WO2010021570A1 - Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом - Google Patents
Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом Download PDFInfo
- Publication number
- WO2010021570A1 WO2010021570A1 PCT/RU2009/000396 RU2009000396W WO2010021570A1 WO 2010021570 A1 WO2010021570 A1 WO 2010021570A1 RU 2009000396 W RU2009000396 W RU 2009000396W WO 2010021570 A1 WO2010021570 A1 WO 2010021570A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- biologically active
- active substance
- polymer
- immobilized
- solution
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims abstract description 59
- 239000013543 active substance Substances 0.000 title abstract description 33
- 239000000969 carrier Substances 0.000 title description 3
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 claims abstract description 50
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims abstract description 26
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims abstract description 16
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims abstract description 16
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 15
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims abstract description 15
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims abstract description 14
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 claims abstract description 14
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims abstract 3
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 126
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 116
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 63
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 63
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 63
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 37
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 37
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 claims description 35
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 claims description 32
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 claims description 32
- -1 polyethylene Polymers 0.000 claims description 30
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 claims description 29
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 12
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000005461 Bremsstrahlung Effects 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 abstract description 4
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 60
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 16
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 16
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 14
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 13
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000010894 electron beam technology Methods 0.000 description 6
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 229940119743 dextran 70 Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920003072 Plasdone™ povidone Polymers 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 4
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 4
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 4
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,5-tetrahydroxy-6-[3,4,5-trihydroxy-6-[[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxyhexanal Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002709 granulomonocytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 108010027350 protosubtilin Proteins 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000003013 erythroid precursor cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 1
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000925 erythroid effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 229940080237 sodium caseinate Drugs 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Definitions
- the invention relates to medicine, biology, pharmacology.
- WO0044785 describes a conjugate of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF, gCSF) with a molecular weight polyethylene oxide of 5000-30000 Da obtained by the method of peptide bond synthesis using active esters.
- G-CSF granulocyte colony stimulating factor
- gCSF granulocyte colony stimulating factor
- the conjugates described in CN 1966528 are obtained in a similar manner, but bound carriers are used. between themselves two molecules of polyethylene oxide with a molecular weight
- the drug is used for injection.
- the method provides a covalent bond of biologically active substances with the polymer, however, due to the use of rather aggressive chemicals, a high percentage of biologically active substances is destroyed during immobilization.
- This technique includes a series of sequential chemical reactions, which greatly complicates the synthesis of the final compound and requires additional technological operations for the purification of the drug, because reagents used in the process are toxic to the body. As a result, this leads to a significant increase in the cost of pharmacological substance.
- patent WO2005055946 describes a gCSF conjugate with polyethylene oxide (polypropylene oxide), the bond between which is via sialic acid. Transferase is used to synthesize such conjugates.
- This method also provides a covalent bond of the biologically active substance with the polymer, but is also multi-stage, which significantly complicates the synthesis of the final compound and requires additional technological operations for the purification of the drug.
- a known method of immobilizing amphotericin B on a water-soluble polymer dextran in which dextran is irradiated with a stream of accelerated electrons or ⁇ -radiation at a dose of 1-5 Mrad, achieving its activation (RU2297246). Then a biologically active substance is introduced into the activated polymer.
- dextran with MM 30-60 kDa and a concentration of 1-10%.
- the ratio of amphotericin B and dextran in the reaction mixture is 1 to 800.
- the yield of the therapeutic composition is 99%.
- a known method of immobilization of protosubtilin on polyethylene oxide in which protosubtilin in a solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 1500-4000 Da is subjected to irradiation with bremsstrahlung radiation at a dose of 0.5 -1 Mrad (RU2270861, prototype).
- Polyethylene oxide is added to the protosubtiline solution to a concentration by weight of 5-10% in the ratio (3-8): 1.
- the yield of the finished product is 95-98%.
- the drug can be applied parenterally.
- the essence of the first variant of the method of immobilization of a biologically active substance (BAS) on a pharmacologically acceptable polymer carrier is that the BAS is dissolved in an aqueous solution of a polymer carrier having a concentration above 10% to a saturated solution, then the reaction mixture is irradiated with ionizing radiation.
- BAS biologically active substance
- the reaction mixture can be frozen at a temperature of (-20 °) - (-140 °) C.
