으로 달성될 수 있으나, 이들은 또한 현저한 제한을 나타낸다. 먼저, 백신이 면역억제되거나, 병원균 자체가 면역억제를 유도할 수 있는 경우 (예를 들어, 사람 면역결핍 바이러스), 감염의 위험이 있다. 두번째로, 일부 병원균은 세포 배양하기가 어렵거나 불가능하다 (예를 들어, C형 간염 바이러스). 기타 존재하는 백신 예컨대, 불활성화된 전세포 백신 또는 알룸 애쥬번트 처리된 재조합 단백질 서브유닛 백신은 CD8 반응의 현저하게 빈약한 유도체이다.

이러한 이유로, 대안적인 방법이 개발되고 있다: 생 벡터 백신, 플라스미드 DNA 백신, 합성 펩티드 또는 특이적 애쥬번트. 생 벡터 백신은 강한 세포 반응을 유도한다는 점에 있어서 우수하지만, 벡터에 대한 이미 존재하는 (예를 들어, 아데노바이러스) 또는 백신-유도된 면역성이 추가적 용량의 백신의 효율을 위태롭게 할 수 있다 (Casimiro et al, JOURNAL OF VIROLOGY, June 2003, p. 6305-6313). 플라스미드 DNA 백신은 또한, 세포 반응을 유도하지만 (Casimiro et al., JOURNAL OF VIROLOGY, June 2003, p. 6305-6313), 사람에서는 빈약하며 (Mc Conkey et al., Nature medicien 9, 729-735, 2003), 항체 반응은 매우 빈약하다. 또한, 합성 펩티드는 현재 임상 실험에서 평가중이나 (Khong et al, J Immunother 2004;27:472-477), 제한된 수의 T 세포 에피토프를 엔코딩하는 이러한 백신의 효율성은 백신 이스케이프 변이체의 출현 또는 HLA-매칭된 환자에 대한 우선적인 선택 필요성에 의해 방해받을 수 있다.

비생(non-live) 벡터 예컨대, 박테리아 독소를 이용한 항원 전달에 기초한 대안적인 방법이 또한 기술되어 있다. 시가 B 벡터화 시스템 (STxB)은 시가 독소 의 비독성 B 서브유닛에 기초한다. 이러한 분자는 항원 제시화를 위한 벡터가 되게하는 경향이 있는 수 많은 특징을 가진다: 독성의 부재, 낮은 면역원성, CD77 수용체를 통한 표적화 및 MHC 클래스 1-제한된 항원-제시 경로로 카고 항원을 유도하는 능력 (Haicheur et al (2003) Int. Immuno 15 pp 1161-1171). 특히, 시가 독소의 B 서브유닛으로의 항원의 물리적 결합은 마우스 모델에서 검출가능한 CD8 반응을 유도하는 것으로 관찰되었다 (Haicheur et al, 2000 Journal of Immunology 165 pp 3301-3308; Haicheur et al, 2003 Int. Immunol 15 pp 1161-1171). 그러나, 이라한 반응은 높은 용량의 항원의 3회 접종이 요망되며 (80㎍ 까지, Haicheur et al, 2003 Int. Immunol 15 pp 1161-1171), 복강내 투여할 경우 프라운드 불완전 애쥬번트(Freund's Incomplete adjuvant)와의 혼합에 의해 개선될 수 없었다 (Haicheur et al, 2000 Journal of Immunology 165 pp 3301-3308).

백신 항원 및 전달 시스템의 이러한 제한은 새로운 백신 조성물에 대한 연구를 정당화시킨다. 본 발명자들은 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물을 포함하는 조성물에서 애쥬번트의 포함은 유도된 면역 반응 특히, CD8 특이적 반응에 이로운 효과를 가질 수 있음을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 항원과 복합체화된, Gb3 수용체에 결합할 수 있는 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이들의 면역학적 작용성 등가물을 포함하며, 추가로 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물로서, 단 애쥬번트가 단독의 금속 염인 경우, 항원의 약 60% 이하가 금속 염에 흡착되는 방식으로 제형화된 백신 조성물을 제공한다.

특정 애쥬번트는 금속 염, 수중유 에멀션, 톨(Toll) 유사 수용체 아고니스트 (특히, 톨 유사 수용체 2 아고니스트, 톨 유사 수용체 3 아고니스트, 톨 유사 수용체 4 아고니스트, 톨 유사 수용체 7 아고니스트, 톨 유사 수용체 8 아고니스트 및 톨 유사 수용체 9 아고니스트), 사포닌 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 애쥬번트이며, 단 금속 염은 항원의 약 60% 이하가 금속염에 흡착되는 방식으로 제형화되지 않는다면, 다른 애쥬번트와 함께 사용되어야 하며, 단독으로 사용되지 않는다. 바람직하게는, 항원의 약 50% 이하 예를 들어, 40%가 금속 염에 흡착되며, 한 구체예에서는, 항원의 약 30% 이하가 금속 염에 흡착된다. 금속 염에 흡착되는 항체 수준은 실시예 1.5에 기술된 방법과 같은 당해분야에 널리 공지된 기법에 의해 측정될 수 있다. 유리 항원의 수준은 예를 들어, 포스페이트 이온 예컨대, 포스페이트 완충된 염수의 존재하에 조성물을 제형화시킴으로써, 또는 금속 염에 대한 항원의 비를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 한 구체예에서, 애쥬번트는 금속 염을 단독의 애쥬번트로서 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 애쥬번트는 금속 염을 포함하지 않는다. 종래에 입증된 상항과는 반대로, 본 발명자들은 이러한 조성물이 근내로 투여되지 않는 경우의 시가 독소 (또는 면역학적 작용성 등가물) 및 항원의 효과를 주장하기 위해 불완전 프라운드 애쥬번트(Freund's adjuvant)의 능력을 입증하였다. 또한, CD8 반응의 이러한 개선은 더 적은 용량의 항원을 사용할 경우 단일 주입 후에도 용이하게 관찰된다.

시가 독소의 B 서브유닛 및 이의 면역학적 작용성 등가물은 본원에서 명명된 본원발명의 단백질이다. 시가 독소의 B 서브유닛의 면역학적 작용성 등가물은 비제한적으로 Gb3 수용체에 결합할 수 있는 독소, 독소 서브유닛 또는 이의 작용성 단편과 같은 단백질로서 규정된다. 이러한 결합 능력은 실시예 1.2에 기술된 검정 프로토콜에 따라 측정될 수 있다. Gb3 결합은 대상 항원의 적합한 수송을 유도하고, 이에 따라 이의 MHC 클래스 1 제시를 촉진하는 것으로 여겨진다. 한 구체예에서, 이러한 단백질은 성숙한 형태의 시가 독소의 B 서브유닛에 대해 아미노산 수준에서 50% 이상의 아미노산 서열 동일성, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%의 동일성을 갖는다.

이러한 면역학적 작용성 등가물은 다양한 시겔라(Shigella) 종 특히, 시겔라 다이센테리아(Shigella dysenteriae)로부터 분리된 독소의 B 서브유닛을 포함한다. 또한, 시가 독소의 면역학적 작용성 등가물은 독소가 시가 독소의 B 서브유닛에 대해 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 기타 박테리아로부터의 Gb3 수용체에 결합할 수 있는 상동성 독소를 포함한다. 예를 들어, E Coli로부터의 베로톡신-1 (VT1)의 B 서브유닛은 시가 독소의 B 서브유닛과 동일하다. E Coli로부터의 VT1 및 VT2는 Gb3 수용체에 결합하는 것으로 공지되어 있으며, 본 발명에 사용될 수 있으며, 기타 박테리아로부터 생성된 기타 시가 유사 독소일 수 있다. 본 발명의 문맥상, 용어 독소는 이들이 사람에게는 더 이상을 독성을 띠지 않는 방식으로 탈독소화된 독소, 또는 사람에서 독성 활성이 실질적으로 없는 독소 서브유닛 또는 이들의 단편을 의미한다.

본 발명의 백신 조성물은 CD8 특이적 면역 반응을 개선시킬 수 있다. 이러한 개선은 본 발명의 단백질과 복합체화된 항원 및 애쥬번트를 포함하는 본 발명의 조성물에 대한 반응을 애쥬번트의 부재하에 본 발명의 단백질과 복합체화된 항원을 포함하는 조성물에 대한 반응, 또는 애쥬번트를 갖는 항원을 포함하는 제형에 대한 반응과 비교함으로써 관찰된다. 개선은 면역 반응 수준의 증가, 더 낮은 용량의 항원으로의 동등한 면역 반응의 생성, 면역 반응의 질적 향상, 면역 반응의 지속성 증가, 또는 상기의 조합된 사항으로서 규정될 수 있다. 이러한 개선은 제 1 면역화 이후 관찰될 수 있고/거나, 후속 면역화 이후에 관찰될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 낮은 용량의 항원 (마우스에 대한 8ng 만큼 낮은 항원)이 이러한 면역 반응을 유발시키는데 사용될 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 단백질과 복합체화된 애쥬번트 처리된 항원은 일차 CD8 반응 (테트라머 염색, 세포내 사이토킨 염색 및 생체내 세포독성 활성에 의해 측정됨)을 유도하며, 이러한 반응은 본 발명의 단백질과 복합체화되지 않은 애쥬번트 처리된 항원 또는 본 발명의 단백질과 복합체화되었으나 애쥬번트 처리되지 않은 항원과 비교하여 지속적으로 나타나는데, 상기 비교된 항원은 이러한 지속적 반응을 유발시킬 수 없다.

CD8 면역 반응은 시간에 따라 쇠약해지며; 피크 후에 수축기(contraction phase)가 존재하며, 이는 대부분의 이펙터 세포는 치사되는 반면, 메모리 세포는 생존하는 기간입니다. 이러한 반응성 메모리 T 세포 군집의 성립은 항원-특이적 세포의 장기간 검출 및 상승되는 이들의 능력에 의해 식별된다.

애쥬번트는 바람직하게는, 하기 군으로부터 선택된다: 사포닌, 리피드 A 또는 이들의 유도체, 면역자극성 올리고누클레오티드, 알킬 글루코사미니드 포스페이트 또는 이들의 혼합물. 추가의 바람직한 애쥬번트는 또 다른 애쥬번트와 혼합된 금속 염이다. 바람직하게는, 애쥬번트는 톨 유사 수용체 아고니스트 특히, 톨 유사 수용체 2, 3, 4, 7, 8 또는 9의 아고니스트, 또는 사포닌 특히, Qs21이다. 추가로 바람직하게는, 애쥬번트 시스템은 상기 리스트로부터 2개 이상의 애쥬번트를 포함한다. 특히, 혼합물은 바람직하게는 사포닌 (특히, Qs21) 애쥬번트 및/또는 톨 유사 수용체 9 아고니스트 예컨대, CpG 함유 면역자극성 올리고누클레오티드를 함유한다. 기타 바람직한 혼합물은 사포닌 (특히, QS21)과 톨 유사 수용체 4 아고니스트 예컨대, 모노포스포릴 리피드 A 또는 이의 3 데아실화된 유도체, 3D-MPL, 또는 사포닌 (특히, QS21)과 톨 유사 수용체 4 리간드 예컨대, 알킬 글루코사미니드 포스페이트를 포함한다.

특히 바람직한 애쥬번트는 3D-MPL 및 QS21의 혼합물 (EP 0 671 948 B1), 3D-MPL 및 QS21을 포함하는 수중유 에멀션 (WO 95/17210, WO 98/56414), 또는 기타 담체로 제형화된 3D-MPL (EP 0 689 454 B1)이다. 기타 바람직한 애쥬번트 시스템은 US6558670, US6544518에 기술된 3D MPL, QS21 및 CpG 올리고누클레오티드의 혼합물을 포함한다.

한 구체예에서, 애쥬번트는 톨 유사 수용체 (TLR) 4 리간드, 바람직하게는 아고니스트 예컨대, 리피드 A 유도체 특히, 모노포스포릴 리피드 A 또는 더욱 특히, 3 데아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D - MPL)이다.

