WO2022197154A1 - 조직 공학용 자발 호흡성 바이오소재 - Google Patents

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WO2022197154A1
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alginate
ctp
oxygen
hydrogel
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이동윤
장선미
유채림
김지윤
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한양대학교 산학협력단
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    • A61F2250/0067—Means for introducing or releasing pharmaceutical products into the body

Definitions

  • the present invention relates to spontaneously respirable biomaterials for use in tissue engineering.
  • Blood which carries oxygen, accounts for 7-8% of body weight, and loss of more than 1/5 can be life-threatening. Loss of blood through various diseases such as arteriosclerosis, cerebral infarction, myocardial infarction, or vascular injury is life-threatening because of the lack of oxygen due to the loss of oxygen delivery power.
  • organs removed for organ transplantation also suffer from organ damage due to hypoxia and ischemia/reperfusion (I/R) damage.
  • I/R ischemia/reperfusion
  • a large amount of cell therapy must be injected into the body (rapid increase in marginal cell mass) as the survival rate is rapidly reduced due to lack of oxygen at the injected site.
  • carbon dioxide a by-product of cellular respiration, rapidly affects the pH change and affinity for oxygen inside and outside the cell, control of carbon dioxide in the microenvironment around the cell is also an important factor.
  • oxygen-releasing biomaterials ORB
  • oxygen-generating biomaterials OGB
  • Implantation of cell-based devices is usually hampered by inadequate oxygen delivery, with the inevitable delay of angiogenesis after implantation. Insufficient oxygen supply to the transplanted cells can lead to cell necrosis and cell death in some of the grafts, as well as a shift to anaerobic metabolism and energy conservation.
  • In situ oxygenation is a highly desirable approach as it eliminates the need for multiple surgeries and provides supplemental oxygen immediately after implantation. Although these approaches highlight the potential of in situ oxygenation to improve cell viability, most of them either increase the size of the implantation device or introduce toxic by-products, making implantation difficult.
  • One aspect is to provide a hydrogel composition comprising a chloroplast and a chloroplast transit peptide (Chloroplast Transit Peptide, CTP).
  • Another aspect is to provide a hydrogel composition
  • a hydrogel composition comprising a chloroplast, a chloroplast transit peptide (Chloroplast Transit Peptide, CTP) and alginate (alginate).
  • CTP chloroplast Transit Peptide
  • alginate alginate
  • Another aspect is to provide a hydrogel composition comprising chloroplast, chloroplast Transit Peptide (CTP), alginate and pancreatic cells.
  • CTP chloroplast Transit Peptide
  • Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, including the hydrogel composition.
  • Another aspect is to provide a microcapsule (Microcapsule) comprising the hydrogel composition.
  • Another aspect comprises the steps of combining alginate (Alginate) and chloroplast transit peptide (Chloroplast Transit Peptide, CTP); and
  • It is to provide a method for producing a hydrogel composition comprising a; mixing the combined alginate-CTP compound with the chloroplast separated from the individual to gel.
  • Another aspect comprises the steps of treating the hydrogel composition.
  • the present inventors have developed a spontaneous respiration material for tissue engineering capable of oxygen supply and carbon dioxide control and active oxygen control in order to improve the limitations of the prior art.
  • the present invention provides a hydrogel composition comprising chloroplast and chloroplast transit peptide (CTP).
  • CTP chloroplast transit peptide
  • the term "respiratoid” refers to a sustainable biological material of the present invention, and is a combination of 'Respirate' meaning 'breathe' and the suffix ' ⁇ oid' meaning artificiality. It is a new word created by combining
  • the resperatoid can rapidly regenerate carbon dioxide produced by cells/organs through cellular respiration back to oxygen, and its production rate makes it possible to make it faster when exposed to a specific wavelength, and also causes temporary hypoxia. In this case, active oxygen (superoxide anion, hydrogen peroxide, etc.) generated in cells or tissues can be regenerated into oxygen.
  • the resperatoid according to the present invention has very good biocompatibility and thus has little toxicity.
  • Resperatoid has 'superiority/differentiation' as summarized in the table below compared to existing oxygen-releasing materials (ORB) and oxygen-generating materials (OGB).
  • Oxygen-releasing biomaterials ORBs
  • Oxygen-generating biomaterials OGB
  • Respiratoid Yes Sodium percarbonate - Calcium peroxide - Magnesium peroxide Perfluorooctance Respiratoid (this proposal) external stimulus (pH, light, heat) Unnecessary Unnecessary not necessary / necessary by-product active oxygen doesn't exist doesn't exist O 2 supply several hours several hours to several days infinity CO 2 Removal doesn't exist doesn't exist infinity cytotoxicity has exist has exist doesn't exist doesn't exist
  • the hydrogel composition may be a respiratoid for tissue engineering, including chloroplast and CTP, a spontaneous respiration material. Therefore, when using the hydrogel composition, cells / organs can rapidly reproduce carbon dioxide produced through cellular respiration back to oxygen.
  • the hydrogel composition uses chloroplast in plant leaves, and alginate used for gelation may be obtained from plants such as seaweed leaves.
  • alginate used for gelation may be obtained from plants such as seaweed leaves.
  • the chloroplast transfer peptide with high selectivity is used for the outer membrane of the double layer of the chloroplast composed of fatty acids rather than the modification reaction of the chloroplast itself, the biocompatibility is very good, and the photoreaction and Calvin cycle of the chloroplast are used. It has little effect on the reaction, etc.
  • the hydrogel composition can control oxygen supply and carbon dioxide, it is highly likely to be widely used in tissue engineering fields such as blood cell therapy and organ transplantation. Specifically, it has very high originality and versatility, (1) the field of artificial blood development (2) the field of organ extraction and preservatives (3) the field of high-efficiency high-capacity culture of microorganisms/cells, and (4) the field of (stem) cell therapy and tissue engineering etc. can be used. In addition, it is possible to study cell-cell interactions in vivo in an environment mimicking a living body, so new functions of cells can be identified from a physiological point of view, and it can be applied as a new technology in the field of stem cell therapeutics research.
  • the hydrogel composition uses the thylakoid and the stromal Calvin cycle present in the chloroplast of a plant leaf that simultaneously controls oxygen and carbon dioxide, and for this purpose, the chloroplast It may include a chloroplast transit peptide (CTP) capable of binding or conjugating to. In one embodiment, the CTP may bind to a chloroplast outer membrane.
  • CTP chloroplast transit peptide
  • bonding includes chemical bonds and physical bonds.
  • the CTP may be physically conjugated or inserted into the chloroplast outer membrane, and the CTP may be bound to the chloroplast outer membrane through a covalent bond.
  • the CTP may be derived from a chloroplast membrane protein.
  • the CTP may include a partial sequence of a chloroplast membrane protein, and specifically, may include a partial sequence of a chloroplast outer membrane protein.
  • the CTP is chloroplast outer membrane protein 34 ((Outer envelope protein 34, OEP34) (or Translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts 34 (TOC34, Arabidopsis thaliana)) or outer membrane protein ((Outer) envelope protein 64, OEP64) (or Translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts 64 (TOC64, genus Arabidopsis thaliana))
  • the CTP is derived from OEP34/TOC34 or OEP64/TOC64 .
  • the CTP may include a part of the transmembrane domain sequence of the chloroplast outer membrane protein 34 or the outer membrane protein 64.
  • the CTP may be a peptide including a portion of one or more sequences selected from the amino acid sequences of the transmembrane domain shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • the CTP may be a peptide comprising at least one selected from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • the CTP may be a peptide comprising MFAFQYLLVM (SEQ ID NO: 1), which is a predicted sequence for the transmembrane site of OEP34 (or TOC34), a chloroplast outer membrane protein, LI PLMFAFQYLL VMKPLV (SEQ ID NO: 3) It may be a peptide sequence derived from
  • the CTP may be a peptide comprising VILGLGLAGI (SEQ ID NO: 2), which is a transmembrane site predicted sequence of OEP64 (or TOC64), a chloroplast outer membrane protein, SPSSQ IWVILGLGLA GIYVL (SEQ ID NO: 4) It may be a peptide sequence derived from
  • the CTP may be to increase oxygen generation of the chloroplast.
  • the hydrogel composition may further include alginate.
  • the hydrogel may be one in which the CTP end and the alginate end are combined to form a gel.
  • the hydrogel may be gelled by conjugation or bonding between the primary amine of CTP and the carboxyl group of alginate.
  • the alginate may be mixed with a calcium solution and gelled through cross-linking.
  • the hydrogel may further include pancreatic cells.
  • the pancreatic cells may be encapsulated in a chloroplast-CTP-alginate hydrogel.
  • the chloroplast-CTP-alginate hydrogel composition in which the pancreatic cells are encapsulated in the present invention can exhibit excellent cell viability and diabetes prevention or treatment effect according to self-respiration, and using this, hydrogel-based tissue engineering transplantation can be applied to the body.
  • the hydrogel composition may be to generate oxygen upon irradiation with light.
  • the light irradiation may be made at an oxygen concentration of 10 1 /ml to 10 10 /ml. In one embodiment, the light irradiation may be made at an oxygen concentration of 10 2 /ml to 10 8 /ml.
  • the light irradiation may be made at a temperature of 20 °C to 40 °C. In one embodiment, the light irradiation may be made at a temperature of 23 °C to 38 °C.
  • the light irradiation may be continuously performed for a predetermined time, or may be non-continuously and alternately performed by exposing to light for a predetermined time and not exposing to light at predetermined time intervals.
  • the light irradiation is continuously exposed to light for 10 to 50 minutes, and then not exposed to light for 10 to 50 minutes as one cycle, 1 to 5 times it may be done In one embodiment, the light irradiation is continuously exposed to light for 20 to 40 minutes, and then not exposed to light for 20 to 40 minutes as one cycle, and may be made 2 to 4 times. have.
  • the oxygen production rate of the hydrogel composition may increase upon exposure to a specific wavelength, and the wavelength may be 620 nm to 700 nm, 640 nm to 680 nm, or 650 nm to 670 nm.
  • the hydrogel composition can reproduce active oxygen generated when the surrounding cells or tissues are in a temporary hypoxia (hypoxia) state into oxygen.
  • the hydrogel may contain chloroplasts at a concentration of 10 1 /ml to 10 10 /ml.
  • the hydrogel is a chloroplast from 10 3 /ml to 10 10 /ml, 10 6 /ml to 10 10 /ml, 10 7 /ml to 10 9 /ml or 10 3 /ml to 10 9 /ml concentration may be included.
  • the hydrogel may include insulin secreted by the pancreatic cells.
  • the pancreatic cells included in the hydrogel composition of the present invention exist in a sealed state inside the hydrogel, and can stably secrete insulin.
  • the hydrogel composition may be for delivering oxygen to cells or tissues.
  • the oxygen delivery can be achieved by rapidly regenerating carbon dioxide produced through cellular respiration into oxygen, or by regenerating active oxygen generated in cells or tissues into oxygen in the case of temporary hypoxia. have.
  • Cell death can be alleviated by oxygen delivery by the hydrogel composition of the present invention, and the rate of oxygen generation can be controlled.
  • the present invention provides a microcapsule (Microcapsule) comprising the hydrogel composition.
  • the microcapsules can be used for cell therapy.
  • the microcapsule may be a microcapsule for generating oxygen when irradiated with light.
  • the microcapsule may be a microcapsule for preventing or treating a metabolic disease.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases, comprising the hydrogel composition.
  • prevention may refer to any action that suppresses or delays the onset of a disease of an individual by administration of a pharmaceutical composition according to an aspect.
  • treatment may refer to any action in which symptoms of a disease are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to an aspect.
  • active ingredient or “pharmaceutically effective amount” means any amount of a composition used in the practice of the invention provided herein sufficient to alleviate, inhibit the progression or prevent a disease, disorder or condition, or one or more symptoms thereof. can mean
  • the metabolic disease is from the group consisting of type 1 diabetes, type 2 diabetes, impaired glucose tolerance, impaired fasting blood glucose, dyslipidemia, lipid metabolism disorder, obesity, fatty liver, insulin resistance and glucose tolerance syndrome. It may be one or more selected. In one embodiment, the metabolic disease may be diabetes, type 1 diabetes or type 2 diabetes.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent may be one known in the art.
  • the carrier or diluent may be lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, gum acacia, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water (eg, saline and sterile water), syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, Ringer's solution, buffer, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, dextran, albumin , or any combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may further include a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending
  • the pharmaceutical composition may be prepared in a unit dose form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method known to those skilled in the art, or may be prepared by internalizing in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup, or emulsion in an oil or aqueous solvent, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally include a dispersant or stabilizer.
  • the aqueous solvent may include physiological saline or PBS.
  • the pharmaceutical composition according to one embodiment may be formulated in an oral or parenteral dosage form, preferably in a parenteral dosage form.
  • a sterile solution of the active ingredient is usually prepared, which may contain a buffer capable of appropriately adjusting the pH of the solution, and for intravenous administration is isotonic in the formulation.
  • Tonicity agents may be included to impart sex.
  • the dosage (effective amount) of the pharmaceutical composition is the dosage, such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathology, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity of the patient. It can be prescribed in various ways depending on factors, and those skilled in the art can appropriately adjust the dosage in consideration of these factors.
  • the number of administration may be once a day or twice or more within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites for the administration site, and total daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration may range from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after a titration period.
  • the same dose as that of humans per kg or, for example, the above dose is converted by the volume ratio (for example, the average value) of the target animal and the human organ (heart, etc.)
  • One dose can be administered.
  • Possible routes of administration may include parenteral (e.g., subcutaneous, intramuscular, intraarterial, intraperitoneal, intrathecal, or intravenous), topical (including transdermal), and injection, or insertion of an implantable device or substance. have.
  • Examples of the animal to be treated according to one embodiment include humans and other target mammals, specifically humans, monkeys, mice, rats, rabbits, sheep, cattle, dogs, horses, pigs, etc. Included.
  • the present invention provides a health functional food for preventing or improving metabolic disease comprising the hydrogel composition as an active ingredient.
  • hydrogel composition The hydrogel composition, metabolic disease and prevention are as described above.
  • improvement may refer to any action that suppresses or delays the onset of a metabolic disease of an individual by administration of the composition according to an aspect.
  • the health functional food defined in the present invention has sufficiently established the function and safety for the human body newly defined through the Health Functional Food Act amended in 2008, and the health function stipulated in the Food and Drug Administration Notice No. 2008-72 of the Food and Drug Administration. It may be a health functional food listed in the Regulations on Recognition of Food Functional Ingredients.
  • the composition of the present invention When the composition of the present invention is included in health functional food, the composition may be added as it is or used together with other health functional food or health functional food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be suitably determined according to the purpose of use.
  • the active ingredient constituting the composition according to the present invention may be included in an amount of 0.01 to 15% by weight, preferably 0.2 to 10% by weight of the total food weight, and when prepared as a beverage, 0.1 to 15% by weight based on 100 mL 30 g, preferably, may be contained in a ratio of 0.2 to 5 g, and the entire beverage may be composed of natural ingredients.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • the composition for health functional food according to the present invention may be formulated in the formulation of a conventional health functional food known in the art.
  • the health functional food may be prepared, for example, in powders, granules, tablets, pills, capsules, suspensions, emulsions, syrups, needles, liquids, extracts, gums, teas, jellies, or beverages, etc., preferably beverages. It can be formulated in the form of As the pharmaceutically acceptable carrier or additive, any carrier or additive known to be usable in the art for the preparation of the formulation to be prepared may be used. It may also include food used as feed for animals.
  • the health functional food may include nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, depending on the purpose or preference. , a carbonation agent used in carbonated beverages, and the like. In addition, it may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. In addition, the health functional food composition may additionally contain food additives, and the suitability as a "food additive" is determined according to the general rules and general test methods of the Food Additives Code approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. It can be judged according to the standards and standards applied to
  • the present invention comprises the steps of combining alginate (Alginate) and chloroplast transfer peptide (Chloroplast Transit Peptide, CTP); And it provides a method for producing a hydrogel composition comprising a; and mixing the combined alginate-CTP compound with the chloroplast separated from the individual to gel.
  • the manufacturing method may further include encapsulating pancreatic cells in the gelled hydrogel.
  • the present invention comprises the steps of treating the hydrogel composition; And it provides a method of delivering oxygen to cells or tissues, including; irradiating light to the treated hydrogel composition.
  • the light irradiation may be made at an oxygen concentration of 10 1 /ml to 10 10 /ml. In one embodiment, the light irradiation may be made at an oxygen concentration of 10 2 /ml to 10 8 /ml.
  • the step of irradiating the light may be made at a temperature of 20 °C to 40 °C. In one embodiment, the step of irradiating the light may be made at a temperature of 23 °C to 38 °C.
  • the step of irradiating light may be continuously performed for a predetermined time, or may be non-continuous and alternating by exposing to light for a predetermined time and not exposing to light at predetermined time intervals.
  • the step of irradiating light in the step of irradiating light, exposure to light continuously for 10 minutes to 50 minutes, and then not to be exposed to light for 10 minutes to 50 minutes as one cycle, 1 to 5 times It may be done over In one embodiment, the step of irradiating the light is continuously exposed to light for 20 to 40 minutes, and then not exposed to light for 20 to 40 minutes as one cycle, consisting of 2 to 4 times it could be
  • the oxygen generation rate according to the method may increase upon exposure to a specific wavelength, and the wavelength may be 620 nm to 700 nm, 640 nm to 680 nm, or 650 nm to 670 nm.
  • the present invention provides a method for preventing or treating metabolic diseases, including; administering the hydrogel composition to an individual.
  • the method may further include; irradiating light to the object.
  • the present invention also provides the use of said hydrogel composition.
  • the present invention provides the use of the hydrogel composition for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of metabolic diseases.
  • the present invention provides the use of microcapsules comprising the hydrogel composition.
  • the present invention provides the use of microcapsules comprising the hydrogel composition for use in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of metabolic diseases.
  • the hydrogel composition comprising chloroplast, chloroplast transit peptide (CTP) and alginate of the present invention can supply oxygen to cells or tissues and control carbon dioxide.
  • CTP chloroplast transit peptide
  • the hydrogel composition comprising chloroplast, chloroplast transit peptide (CTP), alginate, and pancreatic cells of the present invention is harmless to cells and individuals, and excellent prevention of diseases such as diabetes or may have a therapeutic effect.
  • CTP chloroplast transit peptide
  • FIG. 1 is a diagram of the action of sustainable autorespiration material in cells/organs.
  • This self-respiration material carbon dioxide produced through cellular respiration in cells can be regenerated back to oxygen by the photoreaction of chloroplast of the self-respiration material, and the oxygen production rate can be increased at a specific wavelength (660 nm).
  • reactive oxygen species generated during temporary hypoxia can be regenerated into oxygen through an enzymatic reaction by catalase (CAT) or superoxide dismutase (SOD) enzymes.
  • CAT catalase
  • SOD superoxide dismutase
  • Figure 2 is a diagram relating to the action of Alginate-CTP ancoring to the outer membrane of chloroplast.
  • the CTP sequence is Met-Phe-Ala-Phe-Gln-Tyr-Leu-Leu-Val-Met (1.26 kDa), which can be anchored to the outer chloroplast membrane to form Alginate-CTP-chloroplast.
  • FIG 3a is a diagram showing the Chloroplast-transit-peptide (CTP) sequence.
  • Figure 3b is a diagram showing the results of MS (mass spectrometry).
  • a Chloroplast-transit-peptide (CTP) peptide sequence that can be inserted into the Chloroplast outer membrane was established, and a 1.26 kDa MFAFQYLLVM (SEQ ID NO: 1) peptide with 97% purity was synthesized.
  • Figure 4 is a schematic diagram showing the chemical bonding reaction formula of the N-termius portion of the peptide and COOH of Alginate using the EDC / NHS method.
  • 20mM sodium alginate was dissolved in 10ml of 0.1M MES buffer of pH6, 2mM EDC and 5mM NHS were added and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • peptide dissolved in 1% DMSO was added in a molar ratio and reacted at room temperature for 2 hours. After dialysis, freeze-drying was performed to obtain a compound.
  • a carbodiimide coupling reaction was used, and an amide bond was formed between the caboxylate group of alginate and the primary amine of CTP to make a conjugate.
  • EDC/NHS was used.
  • Figure 5 is a schematic diagram relating to the Alginate-CTP compound 1H-NMR results.
  • the alginate:CTP binding molar ratio of all nine groups from 1:1 to 1:600 was about 4ppm, the peak of alginate, and the amine bond peak of the peptide at 2.7ppm, 2.9.
  • the n-acylurea peak of the peptide was confirmed at around ppm and 1.2 ppm.
  • 7a and 7b are the results of confirming the strength of the gel (100mM CaCl2) through the gelation of the Alginate-CTP compound and the rheometer.
  • Capsule gel formation conditions were optimized for the CTP-alginate conjugate using CaCl2 solution. 400ul of CaCl2 solution for each molar concentration was added, and 200ul of an alginate solution prepared at a concentration of 8mg/ml of CTP-alginate synthesized in various ratios in 0.9% NaCl was added and gelated for 30 minutes to confirm the capsule gel formation.
  • Figure 8a is a view showing the chloropalst separation (isolation) process.
  • Figure 8b is a view confirming the separated chloroplast with an optical microscope 200x magnification. After separation of 2*10 10 total chloroplast based on 35 g of spinach leaves in the same process as in the schematic diagram of FIG. 8a, optimized chloroplast separation conditions were established to obtain intact chloroplast with a shiny round border.
  • 10a and 10b are diagrams showing the results of confocal and TEM confirmation of the binding capacity of the two after CTP-FITC treatment on Chloroplast.
  • 1*10 8 /ml of chloroplast and 0.6mg/ml of CTP-FITC were treated with a confocal microscope for each hour (1, 5, 10, 30, 60 min). Analyzed by TEM.
  • FIG. 11 is a photograph confirming the remaining amount of chloroplast after forming a hydrogel and hydrogel formed with a CaCl2 solution after treating Alginate-CTP and chloroplast synthesized in various molar ratios and chlorophyll according to Alginate-CTP synthesis molar ratio It is a graph showing the encapsulation rate.
  • a gelation test was performed to confirm that there would be no effect on gelation even if CIB was used when anchoring Alginate-CTP and chloroplast as a preceding experiment. It was confirmed that this did not happen.
  • 11a is a photograph of capsule gel formed with CaCl2 solution after processing Alginate-CTP and chloroplast synthesized in various molar ratios of the prepared capsule gel (left) and the remaining amount of chloroplast after forming the capsule gel This is the confirmed result (right).
  • Alginate-CTP conjugate having a feed molar ratio of 1:1 to 1:50 was treated with 1*10 8 /ml of chloroplast and reacted for 5 minutes to prepare 200 ⁇ l of a solution, and then 400 ⁇ l of 100 mM CaCl2 solution was added, Alginate-CTP synthesized in various ratios in 0.9% NaCl was added to 200 ⁇ l of Alginate solution prepared at a concentration of 8 mg/ml, and gelation was performed for 30 minutes to form a hydrogel.
  • 11b is a result of confirming the amount of chloroplast bound in the hydrogel by measuring the total chlorophyll concentration.
  • Figure 12a is a photograph taken with an optical microscope after treatment of each chloroplast concentration in HEK293 cells
  • Figure 13a is a view showing the state of exposing the light (660 nm) that increases the photosynthetic efficiency of chloroplast to the chloroplast solution at a distance of 5 cm from the ground.
  • 13b is a graph comparing the amount of oxygen produced according to the concentration of chloroplast according to the presence or absence of light in a normal oxygen state.
  • FIG. 14 is an Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel (ACC) photograph according to the chloroplast concentration (14a) and a graph comparing the oxygen production according to the chloroplast concentration in the ACC according to the presence or absence of light in normoxic conditions (14b).
  • ACC Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel
  • FIG. 15a is a view showing Alginate-CTP-Chloroplast (ACC) and Alginate-Chloroplast hydrogel (AC) prepared by each concentration of Chloroplast.
  • Figure 15b is a graph showing the results of the rheology test to confirm the long-term strength of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel according to the presence or absence of CTP. There was no difference between groups on day 0, but higher storage modulus values were measured on day 7 in hydrogels with CTP. On day 30, the storage modulus values of all groups were measured close to zero. Therefore, although the exact mechanism has not yet been elucidated, it was confirmed that the hydrogel with CTP showed better physical strength (physical properties).
  • 16 is a graph showing the results of measuring the oxygen production amount of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel for each chloroplast concentration according to the normalized oxygen state and the hypoxic state.
  • 17 is a graph showing the results of measuring oxygen production of free chloroplast, Alginate-chloroplast (AC) hydrogel, and Alginate-CTP-Chloroplast (ACC) hydrogel when exposed to light under hypoxic conditions.
  • 18 is a graph showing the results of performing the ABTS assay to confirm the reason for the decrease in oxygen production in the high concentration chloroplast group.
  • 19 is a graph showing the results of cell viability assay (CCK-8 assay) for each concentration of Alginate-CTP solution for INS-1 cells (single cell) and Live & Dead assay results.
  • Figure 19b is a view confirming the Live & Dead assay through a fluorescence micrograph (200X, green fluorescence-live cells, red fluorescence-dead cells) qualitatively showing the viability of INS-1 cells according to the concentration of the Alginate-CTP solution. to be.
  • 20 is a graph showing the results of cell viability assay (CCK-8 assay) for each concentration of Alginate-CTP hydrogel for pancreatic cells (cell population) and Live & Dead assay results.
  • 20A is an optical micrograph (40X) of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel according to chloroplast concentration.
  • 21 is a graph showing the results of a cell viability assay (CCK-8 assay) of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Chloroplast by concentration and a photograph of Live & Dead assay results.
  • 21A is an optical micrograph (40X) of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel according to chloroplast concentration.
  • 21c is a fluorescence micrograph qualitatively showing the viability of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel by chloroplast concentration (200X, green fluorescence-living cells, red fluorescence-dead cells).
  • 200X green fluorescence-living cells, red fluorescence-dead cells.
  • 22 is a graph showing the results of measuring the oxygen concentration of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel encapsulated with pancreatic cells and treated with Chloroplast for each concentration for 30 hours.
  • Figure 22b is a graph (based on 24 hours) of measuring the oxygen production amount of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel for each concentration of chloroplast encapsulated with pancreatic cells.
  • FIG. 23 is a graph of the insulin secretion ability of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Chloroplast by concentration (GSIS assay) and the glucose response index of the pancreatic cells shown based on this graph.
