HRP20040448A2 - Method for detecting cells with numerical chromosomal abnormalities - Google Patents
Method for detecting cells with numerical chromosomal abnormalities Download PDFInfo
- Publication number
- HRP20040448A2 HRP20040448A2 HR20040448A HRP20040448A HRP20040448A2 HR P20040448 A2 HRP20040448 A2 HR P20040448A2 HR 20040448 A HR20040448 A HR 20040448A HR P20040448 A HRP20040448 A HR P20040448A HR P20040448 A2 HRP20040448 A2 HR P20040448A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- conjugate according
- hgh
- group
- poly
- peg
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 67
- 206010008805 Chromosomal abnormalities Diseases 0.000 title 1
- 208000031404 Chromosome Aberrations Diseases 0.000 title 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 268
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 268
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 247
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims abstract description 8
- -1 poly(ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 134
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 124
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 63
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 claims description 33
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 19
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 19
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 claims description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 16
- 206010012559 Developmental delay Diseases 0.000 claims description 15
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 15
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims description 12
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 10
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 10
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 10
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 8
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 5
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 claims description 5
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241001061127 Thione Species 0.000 claims description 4
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 claims description 4
- 150000002513 isocyanates Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 claims description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 claims description 3
- LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N imidazol-2-ylidenemethanone Chemical compound O=C=C1N=CC=N1 LFKYBJLFJOOKAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000002540 isothiocyanates Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003923 2,5-pyrrolediones Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 7
- 206010041092 Small for dates baby Diseases 0.000 claims 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims 5
- IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 2,4-diphenyl-4h-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O=C1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC1C1=CC=CC=C1 IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 2
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims 2
- 125000002877 alkyl aryl group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000006615 aromatic heterocyclic group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000001733 carboxylic acid esters Chemical class 0.000 claims 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims 1
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical class C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-(6-hydroxynaphthalen-2-yl)-1H-indazole-5-carboximidate dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1=C(O)C=CC2=CC(C3=NNC4=CC=C(C=C43)C(=N)OCC)=CC=C21 CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 51
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 48
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 abstract description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 51
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 47
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 31
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 23
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 22
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 15
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 15
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 14
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 9
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 9
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 9
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 9
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 9
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 8
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 8
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 8
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 8
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 8
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 6
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 6
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GQWWGRUJOCIUKI-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(2-methyl-1-oxopyrrolo[1,2-a]pyrazin-3-yl)propyl]guanidine Chemical compound O=C1N(C)C(CCCN=C(N)N)=CN2C=CC=C21 GQWWGRUJOCIUKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 4
- 229920001734 PEG propionaldehyde Polymers 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 4
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 4
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- 241000282553 Macaca Species 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 3
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 3
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 2h-benzotriazole;carbonic acid Chemical class OC(O)=O.C1=CC=C2NN=NC2=C1 BTBWSRPRAGXJJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 229940093476 ethylene glycol Drugs 0.000 description 2
- 206010016165 failure to thrive Diseases 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 108010001564 pegaspargase Proteins 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 2
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 1-(2-methoxyethyl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound COCCN1C(=O)C=CC1=O ASUGWWOMVNVWAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 1-decane-sulfonic-acid Chemical compound CCCCCCCCCCS(O)(=O)=O KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100338243 Caenorhabditis elegans hil-6 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- 101710183811 Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 102000004547 Glucosylceramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010017544 Glucosylceramidase Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001123448 Homo sapiens Prolactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229910020889 NaBH3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004576 Placental Lactogen Human genes 0.000 description 1
- 108010003044 Placental Lactogen Proteins 0.000 description 1
- 239000000381 Placental Lactogen Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 229940060205 adagen Drugs 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012382 advanced drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N bis(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) carbonate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)ON1C(=O)CCC1=O PFYXSUNOLOJMDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 150000004657 carbamic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001595 flow curve Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042795 hydrazides for tuberculosis treatment Drugs 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N isothiocyanate group Chemical group [N-]=C=S ZBKFYXZXZJPWNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N medroxyprogesterone acetate Chemical compound C([C@@]12C)CC(=O)C=C1[C@@H](C)C[C@@H]1[C@@H]2CC[C@]2(C)[C@@](OC(C)=O)(C(C)=O)CC[C@H]21 PSGAAPLEWMOORI-PEINSRQWSA-N 0.000 description 1
- 230000009245 menopause Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N nitrocyclohexatriene Chemical group [O-][N+](=O)C1=CC=C=C[CH]1 ZHCAAFJSYLFLPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940099216 oncaspar Drugs 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002923 oximes Chemical class 0.000 description 1
- 125000006353 oxyethylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920003196 poly(1,3-dioxolane) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 229960004063 propylene glycol Drugs 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000467 secondary amino group Chemical class [H]N([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000008362 succinate buffer Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000003900 succinic acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical group 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N urea urea Chemical compound NC(N)=O.NC(N)=O ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormones [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH] (Somatotropin)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
Abstract
Ovaj izum daje kemijski modificirani ljudski hormon rasta (hGH), pripremljen vezanjem polimera topljivog u vodi na protein. Kemijski modificirani protein u skladu s ovim izumom može imati znatno dugotrajniju aktivnost hGH u usporedbi s nemodificiranim hGH, što omogućuje smanjenje doze i razne mogućnosti rasporeda doziranja.
Description
Ova prijava povlači prioritet pred Naslovom 35, US kôd, §119 Serije privremenih prijava Sjedinjenih Država serijskog broja 60/331 907, podnesenim 20. studenog 2001., koji je ovdje u potpunosti uključen citatom i kao da je ovdje napisan.
Područje izuma
Ovaj se izum odnosi na kemijsku modifikaciju ljudskog hormona rasta (engl. human Growth Hormone, hGH) i njegovih agonističkih varijanti, pri čemu se mogu promijeniti kemijska i/ili fiziološka svojstva hGH. PEG-ilirani hGH može imati povećano trajanje u plazmi, smanjenu brzinu klirensa, poboljšanu stabilnost, smanjenu antigenost ili kombinaciju navedenog. Ovaj se izum također odnosi na postupke modifikacije hGH. Nadalje, ovaj se izum odnosi na farmaceutske pripravke koji sadrže modificirani hGH. Još jedno ostvarenje je upotreba modificiranog hGH u liječenju poremećaja rasta i razvitka.
Pozadina izuma
Ljudski hormon rasta (hGH) je protein koji sadrži jedan lanac od 191 aminokiseline, križno povezan dvama disulfidnim mostovima, a monomerni oblik ima molekulsku masu od 22 kDa. Ljudski GH luči hipofiza, a može se proizvesti i rekombinantnim genetskim inženjerstvom. hGH uzrokuje rast u svim tjelesnim tkivima koja mogu rasti. Rekombinantni hGH komercijalno je dostupan već nekoliko godina. Na tržištu su prisutna dva oblika terapeutski korisna pripravka rekombinantnog hGH: autentični, npr. GenotropinTM ili NutropinTM, te analog s dodatnim metioninom na N-kraju, npr. SomatonormTM. hGH se koristi za stimulaciju linearnog rasta u pacijenata s hipopituitarnim patuljastim rastom, koji se također navodi kao nedostatnost hormona rasta (engl. Growth Hormone Deficiency, GHD) ili Turnerovim sindromom, ali navedene su i druge indikacije, uključujući dugotrajno liječenje zastoja rasta u djece koja su rođena prekratka za gestacijsku dob (engl. short for gestational age, SGA), za liječenje pacijenata oboljelih od Prader-Willi sindroma (PWS), kronične bubrežne insuficijencije (CRI), iscrpljivanja kod AIDS-a i starenja.
Glavni biološki učinak hormona rasta (GH) je pospješivanje rasta mladih sisavaca i održavanje tkiva u starijih sisavaca. Organski sustavi na koje on utječe uključuju kostur, vezivno tkivo, mišiće i unutarnje organe, kao što su jetra, crijeva i bubrezi. Hormoni rasta izražavaju svoje djelovanje putem interakcije sa specifičnim receptorima na membrani ciljne stanice. hGH je član obitelji homolognih hormona, koja uključuje placentalne laktogene, prolaktine i druge genetske i vrsne varijante ili hormone rasta (Nicoll, C.S. i sur. (1986) Endocrine Reviews 7:169). hGH je među njima neobičan po tome što pokazuje široku vrsnu specifičnost i veže se i za klonirani somatogeni (Leung, D.W. i sur. (1987) Nature 330;537) ili prolaktinski receptor (Boutin, J.M. i sur. (1988) Cell; 53:69). Klonirani gen za hGH eksprimiran je u sekrecijskom obliku u bakteriji Escherichia coli (Chang, C.N. i sur. (1987) Gene 55:189), a objavljene su i njegove DNA i aminokiselinska sekvenca (Goeddel i sur. (1979) Nature 281:544; Gray i sur. (1985) Gene 39:247).
Ljudski hormon rasta (hGH) u mnogome sudjeluje u regulaciji normalnog ljudskog rasta i razvitka. Ovaj hormon hipofize pokazuje mnoštvo bioloških učinaka, uključujući, između ostalog, linearni rast (somatogenezu), laktaciju, aktivaciju makrofaga, inzulinu slične i dijabetogene učinke (Chawla, R.K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C.K. i sur. (1988) Science 239, 769; Thomer, M.O. i sur (1988) J. Clin. Invest. 81:745). Nedostatak hormona rasta u djece uzrokuje patuljasti rast, koji se već dulje od desetljeća uspješno liječi egzogenom primjenom hGH.
Ljudski hormon rasta (hGH) je jednolančani polipeptid koji se sastoji od 191 aminokiseline (molekulska masa 21 500). Disulfidne veze povezuju položaje 53 i 165 i položaje 182 i 189. Niall, Nature, new BIology, 230:90 (1971). hGH je snažno anaboličko sredstvo, naročito zbog zadržavanja dušika, fosfora, kalija i kalcija. Liječenje hipofizektomiranih štakora GH može održati bar dio stope rasta štakora. Moore i sur., Endocrinology 122:2920-2926 (1988). Među najizraženijim učincima u hipopituitarnih osoba (s nedostatkom GH) ubrzan je linearni rast ploče rasta između kosti i hrskavice, što rezultira povećanim stasom. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964).
hGH uzrokuje niz fizioloških i metaboličkih učinaka u raznim životinjskim modelima, što uključuje linearni rast kosti, laktaciju, aktivaciju makrofaga, inzulinu slične i dijabetogene učinke i drugo (R.K. Chawla i sur., Annu. Rev. Med. 34:519 (1983); O.G.P. Isaksson i sur., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C.K. Edwards i sur., Science 239, 769 (1988); M.O. Thomer i M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82:745 (1988); J.P. Hughes i H.G.riesen, Ann. Rev. Physiol. 47:469 (1985)). Poznato je da se, naročito u žena nakon menopauze, lučenje GH smanjuje s godinama. Millard i sur., Neurobiol. Aging, 1:229-235 (1990); Takahashi i sur., Neuroendocrinology M, L6-137-142 (1987). V. također Rudman i sur., J. Clin. Invest., 67:1361-1369 (1981) i Blackman, Endocrinology and Aging, 16:981 (1987). Nadalje, postoje podaci da se neke od manifestacije starenja, uključujući smanjenje "nemasne" tjelesne mase, povećanje mase masnog tkiva i tanjenje kože, mogu reducirati davanjem GH tri puta tjedno. V. npr. Rudman i sur., N. Eng. J. Med., 323:1-6 (1990) i popratni članak u istom broju časopisa od Dr. Vance (str. 52-54). Ovi biološki učinci posljedica su interakcije hGH i specifičnih staničnih receptora. Klonirana su dva različita ljudska receptora, hGH receptor iz jetre (D. W. Leung i sur., Nature 330:537 (1987)) i ljudski prolaktinski receptor (J. M. Boutin i sur., Mol. Endocrinology, 3:1455 (1989)). Međutim, vjerojatno postoje i drugi, uključujući ljudski placentalni laktogeni receptor (M. Freemark, M. Comer, G. Komer i S. Handwerger, Endocrinol. 120:1865 (1987)). Ovi homologni receptori sadrže glikoziliranu izvanstaničnu domenu za vezanje hormona, jednu transmembransku domenu i citoplazmatsku domenu, koje se znatno razlikuju u sekvenci i veličini. Smatra se da jedan ili više receptora sudjeluju u određivanju fiziološkog odgovora na hGH.
Općenito je opaženo da fiziološki aktivni proteini, primijenjeni u organizmu, mogu pokazati svoju farmakološku aktivnost samo u kratkom vremenskom periodu, zbog visoke stope klirensa u organizmu. Nadalje, relativna hidrofobnost tih proteina može ograničiti njihovu stabilnost i/ili topljivost.
Da bi se smanjila stopa klirensa, poboljšala stabilnost ili ukinula antigenost terapijskih proteina, predloženi su neki postupci u kojima su proteini kemijski modificirani polimerima topljivima u vodi. Kemijska modifikacija tog tipa može učinkovito blokirati kontakt proteolitičkog enzima s proteinskom kralješnicom, čime se sprečava razgradnja. Kemijsko pričvršćivanje nekih polimera topljivih u vodi može učinkovito smanjiti bubrežni klirens zbog povećanog hidrodinamskog volumena molekule. Dodatne prednosti uključuju, u nekim okolnostima, povećanje stabilnosti i vremena cirkulacije terapijskog proteina, povećanu topljivost i smanjenu imunogenost. Poli(alkilen-oksid), naročito poli(etilen-glikol) (PEG), takva je kemijska jedinica koja je korištena u pripremi terapijskih proteinskih produkata (glagol "pegilirati" znači pričvrstiti bar jednu molekulu PEG). Pokazalo se da pričvršćenje poli(etilen-glikola) štiti od proteolize, Sada i sur., J. Fermentation Bioengineering 71:137-139 (1991), a dostupni su i postupci za pričvršćivanje nekih poli(etilen-glikolnih) jedinica. V. U.S. patent br. 4 179 337, Davis i sur., "Non-Immunogenic Polypeptides", objavljeno 18. prosinca 1979; i U.S. patent br. 4 002 531, Royer, "modifying enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby", objavljeno 11. siječnja 1977. Za pregled, v. Abuchowski i sur., u Enzymes as Drugs (J. S. Holcerberg i J. Roberts, ur., str. 367-383 (1981)).