- This method can be immobilized onto a polymeric carrier, in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
- a polymeric carrier in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
- G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
- water-soluble polymer carrier in particular, polyethylene oxides, dextrans, polyvinylpyrrolidone, acrylamide, some polymeric surface-active substances (surfactants, for example, Pluronic (Pluropis), etc.) and others.
- surfactants for example, Pluronic (Pluropis), etc.
- N ° l The technical result of the proposed method according to the option N ° l is the possibility of immobilization on a polymer carrier of those water-soluble biologically active substances that are unstable, i.e. are destroyed when they are immobilized by other methods, in particular, in the conditions of the prototype method using ionizing radiation at a dose of 0.5-1 Mrad and a polymer concentration of 5-10%, as well as an increase in the fraction of stored biologically active substances in those cases when immobilizing biologically active substances is destroyed not completely.
- the essence of the second variant of the method for immobilizing a biologically active substance on a pharmacologically acceptable polymer carrier is that the biologically active substance is dissolved in an aqueous solution of a polymer carrier, then the mixture is frozen to a temperature of (-20 °) - (- 140 °) C, after which it is irradiated with ionizing radiation.
- a water-soluble pharmacologically acceptable polymeric carrier is used at a concentration above 0% to a saturated solution.
- This method can be immobilized onto a polymeric carrier, in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
- a polymeric carrier in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
- G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
- water-soluble polymer carrier in particular, polyethylene oxides, dextrans, polyvinylpyrrolidone, acrylamide, some polymeric surface-active substances (surfactants, for example, Pluronic Pluripis, etc.) and others.
- the biologically active substance covalently binds to the polymer.
- the technical result of the proposed method according to option N ° 2 is the same as indicated above for the method according to option 1: the ability to immobilize on a polymer carrier those water-soluble biologically active substances that are unstable, i.e. are destroyed when they are immobilized by other methods, in particular, in the conditions of the prototype method using ionizing radiation at a dose of 0.5-1 Mrad and a polymer concentration of 5-10%, as well as an increase in the fraction of stored biologically active substances in cases when the biologically active substances break down not completely.
- the technical result is provided under the conditions of the proposed method by freezing the reaction mixture at a temperature of (-20 °) - (-140 °) C before irradiation.
- both variants of the proposed method are intended for immobilization of a water-soluble biologically active substance.
- the pH of the solution is adjusted to the desired value using a pharmacologically acceptable substance, for example, acetic acid.
- the BAS-carrier conjugate obtained by the above methods is characterized in that the BAS is selected from the group of: proinsulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, alkalase, hyaluronidase, somatotropin, and the carrier is a pharmacologically acceptable polymer, selected from the group: polyethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, dextran, pluronic, acrylamide, moreover, the BAS molecule is covalently linked to at least one polymer molecule, in particular the following:
- FIG. 1 HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500.
- FIG. 2 HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500 after irradiation with ionizing radiation at a dose of 0.5 Mrad.
- Fig.Z HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500 after irradiation with ionizing radiation at a dose of 1.5 Mrad.
- FIG. 4 HPLC of a solution of insulin in a 20% solution of polyethylene oxide -1500.
- FIG. 5 HPLC of insulin solution in 20% polyethylene oxide-1500 after irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 6 HPLC of an insulin solution in 75% polyethylene oxide-1500 after irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 7 HPLC of an aqueous solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate.
- FIG. 8 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in an 11% Plasdone K-17 solution after irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 9 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 50% Plasdone K-17 solution after irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 10 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 50% Plasdone K-17 solution after freezing to -2O 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 11 The content of CFU-GM (A) and CFU-E (B) in the bone marrow (index-1) and in the peripheral blood (index-2) in CBA / Calac mice with physiological saline (white bars), subcutaneous injection immobilized G-CSF (oblique hatching columns), enteral administration of immobilized G-CSF (black columns) and with subcutaneous administration of unconjugated G-CSF (horizontal hatching columns).
- the indicator values On the abscissa axis, the study time (day), on the ordinate axis, the indicator values: A - 10 5 myelocaryocytes; B - for 10 5 mononuclear cells. Confidence Intervals at p ⁇ 0.05.