  • GSIS assay concentration-specific assay
  • FIG. 24 is a diagram illustrating an apparatus capable of inducing a hypoxic environment for accurately measuring an oxygen production amount.
  • the oxygen concentration was measured in real time by putting an Oxygen Plate Reader (SDR SensorDish® Reader, PreSens) in the hypoxia chamber. ), and to prevent the inflow of external oxygen, the Hypoxia Chamber sealed parafilm was used to block the inflow.
  • a hypoxia environment of 1% O 2 was realized by injecting mixed gas (1% O 2 + 5% CO 2 + 94% N 2 ) at a rate of 40L/min into the Hypoxia Chamber in which the ambient conditions were implemented.
  • 25 is a graph showing the measurement result of oxygen production of chloroplast (10 6 /ml, 10 7 /ml, 10 8 /ml) according to the presence or absence of light (660nm) conditions.
  • chloroplast 10 6 /ml, 10 7 /ml, 10 8 /ml
  • fresh isolated chloroplast diluted in Media RPMI +1% PS, 10% FBS
  • the Chloroplast solution was made into a low-oxygen environment (60 mmHg or less), and the oxygen concentration of the Chloroplast Solution was continuously measured for 20 hours by putting an Oxygen Plate Reader in the Hypoxia chamber.
  • chloroplast (Light) exposed to light for 20 hours and Chloroplast (No Light) without exposure were divided into groups.
  • 26 is a schematic diagram of a temperature-controlled desiccator capable of inducing a hypoxic environment to compensate for the shortcomings of the hypoxia chamber of FIG. 24 .
  • 26A is a diagram of a device for inducing a hypoxic environment using a temperature-controlled desiccator.
  • 26B is a view showing the result of confirming the low-oxygen environment inducing device and the low-oxygen environment using a temperature-controlled desiccator.
  • Oxygen plate reader SDR SensorDish® Reader, PreSens
  • a low-oxygen environment of 1% O 2 was realized by injecting mixed gas (1% O 2 + 5% CO 2 + 94% N 2 ) at a rate of 40L/min into the temperature-controlled desiccator that realized the ambient environmental conditions, and Oxygen You can check the environment in real time by using the Detector. As a result of comparing FIG. 24 and FIG. 26, it was confirmed that when the Desiccator was used, the ability to block the inflow of external air was excellent.
  • FIG. 27 is a diagram showing an oxygen concentration measurement graph and AUC (Area under the ROC Curve.) measurement results when chloroplast is cultured for a long time (20 hours) in a hypoxic environment (Desiccator). After inducing a hypoxic environment using the temperature-controlled desiccator implemented in FIG. 26, fresh isolated chloroplast diluted in media (RPMI +1% PS, 10% FBS) was prepared for each concentration of 10 8 pieces/ml, chloroplast After making the solution in a hypoxic state (1% O 2 ), the oxygen concentration of the Chloroplast Solution was continuously measured for 20 hours using an Oxygen Plate Reader.
  • AUC Ana under the ROC Curve.
  • FIG. 28 is a schematic diagram comparing the Hypoxia Chamber (A) and the Desiccator (B). If the inflow of external oxygen is prevented using the Hypoxia Chamber sealed parafilm of FIG. However, to create a hypoxic environment, 40L of Mixed gas (1% O 2 + 5% CO 2 + 94% N 2 ) must all be used, it takes a long time, and does not use two or more Oxygen Plate Readers. It can be applied as a disadvantage that it cannot be inserted, and that the hypoxic environment must be judged by the oxygen concentration of the solution rather than the environment in the hypoxia chamber because the Oxygen Detector cannot be inserted. Since the temperature-controlled desiccator of FIG.
  • FIG. 29 is a graph of oxygen concentration measurement in a low-oxygen environment of Chloroplast according to temperature conditions.
  • fresh isolated chloroplast diluted in media RPMI +1% PS, 10% FBS
  • Chloroplast solution After making a hypoxic environment (1% O 2 ), continuously measure the oxygen concentration of the Chloroplast Solution for 20 hours using an Oxygen Plate Reader.
  • dilute chloroplast in media RPMI +1% PS, 10% FBS
  • FIG. 30 is a graph of oxygen concentration measurement in a low oxygen environment of Chloroplast according to light (660 nm) conditions. Each group was divided according to the intensity of light (660 nm) (FIG. 30A), exposure time to light (FIGS. 30B and 30C), and duration of exposure to light (FIGS. 30D and 30E), and experiments were conducted. After inducing a hypoxic environment using the temperature-controlled desiccator implemented in FIG.
  • 31 is a view showing an optical micrograph of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel encapsulated with pancreatic cells.
  • 31A is a diagram illustrating classification of each group.
  • FIG. 31b is a view showing optical micrographs of Chloroplast-CTP(MFAFQYLLVM)-Alginate hydrogel encapsulated with pancreatic cells (40X, 400X).
  • 31c is a view confirming the Chloroplast-CTP(MFAFQYLLVM)-Alginate hydrogel encapsulated with pancreatic cells cultured in a hypoxic environment under an optical microscope (40X, 400X).
  • a hypoxic environment 1% O 2
  • a temperature-controlled desiccator was made by using a temperature-controlled desiccator, and after culturing for 24 hours, using an optical microscope to check the degradation of pancreatic cells in each group. Confirmed. As a result, it was confirmed that the form of pancreatic cells was well maintained in each group.
  • 20 ⁇ l of CCK solution (10%) was dispensed and absorbance (OD450nm) was measured 2 hours later, and then each using Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kits.
  • the cell viability of the pancreatic cells due to the prolonged exposure to the hypoxic environment in the pancreatic cells in the hypoxic environment showed that the viability of the pancreatic cells was in the IN group except for the IH group. It can be seen that there is no significant decrease when compared to The IH group could confirm that the viability of pancreatic cells decreased by about 18% due to exposure to a hypoxic environment for 24 hours, which means that the hypoxic environment is not suitable for culturing pancreatic cells.
  • Alginate-CTP-Chloroplast (groups 4 and 6) showed a decrease in cell viability compared to the IN group, but it was confirmed that this was not a significant result.
  • GSIS Static Glucose-stimulated Insulin Secretion
  • the amount of insulin in each group was measured, and then the absorbance value was corrected through the amount of DNA for each experimental group using Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kits. It can be confirmed that the insulin secretory ability of pancreatic cells does not decrease significantly when compared to the IN group except for the IH group. In the IH group, it was confirmed that the insulin secretory ability of the pancreatic cells was decreased due to exposure to the hypoxic environment for 24 hours. Since the Alginate-CTP-Chloroplast group shows the glucose response index (SI) of pancreatic cells similar to that of the IN group, this indicates that the Alginate-CTP-Chloroplast group (groups 4 and 6) secreted insulin despite exposure to a hypoxic environment. means it has not decreased. In addition, in hypoxic environment, groups 0, 4, and 6 showed significantly higher insulin secretion compared to IH group. This means that it can have suitable conditions for culturing in a hypoxic environment.
  • SI glucose response index
  • FIG. 34 is a diagram showing the results of evaluation of the physical properties of Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules (Microcapsule).
  • the conditions for the formation of microcapsules formed with Alginate-CTP-Chloroplast conjugate using the encapsulator were optimized.
  • the gelation ability of microcapsules of 1) Alginate, 2) Alginate-Chloroplast 3) Alginate-CTP-Chloroplast of each group was confirmed, and the final concentration was 1.5% w/v alginate diluted in CIB and Alginate solution.
  • Chloroplast (2.5x10 9 pieces/ml) was mixed 1:1 to prepare microcapsules using an encapsulator, and then 300 ⁇ l of 100 mM CaCl2 solution was added to react, and the gelation ability of each group was evaluated. As a result, it was confirmed that microcapsules were well formed in all groups.
  • 35 is a view showing the evaluation result of the degradation (degradation) of Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules (Microcapsule).
  • pancreatic cells islets extracted from experimental animals (Rat) were encapsulated in microcapsules.
  • CCK solution 10% was dispensed and absorbance (OD450nm) was measured after 2 hours. After that, the absorbance value was corrected through the amount of DNA for each experimental group using Quant-iTTM PicoGreenTM dsDNA Assay Kits. Due to prolonged exposure to hypoxic environment in pancreatic cells in hypoxic environment, the cell viability of pancreatic cells was significantly reduced to about 22% compared to pancreatic cells in normoxic environment.
  • the green signal was stronger in the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule group compared to other groups in the hypoxic environment, and the yellow signal was the weakest as a result of combining Green and Red.
  • the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule is an environment suitable for the survival of pancreatic cells, as in the CCK-8 Assay result of FIG. 39 .
  • CTP Chloroplast-transit-peptide
  • VILGLGLAGI Chloroplast-transit-peptide
  • V- Chloroplast outer membrane
  • 43(A) is a confocal microscope and optical microscope image of CTP(V-)-FITC (green fluorescence) binding to a chloroplast (red fluorescence) surface.
  • 43 (B) is an image confirming the presence of the FITC-VILGLGLAGI peptide physically bound to the chloroplast surface under an optical microscope.
  • CTP(V-) and CTP(V-)-FITC with chloroplast were treated and analyzed with a confocal microscope and an optical microscope over time (1, 5, 10, 30, 60 min).
  • Figure 44 is a schematic diagram showing the chemical bonding reaction formula of the N-terminus portion of COOH and CTP (V-) of Alginate using the EDC / NHS method.
  • a carbodiimide coupling reaction was used, and an amide bond was formed with the caboxylate (-COOH) group of alginate and the primary amine of CTP (V-) to make a conjugate.
  • EDC/NHS was used.
  • CTP(V-)-alginate each concentration of sodium alginate (0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1mg/ml) was dissolved in 10ml of 0.1M MES buffer of pH6, followed by 2mM EDC and 5mM NHS was added and reacted at room temperature for 15 minutes. After titration to pH7, 10 mg/ml peptide dissolved in 1% DMSO was added, followed by reaction at room temperature for 2 hours. After dialysis, freeze-drying was performed to obtain a compound.
  • 46 is a view showing FT-IR results for confirming the synthesis results according to the concentration of the Alginate-Chloroplast-transit-peptide (CTP(V-), LDY004) conjugate.
  • Alginate (-COOH) and CTP (-NH 2 ) were conjugated in the following way to obtain a compound.
  • Peptide dissolved in 1% DMSO (10mg/ml, peptide synthesized by requesting peptide synthesis company peptron) corresponds to molar ratio (1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50)
  • the amount was added to the solution.
  • the reaction was carried out at RT for 2 hours.
  • Dialysis was performed for 3 days using a 6,000 to 8,000 MWCO (molecular weight cut-off) dialysis membrane. After freezing in a deep freezer, it was freeze-dried to obtain an Alginate-CTP compound in powder form (see FIG. 4 ).
  • the amount of CTP (protein) in the alginate-CTP compound was quantified by the following method.
  • the strength of the hydrogel formed by the molar ratio of the Alginate-CTP composite was confirmed by the following method.
  • capsule gel was not formed at an Alginate-CTP synthesis molar ratio of 1:280 or more (see FIG. 7a ). This means that too much peptide prevents gel formation by calcium. In all groups, the higher the molar concentration of the calcium solution, the better the gel (gel) was formed and showed a hard appearance.
  • Chloroplast was isolated from spinach by the following method (see FIG. 8).
  • the pellet was resuspended in 2ml of 1x CIB buffer with BSA and pipetted. 40%, 80% percoll solutions were prepared, and 3ml 80% percoll, 3ml 40% percoll, 6ml chloroplast suspension were carefully placed in a 15ml conical tube in this order. Centrifugation was performed at 4000 RPM for 10 minutes. Only the solution between the 80%/40% percoll layers containing intact chloroplast was carefully picked and transferred to another conical tube. After that, the obtained pellet was mixed with 10ml of 1x CIB buffer without BSA, wrapped in foil, and refrigerated.
  • 0% and 1% DMSO was prepared, diluted in 1*10 8 pieces/ml chloroplast in 1ml of CIB solution, and treated for 0, 5, 10, 30, 60 minutes. For each time period, 10 ⁇ l of the solution was collected and the number of chloroplast was counted using a hemocytometer.
  • Chlorophyll was measured to quantify Chloroplast in the following way.
  • Alginate (control), Alginate-CTP (1:50) is prepared, and 100mM CaCl2 solution as a positive control to check the existing gelation function and Ca 2+ , Mg 2+ -free PBS as a negative control, gelation will not occur
  • the expected experimental group, CIB was prepared.
  • Alginate or Alginate-CTP 4mg, NaCl 4.5mg, and 500 ⁇ l of tertiary distilled water were mixed well. In a 48 well plate, 250 ⁇ l of the solution of step 3 was reacted with CIB for 30 minutes. By measuring rheology through a rheometer, the strength of the gel (whether it has the characteristics of a gel) was confirmed.
  • Chloroplast isolated on the same day from spinach was prepared at a concentration of 1*10 8 pieces/ml. After mixing 250 ⁇ l of the solution of step 2 and 250 ⁇ l of the solution of step 3 in a 48 well plate, it was reacted with 100 mM CaCl 2 for 30 minutes. The strength of the hydrogel (whether it has the properties of a hydrogel) was confirmed by measuring the rheology through a rheometer.
  • chloroplast in the hydrogel was quantified using the remaining solution.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared as in the method of 9.2, and all solutions except for the hydrogel were recovered and centrifuged at 13,500 RPM for 1 minute. Pellet was dissolved after suspension (vortexing & stay 3 times) in 250 ⁇ l of 80% acetone. After measuring absorbance at 663 nm and 645 nm using Nanodropdrop, the amount of total chlorophyll ( ⁇ g/ml) was calculated according to Arnon's equation below.
  • Chloroplast contained in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was quantified by the following method.
  • EDTA was added to PBS at 5 mg/ml, and the pH was raised to 7.
  • Alginate lyase was added to the EDTA solution, and Vortexing & stay was repeated 3 times. After the hydrogel was released, centrifugation was performed at 13500 RPM for 1 minute, and the pellet was suspended in 250 ⁇ l of 80% acetone. After that, Vortexing & stay was repeated 3 times to dissolution, and absorbance was measured at 663 nm and 645 nm using a Nanodrop drop. The amount of total chlorophyll ( ⁇ g/ml) was calculated by substituting the measured absorbance into the following Arnon's equation.
  • Chlorophyll b ( ⁇ g/ml) 22.9 (A 645 ) - 4.68 (A 663 )
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared according to the method of Example 9. After that, the strength of the hydrogel was confirmed by performing a rheology test through a rheometer to see if the hydrogel was loosened for 4 weeks.
  • CCK-8 assay was performed using HEK 293 cells, a general cell line, and the results were confirmed.
  • DMEM media
  • the amount of oxygen produced by chloroplast was confirmed in the presence or absence of light by the following method.
  • the oxygen production amount of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was confirmed in the presence or absence of light by the following method.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was made by adding chloroplast according to the group in a 96 well plate.
  • the amount of oxygen produced by chloroplast in the presence or absence of light was measured using an oxygen sensor.
  • the oxygen sensor used OxyLite (Oxford Optronix, U.K.).
  • the distance between the material and the light was set to 5 cm.
  • Oxygen production was measured in units of 0, 30, 60, and 120 min using an oxygen sensor (reading time: 3 min).
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was made by adding chloroplast according to the group in a 96 well plate.
  • the 96 well plate was implemented in normoxic and hypoxic conditions under the following conditions.
  • a 1% oxygen environment is achieved by injecting a mixed gas (94% N 2 + 5% CO 2 + 1% O 2 ) into the hypoxia chamber laboratory apparatus.
  • the amount of oxygen produced by chloroplast upon exposure to light under normal and hypoxic conditions was measured using an oxygen sensor.
  • the oxygen sensor used OxyLite (Oxford Optronix, U.K.). The distance between the material and the light was set to 5 cm, and the oxygen production amount was measured in units of 0, 30, 60, and 120 min using the oxygen sensor (reading time: 3 min).
  • the oxygen production amount of each experimental group was confirmed by exposure to light under normoxic and hypoxic conditions by the following method.
  • Free chloroplast, Alginate-Chloroplast hydrogel, and Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel were made by adding chloroplast to a 96-well plate according to the concentration. 96-well plates made for each experimental group were implemented under normoxic and hypoxic conditions as follows.
  • 1% oxygen environment is realized by injecting mixed gas (94% N 2 +5% CO 2 + 1% O 2 ) into the hypoxia chamber laboratory apparatus
  • Oxygen production of chloroplast according to light exposure under normal and hypoxic conditions was measured using an oxygen sensor.
  • the oxygen sensor used OxyLite (Oxford Optronix, U.K.).
  • the distance between the material and light was set to 5 cm, and oxygen production was measured for 6 days using an oxygen sensor (24 hour intervals). On the 5th day of measurement, the oxygen production amount was measured by changing to a normal oxygen environment.
  • the free chloroplast group maintained oxygen concentrations higher than the severe hypoxemia level of 40 mmHg (69.5 ⁇ M/L) for 5 days.
  • the severe hypoxemia level 40 mmHg (69.5 ⁇ M/L) for 5 days.
  • a low level of oxygen concentration was measured in the control group and the high concentration (10 8 /ml).
  • the high concentration group did not recover the oxygen concentration under normal oxygen on the 5th day of measurement (see FIG. 17a ).
  • Oxygen concentrations of all concentration groups in the AC group were measured to be 0 ⁇ M/L within 48 hours.
  • the ACC group showed a pattern of oxygen production similar to that of free chloroplast.
  • the ACC group maintained an oxygen concentration above 40 mmHg (69.5 ⁇ M/L), which is a severe hypoxemia level.
  • the ACC group showed an oxygen production pattern similar to that of free chloroplast, and in particular, it was confirmed that oxygen was better produced at concentrations of 10 2 /ml, 10 4 /ml, and 10 6 /ml (see Fig. 17c). ).
  • Free chloroplast, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was made by adding chloroplast according to the concentration in a 96-well plate.
  • media RPMI
  • Insulin-secreting pancreatic cells were isolated from the pancreas of rats by the following method.
  • Materials include (1) SD rats (6-7 weeks old, male), (2) surgical instruments (mirco-scissors, forceps, etc.), (3) Collagenase 1mg/ml (diluted with pH 7.8 HBSS buffer) and (4) ) A 10 ml syringe was used.
  • Rat was euthanized by injecting 100% CO2 gas for 5-10 minutes, and it was confirmed that breathing was stopped or the heartbeat was stopped.
  • the integument and endothelium of the abdomen were removed, the liver was lifted to find the pancreas, and the duct (vessel) connected to the liver was found while unfolding the pancreas with forceps.
  • collagenase which can remove the extracellular matrix (ECM) by gently scraping it with scissors so as not to break, was injected through the duct with a syringe of 10 ml per animal.
  • the swollen pancreas was isolated from the intestine, liver, stomach, and spleen using surgical instruments.
  • Pancreas was subjected to physical and chemical purification to obtain high-purity pancreatic cells, and various debris or impurities other than pancreatic cells were removed through an optical microscope. Incubation was performed for 24 hours for recovery and stabilization of pancreatic cells.
  • pancreatic cells were encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel as follows.
  • pancreatic cells stabilized for 24 hours were washed twice with media (RPMI).
  • a chloroplast solution separated on the same day from spinach was prepared at a concentration of 4*10 6 pieces/ml.
  • media RPMI +10% FBS
  • Alginate-CTP compound made at a concentration of 0, 8, 16 mg/ml was prepared, the solution was mixed, and the solution was put into a 100 mM CaCl 2 solution and reacted for 30 minutes.
  • Each of the prepared Alginate-CTP-Chloroplast hydrogels was put into each well of a 96 well plate (RPMI +10% FBS+1% PS, 200 ⁇ l) and incubated for 24 hours.
  • pancreatic cells were encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel.
  • Pancreatic cells stabilized for 24 hours were washed twice with media (RPMI). Chloroplast isolated on the same day from spinach was prepared at a concentration of 4*10 6 pieces/ml. For cell experiments, media (RPMI +10% FBS) was used to dilute chloroplast. Twenty pancreatic cells (20IEQ) were mixed well with 250 ⁇ l of the isolated chloroplast solution. An Alginate-CTP compound prepared at a concentration of 8 mg/ml was prepared. For cell experiments, media (RPMI +10% FBS) was used when dissolving Alginate-CTP. The above solution and the Alginate-CTP compound were mixed and put into a 100 mM CaCl 2 solution and reacted for 30 minutes. Each of the prepared Alginate-CTP-Chloroplast hydrogels was put into each well of a 96 well plate (RPMI +10% FBS +1% PS, 200 ⁇ l) and incubated for 24 hours.
  • media RPMI +10% FBS +1% PS, 200 ⁇ l
  • Pancreatic cells were encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel in a hypoxic environment as follows.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Pancreatic cells isolated from experimental animals were washed twice with media (RPMI). Chloroplast isolated on the same day from spinach was prepared by concentration. For cell experiments, media (RPMI +10% FBS) was used to dilute chloroplast. Twenty pancreatic cells (20IEQ) were mixed well with 250 ⁇ l of the solution of step 2. An Alginate-CTP compound prepared at a concentration of 8 mg/ml was prepared. For cell experiments, media (RPMI +10% FBS) was used when dissolving Alginate-CTP. The above solutions were mixed and put into a 100 mM CaCl 2 solution and reacted for 30 minutes.
  • One Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel for each concentration was put into each well of a 6 well plate (RPMI +10% FBS +1% PS, 1ml).
  • the groups (1), (2), (3), (4) are also placed in each well (RPMI +10% FBS +1% PS, 200 ⁇ l) of a 6 well plate, and the 6 well plate is subjected to normal oxygenation as follows. and hypoxic state, and incubated for 24 hours.
  • Example 17 Evaluation of toxicity of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Alginate-CTP compound by concentration was confirmed by the following method.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with Alginate-CTP. All hydrogels were washed twice with PBS and treated with 100 ⁇ l of media (RPMI) + 10 ⁇ l of CCK solution. After incubation wrapped in foil for 2 hours, absorbance was measured at 450 nm using a reader.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Alginate-CTP compound by concentration was confirmed by the following method.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with Alginate-CTP. All hydrogels were washed with PBS twice, and 100 ⁇ l of reagents made of 1 ⁇ M Calcein-AM and 1 ⁇ M Ethidium homodimer-1 (EthD-1) were treated in each well, and incubation was performed for 30 minutes. After checking live cells (green fluorescence) and dead cells (red fluorescence) using a fluorescence microscope, pictures were taken.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Chloroplast by concentration was confirmed.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with chloroplast. All hydrogels were washed twice with PBS and treated with 100 ⁇ l of media (RPMI) + 10 ⁇ l of CCK solution. After incubation wrapped in foil for 2 hours, absorbance was measured at 450 nm using a reader.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Chloroplast by concentration was confirmed.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with chloroplast. All hydrogels were washed twice with PBS, and 100 ⁇ l of a reagent made of 1 ⁇ M Calcein-AM and 1 ⁇ M Ethidium homodimer-1 (EthD-1) was treated in each well. After incubation for 30 minutes, live cells (green fluorescence) and dead cells (red fluorescence) were checked using a fluorescence microscope, and then pictures were taken.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with chloroplast according to concentration in a hypoxic environment as follows.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared for each group by encapsulating pancreatic cells and pancreatic cells incubated for 24 hours in normoxic and hypoxic environments and treated with chloroplast by concentration. All groups were washed twice with PBS, treated with media (RPMI) 100 ⁇ l + CCK solution 10 ⁇ l, wrapped in foil for 2 hours, incubated, and absorbance was measured at 450nm using a reader, and then Quant-iTTM PicoGreenTM The absorbance value was corrected through the amount of DNA for each experimental group using dsDNA Assay Kits.
  • pancreatic cells does not significantly decrease compared to the IN group except for the IH group due to exposure to the hypoxic environment for a long time in the pancreatic cells in the hypoxic environment. have.
  • the IH group could confirm that the viability of pancreatic cells decreased by about 18% due to exposure to a hypoxic environment for 24 hours, which means that the hypoxic environment is not suitable for culturing pancreatic cells.
  • Alginate-CTP-Chloroplast (groups 4 and 6) showed a decrease in cell viability compared to the IN group, but it was confirmed that this was not a significant result. This means that it is not toxic to cells.
  • Example 18 Oxygen production measurement of Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel encapsulated with pancreatic cells and treated with Chloroplast by concentration
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells and treating each concentration with chloroplast.
  • Oxygen plate reader Add one hydrogel of step 1 to each well of the well plate (24well) and incubate for 30 hours, using an oxygen sensor to measure the amount of oxygen production in units of 0, 6, 12, 18, 24, 30 hours. measured.
  • SDR SensorDish PreSens, Germany
  • the Oxygen plate reader well plate (24well) was a well plate dedicated to SDR SensorDish.
  • Insulin secretion function of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with Chloroplast according to concentration was confirmed as follows.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with chloroplast. All hydrogels were washed twice with PBS, 200 ⁇ l of low glucose (2.8 mM) was dispensed into each well, and incubated for 30 minutes. 200 ⁇ l of low glucose (2.8 mM) was again dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the low glucose solution present was recovered. Then, 200 ⁇ l of high glucose (20.2 mM) was dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the high glucose solution present was recovered. The amount of insulin secretion was measured and calculated based on the low glucose and high glucose solution recovered using the insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay.
  • ELISA insulin enzyme-linked immunosorbent
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel showed insulin secretion at a level similar to that of the control (intact islet) regardless of the concentration of chloroplast (see FIG. 23 ).
  • the above results indicate that Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel maintains the insulin-secreting ability of the encapsulated pancreatic cells and does not affect the function of the cells.
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared by encapsulating pancreatic cells incubated in a 96-well plate for 24 hours and treating each concentration with chloroplast. All hydrogels were washed twice with PBS, 200 ⁇ l of 0.1M EDTA (pH7.8) solution was dispensed into each well, and the hydrogel was crushed through sufficient pipetting. At this time, it was carried out to take out the pancreatic cells present in the hydrogel. Each of the solutions was recovered in a 1.5ml tube and centrifuged at 1800RPM for 2 minutes. After removing the supernatant, the pellet (pancreatic cells) was treated with 1 ml of RIPA buffer. Through dsDNA assay, the amount of insulin secreted by pancreatic cells present in each well (Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel) was corrected.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with chloroplast by concentration in a hypoxic environment was confirmed.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared for each group by encapsulating pancreatic cells and pancreatic cells incubated for 24 hours in normoxic and hypoxic environments and treated with chloroplast by concentration. All groups were washed twice with PBS, and 200 ⁇ l of low glucose (2.8 mM) was dispensed into each well and incubated for 30 minutes. 200 ⁇ l of low glucose (2.8 mM) was again dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the low glucose solution present was recovered. 200 ⁇ l of high glucose (20.2 mM) was dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the high glucose solution present was recovered. The amount of insulin was measured and calculated based on the low glucose and high glucose solution recovered using the insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay.