3D-MPL은 코릭사 코포레이션(Corixa corporation)에 의해 상표명 MPL®로 시판되며, IFN-g (Th1) 표현형과의 CD4+ T 세포 반응을 일차적으로 촉진한다. 이는 GB 2 220 211 A에 기술된 방법에 따라 생성될 수 있다. 화학적으로, 이는 3-데아 실화된 모노포스포릴 리피드 A와 3, 4, 5 또는 6 아실화된 사슬의 혼합물이다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에서, 소 입자 3D-MPL이 사용된다. 소 입자 3D-MPL은 0.22㎛ 필터를 통해 멸균 여과될 수 있는 정도의 입자 크기를 갖는다. 이러한 제조물은 국제특허출원 WO94/21292에 기술되어 있다. 리피드 A의 합성 유도체는 공지되어 있으며, 하기를 포함하나 이에 제한되지 않는 TLR 4 아고니스트로 여겨진다:

OM174 (2-데옥시-6-o-[2-데옥시-2-[(R)-3-도데카노일옥시테트라-데카노일아미노]-4-o-포스포노-β-D-글루코피라노실]-2-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]-α-D-글루코피라노실디히드로겐포스페이트), (WO 95/14026)

OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9(R)-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1,10-비스(디히드로겐포스페이트) (WO 99/64301 및 WO 00/0462)

OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-도데카노일옥시테트라데카노일아미노]-4-옥소-5-아자-9-[(R)-3-히드록시테트라데카노일아미노]데칸-1,10-디올,1-디히드로겐포스페이트 10-(6-아미노헥사노네이트) (WO 01/46127)

사용될 수 있는 기타 TLR4 리간드는 알킬 글루코사미니드 포스페이트 (AGPs) 예컨대, WO 9850399 또는 US 6303347에 기술된 것 (AGP의 제조 방법 또한 기술되어 있음), 또는 US6764840에 기술된 바와 같은 AGP의 약제학적으로 허용되는 염이다. 일부 AGP는 TLR4 아고니스트이며, 일부는 TLR4 안타고니스트이다. 이 둘 모두는 애쥬번트로서 유용한 것으로 여겨진다.

본 발명에 사용하기 위한 기타 바람직한 면역자극제는 Quil A 및 이의 유도체이다. Quil A는 사우스 아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quilaja Saponaria Molina)로부터 분리된 사포닌 제조물이며, 이는 1974년 달스가드 등(Dalsgaard et al.)에 의해 처음으로 애쥬번트 활성을 갖는 것으로 기술되었다 ("Saponin adjuvants", Archiv, fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254). Quil A의 정제된 단편은 HPLC에 의해 분리되며, 이는 Quil A (EP 0 362 278) 예를 들어, QS7 및 QS21 (또한, QA7 및 QA21로 공지됨)과 관련된 독성이 없는 애쥬번트 활성을 보유한다. QS-21은 퀼라자 사포나리아 몰리나의 나무껍질로부터 유래된 천연 사포닌이며, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포 (CTL), Th1 세포 및 우세한 IgG2a 항체 반응을 유도하며, 본 발명에서 바람직한 사포닌이다.

QS21의 특정 제형은 특히 바람직한 것으로 기술되어 있으며, 이들 제형은 추가로 스테롤을 포함한다 (WO96/33739). 본 발명의 사포닌 형성 부분은 (바람직하게는, 그러나 비배타적으로 담즙 염을 갖는) 미셀, 혼합된 미셀 형태로 분리될 수 있거나 ISCOM 매트릭스 (EP 0 109 942 B1) 형태, 리포좀 형태 또는 관련 콜로이드 구조 예컨대, 벌레형 또는 고리형 다중결합 복합체 형태, 또는 콜레스테롤 및 리피드와 제형화될 경우 리피드/층화된 구조 및 박막의 형태, 또는 수중유 에멀션 형태 (예를 들어, WO 95/17210)로 존재할 수 있다. 사포닌은 바람직하게는 금속 염 예컨대, 수산화알루미늄 또는 인산염화알루미늄과 혼합될 수 있다 (WO 98/15287). 바람직하게는, 사포닌은 리포좀, ISCOM 또는 수중유 에멀션 형태로 존재한다.

면역자극성 올리고누클레오티드 또는 기타 톨 유사 수용체 (TLR) 9 아고니스트가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 애쥬번트 또는 백신에 사용하기 위한 바람직한 올리고누클레오티드는 CpG 함유 올리고누클레오티드, 바람직하게는, 3개 이상, 더욱 바람직하게는 6개 이상의 누클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디누클로에티드 CpG 모티프를 함유하는 올리고누클레오티드이다. CpG 모티프는 시토신 누클레오티드에 이은 구아닌 누클레오티드이다. 본 발명의 CpG 올리고누클레오티드는 전형적으로 데옥시누클레오티드이다. 바람직한 구체예에서, 올리고누클레오티드에서 누클레오티드 간에는 포스포로디티오에이트, 더욱 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합이 존재하며, 기타 포스포디에스테르 및 기타 누클레오티드간 결합도 본 발명의 범위내에 속한다. 또한, 혼합된 누클레오티드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드도 본 발명의 범위내에 포합된다. 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드 또는 포스포로디티오에이트의 제조 방법은 US5,666,153, US5,278,302 및 WO95/26204에 기술되어 있다.

바람직한 올리고누클레오티드의 예는 하기 서열을 갖는다. 서열은 바람직하게는 포스포로티오에이트 개질된 누클레오티드간 결합을 함유한다.

대안적인 CpG 올리고누클레오티드는 중요하지 않은 결실 또는 첨가가 일어난 상기 바람직한 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 사용된 CpG 올리고누클레오티드는 당해분야에 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다 (예를 들어, EP 468520 참조). 편리하게는, 이러한 올리고누클레오티드는 자동화된 합성기를 사용하여 합성될 수 있다.

TLR 2 아고니스트의 예로는 펩티도글리칸 또는 리포단백질을 포함한다. 이미다조퀴놀린 예컨대, 이미퀴모드(Imiquimod) 및 레시퀴모드(Resiquimod)는 공지된 TLR7 아고니스트이다. 단일 가닥 RNA 또한 공지된 TLR 아고니스트 (사람의 TLR8 및 마우스의 TLR7)인 반면, 이중 가닥 RNA 및 폴리 IC (폴리이노시닉-폴리시티딜릭산 - 바이러스 RNA의 시중의 합성 미메틱)는 TLR3 아고니스트의 예이다. 3D-MPL은 TLR4 아고니스트의 예인 반면, CPG는 TLR9 아고니스트의 예이다.

한 구체예에서, 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물 및 항원은 함께 복합체화된다. 복합체화된다는 것은 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물과 항원이 예를 들어, 정진기 또는 소수성 상호작용 또는 공유 결합에 의해 물리적으로 결합하는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 시가 독소의 B 서브유닛과 항원은 융합 단백질로서 서로 공유적으로 결합되거나 (Haicheur et al, 2000 Journal of Immunology 165 pp 3301-3308) WO 02/060937 (상기 언급됨)에 기술된 바와 같은 방식으로 시스테인 잔기를 통해 연결된다. 본 발명의 구체예에서, 하나 초과의 항원은 각각의 독소 B 분자에 결합되는데, 예컨대, 독소 B 당 2, 3, 4, 5, 6개 항원 분자에 결합된다. 하나 초과의 항원이 존재 하는 경우, 이들 항원은 모두 동일할 수 있거나, 하나 이상이 서로 상이할 수 있거나, 모든 항원이 서로 상이할 수 있다.

항원 자체는 하나 이상의 대상 에피토프를 포함하는 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 항원은 본 발명에 의해 고안된 방식으로 제형화되는 경우 세포내 병원균 예컨대, HIV, 투베르쿨로시스(tuberculosis), 클라미디아 (Chlamydia), HBV, HCV 및 인플루엔자에 대한 면역성을 제공하도록 선택된다. 본 발명은 또한, 양성의 증식성 질환 예컨대, 암에 대한 관련 면역 반응을 증가시킬 수 있는 항원과도 유용함을 발견하였다.

바람직하게는, 본 발명의 백신 제형은 사람 병원균에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 항원 또는 항원성 조성물을 함유하며, 이러한 항원 또는 항원성 조성물은 HIV-1 (예컨대, gag 또는 이의 단편 예컨대, p24, tat, nef, 엔벨로프 예컨대, gp120 또는 gp160, 또는 이들의 단편), 사람 헤르페스 바이러스 예컨대, gD 또는 이의 유도체, 또는 즉시 조기 단백질 예컨대, HSV1 또는 HSV2로부터의 ICP27, 사이토메갈로바이러스 ((esp 사람)(예컨대, gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스 항원, 엡스테인 바르 바이러스 (예컨대, gp350 또는 이의 유도체), 바리셀라 조스테르 바이러스 (Varicella Zoster Virus) (예컨대, gpl, II 및 IE63), 또는 간염 바이러스 예컨대, B형 간염 바이러스 (예를 들어, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스로부터의 항원, 또는 기타 바이러스 병원균 예컨대, 파라믹소바이러스 (paramyxoviruses): 호흡기세포융합 바이러스 (Respiratory Syncytial virus) (예컨대, F G 및 N 단백질 또는 이의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스 (parainfluenza virus), 메아슬레스 바이러스 (measles virus), 멈프스 바이러스 (mumps virus), 사람 파필로마 바이러스 (human papilloma viruses) (예를 들어, HPV 6, 11, 16, 18), 플라비바이러스 (flaviviruses) (예를 들어, 옐로우 페버 바이러스 (Yellow Fever Virus), 덴구에 바이러스 (Dengue Virus), 틱-본 엔세팔리티스 바이러스 (Tick-borne encephalitis virus), 제페니즈 엔세팔리티스 바이러스 (Japanese Encephalitis Virus)) 또는 이의 인플루엔자 바이러스 정제된 또는 재조합 단백질 예컨대, HA, NP, NA, 또는 M 단백질, 또는 이들의 혼합물)로부터 유래되거나, 박테리아 병원균 예컨대, N. 고노르헤아 (N. gonorrhea) 및 N. 메닌지티디스 (N. meningitidis)를 포함하는 나이세리아 spp (예를 들어, 트랜스페린-결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PiIC, 어드헤신); S. 피오제네스 (S. pyogenes) (예를 들어, M 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제), S. 아갈락티아 (S. agalactiae), S. 뮤탄스 (S. mutans); H. 듀크레이 (H. ducreyi); M 카타르할리스 (M catarrhalis), 또한 브란하멜라 카타르할리스 (Branhamella catarrhalis)로서 공지된 것을 포함하는 모락셀라 spp (Moraxella spp) (예를 들어, 고분자량 및 저분자량 어드헤신 및 인바신); B. 페르투스시스 (B. pertussis) (예를 들어, 페르탁틴 (pertactin), 페르투스시스 독소 (pertussis toxin) 또는 이의 유도체, 필라멘트 헤마글루티닌 (filamenteous hemagglutinin), 아데닐레이트 시클라아제 (adenylate cyclase), 핌브리아 (fimbriae)), B. 파라페르투스시스 (B. parapertussis) 및 B. 브론치셉티카 (B. bronchiseptica)를 포함하는 보르데텔라 spp (Bordetella spp); M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis) (예를 들어, ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), M. 보비스 (M. bovis), M. 레프라에 (M. leprae), M. 아비운 (M. avium), M. 파라투베르쿨로시스 (M. paratuberculosis), M. 스메그마티스 (M. smegmatis)을 포함하는 마이코박테리움 spp. (Mycobacterium spp.); L. 뉴모필라 (L. pneumophila)를 포함하는 레지오넬라 spp (Legionella spp); 장독소 E. coli (예를 들어, 콜로니화 인자, 열-불안정성 독소 또는 이의 유도체, 열-안정성 독소 또는 이의 유도체), 장출혈성 E. coli, 장병원성 E. coli를 포함하는 에스케리치아 spp (Escherichia spp), V. 콜레라 (V. cholera) (예를 들어, 콜레라 독소 또는 이의 유도체)를 포함하는 비브리오 spp (Vibrio spp); S. 소네이 (S. sonnei), S. 디센테리아 (S. dysenteriae), S. 플렉스네리 (S. flexnerii)를 포함하는 시겔라 spp (Shigella spp); Y. 엔테로콜리티카 (Y. enterocolitica) (예를 들어, Yop 단백질) , Y. 페스티스 (Y. pestis), Y. 슈도투베르쿨로시스 (Y. pseudotuberculosis)를 포함하는 예르시니아 spp (Yersinia spp); C. 제주니 (C. jejuni) (예를 들어, 독소, 어드헤신 및 인바신) 및 C. 콜라이 (C. coli)를 포함하는 캄필로박터 spp (Campylobacter spp); S. 티피 (S. typhi), S. 파라티피 (S. paratyphi), S. 콜레아수이스 (S. choleraesuis), S. 엔테리티디스 (S. enteritidis)를 포함하는 살모넬라 spp (Salmonella spp); L. 모노사이토제네스 (L. monocytogenes)를 포함하는 리스테리아 spp. (Listeria spp.); H. 피롤리 (H. pylori) (예를 들어, 우레아제, 카탈라아제, 공포화 독소)를 포함하는 헬리코박터 spp (Helicobacter spp); P. 아루기노사 (P. aeruginosa)를 포함하는 슈도모나스 spp (Pseudomonas spp); S. 아우레우스 (S. aureus), S. 에피데르미 디스 (S. epidermidis)를 포함하는 스타필로코커스 spp. (Staphylococcus spp.); E. 파에칼리스 (E. faecalis), E. 파에시움 (E. faecium)을 포함하는 엔테로코커스 spp. (Enterococcus spp.); C. 테타니 (C. tetani) (예를 들어, 테타누스 독소 및 이의 유도체), C. 보툴리늄 (C. botulinum) (예를 들어, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체), C. 디피실리 (C. difficile) (예를 들어, 클로스트리듐 독소 A 또는 B 및 이의 유도체)를 포함하는 클로스트리듐 spp. (Clostridium spp.); B. 안트라시스 (B. anthracis) (예를 들어, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 바실루스 spp. (Bacillus spp.); C. 디프테리아 (C. diphtheriae) (예를 들어, 디프테리아 독소 및 이의 유도체)를 포함하는 코리네박테리움 spp. (Corynebacterium spp.); B. 부르그도르페리 (B. burgdorferi) (예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 가리니 (B. garinii) (예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 아프젤리 (B. afzelii) (예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 안데르소니 (B. andersonii) (예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. 헤름시 (B. hermsii)를 포함하는 보렐리아 spp. (Borrelia spp.); E. 에쿠이 (E. equi) 및 휴먼 그라뉼로시틱 에흐리치오시스 (the Human Granulocytic Ehrlichiosis)의 제제를 포함하는 에흐리치아 spp. (Ehrlichia spp.); R. 리케트시 (R. rickettsii)를 포함하는 리케트시아 spp (Rickettsia spp); C. 트라코마티스 (C. trachomatis) (예를 들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 뉴모니아 (C. pneumoniae) (예를 들어, MOMP, 헤파린-결합 단백질), C. 프시타시 (C. psittaci)를 포함하는 클라미디아 spp. (Chlamydia spp.); L. 인테로간스 (L. interrogans)를 포함하는 렙토스피라 spp. (Leptospira spp.); T. 팔리듐 (T. pallidum) (예를 들어, 드문 외막 단백질 (the rare outer membrane proteins)), T. 덴티콜라 (T. denticola), T. 히요디센테리아 (T. hyodysenteriae)를 포함하는 트레포네마 spp. (Treponema spp.)로부터 유래되거나; 기생충 예컨대, P. 플라시프룸 (P. falciparum)을 포함하는 플라스모듐 spp. (Plasmodium spp.); T. 곤디 (T. gondii) (예를 들어, SAG2, SAG3, Tg34)를 포함하는 톡소플라즈마 spp. (Toxoplasma spp.); E. 히스톨리티카 (E. histolytica)를 포함하는 엔타모에바 spp. (Entamoeba spp.); B. 미크로티 (B. microti)를 포함하는 바베시아 spp. (Babesia spp.); T. 크루지(T. cruzi)를 포함하는 트리파노소마 spp. (Trypanosoma spp.); G. 람블리아 (G. lamblia)를 포함하는 기아르디아 spp. (Giardia spp.); L. 마조르 (L. major)를 포함하는 레쉬마니아 spp. (Leshmania spp.); P. 카리니 (P. carinii)를 포함하는 뉴모사이스티스 spp. (Pneumocystis spp.); T. 바지날리스 (T. vaginalis)를 포함하는 트리코노마스 spp. (Trichomonas spp.); S. 만소니 (S. mansoni)를 포함하는 쉬스토마 spp. (Schisostoma spp.)로부터 유래되거나, 효모 예컨대, C. 알비칸스 (C. albicans)를 포함하는 칸디다 spp. (Candida spp.); C. 네오포르만스 (C. neoformans)를 포함하는 크립토코커스 spp. (Cryptococcus spp.)로부터 유래된다.

M. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis)에 대한 기타 바람직한 특이적 항원은 예를 들어, Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1 (WO 99/51748)이다. M. 투베르쿨로시스에 대한 단백질은 융합 단백질 및 이의 변이체를 포함하며, 여기서 M. 투베르쿨로시스의 2개 이상, 바람직하게는 3개의 폴리펩티드가 더 큰 단백질에 융합된다. 바람직한 융합물은 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI- MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)를 포함한다.

클라미디아 (Chlamydia)에 대한 가장 바람직한 항원은 예를 들어, 고분자량 단백질 (the High Molecular Weight Protein) (HMW) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412), 및 추정의 막 단백질 (Pmps)을 포함한다. 백신 제형의 기타 클라미디아 항원은 WO 99/28475에 기술된 군으로부터 선택될 수 있다.

바람직한 박테리아 백신은 S. 뉴모니아 (S. pneumoniae) (예를 들어, PsaA, PspA, 스트렙토리신, 콜린-결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴모리신 (Pneumolysin)(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25,337-342), 및 이의 변이성 탈독소 유도체 (WO 90/06951; WO 99/03884)를 포함하는 스트렙토코커스 spp로부터 유래된다. 기타 바람직한 박테리아 백신은 H. 인플루엔자 (H. influenzae) 타입 B, 무타입 H. 인플루엔자 (non typeable H. influenzae), 예를 들어, OMP26, 고분자량 어드헤신, P5, P6, 단백질 D 및 리포단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유래된 펩티드 (US 5,843,464) 또는 이의 다중 복사 변이체 또는 융합 단백질을 포함하는 헤모필루스 spp. (Haemophilus spp.)로부터 유래된 항원을 포함한다.

B형 간염 표현 항원의 유도체는 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 특히 유럽특허 출원 EP-A-414 374; EP-A-0304 578, 및 EP 198-474에 기재된 PreS1, PreS2 S 항원을 포함한다. 한 바람직한 양태에서, 본 발명의 백신 제형은 특히, CHO 세 포에서 발현될 경우, HIV-1 항원, gp120을 포함한다. 추가의 구체예에서, 본 발명의 백신 제형은 상기 정의된 바와 같은 gD2t를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 청구된 애쥬번트를 포함하는 백신은 성기사마귀에 반응적인 것으로 여겨지는 사람 파필로마 바이러스 (HPV) (HPB 6 또는 HPV 11 등), 및 자궁경부암에 반응적인 HPV 바이러스 (HPV16, HPV18 등)로부터 유래된다.

특히 바람직한 형태의 성기 사마귀 예방용 또는 치료용 백신은 HPV 단백질 E1, E2, E5, E6, E7, L1, 및 L2로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질 및 L1 단백질을 포함한다.

가장 바람직한 형태의 융합 단백질은 WO 96/26277에 기술된 L2E7 및 W099/10375에 기술된 단백질D(1/3)-E7이다.

바람직한 HPV 자궁 감염 또는 암 예방용 또는 치료용 백신 조성물은 HPV 16 또는 18 항원을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 HPV 16 항원은 단백질 D 담체와 융합되는 초기 단백질 E6 또는 E7을 포함하여, HPV 16으로부터의 단백질 D-E6 또는 E7 융합물 또는 이들의 복합물; 또는 L2와 E6 또는 E7의 혼합물을 형성한다 (WO 96/26277).

대안적으로, HPV 16 또는 18 초기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자 바람직하게는, 단백질 D- E6/E7 융합물로 존재할 수 있다. 이러한 백신은 선택적으로 HPV 18로부터의 E6 단백질 및 E7 단백질중 하나 또는 둘 모두를 바람직하게는, 단백질 D - E6 또는 단백질 D - E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질 형태로 함 유할 수 있다.

본 발명의 백신은 추가로, 기타 HPV 균주, 바람직하게는 균주 HPV 31 또는 33으로부터의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명의 백신은 추가로, 말레리아를 초래하는 파라사이트로부터 유래된 항원 예를 들어, 서큠스포로조이트 단백질 (CS 단백질), RTS, S, MSP1, MSP3, LSA1, LSA3, AMA1 및 TRAP를 포함하는 플라스모디아 팔시파룸 (Plasmodia falciparum)으로부터의 항원을 포함한다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면 (S) 항원에 결합된 P. 팔시파룸의 서큠스포로조이트 (CS) 단백질의 모든 C-말단 부분을 실질적으로 포함하는 하이브리드 단백질이다. 이의 전체 구조는 국제특허출원 PCT/EP92/02591 (WO 93/10152, 우선권 UK 특허 출원 제 9124390.7호)에 기술되어 있다. 효모에서 발현될 경우, RTS는 리포단백질 입자로서 생성되며, HBV로부터의 S 항원과 공동발현되는 경우, RTS,S로서 공지된 혼합된 입자를 생성시킨다. TRAP 항원은 국제 특허 출원 PCT/GB89/00895 (WO 90/01496)에 기술되어 있다. 다중단계 말리리아 백신의 성분이 되는 후보로서 여겨지는 플라스모디아 (Plasmodia) 항원은 P. 팔시파룸 (P. falciparum) MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세퀘스트린 (Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 플라스모듐 spp (Plasmodium spp)에서의 이들의 유사체이다. 본 발명의 한 구체예는 말라리아 백신이며, 여기서 항원 제조물은 하나 이상의 추가의 말라리아 항원과 혼합된 RTS,S 또는 CS 단백질 또는 이의 단편 예컨대, RTS,S의 CS 부분 을 포함하며, 이들 중 하나 또는 둘 모두는 본 발명에 따른 시가 독소 B 서브유닛에 결합될 수 있다. 하나 이상의 추가의 말라리아 항원은 예를 들어, MPS1, MSP3, AMA1, LSA1 또 LSA3로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

제형은 또한, 항-종양 항원을 함유할 수 있으며, 암의 면역치료학적 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 애쥬번트 제형은 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 직장암 또는 흑색종에 대한 것과 같은 종양 거부 항원에 대해 유용성을 갖는다. 예시적 항원으로는 MAGE 1 및 MAGE 3 또는 기타 MAGE 항원 (흑색종 치료용), PRAME, BAGE, 또는 GAGE (Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997) ; Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)이 있다. 실제로 이들 항원은 다양한 범위의 종양 유형 예컨대, 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 흑색종에서 발현된다. 기타 종양 특이적 항원은 본 발명의 애쥬번트와 함께 사용하기에 적합하며, 종양-특이적 강글리오시드, 전립선 특이적 항원 (PSA), 또는 Her-2/neu, KSA (GA733), PAP, 맘마글로빈, MUC-1, 칼시노엠브리오닉 항원 (CEA)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 본 발명에 따른 애쥬번트 조성물 및 종양 거부 항원을 포함하는 백신이 제공된다.

본 발명의 특히 바람직한 양태에서, 백신은 종양 예컨대, 전립선암, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 직장암, 난소암 또는 흑색종 항원을 포함한다. 따라서, 제형은 종양-관련 항원 및 종양-지지 메카니즘 (예를 들어, 혈관신생, 종양 침범)과 관련된 항원을 함유할 수 있다. 또한, 암 치료용 백신에 특히 관련된 항원은 또한, 전립선-특이적 막 항원 (PSMA), 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 티로시나아제, 서르비빈 (survivin), NY-ES01, 프로스타아제, PS108 (WO 98/50567), RAGE, LAGE, HAGE를 포함한다. 또한, 상기 항원은 많은 암 치료 또는 면역학적 거세에 유용한 자가 펩티드 호르몬 예컨대, 전장 고나도트로핀 (Gonadotrophin) 호르몬 방출 호르몬 (GnRH, WO 95/20600)인 짧은 10개 아미노산 길이 펩티드일 수 있다.

본 발명의 백신은 알레르기의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 이러한 백신은 알레르겐 특이적 항원 예를 들어, Der p1을 포함할 것이다.

각 백신 투여량중의 항원 양은 전형적인 백신 접종인에서 현저한 부작용 없이 면역보호적 반응을 유도하는 양으로서 선택된다. 이러한 양은 어떤 특이적 면역원이 사용되는지, 어떻게 존재하는 지에 따라 상이할 것이다. 조성물이 단독 애쥬번트로서 금속 염을 포함하는 경우, 유리 항원의 수준 (예를 들어, 실시예 1.5에 기술된 방법에 의해 측정됨)은 면역보호를 위한 한정된 양일 것이라는 것이 당업자에게는 자명할 것이다.

일반적으로, 각각의 사람 투여량은 0.1-1000㎍의 항원, 바람직하게는 0.1-500㎍, 바람직하게는 0.1-100㎍, 가장 바람직하게는 0.1 내지 50㎍을 포함할 것이다. 특정 백신의 최적량은 백신처리된 피검자에서 적합한 면역 반응을 관찰하는 것을 포함하는 표준 연구에 의해 확인될 수 있다. 초기 백신접종 후, 피검자는 적당한 간격을 두고 1회 또는 수회의 부스터(booster) 면역화 처리될 수 있다. 이러한 백신 제형은 프라이밍(priming) 또는 부스팅(boosting) 백신접종 요법으로 포유 동물의 점막 표면에 적용될 수 있거나; 대안적으로, 예를 들어, 피내, 피하내 또는 근내 경로를 통해 전신 투여될 수 있다. 근내 투여가 바람직하다.

사용된 3 D MPL의 양은 일반적으로 적으나, 백신 제형에 따라, 1회 투여량당 1-1000㎍, 바람직하게는 1회 투여량당 1-500㎍, 더욱 바람직하게는 1회 투여량당 1 내지 100㎍일 수 있다.