Korišteni su i drugi polimeri topljivi u vodi, kao što su kopolimeri etilen-glikola i propilen-glikola, karboksimetilceluloza, dekstran, poli(vinil alkohol), poli(vinil-pirolidon), poli(-1,3-dioksolan), poli(-1,3,6-trioksan), kopolimer etilena i maleinskog anhidrida, poli-aminokiseline (bilo kao homopolimeri ili nasumični kopolimeri).
Opisano je više pegiliranih terapijskih proteina. ADAGEN®, pegilirana formulacija adenozin-deaminaze, odobren je za liječenje teške kombinirane imunodeficijencije. ONCASPAR®, pegilirana L-asparaginaza, odobren je za liječenje svih hipersenzitivnih pacijenata. Pegilirana superoksid-dismutaza je u kliničkim studijama liječenja ozljeda glave. Pegilirani α-interferon (US 5 738 846, 5 382 657) odobren je za liječenje hepatitisa; pegilirana glukocerebrozidaza i pegilirani hemoglobin su u prekliničkom testiranju. Još jedan primjer je pegilirani IL-6, EF 0 442 724, naslovljeno "Modificirani hIL-6", gdje su objavljene poli(etilen-glikolne) molekule dodane na IL-6.
Još jedan specifični terapijski protein, koji je kemijski modificiran, je faktor stimulacije kolonija granulocita (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF). G-CSF potiče brzu proliferaciju i oslobađanje neutrofilnih granulocita u krvotok i time postiže terapijski učinak u borbi protiv infekcije. Europska patentna prijava EP 0 401 384, objavljena 12. prosinca 1990, naslovljena "Kemijski modificiran faktor stimulacije kolonija granulocita", opisuje materijale i metode za pripremu G-CSF na koji su pričvršćene molekule poli(etilen-glikola). Modificirani G-CSF i njegovi analozi također su objavljeni u EP 0 473 268, objavljenoj 4. ožujka 1992, naslovljenoj "Kontinuirano otpuštanje farmaceutskih pripravaka koji sadrže polipeptid kovalentno konjugiran na polimer topljiv u vodi", koja započinje upotrebu raznih G-CSF i derivata kovalentno konjugiranih na čestice polimera topljive u vodi, kao što je poli(etilen-glikol). Modificirani polipeptid s aktivnošću ljudskog faktora stimulacije kolonija granulocita objavljen je u EP 0 335 423, objavljenoj 4. listopada 1989. U US 5 824 784 su dani postupci za N-terminalno modificirane proteine ili njihove analoge i nastale pripravke, uključujući nove N-terminalno kemijski modificirane pripravke G-CSF. US 5 824 778 objavljuje kemijski modificirani G-CSF.
Za poli(etilen-glikol) korišteno je više načina za pričvršćivanje molekula poli(etilen-glikola) na protein. Općenito, molekule poli(etilen-glikola) povezane su s proteinom putem reaktivne grupe na proteinu.
Amino-grupe, kao što su one na lizinskim ili N-terminalnim ostacima, uobičajene su za takvo pričvršćivanje. Na primjer, Royer (US pat. br. 4 002 531, ranije) navodi da je korištena reduktivna alkilacija za pričvršćivanje molekula poli(etilen-glikola) na enzim. EP 0 539 167, objavljena 28. travnja 1993, Wright, "Peg imidati i njihovi proteinski derivati", navodi da su peptidi i organski spojevi sa slobodnim amino-grupama modificirani imidatnim derivatom PEG ili srodnim organskim polimerima topljivima u vodi. US 5 298 643 i US 5 637 749 objavljuju PEG arilne imidate.
Chamow i sur., Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994) navode modifikaciju CD4 imunoadhezina monometoksipoli(etilen-glikol)aldehidom putem reduktivne alkilacije. Autori navode da je 50% CD4-Ig bilo MePEG-modificirano pod uvjetima koji omogućuju kontrolu nad opsegom pegilacije. Isto, str. 137. Autori također navode da se sposobnost vezanja modificiranog CD4-Ig in vitro (za protein gp 120) smanjila brzinom koja korelira s opsegom MePEGilacije, US pat. br. 4 904 584, Shaw, podneseno 27. veljače 1990, odnosi se na modifikaciju nekih lizinskih ostataka u proteinima za pričvršćenje poli(etilen-glikolnih) molekula putem reaktivnih amino-grupa.
Više postupaka pričvršćenja polimera za protein uključuje upotrebu jedinice koja djeluje kao vezna grupa. Takve jedinice, međutim, mogu biti antigene. Postoji postupak sa trezil-kloridom koji ne uključuje veznu grupu, ali taj postupak može biti neprikladan za proizvodnju terapijskih produkata, budući da upotreba trezil-klorida može dovesti do toksičnih popratnih produkata. V. Francis i sur, u: Stability of protein pharmaceuticals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization (ur. Ahern, T. i Manning, M.C., Plenum, New York, 1991). Također, Delgado i sur., "Coupling of PEG to Protein By Activation With Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Preparation", u Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Fisher i sur., ur., Plenum Press, New York, NY, 1989, str. 211-213.
V. također Rose i sur., Bioconjugate Chemistry 2: 154-159 (1991), gdje je objavljeno selektivno pričvršćivanje vezne grupe karbohidrazida na C-terminalnu karboksilnu grupu proteinskog supstrata (inzulin).
WO 93/00109 odnosi se na postupak stimulacije tkiva sisavaca ili ptica koja odgovaraju na GH, što obuhvaća održavanje kontinuirane, učinkovite koncentracije GH u plazmi kroz period od 3 ili više dana. Kao jedan od načina da se postigne takva koncentracija u plazmi navodi se upotreba GH povezanog na makromolekularnu tvar, kao što je PEG (polietilen-glikol). Navedeno je da povezivanje s makromolekularnom tvari rezultira poboljšanim poluživotom. PEGilirani ljudski hormon rasta objavljen je u WO 93/00109, uz upotrebu mPEG aldehida-5000 i mPEG N-hidroksisukcinimidil estera (mPEG-NHS-5000). Upotreba mPEG-NHS rezultira heterogenim smjesama višestrukih PEGiliranih oblika hGH. WO 93/00109 također objavljuje upotrebu mPEG-maleimida za PEGilaciju cisteina varijanti hGH.
WO 99/03887 objavljuje cisteinsku varijantu hormona rasta koja je PEGilirana. Označen kao BT-005, taj konjugat bi trebao biti učinkovitiji u stimulaciji porasta na težini u štakora kojima nedostaje hormon rasta, a trebao bi imati i dulji poluživot od hGH.
PEGilirani ljudski hormon rasta također je objavljen u CLark i sur., uz upotrebu sukcinimidil-estera karboksimetiliranog PEG (Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996). Clark i sur. opisuju derivat hGH povećane veličine upotrebom mPEG-NHS-5000, koji selektivno konjugira primarne amine. Povećana razina PEG modifikacije smanjuje afinitet za odgovarajući receptor i povećava EC50 u staničnom ispitivanju do 1500 puta. Olson i sur., Polymer Preprints 38:568-569, 1997, objavljuju upotrebu N-hidroksisukcinimid (NHS) PEG i sukcinimidil-propionat (SPA) PEG da bi se dobile višestruko pegilirane vrste hGH.
WO 94/20069 proročanski objavljuje PEGilirani hGH kao dio formulacije za plućnu primjenu.
US 4 179 337 objavljuje postupke PEGiliranja enzima i hormona da bi se dobili fiziološki aktivni neimunogeni polipeptidni konjugati topljivi u vodi. GH je spomenut kao jedan od primjera hormona koji su PEGilirani.
EP 458064 A2 objavljuje PEGilaciju uvedenih ili prirodno prisutnih cisteinskih ostataka u somatotropinu. EP 458064 A2 nadalje navodi ugradnju dvaju cisteinskih ostataka u petlju nazvanu omega-petljom, koja je navodno locijrana na ostacima 102-112 u goveđem somatotropinu divljeg tipa, a specifičnije, EP 458064 A2 objavljuje supstituciju ostataka pod brojem 102 i 112 goveđeg somatotropina od Ser u Cys, odnosno Tyr u Cys.
WO 95/11987 sugerira pričvršćivanje PEG na tiolnu grupu cisteinskog ostatka koji je prisutan u roditeljskoj molekuli ili uveden mjesno specifičnom mutagenezom. WO 95/11987 odnosi se na PEGilaciju proteaze neksin-1, međutim, sugerirana je općenita PEGilacija i hGH i drugih proteina.
WO 99/03887 objavljuje npr. hormon rasta modificiran umetanjem dodatnog cisteina umjesto serinskih ostataka i pričvršćivanje PEG na uvedene cisteinske ostatke.
WO 00/42175 odnosi se na postupak izrade proteina koji sadrže slobodne cisteinske ostatke za pričvršćenje PEG. WO 00/42175 objavljuje sljedeće muteine hGH: T3C, S144C i T148C, i njihovu cisteinsku PEGilaciju.
WO 9711178 (kao i US 5849535, US 6004931 i US 6022711) odnosi se na upotrebu varijanti GH kao agonista ili antagonista hGH. WO 9711178 također objavljuje PEGilaciju hGH, uključujući lizinsku PEGilaciju i uvođenje ili zamjenu lizina (npr. K168A i K172R). WO 9711178 također objavljuje supstituciju G120K.
Prethodna izvješća o PEGiliranom hGH zahtijevaju pričvršćivanje više PEG, što rezultira neželjenom heterogenošću produkta, da bi se postigao hidrodinamski volumen veći od 70K molekulske mase koja je granična za bubrežnu filtraciju, kako je opisano (Knauf, M.J. i sur., J. Biol. Chem. 263:15064-15070, 1988).
Molekula GH s duljim poluživotom u cirkulaciji smanjila bi broj potrebnih primjena i potencijalno omogućila optimalne terapijske razine hGH, uz istovremeno povećani terapijski učinak.
Ovaj izum daje kemijski modificirane konjugate hGH sa smanjenom heterogenošću, smanjenom stopom klirensa, povećanim trajanjem u plazmi, povećanom topljivošću, povećanom stabilnošću, smanjenom antigenošću ili kombinacijama navedenog.
Bit izuma
Ovaj se izum odnosi na kemijski modificirani hGH i njegove agonističke varijante koje imaju poboljšano bar jedno kemijsko ili fiziološko svojstvo, izabrano između, ali bez ograničenja, smanjene stope klirensa, povećanog trajanja u plazmi, povećane stabilnosti, povećane topljivosti i smanjene antigenosti. Tako ovaj izum, kako je detaljnije opisano u nastavku, ima više aspekata s obzirom na kemijski modificirani hGH i njegove agonističke varijante, kao i na specifične modifikacije koje koriste razne poli(etilen-glikolne) jedinice.
Ovaj se izum također odnosi na postupke proizvodnje kemijski modificiranog hGH i njegovi agonističkih varijanti.
Ovaj se izum također odnosi na pripravke koji sadrže kemijski modificirani hGH i njegove agonističke varijante.
Modificirani hGH i njegove agonističke varijante ovog izuma mogu biti korisni u liječenju, ali bez ograničenja, patuljastog rasta (GHD), adultne GHD, Turnerovog sindroma, dugotrajnog liječenja zastoja rasta u djece koja su rođena prekratka za gestacijsku dob (SGA), za liječenje pacijenata oboljelih od Prader-Willi sindroma (PWS), kronične bubrežne insuficijencije (CRI), iscrpljivanja kod AIDS-a, starenja, terminalnog zatajenja bubrega i cistične fibroze.
Kratki opis crteža
Slika 1 je reprodukcija reduktivne i nereduktivne SDS-PAGE analize produkata reakcije hGH i 20K PEG-ALD te 20K PEG-ALD hGH pročišćenog izmjenom aniona. Traka 1. Proteinski standard (molekulske mase); traka 2. reducirani hGH - 10 μg; traka 3. reducirana 20K linearna PEG-ALD hGH reakcijska smjesa - 10 μg; traka 4. reducirani 20K linearni PEG-ALD hGH pročišćen izmjenom aniona - 10 μg; traka 5. prazno; traka 6. nereducirani hGH - 10 μg; traka 7. nereducirana 20 K linearna PEG-ALD hGH reakcijska smjesa - 10 μg; traka 8. nereducirani 20K linearni PEG-ALD hGH pročišćen izmjenom aniona - 10 μg; traka 9. prazno; traka 10. proteinski standard (molekulske mase).
Slika 2 je reprodukcija nereduktivne SDS-PAGE analize raznih pegiliranih hGH molekula pročišćenih izmjenom aniona. Traka 1. proteinski standardi (molekulske mase); traka 2. hGH - 10 μg; traka 2. 4-6× 5K PEG-SPA hGH - 10 μg; traka 3. 20K linearni PEG-ALD hGH - 10 μg; traka 4. 20K razgranati PEG-ALD hGH - 10 μg; traka 5. 40K razgranati PEG hGH - 10 μg.
Slika 3 prikazuje reprodukciju RP-HPLC elucijskih profila za produkte tripsinske digestije hGH, 40K Br PEG-ALD hGH i 40K Br PEG-NHS hGH. PEG, povezan primarno na N-kraj hGH (kako je prikazano u 40K Br ALD hGH), rezultira u redukciji vrha N-terminalnog (T1) fragmenta, uz nastajanje novog PEGiliranog T1 vrha.