- FIG. 12 The content of CFU-F (A) and MCK (B) in the bone marrow (index-1) and in peripheral blood (index-2) in CBA / Calac mice with physiological saline (white bars), subcutaneous injection of immobilized G -KSF (columns with oblique hatching), enteral administration of immobilized G-CSF (black columns) and with subcutaneous administration of unconjugated G-CSF (columns with horizontal hatching).
- the abscissa axis shows the duration of the study (24 hours), the ordinate axis shows the values of the indicator: Al — 2.5 ⁇ l O 5 myelocaryocytes; A2 - by 2.5 ⁇ l O 5 mononuclear cells; Bl - on 10 6 myelocaryocytes; B2 - for 10 6 mononuclear cells. Confidence intervals at p ⁇ 0.05.
- FIG. 13 HPLC results of a hyaluronidase solution in a 25% solution of dextran 70 (dextran with a molecular weight of 70 kDa).
- FIG. 14 The HPLC results of a hyaluronidase solution in a 25% solution of dextran 70 after irradiation with inhibitory ⁇ -radiation at a dose of 0.5 Mrad.
- FIG. 15 HPLC results of a proinsulin solution in a 20% solution of Plugopis F-68.
- FIG. 16 The HPLC results of a solution of proinsulin in a 20% solution of Rugopis F-68 after freezing to -7O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons of 1.0 Mrad.
- FIG. 17 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of Rugopis F-68.
- FIG. 18 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of Rugopis F-68 after freezing to -2O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 1.5 Mrad.
- FIG. 19 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of polyethylene oxide-1500.
- FIG. 20 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -14O 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 5 Mrad.
- FIG. 21 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 10% Plasdone K-17 solution after freezing to -70 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 22 Results of HPLC of a solution of growth hormone in 10% dextran.
- FIG. 23 The results of HPLC of a solution of growth hormone in 10% dextran after freezing to -2O 0 C and irradiation with bremsstrahlung ⁇ -radiation at a dose of 0.5 Mrad.
- FIG. 24 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500.
- FIG. 25 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -2O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1 Mrad.
- FIG. 26 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -7O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 1.5 Mrad.
- FIG. 27 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -14O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 5 Mrad.
- the time in minutes is plotted on the abscissa, and the voltage in millivolts is plotted on the ordinate.
- Time on the X axis is plotted on the same scale, voltage on the Y axis is plotted on a different scale.
- the numbers at the tops of the peaks mean: the bottom number is the time in minutes corresponding to the top of the peak (output of the maximum amount of substance corresponding to this peak), the top number is the number of the peak.
- FIG. 1 stock solution
- FIG. 2 solution after irradiation with a dose of 0.5 Mrad
- FIG. 3 solution after irradiation with a dose of 1.5 Mrad.
- Peak 18 in FIG. 1 time 10.77 min.
- Peak 10 in figure 2 time 11.16 min.
- FIG. 3 no peak corresponding to insulin.
- reaction mixtures were sealed in plastic bags and irradiated with an electron accelerator ILU-6 with a radiation dose of 1.5 Mrad to immobilize alkalase on polyethylene oxide-300.
- the polymer concentration has a significant effect on the preservation of an unstable biologically active substance: at a higher polymer concentration more alkalase is retained.
- sample N ° l a sample of 10 mg of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 20% solution of polietilenoksida-1500, in sample N ° 2 a sample of 10 mg of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 75% solution of polietilenoksida- 1500.
- the solutions were transferred into plastic bags, hermetically sealed and irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.0 Mrad.
- FIG. 5 The HPLC results of the irradiated solutions are shown in FIG. 5 (NbI sample) and FIG. 6 (sample N ° 2).
- the insulin corresponds to peak 15 in FIG. 5 and peak 12 in FIG. 6.
- FIG. 7 control
- FIG. 8 sample N ° 2
- FIG. 9 sample N ° 3
- Tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate corresponds to peak 9 in FIG. 7, peak 12 in FIG. 8 and peak 6 in FIG. 9.
- Sample was prepared: 2 mg of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate was mixed with 1 ml of a 50% solution of plasdon K-17 (Plasdope K-17). The solution was sealed in a sealed plastic bag.
- the shift of the peak of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate indicates the immobilization of the biologically active substances on the polymer and the formation of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate-polyvinylpyrrolidone conjugate.