본 발명의 애쥬번트 또는 백신중의 GpG 또는 면역자극성 올리고누클레오티드의 양은 일반적으로 적으나, 백신 제형에 따라, 1회 투여량당 1-1000㎍, 바람직하게는, 1회 투여량당 1-500㎍, 더욱 바람직하게는 1회 투여량당 1 내지 100㎍이다.

본 발명의 애쥬번트에 사용하기 위한 사포닌의 양은 1회 투여량당 1-1000㎍, 바람직하게는 1회 투여량당 1-5000㎍, 더욱 바람직하게는 1회 투여량당 1-250㎍, 가장 바람직하게는 1회 투여량당 1 내지 100㎍일 수 있다.

본 발명의 제형은 예방용 및 치료용으로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 의약에 사용하기 위해 본원에 기술된 바와 같은 백신 조성물을 제공한다.

추가의 구체예에서, 본원에 실질적으로 기술된 바와 같은 조성물을 투여함으로써 질환에 민감하거나 질환으로부터 고통받는 개체를 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본원에 실질적으로 기술된 바와 같은 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하여, 감염성 박테리아 및 바이러스 질환, 기생충 질환, 특정 세포내 병원균 질환, 증식성 질환 예컨대, 전립선염, 유방암, 결장암, 폐암, 췌장암, 직장암, 난소암 또는 흑색종; 암 이외의 만성 질환, 알레르기를 포함하는 군으로부터 선택된 질환으로부터 개체를 예방하는 방법을 제공한다.

게다가, 본 발명의 조성물을 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물에서 CD8+ 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 항원을 애쥬번트와 혼합된 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물과 혼합하는 것을 포함하여 백신을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 혼합물에 사용하는데 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제의 예로는 특히, 물, 인산염 완충된 염수, 등장성 완충액을 포함한다.

본 명세서에 언급된 특허 및 특허 출원을 포함하나 이에 제한되지 않는 모든 문헌은 이들 각각이 본원에 참고문헌으로서 특정하게 그리고 개별적으로 언급되어 있는 경우, 이들 전체가 본원에 참고문헌으로 인용되었다.

본 발명은 하기 실시예 및 도면을 참조로 예시된다. 모든 도면에서, adeno-ova (OVA 단백질을 함유하는 아데노바이러스 벡터)는 1차 주입에서 양성 대조군으로서 사용되었다. P/B (프라임/부스트)는 Adeno-Ova의 1차 주입으로의 양성 대조군이며, 이차는 AS A (도 6B의 AS H)중의 Ova 단백질의 부스트 주입이다.

도 1: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 1차 주입 후 7일째 PBL중의 신페클(Siinfekl)-특이적 CD8 빈도

도 2: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 1차 주입 후 14일째 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 3: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 1차 주입 후 15일째 신페클-특이적 사이토킨-생성 CD8 T 세포를 통한 PBL중에서 평가된 이펙터 T 세포 반응 지속성

도 4: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 1차 주입 후 15일째 항원-특이적 사이토킨-생성 CD8 T 세포를 통한 PBL중에서 평가된 이펙터 T 세포 반응 지속성

도 5: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 1차 주입 후 15일째 생체내에서 검출된 세포독성 활성에 의해 평가된 이펙터 T 세포 반응

도 6: (A) AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 2차 주입 후 47일째 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도. (B) 0일에서 98일까지의 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도의 동역

도 7: AS A 및 AS H STxB Ova 백신으로의 2차 주입 후 47일째의 PBL중의 항원-특이적 사이토킨 생성 CD4 T 세포를 통해 평가된 이펙터 T 세포 반응

도 8: AS A 및 AS H STxB Ova 백신으로의 2차 주입 후 47일째의 PBL중의 항원-특이적 사이토킨 생성 CD8 T 세포를 통해 평가된 이펙터 T 세포 반응

도 9: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 2차 주입 후 47일째의 생체내에서 검출된 세포독성 활성에 의해 평가된 이펙터 T 세포 반응

도 10A: AS A STxB Ova 및 AS H STxB Ova 백신으로의 2차 주입 후 15일 및 40일째의 체액성 반응

도 10B: ASH STxB-OVA의 2차 주입 후 78일째에 비장에서 평가된 항-Ova 메모리 B 세포 빈도

도 11: 1차 주입 후 13일째에 AS A, AS F, AS D, AS E, STxB-ova로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 12A: 1차 주입 후 15일째에 AS A, AS B, AS C, AS G, AS I 및 AS H STxB-ova로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 12B: 1차 주입 후 6일째에 AS A, AS B, AS C, AS G, AS I 및 AS H STxB-ova로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 13: 동일한 용량의 AS H로 제형화된 상이한 용량의 STxB-ova 백신에 대한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 14: 1차 주입 후 14일째에 PBL중에 측정된 AS J (두 용량) 또는 AS K로 처리된 STxB-ova에 의한 생체내에서 유도된 면역 반응의 평가. (A) 신페클-특이적 CD8 빈도. (B) 항원-특이적 사이토킨-생성 CD8 빈도. (C) 생체내에서 검출된 신페클-특이적 세포 분해

도 15: 1차 주입 후 14일째에 AS L, AS G, AS M STxB-ova 백신으로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 16: 1차 주입 후 14일째에 AS B, AS C, AS K, AS F 또는 AS T STxB ova 백신으로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 17: 1차 주입 후 14일째에 AS B, AS N, AS I STxB-ova 백신으로 처리한 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 18: AS G, AS O, AS P, AS Q STxB-ova 백신으로 처리한 1차 주입 후 14일째의 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 19: AS G, AS R, AS S STxB-ova 백신으로 처리한 1차 주입 후 14일째의 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 20: AS A StxB-ova 백신으로의 1차 주입 후 14일 또는 42일째 수행한 2차 주입 후 15일째에 검출한 체액성 반응

도 21: AS G, AS L, AS U, AS V STxB-ova 백신으로 처리한 1차 주입 후 14일째에 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

도 22: ASW1, ASW2-ova 백신으로의 1차 주입 후 14일째의 PBL중의 신페클-특이적 CD8 빈도

1. 시제 및 배지

1.1 애쥬번트 처리된 STxB-Ova의 제조

전장 닭 오브알부민에 결합된 STxB: STxB에서 규정된 어셉터 부위로의 단백질의 화학적 결합을 허용하기 위해, 시스테인을 야생형 단백질의 C-말단에 첨가하여 STxB-Cys를 생성시켰다. 재조합 변이체 STxB-Cys 단백질을 종래에 기술된 바와 같이 생성시켰다 (Haicheur et al.; 2000, J.Immunol. 165, 3301). 리물루스 (Limulus) 검정 테스트에 의해 측정된 내독소 농도는 0.5EU/ml 미만이었다. STxB-ova는 종래에 기술되어 있으며 (HAICHEUR et al., 2003, Int.Immunol., 15, 1161-1171), 루거 조안 (Ludger Johannes) 및 에릭 타투어(Eric Tartour) (Curie Institute)에 의해 제공되어 있다.

전장 닭 오브알부민에 결합된 StxB를 하기 기술된 각각의 애쥬번트 시스템으로 제형화시켰다.

1.2. 갈라비오스(galabiose) 결합 검정

시가 독소의 B 서브유닛에 의해 우선적으로 인지된 Gb3 수용체는 세포 표면 글리고스핑고리피드, 글로보트리아오실세라미드 (Galα1-4Galβ1-4 글루코실세라미드)이며, 여기서 Gal은 갈락토스이다. 하기 기술된 방법은 타라고-트라니(Tarrago-Trani)(Protein Extraction and Purification 38, pp 170-176, 2004)에 의해 기술된 방법에 기초하며, 시중에서 입수가능한 갈락비오스-결합된 아고로스 겔 (calbiochem)상에서의 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 갈락비오스 (Galα1->4Gal)는 Gb3의 올리고사카라이드 부분의 말단 카르보히드레이트 부분이며, 시가 독소의 B 서브유닛에 의해 인지된 최소 구조를 나타내는 것으로 여겨진다. 이러한 방법은 E.coli 분해물로부터 직접적으로 시가 독소를 정제하는데 성공적으로 사용되었다. 따라서, 이들 부분에 결합하는 단백질이 Gb3 수용체에 결합할 것으로 추측할 수 있다.

PBS 완충액 (500㎕)중의 대상 단백질을 동일한 완충액중에서 이미 균질환된 100㎕의 고정화된 갈라비오스 수지 (Calbiochem)와 혼합하고, 회전 휠상에서 4℃에서 30분 내지 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 5000rpm에서 1분 동안 먼저 원심분리 한 후, 펠렛을 PBS로 2회 세척하였다. 그 후, 결합된 물질을 pH2.5 100mM 글리신 2x500㎕중에 최종 펠렛을 재현탁시킴으로써 2회 용출시켰다. 그 후, 통과한 물질, 풀링된 세척물 및 풀링된 용해물에 상응하는 샘플을 SDA Page, 코마시에(Coomassie) 염색 및 웨스턴 블롯팅에 의해 검정하였다. 이들한 검정 기법은 단백질이 갈라비오스에 결합되어 있어 Gb3 수용체에 결합하는 지의 여부를 확인시켜 준다.

1.3 - 애쥬번트 시스템에 사용하기 위한 수중유 에멀션의 제조

수중유 에멀션의 제조는 WO 95/17210에 기술된 프로토콜에 따른다. 에멀션은 5% 스쿠알렌, 5% 토코페롤, 2.0% 트윈 80을 함유하며; 입자 크기는 180nm이다.

수중유 에멀션의 제조 (2배 농도)

트윈 80을 인산염 완충된 염수 (PBS)중에 용해시켜 PBS중의 2% 용액을 제공하였다. 100ml의 2배 농도 에멀션을 제공하기 위해, 5g의 DL 알파 토코페롤 및 5ml의 스쿠알렌을 완전히 혼합될 때 까지 볼텍스하였다. 90ml의 PBS/트윈 용액을 첨가하고, 완전히 혼합하였다. 그 후, 생성 에멀션을 주사기를 통해 통과시키고, M110S 마이크로유체 기기를 사용하여 최종적으로 마이크로유체화시켰다. 생성된 오일 소적의 크기는 약 180nm였다.

1.4 - 애쥬번트 시스템의 제조

1.4.1 애쥬번트 시스템 A: QS21 및 3D-MPL

유기 용매중의 리피드 (예컨대, 난황으로부터 또는 합성된 포스파티딜콜린) 및 콜레스테롤 및 3D-MPL의 혼합물을 진공하에 (또는 대안적으로 불활성 기체의 스트림하에) 건조시켰다. 수용액 (예컨대, 인산염 완충된 염수)을 첨가하고, 모든 리피드가 현탁될 때 까지 용기를 흔들었다. 그 후, 이 현탁액을 리포좀 크기가 약 100nm로 감소될 때 까지 마이크로유체화시킨 후, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 압출 또는 초음파 처리가 본 단계를 대체할 수 있다.

전형적으로, 콜레스테롤:포스파티딜콜린 비는 1:4(w/w)이며; 수용액을 첨가하여 5 내지 50mg/ml의 최종 콜레스테롤 농도를 제공하였다.

리포좀은 100nm의 한정된 크기를 가지며, SUV (소단층 리포좀: small unilamelar vesicles)로서 언급된다. 리포좀 자체는 시간에 걸쳐 안정적이며, 용해능을 갖지 않는다. 멸균된 벌크 SUV를 PBS에 첨가하여 10, 20 또는 100㎍/ml의 3D-MPL의 최종 농도에 도달시켰다. PBS 조성물은 Na2HPO4:9mM; KH2PO4:48mM; NaCl:100mM pH6.1. 수용액중의 QS21을 SUV에 첨가하였다. 이 혼합물을 DQMPLin으로 칭하였다. 그 후, Stx-OVA를 첨가하였다. 각 성분의 첨가간에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.1 +/- 0.1로 조절하였다.

하기 섹션 3.1에 기술된 실험에서, StxB-OVA의 농도는 4, 10, 20 또는 100㎍/ml이며, 3D-MPL 및 QS21의 농도는 10㎍/ml이다. 이러한 경우, 50㎕의 주입 용량은 0.2-5㎍의 STxB-OVA 및 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21에 상응한다. 0.2㎍의 STxB-OVA의 주입 결과는 도 1-10에 도시되어 있다. 50㎕의 주입 용적이 0.5, 1 및 5㎍의 STxB-OVA에 상응하는 경우의 실험을 수행하였다. 이들 실험은 도 1 내지 10에 도시된 결과에 필적하는 결과를 제공한다.

또 다른 실험에서, StxB-OVA는 20 또는 40㎍/ml의 농도이며, 3D-MPL 및 QS21은 20 또는 100㎍/ml의 농도이다. 이들 실험에서, 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STXB-OVA 및 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21 (도 12A 및 12B에 도시됨) 또는 1㎍의 STxB-OVA 및 2.5㎍의 각각의 3D-MPL 및 QS21 (도 11 및 20에 도시됨)에 상응한다.