Slika 4 uspoređuje bioaktivnost in vivo nePEGiliranog hGH, davanog dnevno (0,3 mg/kg/dan) i mono-PEGiliranog hGH doziranog supkutano (SC) jednom u svakih šest dana (1,8 mg/kg), ilustrirajući prinos mase hipofizektomiranih štakora kroz period od 11 dana.
Slika 5 uspoređuje bioaktivnost in vivo nePEGiliranog hGH, davanog SC dnevno (0,3 mg/kg/dan) i 4-6× 5K PEG-SPA-HGH, mono-PEGiliranog 20K razgranatog PEG-ALD hGH i mono-PEGiliranog 40K razgranatog PEG-ALD hGH, svaki je doziran SC jednom u svakih šest dana (1,8 mg/kg), ilustrirajući prinos mase hipofizektomiranih štakora kroz period od 11 dana.
Slika 6 uspoređuje bioaktivnost in vivo nePEGiliranog hGH, davanog SC dnevno (0,3 mg/kg/dan) i 4-6× 5K PEG-CMHBA-hGH, mono-PEGiliranog 20K linearnog ALD, mono-PEGiliranog 30K linearnog ALD, mono-PEGiliranog 20K razgranatog PEG-ALD hGH i mono-PEGiliranog 40K razgranatog PEG-ALD hGH, svaki je doziran SC jednom u svakih šest dana (1,8 mg/kg), ilustrirajući povećanje rasta tibijalne kosti u hipofizektomiranih štakora kroz period od 11 dana.
Slika 7 uspoređuje bioaktivnost in vivo jedne SC doze od 1,8 mg/kg nePEGiliranog hGH, mono-PEGiliranog 5K linearnog PEG-ALD hGH, mono-PEGiliranog 20K linearnog PEG-ALD hGH, mono-PEGiliranog 20K razgranatog PEG-ALD hGH, mono-PEGiliranog 20K linearnog PEG-hidrazid hGH, mono-PEGiliranog 30K linearnog PEG-ALD hGH, mono-PEGiliranog 40K razgranatog PEG-ALD hGH, 4-6× 5K PEG SPA hGH, 4-6× 5K PEG-CMHBA hGH, ilustrirajući porast u razini IGF-1 u plazmi hipofizektomiranih štakora kroz period od 9 dana.
Detaljni opis
hGH i njegove agonističke varijante članovi su obitelji rekombinantnih proteina, opisanih u US 4 658 021 i US 5 633 352. Njihova rekombinantna proizvodnja i postupci upotrebe detaljno su opisani u US 4 342 832, 4 601 980; US 4 898 830; US 5 424 199 te US 5 795 745.
U ovom izumu moguće je koristiti bilo koji oblik pročišćenog i izoliranog hGH ili njegove agonističke varijante, proizveden u stanicama domaćina, kao što su E. coli i animalne stanice transformirane ili transfecirane upotrebom rekombinantnih genetičkih tehnika. Dodatne varijante hGH opisane su u U.S. ser. br. 07/715 300, podnesenoj 14. lipnja 1991 i ser. br. 07/743 614, podnesenoj 9. kolovoza 1991, te WO 92/09690, objavljenoj 11. lipnja 1992. Među njima, naročito su poželjni hGH ili njegova agonistička varijanta, proizvedena u transformiranoj E. coli. Takav hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se dobiti u velikim količinama visoke čistoće i homogenosti. Na primjer, gore opisani hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se pripremiti prema postupcima opisanima u US 4 342 832, 4 601 980; US 4 898 830; US 5 424 199 i US 5 795 745. Izraz "u biti ima sljedeću aminokiselinsku sekvencu" znači da gornja aminokiselinska sekvenca može uključivati jednu ili više promjena aminokiselina (delecija, adicija, insercija ili zamjena), sve dok takve promjene ne uzrokuju neku nepovoljnu nesličnost u funkciji u usporedbi s hGH ili njegovom agonističkom varijantom. Poželjnije je koristiti hGH ili njegovu agonističku varijantu koji u biti posjeduje takvu aminokiselinsku sekvencu, u kojoj je uključen bar jedan lizin, asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, nespareni cisteinski ostatak, slobodna N-terminalna α-amino-grupa ili slobodna C-terminalna karboksilna grupa.
U skladu s ovim izumom, poli(etilen-glikol) je kovalentno vezan kroz aminokiselinske ostatke hGH ili njegove agonističke varijante. Stručnjaku područja poznat je cijeli niz aktiviranih poli(etilen-glikola) koji posjeduju različite funkcionalne grupe, veznike, konfiguracije i molekulske mase, a koje je moguće koristiti u stvaranju PEG-hGH konjugata ili PEG-hGH agonističkih varijanti konjugata (za pregled, v. Roberts M.J. i sur., Adv. Drug Del. Rev. 54:459-476, 2002, Harris J.M. i sur., Drug Delivery Systems 40:538-551, 2001). Aminokiselinski ostatak može biti bilo koji reaktivni ostatak koji ima, na primjer, slobodnu amino, karboksilnu, sulfhidrilnu (tiolnu), hidroksilnu, gvanidilnu ili imidizoilnu grupu, na koju se može vezati terminalna reaktivna grupa aktiviranog poli(etilen-glikola). Aminokiselinski ostaci sa slobodnim amino-grupama mogu uključivati lizinske ostatke i/ili N-terminalne aminokiselinske ostatke, oni sa slobodnom karboksilnom grupom mogu uključivati asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu i/ili C-terminalne aminokiselinske ostatke, sa slobodnom sulfhidrilnom (tiolnom) grupom je npr. cistein, sa slobodnom hidroksilnom grupom su npr. serin ili tirozin, sa slobodnom gvanidilnom grupom je npr. arginin, a slobonu imidizoilnu grupu ima npr. histidin.
U drugom ostvarenju, oksimske kemijske reakcije (Lemieux & Bertozzi Tib Tech 16:506-513, 1998) koriste se za modifikaciju N-terminalnih serinskih ostataka.
Poli(etilen-glikol) korišten u ovom izumu nije ograničen na neki određeni oblik ili raspon molekulskih masa. Molekulska masa poli(etilen-glikola) može varirati između 500 i 100 000. Uobičajeno je koristiti molekulsku masu od 500-60 000, a poželjno od 1000 do 40 000. Još su poželjnije molekulske mase veće od 5000 do oko 40 000.
U drugom ostvarenju, poli(etilen-glikol) je razgranati PEG koji sadrži više od jedne jedinice PEG. Poželjni primjeri razgranatih PEG opisani su u U.S. 5 932 462; U.S. 5 342 940; U.S. 5 643 575; U.S. 5 919 455; U.S. 6 133 906; U.S. 5 183 660; WO 02/09766; Kodera Y., Bioconjugate Chemistry 5:283-288 (1994); te Yamasaki i sur., Agric. Biol. Chem., 52:2125-2127, 1998. U poželjnom ostvarenju, molekulska masa svakog poli(etilen-glikola) razgranatog PEG je od 5000 do 20 000.
Poli(alkilen-oksidi), naročito poli(etilen-glikoli), vezani su na hGH ili njegovu agonističku varijantu putem terminalne reaktivne grupe, koja može ili ne mora ostaviti veznu jedinicu (razmak) između PEG i proteina. Da bi nastali konjugati hGH ili njegovih agonističkih varijanti ovog izuma, polimeri, kao što su poli(alkilen-oksid) se prevode u aktivirane oblike, izraz koji je poznat stručnjacima područja. Reaktivna grupa, na primjer, je terminalna reaktivna grupa, koja posreduje vezu između kemijskih jedinica proteina, kao što su amino, karboksilne ili tiolne grupe, i poli(etilen-glikola). Tipično, jedna ili više terminalnih polimernih hidroksilnih krajnjih grupa (npr. alfa i omega terminalne hidroksi-grupa) prevode se u reaktivne funkcionalne grupe, što omogućuje kovalentnu konjugaciju. Taj se proces često naziva "aktivacija", a poli(etilen-glikolni) produkt koji ima reaktivnu grupu nakon toga se naziva "aktivirani poli(etilen-glikol)". Polimeri koji sadrže i α i ε-vezne grupe nazivaju se "bis-aktivirani poli(alkilen-oksidi)" i nazivaju se "bifunkcionalni". Polimeri koji sadrže istu reaktivnu grupu na α i ε-terminalnim hidroksilnim grupama ponekad se nazivaju "homobifunkcionalni" ili "homobis-aktivirani". Polimeri koji sadrže različite reaktivne grupe na α i ε-terminalnim hidroksilnim grupama ponekad se nazivaju "heterobifunkcionalni" (v. npr. WO 01/26692) ili "heterobis-aktivirani". Polimeri koji sadrže jednu reaktivnu grupu nazivaju se "mono-aktivirani" polialkilen-oksidi ili "mono-funkcionalni". Drugi, u biti neantigeni polimeri, slično tome su "aktivirani" ili "funkcionalizirani".
Aktivirani polimeri prikladni su za posredovanje veze između kemijskih jedinica proteina, kao što su α ili ε-amino, karboksilna ili tiolna grupa, i poli(etilen-glikola). Bis-aktivirani polimeri na taj način mogu reagirati s dvije proteinske molekule ili, u drugom ostvarenju, jednom proteinskom molekulom i reaktivnom malom molekulom, da bi nastali konjugati proteinskih polimera ili proteina i malih molekula, kroz poprečne veze.
Funkcionalne grupe koje mogu reagirati s amino-terminalnim α-amino-grupama ili ε-amino-grupama lizina na hGH ili njegovim agonističkim varijantama uključuju: N-hidroksisukcinimidil-estere, karbonate, kao što su p-nitrofenil ili sukcinimidil (US 5 808 096, 5 612 460, US 5 324 844, US 5 122 614); karbonil, imidazol, azlaktone (US 5 321 095, US 5 567 422); cikličke imidne tione (US 405 877, 5 349 001); izocijanate ili izotiocijanate (Greenwald R.B., J. Org. Chem., 60:331-336, 1995); trezil-klorid (EP 714 402, EP 439 508); halogene formijate (WO 96/40792) i aldehide.
Funkcionalne grupe koje mogu reagirati s karboksilnim grupama, reaktivnim karbonilnim grupama i oksidiranim ugljikohidratnim jedinicama na hGH ili njegovim agonističkim varijantama uključuju primarne amine te hidrazin i hidrazidne funkcionalne grupe, kao što su acil-hidrazidi, karbazati, semikarbamati, tiokarbazati itd. (WO 01/70685).
Merkapto-grupe, ukoliko su dostupne na hGH ili njegovim agonističkim varijantama, također se mogu koristiti kao mjesta pričvršćenja za prikladno aktivirane polimere s reaktivnim grupama kao što su tioli; maleimidi, sulfoni i fenil-glioksali; v. npr. U.S. pat. br. 5 093 531, čija je objava ovdje u potpunosti uključena citatom. Ostali nukleofili koji mogu reagirati s elektrofilnim centrom uključuju, ali bez ograničenja, na primjer, hidroksil, amino, karboksil, tiol, aktivni metilen i slično.
Također su uključeni polimeri koji sadrže lipofilne i hidrofilne jedinice objavljene u US 5 359 030 i US 5 681 811; US 5 438 040 i US 5 359 030.
U WO 98/32466 objavljeni su halogenirani PEG koji mogu reagirati s amino i tiolnim grupama, te aromatskim hidroksi-grupama, koje izravno kovalentno vežu PEG na protein.
U jednom poželjnom ostvarenju ovog izuma nastaju sekundarne aminske ili amidne veze kroz N-terminalnu α-amino-grupu ili ε-amino-grupu lizina hGH ili njegove agonističke varijante i aktiviranog PEG. U drugom poželjnom aspektu ovog izuma, nastaje sekundarna aminska veza između N-terminalne primarne α- ili ε-amino-grupe hGH ili njegove agonističke varijante i jednostavnog ili razgranatog lanca PEG-aldehida, redukcijom s prikladnim reducirajućim sredstvom, kao što su NaCNBH3, NaBH3, piridin-boran itd., kako je opisano u Chamow i sur., Bioconjugate Chem. 5:133-140 (1994) i US pat. br. 5 824 784.
U poželjnom ostvarenju, barem 70%, poželjno barem 80%, poželjno barem 81%, poželjno barem 82%, poželjno barem 83%, poželjno barem 84%, poželjno barem 85%, poželjno barem 86%, poželjno barem 87%, poželjno barem 88%, poželjno barem 89%, poželjno barem 90%, poželjno barem 91%, poželjno barem 92%, poželjno barem 93%, poželjno barem 94%, poželjno barem 95%, poželjno barem 96%, poželjno barem 97% i, najpoželjnije, barem 98% poli(etilen-glikola) je na amino-terminalnoj α-amino-grupi.
U drugom poželjnom ostvarenju ovog izuma, za vezu između hGH ili njegove agonističke varijante i polimera korišteni su polimeri aktivirani veznicima koji tvore amide, kao što su sukcinimidil-esteri, ciklički imidni tioni i slično, v. npr. U.S. pat. br. 5 349 001; U.S. pat. br. 5 405 877 te Greenwald i sur., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000, sve je ovdje uključeno citatom. Jedan od poželjnih aktiviranih poli(etilen-glikola), koji može biti vezan na slobodne amino-grupe hGH ili njegove agonističke varijante, uključuje jednostruki ili razgranati lanac N-hidroksisukcinilimid-poli(etilen-glikol), a može se prirediti aktiviranjem estera sukcinske kiseline poli(etilen-glikola) s N-hidroksisukcinilimidom.