  • ELISA insulin enzyme-linked immunosorbent
  • the insulin secretory ability of the pancreatic cells does not significantly decrease when compared to the IN group except for the IH group.
  • the insulin secretory ability of the pancreatic cells was decreased due to exposure to the hypoxic environment for 24 hours.
  • the Alginate-CTP-Chloroplast group shows the glucose response index (SI) of pancreatic cells similar to that of the IN group, this indicates that the Alginate-CTP-Chloroplast group (groups 4 and 6) has insulin secretion ability despite exposure to a hypoxic environment. This means that it has not decreased.
  • groups 0, 4, and 6 showed significantly higher insulin secretion compared to IH group. This means that it can have suitable conditions for culturing in a hypoxic environment.
  • pancreatic cells As follows, the amount of insulin secreted from pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel treated with chloroplast by concentration in a hypoxic environment was corrected to the size of pancreatic cells.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel was prepared for each group by encapsulating pancreatic cells and pancreatic cells incubated for 24 hours in normoxic and hypoxic environments and treated with chloroplast by concentration. All groups were washed twice with PBS, 200 ⁇ l of 0.1M EDTA (pH7.8) solution was dispensed into each well, and cells and hydrogels were broken through sufficient pipetting. (This was carried out to take out the pancreatic cells present in the hydrogel.) The solution was collected in 1.5ml tubes, centrifuged at 1800RPM for 2 minutes, the supernatant was removed, and the pellet (pancreatic cells) was treated with 1ml of RIPA buffer. The amount of insulin secreted by pancreatic cells present in each well (Alginate-CTP-Chloroplast) was corrected through dsDNA assay.
  • Example 20 Measurement of oxygen production of chloroplast by concentration under light (660 nm) conditions
  • 1% oxygen environment is realized by injecting a mixed gas (94% N 2 +5% CO 2 + 1% O 2 ) into the hypoxia chamber experimental apparatus (see FIG. 24 )
  • the distance between the material and the light was set to 5 cm. This applies only to the light-exposed group, and the non-light-exposed group proceeded without light. Thereafter, the amount of oxygen produced by chloroplast in the presence or absence of light was measured using an oxygen sensor (reading time: 30min). At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • the initial oxygen concentration of Chloroplast in a state in which a hypoxic environment is implemented is different depending on the concentration of Chloroplast for each group, which means that the amount of oxygen generated at the concentration of Chloroplast is different (see FIG. 26a ).
  • the effect of light was confirmed that the oxygen concentration was significantly increased in the group exposed to light for 20 hours compared to the group not exposed to light in 10 8 cells/ml of Chloroplast (Fig. 25b). and 25c).
  • the distance between the material and the light was set to 5 cm. At this time, only the light-exposed group, and the non-light-exposed group proceeded without light.
  • Oxygen production of chloroplast in the presence or absence of light was measured using an oxygen sensor for 20 hours. (reading time: 30min) At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • Example 21 Measurement of oxygen production in chloroplast in a low-oxygen environment
  • the oxygen production amount of chloroplast according to the temperature in a low oxygen environment was confirmed as follows.
  • Chloroplast * The concentration of Chloroplast is fixed at 1 * 10 8 pieces/ml.
  • 1% oxygen environment is realized by injecting mixed gas (94% N 2 +5% CO 2 + 1% O 2 ) into the temperature-controlled desiccator
  • the oxygen production amount of chloroplast according to temperature was measured using an oxygen sensor. At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • the subsequent experiment was conducted in an environment of 37°C.
  • the oxygen production amount of chloroplast according to the intensity (lux) of light (660 nm) in a low oxygen environment was confirmed as follows.
  • Chloroplast * The concentration of Chloroplast is fixed at 1 * 10 8 pieces/ml.
  • the distances between the material and the light were set to 5 cm, 10 cm, and 15 cm, and the amount of oxygen produced by chloroplast according to the light intensity was measured using an oxygen sensor. Depending on the distance between the material and the light, 5 cm, 10 cm, and 15 cm, the intensity of light reaching the material may be changed to 1500 lux, 1000 lux, or 500 lux. At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • the initial oxygen concentration increases as the intensity of light decreases, and it can be confirmed that the initial oxygen concentration tends to remain almost constant for 20 h thereafter (see FIG. 30a ).
  • the oxygen concentration increases by 20 mmHg for 1 hour, which is estimated due to the effect of light, which means that there is no difference in the effect of light depending on the intensity of light, that is, the amount of oxygen produced by chloroplast. means that That is, in subsequent experiments, the experiment was performed by adjusting the exposure time of light, not the intensity of light.
  • the amount of oxygen produced by chloroplast according to the exposure time to light (660 nm) in a low oxygen environment was confirmed as follows.
  • Chloroplast * The concentration of Chloroplast is fixed at 1 * 10 8 pieces/ml.
  • the light intensity (lux) is fixed at 500 lux.
  • the distance between the material and the light was set to 15 cm, and the intensity of the light reaching the material was set to 500 lux.
  • Oxygen production of chloroplast according to light exposure time was measured using an oxygen sensor. At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • Chloroplast * The concentration of Chloroplast is fixed at 1 * 10 8 pieces/ml.
  • the light intensity (lux) is fixed at 500 lux.
  • the distance between the material and the light was set to 15 cm, and the intensity of the light reaching the material was set to 500 lux. Thereafter, light was exposed three times for 30 minutes each, and the oxygen production amount of Chloroplast was measured using an oxygen sensor. At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • the oxygen production of chloroplast was significantly increased up to 79.5% when exposed to light 3 times for 30 minutes (total of 90 minutes) at intervals of time compared to when continuously exposed to light for 2 hours. This was confirmed to have an oxygen-increasing effect of up to 47% compared to the group not exposed to light. Accordingly, in the subsequent experiment, the experiment was performed by maximizing the light stimulus by exposing to light for a total of 60 minutes, twice for 30 minutes with an interval of time to the intensity of light of 1000 lux.
  • Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules were prepared as follows.
  • Chloroplast diluted in CIB was prepared at a concentration (2.5*10 9 pieces/ml), and 1.5% Alginate and Alginate-CTP solution were prepared.
  • microcapsules for each group were prepared using an encapsulator (Nozzle size: 450 ⁇ m, Frequency: 800Hz, Electrode: 500V, Flow rate: 15ml/min).
  • microcapsules were crosslinked by stirring for 15 minutes in a gelation bath containing 30 ml of 100 mM CaCl 2 (stirring speed: 20 rpm). After that, the CaCl 2 solution was removed, and the microcapsules were washed with 10 ml of media (RPMI + 10% FBS +1% PS). For each group, 500 ⁇ l of microcapsules (about 500) and 500 ⁇ l of media were placed in 1 well of a 24-well plate.
  • microcapsules were well formed in all groups.
  • Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules were evaluated as follows.
  • Microcapsules for each group were prepared by incubation in a 24-well plate for 120 hours. The degree of decomposition was confirmed by examining the overall shape and size of the microcapsules with the naked eye, and the strength of the microcapsules for each group was confirmed by measuring the rheology through a rheometer.
  • the elastic modulus (Storage modulus, G') was 6.40 kPa in the Alginate-Chloroplast group and 9.80 kPa in the Alginate-CTP-Chloroplast group (see FIG. 36).
  • the value of the elastic modulus was higher in the CTP-synthesized group, it means that the Alginate-CTP-Chloroplast group had less deformation and had rigid properties.
  • Chloroplast solutions, Alginate-Chloroplast microcapsules, and Alginate-CTP-Chloroplast were prepared by concentration corresponding to each group.
  • Each group was put in an oxygen plate reader well plate (24well) as shown below, and the oxygen production amount was measured using an oxygen sensor while incubating the 24 well plate for 48 hours. At this time, the oxygen sensor used SDR SensorDish (PreSens, Germany).
  • Example 25 Preparation of Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules encapsulated with pancreatic cells
  • pancreatic cells were encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules.
  • Pancreatic cells isolated from experimental animals were washed twice with media (RPMI). Chloroplast diluted in CIB was prepared at a concentration of 2.5*10 9 pieces/ml, and 1.5% Alginate and Alginate-CTP solution were prepared. After that, 3% Alginate solution and tertiary distilled water are mixed 1:1, 1.75ml chloroplast and 1.75ml 3% (w/v) Alginate solution are added and mixed, then 1.75ml chloroplast and 1.75ml 3%(w/v) ) Alginate-CTP solution was added and mixed. 500 IEQ of the extracted pancreatic cells were added to the mixed solution and mixed well.
  • microcapsules for each group were prepared using an encapsulator (* Nozzle size: 450 ⁇ m, * Frequency: 800Hz, Electrode: 500V, Flow rate: 15ml/min).
  • Microcapsules were crosslinked by stirring in a gelation bath containing 30 ml of 100 mM CaCl 2 for 15 minutes (stirring speed: 20 rpm). Thereafter, the CaCl 2 solution was removed, and the microcapsules were washed with 10 ml of media (RPMI +10% FBS +1% PS).
  • 500 ⁇ l of microcapsules for each group (about 500) and 500 ⁇ l of media were placed in 1 well of a 24-well plate.
  • pancreatic cells were well encapsulated in the microcapsules in all groups except for the group not encapsulated in the microcapsules.
  • Example 26 Evaluation of toxicity of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules in hypoxic environment
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Pancreatic cells for each group and microcapsules encapsulated with pancreatic cells were prepared in a 24-well plate for 24 hours, incubated under normoxic and hypoxic conditions as follows.
  • pancreatic cells and microcapsules were washed twice with PBS, treated with 1 ml of media (RPMI) + 100 ⁇ l of CCK solution, wrapped in foil for 2 hours and incubated, and absorbance was measured at 450 nm using a reader.
  • media RPMI
  • the cell viability of the pancreatic cells was significantly reduced to about 22% compared to the pancreatic cells in the normoxic environment (see FIG. 39 ). This means that the hypoxic environment is not a suitable environment for pancreatic cells to survive.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules in hypoxic environment was confirmed as follows.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Pancreatic cells for each group and microcapsules encapsulated in pancreatic cells were prepared in a 24-well plate for 24 hours incubated under normoxic and hypoxic conditions as follows.
  • pancreatic cells and microcapsules were washed twice with PBS, and 1 ml of a reagent made of 5 ⁇ M Calcein-AM and 20 ⁇ M Ethidium homodimer-1 (EthD-1) was treated in each well, followed by incubation for 40 minutes. At this time, groups (3) and (4) proceeded for 15 minutes. Thereafter, live cells (green fluorescence) and dead cells (red fluorescence) were checked using a fluorescence microscope, and then pictures were taken.
  • a reagent made of 5 ⁇ M Calcein-AM and 20 ⁇ M Ethidium homodimer-1 (EthD-1) was treated in each well, followed by incubation for 40 minutes. At this time, groups (3) and (4) proceeded for 15 minutes. Thereafter, live cells (green fluorescence) and dead cells (red fluorescence) were checked using a fluorescence microscope, and then pictures were taken.
  • the Green signal was stronger in the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule group compared to other groups in the hypoxic environment, and the Yellow signal was the weakest as a result of combining Green and Red (see FIG. 40 ).
  • the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule is an environment suitable for the survival of pancreatic cells, as in the CCK-8 Assay result.
  • Example 27 Functional confirmation of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules in hypoxic environment
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules were confirmed in a hypoxic environment as follows.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Pancreatic cells for each group and microcapsules encapsulated in pancreatic cells were prepared in a 24-well plate for 24 hours incubated under normoxic and hypoxic conditions as follows.
  • pancreatic cells and microcapsules were washed twice with PBS, and 1 ml of low glucose (2.8 mM) was dispensed into each well and incubated for 30 minutes. 1ml of low glucose (2.8mM) was again dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the low glucose solution present was recovered. Thereafter, 1 ml of high glucose (20.2 mM) was dispensed into each well, incubated for 2 hours, and the high glucose solution present was recovered. The amount of insulin was measured and calculated based on the low glucose and high glucose solution recovered using the insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay.
  • ELISA insulin enzyme-linked immunosorbent
  • pancreatic cells in the normoxic environment As a result, as a result of comparing the pancreatic cells in the normoxic environment with the pancreatic cells in the hypoxic environment, it was confirmed that the insulin secretion ability of the pancreatic cells was affected by the surrounding environment. This means that the hypoxic environment is not a suitable environment for pancreatic cells to survive. It was confirmed that the pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules secrete insulin at a level similar to that of normal oxygenated pancreatic cells at both low and high glucose concentrations, which indicates that the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule material is encapsulated. This means that it does not affect the insulin-secreting ability of the pancreatic cells.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules have the same level of insulin secretion as the normal oxygen pancreas cells in the hypoxic environment test group. It means that it can best maintain the insulin-secreting ability of pancreatic cells.
  • the pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules have significantly higher glycemic control function than the pancreatic cells encapsulated in Alginate-Chloroplast microcapsules, and the pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules have higher Alginate-Chloroplast microcapsules.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules have the highest insulin secretion ability among each group in a hypoxic environment, indicating that the Alginate-CTP-Chloroplast microcapsule material can maintain the viability and ability of pancreatic cells in a hypoxic environment. It means that there is a possibility.
  • pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules Although the amount of insulin secretion of pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules is lower than that of pancreatic cells in a normoxic environment, this is due to the presence of metabolites (metabolites) or ROS (reactive oxygen ) is expected to be affected. Therefore, in order to supplement this point in subsequent experiments, catalase (CAT) or superoxide dismutase (SOD) enzymes were synthesized and tested.
  • CAT catalase
  • SOD superoxide dismutase
  • pancreatic cells As follows, the amount of insulin secreted from the pancreatic cells encapsulated in Alginate-CTP-Chloroplast microcapsules in a hypoxic environment was corrected to the size of the pancreatic cells.
  • Control 1 Normal oxygen environment
  • pancreatic cells hypoxic environment
  • Pancreatic cells for each group and microcapsules encapsulated in pancreatic cells were prepared in a 24-well plate for 24 hours incubated under normoxic and hypoxic conditions as follows.
  • pancreatic cells and microcapsules were washed twice with PBS, 1 ml of 0.1M EDTA (pH7.8) solution was dispensed into each well, and pancreatic cells and microcapsules were broken through sufficient pipetting (pancreas present in microcapsules). to take out the cells).
  • 0.1M EDTA pH7.8
  • pancreatic cells and microcapsules were broken through sufficient pipetting (pancreas present in microcapsules). to take out the cells).
  • Each solution containing the broken pancreatic cells and microcapsules was recovered in a 1.5 ml tube, centrifuged at 1800 RPM for 2 minutes, the supernatant was removed, and the pellet (pancreatic cells) was treated with 1 ml of RIPA buffer.
  • the amount of insulin secreted by pancreatic cells present in each well Alginate-CTP-Chloroplast was corrected through dsDNA assay.
  • Example 28 Confirmation of chloroplast outer membrane and CTP (VILGLGLAGI)-FITC binding using a fluorescence image
  • CTP VILGLGLAGI-FITC
  • 1*10 8 pieces/ml chloroplast (control) 500 ⁇ l, 1*10 8 /ml chloroplast+CTP-FITC 500 ⁇ l were prepared (CTP-FITC was obtained by requesting synthesis from Peptron, a synthetic company). 1*10 8 pieces/ml In chloroplast+CTP-FITC, CTP-FITC was treated at a concentration of 0.6 mg/ml. 1*10 8 pieces/ml Take 500 ⁇ l from chloroplast/ml (in CIB), and take 30 ⁇ l from CTP 10mg/ml (in DMSO) to make the final concentration of 0.6mg/ml.
  • the carboxylate (-COOH) group of alginate and the primary amine (-NH 2 ) of CTP (V-) were synthesized as follows.
  • CTP VILGLGLAGI
  • CTP MFAFQYLLVM
  • a carbodiimide coupling reaction was used, and an amide bond was formed with the carboxylate (-COOH) group of alginate and the primary amine of CTP (V-) to make a conjugate.
  • EDC/NHS was used (see FIG. 44 ).
  • alginate In the conjugate having a ratio of alginate to peptide 1:19, alginate (0.1mg/ml) was the least, so the peptide properties were well shown (see FIG. 46).
  • Alginate and Peptide were synthesized, a new amide bond was created by a new EDC/NHS reaction.
  • the amine group has several peaks, among which the peptide also has a primary amine peak with amide A and B bonds (NH stretch). -1575cm-1) was confirmed.
  • Amide II (C-N) bond was found in 1:19 and peptide, and it may be seen well because there are relatively many peptides. could
  • the conjugate with the ratio of alginate to peptide 1:19 shows the peptide characteristics well because the least amount of alginate (0.1mg/ml) is included.
  • alginate and peptide are synthesized, a new amide bond must be formed by a new EDC/NHS reaction.
  • 2.2ppm is a peak mainly appearing in Peptide, which is expected to be formed by a primary amine (N-terminal). It was confirmed that the peak appeared stronger as the amount of peptide increased relative to the binding ratio (see FIG. 47). That is, as the peak at 2.2 ppm increases, it can be seen that the characteristics of the peptide appear relatively well.
  • 3.2 ppm is a peak that neither Alginate nor Peptide appears, and it can be confirmed that the peak is formed strongly as the Peptide concentration increases.
  • the amide bond II (C-N) is formed at 3.2 ppm, and it can be estimated that the alginate carboxylate group (-COOH) binds to the primary amine of the peptide and changes into a secondary amine.

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Abstract

본 발명은 엽록체, 엽록체 전달 펩타이드, 알기네이트 및 췌장 세포를 포함하는 하이드로겔 조성물로서, 세포 또는 조직에 산소 공급, 이산화탄소 제어 및 당뇨병 등의 질환에 대한 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있어, 장기 이식 분야 등의 조직 공학 분야에 활용될 수 있다.

Description

조직 공학용 자발 호흡성 바이오소재
본 발명은 조직 공학에 사용하기 위한 자발적 호흡가능한 바이오소재에 관한 것이다.
산소전달을 하는 혈액은 체중의 7~8% 정도 차지하고 1/5 이상을 잃게 되면 생명이 위험해질 수 있다. 동맥경화, 뇌경색, 심근경색 등 여러 질환 또는 혈관 소상 등을 통해 혈액을 잃으면 생명이 위험해지는 이유는 바로 산소 전달력의 상실로 인한 산소 부족에 기인한다. 또한, 장기이식(organ transplantation)을 위해 적출한 장기(organ)도 저산소증(hypoxia) 및 허혈/재관류(I/R) 손상 등으로 장기손상이 발생하고, 또한 체내 주입하는 세포치료제(cell therapy)들이 주입된 부위의 산소부족으로 급격한 생존율 감소되게 됨으로 다량의 세포치료제를 체내에 주입해야 한다(marginal cell mass의 급격한 증가). 또한, 세포 호흡(respiration)의 부산물인 이산화탄소는 세포 내외의 pH 변화 및 산소에 대한 친화력에 빠르게 영향을 미치므로, 세포주위 미세환경의 이산화탄소 제어도 중요한 요소이다.
현재까지 산소전달을 위해 개발된 소재로 크게 두 가지를 들 수 있는데 첫째는 무기화학물 기반 산소방출소재(ORB; oxygen-releasing biomaterials)이고, 둘째는 산소생성소재(OGB; oxygen-generating biomaterials)이다. 하지만 (1) 초기 다량의 산소방출로 활성산소종 생성에 의한 세포손상 (2) 제한된 산소공급 지속 시간 (3) 이산화탄소 제어가 불가능 (4) 생체적합성 문제 등의 이슈로 임상적용에 한계가 존재한다.
세포 기반 장치의 이식은 일반적으로 이식 후 혈관 신생의 불가피한 지연으로, 부적절한 산소전달로 인해 방해를 받는다. 이식된 세포에 산소 공급이 불충분하면 이식편의 일부에서 세포 괴사와 세포 사멸을 초래할 뿐만 아니라 혐기성 대사 및 에너지 보존으로의 전환을 초래할 수 있다.
췌도를 포함하는 세포와 같이 대사 활성이 높은 세포를 포함하는 이식체에 충분한 산소 전달을 제공하는 것은 특히 어려운데, 이는 췌도의 산소 소비율은 다른 많은 세포 유형에 비해 높을 뿐만 아니라 적당한 산소 장력에서도 기능 장애에 민감하기 때문이다.
따라서 초기 생착 기간 동안 조직공학 이식체 내에서 산소 가용성을 증가시키는 방법의 개발은 저산소증에 의해 유발되는 세포 사멸을 완화하는데 도움이 될 것이다. In situ 산소 생성은 여러 번의 수술이 필요하지 않고 이식 즉시 보충 산소를 제공한다는 점에서 매우 바람직한 접근 방식이다. 이러한 방식들은 세포 생존력을 향상시키기 위해 In situ 산소 생성의 잠재력을 강조하지만, 대부분은 이식 장치의 크기를 키우거나 독성 부산물을 도입하여 이식을 어렵게 만든다.
결론적으로, 제어된 반응성과 세포에 독성이 있는 최종 생성물을 제거하여 과산화수소 중간체 또는 hydroxyl radical과 같은 부반응을 생성하는 민감성을 감소시키는 것이 산소 생성 생체물질의 개발을 위해 고려해야할 점이다.
따라서, 상기 한계점들을 개선하기 위해, 산소공급 및 이산화탄소 제어와 활성산소 제어를 할 수 있는 조직공학용 자발적호흡(spontaneous respiration) 소재의 개발이 요구되고 있다.
일 양상은 엽록체 (chloroplast) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 엽록체 (chloroplast), 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP) 및 알기네이트 (alginate)를 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 엽록체 (chloroplast), 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP), 알기네이트 (alginate) 및 췌장 세포를 포함하는, 하이드로겔 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는, 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는, 미세캡슐 (Microcapsule)을 제공하는 것이다.
다른 양상은 알기네이트 (Alginate) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 결합시키는 단계; 및
상기 결합된 알기네이트-CTP 합성물을 개체로부터 분리된 엽록체와 혼합하여 겔화 시키는 단계;를 포함하는, 하이드로겔 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 하이드로겔 조성물을 처리하는 단계; 및
상기 처리된 하이드로겔 조성물에 광조사하는 단계;를 포함하는, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 종래 기술의 한계점들을 개선하기 위해, 산소공급 및 이산화탄소 제어와 활성산소 제어를 할 수 있는 조직공학용 자발적호흡(spontaneous respiration) 소재를 개발하였다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 구현예를 설명하기 위해 사용된 것으로서 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다.
본 발명은 엽록체 (chloroplast) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "레스퍼레이토이드 (Respiratoid)"란 본 발명의 지속가능한 생체 소재를 의미하는 것으로서, ‘호흡시키다’를 뜻하는 ‘Respirate’와 인공(artificiality)을 뜻하는 접미사 ‘~oid’를 조합하여 만든 신조어이다. 상기 레스퍼레이토이드는 세포/장기들이 세포 호흡을 통해 생산되는 이산화탄소를 빠르게 다시 산소로 재생산할 수 있으며 이의 생산속도는 특정 파장을 노출 시에 더 빠르게 할 수 있게 하고, 또한 일시적 저산소증(hypoxia) 상태의 경우에는, 세포 또는 조직에서 발생되는 활성산소(superoxide anion, hydrogen peroxide 등)를 다시 산소로 재생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 레스퍼레이토이드는 생체적합성이 매우 우수하여 독성이 거의 없다.
레스퍼레이토이드는 기존 산소방출소재(ORB) 및 산소생성소재(OGB)와 비교하여 아래의 표에 요약된 바와 같은 '우수성/차별성'을 갖는다.
분류 Oxygen-releasing biomaterials (ORB) Oxygen-generating biomaterials (OGB) Respiratoid
예 - Sodium percarbonate
- Calcium peroxide
- Magnesium peroxide		 Perfluorooctance Respiratoid
(본 제안서)
외부 자극
(pH, 빛, 열)		 불필요 불필요 불필요 / 필요
부산물 활성산소 없음 없음
O2 공급 수 시간 수 시간~수 일 무한대
CO2 제거 없음 없음 무한대
세포 독성 있음 있음 없음
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 엽록체 및 CTP를 포함하는 조직공학용 자발적호흡(spontaneous respiration) 소재 레스피라토이드일 수 있다. 따라서, 상기 하이드로겔 조성물을 이용하는 경우, 세포/장기들이 세포 호흡을 통해 생산되는 이산화탄소를 빠르게 다시 산소로 재생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 식물잎에 있는 엽록체(chloroplast)를 이용하고, 겔화를 위해 사용되는 알기네이트(alginate)는 미역잎 등의 식물체에서 얻는 것일 수 있다. 또한, 엽록체 자체를 변형(modification reaction) 보다는 지방산으로 구성된 엽록체의 2중층 중 외부막(outer membrane)에 선택성이 높은 엽록체 전달 펩타이드를 이용하므로, 생체적합성이 매우 우수하며, 엽록체의 광반응 및 캘빈회로 반응 등에 미치는 영향이 적다.