- freezing solutions before irradiation increases the preservation of biologically active substances immobilized on a polymer.
- the solution was transferred into a plastic bag and hermetically sealed.
- the bag was placed in a freezer at -7O 0 C for 12 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with an irradiation dose of 1.0 Mrad.
- the immobilization of G-CSF on polyethylene oxide-1500 was carried out as follows. 2.5 ml of the substance G-CSF produced by JSC National Biotechnologies)) (0.4 mg / ml in acetate buffer) was mixed with 2.5 ml of 20% polyethylene oxide-1500. The mixture was poured into a plastic bag and frozen at -7O 0 C degrees for 16 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with an irradiation dose of 1.5 Mrad, as a result of which immobilized G-CSF was obtained.
- Non-immobilized G-CSF was administered subcutaneously at a dose of 100 ⁇ g / kg for 5 days.
- Immobilized G-CSF (G-CSF conjugate - polyethylene oxide-1500) was also administered at a dose of the active substance of 100 ⁇ g / kg subcutaneously for 5 days, and reg os for 10 days.
- Control mice in similar modes in an equivalent volume (0.2 ml) were injected with saline.
- G-CSF as the active substance of the studied drugs, in all cases naturally led to an increase in the content of granulomonocytic precursors in hematopoietic tissue. So, when using unconjugated G-CSF and intragastric administration of immobilized G-CSF, an increase in the number of CFU-GM was observed on the 3rd, 5th, 7th day of the study (Fig. 11, Al).
- the results of the experiment prove that biological activity is maintained, bioavailability is increased (can be used orally) and the duration of action of G-CSF is increased.
- G-CSF immobilized by the proposed method has a pronounced biological effect that is superior to non-immobilized G-CSF.
- phase A 95%
- proinsulin After the action of ionizing radiation, 96% of proinsulin was preserved.
- the peak shift on HPLC indicates a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier, which has arisen after the action of ionizing radiation, and the formation of the proinsulin-shguronik F-68 conjugate.
- a 50 ml sample of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 20% solution of pluronic (Pluropis F-68) (concentration close to saturation).
- a sample was taken for HPLC.
- the solution was transferred into a plastic bag, hermetically sealed and placed in a freezer at a temperature of -7O 0 C for 16 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.5 Mrad.
- a sample was repeatedly taken from the irradiated packet for HPLC.
- Reverse-phase HPLC was carried out on a Sukam chromatographic system (made in Germany) on a Phepomepech Luna Cl 8 column 5 ⁇ m 100A (manufactured in the USA).
- phase A 57.6%
- phase B 42.4%
- Sample was prepared: 2 mg of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate was mixed with 1 ml of a 10% solution of plasdon K-17 (Plasdope K-17). The solution was sealed in a sealed plastic bag.
- freezing solutions before irradiation increased the preservation of biologically active substances immobilized on a polymer.
- a suspension of 2.5 mg of somatotropin was dissolved in 5 ml of a 10% dextran solution with a molecular weight of 40-60 kDa.
- a sample was taken for HPLC. Then the solution was transferred into a plastic bag, hermetically sealed and frozen at -2O 0 C for 16 hours. After that, the packet was irradiated with bremsstrahlung radiation at a dose of 0.5 Mrad.
- a sample was repeatedly taken from the irradiated packet for HPLC.
- Reverse-phase HPLC was carried out on a Sukam chromatographic system (made in Germany) on a Phepomepech Luna Cl 8 column 5 ⁇ m 100A (manufactured in the USA).
- the preservation of growth hormone after exposure to ionizing radiation was 93.5%.
- the peak shift on HPLC indicates a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier after exposure to ionizing radiation and the formation of a somatotropin-dextran conjugate with a molecular weight of 40-60 kDa.
- N ° l was placed in a freezer at a temperature of -2O 0 C for 16 hours.
- Samples N ° 2 and N ° 3 were placed in the freezer at a temperature of -7O 0 C for 16 hours.
- sample N ° 1 was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1 Mrad.
- Sample No. 2 was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.5 Mrad.
- the packet with the JNs 3 sample was placed in a container with liquid nitrogen until the temperature reached -14O 0 C.