Druga poželjna ostvarenja ovog izuma uključuju druge aktivirane polimere koji tvore kovalentne veze polimera s hGH ili njegovom agonističkom varijantom putem ε-amino ili drugih grupa. Na primjer, izocijanatni ili izotiocijanatni oblici terminalno aktiviranih polimera mogu se koristiti za stvaranje veza na bazi ureje ili tioureje, s lizinskim amino-grupama (Greenwald R.B., J. Org. Chem., 60:331-336, 1995).
U još jednom poželjnom ostvarenju ovog izuma, nastaju karbamatne (uretanske) veze s proteinskim amino-grupama, kako je opisano u U.S. pat. br. 5 122 614, 5 324 844 i 5 612 640, ovdje uključeni citatom. Primjeri uključuju polimere aktivirane N-sukcinimidil-karbonatom, para-nitrofenil-karbonatom i karbonil-imidazolom. U drugom poželjnom ostvarenju ovog izuma, benzotriazol-karbonatni derivat PEG vezan je na amino-grupe hGH ili njegove agonističke varijante.
Još jedan aspekt ovog izuma predstavlja prolijek ili oblik s odgođenim otpuštanjem hGH ili njegove agonističke varijante, koji se sastoji od polimera topljivog u vodi, kao što je poli(etilen-glikol), pričvršćen na molekulu hGH ili njegove agonističke varijante putem fukcionalnog veznika koji se predvidivo može razgraditi enzimskom ili pH-usmjerenom hidrolizom da bi se oslobodio slobodni hGH ili njegova agonistička varijanta, ili neki drugi derivat hGH ili njegove agonističke varijante. Prolijek može također biti "dvostruki prolijek" (Bundgaard, u Advanced Drug Delivery Reviews 3:39-65, 1989), uključujući zadržavanje kroz kaskadu. U takvim sustavima, hidrolitička reakcija uključuje početni korak, koji određuje brzinu (spori), usmjeren enzimatskim ili pH djelovanjem, te drugi korak, koji uključuje brzu neenzimatsku hidrolizu koji se odvija tek nakon što je gotov prvi korak. Takva oslobodivi polimer omogućuje proteinske konjugate, koji su kratkotrajni i mogu djelovati kao rezervoar koji kontinuirano otpušta hGH ili njegovu agonističku varijantu. Takvi fukcionalni veznici opisani su u US 5 614 549; US 5 840 900; US 5 880 131; US 5 965 119; US 5 965 565; US 6 011 042; US 6 153 655; US 6 180 095 B1; US 6 413 507; Greenwald R.B. i sur., J. Med. Chem. 42: 3657-3667, 1999; Lee S. i sur., Bioconjugate Chem. 12:163-169, 2001; Garman A.J. i sur., FEBS Lett. 223:361-365, 1987; Woghiren C. i sur., Bioconjugate Chem. 4:314-318, 1993; Roberts M.J. i sur., J. Pharm. Sci. 87:1440-1445, 1998; Zhao X. u Ninth Int. Symp. Recent Adv. Drug Delivery Syst. 199; Greenwald R.B. i sur., J. Med. Chem. 43:475-487, 2000; Greenwald R.B. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101-161, 2000 i Zalipsky i sur., 28th Int. Symp. on Controlled Release of Bioactive Materials 1; 73-74, 2001.
Konjugacijske reakcije, nazvane reakcijama pegilacije, prije su se izvodile u otopini s molarnim suviškom polimera i bez posebne pažnje o tome gdje će se polimer pričvrstiti na protein. Takve opće tehnike pokazale su se, međutim, neodgovarajućim za konjugiranje bioaktivnih proteina na neantigene polimere, uz istovremeno zadržavanje dovoljne bioaktivnosti. Jedan od načina za zadržavanje bioaktivnosti hGH ili njegove agonističke varijante jest izbjegavanje konjugaciju onih reaktivnih grupa hGH ili njegove agonističke varijante, povezanih s receptorskim veznim mjestima, u procesu spajanja s polimerom. Drugi aspekt ovog izuma je omogućavanje postupka konjugiranja poli(etilen-glikola) na hGH ili njegovu agonističku varijantu, pri čemu se zadržava visoka razina očuvane aktivnosti.
Kemijska modifikacija kovalentnom vezom može se provesti pod bilo kojim prikladnim uvjetom koji je općenito usvojen u reakciji biološki aktivne tvari s aktiviranim poli(etilen-glikolom). Reakcija konjugacije provodi se u relativno blagim uvjetima, da bi se izbjeglo inaktiviranje hGH ili njegove agonističke varijante. Blagi uvjeti uključuju održavanje pH reakcijske otopine u rasponu od 3 do 10, a reakcijske temperature u rasponu od oko 0°C do 37°C. U slučajevima kad reaktivni aminokiselinski ostaci hGH ili njegove agonističke varijante imaju slobodne amino-grupe, gornju modifikaciju poželjno je provoditi u neograničavajućem broju prikladnih pufera (pH 3 do 10), uključujući fosfatni, MES, citratni, acetatni, sukcinatni ili HEPES pufer, tijekom 1-48 h pri 4-37°C. Kod ciljanja na N-terminalne amino-grupe reagenskima kao što su PEG aldehidi, poželjno je održavati pH 4-8. Aktivirani poli(etilen-glikol) može se koristiti u količini od oko 0,05-100 puta, poželjno oko 0,01-2,5 puta molarne količine broja slobodnih amino-grupa hGH ili njegove agonističke varijante. S druge strane, kad reaktivni aminokiselinski ostaci hGH ili njegove agonističke varijante posjeduju slobodne karboksilne grupe, gornju modifikaciju poželjno je provesti u pH od oko 3,5 do oko 5,5, na primjer, modifikacija poli(oksietilendiaminom) provodi se u prisutnosti karbodiimida (pH 3,5-5) kroz 1-24 h pri 4-37°C. Aktivirani poli(etilen-glikol) može se koristiti u količini 0,05-300 puta molarne količine broja slobodnih karboksilnih grupa hGH ili njegove agonističke varijante.
U pojedinačnim ostvarenjima, gornja granica količine polimera uključenog u konjugacijske reakcije prelazi oko 1:1 do razmjera u kojem je moguća reakcija aktiviranog polimera i hGH ili njegove agonističke varijante, bez nastajanja znatnih količina oblika visoke molekulske mase, tj. više od oko 20% konjugata koji sadrže više od oko jednog polimernog lanca po molekuli hGH ili njegove agonističke varijante. Na primjer, u ovom aspektu izuma smatra se da je moguće koristiti omjere do oko 6:1 da bi nastajale značajne količine željenih konjugata, koji se zatim mogu izolirati iz bilo kojeg oblika visoke molekulske mase.
U još jednom aspektu ovog izuma, moguće je koristiti bifukcionalno aktivirane derivate PEG da bi nastali polimerni hGH ili njegove agonističke varijante u kombinaciji s PEG, u kojima je više molekula hGH ili njegovih agonističkih varijanti unakrsno povezano putem PEG. Iako ovdje opisani reakcijski uvjeti mogu rezultirati značajnim količinama nemodificiranog hGH ili njegove agonističke varijante, nemodificirani hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se lako reciklirati u sljedećim serijama dodatnih konjugacijskih reakcija. Postupci ovog izuma stvaraju iznenađujuće vrlo malo, tj. manje od oko 30%, a još poželjnije manje od oko 10% oblika visoke molekulske mase i oblika koji sadrže više od jednog polimernog lanca po molekuli hGH ili njegove agonističke varijante. Ovi reakcijski uvjeti suprotni su tipično korištenim uvjetima u polimernim konjugacijskim reakcijama, gdje je aktivirani polimer prisutan u višestrukom molarnom suvišku u odnosu na ciljnu molekulu. U drugim aspektima izuma, polimer je prisutan u količinama od oko 0,1/amino-grupi do oko 50 ekvivalenata po ekvivalentu hGH ili njegove agonističke varijante. U ostalim aspektima ovog izuma, polimer je prisutan u količinama od oko 1 do oko 10 ekvivalenata po ekvivalentu hGH ili njegove agonističke varijante.
Konjugacijske reakcije ovog izuma isprva daju reakcijsku smjesu ili "pool", koji sadrži mono- i di-PEG-hGH konjugate, nereagirani hGH, nereagirani polimer, i obično manje od oko 20% oblika visoke molekulske mase. Oblici visoke molekulske mase uključuju konjugate koji sadrže više od jednog polimernog lanca i/ili polimeriziranog PEG-hGH ili njegove agonističke varijante. Nakon uklanjanja nereagiranih oblika i oblika visoke molekulske mase, prikupljaju se pripravci koji sadrže primarno mono- i di-polimer-hGH konjugate ili konjugate s njegovom agonističkom varijantom. Uzevši u obzir činjenicu da konjugati većim dijelom uključuju jedan polimerni lanac, konjugati su u biti homogeni. Ti modificirani hGH ili njegove agonističke varijante imaju barem oko 0,1% biološke aktivnosti in vitro povezane s nativnim ili nemodificiranim hGH ili njegovom agonističkom varijantom, kako je izmjereno standardnim testom proliferacije FDC-P1 stanica (Clark i sur., Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996), testom receptorskog vezivanja (US 5 057 417) ili testom rasta hipofizektomiranog štakora (Clark i sur., Journal of Biological Chemistry 271:21969-21977, 1996). Međutim, u poželjnim aspektima ovog izuma, modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta imaju oko 25% biološke aktivnosti in vitro, poželjnije je da modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta imaju oko 50% biološke aktivnosti in vitro, još poželjnije je da modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta imaju oko 75% biološke aktivnosti in vitro, a najpoželjnije je da modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta imaju ekvivalentnu ili poboljšanu biološku aktivnost in vitro.
Poželjno je da postupci ovog izuma uključuju ograničene omjere polimera i hGH ili njegove agonističke varijante. Tako je utvrđeno da su konjugati hGH ili njegove agonističke varijante uglavnom ograničeni na oblike koji sadrže samo jedan polimerni lanac. Nadalje, pričvršćenje polimera na reaktivne grupe hGH ili njegove agonističke varijante znatno je manje nasumično u usporedbi sa situacijama kad je korišten viši molarni suvišak polimernog veznika. Nemodificirani hGH ili njegova agonistička varijanta prisutna u reakcijskoj smjesi, nakon gašenja konjugacijske reakcije, može se reciklirati u sljedećim reakcijama upotrebom ionske izmjene ili kromatografije uz isključenje veličine, ili sličnim separacijskim tehnikama.
hGH ili njegova agonistička varijanta modificirana poli(etilen-glikolom), tj. kemijski modificirani protein u skladu s ovim izumom, može se iz reakcijske smjese pročistiti uobičajenim postupcima, kao što su dijaliza, isoljavanje, ultrafiltracija, ionsko-izmjenjivačka kromatografija, kromatografija hidrofobnih interakcija (HIC), gel-kromatografija i elektroforeza. Ionsko-izmjenjivačka kromatografija naročito je učinkovita u uklanjanju nereagiranog poli(etilen-glikola) i hGH ili njegove agonističke varijante. U daljnjem ostvarenju ovog izuma, oblici mono- i di-polimer-hGH ili njegove agonističke varijante izoliraju se iz reakcijske smjese da bi se uklonili oblici visoke molekulske mase te nemodificirani hGH ili njegova agonistička varijanta. Separacija se postiže postavljanjem miješanog oblika u pufersku otopinu koja sadrži oko 0,5-10 mg/mL konjugata hGH ili njegove agonističke varijante i polimera. Prikladne otopine imaju pH od oko 4 do oko 8. Poželjno je da otopine sadrže jednu ili više puferskih soli, izabranih između KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H i NaOH.
Ovisno o reakcijskom puferu, otopina konjugata hGH ili njegove agonističke varijante i polimera može najprije proći kroz izmjenu pufera/ultrafiltraciju da bi se uklonio nereagirani polimer. Na primjer, otopina konjugata PEG-hGH ili njegove agonističke varijante može se ultrafiltrirati kroz membranu koja ograničava niske molekulske mase (10 000 do 30 000 Da), da bi se uklonila većina neželjenog materijala, kao što je nereagirani polimer, surfaktanti, ukoliko su prisutni, i slično.
Frakcioniranje konjugata u smjesu koja sadrži željene oblike naročito je poželjno provoditi u mediju za ionsko-izmjenjivačku kromatografiju. Takvi mediji mogu selektivno vezivati konjugate PEG-hGH ili njegove agonističke varijante na temelju razlike u naboju, što varira na svojevrsno predvidiv način. Na primjer, površinski naboj hGH ili njegove agonističke varijante određen je brojem nabijenih grupa na površini proteina. Te nabijene grupe tipično služe kao potencijalne točke pričvršćenja poli(alkilen-oksidnih) polimera. Dakle, konjugati hGH ili njegove agonističke varijante imat će različit naboj od drugih oblika, što omogućuje selektivnu izolaciju.
U postupcima ovog izuma korištene su izrazito polarne smole za anionsku ili kationsku izmjenu, kao što su kvaterne aminske ili sulfopropilne smole. Naročito su poželjne ionsko-izmjenjivačke smole. Neograničavajući niz uključenih komercijalno dostupnih kationsko-izmjenjivačkih smola prikladnih za upotrebu u sklopu ovog izuma čine SP-hitrap®, SP Sepharose® i SP Sepharose® brzog protoka. Moguće je koristiti i druge prikladne kationsko-izmjenjivačke smole, npr. S i CM smole. Neograničavajući niz anionsko-izmjenjivačkih smola, uključujući niz uključenih komercijalno dostupnih anonsko-izmjenjivačkih smola prikladnih za upotrebu u sklopu ovog izuma čine Q-hitrap®, Q Sepharose HP® i Q sepharose® brzog protoka. Moguće je koristiti i druge prikladne anionsko-izmjenjivačke smole, npr. DEAE smole.