또한, 상기 하이드로겔 조성물은 산소공급 및 이산화탄소를 제어할 수 있으므로, 혈세포치료제 및 장기 이식 분야 등 조직공학 분야에 광범위한 활용 가능성이 높다. 구체적으로, 원천성 및 범용성이 매우 높고 (1) 인공혈액 개발 분야 (2) 장기 적출 및 보존제 분야 (3) 미생물/세포의 고효율의 대용량 배양 분야 및 (4) (줄기)세포치료제 및 조직공학 분야 등에 활용될 수 있다. 또한, 생체 내에서 세포-세포 상호 작용을 생체 모사 환경에서 연구가 가능하여, 생리학적 측면에서 세포의 새로운 기능 규명이 가능하며, 줄기세포 치료제 연구 분야에 새로운 기술로써 적용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 산소와 이산화탄소를 동시에 제어하는 식물잎의 엽록체(chloroplast)에 존재하는 틸라코이드(thylakoid) 및 스트로마의 캘빈회로(calvin cycle)를 이용하며, 이를 위해서 엽록체에 결합 또는 접합할 수 있는 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide; CTP)를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 CTP는 엽록체 외막 (chloroplast outer membrane)에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명에서 "결합"은 화학적 결합 및 물리적 결합을 포함한다. 예를 들어, CTP가 엽록체 외막에 물리적으로 접합되거나 삽입되는 것일 수 있으며, CTP가 공유결합을 통해서 엽록체 외막에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 엽록체 막 단백질에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 CTP는 엽록체 막 단백질의 일부 서열을 포함할 수 있으며, 구체적으로, 엽록체 외막 단백질의 일부 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 엽록체의 외막 단백질 34 ((Outer envelope protein 34, OEP34) (혹은 Translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts 34 (TOC34, Arabidopsis thaliana속)) 또는 외막 단백질 ((Outer envelope protein 64, OEP64) (혹은 Translocon at the outer envelope membrane of chloroplasts 64 (TOC64, Arabidopsis thaliana속))에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예에서 상기 CTP는 OEP34/TOC34 또는 OEP64/TOC64에서 유래된 것이다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 엽록체 외막 단백질 34 또는 외막 단백질 64의 막관통부위(transmembrane domain) 서열 중 일부를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 CTP는 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 막관통부위(transmembrane domain)의 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상의 서열 중 일부를 포함하는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 MFAFQYLLVM (서열번호 1)을 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 이는 엽록체 외막 단백질인 OEP34 (혹은 TOC34)의 막관통부위 예상 서열인 LI PLMFAFQYLL VMKPLV (서열번호 3)에서 유래한 펩타이드 서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 VILGLGLAGI (서열번호 2)를 포함하는 펩타이드일 수 있으며, 이는 엽록체 외막 단백질인 OEP64 (혹은 TOC64)의 막관통부위 예상 서열인 SPSSQ IWVILGLGLA GIYVL (서열번호 4)에 서 유래한 펩타이드 서열일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 CTP는 엽록체의 산소 발생을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 알기네이트 (alginate)를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 CTP 말단과 알기네이트 말단이 결합되어 겔화되는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하이드로겔은 CTP의 primary amine과 알기네이트의 carboxyl group이 접합 (conjugation) 또는 결합되어 겔화되는 것일 수 있다. 또한, 일 구체예에서, 알기네이트는 칼슘 용액과 혼합되어, 교차 결합 (cross-linking)을 통해 겔화되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 췌장 세포를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 췌장 세포는 엽록체-CTP-알기네이트 하이드로겔 (chloroplast-CTP-alginate hydrogel) 내부에 봉입된 것일 수 있다. 본 발명의 내부에 췌장 세포가 봉입된 엽록체-CTP-알기네이트 하이드로겔 조성물은 자가호흡에 따른 우수한 세포의 생존능력 및 당뇨병 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있어, 이를 이용하여 하이드로겔 기반의 조직공학용 이식체에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 광조사시 산소를 생성하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사는 산소 농도가 101/ml 내지 1010/ml에서 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광조사는 산소 농도가 102/ml 내지 108/ml에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 광조사는 23℃ 내지 38℃의 온도에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사는 일정 시간동안 지속적으로 이루어지거나, 또는 일정 시간동안 빛에 노출시키고 일정 시간 간격으로 빛에 노출되지 않도록 하여 비 지속적이고 교차적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사는 10분 내지 50분 동안 지속적으로 빛에 노출시키고, 이후 10분 내지 50분 동안 빛에 노출되지 않도록 하는 것을 1 주기로 하여, 1회 내지 5회에 걸쳐 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광조사는 20분 내지 40분 동안 지속적으로 빛에 노출시키고, 이후 20분 내지 40분 동안 빛에 노출되지 않도록 하는 것을 1 주기로 하여, 2회 내지 4회에 걸쳐 이루어지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 하이드로겔 조성물의 산소 생성 속도는 특정 파장 노출 시에 증가할 수 있으며, 상기 파장은 620nm 내지 700nm, 640nm 내지 680nm 또는 650nm 내지 670nm일 수 있다.
또한, 일 구체예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 주변 세포 또는 조직이 일시적 저산소증(hypoxia) 상태인 경우에 발생되는 활성 산소를 산소로 재생산할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔은 엽록체를 101/ml 내지 1010/ml 농도로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 하이드로겔은 엽록체를 103/ml 내지 1010/ml, 106/ml 내지 1010/ml, 107/ml 내지 109/ml 또는 103/ml 내지 109/ml 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 하이드로겔은 상기 췌장 세포가 분비한 인슐린을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 하이드로겔 조성물에 포함된 상기 췌장 세포는 하이드로겔 내부에 봉입된 상태로 존재하여, 인슐린을 안정적으로 분비할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 세포 또는 조직에 산소를 전달하기 위한 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 산소 전달은 세포 호흡을 통해 생산되는 이산화탄소를 빠르게 다시 산소로 재생산하거나, 또한 일시적 저산소증(hypoxia) 상태의 경우에 세포 또는 조직에서 발생되는 활성 산소를 다시 산소로 재생산하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 하이드로겔 조성물에 의한 산소 전달에 의해 세포 사멸을 완화할 수 있으며, 산소 발생 속도를 제어할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는, 미세캡슐 (Microcapsule)을 제공한다. 상기 미세캡슐은 세포치료제에 이용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 미세캡슐은 광조사시 산소 생성용 미세캡슐일 수 있다. 또한, 일 실시예에서 상기 미세캡슐은 대사 질환 예방 또는 치료용 미세캡슐일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는, 대사 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 개체의 질환을 억제 시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 질환 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다.
또한 "유효성분" 또는 "약제학적 유효량"은 질환, 장애 또는 병태, 또는 그의 하나 이상의 증상의 경감, 진행 억제 또는 예방에 충분한 본원에서 제공되는 발명을 실시하는 과정에서 이용되는 조성물의 임의의 양을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대사 질환은 1형 당뇨, 2형 당뇨, 내당능장애, 공복시 혈당장애, 이상지질혈증, 지질 대사 장애, 비만, 지방간, 인슐린 저항성 및 당 내성 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 대사 질환은 당뇨병일 수 있으며, 1형 당뇨 또는 2형 당뇨일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려진 것일 수 있다. 상기 담체 또는 희석제는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물(예를 들면, 식염수 및 멸균수), 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 링거액, 완충제, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 덱스트란, 알부민, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당업자에게 알려진 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 용매 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수 있고, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 수성 용매는 생리식염수 또는 PBS를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따른 상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 형태, 바람직하게는 비경구 투여 형태로 제제화될 수 있다. 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여 형태의 경우, 통상적으로 활성 성분의 멸균 용액을 제조하고, 용액의 pH를 적합하게 조절할 수 있는 완충제를 포함할 수 있으며, 정맥내 투여의 경우 제제에 등장성이 부여되도록 등장화제를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여량(유효량)은 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다. 가능한 투여 경로에는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 동맥내, 복강내, 경막내, 또는 정맥내), 국소 (경피 포함), 및 주사, 또는 이식성 장치 또는 물질의 삽입을 포함할 수 있다. 일 구체예에 따른 치료의 대상 동물로서는, 인간 및 그 밖의 목적으로 하는 포유동물을 예로 들 수 있고, 구체적으로는 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 양, 소, 개, 말, 돼지 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 하이드로겔 조성물, 대사 질환 및 예방은 서술한 바와 같다.
본 명세서에서 "개선"은 일 양상에 따른 조성물의 투여에 의해 개체의 대사 질환을 억제 시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 정의되는 건강기능식품은 2008년 개정된 건강기능식품에 관한 법률을 통하여 새롭게 정의된 인체에 대한 기능성 및 안전성이 충분하게 확립되어 식품의약품안전청 식약청 고시 제2008-72호에 규정된 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정에 수재된 건강기능식품일 수 있다.
본 발명의 조성물을 건강기능식품에 포함하여 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 건강기능식품 또는 건강기능식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명에 따른 조성물을 구성하는 유효 성분을 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.2 내지 10 중량%로 포함할 수 있으며, 음료로서 제조될 경우 100 mL를 기준으로 0.1 내지 30g, 바람직하게는 0.2 내지 5 g의 비율로 함유할 수도 있고, 음료 전체가 천연물 성분으로 구성될 수도 있다. 그러나, 건강 조절 및 위생을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 건강기능식품용 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강기능식품은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 환제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 침제, 액제, 엑스제, 껌, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 음료의 형태로 제제화될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 목적 또는 기호에 따라 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 과한 규격 및 기준에 의하여 판정할 수 있다.
또한, 본 발명은 알기네이트 (Alginate) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 결합시키는 단계; 및 상기 결합된 알기네이트-CTP 합성물을 개체로부터 분리된 엽록체와 혼합하여 겔화시키는 단계;를 포함하는, 하이드로겔 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 제조 방법은 상기 겔화된 하이드로겔 내부에 췌장 세포를 봉입하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 처리하는 단계; 및 상기 처리된 하이드로겔 조성물에 광조사하는 단계;를 포함하는, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사는 산소 농도가 101/ml 내지 1010/ml에서 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광조사는 산소 농도가 102/ml 내지 108/ml에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사하는 단계는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광조사하는 단계는 23℃ 내지 38℃의 온도에서 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사하는 단계는 일정 시간동안 지속적으로 이루어지거나, 또는 일정 시간동안 빛에 노출시키고 일정 시간 간격으로 빛에 노출되지 않도록 하여 비지속적이고 교차적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 광조사하는 단계는 10분 내지 50분 동안 지속적으로 빛에 노출시키고, 이후 10분 내지 50분 동안 빛에 노출되지 않도록 하는 것을 1 주기로 하여, 1회 내지 5회에 걸쳐 이루어지는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 광조사하는 단계는 20분 내지 40분 동안 지속적으로 빛에 노출시키고, 이후 20분 내지 40분 동안 빛에 노출되지 않도록 하는 것을 1 주기로 하여, 2회 내지 4회에 걸쳐 이루어지는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 방법에 따른 산소 생성 속도는 특정 파장 노출 시에 증가할 수 있으며, 상기 파장은 620nm 내지 700nm, 640nm 내지 680nm 또는 650nm 내지 670nm일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 개체에 투여하는 단계;를 포함하는, 대사 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 방법은 상기 개체에 광조사하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 대사 질환의 예방 또는 치료용 의약 제조에 사용하기 위한 상기 하이드로겔 조성물의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 미세캡슐의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 대사 질환의 예방 또는 치료용 의약 제조에 사용하기 위한 상기 하이드로겔 조성물을 포함하는 미세캡슐의 용도를 제공한다.
본 발명의 엽록체 (chloroplast), 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP) 및 알기네이트 (alginate)를 포함하는 하이드로겔 조성물은 세포 또는 조직에 산소를 공급하고, 이산화탄소를 제어할 수 있다.
본 발명의 엽록체 (chloroplast), 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP), 알기네이트 (alginate) 및 췌장 세포를 포함하는 하이드로겔 조성물은 세포 및 개체에 무해하며, 당뇨병 등의 질환에 대한 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
도 1은 세포/장기에서 지속가능한 자가호흡 소재의 작용에 관한 도면이다. 본 자가호흡 소재를 통해, 세포에서 세포호흡을 통해 생성된 이산화탄소는 자가호흡 소재의 chloroplast의 광반응에 의해 산소로 다시 재생산될 수 있으며, 특정 파장(660nm)에서 산소 생산 속도를 증가시킬 수 있다. 또한 일시적 저산소증(hypoxia) 상태에서 발생되는 활성산소는 catalase (CAT) 또는 Superoxide dismutase (SOD) 효소에 의한 효소반응을 통해 다시 산소로 재생산될 수 있다.
도 2는 Alginate-CTP가 chloroplast의 outer membrane에 ancoring 되는 작용에 관한 도면이다. CTP 서열은 Met-Phe-Ala-Phe-Gln-Tyr-Leu-Leu-Val-Met (1.26kDa)로, 엽록체 outer membrane에 anchoring 되어 Alginate-CTP-chloroplast를 형성할 수 있다.
도 3a는 Chloroplast-transit-peptide (CTP) 서열을 나타낸 도이다. 도 3b는 MS(mass spectrometry) 결과를 나타낸 도이다. Chloroplast outer membrane에 삽입될 수 있는 Chloroplast-transit-peptide (CTP) 펩타이드 서열을 설정하였고, 97%의 purity를 가진 1.26 kDa의 MFAFQYLLVM (서열번호 1) 펩타이드를 합성하였다.
도 4는 EDC/NHS방법을 이용한 Alginate의 COOH와 펩타이드의 N-termius부분의 화학결합 반응식을 나타낸 모식도이다. CTP-alginate의 합성을 위해서, pH6의 0.1M MES buffer 10ml에 20mM의 sodium alginate를 녹인 후, 2mM의 EDC 및 5mM의 NHS를 넣고 상온 15분간 반응시켰다. pH 6으로 맞춘 후 1%의 DMSO에 녹인 peptide를 몰 비율로 첨가 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. dialysis 진행 후 동결 건조 시켜 합성물을 얻었다. carbodiimide coupling reaction을 이용하였으며, Alginate의 caboxylate group와 CTP의 primary amine으로 amide bond를 형성하여 접합체를 만들었다. carbodiimide coupling reaction의 효율을 높이기 위해서, EDC/NHS를 이용하였다.
도 5는 Alginate-CTP 합성물 ¹H-NMR 결과에 관한 모식도이다. 1H-NMR결과, CTP-alginate 합성물에서는 alginate:CTP 결합 몰비율이 1:1부터 1:600까지의 9가지 그룹들 모두 약 4ppm 부근에서 alginate의 peak, 2.7ppm에서 펩타이드의 amine bond peak, 2.9ppm 및 1.2ppm 부근에서 펩타이드의 n-acylurea peak를 확인하였다.
도 6은 Alginate-CTP 합성 후 BCA assay를 통해 단백질을 정량하여 기존에 합성을 진행한 몰비율(1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50)과 실제로 합성된 몰비율 결과를 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 7a 및 7b는 Alginate-CTP 합성물의 gelation 및 rheometer를 통해 gel의 강도를 확인(100mM CaCl₂) 한 결과이다. CTP-alginate 접합체를 CaCl₂용액을 이용하여 캡슐젤(gel) 형성조건을 최적화하였다. 몰농도별 CaCl₂용액 400ul를 넣고, NaCl 0.9%에 여러 비율로 합성한 CTP-alginate를 8mg/ml의 농도로 제조한 alginate 용액 200ul를 넣어 30분간 gelation 시켜 캡슐젤 형성을 확인하였다.
도 8a는 chloropalst 분리 (isolation) 공정을 나타낸 도이다. 도 8b는 분리된 chloroplast를 광학현미경 200x 배율로 확인한 도이다. 도 8a의 모식도와 같은 공정으로 시금치 잎 35g 기준, 2*1010 total chloroplast 분리 후, 동그란 모양의 테두리가 빛나는 온전한 chloroplast를 얻는 최적화된 chloroplast 분리 조건을 확립하였다.
도 9a 및 9b는 chloroplast에서 DMSO의 독성을 평가한 결과를 그래프(%) 및 표로 나타낸 도이다. Chloroplast에 대한 DMSO를 처리 후, 시간별로 확인한 독성을 평가하고 (%, n=5), 시간별 chloroplast의 양을 확인하였다.
도 10a 및 10b는 Chloroplast에 CTP-FITC 처리 후 이 둘의 결합능을 confocal 및 TEM으로 확인한 결과를 나타낸 도이다. CTP 펩타이드와 chloroplast와의 결합(anchoring)능을 평가하기 위하여 1*108/ml의 chloroplast와 0.6mg/ml의 CTP-FITC를 처리하여 시간별(1, 5, 10, 30, 60min)로 confocal microscope과 TEM으로 분석하였다.
도 11은 여러 몰비율로 합성한 Alginate-CTP와 chloroplast를 처리하여 결합체를 제조한 후, CaCl₂ 용액으로 형성시킨 hydrogel과 hydrogel을 형성한 후 잔량의 chloroplast를 확인한 사진과 Alginate-CTP 합성 몰비에 따른 chlorophyll 봉입율을 나타낸 그래프이다. 본 실험을 진행하기 전, 선행 실험으로 Alginate-CTP와 chloroplast를 anchoring 시킬 때 CIB를 이용해도 gelation에 영향이 없을지 확인하는 gelation test를 진행하였고, CIB는 일반적으로 사용하는 buffer인 PBS와 동일하게 gelation이 일어나지 않음을 확인하였다. 도 11a는 제조한 캡슐젤의 여러 몰비율로 합성한 Alginate-CTP와 chloroplast를 처리하여 결합체를 제조한 후 CaCl₂용액으로 캡슐젤을 형성한 사진 (좌) 및 캡슐젤을 형성한 후 잔량의 chloroplast를 확인한 결과이다 (우). 1:1에서 1:50 합성 몰비 (feed molar ratio)를 갖는 Alginate-CTP 접합체에 1*108/ml의 chloroplast를 처리하여 5분간 반응시킨 용액 200μl를 준비 후, 100 mM CaCl₂용액 400μl를 넣고, NaCl 0.9%에 여러 비율로 합성한 Alginate-CTP를 8mg/ml의 농도로 제조한 Alginate 용액 200μl를 넣어 30분간 gelation 시켜 hydrogel을 형성하였다. 도 11b는 Total chlorophyll 농도를 측정하여 hydrogel 안에 결합된 chloroplast 양을 확인한 결과이다.
도 12a는 HEK293 cell에 chloroplast 농도별 처리 후 광학현미경으로 촬영한 사진이며, 도 12b는 cell viability assay (CCK-8 assay) 결과를 나타낸 그래프 (%, n=5)이다. (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
도 13a는 chloroplast의 광합성 효율을 높여주는 빛(660nm)을 지면과의 거리 5cm를 두고 chloroplast 용액에 노출시키는 모습을 나타낸 도이다. 도 13b는 정상산소 상태에서의 빛의 유무에 따른 chloroplast 농도에 따른 산소 생성량을 비교한 그래프이다.
도 14는 chloroplast 농도에 따른 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel (ACC) 사진 (14a) 및 정상산소 상태에서 빛의 유무에 따른 ACC 내의 chloroplast 농도에 따른 산소 생성량을 비교한 그래프이다 (14b). 도 14a와 같이 약 0.5cm의 비교적 균일한 크기의 hydrogel이 만들어졌고, 그 형태를 잘 유지하며 chloroplast의 농도가 높아질수록 색의 농도가 진해지는 것을 확인하였다.
도 15a는 Chloroplast 농도별로 제조한 Alginate-CTP-Chloroplast (ACC) 및 Alginate-Chloroplast hydrogel (AC)를 나타낸 도이다. 도 15b는 CTP 유무에 따른 Alginate- CTP-Chloroplast hydrogel의 장기간의 강도를 확인하기 위해 rheology test를 진행한 결과를 나타낸 그래프이다. 0일차에는 그룹 간 차이가 없었지만 7일차에 CTP가 있는 hydrogel에서 더욱 높은 storage modulus 값이 측정되었다. 30일 차에는 모든 그룹의 storage modulus 값이 0에 가깝게 측정되었다. 따라서 아직 정확한 기전은 밝혀지지 않았으나, CTP가 있는 hydrogel이 더 좋은 물리적 강도(물성)를 보이는 것을 확인하였다.
도 16은 정산 산소 상태와 저산소 상태에 따른 chloroplast농도별 Alginate- CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 저산소 상태에서 빛 노출 시의 free chloroplast, Alginate-chloroplast (AC) hydrogel, Alginate-CTP-Chloroplast (ACC) hydrogel의 산소 생성량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 17a는 저산소 상태에서 빛 노출 시의 free chloroplast 산소 생성량 그래프 (μM/L-좌, %-우, n=5)이다. 도 17b는 저산소 상태에서 빛 노출 시의 AC 산소 생성량 그래프 (μM/L-좌, %-우, n=5)이다. 도 17c는 저산소 상태에서 빛 노출 시의 ACC 산소 생성량 그래프 (μM/L-좌, %-우, n=5)이다.
도 18은 고농도의 chloroplast 그룹에서 산소 생성량이 감소하는 이유를 확인하기 위해 ABTS assay를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 18A는 Free chloroplast의 과산화수소 생성량 그래프 (n=5)이다. 도 18B는 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 과산화수소 생성량 그래프 (n=5)이다.
도 19는 INS-1 세포 (단일 세포)에 대한 Alginate-CTP solution의 농도별 세포 viability assay (CCK-8 assay) 결과 그래프 및 Live & Dead assay 결과를 나타낸 도이다. 도 19a는 Alginate-CTP 용액 농도에 따른 INS-1 세포의 생존 가능성을 정량적으로 나타낸 그래프 (%, n=5)이다. 도 19b는 Alginate-CTP 용액 농도에 따른 INS-1 세포의 생존 가능성을 정성적으로 나타낸 형광현미경 사진 (200X, green 형광- 살아있는 세포, red 형광- 죽은 세포)을 통해, Live & Dead assay를 확인한 도이다. (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
도 20은 췌장 세포 (세포 집단)에 대한 Alginate-CTP hydrogel의 농도별 세포 viability assay (CCK-8 assay) 결과 그래프 및 Live & Dead assay 결과를 나타낸 도이다. 도 20a는 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 광학 현미경 사진 (40X)이다. 도 20b는 Alginate-CTP hydrogel 농도에 따른 췌장 세포의 생존 가능성을 정량적으로 나타낸 그래프 (%, n=5)이다. 도 20c는 Alginate-CTP hydrogel 농도에 따른 췌장 세포의 생존 가능성을 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진 (200X, green 형광- 살아있는 세포, red 형광- 죽은 세포)이다. (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
도 21은 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 세포 viability assay (CCK-8 assay) 결과 그래프 및 Live & Dead assay 결과 사진이다. 도 21a는 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 광학 현미경 사진 (40X)이다. 도 21b는 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존 가능성을 정량적으로 나타낸 그래프 (%, n=5)이다. 도 21c는 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존 가능성을 정성적으로 나타낸 형광 현미경 사진 (200X, green 형광- 살아있는 세포, red 형광- 죽은 세포)이다. (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
도 22는 췌장 세포를 봉입하고 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP- Chloroplast hydrogel의 산소 농도를 30시간 동안 측정한 결과 그래프이다. 도 22a는 췌장 세포를 봉입한 chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량 측정 그래프 (μM/L, n=5)이다. 도 22b는 췌장 세포를 봉입한 chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량을 측정한 그래프 (24시간 기준)이다. (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
도 23은 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 능력을 평가 (GSIS assay)한 결과 그래프와 이를 바탕으로 나타낸 췌장 세포의 포도당 반응 지수(stimulation index)를 표시한 그래프이다 (Insulin ng/ DNA ng, n=5).
도 24는 정확한 산소 생성량을 측정하기 위한 저산소 환경을 유도할 수 있는 장치를 나타낸 도이다. Hypoxia Chamber안에 Oxygen Plate Reader(SDR SensorDish® Reader, PreSens)를 넣어 실시간으로 산소 농도를 측정하였으며, Oven에서 온도 조건(37℃)과 빛에 노출될 수 있는 환경 (660nm, 2000lux, distance: 15cm from sample)을 구현하였으며, 외부의 산소 유입을 방지하기 위하여, Hypoxia Chamber sealed parafilm을 이용하여 유입을 차단하였다. 주변 환경 조건이 구현된 Hypoxia Chamber에 Mixed gas (1% O2 + 5% CO2 + 94% N2)를 40L/min의 속도로 주입하여 1% O2의 저산소 환경을 구현하였다.
도 25는 빛(660nm) 조건 유무에 따른 chloroplast(106개/ml, 107개/ml, 108개/ml)의 산소 생성량 측정 결과 그래프이다. 상기 도 24에서 구현된 Hypoxia Chamber을 이용한 저산소 환경을 유도한 후, Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 희석시킨 Fresh isolated chloroplast를 106개/ml, 107개/ml, 108개/ml 농도별로 준비하여, Chloroplast solution을 저산소 환경 (60mmHg이하)로 만들어 준 후 Hypoxia chamber 내에 Oxygen Plate Reader기를 넣어서 20시간동안 Chloroplast Solution의 산소 농도를 지속적으로 측정하였다. 또한, 빛(660nm)의 유무에 따른 산소 생성 정도를 측정하기 위하여 Light에 20시간동안 노출한 chloroplast(Light)와 노출시키지 않은 Chloroplast(No Light)으로 그룹을 나누어 실험하였다. 도 25a는 빛(660nm) 조건 유무에 따른 농도별 chloroplast의 산소 생성량 측정 결과이다 (mmHg, n=6). 도 25b (mmHg, n=6) 및 25c (%, n=6)는 빛(660nm) 조건 유무에 따른 농도별 chloroplast의 산소 생성량 측정 결과이다.
도 26은 상기 도 24의 Hypoxia Chamber의 단점을 보완하기 위해 저산소 환경을 유도할 수 있는 온도 조절형 Desiccator의 모식도이다. 도 26a는 온도 조절형 Desiccator를 이용한 저산소 환경 유도 장치 도면도이다. 도 26b는 온도 조절형 Desiccator를 이용한 저산소 환경 유도 장치와 저산소 환경 상태를 확인한 결과를 나타낸 도이다. 온도 조절형 Desiccator안에 Oxygen Plate Reader (SDR SensorDish® Reader, PreSens)를 넣어 실시간으로 산소 농도를 측정하였으며, 온도 조건(37℃)과 빛에 노출될 수 있는 환경 (660nm, 2000lux, distance: 15cm from sample)을 구현하였다. 주변 환경 조건이 구현된 온도 조절형 Desiccator에 Mixed gas(1% O2 + 5% CO2 + 94% N2)를 40L/min의 속도로 주입하여 1% O2의 저산소 환경을 구현하였으며, Oxygen Detector을 이용하여 그 환경을 실시간으로 확인할 수 있다. 상기 도 24와 도 26를 비교한 결과 Desiccator를 이용했을 때, 외부 공기 유입 차단 능력이 우수함 확인하였다.