- the packet was irradiated with an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 5 Mrad.
- FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26 and FIG. 27 The results of HPLC are shown in FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26 and FIG. 27. Insulin corresponds to peak 19 in FIG. 24, peak 15 in FIG. 25, peak 16 in FIG. 26 and Fig. 27.
- sample N ° 1 54% of insulin was preserved, in sample N ° 2 - 41%, in sample N ° 3 - 57%.
- the peak shift on HPLC indicates the emergence of a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier after the action of ionizing radiation and the formation of the incyline-polyethylene oxide-1500 conjugate.
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии и касается способа иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на фармакологически приемлемом полимерном носителе. Способ включает растворение БАВ в водном растворе полимерного носителя, имеющего концентрацию выше 0% до концентрации насыщенного раствора, и облучение реакционной смеси ионизирующим излучением. Для увеличения сохранности БАВ от разрушения ионизирующим излучением перед облучением реакционная смесь может быть заморожена при температуре (-20°)-(-140°)C. При иммобилизации предлагаемым способом БАВ ковалентно связывается с полимером. Преимуществом предлагаемого способа является возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами полностью или почти полностью, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизации БАВ разрушается не полностью. Конъюгат БАВ-носитель характеризуется тем, что БАВ выбран из группы, включающей: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера.
Description
СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ (ВАРИАНТЫ) И КОНЪЮГАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ДАННЫМ СПОСОБОМ
Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии.
Уровень техники
В настоящее время в арсенале экспериментальной и практической медицины имеются препараты, часто белковой природы, которые имеют доказанную высокую эффективность в отношении многих патологических состояний (далее - биологически активные вещества, Б AB ). Механизм их действия реализуется как на рецепторном аппарате клетки, так и посредством прямого действия на патологические субстраты, такие как тромбы, белковый детрит, остатки клеточных мембран.
При высокой эффективности данные БАВ имеют ряд нежелательных свойств. Белковые препараты могут вызывать аллергическую реакцию. Некоторые БАВ быстро разрушаются в кровяном русле или при хранении. Однако, перспектива их использования настолько привлекательна для врачей-клиницистов, что становится очевидной необходимость модификации молекул данных БАВ таким образом, чтобы обеспечить безопасность препарата, не утратив при этом его фармакологической эффективности.
Для решения этой задачи, как правило, используется иммобилизация БАВ на водорастворимом полимере-носителе (полиэтиленоксиде, полиакриламиде, декстране и т.п.). При этом увеличивается время жизни препарата в кровотоке, следовательно увеличивается длительность его воздействия; снижается иммуногенность препарата; обеспечивается полноценная активность в лекарственной форме при длительном сроке хранения.
Существуют различные способы иммобилизации БАВ на полимере.
Известны способы иммобилизации БАВ на полимере химическим путем. Например, в патенте WO0044785 описан конъюгат гранулоцит- колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, gСSF) с полиэтиленоксидом молекулярной массы 5000-30000 Да, полученный способом синтеза пептидной связи с использованием активных эфиров. Подобным способом получены конъюгаты, описанные в патенте CN 1966528, но в качестве носителя используются связанные
между собой две молекулы полиэтиленоксида молекулярной массой
5000-30000 Да. Препарат используется для инъекционного введения.
Способ обеспечивает ковалентную связь БАВ с полимером, однако, вследствие использования довольно агрессивных химических веществ, высокий процент БАВ разрушается в процессе иммобилизации. Данная методика включает серию последовательных химических реакций, что значительно усложняет синтез конечного соединения и требует дополнительных технологических операций по очистке препарата, т.к. используемые в технологическом процессе реактивы токсичны для организма. В итоге это приводит к значительному удорожанию фармакологической субстанции.
Известен способ ферментативной иммобилизации БАВ на полимере. Например, в патенте WO2005055946 описан конъюгат gСSF с полиэтиленоксидом (полипропиленоксидом), связь между которыми осуществлена через сиаловую кислоту. Для синтеза таких конъюгатов используется трансфераза.
Данный способ также обеспечивает ковалентную связь БАВ с полимером, но тоже является многостадийным, что существенно усложняет синтез конечного соединения и требует дополнительных технологических операций по очистке препарата.