Na primjer, anionsko- ili kationsko-izmjenjivačka smola poželjno je pakirana u kolonu i uravnotežena konvencionalnim postupkom. Koristi se pufer koji ima isti pH i osmolalnost kao i polimer konjugiran na hGH ili njegovu agonističku varijantu. Poželjno je da pufer za eluciju sadrži jednu ili više soli izabranih između KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 i (NH4)2CO3. Otopina koja sadrži konjugat adsorbira se na kolonu s nereagiranim polimerom i nekim oblicima visoke molekulske mase koji se ne zadržavaju. Po završetku nanošenja, na kolonu se primjenjuje gradijent protoka elucijskog pufera uz porast koncentracije soli, da bi se eluirala željena frakcija polialkilen-oksid-konjugiranog hGH ili njegove agonističke varijante. Poželjno je da se eluirane spojene frakcije ograniče na uniformne polimerne konjugate nakon koraka kationske ili anionske izmjene. Oblici nekonjugiranog hGH ili njegove agonističke varijante zatim se mogu ponovno isprati s kolone uobičajenim tehnikama. Ukoliko je opželjno, mono- i višestruko pegilirani hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se dodatno razdvojiti dodatnom ionsko-izmjenjivačkom kromatografijom ili kromatografijom uz isključenje veličine.
Također je moguće koristiti postupke koji koriste višestruke izokratne korake povećanja koncentracije soli ili pH. Višestruki izokratni elucijski koraci povećanja koncentracije rezultirat će uzastopnom elucijom di- i zatim mono-hGH ili njegove agonističke varijante-polimernih konjugata.
Temperaturni raspon za eluciju je između 4°C i oko 25°C. Poželjno je eluciju provoditi na temperaturi između oko 4°C i oko 22°C. Na primjer, elucija frakcije PEG-hGH ili njegove agonističke varijante detektira se UV apsorbancijom na 280 nm. Prikupljanje frakcija može se postići jednostavnim vremenskim elucijskim profilima.
U postupcima konjugacije poli(etilen-glikolnog) polimera sa hGH ili njegovom agonističkom varijantom moguće je koristiti surfaktant. Prikladni surfaktanti uključuju sredstva ionskog tipa, kao što je natrijev dodecil-sulfat (SDS). Moguće je koristiti i druge ionske surfaktante, kao što su litijev dodecil-sulfat, kvaterne amonijeve spojeve, taurokolinsku kiselinu, kaprilnu kiselinu, dekan-sulfonsku kiselinu, itd. Moguće je koristiti i neionske surfaktante, na primjer, materijale kao što su poli(oksietilen)-sorbitani (Tween) i poli(oksietilen)-eteri (Triton). V. također Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992), Calbiochem. Corp. Jedino ograničenje upotrebe surfaktanata u postupcima ovog izuma jest to da se oni koriste u uvjetima i koncentracijama koje ne uzrokuju značajnu ireverzibilnu denaturaciju hGH ili njegove agonističke varijante i ne inhibiraju u potpunosti polimernu konjugaciju. Surfaktanti su prisutni u reakcijskoj smjesi u količinama od oko 0,01-0,5%; poželjno oko 0,05-0,5%, a najbolje oko 0,075-0,25%. Moguće je upotrijebiti i smjese surfaktanata.
Smatra se da surfaktanti omogućuju privremeni, reverzibilni zaštitni sustav tijekom procesa polimerne konjugacije. Surfaktanti su se pokazali učinkovitima u selektivnom sprečavanju nastajanja polimernih agragata, dok istovremeno omogućuju odvijanje konjugacije na bazi lizina ili amino-kraja.
Ovdje opisan poli(etilen-glikol)-modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta ima trajniji farmakološki učinak, što se može pripisati njegovom produljenom poluživotu in vivo.
Nadalje, ovdje opisan poli(etilen-glikol)-modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta mogu se koristiti u liječenju hipopituiratrnog patuljastog rasta (GHD), nedostatnosti hormona rasta u odraslih, Turnerovog sindroma, zastoja rasta u djece rođene prekratke za gestacijsku dob (SGA), Prader-Willi sindroma (PWS), kronične bubrežne insuficijencije (CRI), iscrpljivanja kod AIDS-a i starenja.
Ovdje opisan poli(etilen-glikol)-modificirani hGH ili njegova agonistička varijanta može se formulirati u farmaceutike koji sadrže i farmaceutski prihvatljivo sredstvo za razrjeđivanje, sredstvo za pripremu izotoničke otopine, za održavanje pH i slično, u svrhu primjene u pacijenta.
Gore navedeni farmaceutici mogu se primijeniti supkutano, intramuskularno, intravenski, pulmonarno, intradermalno ili oralno, ovisno o cilju liječenja. Doza se može bazirati na vrsti i stanju bolesti pacijenta kojeg se liječi, u rasponu od 0,1 mg i 5 mg putem injekcije i od 0,1 mg do 50 mg oralnom primjenom u odraslih.
Poželjno je da su uključene polimerne tvari također topljive u vodi na sobnoj temperaturi. Neograničavajući niz takvih polimera uključuje poli(alkilen-oksidne) homopolimere, kao što su poli(etilen-glikol) ili poli(propilen-glikoli), poli(oksietilenirani polioli), njihovi kopolimeri i kopolimeri u bloku, uz održavanje topljivosti bloka kopolimera u vodi.
Kao alternativa polimerima na bazi PEG, moguće je učinkovito koristiti neantigene materijale kao što su dekstran, poli(vinil-pirolidoni), poli(akrilamidi), poli(vinil-alkoholi), polimere na bazi ugljikohidrata i slično. Naime, aktivacija α- i ω-terminalnih grupa ovih polimernih tvari može se postići na način sličan onom koji je korišten u konverziji poli(alkilen-oksida) i time je razumljiv za stručnjake. Stručnjak područja shvatit će da je prethodni popis samo ilustrativan i da su uključeni svi polimerni materijali sa svojstvima koja odgovaraju ranije opisanima. Za namjene ovog izuma, "učinkovito neantigeno" znači da su svi materijali opisani u ovog djelu netoksični i ne potiču zamjetni imunogeni odgovor u sisavaca.
Definicije
U nastavku slijedi popis kratica i odgovarajućih značenja kako su ovdje naizmjence korištena:
g gram(i)
mg miligram(i)
ml ili mL mililitri
ST sobna temperatura
PEG poli(etilen-glikol)
Cjelokupni sadržaj svih publikacija, patenata i patentnih prijava citiranih u ovoj objavi ovdje je uključen citatom, kao što je i za svaku pojedinačnu publikaciju, patent ili patentnu prijavu specifično i pojedinačno naznačeno da su uključeni citatom.
Iako je ovaj izum detaljnije opisan putem ilustracija i primjera u svrhu jasnijeg razumijevanja, stručnjaku područja bit će očito da su, u sklopu uputa ovog izuma, moguće promjene i modifikacije bez udaljavanja od duha i cilja ovog izuma. Sljedeći primjeri dani su samo radi pojašnjavanja i nije im namjera ograničiti dosege ovog izuma, koji je općenitim pojmovima opisan ranije.
U sljedećim primjerima, hGH posjeduje sekvencu id. br. 1. Razumije se da i ostali članovi obitelji polipeptida hGH ili njegovih agonističkih varijanti mogu biti pegilirani na sličan način, kao što je pokazano primjerima u nastavku.
Sve ovdje citirane reference, patenti ili prijave uključeni su u cijelosti citatom, kako je ovdje napisano.
Ovaj izum bit će nadalje ilustriran pomoću sljedećih primjera, koji, međutim, nisu smišljeni u svrhu ograničavanja dosega ovog izuma.
PRIMJER 1
Ravni lanac 20 000 m.m. PEG-ALD hGH
[image]
Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenog pripravka N-terminalno monopegiliranog hGH reduktivnom alkilacijom. Metoksi-linearni PEG-propionaldehini reagens molekulske mase približno 20 000 (Shearwater Corp.) selektivno je povezan, reduktivnom aminacijom, s N-krajem hGH korištenjem razlike u relativnoj pKa vrijednosti primarnog amina na N-kraju u odnosu na pKa vrijednosti primarnih amina na ε-amino položaju lizinskih ostataka. hGH protein, otopljen u koncentraciji 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 6,0; 25 mM Hepes (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 7,0 ili u 10 mM natrijevom acetatu (Sigma Chemical, St. Louis, MO), pH 4,5, reagirao je s metoksi-PEG-propionaldehidom, M-PEG-ALD (Shearwater Corp., Huntsville, AL) dodatkom M-PEG-ALD da bi se dobio relativni molarni omjer PEG:hGH od 0,1:0,7 po aminu (po želji je moguće dodati 8% acetonitrila). Reakcije su katalizirane dodatkom stock 1M otopine NaCNBH4 (Sigma Chemical, St. Louis, MO), otopljenog u H2O, do konačne koncentracije 10-50 mM. Reakcije su provedene u tamnom, pri 4°C do ST kroz 18-24 sata. Reakcije su zaustavljene dodatkom 1M Tris (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) ~pH 7,6 do konačne koncentracije Tris-a od 50 mM ili su razrijeđene odgovarajućim puferom za izravno pročišćavanje.
PRIMJER 2
Ravni lanac 30 000 m.m. PEG-ALD hGH
Metoksi-linearni PEG-propionaldehidni reagens molekulske mase 30 000 (Shearwater Corp.) spojen je na N-kraj hGH postupkom opisanim u Primjeru 1.
PRIMJER 3
Ravni lanac 5 000 m.m. PEG-ALD hGH
Metoksi-linearni PEG-propionaldehidni reagens molekulske mase 5 000 (Fluka) spojen je na N-kraj hGH postupkom opisanim u Primjeru 1.
PRIMJER 4
Razgranati lanac 40 000 m.m. PEG-ALD hGH
[image]
Metoksi-razgranati PEG-aldehidni reagens (PEG2-ALD) molekulske mase 40 000 (Shearwater Corp.) spojen je na N-kraj hGH postupkom opisanim u Primjeru 1.
PRIMJER 5
Razgranati lanac 20 000 m.m. PEG-ALD hGH
Metoksi-razgranati PEG-aldehidni reagens (PEG2-ALD) molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.) spojen je na N-kraj hGH postupkom opisanim u Primjeru 1, uz upotrebu molarnih omjera PEG i hGH od 0,1-0,5 po aminu.
PRIMJER 6
Ravni lanac 30 000 m.m. SPA-PEG hGH
[image]
Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenih pripravaka mono-pegiliranog hGH uz upotrebu N-hidroksisukcinimidil (NHS) aktivnih estera. Stock otopina hGH proteina otopljena je u koncentraciji 10 mg/mL u 0,25 M HEPES pufera, pH 7,2 (po želji, moguće je dodati i 8% acetonitrila). Otopina je zatim reagirala s metoksi-PEG-sukcinimidil-propionatom (SPA-PEG), dodatkom SPA-PEG da bi se dobio relativni molarni omjer PEG:hGH od 0,1-0,65 po aminu. Reakcije su provedene pri 4°C do ST kroz 5 minuta do 1 sat. Reakcije su zaustavljene spuštanjem pH na 4,0 dodatkom 0,1N octene kiseline ili dodatkom 5× molarnog suviška Tris HCl.
PRIMJER 7
Ravni lanac 20 000 m.m. SPA-PEG hGH
Ravni lanac SPA-PEG reagensa molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.) spojen je na N-kraj hGH postupkom opisanim u Primjeru 6.
PRIMJER 8
Ravni lanac 3 400 m.m. biotin-SPA-PEG-hGH
[image]
Biotin-PEG-CO2-NHS reagens molekulske mase 3 400 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim u Primjeru 6.
PRIMJER 9
Razgranati lanac 10 000 m.m. NHS-PEG-hGH
[image]
Razgranati PEG2-NHS molekulske mase 10 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6.
PRIMJER 10
Razgranati lanac 20 000 m.m. NHS-PEG-hGH
Razgranati PEG2-NHS molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6.
PRIMJER 11
Razgranati lanac 40 000 m.m. NHS-PEG-hGH
Razgranati PEG2-NHS molekulske mase 40 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6.
PRIMJER 12
Ravni lanac 20 000 m.m. PEG-BTC-hGH
[image]
PEG-BTC molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6. Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenih pripravaka pegiliranog hGH uz upotrebu benzotriazol-karbonatnih derivata PEG.
PRIMJER 13
Ravni lanac 5 000 m.m. PEG-SS-hGH
[image]
Sukcinimidil-sukcinat-PEG (SS-PEG) molekulske mase 5 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6. Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenih pripravaka pegiliranog hGH uz upotrebu hidrolizabilne veze.
PRIMJER 14
Ravni lanac 20 000 m.m. PEG-CM-HBA-hGH
[image]
Karboksimetil-hidroksibutirna kiselina-PEG (CM-HBA-PEG) molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 6. Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenih pripravaka pegiliranog hGH uz upotrebu hidrolizabilne veze.
PRIMJER 15
Ravni lanac 2-4× 5 000 m.m. PEG-CM-HBA-hGH
PEG-CM-HBA molekulske mase 5 000 (Shearwater Corp.) spojen je na hGH postupkom opisanim za Primjer 13.
PRIMJER 16
Ravni lanac 20 000 m.m. HZ-PEG-hGH
PEG-OCH2CONHNH2
Ovaj primjer pokazuje postupak dobivanja u biti homogenih pripravaka pegiliranog hGH uz upotrebu metoksi-PEG-hidrazida, HZ-PEG, molekulske mase 20 000 (Shearwater Corp.). Stock otopina hGH proteina otopljena je u koncentraciji 10 mg/mL u 10 mM MES, pH 4,0. Otopina je zatim reagirala sa HZ-PEG, dodatkom krutine da bi se dobio relativni molarni omjer PEG:hGH od 0,1-5,05 po karboksilnoj grupi. Reakcije su katalizirane karbodiimidom (EDC, EOAC, EDEC) u konačnoj koncentraciji od 2 mM do 4 mM. Reakcije su provedene pri 4°C kroz 2 sata do preko noći ili na sobnoj temperaturi od 10 minuta do preko noći. Reakcije su zaustavljene uklanjanjem nekonjugiranog PEG i karbodiimida pročišćavanjem uz izmjenu kationa.