도 27은 chloroplast를 저산소 환경(Desiccator)에서 장시간(20시간) 배양했을 때의 산소 농도 측정 그래프와 AUC(Area under the ROC Curve.) 측정 결과를 나타낸 도이다. 상기 도 26에서 구현된 온도 조절형 Desiccator을 이용하여 저산소 환경을 유도한 후, Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 희석시킨 Fresh isolated chloroplast를 108개/ml 농도별로 준비하여, Chloroplast solution을 저산소 상태 (1% O2)로 만들어 준 후 Oxygen Plate Reader기를 이용하여 20시간동안 Chloroplast Solution의 산소 농도를 지속적으로 측정하였다. 도 27a는 chloroplast를 저산소 환경(Desiccator)에서 장시간(20시간) 배양했을 때의 산소 농도 측정한 결과이다 (torr-좌, %-우, n=24). 도 27b는 chloroplast를 저산소 환경(Desiccator)에서 장시간(20시간) 배양했을 때의 산소 농도 측정 AUC 결과이다 (min*torr, n=24).
도 28은 Hypoxia Chamber(A)와 Desiccator(B) 비교 모식도이다. 도 28(A)의 Hypoxia Chamber sealed parafilm을 이용하여 외부의 산소 유입을 방지한다면, 20시간 동안 저산소 환경 수준의 산소 농도(40mmHg)를 유지할 수 있다. 하지만, 저산소 환경을 만들기 위해서 40L의 Mixed gas(1% O2 + 5% CO2 + 94% N2)를 모두 사용해야 한다는 점, 시간이 오래 걸린다는 점, 그리고 두 개 이상의 Oxygen Plate Reader를 사용하지 못한다는 점, 그리고 Oxygen Detector를 삽입하지 못해, Hypoxia Chamber 내의 환경이 아닌 Solution의 산소 농도로 저산소 환경을 판단해야 한다는 점이 단점으로 적용될 수 있다. 도 28(B)의 온도 조절형 Desiccator는 자체적으로 온도를 조절할 수 있기 때문에, 다양한 온도 환경에서 실험을 진행할 수 있으며, 84L의 크기를 가지고 있어 상대적으로 Hypoxia Chamber보다 큰 크기를 가지고 있어 Light, 두개 이상의 Oxygen Plate Reader와 Oxygen Detector를 내부에 삽입할 수 있다는 점이 장점으로 작용할 수 있다. 또한, Desiccator의 특성 상 완벽히 밀폐되는 환경을 가지고 있으며, 실시간으로 Desiccator 내부의 산소 농도를 파악할 수 있다는 점이 장점으로 적용될 수 있다. 위의 두 가지를 고려해볼 때, Hypoxia Chamber를 이용하는 것보다, 온도 조절형 Desiccator을 이용하는 점이 저산소 환경을 유도한 후 실험을 진행하는 것에 있어서 유리하다고 판단되므로 추후 진행되는 연구에서는 Desiccator를 이용하여 실험을 진행하였다.
도 29는 온도 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프결과 그래프이다. 상기 도 26에서 구현된 온도 조절형 Desiccator을 이용하여 저산소 환경을 유도한 후, Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 희석시킨 Fresh isolated chloroplast를 108개/ml을 준비하여, Chloroplast solution을 저산소 환경 (1% O2)로 만들어 준 후 Oxygen Plate Reader기를 이용하여 20시간동안 Chloroplast Solution의 산소 농도를 지속적으로 측정한다. 이 때, 온도에 다른 chloroplast의 산소 생성 능력을 측정하기 위하여, 각각 미리 heating 한 25℃와 37℃의 Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 chloroplast를 희석시킨다. 또한 주변 환경을 25℃와 37℃로 맞춰 주기 위하여 온도 조절형 Desiccator을 이용한다. 도 29a는 온도 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도(좌) 및 AUC(우)를 나타낸 그래프이다 (torr-좌, time*torr-우, n=24). 도 29b는 온도 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도를 확인한 그래프이다 (%, n=24).
도 30은 빛(660nm) 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프 결과이다. 각각 빛(660nm)의 세기(도 30a), 빛에 노출되는 시간(도 30b 및 30c), 빛에 노출되는 시간의 지속성(도 30d 및 30e)에 따라 그룹을 나누어 실험을 진행하였다. 상기 도 26에서 구현된 온도 조절형 Desiccator을 이용하여 저산소 환경을 유도한 후, Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 희석시킨 37℃ Fresh isolated chloroplast를 108개/ml을 준비하여, Chloroplast을 저산소 환경 (1% O2)로 만들어 준 후 Oxygen Plate Reader기를 이용하여 20시간동안 빛 조건을 다르게 설정하여, Chloroplast Solution의 산소 농도를 지속적으로 측정하였다. 도 30a는 빛 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프이다 (torr-좌, torr-우, n=24). 도 30b는 빛 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프이다 (torr-좌, torr-우, n=24). 도 30c는 빛 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프이다 (torr-좌, torr-우, n=24). 도 30d는 빛 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프이다 (torr, n=24). 도 30e는 빛 조건에 따른 Chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 농도 측정 그래프이다 (torr-좌, torr-우, n=24).
도 31은 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 광학 현미경 사진을 나타낸 도이다. 도 31a는 각 그룹을 분류한 것을 나타낸 도이다. 도 31b는 췌장 세포를 봉입한 Chloroplast-CTP(MFAFQYLLVM)-Alginate hydrogel의 광학 현미경 사진을 나타낸 도이다 (40X, 400X). 각각의 농도에 맞게 Media(RPMI +10%FBS)에 희석시킨 chloroplast를 준비한 후, 증류수에 희석시킨 Alginate-CTP용액과 실험 동물(Rat)에서 추출한 췌장 세포와 20IEQ씩 (*IEQ = 췌장 세포 단위) 추가하여 100mM의 CaCl₂용액 500μl에 넣어 반응시켜 Chloroplast-CTP-Alginate hydrogel을 제조한 후 각 그룹에 췌장 세포가 잘 봉입 되었는지 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 모든 그룹에서 hydrogel안에 췌장 세포가 잘 봉입된 것을 확인하였다. 도 31c는 저산소 환경에 배양한 췌장 세포를 봉입한 Chloroplast-CTP(MFAFQYLLVM)-Alginate hydrogel를 광학 현미경으로 확인한 도이다 (40X, 400X). 위의 실험 후, 온도 조절형 Desiccator을 이용하여 저산소 환경 (1% O2)로 만들어준 후 24시간을 배양한 후 각 그룹에서의 췌장 세포의 분해도(degradation)의 확인하기 위하여 광학 현미경을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 각 그룹에서 췌장 세포의 형태가 잘 유지되었다는 것을 확인하였다.
도 32는 저산소 환경에서의 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존 가능성을 정량적으로 나타낸 그래프이다 (%, n=5). 상기 도 31의 실험 후, 각 그룹에 대하여, CCK 용액(10%)를 20μl씩 분주한 뒤 2시간 후 흡광도(OD450nm)를 측정하였으며, 그 후 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kits를 이용하여 각 실험 군에 대하여 DNA양을 통하여 흡광도 값을 보정한 결과, 저산소 환경의 췌장 세포에서 장시간 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율(Cell Viability)가 췌장 세포의 생존율이 IH 그룹을 제외하고는 IN 그룹과 대비했을 떄 유의하게 감소하지 않을 것을 확인할 수 있다. IH 그룹은 24시간동안 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율 약 18% 감소하였음을 확인할 수 있었으며, 이는 췌장 세포가 배양되기에 저산소 환경이 적절하지 않다는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast(4, 6그룹)는 IN 그룹보다 세포 생존율이 감소했지만 이는 유의하지 않은 결과로 확인되었으며, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel은 chloroplast의 농도에 관계없이 Alginate-CTP-Chloroplast 소재가 췌장 세포에 대하여 독성을 가지지 않는 다는 것을 의미한다. 또한, 저산소 환경에서 0, 4, 6그룹이 IH 그룹에 비하여 세포 생존율이 높아지는 것으로 보아, 이는 Alginate- CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포는 저산소 환경에서 배양되기에 적절한 조건을 가질 수 있다는 것을 의미한다. (N.S: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=24. Results are shown as mean ± S.E.M.)
도 33은 저산소 환경에서의 Chloroplast 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 능력 평가 (Static Glucose-stimulated Insulin Secretion (GSIS) Assay) 결과를 나타낸 그래프이다 (Insulin ng/DNA ng, n=5). 상기 도 33에서 진행된 실험 후, 각 그룹에 대하여, Low glucose solution (2.8mM) 용액를 분주한 뒤 2시간, High glucose solution (20.2mM) 용액을 분주한 뒤 2시간 후 Rat Insulin ELISA assay kit를 이용하여 각 그룹의 insulin양을 측정하였으며, 그 후 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kits를 이용하여 각 실험 군에 대하여 DNA양을 통하여 흡광도 값을 보정한 결과이다. 췌장 세포의 인슐린 분비능이 IH 그룹을 제외하고는 IN 그룹과 대비했을 때 유의하게 감소하지 않을 것을 확인할 수 있다. IH 그룹은 저산소 환경에 24시간 동안 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 인슐린 분비능이 감소된 것으로 확인된다. Alginate-CTP-Chloroplast group은 IN그룹과 유사한 췌장 세포의 포도당 반응 지수(Stimulation index, SI)를 나타내고 있으므로, 이는 Alginate-CTP- Chloroplast group (4, 6그룹)이 저산소 환경에 노출되었음에도 불구하고 인슐린 분비는이 감소하지 않았다는 것을 의미한다. 또한, 저산소 환경에서 0, 4, 6그룹이 IH 그룹에 비하여 인슐린 분비능이 유의하게 높은 것으로 보아 이는 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포는 저산소 환경에서 배양되었음에도 불구하고 인슐린 분비능이 감소하지 않았으며, 저산소 환경에서 배양되기에 적절한 조건을 가질 수 있다는 것을 의미한다.
도 34는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐(Microcapsule)의 물성 평가 결과 결과를 나타낸 도이다. Encapsulator를 이용한 Alginate-CTP-Chloroplast 접합체로 형성하는 미세캡슐(Microcapsule)의 형성 조건을 최적화 시켰다. 각 그룹 1)Alginate, 2)Alginate- Chloroplast 3) Alginate-CTP-Chloroplast의 미세캡슐의 겔화(gelation) 능력을 확이하였으며, 최종 농도가 1.5% w/v alginate가 되도록 만든 Alginate 용액과 CIB에 희석시킨 Chloroplast(2.5x109개/ml)을 1:1로 섞어 Encapsulator를 이용하여 미세캡슐을 제조한 후, 100mM의 CaCl₂용액 300μl를 넣어 반응시킨 후 각 그룹의 겔화(gelation) 능력을 평가하였다. 그 결과, 모든 그룹에서 미세캡슐이 잘 형성된 것을 확인하였다.
도 35는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐(Microcapsule)의 분해도(degradation) 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 36은 각 그룹별 미세캡슐의 기계강도(mechanical strength) 평가를 위해 Rheometer를 이용한 Rheology test 결과를 나타낸 도이다 (kPa, n=2).
도 37은 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐(Microcapsule)의 산소 제어 능력 평가 결과를 나타낸 도이다 (μmol/L, n=6). 미세캡슐에서 각각 Media(RPMI +10%FBS, 1%PS) 와 CIB에 희석시킨 Chloroplast와 CTP의 산소 생성 능력을 확인하기 위해서 각각 1) Free Chlorplast (106, 107, 108개/ml) 2) Alginate-Chloroplast (106, 107, 108개/ml) 3) Alginate-CTP-Chloroplast (106, 107, 108개/ml)으로 나누어 그룹별 48시간 동안 산소 생성량을 확인하였다. (Alginate = 1.5%(w/v)).
도 38은 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐(Microcapsule)에 봉입된 각 그룹별 췌장 세포의 광학현미경 사진을 나타낸 도이다 (4X, 10X, n=5). Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐의 독성을 평가하고 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비능을 확인하기 위하여, Encapsulator을 이용하여 실험 동물(Rat)에서 추출한 췌장 세포(Islet)를 미세 캡슐에 봉입하였다. 각각 0) Intact Islet(Normoxia) (*Normoxia: 정상산소 환경) 1) Intact Islet(Hypoxia) (*Hypoxia: 저산소 환경) 2) Alginate + Islet 3) Alginate-Chloroplast + Islet 4) Alginate- CTP -Chloroplast + Islet의 그룹으로 나누어 실험 진행하였으며, 최종 농도가 1.5% alginate가 되도록 만든 Alginate 용액과 CIB에 희석시킨 Chloroplast(2.5x109개/ml)을 1:1로 섞어 용액을 제조한 후 각 그룹별로 추출한 췌장 세포를 500IEQ씩 (*IEQ = 췌장 세포 단위) 추가하여 Encapsulator를 이용하여 미세캡슐을 제조하였다.
도 39는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐(Microcapsule)에 봉입된 각 그룹별 췌장 세포의 생존 가능성과 세포괴사(necrosis) 평가를 평가하기 위하여, CCK-8 Assay를 진행한 결과를 나타낸 도이다 (%, n=5). 위의 실험의 각 그룹에 대하여, CCK 용액(10%)를 1ml씩 분주한 뒤 2시간 후 흡광도(OD450nm)를 측정. 그 후 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kits를 이용하여 각 실험 군에 대하여 DNA양을 통하여 흡광도 값을 보정한 결과이다. 저산소 환경의 췌장 세포에서 장시간 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율(Cell Viability)이 정상산소 환경의 췌장 세포에 비하여 약 22%로 유의하게 감소하였고, 이는 저산소 환경은 췌장 세포가 생존하기 적절한 환경이 아니라는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 세포 생존율을 확인한 결과, 정산산소 환경의 췌장 세포보다 약 10% 감소하였으며, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 소재가 췌장 세포의 생존에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미한다. Alginate-Chloroplast 미세캡슐을 Alginate 미세캡슐과 비교하였을 때, Alginate- Chloroplast 미세캡슐의 chloroplast가 세포를 생존에 도움을 줄 수 있는 산소를 생산할 수 있다는 것을 확인하였다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐과 Alginate-Chloroplast 미세캡슐을 비교하였을 때, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에서 낮은 세포 생존율의 감소를 보이고 있기 때문에, chloroplast가 산소를 생산하는 것에 있어서 CTP의 효능이 중요한 역할을 한다는 것을 의미하며, 이는 CTP로 안정화된 chloroplast가 보다 더 기능적인 측면에 있어서 유리한 점을 지니고 있음을 의미한다. 각 그룹별 세포 생존율을 비교하였을 때, Alginate-CTP-Chloplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 세포 생존율이 정상산소 환경의 췌장 세포보다 낮지만, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 내에 존재하는 췌장 세포의 metabolites(대사체) 혹은 ROS (활성산소)의 영향일 것으로 예상된다. 이에, 이후 실험에서 이와 같은 점을 보완하기 위하여, catalase(CAT) 또는 superoxide dismutase(SOD)효소를 합성하여 실험하였다.
도 40은 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 봉입 후 저산소 환경 (1% O2)에 24시간동안 노출시킨 후 각 그룹별 췌장 세포의 생존 가능성을 확인하기 위해 Live & Dead assay을 진행한 결과를 나타낸 형광 현미경 사진을 나타낸 도이다 (4X 10X, n=5, green 형광- 살아있는 세포, red 형광- 죽은 세포). 위의 실험의 각 그룹의 저산소 환경과 미세캡슐 환경에 대한 세포 독성(cellular toxicity)을 평가하기 위하여 미세캡슐을 제조한 후 (0그룹: Intact Islet (Normoxia) 제외), 빛의 영향에 따른 Chloroplast의 효능을 확인할 수 있도록, 초기 150분 동안 30분씩 시간 간격을 두고 빛(660nm, 1000lux)에 2번 노출시킨 후, Live&Dead Assay를 수행하였다. 각 그룹에 대하여 Calcein 5μl, EthD 20μl을 PBS에 섞은 용액을 1ml씩 분주한 뒤 40분 후, 형광 현미경을 이용하여 췌장 세포의 생존율을 확인하였다. 그 결과, 저산소 환경의 다른 그룹에 비하여 상대적으로 Alginate-CTP- Chloroplast 미세캡슐 그룹에서 Green signal이 강하게 나타나며, Green과 Red를 합친 결과 Yellow signal이 가장 약하게 나타나는 것을 확인하였다. 이는 상기 도 39의 CCK-8 Assay 결과와 동일하게 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐이 췌장 세포가 생존하기에 적절한 환경임을 의미한다.
도 41은 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 봉입 결과 각 그룹의 미세캡슐 안에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비능력을 통한 기능을 평가하기 위해 Glucose-stimulated Insulin Secretion (GSIS) Assay를 진행한 결과 그래프이다 (Insulin ng/DNA ng, n=5).
도 42는 추가적으로 설정한 Chloroplast outer membrane에 삽입될 수 있는 Chloroplast-transit-peptide (CTP, VILGLGLAGI, 이하 CTP(V-)) 펩타이드 서열을 나타낸 도이다 (VILGLGLAGI, 0.924kDa). VILGLGLAGI 펩타이드를 합성하여 95%의 순도를 가진 펩타이드를 합성하였으며, 이는 0.924kDa으로 확인되었다. 또한, VILGLGLAGI 펩타이드는 MFAFQYLLVM 펩타이드와 달리 Hydrophilicity가 0%로 확인되었다.
도 43(A)는 Chloroplast (red 형광) 표면에 결합한 CTP(V-)-FITC(green 형광)의 결합에 대한 Confocal microscope과 광학현미경 이미지이다. 도 43(B)는 chloroplast 표면에 물리적 결합되는 FITC-VILGLGLAGI 펩타이드 존재를 광학현미경으로 확인한 이미지이다. CTP(V-)와 chloroplast와의 CTP(V-)-FITC를 처리하여 시간별(1, 5, 10, 30, 60min)로 Confocal microscope과 광학현미경으로 분석하였다.
도 44는 EDC/NHS방법을 이용한 Alginate의 COOH와 CTP(V-)의 N-terminus 부분의 화학결합 반응식을 나타낸 모식도이다. Carbodiimide coupling reaction을 이용하였으며, Alginate의 caboxylate(-COOH) 그룹과 CTP(V-)의 primary amine으로 amide bond를 형성하여 접합체를 만들었다. carbodiimide coupling reaction의 효율을 높이기 위해서, EDC/NHS를 이용하였다.
도 45는 Alginate-Chloroplast-transit-peptide(CTP(V-)) 접합체의 가장 최적의 비율을 확인하기 위하여 다양한 농도로 진행한 접합체 합성 비율을 나타낸 표이다. CTP(V-)-alginate의 합성을 위해서, pH6의 0.1M MES buffer 10ml에 각 농도별로 sodium alginate(0.1mg/ml, 0.5mg/ml, 1mg/ml)를 녹인 후, 2mM의 EDC 및 5mM의 NHS를 넣고 상온 15분간 반응시켰다. pH7로 적정한 후 1%의 DMSO에 녹인 10mg/ml peptide를 첨가 후 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. Dialysis 진행 후 동결 건조시켜 합성물을 얻었다.
도 46은 Alginate-Chloroplast-transit-peptide (CTP(V-), LDY004) 접합체의 농도에 따른 합성 결과를 확인하기 위한 FT-IR 결과를 나타낸 도이다.
도 47은 Alginate-Chloroplast-transit-peptide (CTP(V-)) 접합체의 농도에 따른 합성 결과를 확인하기 위한 ¹H-NMR 결과를 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. Alginate-CTP 접합 (conjugation)
다음과 같은 방법으로 Alginate(-COOH)와 CTP(-NH2)를 접합하여 합성물을 얻었다.
0.1M MES buffer (+0.5M NaCl) 10ml 제조 후, pH를 6으로 맞추었다. 상기 제조된 MES buffer 10ml에 0.2mM의 sodium alginate(228mg/10ml)를 녹였다. 이 때, 잘 풀어지도록 뭉치지 않게 넣어주었다. solution이 충분히 녹으면 2mM에 해당하는 4mg/10ml의 EDC(191.7MW)를 녹였다. 이후, 6mg/10ml의 NHS(5mM)를 넣고 RT에서 15분간 반응시켰다. PBS나 sodium bicarbonate(NaHCO3, 탄산수소나트륨)를 이용하여 pH를 7까지 올렸다. 1%의 DMSO에 녹인 peptide(10mg/ml, peptide는 peptide 합성 업체인 peptron에 의뢰하여 합성)를 molar ratio(1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50)에 해당하는 양만큼 solution에 넣어주었다. 그 후, RT에서 2시간 동안 반응시켰다. 6,000 내지 8,000 MWCO(molecular weight cut-off) dialysis membrane을 이용하여 3일간 dialysis를 진행하였다. Deep freezer에 얼린 후, 동결 건조하여 powder 형태의 Alginate-CTP 합성물을 얻었다 (도 4 참조).
실시예 2. BCA assay
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 합성물에서 CTP(단백질)의 양을 정량 하였다.
BCA assay kit를 이용하여 control A 내지 I를 만들었다. 얼음 위에 호일을 깔고 96 well plate를 둔 후 control을 24μl씩 loading하였다. Control을 loading한 line 밑에 sample을 loading하였다. (n=5, 농도 2mg/ml (RIPA solution)) 그 후, 시료를 loading 한 것 위에 well 당 A+B solution 200μl loading하였다. 이때 A, B solution은 반드시 상온에서 진행하여야 한다 (A=196μl, B=4μl, A:B = 50:1). Control은 저 농도부터 넣어주었다. 30분 incubation 후, 기기를 이용하여 562nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 6 참조).
그 결과, 순서대로 1:19, 1:31, 1:36, 1:79, 1:62의 moral ratio를 확인할 수 있었다. 따라서 molar ratio 값이 적을수록 (1:1, 1:5, 쪋) 높은 비율로 합성이 잘 이루어짐을 확인하였다.
실시예 3. Alginate-CTP gelation과 rheology test
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 합성물의 molar ratio별로 형성된 hydrogel의 강도를 확인하였다.
- 그룹 (n=5)
(1) Alginate (control)
(2) Alginate-CTP (1:1)
(3) Alginate-CTP (1:5)
(4) Alginate-CTP (1:10)
(5) Alginate-CTP (1:25)
(6) Alginate-CTP (1:50)
Alginate 혹은 Alginate-CTP 용액 (0.07mM)을 만들기 위해 0.9% NaCl,
1.5% alginate 혹은 alginate-CTP를 넣어 3차 증류수로 희석시켰다 (3차 증류수 500μl + NaCl 4.5mg + alginate 혹은 alginate-CTP 4mg). 이 때, Alginate powder를 넣을 때에는, 천천히 넣어주고 충분히 희석시켰다. CaCl2 용액 (100mM)을 만들기 위해 1L 3차 증류수에 11g CaCl2 (110.98g/mol)과 2.6g HEPES를 넣었다. 만들어진 CaCl2 용액은 filtering 하여 냉장 보관하였다. 이후, 48 well plate에 과정 1의 용액 200μl와 100mM CaCl2 용액 500μl를 30분간 반응시켜 gelation시켰다. Rheometer를 통해 rheology를 측정하여 hydrogel의 강도를 확인하였다.
그 결과, Alginate-CTP 합성 몰비 1:280 이상에서는 캡슐젤 형성이 되지 않음을 확인하였다 (도 7a 참조). 이는 너무 많은 peptide에 의해서는 칼슘에 의해 젤 형성을 못하게 함을 의미한다. 모든 그룹은 칼슘용액의 몰농도가 높을수록 젤(gel)이 잘 형성되었고, 단단한 모습을 보였다.
또한, 제조한 캡슐젤의 Rheology test 결과, 100mM CaCl₂ 기준, alginate에서는 6kPa(G')을 보이고, 합성 몰비가 증가할수록 값이 점점 작아졌으며 1:18 몰비 5.3kPa(G'), 1:62 몰비 1.7kPa(G') 값을 얻었고, 모든 그룹의 G'(storage modulus)값은 G'‘(loss modulus) 값보다 큼을 확인할 수 있었다 (도 7b 참조). 따라서, 캡슐젤이 되었다고 판단할 수 있다. 반면, 더 높은 1:128 몰비부터는 1kPa(G') 미만으로 캡슐젤 형성되지 않음을 확인하였다.
실시예 4. 엽록체 분리 (Chloroplast isolation)
다음과 같은 방법으로 시금치로부터 엽록체 (chloroplast)를 분리하였다 (도 8 참조).
재료는 시금치 잎 35g, 가위, blender, 거즈, conical tube, cooling centrifuge, 1x chloroplast isolation buffer(CIB) without BSA (0.33M sorbitol, 0.1M tris-cl pH 7.8, 5mM MgCl2, 10mM NaCl, 2mM EDTA), 1x chloroplast isolation buffer with BSA (0.1% W/V), 40% percoll (4ml percoll and 6ml 1x CIB buffer with BSA) 및 80% percoll (8ml percoll and 2ml 1x CIB buffer with BSA)를 이용하였다.
모든 실험은 cold room or cold condition에서 신속하게 수행하였다. 잎맥 부분을 제외한 시금치 잎 35g을 획득하고, 시금치 잎을 에탄올로 소독한 가위를 이용하여 1cm 너비의 작은 조각으로 잘랐다. BSA가 들어있는 CIB buffer 120ml를 차가운 blender에 넣고 시금치 잎과 함께 2초간 10번 blending하였다. 위 용액을 ice 안에 있는 여러 겹의 거즈를 씌운 비커에 부어 filtration하였다. 걸러진 용액을 conical tube에 넣고 4℃ 2500RPM에서 70초간 centrifugation하였다. 상층액을 새로운 conical tube에 옮긴 후, 4℃ 2500RPM에서 7분간 centrifugation하였다. 상층액을 버리고 green pellet을 finger tapping으로 부드럽게 풀어주었다. Pellet을 2ml의 1x CIB buffer with BSA로 resuspend 해주고 pipetting하였다. 40%, 80% percoll 용액을 준비하여 3ml 80% percoll, 3ml 40% percoll, 6ml chloroplast suspension을 순서대로 조심스럽게 15ml conical tube에 넣어주었다. 4000RPM에서 10분간 centrifugation하였다. Intact chloroplast를 함유하는 80%/40% percoll층 사이의 용액만을 조심스럽게 따서 다른 conical tube로 옮겨주었다. 그 후, 얻어진 Pellet을 1x CIB buffer without BSA 10ml과 섞은 후, 호일로 감싸 냉장 보관하였다.
실시예 5. Chloroplast에 대한 DMSO 독성 평가
다음과 같은 방법으로 Peptide를 녹일 때 이용하는 DMSO(10mg/ml)가 chloroplast(1*108개/ml)에 시간별로 독성이 있는지 여부를 평가하였다.
