EA019967B1

EA019967B1 - Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека

Info

Publication number: EA019967B1
Application number: EA201101664A
Authority: EA
Inventors: Сергей Викторович Шереметьев; Сергей Анатольевич Коровкин; Антон Викентьевич Катлинский; Андрей Викторович Семченко; Владимир Антонович Катлинский
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Форт" (Ооо "Форт")
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2011-12-21
Publication date: 2014-07-30
Also published as: EA201101664A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с гормоном роста человека (соматотропином), в котором полимер присоединен к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, общей структуры (I)где А - аминокислотный фрагмент гистидина; В - аминокислотный фрагмент тирозина; hGH - соматотропин; n - целое число от 10 до 1200; m принимает значения от 0 до 3; k принимает значения от 0 до 8, причем m≠k, если m или k равны 0. Конъюгат hGH обладает большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным соматотропином при сохранении существенной доли его активности.

Description

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с гормоном роста человека (соматотропином), в котором полимер присоединен к полипептиду посредством азогруппы.

Сведения о предшествующем уровне техники

Гормон роста человека (соматотропин, соматропин, ИОН) является одним из гормонов, продуцируемых передней долей гипофиза, и относится к пептидным гормонам. Соматотропин состоит из 191 аминокислот и имеет молекулярную массу 22124 Да |Баше1к М.Е. Ы11у'к Нишайоре Ехрепепсе. Иа1иге Бю1есЬпо1, νο1. 10, Νο. 7 (1992), р. 812].

Соматотропин стимулирует скелетный и соматический рост, а также оказывает выраженное влияние на метаболические процессы. Основа механизма его действия состоит в стимуляции роста костей скелета путем воздействия на пластинки эпифиза трубчатых костей, в частности на костный метаболизм у детей. Кроме того, соматотропин способствует нормализации структуры тела посредством увеличения мышечной массы и снижения жировой массы тела. При этом увеличивается число и размер клеток мышц, а также печени, вилочковой железы, половых желез, надпочечников, щитовидной железы. Стимуляция транспорта аминокислот в клетку и синтеза белков снижает уровень холестерина, воздействуя на профиль липидов и липопротеидов. Помимо этого, соматотропин подавляет высвобождение инсулина, способствует задержке натрия, калия и фосфора в организме, что положительно влияет на мышечную активность и физическую выносливость.

У пациентов с дефицитом гормона роста и остеопорозом заместительная терапия приводит к нормализации минерального состава и плотности костей.

Показаниями к применению ИОН у детей являются задержка роста вследствие недостаточной секреции гормона роста, синдром Шерешевского-Тернера, хроническая почечная недостаточность (снижение функции почек более чем на 50%) в препубертатном периоде. У взрослых применение ИОН показано при подтвержденном врожденном или приобретенном выраженном дефиците гормона роста в качестве заместительной терапии.

Тем не менее, медицинское применение существующих препаратов ИОН, таких как Растан, ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является недостаточная энзиматическая стабильность в организме, которая приводит к необходимости увеличения частоты введения препарата, что в ряде случаев сопряжено с побочными эффектами, например аллергией.

Так, после подкожного введения абсорбция соматропина составляет 80%, С_тах в плазме крови достигается через 3-6 ч, время полувыведения составляет всего 3-5 ч. В связи с этим возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы ИОН с целью преодоления указанных недостатков.

Для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой [Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние, проблемы и перспективы, в сб.: Вирусные гепатиты: достижения перспективы, № 3 (13) (2001), с. 3-8].