PRIMJER 17
Višestruko pegilirani oblici
Modificirani hGH s dva ili više pričvršćena PEG (višestruko pegilirani) također su dobiveni iz Primjera 1 i 4 i razdvojeni su od mono-pegiliranih oblika kromatografijom uz izmjenu aniona. Modificirani hGH s dva ili više pričvršćena PEG (višestruko pegilirani) od mono-pegiliranih oblika razdvojeni su i kromatografijom uz izmjenu aniona.
Modificirani hGH s dva ili više pričvršćena PEG (višestruko pegilirani) također su dobiveni u Primjerima 2, 3 i 5-13 te su pročišćeni na način sličan onome u Primjerima 1 i 4.
PRIMJER 18
Pročišćavanje pegiliranog hGH
Pegilirani oblici hGH pročišćeni su iz reakcijske smjese do >95% (SEC analiza) uz korak jednostruke ionsko-izmjenjivačke kromatografije.
Kromatografija uz izmjenu aniona
PEG oblici hGH pročišćeni su iz reakcijske smjese do >95% (SEC analiza) uz korak jednostruke anionsko-izmjenjivačke kromatografije. Mono-pegilirani hGH pročišćen je od nemodificiranog hGH i višestruko pegiliranih oblika hGH pomoću kromatografije uz izmjenu aniona. Tipična 20K aldehid-hGH reakcijska smjesa (5-100 mg proteina), kako je opisana ranije, pročišćena je na Q-Sepharose Hitrap koloni (1 ili 5 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ili Q-Sepharose koloni brzog protoka (26/20, volumen kuglica 70 mL) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), uravnoteženoj u 25 mM HEPES, pH 7,3 (pufer A). Reakcijska smjesa razrijeđena je 5-10× puferom A i nanesena na kolonu uz brzinu protoka od 2,5 mL/min. Kolona je isprana s 8 volumena kolone pufera A. Zatim su različiti oblici hGH eluirani s kolone u 80-100 volumena kolone pufera A i linearnom gradijentu NaCl od 0-100 mM. Eluent je praćen apsorbancijom na 280 nm (A280), a prikupljane su frakcije od 5 mL. Frakcije su skupljane prema razmjeru pegilacije, npr. mono, di, tri, itd. (kako je postavljeno u Primjeru 15). Skupljeni uzorci zatim su koncentrirani do 0,5-5 mg/mL u Centriprep YM10 koncentratoru (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA). Koncentracija proteina u uzorku određena je pomoću A280 i ekstincijskog koeficijenta od 0,78. Ukupan prinos pročišćenog mono 20K PEG-aldehid-hGH iz ovog postupka bio je 25-30%.
Kromatografija uz izmjenu kationa
Kromatografija uz izmjenu kationa provedena je na SP Sepharose koloni visokog učinka (Pharmacia XK 26/20, volumen kuglica 70 mL), uravnoteženoj u 10 mM natrijevog acetata pH 4,0 (pufer B). Reakcijska smjesa razrijeđena je 10× puferom B i nanesena na kolonu uz brzinu protoka od 5 mL/min. Zatim je kolona isprana s 5 volumena kolone pufera B, a nakon toga s 5 volumena kolona 12%-tnog pufera C (10 mM acetat pH 4,5, 1M NaCl). Nakon toga, oblici PEG-hGH eluirani su s kolone u linearnom gradijentu od 12 do 27% pufera C u 20 volumena kolone. Eluent je praćen na 280 nm i prikupljane su frakcije do 10 mL. Frakcije su skupljane prema razmjeru pegilacije (mono, di, tri, itd.), promijenjene u 10 mM acetatnom puferu pH 4,5 i koncentrirane do 1-5 mg/mL u komori za miješanje opremljenoj Amicon YM10 membranom. Koncentracija proteina u uzorku određena je pomoću A280 uz ekstincijski koeficijent 0,78. Ukupan prinos monopegiliranog hGH iz ovog postupka bio je 10-50%.
PRIMJER 19
Biokemijska karakterizacija
Pročišćeni pegilirani uzorci hGH karakterizirani su reducirajućom i nereducirajućom SDS-PAGE, nedenaturirajućom i denaturirajućom kromatografijom uz isključenje veličine, analitičkom kromatografijom uz izmjenu aniona, N-terminalnim sekvenciranjem, kromatografijom hidrofobnih interakcija i HPLC obrnutih faza.
Tekućinska kromatografija visokog učinka uz isključenje veličine (SEC-HPLC)
Nedenaturirajuća SEC-HPLC
Reakcija metoksi-PEG različitih kemizama pričvršćenja, veličina, veznika i geometrija s hGH, skupljeni uzorci nakon izmjene aniona i konačno pročišćeni produkti procijenjeni su nedenaturirajućom SEC-HPLC. Analitička nedenaturirajuća SEC-HPLC provedena je na Tosohaas G4000PWXL koloni, 7,8 mm × 30 cm (Tosohaas Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) ili Superdex 200 (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ) u 20 mM fosfatu pH 7,2, 150 mM NaCl i pri brzini protoka od 0,5 mL/minuti. PEGilacija znatno povećava hidrodinamski volumen proteina, što dovodi do pomaka prema kraćem retencijskom vremenu. U reakcijskim smjesama PEG-aldehid-hGH opaženi su novi oblici, zajedno s nemodificiranim hGH. Ti PEGilirani i ne-PEGilirani oblici razdvojeni su Q-Sepharose kromatografijom, a nastali pročišćeni mono-PEG-aldehid hGH oblici eluirani su kao jedan vrh na nedenaturirajućoj SEC (>95% čistoće). Korak Q-Sepharose kromatografije učinkovito je uklonio slobodni PEG, hGH i višestruko PEGilirane oblike hGH od mono-PEGiliranih hGH. Nedenaturirajuća SEC-HPLC pokazala je da je efektivna veličina raznih PEGiliranih hGH znatno veća od njihovih odgovarajućih teoretskih molekulskih masa (Tablica 1).
Tablica 1
Kromatografija uz isključenje veličine (SEC)
[image]
Denaturirajuća SEC-HPLC
Reakcija raznih metoksi-PEG s hGH, produkti nakon izmjene aniona i konačno pročišćeni produkti procijenjeni su denaturirajućom SEC-HPLC. Analitička denaturirajuća SEC-HPLC provedena je na Tosohaas 3000SWXL koloni, 7,8 mm × 30 cm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u 100 mM fosfatu pH 6,8, 0,1% SDS i pri brzini protoka od 0,8 mL/minuti. PEGilacija znatno povećava hidrodinamski volumen proteina, što dovodi do pomaka prema kraćem retencijskom vremenu. U reakcijskim smjesama 20K PEG-aldehid-hGH opaženi su novi oblici, zajedno s nemodificiranim hGH. Ti PEGilirani i ne-PEGilirani oblici razdvojeni su Q-Sepharose kromatografijom, a nastali pročišćeni 20K mono-PEG-aldehid hGH oblici eluirani su kao jedan vrh na denaturirajućoj SEC (>95% čistoće). Korak Q-Sepharose kromatografije učinkovito je uklonio slobodni PEG, hGH i višestruko PEGilirane oblike hGH od mono-PEGiliranih hGH.
SDS PAGE/prijenos na PVDF
SDS-PAGE korištena je za procjenu reakcije raznih PEG reagensa s hGH i pročišćenih konačnih produkata. Primjeri ove tehnike pokazani su s mono-20K linearnim i razgranatim 20K i 40K PEG aldehidom, te 4×6 5K SPA PEG (slike 1 i 2). SDS-PAGE provedena je u 10-20% Tris-tricin gelovima debljine 1 mm (Invitrogen, Carlsbad, CA) u reducirajućim i nereducirajućim uvjetima, uz bojenje Novex Colloidal CoomassieTM G-250 kompletom za bojenje (Invitrogen, Carlsbad, CA). Pročišćeni oblici mono PEG-aldehid hGH putuju kao jedna glavna vrpca na SDS-PAGE. Vrpce su prenesene na PVDF membranu za N-terminalnu identifikaciju sekvence koja je uslijedila odmah zatim.
Analitička HPLC uz izmjenu aniona
Analitička HPLC uz izmjenu aniona korištena je za procjenu reakcije raznih mPEG s hGH, frakcija nakon pročišćavanja izmjenom aniona i konačnih pročišćenih produkata. Analitička HPLC uz izmjenu aniona provedena je na Tosohaas Q5PW ili DEAE-PW koloni za izmjenu aniona, 7,5 mm × 75 mm (Tosohaas Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) u 50 mM Tris pH 8,6 pri brzini protoka od 1 mL/min. Uzorci su eluirani linearnim gradijentom 5-200 mM NaCl.
HPLC obrnutih faza (RP-HPLC)
Reakcijske smjese PEG-hGH i pročišćeni PEGilirani produkti analizirani su RP-HPLC da bi se utvrdili oblici hGH, jedno- i višestruko PEGilirani oblici hGH i da bi se pratili oksidirani oblici hGH, kao i izoforme PEG hGH sa samo jednim PEG vezanim na različitim mjestima (npr. N-kraj u odnosu na lizinske ε-amino-grupe). RP-HPLC provedena je na Zorbax SB-CN 150 ili 250 mm × 4,6 mm (3,5 mm ili 5 mm) koloni za HPLC obrnutih faza. Pokusi su provedeni na ambijentalnoj temperaturi, uz tipično nanošenje 10 mg proteina po uzorku. Pufer A je 0,1% trifluorooctena kiselina u vodi; pufer B je 0,1% trifluorooctena kiselina u acetonitrilu. Gradijent, koji rezultira 1/2%-tnim povećanjem u B po minuti, bio je kako slijedi:
korak vrijeme protok %A %B korak
0 0 1 60 40 0
1 3 1 60 40 0
2 20 1 50 50 1
3 2 1 60 40 1
4 6 1 60 40 0
N-terminalna sekvenca i mapiranje peptida
Automatizirana Edmanova odgradnja korištena je za određivanje NH2-terminalne proteinske sekvence. Za odgradnju je korišten Applied Biosystems Model 494 Precise sequencer (Perkin Elmer, Wellesley, MA). Odgovarajući PTH-A4 derivati identificirani su RP-HPLC analizom na on-line način, uz korištenje Applied Biosystems Model 140C PTH analizatora opremljenim Perkin Elmer/Brownlee 2,1 mm i.d. PTH-C18 kolonom. Sekvencirane su 20K linearne i 20 i 40K razgranate PEG-ALD hGH proteinske vrpce prenesene na PVDF membrane ili otopine pročišćenih 20K linearnih te 20K i 40K razgranatih 20 i 40K PEG-ALD hGH. Pročišćeni 20K linearni PEG-hGH dao je glavni signal (približni prinos 88%) s očekivanom sekvencom hGH, osim odsutnosti N-terminalne aminokiseline. Taj je rezultat bio očekivan za protein koji je N-terminalno PEGiliran aldehidnom kemijom. Ostatak nakon prvog ciklusa nije više moguće prikupiti zbog pričvršćene jedinice PEG. Manji signal (približni prinos 12%) imao je ispravnu N-terminalnu aminokiselinsku sekvencu. Ako se uzme u obzir da je vrh prikupljen RP-HPLC 100% PEGiliran, ovi podaci upućuju da je približno 88% PEG modifikacije na N-kraju, dok je ostatak očigledno vezan na jedan ili više mogućih lizinskih ostataka.
Tripsinska digestija provedena je u koncentraciji 1 mg/mL i korišteno je tipično 50 μg materijala po digestiji. Tripsin je dodan tako da je omjer tripsina i PEG-hGH bio 1:30 (w/w). Tris pufer bio je prisutan u koncentraciji od 30 mM, pH 7,5. Uzorci su inkubirani pri sobnoj temperaturi kroz 16 ± 0,5 sati. Reakcije su ugašene dodatkom 50 μL 1N HCl po mL digestijske otopine. Uzorci su razrijeđeni prije nanošenja u "autosampler" do konačne koncentracije od 0,25 mg/mL u 6,25% acetonitrilu. Najprije je dodan acetonitril (do 19,8% acetonitrila), blago je promiješano, a zatim je dodana voda do konačnog volumena (četiri početna volumena). Suvišak digestijske otopine može se ukloniti i pohraniti do 1 tjedan na -20°C.
Za analizu je korišten Waters Alliance 2695 HPLC sustav, ali ostali sustavi trebali bi dati slične rezultate. Korištena je Astec C-4 polimerna 25 cm × 4,6 mm kolona s česticama od 5 μm. Pokusi su provedeni pri ambijentalnoj temperaturi, uz tipično nanošenje 50 μg proteina po uzorku. Pufer A je 0,1% trifluorooctena kiselina u vodi; pufer B je 0,085% trifluorooctena kiselina u acetonitrilu. Gradijent je kako slijedi:
vrijeme A% B% C% D% protok krivulja
0,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 1
90,00 0,0 0,0 55,0 45,0 1,000 6
90,10 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6
91,00 0,0 0,0 0,0 100,0 1,000 6
91,10 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6
95,00 0,0 0,0 100,0 0,0 1,000 6
Kolona je zagrijavana na 40°C korištenjem plašta za zagrijavanje. Vrhovi su detektirani pomoću Waters 996 PDA detektora, a prikupljani su podaci između 210 i 300 nm. Ekstrahirani kromatogram pri 214 nm korišten je za analizu uzoraka, da bi se odredio opseg N-terminalne PEGilacije (gubitak T-1 fragmenta), kako je pokazano u Tablici 2.