0%와 1%의 DMSO를 준비하고, 1*108개/ml chloroplast in CIB 용액 1ml에 희석하여 0, 5, 10, 30, 60분간 처리하였다. 각 시간대 별로 용액을 10μl 따서 hemocytometer를 이용해 chloroplast의 수를 counting 하였다.
그 결과, DMSO를 처리하지 않은 control group과 1% DMSO를 처리한 group간의 유의미한 차이는 없어 1%의 DMSO는 chloroplast에 영향을 미치지 않는 것으로 확인하였다 (도 9 참조).
실시예 6. Chloroplast의 chlorophyll 측정
다음과 같은 방법으로 Chloroplast를 정량하기 위해 chlorophyll를 측정하였다.
CIB를 이용하여 2*108개/ml chloroplast를 0% 내지 100%까지 총 14구간으로 희석하였다. 각각 희석한 용액 250μl에 80% acetone (+5mg/ml pH7 EDTA) 250μl를 넣어주었다. 80% acetone(+5mg/ml pH7 EDTA)은 chloroplast를 깨서 chlorophyll 얻기 위하여 실시하여, 최종 농도가 1*108/ml인 용액을 얻었다 (100% 기준). Nanodropdrop을 이용하여 UV-VIS 645nm. 663nm에서의 흡광도를 측정하였다. 그 후, 하기 Arnon’s equation에 측정값을 대입하여 total chlorophyll의 μg/ml 값을 구했다.
<Arnon’s equation>
*Chlorophyll a (μg/ml) = 12.7 (A663) - 2.69 (A645)
*Chlorophyll b (μg/ml) = 22.9 (A645) - 4.68 (A663)
*Total chlorophyll (μg/ml) = 20.2 (A645) + 8.02 (A663)
실시예 7. chloroplast 외막과 CTP-FITC 결합 확인
7.1. 형광 이미지를 이용한 chloroplast 외막과 CTP-FITC 결합 확인
다음과 같은 방법으로 Peptide-FITC가 chloroplast의 외막에 anchoring 될 수 있는지 형광으로 확인하였다 (도 10a 참조).
실험 과정 동안 빛에 노출되지 않도록 주의하였다. 1*108개/ml chloroplast (control) 500μl, 1*108/ml chloroplast+CTP-FITC 500μl 준비하였다. 이 때, CTP-FITC는 합성 업체인 에니젠에 합성 의뢰하여 얻었다. 1*108개/ml chloroplast+CTP-FITC에서 CTP-FITC는 0.6mg/ml의 농도로 처리하였다. 이 때, 1*108개/ml chloroplast/ml (in CIB)에서 500μl를 취하고, CTP 10mg/ml (in DMSO)에서 30μl를 취해서 넣으면 최종 농도가 0.6mg/ml이 된다. 이 후, 1, 5, 10, 30, 60분마다 100μl씩 따서 고정하고, 시간별로 반응시킨 용액을 13500RPM에서 1분간 centrifugation하였다. Pellet을 얻어 2.5% glutaraldehyde (0.05M SCB) 고정액에 고정하고 (500μl, 15분), 미 반응의 CTP-FITC를 제거하기 위해 PBS로 2번 wash 진행하였다. 이후, CIB buffer로 500μl를 채운 뒤, 슬라이드 글래스/커버글래스를 이용하여 mounting하였다. Confocal microscope를 이용하여 형광사진을 촬영하고, 두께는 1μm 정도로 section하였다 (green 형광 (FITC) = 488nm, red 형광 (chloroplast auto 형광) = 580nm).
7.2. TEM을 이용한 chloroplast 외막과 CTP-FITC 결합 확인
다음과 같은 방법으로 Peptide-FITC가 chloroplast의 외막에 anchoring 될 수 있는지 TEM으로 확인하였다 (도 10b 참조).
상기 7.1의 방법과 동일한 시간(1, 5, 10, 30, 60분)으로 반응시킨 1*108/ml chloroplast (control) 500μl, 1*108/ml chloroplast + CTP-FITC 500μl를 2% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.05M sodium cacodylate buffer 고정액 1ml에 15분간 고정시켰다. 고정 후, 미반응의 CTP-FITC를 제거하기 위해서, PBS wash를 2번 반복하고 pellet을 얻었다. 얻어진 pellet에 2% glutaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0.05M sodium cacodylate buffer 1ml을 넣고 4℃에서 overnight 진행하였다. TEM 전처리 과정(chloroplast 고정 후 resin으로 block 제작) 진행 후, ultramicrotome을 이용하여 미세 박편을 제작하고 TEM을 찍어 확인하였으며, TEM 전처리과정부터는 서울대학교 농업생명대학 공동기기원에서 진행하였다.
7.3. 소결
상기 실험 결과, 5분 이상의 반응시간부터 CTP가 chloroplast의 외막에 anchoring되어 충분히 코팅되는 것을 확인할 수 있었고, 이후 CTP와 chloroplast의 반응 시간을 5분으로 설정하였다.
실시예 8. hydrogel의 gelation과 rheology test
8.1. Alginate-CTP hydrogel의 gelation과 rheology test (CIB)
다음과 같은 방법으로, CIB에서 Alginate-CTP와 CaCl₂용액의 gelation 정도를 확인하여 Alginate-CTP와 chloroplast를 anchoring 시킬 때 CIB를 이용해도 영향이 없는지를 확인하였다. 이 때, gelation 일어나지 않을 것이라 가정하였다.
- 그룹 (n=5)
(1) Alginate (control)
(2) Alginate-CTP (1:50)
Alginate (control), Alginate-CTP (1:50) 준비하고, 기존의 gelation 기능을 확인하기 위한 positive control인 100mM CaCl₂용액과 negative control인 Ca2+, Mg2+-free PBS, gelation이 일어나지 않을 것이라 예상하는 실험군인 CIB를 준비하였다. Alginate 혹은 Alginate-CTP 4mg, NaCl 4.5mg, 3차 증류수 500μl를 잘 섞었다. 48 well plate에 과정 3의 용액 250μl를 CIB와 30분간 반응시켰다. Rheometer를 통해 rheology를 측정하여 gel의 강도(gel의 특성을 지니는지)를 확인하였다.
8.2. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 gelation과 rheology test
다음과 같은 방법으로, Alginate-CTP 합성물과 chloroplast를 반응시켜 gelation이 일어나는지, 이에 따라 만들어진 hydrogel의 강도를 측정하기 위하여 실시하였다.
- 그룹 (n=5)
(1) Alginate (control)
(2) Alginate-CTP (1:1)
(3) Alginate-CTP (1:5)
(4) Alginate-CTP (1:10)
(5) Alginate-CTP (1:25)
(6) Alginate-CTP (1:50)
Alginate (control), Alginate-CTP (1:1, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50 molar ratio) 준비하고, Alginate 혹은 Alginate-CTP 4mg, NaCl 4.5mg, 3차 증류수 500μl를 잘 섞었다. 시금치로부터 당일 분리한 chloroplast를 1*108개/ml의 농도로 준비하였다. 48 well plate에 과정 2의 용액 250μl와 과정 3의 용액 250μl를 잘 섞어준 후, 100mM CaCl2와 30분간 반응시켰다. Rheometer를 통해 rheology를 측정하여 hydrogel의 강도 (hydrogel의 특성을 지니는지)를 확인하였다.
실시예 9. chloroplast 정량
9.1. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 잔여 용액을 이용한 chloroplast 정량
다음과 같은 방법으로, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 제거 후 잔여 용액을 이용하여 hydrogel 내의 chloroplast를 정량 하였다.
상기 9.2의 방법과 같이 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 만들고, hydrogel을 제외한 용액을 모두 회수하여 13,500RPM에서 1분간 centrifugation하였다. Pellet을 80% acetone 250μl에 suspension (vortexing & stay 3회 반복) 후 용해시켜주었다. Nanodropdrop을 이용하여 663nm, 645nm에서 흡광도 측정 후, 측정 값을 하기 Arnon’s equation에 따라 total chlorophyll (μg/ml) 양을 계산하였다.
<Arnon’s equation>
*Chlorophyll a (μg/ml) = 12.7 (A663) - 2.69 (A645)
*Chlorophyll b (μg/ml) = 22.9 (A645) - 4.68 (A663)
*Total chlorophyll (μg/ml) = 20.2 (A645) + 8.02 (A663))
9.2. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 내 존재하는 chloroplast 정량
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 내에 들어있는 chloroplast를 정량 하였다.
PBS에 5mg/ml로 EDTA를 넣고, pH를 7로 올려주었다. Alginate lyase를 EDTA solution에 넣고, Vortexing & stay를 3회 반복하였다. Hydrogel이 풀어지면 13500RPM에서 1분간 centrifugation하고, Pellet을 80% acetone 250μl에 suspension하였다. 이 후, Vortexing & stay를 3회 반복하여 dissolution시키고, Nanodrop drop을 이용하여 663nm, 645nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 측정된 흡광도를 하기 Arnon’s equation에 대입하여 total chlorophyll (μg/ml) 양을 계산하였다.
<Arnon’s equation>
* Chlorophyll a (μg/ml) = 12.7 (A663) - 2.69 (A645)
* Chlorophyll b (μg/ml) = 22.9 (A645) - 4.68 (A663)
* Total chlorophyll (μg/ml) = 20.2 (A645) + 8.02 (A663)
9.3. 소결
상기 실험 결과, 약 99%의 봉입률을 보여 1:1 및 1:5 합성 몰비를 갖는 Alginate-CTP의 hydrogel 효율이 매우 좋음을 확인하였다. 따라서 합성 몰비 1:1과 1:5 Alginate-CTP의 경우 거의 모든 chloroplast와 효과적으로 결합 가능함을 확인하였다 (도 11 참조).
실시예 10. 시간별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 gelation 확인 방법
다음과 같은 방법으로, 시간에 따라 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel이 풀어지는지 확인하였다.
상기 실시예 9의 방법에 따라 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 만들었다. 이 후, 4주 동안 hydrogel이 풀어지는지 rheometer를 통해 rheology test를 수행하여 hydrogel의 강도를 확인하였다.
실시예 11. HEK 293 T 세포에 대한 Chloroplast의 독성 평가 (CCK-8 assay)
Chloroplast가 세포에 영향을 미치는지 알기 위해 일반적인 세포 line인 HEK 293 세포를 이용하여 CCK-8 assay를 진행하여 결과를 확인하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석하였다.)
(1) Control (HEK 293 T 세포 + DMEM media)
(2) Chloroplast 1 * 102개/ml
(3) Chloroplast 1 * 104개/ml
(4) Chloroplast 1 * 106개/ml
(5) Chloroplast 1 * 108개/ml
(6) CIB
96 well plate에서 24시간 동안 안정화시킨 HEK 293 T 세포(3.5*10⁴개/well)을 준비하였다 (n=5). 준비된 각 그룹에 농도별로 준비한 chloroplast 용액을 100μl씩 처리하였다. 24시간 동안 incubation 후, chloroplast 용액을 suction하였다. PBS로 2번 wash하고 media(DMEM) 100μl + CCK solution 10μl를 처리하였다. 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, chloroplast 흡광도 영향 줄이기 위해 상층액만 50μl 따서 수행하였다.
그 결과, chloroplast의 농도가 높아지더라도 세포에는 독성이 없는 것으로 확인하였다 (도 12 참조). 108/ml 농도 chloroplast의 경우, chloroplast에 의해 흡광도가 높게 나온 것으로 판단된다.
실시예 12. Chloroplast의 산소 생성량 측정
12.1. 빛의 유무에 따른 Chloroplast의 산소 생성량 측정
다음과 같은 방법으로 빛의 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시켰다.)
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 1 * 102개/ml
(3) Chloroplast 1 * 104개/ml
(4) Chloroplast 1 * 106개/ml
(5) Chloroplast 1 * 108개/ml
96 well plate에 CIB를 이용하여 그룹에 맞게 chloroplast를 희석 후 300μl를 넣어 준비하였다. 빛 (660nm) 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이때, 산소 센서는 OxyLite (Oxford Optronix, U.K.)를 이용하였다. 물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하였다. 산소 센서를 이용하여 0, 30, 60, 120min 단위로 산소 생성량을 측정하였다 (reading time: 3min).
그 결과, 빛(660nm)에 노출시키지 않은 그룹(No Light)에서는 최대 6.5% 더 높은 산소 생성 수준을 보였지만, 빛(660nm) 조건 하에서는 control 그룹은 가시광선과 동일한 수준의 산소 생성량을 보인 반면, chloroplast가 삽입된 그룹의 경우 최대 9.3% 더 높은 산소 생성량을 보였다. 고농도의 chloroplast 농도에서는 오히려 산소 생성이 대조군보다 감소함을 확인하였다 (도 13 참조).
12.2. 빛의 유무에 따른 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량 측정
다음과 같은 방법으로 빛의 유무에 따른 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시켰으며, 합성 비율은 alginate:peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 1 * 102개/ml
(3) Chloroplast 1 * 104개/ml
(4) Chloroplast 1 * 106개/ml
(5) Chloroplast 1 * 108개/ml
96 well plate에 그룹에 맞게 chloroplast를 넣어 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 만들었다. 빛 (660nm) 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 OxyLite (Oxford Optronix, U.K.)를 이용하였다. 물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하였다. 산소 센서를 이용하여 0, 30, 60, 120min 단위로 산소 생성량을 측정하였다 (reading time: 3min).
그 결과, 시간이 지날수록 산소 분압 생성량이 약 105%까지 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 빛(660nm) 조건 하에서는 더 많은 산소 생성량을 확인했다. 반면, 빛(660nm)에 노출되지 않은 경우 산소 생성량이 초반에는 증가는 양상을 보이지만, 120분 후에는 감소하는 모습을 보였다. Chloroplast가 108/ml 들어있는 hydrogel의 경우 빛(660nm) 조건 하에서는 약 95%까지 감소하는 것을 확인하였다 (도 14b 참조).
이는 hydrogel이 아닌 chloroplast 자체의 산소 농도를 측정했던 조건과 비교하였을 때(약 55%)에 비하여 증가된 것을 나타낸다.
실시예 13. 정상산소 및 저산소 상태에서의 산소 생성량 측정
13.1. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 정상산소 및 저산소 상태에서의 산소 생성량 측정
다음과 같은 방법으로, 정상산소 및 저산소 상태에서 빛 노출 시에 따른 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시켰으며, 합성 비율은 alginate:peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 1 * 102개/ml
(3) Chloroplast 1 * 104개/ml
(4) Chloroplast 1 * 106개/ml
(5) Chloroplast 1 * 108개/ml
96 well plate에 그룹에 맞게 chloroplast를 넣어 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 만들었다. 상기 96 well plate를 하기와 같은 조건으로 정상산소 및 저산소 상태로 구현하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경 구현
- 저산소 상태: 저산소 챔버 (hypoxia chamber) 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2 + 5% CO2 + 1% O2)를 주입해 1% 산소 환경 구현
이 후, 정상산소 및 저산소 상태에서 빛 노출 시에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 OxyLite (Oxford Optronix, U.K.)를 이용하였다. 물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하고, 상기 산소 센서를 이용하여 0, 30, 60, 120min 단위로 산소 생성량을 측정하였다 (reading time: 3min).
그 결과, Chloroplast가 삽입된 그룹에서 대조군보다 높은 수준의 산소 생성량을 확인하였고 (약 8% 증가), 정상산소 상태보다 저산소 상태에서 산소 생성 수준이 더욱 효과적임을 확인하였다. 고농도의 Chloroplast 그룹에서는 산소 생성량이 정상산소 및 저산소 상태 모두에서 감소함을 확인하였다 (도 16 참조).
13.2. 정상산소 상태와 저산소 상태에 따른 각 그룹별 산소 생성량 측정
다음과 같은 방법으로, 정상산소 및 저산소 상태에서 빛 노출 시에 따른 실험 군별 (free chloroplast, Alginate-Chloroplast hydrogel, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel)의 산소 생성량을 확인하였다.
- 실험군
(1) Free chloroplast
(2) Alginate-Chloroplast hydrogel
(3) Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel
- 각 그룹별 농도 (n=5, CIB를 이용해 희석하였고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 1 * 102개/ml
(3) Chloroplast 1 * 104개/ml
(4) Chloroplast 1 * 106개/ml
(5) Chloroplast 1 * 108개/ml
96 well plate에 농도에 맞게 chloroplast를 넣어 free chloroplast, Alginate-Chloroplast hydrogel, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel을 만들었다. 각 실험 군별 만들어진 96 well plate를 하기와 같이 정상산소 및 저산소 상태로 구현하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경 구현
- 저산소 상태: 저산소 챔버 (hypoxia chamber) 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소 환경 구현
정상산소 및 저산소 상태에서 빛 노출 시에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때 산소 센서는 OxyLite (Oxford Optronix, U.K.)를 이용하였다.
물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하고, 산소 센서를 이용하여 6일 간 산소 생성량을 측정하였다 (24시간 간격). 측정 5일차에는 정상산소 환경으로 바꾸어 산소 생성량을 측정하였다.
그 결과, Free chloroplast 그룹은 5일 동안 심각한 저산소혈증 수치인 40㎜Hg (69.5μM/L)보다 높은 산소 농도를 유지했다. 또한, 측정 5일차에 정상산소 농도에 24시간 동안 노출된 결과, free chloroplast 그룹 대부분이 초기 산소 농도로 회복된 것을 확인하였다. 하지만 이전의 실험 결과와 마찬가지로 대조군과 고농도(108/ml)에서는 낮은 수준의 산소 농도가 측정되었다. 특히 고농도 그룹은 측정 5일차에 정상산소 상태에서 산소 농도를 회복하지 못했음을 확인하였다 (도 17a 참조). AC 그룹에서 모든 농도 그룹의 산소 농도는 48시간 이내에 0 μM/L로 측정되었다. 따라서 AC는 저산소 상태에서 chloroplast에 의한 산소를 생성하지 못하는 것으로 확인되었다 (도 17b 참조). 또한, ACC 그룹은 free chloroplast와 유사한 산소 생성 패턴을 보였다. 대조군과 고농도(108/ml)를 제외하고 ACC 그룹은 심각한 저산소혈증 수치인 40 mmHg(69.5 μM/L) 이상의 산소 농도를 유지하였다. 종합적으로 저산소 조건에서 ACC 그룹은 free chloroplast와 유사한 산소 생성 패턴을 보였으며, 특히 농도 102/ml, 104/ml, 106/ml에서 산소를 보다 더 잘 생성하는 것으로 확인되었다 (도 17c 참조).
실시예 14. 과산화수소 농도 측정
하기와 같은 방법으로 고농도의 chloroplast 그룹에서 산소 생성량이 감소하는 이유를 확인하였다.
재료는 (1) ABTS (548.68g/mol), (2) HRP (peroxidase, 250units/ml), (3) H202 solution (standard curve용, 8.943M(9M/L)) 및 (4) Chloroplast (0-3X108개/ml)를 이용하였다.
- 그룹
(1) Free chloroplast
(2) Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel
- 각 그룹별 농도 (n=5)
※ 시료를 넣게 되면 농도가 3배 희석되기 때문에 희석했을 때의 농도를 고려하였다.
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 3 * 102개/ml
(3) Chloroplast 3 * 104개/ml
(4) Chloroplast 3 * 106개/ml
(5) Chloroplast 3 * 108개/ml
96 well plate에 농도에 맞게 chloroplast를 넣어 free chloroplast, Alginate-CTP- Chloroplast hydrogel을 만들었다.
이후, 하기와 같이 ABTS assay에 필요한 시료를 준비하였다.
- ABTS 1.2mM 준비: 65.8mg/100ml -> 0.4mM (3차 증류수로 희석)
- HRP 3unit/ml 준비: 1.2mg/100ml -> 1unit/ml (3차 증류수로 희석)
- H2O2 solution 농도별 준비: 3mM에서 3차 증류수로 serial dilution을 이용하여 1, 0.5, 0.25, 0.125mM으로 만들었다.
Standard curve를 만들기 위해 HRP 1ml, 농도별 H2O2 1ml를 넣은 후, ABTS 1ml 넣었다. HRP:H2O2:ABTS = 1:1:1 반응시키고, ABTS를 마지막에 넣었다. 상기 용액 200μl를 따서 96 well plate에 옮긴 후, 5분 반응시키고, Plate reader기에 넣어 405nm에서 흡광도를 확인하였다. Chloroplast에서 생성된 H2O2를 확인하기 위해 갈색 epen tube에 chloroplast를 농도별로 1ml, HRP 1ml를 넣은 후, ABTS 1ml 넣었다. 이 때, Chloroplast는 빛에 민감하기 때문에 갈색 tube를 사용하였다. 3분간 반응시킨 후, 13500RPM에서 2분간 centrifugation 하였다. 이후, 상층액 200μl 따서 96 well plate에 옮긴 후, plate reader기에 넣어 405nm에서 흡광도를 확인하였다. Chloroplast 자체의 색으로 인해 흡광도의 영향을 받을 수 있어서 상층액만을 획득하였다.
상기 방법에 의해 과산화 수소 생성량을 확인한 결과, Free chloroplast와 ACC 그룹 모두 고농도의 chloroplast 농도에서 유의한 수준의 높은 hydrogen peroxide 생성량을 보였다. 따라서 고농도의 chloroplast를 처리할 경우, 과산화수소가 과다하게 생성되어 오히려 산소 생성량을 감소시킬 수 있음을 확인하였다 (도 18 참조). (N.S.: statistically no significant, *P≤0.05, **P≤0.01, ***P ≤ 0.001, n=5, Results are shown as mean ± S.E.M)
실시예 15. INS-1 세포에 대한 Alginate-CTP의 독성 평가
15.1. CCK-8 assay를 통한 INS-1 세포에 대한 Alginate-CTP의 독성 평가
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 용액이 INS-1 세포에 독성이 있는지 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 용해시켰고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (INS-1 세포 + RPMI media)
(2) Alginate-CTP 2mg/ml
(3) Alginate-CTP 4mg/ml
(4) Alginate-CTP 6mg/ml
(5) Alginate-CTP 8mg/ml
(6) Alginate-CTP 10mg/ml
(7) Alginate-CTP 12mg/ml
(8) Alginate-CTP 14mg/ml
(9) Alginate-CTP 20mg/ml
96 well plate에서 24시간 동안 안정화시킨 INS-1 세포 (3*104개/well)을 준비하였다 (n=5). 각 그룹에 농도별로 준비한 Alginate-CTP 용액을 100μl씩 처리하였다. 24시간 동안 incubation 후, Alginate-CTP 용액을 suction하였다. PBS로 2번 wash하고 media(RPMI) 100μl + CCK solution 10μl를 처리하고, 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 연구에서 사용하는 농도인 8 mg/ml은 대조군의 생존율과 유의한 차이를 보이지 않았다 (도 19a 참조).
15.2. Live & Dead assay를 통한 INS-1 세포에 대한 Alginate-CTP의 독성 평가
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 용액이 INS-1 세포 line에 독성이 있는지 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 용해시켰으며, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (INS-1 세포 + RPMI media)
(2) Alginate-CTP 2mg/ml
(3) Alginate-CTP 4mg/ml
(4) Alginate-CTP 6mg/ml
(5) Alginate-CTP 8mg/ml
(6) Alginate-CTP 10mg/ml
(7) Alginate-CTP 12mg/ml
(8) Alginate-CTP 14mg/ml
(9) Alginate-CTP 20mg/ml
96 well plate에서 24시간 동안 안정화시킨 INS-1 세포 (3*104개/well)을 준비하였다 (n=5). 각 그룹에 농도별로 준비한 Alginate-CTP 용액을 100μl씩 처리하고, 24시간 동안 incubation 후, Alginate-CTP 용액을 suction하였다. 이후, PBS로 2번 wash하고, 1μM Calcein-AM와 1μM Ethidium homodimer-1 (EthD-1)로 만든 시약을 각 well에 100μl씩 처리하고, 10분 동안 incubation을 진행하였다. 그리고 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포(green 형광)와 죽은 세포(red 형광)를 확인한 후, 사진을 촬영하였다.
그 결과, 유사한 수준의 green signal을 확인하였다. 따라서 본 농도는 단일 세포에 독성이 없음을 확인하였다 (도 19b 참조).
실시예 16. 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 제조
16.1. Rat로부터 췌장 세포를 분리
다음과 같은 방법으로 Rat의 췌장으로부터 인슐린을 분비하는 췌장 세포를 분리하였다.
재료는 (1) SD 계통의 Rat (6-7주령, male), (2) 수술 도구 (mirco-scissors, forceps 등), (3) Collagenase 1mg/ml (pH 7.8 HBSS buffer로 희석) 및 (4) 10ml 주사기를 이용하였다.
Rat에 5-10분간 100% CO2 가스를 주입하여 안락사시키고, 호흡이 멈췄거나, 심장 박동이 정지되어 있는 것을 확인하였다. 배 부위의 외피와 내피를 제거하고, 간을 들어 올려 췌장을 찾고, 췌장을 집게로 펼치면서 간과 연결된 부분인 duct (혈관)를 찾았다. Duct를 팽팽하게 당긴 후, 끊어지지 않을 만큼 살짝 가위로 흠집을 내어 세포외 기질(ECM)을 제거할 수 있는 collagenase를 duct를 통해 주사기로 1마리당 10ml씩 넣었다. 수술 도구를 이용해 장과 간, 위, 비장으로부터 부풀어 오른 췌장을 분리하였다. 췌장을 물리적 및 화학적 정제를 통하여 순도 높은 췌장 세포를 얻고, 광학 현미경을 통해 췌장 세포 외에 여러 debris 혹은 불순물 등을 제거하였다. 췌장 세포의 회복 및 안정화를 위해 24시간 동안 incubation을 진행하였다.
16.2. 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 제조
16.2.1. Alginate-CTP 합성물을 농도별로 처리한 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 제조
다음과 같이 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 상기 분리된 췌장 세포를 봉입하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 용해시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Alginate-CTP 8mg/ml
(3) Alginate-CTP 16mg/ml
24시간 동안 안정화시킨 상기 분리된 췌장 세포를 media(RPMI)로 wash 2회 진행하였다. 시금치로부터 당일 분리한 chloroplast 용액을 4*106개/ml의 농도로 준비하였다. 세포 실험을 위해, chloroplast를 희석시킬 때 media (RPMI +10% FBS) 사용하였다. 20개의 췌장 세포 (20IEQ)를 상기 준비된 용액 250μl와 잘 섞어주었다.