Кроме указанных выше химического и ферментативного способов, для получения конъюгатов БАВ с полимером используют электронно-лучевые технологии.
Известен способ иммобилизации амфотерицина В на водорастворимом полимере декстране, при котором потоком ускоренных электронов или γ -излучением в дозе 1-5 Мрад облучают декстран, достигая его активации (RU2297246). Затем в активированный полимер вносят БАВ. Используют декстран с MM 30-60 кДа и концентрацией 1-10%. Соотношение амфотерицина В и декстрана в реакционной смеси составляет 1 к 800. Выход терапевтической композиции составляет 99%.
При таком способе иммобилизации нестойкие биологически активные вещества не подвергаются деструкции, однако данным способом не удается добиться ковалентной сшивки БАВ с полимером, следовательно, ослабляются позитивные эффекты иммобилизации.
Известен способ иммобилизации протосубтилина на полиэтиленоксиде, при котором протосубтилин в растворе полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500- 4000 Да подвергают облучению тормозным γ-излучением в дозе 0,5 -1 Мрад
(RU2270861, прототип). Полиэтиленоксид добавляют к раствору протосубтилина до концентрации по массе 5-10% в соотношении (3-8):1. Выход готового продукта составляет 95-98%. Препарат может быть применен парэнтерально.
Недостатком данного способа является то, что, ряд БАВ (полипептиды, проинсулин, инсулин, соматотропный гормон, интерферон-альфа и др.), как показали наши исследования, при иммобилизации данным способом под действием ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад разрушаются практически полностью. Меньшие дозы облучения не приводят к иммобилизации БАВ и получению конъюгата.
Раскрытие изобретения
Сущность первого варианта способа иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на фармакологически приемлемом полимерном носителе заключается в том, что БАВ растворяют в водном растворе полимерного носителя, имеющего концентрацию выше 10% до насыщенного раствора, затем реакционную смесь облучают ионизирующим излучением.
Для увеличения сохранности БАВ от разрушения ионизирующим излучением перед облучением реакционная смесь может быть заморожена при температуре (-20°)- ( -140°)C.
В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
Данным способом могут быть иммобилизированы на полимерный носитель, в частности, алкалаза, инсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гиалуронидаза, проинсулин, соматотропин, и другие БАВ.
В качестве водорастворимого полимерного носителя могут быть использованы, в частности, полиэтиленоксиды, декстраны, поливинилпирролидон, акриламид, некоторые полимерные поверхностно-активные вещества (ПАВ, например, плюроник (Рlurопiс) и др.) и др.
Далее в тексте приведены примеры осуществления данного способа и получения конъюгатов алкалазы с полиэтиленоксидом, инсулина с полиэтиленоксидом, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата с поливинилпирролидоном, Г-КСФ с полиэтиленоксидом, гиалуронидазы с декстраном, инсулина с плюроником.
При иммобилизации предлагаемым способом БАВ ковалентно связывается с полимером.
Техническим результатом предлагаемого способа по варианту N°l является возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами, в частности, в условиях способа-прототипа при использовании ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад и концентрации полимера 5-10%, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизпции БАВ разрушается не полностью.
Технический результат обеспечивается в условиях предлагаемого способа концентрацией полимера выше 10% до насыщенного раствора.
Сущность второго варианта способа иммобилизации БАВ на фармакологически приемлемом полимерном носителе заключается в том, что БАВ растворяют в водном растворе полимерного носителя, затем смесь замораживают до температуры (-20°)-(-140°)C, после чего облучают ионизирующим излучением.
Водорастворимый фармакологически приемлемый полимерный носитель используют в концентрации выше 0% до насыщенного раствора.
В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
Данным способом могут быть иммобилизированы на полимерный носитель, в частности, алкалаза, инсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гиалуронидаза, проинсулин, соматотропин, и другие БАВ.
В качестве водорастворимого полимерного носителя могут быть использованы, в частности, полиэтиленоксиды, декстраны, поливинилпирролидон, акриламид, некоторые полимерные поверхностно-активные вещества (ПАВ, например, плюроник Рlurопiс и др.) и др.
Далее в тексте приведены примеры осуществления данного способа и получения конъюгатов тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата с поливинилпирролидоном, инсулина с полиэтиленоксидом, соматотропина с декстраном, Г-КСФ с полиэтиленоксидом, гиалуронидазы с декстраном, инсулина с плюроником.