Tablica 2
uzorak % T-1 prisutno % T-1 izgubljeno % T-1 prisutno u usporedbi s kontrolom
aldehid
5K ALD 2,0 98,0 7,4
20K 0,0 100,0 0,0
2×20K 0,0 100,0 0,0
30K 1,3 98,7 4,5
40K razgranati 1,9 98,1 6,8
NHS
4-6×5 SPA 1,3 98,7 4,7
2-4×5 CM 0,0 100,0 0,0
20K CM 23,1 76,9 84,1
30K 18,2 81,8 63,9
2×30K 5,7 94,3 19,9
40K razgranati 20,9 79,1 73,5
Primjer 20
Farmakodinamske studije
Studije učinkovitosti u hipofizektomiranih štakora
Ženke Sprague Dawley štakora, hipofizektomirane u Harlan Labs, prethodno su praćene prema brzini rasta u periodu od 7 do 10 dana. Nakon toga, studije rasta provedene su kroz 11 dana. Štakori su podijeljeni u grupe od šest do osam. Grupa 1 sastojala se od štakora kojima je dnevno ili u dane 0 i 6 davana supkutana doza nosača. Grupi 2 dnevno su davane supkutane doze GH (0,3 mg/kg/dozi). Grupi 3 su davane supkutane doze GH u dane 0 i 6 (1,8 mg/kg/dozi). Grupi 4 supkutano su davane doze PEG-GH u dane 0 i 6 (1,8 mg/kg/dozi).
Hipofizektomiranim štakorima praćen je prinos težine vaganjem barem svakog drugog dana tijekom studije. Prinosi težine (srednje +/- SEM) za 20K PEG-ALD hGH, 20K i 40K razgranati PEG-ALD hGH i 4-6× 5PEG-SPA hGH dozirane jednom tjedno bili su slični (srednje +/- SEM) 11. dana za različite PEGilirane molekule hGH dozirane jednom tjedno u odnosu na dnevne doze hGH.
Tablica 3
Prinos težine glodavaca
[image]
Po završetku svake studije rasta, životinje su žrtvovane i analizirane su duljine kostiju (tibije). Slika 6 prikazuje promjenu u duljini tibijalne kosti (srednje +/- SEM) 11. dana kao odgovor na različite PEG-GH konjugate dozirane u dane 0 i 6 ili na dnevno dozirani hGH.
Razine IGF-1 u hipofizektomiranih štakora
Pokusi su provedeni kako je gore opisano za studije prinosa težine, ali su uzorci krvi uzimani u dane 0, 1, 2, 3, 4, 5 i nakon žrtvovanja životinje 9. dana. Razine IGF-1 određene su pomoću ELISA. Slika 7 uspoređuje poraste u razinama serumskog IGF-1 (srednje +/- SEM) u hipofizektomiranih štakora nakon dnevnog doziranja hGH ili jedne doze hGH ili doziranja PEGiliranog hGH u dane 0 i 6.
Farmakokinetske studije
Farmakokinetske studije provedene su u normalnih mužjaka Sprague-Dawley štakora, miševa i majmuna makaka. Injekcije su priređene ili kao jedan supkutani bolus od 1,8 mg/kg ili kao jedna IV doza od 1,0 mg/kg GH ili PEG-GH u štakora i miševa, uz korištenje šest štakora i do 60 miševa po skupini. U makaka je korištena doza od 0,18 mg/kg GH ili PEG-GH i kao jedan supkutani bolus i IV, uz korištenje 2-4 majmuna po skupini. Uzorci krvi uzimani su od jedan do pet dana, kako je već prikladno za procjenu relevantnih PK parametara (Tablica 4). (t1/2) = terminalni poluživot, (Cl) = klirens, (Tmax) = vrijeme do maksimalne koncentracije, Vss = distribucija volumena (prividna) u ravnotežnom stanju, (Cmax) = maksimalna koncentracija GH i PEG-GH u krvi, praćeno pri svakom uzimanju uzorka pomoću imunotestova.
hGH imunotest
Koncentracije hGH i PEGiliranog hGH proteina u plazmi štakora, miša i makaka određene su pomoću hGH AutoDELFIA kompleta za fluorescentni imunotest (Perkin Elmer Life Sciences), uz upotrebu prikladnog PEG hGH da bi se dobila standardna krivulja.
Tablica 4
[image]
Claims (79)
1. Konjugat, naznačen time da se sastoji od bar jedne molekule polimera topljivog u vodi, kovalentno vezanog na bar jedan aminokiselinski ostatak biološki aktivnog polipeptida ljudskog hormona rasta (hGH) ili njegove agonističke varijante.
2. Konjugat prema zahtjevu 1, naznačen time da navedeni polipeptid hGH sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
3. Konjugat prema zahtjevima 1 ili 2, naznačen time da je navedeni polimer molekula poli(etilen-oksida).
4. Konjugat prema zahtjevu 3, naznačen time da je navedena molekula poli(etilen-oksida) molekula poli(etilen-glikola).
5. Konjugat prema zahtjevu 4, naznačen time da je poli(etilen-glikol) pričvršćen na aminokiselinski ostatak koji ima slobodnu amino-grupu, karboksilnu grupu ili sulfhidrilnu grupu.
6. Konjugat prema zahtjevu 5, naznačen time da je formiran pomoću aktiviranog poli(etilen-glikola).
7. Konjugat prema zahtjevu 6, naznačen time da navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) sadrži funkcionalnu grupu.
8. Konjugat prema zahtjevu 7, naznačen time da je navedeno pričvršćenje na mjestu aminokiseline koja ima slobodnu amino-grupu.
9. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izabrana između sljedećih grupa: karbonata, karbonil-imidazola, aktivnih estera karboksilnih kiselina, azlaktona, cikličkih imidnih tiona, izocijanata ili izotiocijanata, imidata i aldehida.
10. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa karbonat ili karbonil-imidazol.
11. Konjugat prema zahtjevu 10, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
12. Konjugat prema zahtjevu 11, naznačen time da posjeduje strukturu
[image]
gdje je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
13. Konjugat prema zahtjevu 12, naznačem time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
14. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa ciklički imidni tion.
15. Konjugat prema zahtjevu 14, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
a gdje je L izabrana iz grupe koju čine -O-, -NH-, -OCH2-, -NH-CO(CH2)n, -NH-CO(CH2)n-O-, -CO-NH(CH2)n-, -S-, -CO-NH(CH2)nO-, -O(CH2)nO-, -O(CH2)n-, -SCH2CH2- i -NH(CH2)n-.
16. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa azlakton.
17. Konjugat prema zahtjevu 16, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
gdje je
R1 izabran iz grupe koju čine vodik, alkil, cikloalkil, karbociklički i heterociklički aromatski prstenovi, α, β-nezasićeni alkil; a
R2 i R3 su, neovisno jedan o drugome, izabrani između vodika, alkila, arila i alkilarila.
18. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izocijanat ili izotiocijanat.
19. Konjugat prema zahtjevu 18, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-gliko) izabran iz grupe koju čine:
mPEG-N=C=O i mPEG-N=C=S.
20. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa aldehid ili aldehid-hidrat.
21. Konjugat prema zahtjevu 20, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
22. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa aktivni ester karboksilne kiseline.
23. Konjugat prema zahtjevu 22, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
24. Konjugat prema zahtjevu 23, naznačen time da posjeduje strukturu izabranu iz grupe koju čine:
[image]
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
25. Konjugat prema zahtjevu 24, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
26. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
27. Konjugat prema zahtjevu 26, naznačen time da posjeduje strukturu izabranu iz grupe koju čine:
[image]
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
28. Konjugat prema zahtjevu 27, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
29. Konjugat prema zahtjevu 28, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa imidat.
30. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedeni aktivirani poli(etilen-glikol) izabran iz grupe koju čine:
[image]
31. Konjugat prema zahtjevu 9, naznačen time da je navedena slobodna amino-grupa amino-terminalna α-amino-grupa.
32. Konjugat prema zahtjevu 31, naznačen time da je navedena amino-terminalna α-amino-grupa na fenilalaninu.
33. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeno pričvršćenje na mjestu aminokiseline sa slobodnom karboksilnom grupom.
34. Konjugat prema zahtjevu 33, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izabrana iz grupe koju čine primarni amini; hidrazin i hidrazidne funkcionalne grupe.
35. Konjugat prema zahtjevu 34, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izabrana iz grupe koju čine:
[image]
36. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeno pričvršćenje na mjestu aminokiseline sa slobodnom sulfhidrilnom grupom.
37. Konjugat prema zahtjevu 36, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izabrana iz grupe koju čine tioli; maleimidi; vinil-sulfoni i fenil-glioksali.
38. Konjugat prema zahtjevu 37, naznačen time da je navedena funkcionalna grupa izabrana iz grupe koju čine:
[image]
39. Konjugat prema zahtjevu 38, naznačen time da posjeduje strukturu izabranu iz grupe koju čine:
[image]
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
40. Konjugat prema zahtjevu 39, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
41. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeni poli(etilen-glikol) molekulske mase od između oko 0,5 kDa i oko 100 kDa.
42. Konjugat prema zahtjevu 41, naznačen time da je navedeni poli(etilen-glikol) molekulske mase od između oko 5 kDa i oko 40 kDa.
43. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeni poli(etilen-glikol) razgranati polimer.
44. Konjugat prema zahtjevu 43, naznačen time da je navedeni razgranati polimer izabran iz grupe koju čine:
[image]
45. Konjugat ljudskog hormona rasta i PEG, naznačen time da posjeduje strukturu:
[image]
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
46. Konjugat prema zahtjevu 45, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
47. Konjugat prema zahtjevu 46, naznačen time da je barem 80% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
48. Konjugat prema zahtjevu 46, naznačen time da je barem 90% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
49. Konjugat prema zahtjevima 47 ili 48, naznačen time da je svaki mPEG molekulske mase od oko 20 kDa.
50. Konjugat ljudskog hormona rasta i PEG, naznačen time da posjeduje strukturu:
[image]
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
51. Konjugat prema zahtjevu 50, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
52. Konjugat prema zahtjevu 51, naznačen time da je barem 80% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
53. Konjugat prema zahtjevu 51, naznačen time da je barem 90% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
54. Konjugat prema zahtjevima 52 ili 53, naznačen time da je svaki mPEG molekulske mase od oko 20 kDa.
55. Konjugat ljudskog hormona rasta i PEG, naznačen time da posjeduje strukturu:
mPEG-OCH2CH2CH2NH-R
pri čemu je R polipeptid ljudskog hormona rasta.
56. Konjugat prema zahtjevu 55, naznačen time da navedeni polipeptid ljudskog hormona rasta sadrži aminokiselinsku sekvencu id. br. 1.
57. Konjugat prema zahtjevu 56, naznačen time da je barem 80% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
58. Konjugat prema zahtjevu 56, naznačen time da je barem 90% navedenog polietilen-glikola konjugirano na amino-terminalni fenilalanin.
59. Konjugat prema zahtjevima 57 ili 58, naznačen time da je svaki mPEG molekulske mase od oko 20 kDa.
60. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeni poli(etilen-glikol) bifunkcionalni polimer.
61. Konjugat prema zahtjevu 8, naznačen time da je navedeni poli(etilen-glikol) prolijek.
62. Pripravak, naznačen time da sadrži hGH prema zahtjevu 1 i barem jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
63. Postupak liječenja pacijenta s poremećajem rasta ili razvitka, naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski djelotvorne količine hGH konjugata prema zahtjevu 1 navedenom pacijentu.
64. Postupak prema zahtjevu 63, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka nedostatak hormona rasta (GHD).
65. Postupak prema zahtjevu 63, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka Turnerov sindrom.
66. Postupak prema zahtjevu 63, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka kronična bubrežna insuficijencija.
67. Postupak prema zahtjevu 63, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka mali rast za gestacijsku dob (SGA).
68. Pripravak, naznačen time da sadrži hGH prema zahtjevu 48 i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
69. Postupak liječenja pacijenta s poremećajem rasta ili razvitka, naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski djelotvorne količine hGH konjugata prema zahtjevu 48 navedenom pacijentu.
70. Postupak prema zahtjevu 69, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka nedostatak hormona rasta (GHD).
71. Postupak prema zahtjevu 69, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka Turnerov sindrom.
72. Postupak prema zahtjevu 69, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka kronična bubrežna insuficijencija.
73. Postupak prema zahtjevu 69, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka mali rast za gestacijsku dob (SGA).
74. Pripravak, naznačen time da sadrži hGH prema zahtjevima 50 ili 55 i bar jedan farmaceutski prihvatljiv nosač.
75. Postupak liječenja pacijenta s poremećajem rasta ili razvitka, naznačen time da obuhvaća primjenu terapijski djelotvorne količine hGH konjugata prema zahtjevima 50 ili 55 navedenom pacijentu.
76. Postupak prema zahtjevu 75, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka nedostatak hormona rasta (GHD).
77. Postupak prema zahtjevu 75, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka Turnerov sindrom.
78. Postupak prema zahtjevu 75, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka kronična bubrežna insuficijencija.