0, 8, 16mg/ml의 농도로 만든 Alginate-CTP 합성물을 준비하고, 상기 용액을 섞어 100mM CaCl2 용액에 넣어 30분간 반응시켰다. 만들어진 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 1개씩 96 well plate의 각 well (RPMI +10% FBS+1% PS, 200μl)에 넣어서 24시간 동안 incubation 시켰다.
16.2.2. Chloroplast를 농도별로 처리한 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 제조
다음과 같이, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 췌장 세포를 봉입하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 4 * 104개/ml
(3) Chloroplast 4 * 106개/ml
24시간 동안 안정화시킨 췌장 세포를 media (RPMI)로 wash 2회 진행하였다. 시금치로부터 당일 분리한 chloroplast를 4*106개/ml의 농도로 준비하였다. 세포 실험을 위해, chloroplast를 희석시킬 때 media (RPMI +10% FBS) 사용하였다. 20개의 췌장 세포 (20IEQ)를 상기 분리된 chloroplast 용액 250μl와 잘 섞어주었다. 8mg/ml의 농도로 만든 Alginate-CTP 합성물을 준비하였다. 세포 실험을 위해, Alginate-CTP를 용해시킬 때 media (RPMI +10% FBS) 사용하였다. 상기의 용액과 Alginate-CTP 합성물을 섞어 100mM CaCl2 용액에 넣어 30분간 반응시켰다. 만들어진 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 1개씩 96 well plate의 각 well (RPMI +10% FBS +1% PS, 200μl)에 넣어서 24시간 동안 incubation 시켰다.
16.2.3. 저산소 환경에서 Chloroplast를 농도별로 처리한 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 제조
다음과 같이 저산소 환경에서 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 췌장 세포를 봉입하였다.
- 그룹 (n=6)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate-CTP hydrogel: 저산소 환경
(6) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 104개/ml) hydrogel: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 106개/ml) hydrogel: 저산소 환경
실험 동물(Rat)로부터 분리한 췌장 세포를 media (RPMI)로 wash 2회 진행하였다. 시금치로부터 당일 분리한 chloroplast를 농도별로 준비하였다. 세포 실험을 위해, chloroplast를 희석시킬 때 media (RPMI +10% FBS) 사용하였다. 20개의 췌장 세포 (20IEQ)를 과정 2의 용액 250μl와 잘 섞어주었다. 8mg/ml의 농도로 만든 Alginate-CTP 합성물을 준비하였다. 세포 실험을 위해, Alginate-CTP를 용해시킬 때 media (RPMI +10% FBS) 사용하였다. 상기 용액들을 섞어 100mM CaCl2 용액에 넣어 30분간 반응시켰다. 만들어진 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel 1개씩 6 well plate의 각 well (RPMI +10% FBS +1% PS, 1ml)에 넣었다. 상기 그룹 (1), (2), (3), (4) 또한 6 well plate의 각 well (RPMI +10% FBS +1% PS, 200μl)에 넣고, 상기 6 well plate를 하기와 같은 정상산소 및 저산소 상태로 구현하고, 24시간 동안 incubation 시켰다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경 구현
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경 구현
실시예 17. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 독성 평가
17.1. Alginate-CTP 합성물을 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 독성 평가
17.1.1. CCK-8 assay를 통한 독성 평가
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 합성물을 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 용해시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Alginate-CTP 8mg/ml
(3) Alginate-CTP 16mg/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 Alginate-CTP를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번 wash하고 media(RPMI) 100μl + CCK solution 10μl를 처리하였다. 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 연구에서 사용하는 농도인 8mg/ml은 대조군의 생존율과 유의한 차이를 보이지 않았다 (도 20a 및 20b 참조).
17.1.2. Live & Dead assay를 통한 독성 평가
다음과 같은 방법으로 Alginate-CTP 합성물을 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 용해시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Alginate-CTP 8mg/ml
(3) Alginate-CTP 16mg/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 Alginate-CTP를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번하고, 1μM Calcein-AM와 1μM Ethidium homodimer-1 (EthD-1)로 만든 시약을 각 well에 100μl씩 처리하고, 30분 동안 incubation을 진행하였다. 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포(green 형광)와 죽은 세포(red 형광)를 확인한 후, 사진을 촬영하였다.
그 결과, Live & Dead assay를 통해서도 유사한 수준의 green signal을 확인하였다 (도 20c 참조). 따라서 본 농도는 단일 세포 뿐만 아니라 세포 집단에도 독성이 없음을 확인하였다.
17.2. Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 독성 평가
17.2.1. CCK-8 assay를 통한 독성 평가
다음과 같이 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 1 * 104개/ml
(3) Chloroplast 1 * 106개/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번 wash하고 media(RPMI) 100μl + CCK solution 10μl를 처리하였다. 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, chloroplast의 농도와 관계없이 모든 농도 그룹의 생존율은 대조군과 유의한 차이가 없었다 (도 21a 및 21b 참조).
17.2.2. Live & Dead assay를 통한 독성 평가
다음과 같이 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 1 * 104개/ml
(3) Chloroplast 1 * 106개/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번 wash하고, 1μM Calcein-AM와 1μM Ethidium homodimer-1 (EthD-1)로 만든 시약을 각 well에 100μl씩 처리하였다. 30분 동안 incubation을 진행하고, 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포(green 형광)와 죽은 세포(red 형광)를 확인한 후, 사진을 촬영하였다.
그 결과, Live & Dead assay를 통해 강한 green signal을 확인하였다 (도 21c 참조). 따라서 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel은 chloroplast 농도에 관계없이 췌장 세포에 독성이 없는 소재임을 확인하였다.
17.3. 저산소 환경에서 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 독성 평가 (CCK-8 assay)
다음과 같이 저산소 환경에서의 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하기 위하여 실시하였다.
- 그룹 (n=6)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate-CTP hydrogel: 저산소 환경
(6) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 104개/ml) hydrogel: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 106개/ml) hydrogel: 저산소 환경
정상산소 및 저산소 환경에서 24시간 동안 incubation 시킨 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 각 그룹별로 준비하였다. 모든 그룹을 PBS로 2번 wash하고 media(RPMI) 100μl + CCK solution 10μl를 처리하고, 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 후 Quant-iT™ PicoGreen™ dsDNA Assay Kits를 이용하여 각 실험 군에 대하여 DNA양을 통하여 흡광도 값을 보정하였다.
그 결과, 저산소 환경의 췌장 세포에서 장시간 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율(Cell Viability)가 췌장 세포의 생존율이 IH 그룹을 제외하고는 IN 그룹과 대비했을 때 유의하게 감소하지 않을 것을 확인할 수 있다. IH 그룹은 24시간동안 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율 약 18% 감소하였음을 확인할 수 있었으며, 이는 췌장 세포가 배양되기에 저산소 환경이 적절하지 않다는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast(4, 6그룹)는 IN 그룹보다 세포 생존율이 감소했지만 이는 유의하지 않은 결과로 확인되었으며, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel은 chloroplast의 농도에 관계없이 Alginate-CTP-Chloroplast 소재가 췌장 세포에 대하여 독성을 가지지 않는 다는 것을 의미한다. 또한, 저산소 환경에서 0, 4, 6그룹이 IH 그룹에 비하여 세포 생존율이 높아지는 것으로 보아, 이는 Alginate- CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포는 저산소 환경에서 배양되기에 적절한 조건을 가질 수 있다는 것을 의미한다 (도 32 참조).
실시예 18. 췌장 세포를 봉입하고 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량 측정
다음과 같이 췌장 세포를 봉입하고 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 1 * 104개/ml
(3) Chloroplast 1 * 106개/ml
췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. Oxygen plate reader well plate(24well)의 각 well에 과정 1의 hydrogel을 1개씩 넣고 30시간 동안 incubation을 진행하면서 0, 6, 12, 18, 24, 30시간을 단위로 산소 센서를 이용하여 산소 생성량을 측정하였다. 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였고, Oxygen plate reader well plate(24well)는 SDR SensorDish 전용 well plate를 이용하였다.
그 결과, 시간이 지남에 따라 산소 생성량이 꾸준히 증가하였고, chloroplast가 없는 대조군보다 chloroplast가 삽입된 그룹에서 더 높은 수준의 산소 생성량을 보였다 (도 22a 참조). 또한, 24시간을 기준으로 측정한 결과, chloroplast가 104개/ml의 농도로 삽입된 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에서 chloroplast가 없는 대조군보다 매우 유의하게 높은 산소 생성량을 나타내는 것으로 확인하였다 (도 22b 참조).
실시예 19. Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 기능성 확인
19.1. Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 기능성 확인
19.1.1. Glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay를 통한 확인
다음과 같이 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 기능을 확인하였다.
재료는 (1) Low glucose (2.8mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석) 및 (2) High glucose (20.2mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석)를 이용하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 1 * 104개/ml
(3) Chloroplast 1 * 106개/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번 wash하고 low glucose (2.8mM)를 각 well에 200μl씩 분주하고 30분 incubation하였다. Low glucose (2.8mM)를 다시 각 well에 200μl씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 low glucose 용액을 회수하였다. 그리고 High glucose (20.2mM)를 각 well에 200μl씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 high glucose 용액을 회수하였다. Insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay를 이용해 회수한 low glucose, high glucose 용액을 바탕으로 인슐린 분비 양을 측정 및 계산하였다.
그 결과, Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포는 chloroplast의 농도에 관계없이 대조군(intact islet)과 유사한 수준의 인슐린 분비량을 보였다 (도 23 참조). 상기 결과는 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel은 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 능력을 잘 유지시켜주며 세포의 기능에 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
19.1.2. dsDNA assay를 통한 확인
다음과 같이 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포에서 분비된 인슐린 양을 췌장 세포의 크기로 보정해주기 위해 실시하였다.
- 그룹 (n=5, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control (췌장 세포 + RPMI media)
(2) Chloroplast 1 * 104개/ml
(3) Chloroplast 1 * 106개/ml
24시간 동안 96 well plate에서 incubation 시킨 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 준비하였다. 모든 hydrogel을 PBS로 2번 wash하고, 0.1M EDTA (pH7.8) 용액을 각 well에 200μl씩 분주하고 충분한 pipetting을 통하여 hydrogel을 부쉈다. 이 때, hydrogel 내에 존재하는 췌장 세포를 꺼내기 위하여 실시하였다. 상기 용액을 각각 1.5ml tube에 회수하여 1800RPM에서 2분간 centrifugation하였다. 상층액을 제거하고 pellet(췌장 세포)에 RIPA buffer 1ml씩 처리하였다. dsDNA assay를 통하여 각 well (Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel)에 존재했던 췌장 세포가 분비해낸 인슐린의 양을 보정해주었다.
19.2. 저산소 환경에서 Chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 기능성 확인
19.2.1. Glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay를 통한 확인
다음과 같이 저산소 환경에서 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 기능을 확인하였다.
- 재료
(1) Low glucose (2.8mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석)
(2) High glucose (20.2mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석)
- 그룹 (n=6)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate-CTP hydrogel: 저산소 환경
(6) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 104개/ml) hydrogel: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 106개/ml) hydrogel: 저산소 환경
정상산소 및 저산소 환경에서 24시간 동안 incubation 시킨 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 각 그룹별로 준비하였다. 모든 그룹을 PBS로 2번 wash하고 low glucose (2.8mM)를 각 well에 200μl씩 분주하고 30분 incubation하였다. Low glucose (2.8mM)를 다시 각 well에 200μl씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 low glucose 용액을 회수하였다. High glucose (20.2mM)를 각 well에 200μl씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 high glucose 용액을 회수하였다. Insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay를 이용해 회수한 low glucose, high glucose 용액을 바탕으로 인슐린 양을 측정 및 계산하였다.
그 결과, 췌장 세포의 인슐린 분비능이 IH 그룹을 제외하고는 IN 그룹과 대비했을 때 유의하게 감소하지 않을 것을 확인할 수 있다. IH 그룹은 저산소 환경에 24시간 동안 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 인슐린 분비능이 감소된 것으로 확인된다. Alginate-CTP-Chloroplast group은 IN그룹과 유사한 췌장 세포의 포도당 반응 지수(Stimulation index, SI)를 나타내고 있으므로, 이는 Alginate-CTP- Chloroplast group (4, 6그룹)이 저산소 환경에 노출되었음에도 불구하고 인슐린 분비능이 감소하지 않았다는 것을 의미한다. 또한, 저산소 환경에서 0, 4, 6그룹이 IH 그룹에 비하여 인슐린 분비능이 유의하게 높은 것으로 보아 이는 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포는 저산소 환경에서 배양되었음에도 불구하고 인슐린 분비능이 감소하지 않았으며, 저산소 환경에서 배양되기에 적절한 조건을 가질 수 있다는 것을 의미한다.
19.2.2. dsDNA assay를 통한 확인
다음과 같이 저산소 환경에서 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel에 봉입된 췌장 세포에서 분비된 인슐린 양을 췌장 세포의 크기로 보정하였다.
- 그룹 (n=6)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 5 molar ratio로 고정
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate-CTP hydrogel: 저산소 환경
(6) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 104개/ml) hydrogel: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (1 * 106개/ml) hydrogel: 저산소 환경
정상산소 및 저산소 환경에서 24시간 동안 incubation 시킨 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입하고 chloroplast를 농도별로 처리한 Alginate-CTP-Chloroplast hydrogel를 각 그룹별로 준비하였다. 모든 그룹을 PBS로 2번 wash하고, 0.1M EDTA (pH7.8) 용액을 각 well에 200μl씩 분주하고 충분한 pipetting을 통하여 세포 및 hydrogel을 부수었다. (hydrogel 내에 존재하는 췌장 세포를 꺼내기 위하여 실시하였다.) 상기 용액을 각각 1.5ml tube에 회수하여 1800RPM에서 2분간 centrifugation하고, 상층액을 제거하고 pellet(췌장 세포)에 RIPA buffer 1ml씩 처리하였다. dsDNA assay를 통하여 각 well (Alginate-CTP-Chloroplast)에 존재했던 췌장 세포가 분비해낸 인슐린의 양을 보정하였다.
실시예 20. 빛(660nm) 조건 하의 농도별 chloroplast의 산소 생성량 측정
20.1. Hypoxia Chamber를 이용한 산소 생성량 측정
다음과 같이 저산소 환경에서의 빛(660nm)의 유무에 따른 농도별 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹
(1) 빛(660nm) 노출 그룹
(2) 빛(660nm) 미 노출 그룹
- 각 그룹별 농도 (n=6)
* 1) 내지 4)는 CIB를 이용해 희석시킨다.
1) Control (CIB)
2) Chloroplast 1 * 106개/ml
3) Chloroplast 1 * 107개/ml
4) Chloroplast 1 * 108개/ml
* 5) 내지 6)은 Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시켰다.
5) Control (Media)
6) Chloroplast 1 * 106개/ml
7) Chloroplast 1 * 107개/ml
8) Chloroplast 1 * 108개/ml
Oxygen plate reader well plate(24well)에 각 그룹에 맞는 농도별 chloroplast를 1ml씩 분주하고, 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 저산소 챔버 (hypoxia chamber) 실험 기구 (도 24 참조)에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소 환경 구현
물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하였다. 빛 노출 그룹에만 해당하며, 빛 미 노출 그룹은 빛 없이 진행하였다. 이 후, 빛 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다 (reading time : 30min). 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
그 결과, 각 그룹에 대하여 Chloroplast농도에 따라 저산소 환경이 구현된 상태의 Chloroplast의 초기 산소 농도가 다르다는 확인할 수 있으며, 이는 Chloroplast의 농도에 생성되는 산소량이 다르다는 것을 의미한다 (도 26a 참조). 또한, 빛(660nm)에 의한 영향은 108개/ml의 Chloroplast에서 Light에 노출하지 않은 그룹에 비하여 Light에 20시간동안 노출시킨 그룹이 유의미하게 산소 농도가 증가되는 경향을 확인할 수 있었다 (도 25b 및 25c 참조).
20.2. 온도 조절형 Desiccator를 이용한 산소 생성량 측정
다음과 같이 저산소 환경에서의 빛(660nm)의 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹
(1) 빛(660nm) 노출 그룹 (Light)
(2) 빛(660nm) 미 노출 그룹 (No Light)
- 각 그룹별 농도 (n=24, Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시켰다.)
(1) Control (Media)
(2) Chloroplast 1 * 108개/ml
Oxygen plate reader well plate(24well)에 각 그룹에 맞는 농도별 chloroplast를 1ml씩 분주하였다. 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator (도 26 참조)에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경 구현
물질과 빛 사이의 거리는 5cm로 설정하였다. 이 때, 빛 노출 그룹에만 해당하며, 빛 미 노출 그룹은 빛 없이 진행하였다. 빛 유무에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 20시간 동안 산소 센서를 이용하여 측정하였다. (reading time : 30min) 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
그 결과, 대조군 Media(RPMI +1% PS, 10% FBS)에 대비하여 chloroplast(108개/ml)에서 산소 농도가 유의하게 높은 산소 농도가 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 27a 참조). 또한, 20시간 동안의 전체 산소 농도를 비교해 보았을 때(AUC), Chloroplast그룹에서 대조군 대비 약 48%더 높은 산소 농도를 확인할 수 있었으며 (도 27b 참조), 이를 1분당 산소 생성량으로 환산한다면 (전체 산소 생성량/1200min), 37℃에서 108개/ml chloroplast는 평균적으로 1분당 14.8mmHg에 해당하는 산소를 대조군에 비하여 더 많이 생성시킬 수 있다는 것을 의미한다. 상기 결과는 이는 대조군에 비하여 chloroplast가 산소를 생성시키는 효과 있다는 것을 의미한다.
실시예 21. chloroplast의 저산소 환경에서의 산소 생성량 측정
21.1. 온도 조건에 따른 산소 생성량 측정
다음과 같이 저산소 환경에서의 온도에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=24)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* Chloroplast의 농도는 1 * 108개/ml로 고정한다.
(1) 25℃
(2) 37℃
Oxygen plate reader well plate(24well)에 그룹에 맞게 온도를 미리 맞추어 준비한 chloroplast를 1ml씩 분주하였다. 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소 환경 구현
온도에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
그 결과, 25℃ chloroplast가 시간에 따른 산소 농도 변화량이 적은 것으로 확인되었으며, 이는 37℃ chloroplast에 비해 동일한 농도까지 도달하는 데 시간이 오래 소요된다는 것을 의미한다 (도 29a 참조). 또한, 20시간동안의 전체 산소 생성량을 비교하기 위하여, AUC를 비교했을 때, 25℃ chloroplast가 37℃ chloroplast에 비하여 약 25% 정도 더 산소를 많이 생성하지만 이는 유의하지 않은 결과이다.
또한, 각 그룹에서 초기 산소 농도에 비해 각 시간 별로(0, 5, 10, 20 시간) 산소 농도가 감소하는 정도를 그래프로 비교하였을 때, 37℃ chloroplast 보다 25℃ chloroplast에서 감소한 정도가 더 낮을 것을 확인하였다 (도 29b 참조). 이는 25℃ 환경이 37℃ 환경보다 chloroplast의 photosynthetic activity를 더 오래 유지할 수 있다는 것을 의미하여, 이를 통해 더 결과적으로 산소를 더 많이 생성시킬 수 있다는 것을 의미한다.
상기 결과로 확인하였을 때, 주변 환경이 25℃로 주어졌을 때, Chloroplast가 최대로 산소를 생성시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 하지만, [The structural integrity of the islet in vitro: the effect of incubation temperature ; A Ilieva , S Yuan]을 참고하였을 때, 24℃에서 배양 된 췌장 세포는 12일간 배양했을 때, 그 형태를 잃어버렸으며, 약 40%의 정도의 세포가 사멸되었다는 것을 확인하였다. 또한, 24℃에서 인슐린 면역 활성은 점점 더 분포의 균질성이 감소했으며, 12일째에는 인슐린 면역 활성 영역이 췌장 세포 전체의 19±9%로 현저하게 감소했다는 것을 확인하였다.
이에 의해, 추후 실험에 사용되는 췌장 세포의 인슐린 분비능이 감소할 것을 고려하여, 이 후 실험은 37℃의 환경에서 진행하였다.
21.2. 빛 조건에 따른 산소 생성량 측정
21.2.1. 빛(660nm)의 세기(lux)에 따른 산소 생성량 측정
다음과 같이 저산소 환경에서의 빛(660nm)의 세기(lux)에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=24)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* Chloroplast의 농도는 1 * 108개/ml로 고정한다.
* 온도는 37℃로 고정한다.
(1) Light 1500lux
(2) Light 1000lux
(3) Light 500lux
Oxygen plate reader well plate(24well)에 1*108개/ml 농도의 chloroplast를 1ml씩 분주하였다. 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경 구현
물질과 빛 사이의 거리는 5cm, 10cm, 15cm로 설정하고, 빛의 세기에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 상기 물질과 빛 사이의 거리는 5cm, 10cm, 15cm에 따라 물질에 도달하는 빛의 세기는 1500lux, 1000lux, 500lux로 달라질 수 있다. 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
그 결과 빛의 세기가 작을수록 초기 산소 농도가 높아지는 것을 확인할 수 있으며, 이후 20h 동안 거의 일정하게 유지되는 경향을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다 (도 30a 참조). 또한, 빛의 효과로 추정되는 1시간 동안 산소 농도가 20mmHg가 증가하는 것은 공통적인 양상을 가지고 있는 것으로 확인되며, 이는 빛의 세기에 따른 빛의 효과 즉, chloroplast의 산소 생성량에 차이가 생기지 않는 다는 것을 의미한다. 즉, 이후 실험에서 빛의 세기가 아닌 빛의 노출 시간을 조정하여 실험하였다.
21.2.2. 빛(660nm)의 노출 시간에 따른 산소 생성량 측정
다음과 같이 저산소 환경에서의 빛(660nm) 노출 시간에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=24)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* Chloroplast의 농도는 1 * 108개/ml로 고정한다.
* 온도는 37℃로 고정한다.
* 빛의 세기(lux)는 500lux로 고정한다.
(1) 20시간
(2) 2시간
Oxygen plate reader well plate(24well)에 1*108개/ml 농도의 chloroplast를 1ml씩 분주하였다. 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경 구현
물질과 빛 사이의 거리는 15cm로 설정하고, 물질에 도달하는 빛의 세기를 500lux로 설정하였다. 빛의 노출 시간에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
그 결과, 빛에 노출되는 시간이 길수록 산소 농도가 낮아지는 것을 확인 두 그룹의 차이에서 확인할 수 있으며 (도 30b 참조), 2시간 후 빛에 노출시키지 않는 그룹에서 20시간동안 지속적으로 노출시킨 그룹에 비해 최대 산소 농도를 유지하는 시간이 길어진 것을 확인할 수 있다 (도 30c 참조). 빛의 세기를 500lux로 고정하였을 때, 빛에 2시간 노출시킨 그룹에서 최대 산소 농도 80mmHg에서 약 100분 동안 지속 된 것을 확인할 수 있다. 또한, 이를 동일한 조건의 빛에 노출시키지 않은 그룹과 비교했을 때(도 30c), 2시간동안 빛에 노출시켰을 때, 빛에 노출시키지 않은 그룹 대비 최대 47%의 산소 생성량이 증가된 것으로 확인되었다. 이는 Photoinhibition에 의한 결과로 추정되며, 지속적으로 chloroplast가 강한 빛에 노출되었을 때, 광합성이 일어나는 Photosystem II (광계 II)에서 활성 산소(ROS)를 생성하게 되면서 chloroplast의 산소 생성 능력이 감소되는 것으로 추정된다. 이와 반대로 chloroplast가 빛에 노출되었다가 노출되지 않았을 때, Reversible Photoinhibition이 일어나면서 산소 생성량이 증가한다는 연구 결과를 바탕으로 이 후 실험에서 chloroplast를 빛에 시간적인 간격을 두고 노출시켰을 때의 산소 생성량을 비교해 보았다.
21.2.3. 빛(660nm)의 노출 시간 간격에 따른 산소 생성량 측정
다음과 같이, 저산소 환경에서의 빛(660nm) 노출 시간 간격에 따른 chloroplast의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=24)
* Media (RPMI +10% FBS)를 이용해 희석시킨다.
* Chloroplast의 농도는 1 * 108개/ml로 고정한다.
* 온도는 37℃로 고정한다.
* 빛의 세기(lux)는 500lux로 고정한다.
(1) 30분 노출 * 3번
Oxygen plate reader well plate(24well)에 1*108개/ml 농도의 chloroplast를 1ml씩 분주하였다. 상기 plate를 하기와 같은 저산소 상태로 구현하였다.
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경 구현
물질과 빛 사이의 거리는 15cm로 설정하고, 물질에 도달하는 빛의 세기는 500lux로 설정하였다. 이 후, 빛을 30분씩 3번 노출시키고, Chloroplast의 산소 생성량을 산소 센서를 이용하여 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
chloroplast를 빛에 30분의 시간 간격을 두고 3번 노출시킨 후 20시간 동안 산소 생성량을 측정한 결과, 빛에 노출시키지 않은 그룹보다 약 70-80mmHg로 높은 산소 농도에서 유지되는 경향을 보였다 (도 30d 및 30e 참조). 빛에 노출시켰을 때 보다, 노출시키지 않은 상태(빛에 30분간 노출시킨 후)에서 약 76.8%로 산소 증가 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 이는 빛에 노출되는 상태에서는 chloroplast의 reversible photoinhibition으로 인하여 산소 증가 효과가 나타나지 않다가, 빛의 노출을 제거했을 때(dark condition) chloroplast의 손상이 회복되면서 빛의 자극에 의한 산소 생성 효과가 나타나는 것으로 추정된다. 즉 지속적으로 빛에 2시간 노출시켰을 때 보다 시간 간격을 두고 30분간 3번씩(총 90분)을 빛에 노출시켰을 때, chloroplast의 산소 생성이 최대 79.5%로 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다. 이는 빛에 노출시키지 않은 그룹에 비하여 최대 47%의 산소 증가 효과를 가지고 있는 것으로 확인되었다. 이에 따라, 이후 실험에서는 1000lux의 빛에 세기에 시간 간격을 두고 30분간 2번, 총 60분 동안 빛에 노출시켜 빛의 자극의 최대화하여 실험을 진행하였다.
실시예 22. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 제조
다음과 같이 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐을 제조하였다.