Как правило, в ковалентных конъюгатах полимерный фрагмент присоединен к полипептиду через одну из свободных аминогрупп последнего |Κοζ1ο\ν51<ί А., СИаг1ек 8.А., Нагпк 1.М. ^еνе1οртеηΐ οί Реду1а1ей 1п1егГегоп5 ίοτ 1Ие Тгеа1теп1 οί Сйгошс Нераййк С. ВюБгидк.; νο1. 15(7) (2001), р. 419-429], а препарат представляет собой смесь позиционных изомеров, химическая структура которых друг от друга отличается местом прикрепления полимера к полипептиду. Теоретически число позиционных изомеров в данном случае равно количеству свободных аминогрупп в полипептиде [Блохин Н.П., Никитин И.Г. Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа) Пегасис: новые возможности терапии хронического гепатита С, в сб.: Материалы VII Российской конференции Гепатология сегодня, РЖГГК, 2002, с. 6].

Например, в международной заявке №О 2009/133137 (опубл. 05.11.2009) раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая подходящие фармацевтические эксципиенты, а также содержащая пролекарственный конъюгат гормона роста человека (ИОН) формулы 11СН^Н-Б''-8°. в которой ЙСН-ΝΒ представляет остаток ИОН; Ь^а представляет функциональную группу, способную к аутогидролизу; а 8° является полимерной цепью, имеющей молекулярную массу по меньшей мере 5 кДа.

Одним из способов снижения числа позиционных изомеров является присоединение ПЕГ преимущественно к Ν-терминальной аминогруппе полипептида, используя разность значений рК_а для Νконцевой α-аминогруппы и ε-аминогруппы лизиновых фрагментов белка.

Так, в международной заявке №О 2006/024953 (опубл. 09.03.2006) предложен ковалентный конъюгат ИОН структуры

- 1 019967

Н₂С------О(СН₂СН2О)_ПСН2СН₂СН₂ЦНК

СН------О(СН₂СН₂О)_гоСНз

Н₂С------О(СН₂СН2Р)_тСНз где η - целое число от 60 до 75;

т - целое число от 450 до 460;

Я - человеческий гормон роста, в котором ПЕГ присоединен по α-аминогруппе Ν-терминального фенилаланина.

В международной заявке \¥О 2005/079838 (опубл. 01.09.2005) предложены ковалентные конъюгаты соматотропина, в которых ПЕГ присоединен к Ν-терминальной аминогруппе полипептида, имеющие следующие структуры:

и тРЕС-Ю(СН₂СН2О)_п(СН₂)_тСН_гМН-Е где η - целое число от 1 до 10;

т - целое число от 1 до 10;

Я - человеческий гормон роста или метионилированный гормон роста.

Однако условия конъюгации в данных патентах полностью не исключают вероятность присоединения ПЕГ к ε-аминогруппам лизиновых фрагментов, часть которых, несмотря на высокое значение рК_а, даже при кислых рН депротонирована, а их молярное соотношение к Ν-терминальной α-аминогруппе в молекуле ИОН как 9:1 соответственно.

Известно, что позиционные изомеры полипептидов имеют различную биологическую активность (И8 2004/0223950, опубл. 11.11. 2004). Это создает предпосылки для расширения арсенала таких средств за счет различных вариантов модифицирования молекул протеинов. Например, изменение положений и способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипепти дов.

Наиболее близкими по технической сущности рассматриваются физиологически активные конъюгаты, в частности, инсулина, раскрытые в И8 4179337 (опубл. 18.12.1979), содержащие в молекуле фрагмент парафенилендиазония и имеющие строение аминоазопроизводного формулы

где Я представляет РЕО-О-СН₂-, РЕО-О-СН₂-СН(ОН)-СН₂-О- или РЕО-О-С(=О)-; а представляет пептидную цепь.

Недостатками таких производных являются относительно большое количество возможных вариантов позиционных изомеров вследствие присоединения полимерной части к аминогруппам полипептидов и их невысокая стабильность в организме и, как следствие, связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности диазосоединений.

Таким образом, существует потребность в новых конъюгатах ИОН.