79. Postupak prema zahtjevu 75, naznačen time da je navedeni poremećaj rasta ili razvitka mali rast za gestacijsku dob (SGA).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US33190701P | 2001-11-20 | 2001-11-20 | |
| PCT/US2002/037270 WO2003044056A2 (en) | 2001-11-20 | 2002-11-20 | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP20040448A2 true HRP20040448A2 (en) | 2006-02-28 |
Family
ID=23295870
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR20040448A HRP20040448A2 (en) | 2001-11-20 | 2004-05-20 | Method for detecting cells with numerical chromosomal abnormalities |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1453859A2 (hr) |
| JP (2) | JP2005525302A (hr) |
| KR (2) | KR20050044858A (hr) |
| CN (1) | CN1608079A (hr) |
| AP (1) | AP2004003050A0 (hr) |
| AU (1) | AU2002356990A1 (hr) |
| BR (1) | BR0214451A (hr) |
| CA (1) | CA2467731A1 (hr) |
| CO (1) | CO5580794A2 (hr) |
| EA (2) | EA008505B1 (hr) |
| EC (1) | ECSP045114A (hr) |
| GE (1) | GEP20063860B (hr) |
| HR (1) | HRP20040448A2 (hr) |
| HU (1) | HUP0500997A2 (hr) |
| IL (1) | IL162031A0 (hr) |
| IS (1) | IS7268A (hr) |
| MA (1) | MA27544A1 (hr) |
| MX (1) | MXPA04004809A (hr) |
| NO (1) | NO20042182L (hr) |
| OA (1) | OA13063A (hr) |
| PL (1) | PL374354A1 (hr) |
| RS (1) | RS53104A (hr) |
| TN (1) | TNSN04090A1 (hr) |
| WO (1) | WO2003044056A2 (hr) |
| ZA (1) | ZA200403907B (hr) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030171285A1 (en) * | 2001-11-20 | 2003-09-11 | Finn Rory F. | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
| US6916962B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-07-12 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| US6956135B2 (en) | 2001-12-11 | 2005-10-18 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| AU2002357806A1 (en) * | 2001-12-11 | 2003-06-23 | Sun Bio, Inc. | Novel monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| US7041855B2 (en) | 2001-12-11 | 2006-05-09 | Sun Bio, Inc. | Monofunctional polyethylene glycol aldehydes |
| KR100964411B1 (ko) * | 2002-01-18 | 2010-06-15 | 바이오겐 아이덱 엠에이 인코포레이티드 | 생물학적 활성 화합물과 컨쥬게이팅되는 잔기를 갖는 폴리알킬렌 글리콜 |
| EP1591467A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-11-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugate between a polyethylene glycol having a terminal alkanal group and a human growth hormone |
| US7157546B2 (en) | 2002-09-09 | 2007-01-02 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Water-soluble polymer alkanals |
| US20040142870A1 (en) * | 2002-11-20 | 2004-07-22 | Finn Rory F. | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
| US20050281778A1 (en) * | 2003-03-28 | 2005-12-22 | Myung-Ok Park | Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer |
| ES2349743T3 (es) * | 2003-10-10 | 2011-01-11 | Novo Nordisk A/S | Derivados de la il-21. |
| US7524813B2 (en) | 2003-10-10 | 2009-04-28 | Novo Nordisk Health Care Ag | Selectively conjugated peptides and methods of making the same |
| RU2385879C2 (ru) * | 2004-01-21 | 2010-04-10 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Способ конъюгации пептидов, опосредованной трансглутаминазой |
| AP2007003919A0 (en) * | 2004-08-31 | 2007-02-28 | Pharmacia & Upjohn Co Llc | Glycerol branched polyethylene glycol human growthhormone conjugates, process for their prepation a nd methods of use thereof |
| SG161210A1 (en) * | 2004-12-22 | 2010-05-27 | Ambrx Inc | Methods for expression and purification of recombinant human growth hormone |
| KR20070090023A (ko) * | 2004-12-22 | 2007-09-04 | 암브룩스, 인코포레이티드 | 변형 인간 성장 호르몬 |
| DK2399893T3 (en) * | 2004-12-22 | 2018-10-08 | Ambrx Inc | COMPOSITIONS CONTAINING, INVOLVING PROCEDURES, AND USES OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND POLYPEPTIDES |
| WO2006084888A2 (en) | 2005-02-10 | 2006-08-17 | Novo Nordisk A/S | C-terminally pegylated growth hormones |
| EP1877439B1 (en) | 2005-04-18 | 2011-02-09 | Novo Nordisk A/S | Il-21 variants |
| AU2006286486A1 (en) | 2005-08-30 | 2007-03-08 | Novo Nordisk Health Care Ag | Liquid formulations of pegylated growth hormone |
| RS51998B (en) * | 2005-11-08 | 2012-04-30 | Ambrx Inc. | ACCELERATORS FOR MODIFICATION OF NON-NATURAL AMINO ACIDS AND NON-NATURAL AMINO ACID POLYPEPTIDES |
| EP1968635B1 (en) | 2005-12-14 | 2014-09-17 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
| AU2007271150A1 (en) | 2006-07-07 | 2008-01-10 | Novo Nordisk Health Care Ag | New protein conjugates and methods for their preparation |
| CN101108895B (zh) * | 2006-07-19 | 2011-10-26 | 北京键凯科技有限公司 | 聚乙二醇乙醛衍生物及其与药物的结合物 |
| AU2007310777A1 (en) | 2006-10-26 | 2008-05-02 | Novo Nordisk A/S | IL-21 variants |
| CL2008002399A1 (es) | 2007-08-16 | 2009-01-02 | Pharmaessentia Corp | Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c. |
| ES2453946T3 (es) | 2008-04-03 | 2014-04-09 | Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. | Hormona del crecimiento modificada con polietilenglicol bicatenario, método de preparación y aplicación de esta |
| KR101104574B1 (ko) * | 2008-05-14 | 2012-01-11 | 성균관대학교산학협력단 | 폴리에틸렌글리콜로 화학적으로 수식된 인간 성장 호르몬, 이의 제조방법 및 용도 |
| JP5639585B2 (ja) * | 2008-07-31 | 2014-12-10 | ファーマエッセンティア コーポレイション | ペプチド−ポリマー共役体 |
| MX2011000847A (es) | 2008-08-06 | 2011-02-25 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo. |
| RU2409669C9 (ru) * | 2008-08-18 | 2012-05-27 | ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" ("Scientific Future Management", "SFM") | Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами |
| JP5766118B2 (ja) * | 2008-09-11 | 2015-08-19 | ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション | ポリマー性アルファ−ヒドロキシアルデヒドおよびケトン反応剤ならびに抱合方法 |
| US8513192B2 (en) | 2009-01-22 | 2013-08-20 | Novo Nordisk A/S | Stable growth hormone compounds resistant to proteolytic degradation |
| JP6086528B2 (ja) | 2009-08-06 | 2017-03-01 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | 長期のインビボ有効性を有する成長ホルモン |
| SG181648A1 (en) | 2009-12-15 | 2012-07-30 | Ascendis Pharma As | Dry growth hormone composition transiently linked to a polymer carrier |
| RU2012134974A (ru) | 2010-01-22 | 2014-02-27 | Ново Нордиск Хелс Кеа Аг | Стабилизированное соединение гормона роста |
| TWI508737B (zh) | 2010-01-22 | 2015-11-21 | 諾佛 儂迪克股份有限公司 | 具有延長的活體內功效的生長激素 |
| NZ603399A (en) * | 2010-05-17 | 2014-09-26 | Cebix Inc | Pegylated c-peptide |
| EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
| EA019967B1 (ru) * | 2011-12-21 | 2014-07-30 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт") | Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека |
| ES2841123T3 (es) | 2013-04-05 | 2021-07-07 | Formulacion Del Compuesto De La Hormona De Crecimiento | Formulación del compuesto de la hormona de crecimiento |
| EP4282485A3 (en) | 2014-11-06 | 2024-01-17 | PharmaEssentia Corporation | Dosage regimen for pegylated interferon |
| IL254389B2 (en) * | 2015-03-11 | 2023-03-01 | Nektar Therapeutics | Polymer conjugates and the il–7 group |
| SG11201802180TA (en) | 2015-09-18 | 2018-04-27 | Univ Miyazaki | Long-acting adrenomedullin derivative |
| CN114539384A (zh) * | 2020-11-19 | 2022-05-27 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 聚乙二醇化长效生长激素及其制备方法和医药应用 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| DK0458064T3 (da) * | 1990-05-04 | 1998-04-27 | American Cyanamid Co | Stabilisering af somatotropiner ved modificering af cysteinrester |
| CA2101918A1 (en) * | 1991-03-18 | 1992-09-19 | Samuel Zalipsky | Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers |
| WO1993000109A1 (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-07 | Genentech, Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
| NZ250375A (en) * | 1992-12-09 | 1995-07-26 | Ortho Pharma Corp | Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives |
| US5824784A (en) * | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| DE69635026T2 (de) * | 1995-09-21 | 2006-05-24 | Genentech Inc., San Francisco | Varianten des menschlichen wachstumshormons |
| DE69838552T2 (de) * | 1997-07-14 | 2008-05-21 | Bolder Biotechnology, Inc., Louisville | Derivate des wachstumshormons und verwandte proteine |
| CA2359345A1 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| ES2204509T3 (es) * | 1999-01-29 | 2004-05-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Conjugados de gcsf. |
| WO2001076639A2 (en) * | 2000-04-06 | 2001-10-18 | Pharmacia Corporation | Chemically-modified myelopoietin conjugates |
| WO2002055532A2 (en) * | 2001-01-11 | 2002-07-18 | Maxygen Aps | Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecular compounds |
-
2002
- 2002-11-20 CN CNA028259289A patent/CN1608079A/zh active Pending
- 2002-11-20 MX MXPA04004809A patent/MXPA04004809A/es not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 RS YU53104A patent/RS53104A/sr unknown
- 2002-11-20 IL IL16203102A patent/IL162031A0/xx unknown
- 2002-11-20 KR KR1020047007708A patent/KR20050044858A/ko active IP Right Grant
- 2002-11-20 OA OA1200400143A patent/OA13063A/en unknown
- 2002-11-20 BR BRPI0214451-4A patent/BR0214451A/pt not_active IP Right Cessation
- 2002-11-20 AU AU2002356990A patent/AU2002356990A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-20 EA EA200400565A patent/EA008505B1/ru unknown
- 2002-11-20 EA EA200700431A patent/EA200700431A1/ru unknown
- 2002-11-20 HU HU0500997A patent/HUP0500997A2/hu unknown
- 2002-11-20 KR KR1020077011730A patent/KR20070072924A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 AP APAP/P/2004/003050A patent/AP2004003050A0/en unknown
- 2002-11-20 CA CA002467731A patent/CA2467731A1/en not_active Abandoned
- 2002-11-20 WO PCT/US2002/037270 patent/WO2003044056A2/en not_active Application Discontinuation
- 2002-11-20 GE GE5599A patent/GEP20063860B/en unknown
- 2002-11-20 JP JP2003545691A patent/JP2005525302A/ja active Pending
- 2002-11-20 PL PL02374354A patent/PL374354A1/xx unknown
- 2002-11-20 EP EP02803695A patent/EP1453859A2/en not_active Withdrawn
-
2004
- 2004-05-17 IS IS7268A patent/IS7268A/is unknown
- 2004-05-19 MA MA27686A patent/MA27544A1/fr unknown
- 2004-05-20 EC EC2004005114A patent/ECSP045114A/es unknown
- 2004-05-20 TN TNP2004000090A patent/TNSN04090A1/fr unknown
- 2004-05-20 HR HR20040448A patent/HRP20040448A2/hr not_active Application Discontinuation
- 2004-05-20 ZA ZA200403907A patent/ZA200403907B/en unknown
- 2004-05-20 CO CO04046633A patent/CO5580794A2/es not_active Application Discontinuation
- 2004-05-26 NO NO20042182A patent/NO20042182L/no not_active Application Discontinuation
-
2006
- 2006-07-14 JP JP2006193577A patent/JP2006321808A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA200700431A1 (ru) | 2008-02-28 |
| OA13063A (en) | 2006-11-10 |
| KR20050044858A (ko) | 2005-05-13 |
| PL374354A1 (en) | 2005-10-17 |
| MXPA04004809A (es) | 2004-08-11 |
| EP1453859A2 (en) | 2004-09-08 |
| HUP0500997A2 (en) | 2007-11-28 |
| TNSN04090A1 (fr) | 2006-06-01 |
| JP2005525302A (ja) | 2005-08-25 |
| BR0214451A (pt) | 2006-05-30 |
| CN1608079A (zh) | 2005-04-20 |
| JP2006321808A (ja) | 2006-11-30 |
| CO5580794A2 (es) | 2005-11-30 |
| AU2002356990A1 (en) | 2003-06-10 |
| IL162031A0 (en) | 2005-11-20 |
| WO2003044056A2 (en) | 2003-05-30 |
| ECSP045114A (es) | 2004-07-23 |
| RS53104A (en) | 2006-10-27 |
| IS7268A (is) | 2004-05-17 |
| EA200400565A1 (ru) | 2005-06-30 |
| ZA200403907B (en) | 2007-12-27 |
| CA2467731A1 (en) | 2003-05-30 |
| AP2004003050A0 (en) | 2004-06-30 |
| MA27544A1 (fr) | 2005-10-03 |
| NO20042182L (no) | 2004-08-11 |
| KR20070072924A (ko) | 2007-07-06 |
| WO2003044056A3 (en) | 2003-08-21 |
| EA008505B1 (ru) | 2007-06-29 |
| GEP20063860B (en) | 2006-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP20040448A2 (en) | Method for detecting cells with numerical chromosomal abnormalities | |
| EP1715887B1 (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and use thereof | |
| NL1028837C2 (nl) | N-terminaal monogepegyleerde conjugaten van humaan groeihormoon en werkwijze voor de bereiding daarvan. | |
| US20030171285A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| CA2577999A1 (en) | Glycerol branched polyethylene glycol human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof | |
| US20040038892A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
| US20090203589A1 (en) | Chemically modified human growth hormone receptor antagonist conjugates | |
| MXPA06008888A (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODRP | Renewal fee for the maintenance of a patent |
Payment date: 20071018 Year of fee payment: 6 |
|
| OBST | Application withdrawn |