При иммобилизации данным способом БАВ ковалентно связывается с полимером.
Техническим результатом предлагаемого способа по варианту N°2 является тот же, что указан выше для способа по варианту 1 : возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами, в частности, в условиях способа-прототипа при использовании ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад и концентрации полимера 5-10%, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизации БАВ разрушается не полностью.
Технический результат обеспечивается в условиях предлагаемого способа замораживанием реакционной смеси при температуре (-20°) - (-140°)C перед ее облучением.
Как указывалось выше, оба варианта предлагаемого способа предназначены для иммобилизации водорастворимого БАВ. В тех случаях, когда конкретное БАВ слабо растворяется в нейтральной водной среде, рН раствора доводят до необходимого значения с помощью фармакологически приемлемого вещества, например, уксусной кислоты.
Конъюгат БАВ-носитель, получаемый вышеописанными способами, характеризуется тем, что БАВ выбран из группы: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера, в частности, следующие:
• конъюгат тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат - поливинилпирролидон (Рlаsdопе К- 17) (пример 4, фиг.7,8,9; пример 5, фиг.10,9; пример 12, фиг. 21,8);
• конъюгат алкалаза - пoлиэтилeнoкcид-300 (полиэтиленоксид с молекулярной массой 300 Да) (пример 2, таблица);
• конъюгат гиалуронидаза - декстран 70 (декстран с молекулярной массой 70 кДа) (пример 8, фиг.13,14);
• конъюгат проинсулин - плюроник (Рlurопiс F-68) (пример 9, фиг. 15,16; пример 10, фиг.17, 18);
• конъюгат соматотропин - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа (пример 14, фиг.22,23).
Перечень фигур иллюстративного материала:
Фиг. 1. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500.
Фиг. 2. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его ионизирующим излучением в дозе 0,5 Мрад.
Фиг.З. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его ионизирующим излучением в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 4. ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида -1500.
Фиг. 5. ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 6. ВЭЖХ раствора инсулина в 75%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,0 Мрад.
Фиг. 7. ВЭЖХ водного раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата.
Фиг. 8. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 11%-м растворе Plasdone K- 17 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 9. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 50%-м растворе Plasdone K- 17 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 10. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 50%-м растворе Plasdone K- 17 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 11. Содержание КОЕ-ГМ (А) и КОЕ-Э (Б) в костном мозге (индекс- 1) и в периферической крови (индeкc-2) у мышей линии СВА/Саlас при введении физиологического раствора (белые столбики), подкожного введения иммобилизированного Г-КСФ (столбики с косой штриховкой), энтерального введения иммобилизированного Г-КСФ (чёрные столбики) и при подкожном введении неконъюгированного Г-КСФ (столбики с горизонтальной штриховкой). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А - на 105 миелокариоцитов; Б - на 105 мононуклеаров. Доверительные интервалы при
p<0,05.
Фиг. 12. Содержание КОЕ-Ф (А) и MCK (Б) в костном мозге (индекс- 1) и в периферической крови (индeкc-2) у мышей линии СВА/Саlас при введении физиологического раствора (белые столбики), подкожного введения иммобилизированного Г-КСФ (столбики с косой штриховкой), энтерального введения иммобилизированного Г-КСФ (черные столбики) и при подкожном введении неконъюгированного Г-КСФ (столбики с горизонтальной штриховкой). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: Al - на 2,5 χl О5 миелокариоцитов; A2 - на 2,5 χl О5 мононуклеаров; Бl - на 106 миелокариоцитов; Б2 - на 106 мононуклеаров. Доверительные интервалы при p<0,05.
Фиг. 13. Результаты ВЭЖХ раствора гиалуронидазы в 25%-м растворе декстрана 70 (декстрана с молекулярной массой 70 кДа).
Фиг. 14. Результаты ВЭЖХ раствора гиалуронидазы в 25%-м растворе декстрана 70 после облучения его тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад.
Фиг. 15. Результаты ВЭЖХ раствора проинсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F- 68.
Фиг. 16. Результаты ВЭЖХ раствора проинсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F- 68 после замораживания до -7O0C и облучения потоком ускоренных электронов 1,0 Мрад.