1.4.2 애쥬번트 시스템 B: QS21

1.4.2.1: 애쥬번트 시스템 B1

애쥬번트를 애쥬번트 시스템 A에 사용된 방법에 따라 단 3D-MPL은 생략하고 제조하였다. StxB-OVA 및 QS21을 10 또는 20㎍/ml의 농도로 조절하였다. 25 또는 50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 StxB-OVA 및 0.5㎍의 QS21에 상응한다 (도 12A, 12B 및 17에 도시됨).

1.4.2.2: 애쥬번트 시스템 B2

QS21을 100㎍/ml의 pH6.8 PBS중에 희석시킨 후 StxB-OVA를 첨가하여 최종 항원 농도가 40㎍/ml가 되게하였다. 주입 용적 25㎕은 1㎍의 StxB-OVA 및 2.5㎍의 QS21에 상응한다 (도 16에 도시됨).

1.4.3 애쥬번트 시스템 C: 3D-MPL

1.4.3.1: 애쥬번트 시스템 C1

3D-MPL의 멸균된 벌크를 100 또는 200㎍/ml의 수크로오스 용액으로 최종 농도 9.25%로 희석하였다. StxB-OVA를 첨가하여 20 또는 40㎍/ml의 항원 농도에 도달시켰다.

25㎕의 주입 용적은 1㎍의 StxB-OVA와 5㎍의 3D-MPL (도 16에 도시) 또는 0.5㎍의 StxB-OVA와 2.5㎍의 3D-MPL에 상응한다 (결과는 도시되어 있지 않으나 상기 결과에 필적함).

1.4.3.2: 애쥬번트 시스템 C2

애쥬번트를 애쥬번트 시스템 A에 사용된 방법에 따라 단 QS21을 생략하고 제조하였다.

STxB-OVA 및 MPL을 10㎍/ml의 농도로 조절하였다. 50㎕의 주입 용적은 0.5 ㎍의 StxB-OVA 및 0.5㎍의 MPL에 상응한다.

1.4.4 애쥬번트 시스템 D: 수중유 에멀션중의 3D-MPL 및 QS21

실시예 1.3에서와 같이 제조된 멸균된 벌크 에멀션을 PBS에 첨가하여 ml 당 250 또는 500㎕의 에멀션 농도(v/v)가 되게하였다. 그 후, 3D-MPL을 첨가하여 최종 농도가 50 또는 100㎍/ml가 되게하였다. 그 후, QS21을 첨가하여 ml 당 50 또는 100㎍의 최종 농도가 되게하였다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 10 또는 40㎍/ml가 되게하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.8+/-0.1로 조절하였다.

25 또는 50㎕의 주입 용적은 0.5 또는 1㎍의 STxB-Ova, 2.5㎍의 3D-MPL 및 QS21, 12.5㎕ 또는 25㎕의 에멀션에 상응한다. 50㎕의 주입 용적을 이용한 실험은 도 11에 도시되어 있다. 25㎕ 주입 용적을 사용한 실험은 상기 결과에 필적하는 결과를 제공한다.

1.4.5 애쥬번트 시스템 E: 수중유 에멀션중의 고용량 3D-MPL 및 QS21

실시예 1.3에서와 같이 제조된 멸균된 벌크 에멀션을 PBS에 첨가하여 최종 농도가 ml 당 500㎕의 에멀션 (v/v)이 되게 하였다. 200㎍의 3D-MPL 및 200㎍의 QS21을 첨가하였다. 성분의 각각의 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 40㎍/ml의 최종 농도에 도달하게 하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.8 +/-0.1로 조절하였다.

25㎕의 주입 용적은 1㎍의 STxB-OVa, 5㎍의 두 면역자극제 및 12.5㎕의 에멀 션에 상응한다.

1.4.6 애쥬번트 시스템 F: 적은 수중유 에멀션중의 3D-MPL 및 QS21

수중유 에멀션은 실시예 1.3에서와 같으며, 콜레스테롤을 유기상에 첨가하여, 1% 스쿠알렌, 1% 토코페롤, 0.4% 트윈 80 및 0.05% 콜레스테롤의 최종 조성물에 도달하게 하였다. 에멀션 형성 후, 3D-MPL을 첨가하여 100㎍/ml의 최종 농도에 도달하게 하였다. 그 후, QS21을 첨가하여 ml당 100㎍의 최종 농도에 도달하게 하였다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 40㎍/ml의 최종 농도에 도달하게 하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.8+/-0.1로 조절하였다. 25㎕의 주입 용적은 1㎍의 STxB-Ova, 2.5㎍의 3D-MPL 및 QS21, 2.5㎕의 에멀션에 상응한다.

1.4.7 애쥬번트 시스템 G: CpG2006

멸균된 벌크 CpG를 PBS 또는 NaCl 150mM 용액에 첨가하여 100 또는 200㎍/ml의 최종 농도가 되게 하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 10 또는 20㎍/ml의 최종 농도가 되게하였다. 사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (Seq ID No.4)을 갖는 24-머이다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.1+/-0.1로 조절하였다.

50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 5㎍의 CpG에 상응한다 (도 12A, 12B 및 21). 실험은 25㎕의 주입 용적 (0.5㎍의 STxB-Ova 및 5㎍의 CpG에 상응)으로 수행하였다. 결과는 도시되어 있지 않으나 상기 결과에 필적한다.

1.4.8 애쥬번트 시스템 H: QS21, 3D-MPL 및 CpG2006

멸균된 벌크 CpG를 PBS 용액에 첨가하여 최종 농도 100㎍/ml가 되게하였다. PBS 조성물은 Na₂HPO₄: 9mM; KH2PO4:48mM; NaCl:100mM pH6.1이다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게하였다. 최종적으로, QS21 및 3D-MPL을 DQMPLin으로서 언급된 3D-MPL 및 QS21을 함유하는 멸균된 벌크 SUV의 사전 혼합물로서 첨가하여, 10㎍/ml의 최종 3D-MPL 및 QS21에 도달하게 하였다.

사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (Seq ID No.4)을 갖는 24-머이다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.1+/-0.1로 조절하였다.

50㎕의 주입 용적은 1㎍의 STxB-Ova, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21 및 5㎍의 CpG에 상응한다. 그 후, 이러한 제형은 3D-MPL/QS21 및 CpG (각각 10, 10 및 100㎍/ml의 농도)의 용액중에 희석시켜 0.2, 0.04 및 0.008㎍의 StxB-OVA의 투여량을 수득하였다 (이들 제형은 도 1 내지 10 및 13에 도시된 실험에 사용되었다).

도 12A 및 12B에서 도시된 실험에서, CpG의 농도는 100㎍/ml이며, 3D-MPL 및 QS21은 10㎍/ml이며, StxB-OVA는 10㎍/ml이다.

주입 용적 50㎕는 0.5㎍의 StxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21 및 5㎍의 CpG에 상응한다.

한 추가의 실험에서, CpG의 농도는 1000㎍/ml이며, 3D-MPL 및 QS21의 농도는 100㎍/ml이며, StxB-OVA의 농도는 40㎍/ml이다. 주입 용적 25㎕는 1㎍의 StxB- OVA, 2.5㎍의 3D-MPL 및 QS21 및 25㎍의 CpG에 상응한다. 이러한 실험의 결과는 도시되어 있지 않지만, 기타 농도의 성분으로 관찰된 결과에 필적한다.

1.4.9 애쥬번트 시스템 I: QS21 및 CpG2006

멸균된 벌크 CpG를 PBS 또는 NaCl 150mM 용액에 첨가하여 최종 농도가 100 또는 200㎍/ml가 되게하였다. PBS 조성물은 PO4 10mM, NaCl 150mM pH7.4 또는 Na2HPO4: 9mM; KH2PO4:48mM; NaCl:100mM pH6.1이다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도가 10 또는 20㎍/ml가 되게하였다. 최종적으로, QS21을 SUV와 QS21의 멸균된 벌크 사전 혼합물 (실시예 1.3.14에서와 같이 제조된 DQ로서 언급됨)로서 첨가하여 최종 QS21 농도가 10 또는 20μ/ml가 되게 하였다.

50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova, 0.5㎍의 QS21 및 5㎍의 CpG에 상응한다 (도 12A 및 12B).

실험을 또한, 25㎕의 주입 용적 (0.5㎍의 STxB-Ova, 0.5㎍의 QS21 및 5㎍의 CpG에 상응)으로 수행하였다. 결과는 도시되어 있지 않으나 상기 결과에 필적한다.

1.4.10 애쥬번트 시스템 J: 불완전 프라운드 애쥬번트 (IFA)

IFA는 CALBIOCHEM으로부터 수득하였다. IFA를 1분 동안 볼텍스를 사용하여 항원 용적으로 에멀션화시켰다.

STxB-ova를 PBS pH 6.8 또는 7.4중에 40㎍/ml의 농도로 희석하고, 사용된 바와 같은 500㎕/ml의 IFA와 또는 PBS중에 20배 희석시킨 후에 혼합하였다. 25㎕의 주입 용적은 1㎍의 STxB-ova 및 12.5 또는 0.625㎕의 IFA에 상응한다 (도 14에 도시됨).

또 다른 실험에서, StxB-OVA를 PBS pH 6.8 또는 7.4중에 10㎍/ml로 희석시키고, 500 또는 250㎕/ml의 IFA와 혼합하였다. 주입 용적 50㎕은 0.5㎍의 StxB-OVA 및 12.5 또는 25㎕의 IFA에 상응한다. 이들 실험은 도 14에 도시된 결과에 필적하는 결과를 제공하였다.

1.4.11 애쥬번트 시스템 K: 수중유 에멀션

1.4.11.1 애쥬번트 시스템 K1

멸균된 벌크 에멀션을 3D-MPL 및 QS21을 생략한 것을 제외하고는 실시예 1.3에서와 같이 제조하였다.

주입 용적 25㎕는 1㎍의 StxB-OVA 및 12.5㎕의 에멀션에 상응한다. 결과는 도 16에서 애쥬번트 시스템 K로서 도시되어 있다.

1.4.11.2 애쥬번트 시스템 K2

멸균 벌크 에멀션을 3D-MPL 및 QS21을 생략한 것을 제외하고는 애쥬번트 시스템 F에서와 같이 제조하였다.

주입 용적 25㎕는 1㎍의 StxB-OVA 및 2.5㎕의 에멀션에 상응한다.

결과는 도시하지 않았으나, 애쥬번트 시스템 K1으로 관찰된 결과에 필적한다.

1.4.12 애쥬번트 시스템 L: 폴리 I:C

폴리 I:C (폴리이노시닉-폴리시티딜릭산)은 아머샴(Amersham)으로부터의 바이러스 RNA의 시중의 합성 미메틱이다. 일부 실험에서, StxB-OVA를 NaCl 150mM로 희석하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게 하였다. 그 후, 멸균된 벌크 폴리 I:C를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게 하였다.

성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

주입 용적 25㎕는 0.5㎍의 STxB-Ova 및 0.5㎍의 폴리 I:C에 상응한다 (도 15 및 21에 도시됨).

기타 실험에서, StxB-OVA의 농도는 10㎍/ml이며, 폴리 I:C의 농도는 20 또는 100㎍/ml이었다.

주입 용적 50㎕는 0.5㎍의 STxB-Ova 및 1 또는 5㎍의 폴리 I:C에 상응한다.

이들 실험은 도 15 및 21에 도시된 결과에 필적하는 결과를 제공하였다.

1.4.13 애쥬번트 시스템 M: CpG5456

StxB-OVA를 NaCl 150mM으로 희석하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게 하였다. 그 후, 멸균된 벌크 CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하였다. 사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G-3' (CpG 5456)을 갖는 22-머이다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

주입 용적 25㎕는 0.5㎍의 STxB-Ova 및 5㎍의 CpG와 상응한다.

1.4.14 애쥬번트 시스템 N: QS21 및 폴리 I:C

유기 용매중의 리피드 (예컨대, 난황으로부터 또는 합성된 포스파티딜콜린) 와 콜레스테롤의 혼합물을 진공하에 (또는 대안적으로 불활성 기체의 스트림하에) 건조시켰다. 수용액 (예컨대, 인산염 완충된 염수)을 첨가하고, 모든 리피드가 현탁될 때 까지 용기를 흔들었다. 그 후, 이 현탁액을 리포좀 크기가 약 100nm로 감소될 때 까지 마이크로유체화시킨 후, 0.2㎛ 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 압출 또는 초음파 처리가 본 단계를 대체할 수 있다.

리포좀은 100nm의 한정된 크기를 가지며, SUV (소단층 리포좀: small unilamelar vesicles)로서 언급된다. 리포좀 자체는 시간에 걸쳐 안정적이며, 용해능을 갖지 않는다.