- 그룹 (n=5)
* CIB를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정
(1) Alginate 미세캡슐
(2) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
(3) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
CIB에 희석시킨 chloroplast를 농도 (2.5* 109개/ml)로 준비하고, 1.5% Alginate 및 Alginate-CTP solution을 준비하였다. 3% Alginate solution과 3차 증류수를 1:1로 섞고, 1.75ml chloroplast 와 1.75ml 3%(w/v) Alginate solution을 넣고 섞은 후, 1.75ml chloroplast 와 1.75ml 3%(w/v) Alginate-CTP solution을 넣고 섞었다. 이후, Encapsulator을 이용하여 각 그룹별 미세캡슐을 제조하였다 (Nozzle size : 450μm, Frequency: 800Hz, Electrode : 500V, Flow rate : 15ml/min). 15분 동안 100mM CaCl2가 30ml이 들어 있는 gelation bath에 넣어 미세캡슐을 stirring하여 가교하였다 (stirring 속도 : 20rpm). 이 후, CaCl2 용액을 제거하고, media(RPMI + 10% FBS +1% PS) 10ml로 미세캡슐을 wash 하였다. 각 그룹별 500μl의 미세캡슐을 (약 500개)와 500μl media를 24 well plate의 1well에 담았다.
그 결과, 모든 그룹에서 미세캡슐이 잘 형성된 것을 확인하였다.
실시예 23. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐의 분해도(degradation) 및 기계강도 (mechanical strength) 평가
다음과 같이 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐의 분해도(degradation) 및 기계강도 (mechanical strength)를 평가하였다.
- 그룹 (n=5)
* CIB를 이용해 희석시킨다.
* 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정
(1) Alginate 미세캡슐
(2) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
(3) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
120시간 동안 24 well plate에서 incubation 시킨 각 그룹별 미세캡슐을 준비하였다. 육안으로 전체적인 미세캡슐의 모양 및 크기를 살펴보아 분해도를 확인하고, Rheometer를 통해 rheology를 측정하여 그룹별 미세캡슐의 강도를 확인하였다.
각 그룹별 분해도를 평가한 결과, 모든 그룹에서 120시간 지난 후에도 미세캡슐이 잘 유지된 것으로 확인되었으며, 이는 미세 캡슐이 최소 5일까지 유지될 수 있는 것을 의미한다 (도 35 참조).
또한, 각 그룹별 기계강도를 평가한 결과, Alginate-Chloroplast 그룹에서는 탄성 계수(Storage modulus, G’)은 6.40kPa, Alginate-CTP-Chloroplast 그룹에서는 9.80kPa로 확인되었다 (도 36 참조). CTP를 합성한 그룹에서 탄성 계수의 값이 더 높은 것으로 보아, Alginate-CTP-Chloroplast 그룹에서 변형이 덜 발생하며, 단단한 물성을 가지고 있다 것을 의미한다.
실시예 24. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐의 산소 제어 능력 평가
다음과 같이, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐의 산소 생성량을 확인하였다.
- 그룹 (n=6, CIB를 이용해 희석시켰다.)
(1) Control (CIB)
(2) Chloroplast 1 * 106개/ml
(3) Chloroplast 1 * 107개/ml
(4) Chloroplast 1 * 108개/ml
(5) Control (Alginate 미세캡슐)
(6) Alginate-Chloroplast 1 * 106개/ml 미세캡슐
(7) Alginate-Chloroplast 1 * 107개/ml 미세캡슐
(8) Alginate-Chloroplast 1 * 108개/ml 미세캡슐
* (9) 내지 (11)의 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.
(9) Control (Alginate-CTP 미세캡슐)
(10) Alginate-CTP-Chloroplast 1 * 106개/ml 미세캡슐
(11) Alginate-CTP-Chloroplast 1 * 107개/ml 미세캡슐
(12) Alginate-CTP-Chloroplast 1 * 108개/ml 미세캡슐
각 그룹에 해당하는 농도별 chloroplast 용액, Alginate-Chloroplast 미세캡슐, Alginate-CTP-Chloroplast를 준비하였다. Oxygen plate reader well plate(24well)에 아래에 맞게 각 그룹을 넣어주고, 24 well plate를 48시간 동안 incubation을 진행하면서 산소 센서를 이용하여 산소 생성량을 측정하였다. 이 때, 산소 센서는 SDR SensorDish (PreSens, Germany)를 이용하였다.
* 그룹 (1), (2), (3), (4): 농도별 chloroplast 용액 500μl+ media(RPMI) 500μl
* 그룹 (5), (6), (7), (8): 농도별 Alginate-Chloroplast 미세캡슐 500μl+ media(RPMI) 500μl
* 그룹 (9), (10), (11), (12): 농도별 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 500μl+ media(RPMI) 500μl
그 결과, 각 그룹 모두에서 Chloroplast의 농도가 높은 108개/ml 그룹에서 가장 높은 산소 생성률 확인하였으며, CTP가 합성된 그룹에서 상대적으로 더 높은 산소 생성량을 가지는 것으로 보아 CTP가 산소 생성에 도움이 되는 효능을 가졌다는 것을 확인하였다 (도 37 참조). 또한 CIB에 희석시킨 chloroplast보다 Media(RPMI +10%FBS, 1%PS)에 희석시킨 Chloroplast에서 산소 생성량이 유사하게 나타나지만, Encapsulator을 이용한 실험의 특성 상 Media(RPMI +10%FBS, 1%PS)를 사용하여 chloroplast를 희석시킬 경우 미세캡슐의 모양이 일정하지 않으므로 이 후 실험에서는 CIB를 이용하여 chloroplast를 희석시켜 미세 캡슐을 제조하였다.
실시예 25. 췌장 세포를 봉입한 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 제조
다음과 같이, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 췌장 세포를 봉입하였다.
- 그룹 (n=6, CIB를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Alginate 미세캡슐
(2) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
(3) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐
실험 동물(Rat)로부터 분리한 췌장 세포를 media (RPMI)로 wash 2회 진행하였다. CIB에 희석시킨 chloroplast를 2.5*109개/ml의 농도로 준비하고, 1.5% Alginate 및 Alginate-CTP solution을 준비하였다. 이 후, 3% Alginate solution과 3차 증류수를 1:1로 섞고, 1.75ml chloroplast 와 1.75ml 3%(w/v) Alginate solution을 넣고 섞은 다음, 1.75ml chloroplast 와 1.75ml 3%(w/v) Alginate-CTP solution을 넣고 혼합하였다. 상기 혼합된 용액에 추출한 췌장 세포를 500IEQ씩 넣고 잘 섞어주었다. 이 후, Encapsulator을 이용하여 각 그룹별 미세캡슐을 제조하였다 (* Nozzle size : 450μm, * Frequency: 800Hz, Electrode : 500V, Flow rate : 15ml/min). 15분 동안 100mM CaCl2가 30ml이 들어 있는 gelation bath에 넣어 미세캡슐을 stirring하여 가교하였다 (stirring 속도 : 20rpm). 이 후, CaCl2 용액을 제거하고, media(RPMI +10% FBS +1% PS) 10ml로 미세캡슐을 wash하였다. 각 그룹별 500μl의 미세캡슐을 (약 500개)와 500μl media를 24 well plate의 1 well에 담았다.
그 후, 100mM의 CaCl₂용액 300μl에 넣어 반응시킨 후 각 그룹에 췌장 세포가 잘 봉입 되었는지 광학 현미경을 이용하여 확인하였다 (도 38 참조). 그 결과, 모든 그룹에서 미세캡슐에 봉입되지 않는 그룹을 제외한 그룹에서 미세캡슐 안에 췌장 세포가 잘 봉입된 것을 확인하였다.
실시예 26. 저산소 환경에서의 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 독성 평가
26.1. CCK-8 assay를 통한 독성 평가
다음과 같이 저산소 환경에서 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하기 위하여 실시하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate 미세캡슐: 저산소 환경
(6) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
24시간 동안 24 well plate에서 아래와 같이 정상산소 및 저산소 상태에서 incubation 시킨 그룹별 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입한 미세캡슐들을 준비하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경
모든 췌장 세포 및 미세캡슐을 PBS로 2번 wash하고, media(RPMI) 1ml + CCK solution 100μl를 처리하고, 2시간 동안 호일에 감싸 incubation 후, reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 저산소 환경의 췌장 세포에서 장시간 저산소 환경에 노출됨으로 인하여 췌장 세포의 생존율(Cell Viability)이 정상산소 환경의 췌장 세포에 비하여 약 22%로 유의하게 감소하였다 (도 39 참조). 이는 저산소 환경은 췌장 세포가 생존하기 적절한 환경이 아니라는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 세포 생존율을 확인한 결과, 정산산소 환경의 췌장 세포보다 약 10% 감소하였으며, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 소재가 췌장 세포의 생존에 도움을 줄 수 있다는 것을 의미한다. Alginate-Chloroplast 미세캡슐을 Alginate 미세캡슐과 비교하였을 때, Alginate- Chloroplast 미세캡슐의 chloroplast가 세포를 생존에 도움을 줄 수 있는 산소를 생산할 수 있다는 것을 확인하였다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐과 Alginate-Chloroplast 미세캡슐을 비교하였을 때, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에서 낮은 세포 생존율의 감소를 보이고 있기 때문에, chloroplast가 산소를 생산하는 것에 있어서 CTP의 효능이 중요한 역할을 한다는 것을 의미하며, 이는 CTP로 안정화된 chloroplast가 보다 더 기능적인 측면에 있어서 유리한 점을 지니고 있음을 의미한다. 각 그룹별 세포 생존율을 비교하였을 때, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 세포 생존율이 정상산소 환경의 췌장 세포보다 낮지만, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 내에 존재하는 췌장 세포의 metabolites(대사체) 혹은 ROS (활성산소)의 영향일 것으로 예상된다. 이에, 이후 실험에서 이와 같은 점을 보완하기 위하여, catalase(CAT) 또는 superoxide dismutase(SOD)효소를 합성하여 실험하였다.
26.2. Live & Dead assay를 통한 독성 평가
다음과 같이 저산소 환경에서 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 생존율을 확인하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate 미세캡슐: 저산소 환경
(6) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
24시간 동안 24 well plate에서 하기와 같은 정상산소 및 저산소 상태에서 incubation 시킨 그룹별 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입한 미세캡슐들을 준비하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경
모든 췌장 세포 및 미세캡슐을 PBS로 2번 wash하고, 5μM Calcein-AM와 20μM Ethidium homodimer-1 (EthD-1)로 만든 시약을 각 well에 1ml씩 처리하고, 40분 동안 incubation을 진행하였다. 이 때, 그룹 (3), (4)는 15분간 진행하였다. 이 후, 형광 현미경을 이용하여 살아있는 세포(green 형광)와 죽은 세포(red 형광)를 확인한 후, 사진을 촬영하였다.
그 결과, 저산소 환경의 다른 그룹에 비하여 상대적으로 Alginate-CTP- Chloroplast 미세캡슐 그룹에서 Green signal이 강하게 나타나며, Green과 Red를 합친 결과 Yellow signal이 가장 약하게 나타나는 것을 확인하였다 (도 40 참조). 이는 상기 CCK-8 Assay 결과와 동일하게 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐이 췌장 세포가 생존하기에 적절한 환경임을 의미한다.
실시예 27. 저산소 환경에서의 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 기능성 확인
27.1. Glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay를 통한 기능성 확인
다음과 같이 저산소 환경에서 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 기능을 확인하였다.
재료는 (1) Low glucose (2.8mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석) 및 (2) High glucose (20.2mM, Krebs Ringer buffered HEPES (pH 7.4)로 희석)를 이용하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate 미세캡슐: 저산소 환경
(6) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
24시간 동안 24 well plate에서 아래와 같은 정상산소 및 저산소 상태에서 incubation 시킨 그룹별 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입한 미세캡슐들을 준비하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경
모든 췌장 세포 및 미세캡슐을 PBS로 2번 wash하고, low glucose (2.8mM)를 각 well에 1ml씩 분주하고 30분 incubation하였다. Low glucose (2.8mM)를 다시 각 well에 1ml씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 low glucose 용액을 회수하였다. 이후, High glucose (20.2mM)를 각 well에 1ml씩 분주하고 2시간 incubation하고, 존재하는 high glucose 용액을 회수하였다. Insulin enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay를 이용해 회수한 low glucose, high glucose 용액을 바탕으로 인슐린 양을 측정 및 계산하였다.
그 결과, 정상산소 환경의 췌장 세포와 저산소 환경의 췌장 세포를 비교한 결과 주변 환경으로 인해 췌장 세포의 인슐린 분비능이 영향을 받음을 확인하였다. 이는 저산소 환경은 췌장 세포가 생존하기 적절한 환경이 아니라는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포는 저포도당 및 고포도당 농도에서 모두 정상산소의 췌장 세포와 유사한 수준의 인슐린을 분비하고 있음을 확인하였으며, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 소재는 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비 능력에 영향을 끼치지 않는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포는 저산소 환경 실험 군 중에서 가장 정상산소의 췌장 세포와 비슷한 수준의 인슐린 분비 능력을 가지고 있는 것으로 확인할 수 있으며, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 소재가 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비능을 가장 잘 유지시켜 줄 수 있음 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포는 Alginate-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포에 비해 glycemic control function이 유의하게 높으며, Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포는 Alginate- Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포에 비해 glycemic control function을 유지하고 있음을 확인하였다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포가 저산소 환경의 각 그룹 중에서 인슐린 분비 능력이 가장 높으며, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 소재가 저산소 환경으로부터 췌장 세포의 생존율 증진 가능성과 능력을 유지할 수 있는 가능성을 가지고 있는 것을 의미한다. Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포의 인슐린 분비량이 정상산소 환경의 췌장 세포보다 낮지만, 이는 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐 내에 존재하는 췌장 세포의 metabolites(대사체) 혹은 ROS (활성산소)의 영향일 것으로 예상된다. 이에 이후 실험에서 이와 같은 점을 보완하기 위하여, catalase(CAT) 또는 superoxide dismutase(SOD)효소를 합성하여 실험하였다.
27.2. dsDNA assay를 통한 기능성 확인
다음과 같이 저산소 환경에서 Alginate-CTP-Chloroplast 미세캡슐에 봉입된 췌장 세포에서 분비된 인슐린 양을 췌장 세포의 크기로 보정하였다.
- 그룹 (n=5, CIB를 이용해 희석시키고, 합성 비율은 alginate : peptide = 1: 1 molar ratio로 고정하였다.)
(1) Control 1 (RPMI media): 정상산소 환경
(2) Control 2 (RPMI media): 저산소 환경
(3) 췌장 세포: 정상산소 환경
(4) 췌장 세포: 저산소 환경
(5) Alginate 미세캡슐: 저산소 환경
(6) Alginate-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
(7) Alginate-CTP-Chloroplast (2.5* 109개/ml) 미세캡슐: 저산소 환경
24시간 동안 24 well plate에서 아래와 같은 정상산소 및 저산소 상태에서 incubation 시킨 그룹별 췌장 세포 및 췌장 세포를 봉입한 미세캡슐들을 준비하였다.
- 정상산소 상태: 일반적인 21% 산소 환경
- 저산소 상태: 온도 조절형 Desiccator 실험 기구에 혼합 가스 (94% N2+5% CO2+ 1% O2)를 주입해 1% 산소, 37℃ 환경
모든 췌장 세포 및 미세캡슐을 PBS로 2번 wash하고, 0.1M EDTA (pH7.8) 용액을 각 well에 1ml씩 분주하고 충분한 pipetting을 통하여 췌장 세포 및 미세캡슐을 부수었다 (미세캡슐 내에 존재하는 췌장 세포를 꺼내기 위하여 실시). 상기 부숴진 췌장 세포 및 미세캡슐을 포함하는 용액을 각각 1.5ml tube에 회수하여 1800RPM에서 2분간 centrifugation하고, 상층액을 제거하고 pellet(췌장 세포)에 RIPA buffer 1ml씩 처리하였다. dsDNA assay를 통하여 각 well (Alginate-CTP-Chloroplast)에 존재했던 췌장 세포가 분비해낸 인슐린의 양을 보정하였다.
실시예 28. 형광 이미지를 이용한 chloroplast 외막과 CTP(VILGLGLAGI)-FITC 결합 확인
다음과 같은 방법으로 기존에 사용하던 CTP(MFAFQYLLVM) 외에도 CTP(VILGLGLAGI)-FITC도 chloroplast의 외막에 anchoring 될 수 있는지 형광으로 확인하였다. 실험 과정 동안 빛에 노출되지 않도록 주의하였다.
1*108개/ml chloroplast (control) 500μl, 1*108/ml chloroplast+CTP-FITC 500μl 준비하였다 (CTP-FITC는 합성 업체인 Peptron에 합성 의뢰하여 얻었다). 1*108개/ml chloroplast+CTP-FITC에서 CTP-FITC는 0.6mg/ml의 농도로 처리하였다. 1*108개/ml chloroplast/ml (in CIB)에서 500μl를 취하고, CTP 10mg/ml (in DMSO)에서 30μl를 취해서 넣으면 최종 농도를 0.6mg/ml이 만들었다. 이 후, 1, 5, 10, 30, 60분마다 100μl씩 따서 고정하고, 시간별로 반응시킨 용액을 13500RPM에서 1분간 centrifugation하였다. Pellet을 얻어 2.5% glutaraldehyde (0.05M SCB) 고정액에 고정하고 (500μl, 15분), 미 반응의 CTP-FITC를 제거하기 위해 PBS로 2번 wash 진행하였다. 이후, CIB buffer로 500μl를 채운 뒤, 슬라이드 글래스/커버글래스를 이용하여 mounting하였다. Confocal microscope를 이용하여 형광사진을 촬영하고, 두께는 1μm 정도로 section하였다 (green 형광 (FITC) = 488nm, red 형광 (chloroplast auto 형광) = 580nm).
그 결과, 5분 이상의 반응시간부터 CTP(V-)가 chloroplast의 outer membrane에 anchoring 되어 충분히 코팅되는 것을 확인할 수 있었고, 뿐만 아니라 inner membrane까지 anchoring할 수 있는 것으로 확인되었으며, CTP(V-)가 Chloroplast를 안정적으로 감싸고 있음을 확인하였다 (도 43 참조).
실시예 29. Alginate-CTP(VILGLGLAGI) conjugation
29.1. Alginate-CTP(VILGLGLAGI) 합성
다음과 같은 방법으로 Alginate의 carboxylate(-COOH) 그룹과 CTP(V-)의 Primary amine(-NH2)을 합성시켰다. 이 때, CTP(MFAFQYLLVM)가 아닌 CTP(VILGLGLAGI)를 이용하였다. Carbodiimide coupling reaction을 이용하였으며, Alginate의 carboxylate(-COOH) 그룹과 CTP(V-)의 primary amine으로 amide bond를 형성하여 접합체를 만들었다. carbodiimide coupling reaction의 효율을 높이기 위해서, EDC/NHS를 이용하였다 (도 44 참조).
0.1M MES buffer (+0.5M NaCl) 10ml 제조 후, pH를 6으로 맞추었다. 제조된 MES buffer 10ml에 0.088mM의 sodium alginate(10mg/ml)를 녹였다. 이 때, 잘 풀어지도록 뭉치지 않게 넣어주었다. 상기 Solution이 충분히 녹으면 2mM에 해당하는 4mg/10ml의 EDC(191.7 M.W)를 녹였다. 이후, 6mg/10ml의 NHS(5mM)를 넣고 RT에서 15분간 반응시키고, PBS나 sodium bicarbonate (NaHCO3, 탄산수소나트륨)를 이용하여 pH7로 적정하였다. 1%의 DMSO에 녹인 peptide(10mg/ml, peptide는 합성 업체인 peptron에 의뢰하여 합성)를 molar ratio(1:1.9, 1:3.8, 1:19)에 해당하는 양만큼 상기 용액에 넣고, RT에서 2시간 동안 반응시켰다. 6,000 내지 8,000 MWCO(molecular weight cut-off) dialysis membrane을 이용하여 3일간 dialysis를 진행하였다. 이 후, Deep freezer에 얼리고, 동결 건조하여 powder형태의 Alginate- CTP(VILGLGLAGI) 합성물을 얻었다 (도 45 참조). Sodium alginate는 1M에 carboxylate 그룹(-COOH)이 648M이 존재하는 고분자이다. 1분자의 alginate에 존재하는 carboxylate 그룹(-COOH)이 많기 때문에 기존 Chloroplast-transit-peptide(CTP(V-))을 합성할 떄 적용했던 비율에 비해 Sodium alginate 농도를 줄이고, Peptide 농도는 동일 10mg/ml로 동일하게 실험하였다.
29.2. Alginate-CTP(VILGLGLAGI) conjugation 확인
29.2.1. FT-IR을 통한 확인
Alginate와 Peptide의 비율이 1:19의 비율을 가지고 있는 접합체는 alginate (0.1mg/ml)가 가장 적게 들어갔기 때문에 peptide의 특성이 잘 나타났다 (도 46 참조). Alginate와 Peptide가 합성되면, 새로운 EDC/NHS반응에 의하여 새로운 Amide 결합이 생성되었다. Amine그룹은 여러 peak를 가지게 되는데, 그 중 peptide에도 Amide A, B 결합(NH stretch)을 가지는 primary amine peak를 가지기 때문에, 합성물의 새로운 Amide 결합을 확인하기 위해서 Amide II (C-N)결합의 peak(1480-1575cm-1) 이 존재여부를 확인하였다. 그 결과 1:19와 peptide에서 Amide II (C-N)결합이 나타났으며, Peptide가 상대적으로 많아서 잘 보이는 것일 수 있으나, 해당 구역에서 peak의 세기를 비교해보았을 때 1:19 접합체에서 더 강해지는 것을 확인할 수 있었다.
29.2.2. 1 H-NMR 을 통한 확인
Alginate와 Peptide의 비율이 1:19의 비율을 가지고 있는 접합체는 alginate (0.1mg/ml)가 가장 적게 들어갔기 때문에 peptide의 특성이 잘 나타난다. Alginate와 Peptide가 합성되면, 새로운 EDC/NHS반응에 의하여 새로운 Amide 결합이 생성되어야 한다. 2.2ppm은 Peptide에서 주로 나타나는 peak로, Primary amine (N-terminal)에 의해 형성되는 것으로 예상되는 peak이다. 상대적으로 결합 비율에 의해서 peptide 양이 늘어날수록 peak가 강하게 나타나는 것으로 확인하였다 (도 47 참조). 즉, 2.2ppm에서의 peak가 늘어갈 수록 상대적으로 Peptide의 특성이 잘 나타나는 것으로 볼 수 있으며, 이는 새로운 Amide 결합으로 인하여 Peptide에 본래 존재하던 Primary amine으로 인하여 peak가 강해진 것으로 판단할 수 있다. 3.2ppm은 Alginate, Peptide 모두 나타나지 않는 peak로, Peptide 농도가 높아질 수록 peak가 강하게 형성되는 것을 확인할 수 있다. FTIR 결과와 비교했을 때, amide bond II (C-N)가 3.2ppm에서 형성되는 것으로 예상할 수 있으며, Peptide의 primary amine에 alginate carboxylate 그룹(-COOH)이 결합하면서 secondary amine으로 변화한다고 추정할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Met Phe Ala Phe Gln Tyr Leu Leu Val Met
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<400> 2
Val Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala Gly Ile
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Leu Ile Pro Leu Met Phe Ala Phe Gln Tyr Leu Leu Val Met Lys Pro
1 5 10 15
Leu Val
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OEP64 protein transmembrane domain
<400> 4
Ala Ser Pro Ser Ser Gln Ile Trp Val Ile Leu Gly Leu Gly Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ile Tyr Val Leu
20

Claims (25)

  1. 엽록체 (chloroplast) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 CTP는 엽록체 외막에 결합하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 CTP는 엽록체 외막 단백질에서 유래된 것인, 하이드로겔 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 엽록체 외막 단백질은 외막 단백질 34 (Outer envelope protein 34, OEP34) 또는 외막 단백질 (Outer envelope protein 64, OEP64)인 것인, 하이드로겔 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 CTP는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 CTP는 엽록체의 산소 발생을 증가시키는 것인, 하이드로겔 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 알기네이트 (alginate)를 더 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 하이드로겔은 CTP 말단과 알기네이트 말단이 결합되어 겔화되는 것인, 하이드로겔 조성물.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 췌장 세포를 더 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔 조성물은 광조사시 산소를 생성하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  11. 구항 10에 있어서, 상기 광조사는 산소 농도가 101/ml 내지 1010/ml에서 이루어지는 것인, 하이드로겔 조성물.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 광조사는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것인, 하이드로겔 조성물.
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 광조사는 10분 내지 50분의 간격을 두고, 10분 내지 50분 동안 1 내지 5회에 걸쳐 이루어지는 것인, 하이드로겔 조성물.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 하이드로겔은 엽록체를 101/ml 내지 1010/ml 농도로 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  15. 청구항 9에 있어서, 상기 하이드로겔은 상기 췌장 세포가 분비한 인슐린을 포함하는 것인, 하이드로겔 조성물.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물은 세포 또는 조직에 산소를 전달하기 위한 것인, 하이드로겔 조성물.
  17. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물을 포함하는, 미세캡슐 (Microcapsule).
  18. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는, 대사 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는, 대사 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  20. 알기네이트 (Alginate) 및 엽록체 전달 펩타이드 (Chloroplast Transit Peptide, CTP)를 결합시키는 단계; 및
    상기 결합된 알기네이트-CTP 합성물을 개체로부터 분리된 엽록체와 혼합하여 겔화시키는 단계;를 포함하는, 하이드로겔 조성물의 제조 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 겔화된 하이드로겔 내부에 췌장 세포를 봉입하는 단계;를 더 포함하는, 하이드로겔 조성물의 제조 방법.
  22. 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항의 하이드로겔 조성물을 처리하는 단계; 및
    상기 처리된 하이드로겔 조성물에 광조사하는 단계;를 포함하는, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 광조사하는 단계는 산소 농도가 101/ml 내지 1010/ml에서 이루어지는 것인, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법.
  24. 청구항 22에 있어서, 상기 광조사하는 단계는 20℃ 내지 40℃의 온도에서 이루어지는 것인, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법.
  25. 청구항 22에 있어서, 상기 광조사하는 단계는 10분 내지 50분의 간격을 두고, 10분 내지 50분 동안 1 내지 5회에 걸쳐 이루어지는 것인, 세포 또는 조직에 산소를 전달하는 방법.
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