- 2 019967

Сущность изобретения

Авторы изобретения неожиданно установили, что конъюгаты ПЕГ с ЮН, в которых полимер присоединен к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, имеющие общую структуру (I), приобретают способность длительной циркуляции в крови и сохраняют значительную часть биологической активности немодифицированного соматотропина

(0 где А - аминокислотный фрагмент гистидина;

В - аминокислотный фрагмент тирозина;

ЮН - соматотропин;

η - целое число от 10 до 1200;

т принимает значения от 0 до 3;

к принимает значения от 0 до 8, причем т^к. если т или к равны 0.

Для доказательства строения конъюгата как азосоединения применяют, в частности, электронную спектроскопию поглощения (ЭСП), сравнивают спектральные характеристики (интенсивность, ширину и положение максимумов полос поглощения) растворов монопегилированного, дипегилированного и немодифицированного ЮН и интерпретируют полученные закономерности с позиций теории цветности органических соединений, необязательно, с привлечением адекватных методов квантово-химического моделирования. Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики максимумов полос поглощения ЮН и его моно- и дипегилированных производных (вода, рН 4,5, 11,0 см)

Соединение	Характеристика	Значение
пен	λ-макс, НМ	219	280	-	-
с-1% ^ь1см	299	15,1	-	-
ПЕГ-ЬСН	λ-макс г НМ	204	276	333	404*
^£1см	213,8	7,8	7,5	4,3
диПЕГЬСН	λ-макс ζ НМ	204	276	333	404*
_Р1% Чем	333,2	11,6	11,7	6,6

_Е1% '™ - поглощение 1% (мас./об.) раствора при 11 см: * - проявляется в виде плеча.

Появление полос поглощения у моно- и дипегилированного ЮН с максимумами при 333 и 404 нм может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными электронными переходами в хромофорных системах, не связанных сопряжением диарилазогрупп, образовавшихся в результате ковалентного присоединения ПЭГ-агента к тирозиновым и гистидиновым звеньям ЮН. Уширение полос обусловлено наличием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронно-колебательных переходов.

Достижение технического результата, заключающегося в увеличении времени циркуляции в кровотоке моно- и дипегилированного ЮН, подтверждают в сериях исследований на мышиной модели. Результаты сравнительных исследований ίη νίνο приведены в табл. 2.

Таблица 2

Время достижения максимальной концентрации (Т_тах) и период полупревращения (Т_1/2) ЮН и его конъюгатов в соответствии с изобретением в крови мышей после п/к инъекции

Препарат	Аах	Т172, Ч
ЮН	3,1+0,6	3,4±1,1
ПЕГ-ПОН	10,4±1,7	13,2+2,8
диПЕГ-НСН	13,8+2,3	16,9+2,6

Приведенные данные показывают, что конъюгаты ЮН в соответствии с изобретением обладают большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным соматотропином.

- 3 019967

Результаты исследования биологической активности конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением приведены в табл. 3.

Таблица 3

Биологическая активность моно- и дипегилированного соматотропина относительно немодифицированного ЮН

Препарат	МЕ/мг	Остаточная активность, %
йен	3,0	100, 0
ПЕГ-ЮН	0,37	12,3
диПЕГ-ЮН	0,12	4,0

Таким образом, конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением сохраняют существенную часть биологической активности немодифицированного гормона роста человека.

В соответствии с изобретением конъюгаты соматотропина с высокой степенью чистоты могут быть получены способом, включающим стадии, на которых:

а) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты

где η принимает значения от 10 до 1200, диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента - ([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония

где η принимает вышеуказанные значения;

б) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию азосочетания с ЮН в молярном соотношении ПЕГ-агента к ЮН от 1 до 100 к 1 соответственно, в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°С; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси конъюгатов разной степени пегилирования, немодифицированного соматотропина и блокированного ПЭГ-агента;

в) полученную смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с выделением ЮН необходимой степени пегилирования.

При реализации заявленного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного ЮН, увеличение времени его циркуляции в кровотоке.

Повышение выхода пегилированного ЮН достигается за счет количественного переведения ПЕГ агента в активную форму непосредственно перед конъюгацией, исключая деградацию активной группировки - диазогруппы при транспортировке и хранении.