SUV의 멸균된 벌크를 PBS에 첨가하여 100㎍/ml의 MPL의 최종 농도에 도달시켰다. 수용액중의 QS21을 SUV에 첨가하여 최종 QS21 농도 100㎍/ml에 도달하게 하였다. 리포좀과 QS21의 혼합물을 DQ로서 칭하였다.

멸균된 벌크 폴리 I:C (Amersham)을 NaCl 150mM로 희석하여 최종 농도 20㎍/ml에 도달하게 한 후, DQ를 첨가하여 QS21중의 최종 농도를 20㎍/ml에 도달하게 하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml에 도달하게 하였다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

주입 용적 25㎕는 0.5㎍의 STxB-Ova, 0.5㎍의 QS21 및 0.5㎍의 폴리 I:C에 상응한다.

1.4.15 애쥬번트 시스템 O: CpG2006 및 수중유 에멀션

수중유 에멀션을 실시예 1.3에서와 같이 제조하였다. 멸균된 벌크 에멀션을 PBS에 첨가하여 최종 농도가 ml 당 500㎕의 에멀션 (v/v)이 되게하였다. 그 후, CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하였다. 성분의 각각의 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반시켰다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.1+/-0.1로 조절하였다.

사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (Seq ID No.4)을 갖는 24-머이다. 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova, 5㎍의 CpG 및 12.5㎕의 에멀션에 상응한다

1.4.16 애쥬번트 시스템 P: CpG2006 및 수중유 에멀션

수중유 에멀션을 키론 베링 FluAd 백신(Chiron Behring FluAd vaccine)에 포함된 안내 책자에 기술된 방법에 따라 제조하였다.

200ml의 H20중의 36.67mg의 시트르산과 627.4mg의 Na 시트레이트.2H2O를 혼합함으로써 시트레이트 완충액을 제조하였다. 별도로, 3.9g의 스쿠알렌과 470mg의 Span 85를 마그네틱 교반하에 혼합하였다.

470mg의 트윈 80을 시트레이트 완충액과 혼합하였다. 생성된 혼합물을 스쿠알렌/Span 85 혼합물에 첨가하고, 마그네틱 교반하에 강하게 혼합하였다. 최종 용적은 100ml이다.

그 후, 혼합물을 M110S 마이크로유체화기 (Microfluidics로부터 입수)에 넣고 오일 소적의 크기를 감소시켰다. 분자량 분포가 0.06이면서 z 평균은 145nm이 었다. 이 크기는 하기 기술 조건을 이용하여 제타사이저(Zetasizer) 3000HS (Malvern으로부터 입수)에서 수득하였다:

- 레이저 파장: 532nm (Zeta3000HS)

- 레이저 파워: 50mW (Zeta3000HS)

- 90°에서 검출된 산란광 (Zeta3000HS)

- 온도: 25℃

- 기간: 소프트웨어에 의해 자동 측정

- 횟수 : 3 연속 측정

- z-평균 직경: 큐뮬런트 검정에 의해

생성 에멀션의 멸균된 벌크를 PBS에 첨가하여 ml당 500㎕ 에멀션 (v/v)의 최종 농도에 도달하게 하였다. 그 후, CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하였다. 성분의 각각의 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게 하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 6.8+/-0.1로 조절하였다.

1.4.17 애쥬번트 시스템 Q: CpG2006 및 IFA 수중유 에멀션

CALBIOCHEM으로부터 수득된 IFA를 PBS에 첨가하여 ml당 500㎕ 에멀션 (v/v)의 최종 농도에 도달하게 하였다. 그 후, CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하였다. 성분의 각각의 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다. 그 후, StxB-OVA를 첨가하여 최종 농도 20㎍/ml가 되게 하였다. 15분 후, pH를 체크하고, 필요에 따라 NaOH 또는 HCl로 7.4+/-0.1로 조절하였다.

1.4.18 애쥬번트 시스템 R: CpG2006 및 Al(OH)3

브렌태그(Brentag)로부터의 Al(OH)₃를 주입용 물중에 1mg/ml (Al⁺⁺⁺)의 최종 농도로 희석하였다. StxB-OVA를 30분 동안 20㎍/ml의 농도로 Al⁺⁺⁺에 흡착시켰다. CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하고, 30분 동안 인큐베이션하고 NaCl을 첨가하여 최종 농도 150mM이 되게 하였다. 모든 인큐베이션은 오르비탈 쉐이킹하에 실온에서 수행하였다. 사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (Seq ID No.4)을 갖는 24-머이다. 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova, 5㎍의 CpG 및 25㎍의 Al+++에 상응한다.

1.4.19 애쥬번트 시스템 S: CpG2006 및 AIPO4

브렌태그로부터의 AIPO4를 주입용 물중에 1mg/ml (Al⁺⁺⁺)의 최종 농도로 희석하였다. STxB-OVA를 30분 동안 20㎍/ml의 농도로 Al⁺⁺⁺에 흡착시켰다. CpG를 첨가하여 최종 농도 200㎍/ml가 되게 하고, 30분 동안 인큐베이션하고 NaCl을 첨가하여 최종 농도 150mM이 되게 하였다. 모든 인큐베이션은 오르비탈 쉐이킹하에 실온에서 수행하였다. 사용된 CpG는 하기 서열 5'-TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT-3' (Seq ID No.4)을 갖는 24-머이다. 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova, 5㎍의 CpG 및 25㎍의 Al⁺⁺⁺에 상응한다.

1.4.20 애쥬번트 시스템 T: 3D-MPL 및 Al(OH)3

브렌태그로부터의 Al(OH)₃를 주입용 물중에 1mg/ml (Al⁺⁺⁺)의 최종 농도로 희석하였다. StxB-OVA를 30분 동안 40 또는 20㎍/ml의 농도로 Al⁺⁺⁺에 흡착시켰다. 3D-MPL을 첨가하여 최종 농도 100㎍/ml가 되게 하고, 30분 동안 인큐베이션하고 NaCl을 첨가하여 최종 농도 150mM이 되게 하였다. 모든 인큐베이션은 오르비탈 쉐이킹하에 실온에서 수행하였다.

25㎕의 주입 용적은 1 또는 0.5㎍의 STxB-Ova, 2.5㎍의 3D-MPL 및 25㎍의 Al⁺⁺⁺에 상응한다. 1㎍의 STxB-Ova에 대한 결과는 도 16에 도시되어 있다. 0.5㎍의 STxB-Ova가 주입된 실험은 도시하지 않았지만, 도 16에 도시된 결과에 필적하는 결과를 제공하였다.

1.4.21 애쥬번트 시스템 U: TLR2-리간드

사용된 TLR2 리간드는 TLR2 특이적인 것으로 공지된 마이크로콜렉션(Microcollection)으로부터 구입한 박테리아 리포펩티드인 합성 Pam3CysSerLys4이다. StxB-OVA는 NaCl 150mM 또는 PBS pH7.4중에 희석시켜 최종 농도 10 또는 20㎍ /ml가 되게 하였다. 그 후, 멸균된 벌크 Pam3CysSerLys4를 첨가하여 최종 농도 40, 100 및 200㎍/ml이 되게하였다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 5 또는 10㎍의 Pam3CysSerLys4에 상응한다. (5㎍에 대한 결과는 도 21에 도시되어 있으며, 기타 용량의 TLR2에 대한 결과에 대해서는 섹션 3.2.9 참조)

기타 실험에서, 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 1㎍의 Pam3CysSerLys4에 상응한다.

1.4.22 애쥬번트 시스템 V: TLR7/8 리간드

사용된 TLR 7/8 리간드는 레시퀴모드 또는 R-848 (Cayla)로서 공지된 이미퀴모드 유도체이다. R-848은 동물 모델에서 잠재적인 항-바이러스 및 항-종양 특성을 갖는 이미다조퀴놀린 패밀리의 저분자량 화합물이다. 이미퀴모드의 활성은 IFN-a 및 IL-12를 포함하는 사이토킨의 유도를 통해 우세하게 매개된다. R-848은 이미퀴모드의 더욱 유효한 유사체이다 (Akira, S. and Hemmi, H.; IMMUNOLOGY LETTER, 85, (2003), 85-95).

STxB-OVA를 PBS pH7.4중에 희석시켜 최종 농도 10 또는 20㎍/ml이 되게하였다. 그 후, 멸균된 벌크 R-848을 첨가하여 최종 농도 20 및 100㎍/ml에 도달시켰다. 성분의 각 첨가 사이에, 중간 생성물을 5분 동안 교반하였다.

50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 1 또는 5㎍의 R-848에 상응한다. 기타 실험에서, 25㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 0.5㎍의 R-848에 상응한 다.

1.4.22 애쥬번트 시스템 W: AIPO4

1.4.22.1 애쥬번트 시스템 W1

브렌태그로부터의 AIPO4를 주입용 물중에 0.5mg/ml (Al⁺⁺⁺)의 최종 농도로 희석하였다. STxB-OVA를 30분 동안 10㎍/ml의 농도로 Al⁺⁺⁺에 흡착시키고, NaCl을 첨가하여 최종 농도 150mM이 되게 하였다. 모든 인큐베이션은 오르비탈 쉐이킹하에 실온에서 수행하였다. 50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova 및 25㎍의 Al⁺⁺⁺에 상응한다.

1.4.22.2 애쥬번트 시스템 W2

브렌태그로부터의 AIPO4를 PBS pH7.4로 0.5mg/ml (Al⁺⁺⁺)의 최종 농도로 희석하였다. STxB-OVA를 30분 동안 10㎍/ml의 농도로 Al⁺⁺⁺에 흡착시켰다. 모든 인큐베이션은 오르비탈 쉐이킹하에 실온에서 수행하였다. 50㎕의 주입 용적은 0.5㎍의 STxB-Ova, 5㎍의 CpG 및 25㎍의 Al⁺⁺⁺에 상응한다. XXXXX로 세팅된 SDA-PAGE에 의한 실험에 의해 항원의 약 70%가 AIPPO4에 흡착되지 않음이 나타났다.

1.5. 항원/금속 염 복합체중의 흡착된 항원 수준의 평가

대상 제형은 6분 동안 6500g에서 원심분리하였다. 생성된 상청액 샘플을 5분 동안 95℃에서 변성시키고, 감소된 샘플 완충액중의 SDS-PAGE 겔상에 로딩하였 다. 애쥬번트 부재하의 항원 샘플을 또한 로딩하였다. 그 후, 겔을 1시간 동안 200V, 200mA로 런닝시켰다. 그 후, 겔을 다이치 방법(Daichi method)에 따라 은염색하였다. 애쥬번트 처리된 제형으로부터의 샘플을 애쥬번트 부재의 항원과 비교함으로써 제형중의 유리 항원 수준을 측정하였다. 당해분야에 널리 공지된 기타 기법 예컨대, 웨스턴 블롯이 또한 사용될 수 있다.

실시예 2: 본 발명의 백신으로 C57/B6 마우스의 백신접종

본원에 기술된 바와 같은 다양한 제형을 사용하여 6-8주령 C57BL/B6 암컷 마우스 (10/군)를 백신접종하였다. 마우스에 1회 또는 14일 간격을 두고 2회 주입하였으며, 1, 2, 3 및 8중 동안 채혈하였다 (실질적인 채혈일에 있어서는 특정 실시예 참조). 마우스는 근내 백신접종하였다 (25㎕ 또는 50㎕의 최종 용적으로 왼쪽 가스트로크네미엔(gastrocnemien) 근육에 주입). 오브알부민 재조합 아데노바이러스를 5 10⁷ 내지 10⁸의 다양한 용량으로 VP 주입하였다.

5% FCS (Harlan, Holland), 1㎍/ml의 각 항-마우스 항체 CD49d 및 CD28 (BD, Biosciences), 2mM L-글루타민, 1mM 나트륨 피루베이트, 10㎍/ml 스트렙타마이신 설페이트, 10유닛/ml 페니실린 G 나트륨 (Gibco), 10㎍/ml 스트렙타마이신 50μM B-ME 메르캅토에탄올 및 100X 희석된 비필수 아미노산으로 보충된 RPMI 1640 (Biowitaker)인 완전 배지중에서 생체외 PBL 자극을 수행하였으며, 상기 첨가제들은 집코 라이프 테크놀로지스 (Gibco Life technologies)로부터 입수하였다. 펩티드 자극은 37℃에서 5% CO2하에 항상 수행하였다.

2.1 면역자극 분석:

2.1.1 항원-특이적 T 세포의 검출

PBL의 분리 및 테트라머 염색. 혈액을 안와후 정맥으로부터 취하고 (마우스당 50㎕, 군당 10마리 마우스), 직접적으로, RPMI + 헤파린 (LEO) 배지중에 직접적으로 희석하였다. PBL을 림포프렙 구배 (CEDERLANE)를 통해 분리하였다. 그 후, 세포를 세척하고, 카운트하고, 최종적으로 1-5 10⁵ 세포를 1/50 최종 농도 (f.c.)로 CD16/CD32 항체 (BD Biosciences)를 함유하는 50㎕ FACS 완충액 (PBS, FCS1%, 0.002%NaN3)중에 재현탁하였다. 10분 후, 50㎕의 테트라머 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하였다. 테트라머 혼합물은 입수가능성에 따라 각각 이뮤노소스(Immunosource) 또는 이뮤노믹스 코울터(Immunomics Coulter)로부터 0.2 또는 1㎕의 신페클-H2Kb 테트라머-PE를 함유한다. 항-CD8a-PercP (1/100 f.c.) 및 항-CD4-APC (1/200 f.c.)(BD Biosciences) 항체를 또한 시험에 첨가하였다. 그 후, 세포를 실온에서 45분 동안 (이뮤노소스의 테트라머의 경우) 또는 37℃에서 10분 동안 (이뮤노믹스 코울터의 테트라머의 경우) 방치한 후, 1회 세척하고, 셀퀘스트 (CELLQuest^TM) 소프트웨어가 구비된 FACS 칼리부르(FACS Calibur^TM)를 사용하여 검정하였다.

2.1.2 세포내 사이토킨 염색 (ICS)

2.1.1에 기술된 바와 같이 취해진 혈액 샘플로 ICS를 수행하였다. 1㎍/ml의 신페클 펩티드 또는 각각 1㎍/ml의 농도로 존재하는 17 또는 15-머 Ova 펩티드 (11 MHC 클래스I-제한된 펩티드 및 6 MHC 클래스 II-제한된 펩티드) 풀로 보충되거나 보충되지 않은 완전 배지중에 5 내지 10 10⁵ PBL을 재현탁하였다. 2시간 후, 1㎍/ml 브레펠딘(Brefeldin)-A (BD, Biosciences)을 16시간 동안 첨가하고, 세포를 총 18시간 후에 수집하였다. 세포를 1회 세척한 후, BD, Biosciences에서 모든 구입한 항-마우스 항체로 염색하였다; 모든 추가의 단계는 얼음위에서 수행하였다. 세포를 먼저 10분 동안 50㎕의 CD16/32 용액 (1/50 f.c., FACS 완충액)중에 인큐베이션시켰다. 50㎕의 T 세포 표면 마커 혼합물을 첨가하고 (1/100 CD8a perCp, 1/100 CD4 PE), 세포를 세척하기 전에 20분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 200㎕의 투과/고정 용액 (BD, Biosciences)에서 고정시키고 투과가능하게 하고, 투과/세척 완충액 (BD, Biosciences)중에서 1회 세척하고, 4℃에서 2시간 또는 밤새 항 IFNg-APC 및 항 IL2-FITC로 염색하였다. 셀퀘스트(CELLQuest^TM) 소프트웨어가 구비된 FACS 칼리부르(Calibur^TM)를 사용하여 데이타를 분석하였다.

도 14B에서, 항-CD4 항체를 APC Cy7으로 라벨링시키고, 항-CD8을 PercP Cy5.5로 라벨링시키고, 항-TNFa-PE 항체를 사이토킨 염색 단계에 포함시켰다.

2.1.3 생체내에서 검출된 세포 매개된 세포독성 활성 (생체내 CMC)

신페클-특이적 세포독성을 평가하기 위해, 면역화된 마우스 및 대조군 마우스에 2개의 상이하게 CFSE-라벨링된 선청성 비세포 및 림프절 군집으로 이루어지며, 1nM 신페클 펩티드로 로딩되거나 로딩되지 않은 표적의 혼합물을 주입하였다. 상이한 라벨링을 위해, 카르복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; Molecular Probes - Palmoski et al.; 2002, J.Immunol. 168, 4391-4398)를 0.2μM 또는 2.5μM의 농도로 사용하였다. 두 유형의 타겟을 1/1비로 풀링시키고, 10⁸ 표적/ml의 농도에서 재현탁시켰다. 1차 주입 후 15일째에 마우스당 200㎕의 표적 혼합물을 꼬리 정맥에 주입하였다. 상이한 시점 (표적 주입 후 4, 18H 또는 24H)에 희생시킨 동물로부터 취한 배출된 림프절 또는 혈액 (경정맥)에 대한 FACS^R 검정에 의해 세포독성을 평가하였다. 신페클-로딩된 표적 세포의 평균 분해율을 하기 식으로 항원-네거티브 대조군에 관하여 계산하였다:

사전주입된 표적 세포 = 생체내 주입 전에 FACS에 의해 수득된 펩티드-펄싱된 표적 (사전주입 +)과 비펄싱된 표적 (사전주입-)의 혼합물

교정된 표적 (+) = 사전주입된 혼합물 (상기 참조)에서 사전주입+ 세포의 수를 측정하기 위해, 교정된 생체내 주입 후 FACS에 의해 수득된 펩티드-펄싱된 표적의 수

2.1.4 Ag 특이적 항체 역가 (총 IgG의 개별적 검정): ELISA

2차 주입 후 15일 및 40일째에 혈청학적 검정을 평가하였다. 마우스 (군당 10마리)를 레트로-오르비탈 펑처로 출혈시켰다. ELISA에 의해 항-ova 총 IgG를 측 정하였다. 96 웰-플레이트 (NUNC, 면역흡착 플레이트)를 4℃에서 밤새 항원으로 코팅하였다 (ova 용액의 웰 당 50㎕ (ova 10㎍/ml, PBS)). 그 후, 플레이트를 세척 완충액중에 세척하고 (PBS/0.1% 트윈 20 (Merck)), 100㎕ 포화 완충액 (PBS/0.1% 트윈 20/1% BSA/10% FCS)으로 1시간 동안 37℃에서 포화시켰다. 세척 완충액으로 추가로 3회 세척한 후, 100㎕의 희석된 마우스 혈청을 첨가하고, 90분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 또 다시 3회 세척 후, 플레이트를 37℃에서 추가로 1시간 동안 포화 완충액으로 1000배 희석시킨 바이오티닐화된 항-마우스 총 IgG와 인큐베이션하였다. 포화 후, 96w 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 다시 세척하였다. 포화 완충액으로 1000배 희석시킨 스트렙타비딘 퍼옥시다아제 (Amersham) 용액을 웰당 50㎕ 첨가하였다. 마지막 세척은 세척 완충액중의 5 단계 세척이었다. 최종적으로, 웰당 50㎕의 TMB (산성 완충액중의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 - H₂O₂의 농도는 0.01%임 - BIORAD)를 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 실온에서 암실하에 보관하였다. 반응을 중단하기 위해, 웰 당 50㎕의 H₂SO₄ 0.4N을 첨가하였다. BIORAD로부터의 엘리사 플레이트 리더(Elisa plate reader)에 의해 450/630nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 소프트맥스-프로(softmax-pro) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

2.1.5 B 세포 Elispot

비장 및 골수 세포를 2차 주입 후 78일째에 수집하고, 3㎍/ml의 CpG 2006 및 50U/ml의 rhIL-2가 보충된 완전 배지에서 5일 동안 37℃에서 배양시켜, 메모리 B 세포가 항체-분비 플라즈마 세포로 분화되게 하였다. 5일 후, 96-웰 필터 플레이트를 에탄올 70%와 10분 동안 인큐베이션하고, 세척하고, 오브알부민 (50㎍/ml) 또는 염소 항-마우스 Ig 항혈청으로 피복하였다. 그 후, 이들을 완전 배지로 포화시켰다. 세포를 채취하고, 세척하고 1시간 동안 37℃에서 2.x10⁵ 세포/웰로 플레이트상에 신속히 처리하였다. 그 후, 플레이트를 4℃에서 밤새 저장하였다. 다음날, 플레이트를 PBS 트윈 20 0.1%로 세척함으로써 세포를 제거하였다. 그 후, 웰을 1/500 PBS로 희석된 항-IgG 바이오티닐화된 항체로 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 세척하고 1시간 동안 엑스트라비딘-양고추냉이 퍼옥시다아제 (4㎍/ml)와 인큐베이션하였다. 세척 단계 후, 아미노-에틸-카르바졸 (AEC) 및 H₂O₂ 용액과 10분 인큐베이션함으로써 스팟을 드러나게 하였으며, 플레이트를 수돗물로 세척함으로써 이를 고정시켰다. IgG 또는 Ova-특이적 IgG를 분비하는 각각의 세포는 레드 스팟으로서 나타났다. 결과는 총 100개 IgG 스팟당 ova-특이적 IgG 스팟의 빈도수로서 나타내었다.

3. 결과

하기 기술된 결과는 CD8 반응을 유도하는데 있어서 STxB 시스템의 효능을 다양한 애쥬번트 시스템 또는 이들 성분의 일부와 혼합함으로써 현격하게 증대됨을 보여준다.

3.1 애쥬번트 시스템 A & H의 데이타

3.1.1 AS A 및 AS H와의 일차 반응의 평가

수득된 결과는 애쥬번트의 부재하에 STxB-ova로의 저용량 (0.2㎍) 면역화는 생체외에서 검출될 수 있는 강한 CD8 T 세포 면역 반응을 유도하지 못함을 보여준다. 반대로, STXB-OVA가 애쥬번트 시스템 A 또는 H와 혼합되는 경우 강한 면역 반응이 관찰되었다. 또한, 애쥬번트 처리된 단백질에 대한 확실한 이점이 입증되었다. 애쥬번트 시스템 A 또는 H로 애쥬번트 처리된 STxB-ova는 강하고 지속적인 일차 반응을 유도하는데 유효하다. 이는 높은 빈도의 항원-특이적 CD8 T 세포를 유도한다 (도 1 - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍ CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하며, 마우스를 1차 주입 후 7일째에 채혈하였다). 또한, 도 2 (주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG을 포함한다. 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스를 1차 주입 후 14일째 채혈하였다)는 이러한 신페클-특이적 CD8 반응이 주입후 7일 내지 14일 사이에 여전히 증가함을 보여준다. 이는 애쥬번트 처리된 단백질로의 백신접종시에는 관찰되지 않으나, 아데노바이러스와 같은 생 벡터에 의해 유도된 일차 반응의 특징이라 할 수 있다. 프라이밍된 CD8 T 세포는 용이하게 분화된 이펙트 T 세포이며, 이는 면역우성 펩티드 또는 ova 펩티드의 풀로 자극이 수행되던지의 여부에 상관없이 IFNν를 생성한다 (도 3 및 4에 각각 도시됨, 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.2에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 1차 주입 후 14일에 채혈하였다). 펩티드 풀로의 재자극시 관찰된 더 높은 빈도의 반응물 CD8 T 세포는, 일차 CD8 T 세포 레퍼토리가 클래스 I 면역우성 에피토프에 한정되지 않음을 나타낸다. 또한, STxB-ova가 애쥬번트 처리되는 경우에만 생체내에서 높은 세포독성 활성이 검출될 수 있다 (도 5 - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 CPG를 포함한다. 방법은 표적물 주입 후 18시간째에 상기 2.1.3에 기술된 바와 같이 수행하였다). 최종적으로, AS H 애쥬번트 처리된 STxB-ova에 의해 유도된 일차 반응은 도 6B에 기술된 바와 같이 강한 영속성을 띤다 (주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 상이한 시점에서 채혈하였다).

3.1.2 AS A 및 AS H와의 이차 반응의 평가

STxB 독소 전달 시스템과 유효한 애쥬번트의 혼합은 이차 면역 반응의 범위 및 지속성을 또한 증대시킨다. 이는 부스트 후 47일에 반응을 평가함으로써 가장 우수하게 예시화된다. 중요하게는, 애쥬번트 처리된 STxB-OVA에 의해 유도된 높은 CD8 반응은 재조합 아데노바이스 프라임/애쥬번트 처리된 단백질 부스트 기법에 의해 유도된 것과 유사한 강도 및 영속성을 띤다 (도 6A - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 2차 주입 후 47일에 채혈하였다). 이펙터 T-세포 군집에 있어서는, 사이토카인-생성 T 세포는 CD4 및 CD8 T 세포 구획에서 여전히 검출된다 (도 7 및 8 - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG를 포함한다. 방 법은 상기 2.1.2에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 2차 주입 후 47일에 채혈하고, PBL을 ova 펩티드 풀로 자극하였다). 게다가, 후반 시점에서, 세포독소 활성은 표적물 주입후 4시간 (데이타 미도시) 및 24시간 (도 9 - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.3에 기술된 바와 같이 수행하였다)에 생체내에서 여전히 검출될 수 있다.