Увеличение времени циркуляции пегилированного ЮН в кровотоке возможно за счет способности тирозиновых и гистидиновых звеньев ЮН вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных соматотропина.

В случае необходимости, повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования.

В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят нитритом натрия в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой кислотой.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии НС1 в тетрагидрофуране.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания рН применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения ЮН составляет 75-100%,

- 4 019967 а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин.

В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М ЫаС1.

На стадии а) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С.

В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или водно-органической среде. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°С. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например с помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или неорганических кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.

Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°С. Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Кислую среду в полярной органической среде создают растворами НС1 или НВг в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1.

По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Термин пониженная температура означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды. Перед применением активированного ПЭГ-агента для пегилирования интерферона требуется удаление избытка нитрит-ионов, для чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно применяют азиды щелочных или щелочно-земельных металлов.

На стадии б) пегилирование соматотропина достигается в результате протекания реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с БОН в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал рН при пегилировании составляет от 9 до 10. Поддержание рН обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратно-карбонатного буферного раствора. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к БОН составляет от 1:1 до 100:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1.

Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ. По достижении требуемой степени превращения полипептида реакцию пегилирования останавливают добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей. Для этого в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых гетероцикл способен выступать в качестве азосоставляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно тирозин. Предпочтительно степень превращения БОН, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 75-100%.

Выделение пегилированного БОН из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию БОН определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя соответствующее значение А₂₈₀ для раствора с концентрацией полипептида 1 мг/мл.

- 5 019967

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.

Пример 1. Получение пегилированного кСН.

К охлажденному до 1°С раствору 0,5 мкмоль кСН в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 2,0 мкмоль 4-([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония (М.м. 30 кДа), поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Ктотакй 300-5С4, 250x4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм, градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ). По достижении степени превращения 11СН. равной 70-75% приливают раствор тирозина, перемешивают 10 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного кСН, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М №1СТ Выход очищенного монопегилированного кСН 42% (считая на ЮН). ЭСП (вода, рН 4,5, 11,0 см), Х_макс, нм ' ^{1см 1}: 204 (213,8), 276 (7,8), 333 (7,5), 404 (4,3). Выход очищенного дипегилированного кСН 23% (считая на кСН). ЭСП (вода, рН 4,5, 11,0 см), Х_макс, нм / ) ^1см : 204 (333,2), 276 (11,6), 333 (11,7), 404 (6,6).

Пример 2. Определение времени циркуляции моно- и дипегилированного ЮН в крови на мышиной модели.

Самцам мышей линии СВА вводят подкожно по 5 мкг моно- и дипегилированного ЮН в соответствии с изобретением, после чего собирают кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля используют немодифицированный ЮН, который вводят по той же схеме. Взятые пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при - 65°С до проведения тестов. Содержание в сыворотках крови (нг/мл) определяют с помощью ИФА набора ЭРС® Гормон роста человека, далее рассчитывают время достижения максимальной концентрации и период полупревращения.

Пример 3. Определение активности моно- и дипегилированного ЮН.

Биологическую активность ЮН определяют, используя стандартные методики, известные специалисту в данной области. В частности, биологическую активность, связанную с нативным или немодифицированным ЮН, измеряют в соответствии со стандартными исследованиями ίη νίίτο пролиферации клеток [С1агк с1 а1. 1. ΒίοΙ. Скет. Уо1. 271, р. 21969-21977], а также любую из методик, указанных в примере 1 патента ЕР 2113256 А1. Специалисту в данной области также очевидны модификации указанных методик, а также принципы выбора аналогичных методик и условий их выполнения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека, в котором полимер присоединен к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, имеющий общую структуру (I) где А - аминокислотный фрагмент гистидина;

В - аминокислотный фрагмент тирозина;

кСН - соматотропин;

η - целое число от 10 до 1200;

т принимает значения от 0 до 3;

к принимает значения от 0 до 8, причем т^к, если т или к равны 0.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2