체액성 반응은 부스트 후 15일 및 40일에 조사하였다 (도 10a - 주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, AS H에 있어서는 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.4에 기술된 바와 같이 수행하였으며, 결과는 10마리 마우스로 구성된 각각의 군에 대해 기하평균 계산을 통해 나타내었다). 애쥬번트의 부재시, STxB-ova 단독은 B 세포 반응을 유도할 수 없다. 반대로, 애쥬번트 단백질이 STxB에 결합되던지의 여부에 상관없이 시험된 두 시점에서 동등한 항체 역가가 검출되었다.

도 10B (주입물은 0.2㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.5에 기술된 바와 같이 수행하였다)에서, 항-ova 메모리 B 세포 빈도는 주입 후 78일에 관찰되었다. 2회 주입 후 15일 및 40일에 검출된 항체 역가가 동일하였지만, 애쥬번트 처리된 단백질과 비교하여 STxB-ova를 애쥬번트 처리할 경우 더 높은 빈도의 메모리 B 세포가 검출되기 때문에, 메모리 B 세포 반응의 속성은 상이하다. STxB-ova 단독은 이들 상에 메모리 B 세포를 유도할 수 없다.

흥미롭게도, 프라이밍과 부스트가 14일이 아니라 42일 간격을 두고 수행된 경우 (도 20 - 주입물은 0.5㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함한다. 방법은 상기 2.1.4에 기술된 바와 같이 수행하였다), STxB-OVA AS A에 의해 유도된 체액성 반응이 OVA AS A 보다 높았으며, 이는 애쥬번트와 혼합될 경우, 벡터화가 더 높은 빈도의 B 세포 메모리 세포를 유도할 수 있음을 시사한다.

3.1.3 AS H 애쥬번트 시스템과 혼합된 낮은 용량의 STxB-OVA에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 13 (주입물은 0.008, 0.04, 0.2 또는 1㎍의 STxB-OVA, 0.5㎍의 3D-MPL 및 QS21을 포함하며, 5㎍의 CPG를 포함한다. 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 1차 주입 후 14일에 채혈하였다)은 신페클-특이적 CD8 군집이 8ng의 STxB-ova와 같이 낮은 용량의 단일 주입 후 14일에 검출될 수 있으며, 이는 AS H로 제형화된 4ng의 항원에 상응한다. 이들 결과는 애쥬번트와 STxB 시스템의 혼합된 사용이 유도된 T 세포 반응을 감소시키지 않고 항원 용량의 현저한 감소를 가능하게 할 수 있음을 보여준다.

3.2 기타 애쥬번트 시스템과 혼합된 STxB-OVA에 의해 유도된 면역 반응의 평가

본 발명자들은 AS A 또는 AS H 이외의 애쥬번트 시스템 또한 STxB 벡터화 시스템과의 효과를 상승시킬 수 있는지의 여부를 알아보고자 하였다.

3.2.1 AS A, F, D 또는 E STxB ova 백신으로의 백신접종 후의 면역반응의 평가

어떤 애쥬번트 시스템으로 시험하던지, 일차 반응의 평가는 애쥬번트 처리된 STxB-ova가 높은 빈도의 항원 특이적 TCD8을 유도함을 보여준다 (도 11 - 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 1차 주입 후 13일에 채혈하였다). 현저하게는, AS D 및 AS E에 있어서는, 애쥬번트 처리된 단백질로의 단일 면역화 후에 검출불가능한 CD8 반응이 일반적으로 관찰될 수 있음이 입증되었다. 애쥬번트 처리된 STxB-ova는 사이토킨 분비 이펙터 T 세포로 용이하게 분화되는 CD8 T 세포를 강하게 프라이밍시킨다 (데이타 미도시됨).

3.2.2 애쥬번트 시스템의 개별적 성분 (3D-MPL - AS C2, QS21 - AS B, CpG2006 - AS G)과 혼합된 STxB-OVA로 유도된 면역 반응의 평가

본 발명자들은 생체내에서 상기 애쥬번트 시스템의 다양한 성분을 평가하였다. 도 12A (방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 1차 주입 후 15일에 채혈하였다)는 STxB-ova가 단일 면역자극제 예컨대, QS21 또는 TLR9-리간드 예컨대, CpG로 애쥬번트 처리되고, TLR-4 리간드 예컨대, 3D-MPL (AS C2)로 더 좁은 범위로 애쥬번트 처리되는 경우, 신페클-특이적 CD8 군집이 검출될 수 있음을 보여주며, 이러한 후자의 면역자극제는 도 16에서와 같이 더 높은 용량 (AS C1)으로 사용할 경우 심지어 더욱 효과적이다. 상기와 같이, 이들 프라이밍된 CD8 T 세포는 용이하게 사이토킨-분비 이펙터 세포로 분화된다 (데이타 미도시). 각각의 애쥬번트 성분 단독에 의해 유도된 이차 CD8 반응은 동일하나, STxB-ova가 QS21과 하나 이상의 TLR 리간드의 혼합물로 애쥬번트 처리되는 경우, 더 높은 반응이 관찰된다 (도 12B - 방법은 상기 2.1.1에 기술된 바와 같이 수행하고, 마우스는 2 차 주입 후 6일에 채혈하였다).

3.2.3 애쥬번트 J 또는 애쥬번트 K와 혼합된 STxB-OVA에 의해 유도된 면역 반응의 평가

이전에 공개된 관찰과 반대로, STxB-OVA가 에멀션 예컨데 IFA와 혼합될경우, CD8 반응의 증가가 또한 관찰되었다. IFA 즉, 유중수 에멀션으로의 제형화는 용량 의존적 방식으로 CD8 반응을 증가시킨다. 신페클-특이적 CD8 T 세포의 증가된 빈도 (도 14A)는 사이토킨 생성 (도 14B) 및 세포독소 활성 (도 14C)과 같은 증가된 CD8 이펙터 작용에 상응한다. STxB-ova가 수중유 에멀션과 혼합될 경우 유사한 결과가 수득된다.

3.2.4 애쥬번트 시스템 C1, B, K, F 또는 T와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

본 발명자들은 AS T 및 애쥬번트 시스템 F의 다양한 성분을 평가하였다. 도 16은, STxB-OVA와 혼합될 경우, 각각의 성분이 신페클-특이적 CD8 T 반응을 증가시킬 수 있음을 보여준다. 그러나, 성분이 제형중에 혼합될 경우 가장 높은 반응이 관찰된다.

3.2.5 애쥬번트 L, G 또는 M과 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 15는 카테고리 B 및 C를 나타내는 폴리 I:C (TLR3) 또는 CpG 서열 (TLR9)와 같은 TLR 리간드와 STX-B-OVA의 혼합물은 신페클 특이적 CD8 T 반응의 범위를 현저하게 증가시킴을 보여준다.

3.2.6 애쥬번트 시스템 B, N 또는 I와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 17은 QS21 단독으로 애쥬번트 처리되거나, TLR3 리간드 (폴리 I:C) 또는 TLR9 리간드 (CpG)와 혼합된 QS21로 애쥬번트 처리될 경우, STxB-OVA에 의해 유도된 CD8 반응이 현저하게 증대됨을 보여준다.

3.2.7 애쥬번트 시스템 G, O, P 또는 Q와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 18은, CpG 단독으로 애쥬번트 처리되거나, IFA 또는 다양한 수중유 에멀션과 혼합된 CpG로 애쥬번트 처리되는 경우, STxB-OVA에 의해 유도된 CD8 반응이 현저하게 증대됨을 보여준다.

3.2.8 애쥬번트 시스템 G, R 또는 S와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 19는, STX-B-OVA에 의해 유도된 CD8 반응이 CpG 단독으로 애쥬번트 처리되거나, Al(OH)3 또는 AIPO4와 혼합된 CpG로 애쥬번트 처리되는 경우, 현저하게 증가됨을 보여준다.

3.2.9 애쥬번트 시스템 G, L, U 또는 V와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 21은, TLR9 및 3개 리간드 이외에, STX-B-OVA와 TLR2 및 TLR7/8 리간드 혼합물이 신페클 특이적 CD8 T 반응의 범위를 현저하게 증가시킴을 보여준다. TLR2 리간드를 0.2 내지 10㎍의 용량 범위로 시험하였다. 5㎍ 미만의 용량에서는 어떠한 증가도 관찰되지 않았다. 흥미롭게도, 용량을 10㎍으로 증가시키면 감소된 반응이 관찰되었다. 이는 조절 분자 예컨대, IL-10을 유도하는 TLR2 리간드의 능력에 의해 설명될 수 있다.

3.2.10 애쥬번트 시스템 W1 또는 W2와 혼합된 STxB ova에 의해 유도된 면역 반응의 평가

도 22는 AS W1 (항원이 알루미늄 염상에 흡착되는 제형중에 알루미늄 인산염을 함유)와 STxB-Ova의 혼합물이 애쥬번트 처리되지 않은 STxB-ova 펩티드로 관찰된 면역 반응과 비교하여 약간 증가된 면역 반응을 유도함을 보여준다. 그러나, 조성물이, AS W2에서 관찰된 바와 같이 항원의 일부 (이 경우 약 70%)가 예를 들어, 인산염 완충된 염수중에 용해된 알루미늄 염과의 흡착에 의해 알루미늄 염상에 흡착되지 않도록 제형화되는 경우, 애쥬번트 처리되지 않은 STxB-Ova에 의해 제공된 것에 비해 증대된 면역 반응이 관찰되었다.

Claims

항원과 복합체화된, Gb3 수용체에 결합할 수 있는 시가 독소(Shiga toxin)의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물을 포함하며, 추가로 애쥬번트를 포함하며, 애쥬번트가 단독으로 금속 염인 경우, 항원의 약 50% 이하가 금속 염에 흡착되는 방식으로 제형화되는 백신 조성물.
제 1항에 있어서, 시가 독소의 B 서브유닛의 면역학적 작용성 등가물은 시가 독소의 B 서브유닛과 50% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 벡터가 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 작용 단편인 백신 조성물.
제 2항에 있어서, 벡터가 베로톡신-1(Verotoxin-1)의 B 서브유닛 또는 이의 작용 단편인 백신 조성물.
제 1항 내지 제 4항중의 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트가 금속 염, 수중유 에멀션, 톨 유사 수용체(Toll like receptor) 아고니스트, 사포닌 또는 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신 조성물.
제 5항에 있어서, 애쥬번트가 톨 유사 수용체 아고니스트인 백신 조성물.
제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 항원과 B 서브유닛이 공유적으로 결합된 백신 조성물.
제 7항에 있어서, 항원이 시스테인 잔기를 통해 독소에 결합된 백신 조성물.
제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트가 금속 염, 사포닌, 리피드 A 또는 이의 유도체, 알킬 글루코사미니드 포스페이트, 면역자극성 올리고누클레오티드 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 백신 조성물.
제 9항에 있어서, 사포닌이 리포좀, 면역자극복합체(Iscom) 또는 수중유 에멀션의 형태로 존재하는 백신 조성물.
제 9항 또는 제 10항에 있어서, 사포닌이 QS21인 백신 조성물.
제 9항, 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 리피드 A 유도체가 모노포스포릴 리피드 A, 3 데아실화된 모노포스포릴 리피드 A, OM 174, OM197, OM294로부터 선택되는 백신 조성물.
제 1항 내지 제 12항중의 어느 한 항에 있어서, 애쥬번트가 하기 군중 2개로부터 하나 이상의 대조물의 혼합물인 백신 조성물:

i) 사포닌,

ii) 톨 유사 수용체 4 아고니스트, 및

iii) 톨 유사 수용체 9 아고니스트.
제 13항에 있어서, 사포닌이 QS21이며, 톨 유사 수용체 4 아고니스트가 3 데아실화된 모노포스포릴 리피드 A이며, 톨 유사 수용체 9가 CpG 함유 면역자극 올리고누클레오티드인 백신 조성물.
제 1항 내지 제 14항중의 어느 한 항에 있어서, 항원이 세포내 병원균 또는 증식성 질환으로부터 선택된 질환의 군에 대한 면역성을 제공하는 항원의 군으로부터 선택된 백신 조성물.
의약에 사용되는 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물과 항원 및 애쥬번트를 포함하는 백신 조성물.
질환의 예방 또는 치료용 백신 제조를 위한 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물과 항원 및 애쥬번트의 용도.
제 17항에 있어서, 항원 특이적 CD8 반응을 증가시키기 위한 용도.
제 1항 내지 제 15항중의 어느 한 항에 따른 백신 조성물을 질환에 걸렸거나 질환에 민감한 환자에 투여하는 것을 포함하여, 질환을 치료하거나 예방하는 방법.
제 1항 내지 제 15항중의 어느 한 항에 따른 백신을 환자에 투여하는 것을 포함하여 항원 특이적 CD8 면역 반응을 증가시키는 방법.
제 1항 내지 제 15항중 어느 한 항에 따른 백신을 제조하는 방법으로서, 시가 독소의 B 서브유닛 또는 이의 면역학적 작용성 등가물과 혼합된 항원을 애쥬번트와 혼합시키는 방법.