Фиг. 17. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F-68.
Фиг. 18. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F-68 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 19. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида- 1500.
Фиг. 20. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -14O0C и облучения потоком ускоренных электронов дозе 5 Мрад.
Фиг. 21. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 10%-м растворе Plasdone K- 17 после замораживания до -700C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,0 Мрад.
Фиг. 22. Результаты ВЭЖХ раствора соматотропина в 10%-м декстране.
Фиг. 23. Результаты ВЭЖХ раствора соматотропина в 10%-м декстране после замораживания до -2O0C и облучения тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад.
Фиг. 24. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500.
Фиг. 25. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 Мрад.
Фиг. 26. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -7O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 27. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -14O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 5 Мрад.
На фигурах с ВЭЖХ по оси абсцисс отложено время в минутах, по оси ординат - напряжение в милливольтах. Время по оси X отложено в одном и том же масштабе, напряжение по оси Y отложено в разном масштабе. Числа на вершинах пиков означают: нижнее число - время в минутах, соответствующее вершине пика (выходу максимального количества вещества, соответствующего данному пику), верхнее число - номер пика.
Далее изобретение раскрывается в примерах, которые являются иллюстративными, то есть предназначены для лучшего понимания изобретения и не являются ограничивающими объем притязаний, который отражен в формуле изобретения, приведенной далее.
Пример 1. При иммобилизации способом-прототипом нестабильное БАВ (инсулин) разрушается полностью или почти полностью.
В 5-ти мл 10%-го раствора полиэтиленоксида- 1500 растворялась навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Далее раствор переносился в два полиэтиленовых пакета, герметично запаивался и облучался ионизирующим излучением. Доза облучения для первого пакета была 0,5 Мрад, для второго - 1,5 Мрад. Из облученных пакетов повторно отбирались пробы для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германии) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил,
фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг.1 (исходный раствор), фиг. 2 (раствор после облучения дозой 0,5 Мрад), и фиг. 3 (раствор после облучения дозой 1,5 Мрад). Пик 18 на фиг. 1 (время 10,77 мин.), пик 10 на фиг.2 (время 11,16 мин.) соответствуют инсулину. На фиг. 3 соответствующий инсулину пик отсутствует.
По соотношению площадей пиков, относящихся к инсулину, было подсчитано, что в растворе после облучения дозой 0,5 Мрад сохранилось 2,3% исходного количества инсулина (фиг.2). При дозе 1,5 Мрад инсулин разрушен полностью (фиг.З).
Таким образом, при иммобилизации его в условиях способа-прототипа нестабильное БАВ (инсулин) разрушается почти полностью.
Пример 2
Готовили две пробы. В пробе .NbI 5 мл концентрированной алкалазы (производство «Novozymes A/S») растворяли в 45-ти мл 50%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-300 (полиэтиленоксид с молекулярной массой, равной 300 Да), в пробе N°2 - 5 мл концентрированной алкалазы растворяли в 45 мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-300. Контролем служил раствор 5 мл концентрированной алкалазы в 45-ти мл воды. Измеряли исходную протеолитическую активность алкалазы в полученных растворах по гидролизу 1%-го раствора казеината натрия.
Реакционные смеси запаивали в полиэтиленовые пакеты и облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад для иммобилизации алкалазы на пoлиэтилeнoкcидe-300.
После облучения растворов повторно измеряли протеолитическую активность алкалазы в пробах. Результаты представлены в таблице (ниже).
Результаты измерения протеолитической активности алкалазы (Ед/мл)
Из данных, представленных в таблице, видно, что активность иммобилизированной алкалазы значительно снизилась в пробе с 20%-ным пoлиэтилeнoкcидoм-300 в отличие от пробы с 50%-ным полиэтиленоксид ом.
Таким образом, концентрация полимера оказывает существенное влияние на сохранение нестабильного БАВ: при более высокой концентрации полимера
сохраняется большее количество алкалазы.
Пример 3
Готовили две пробы. В пробе N°l навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина растворялась в 5-ти мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500, в пробе N°2 навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина растворялась в 5-ти мл 75%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500.
Из пробы NoI отбиралась проба для проведения ВЭЖХ.
Растворы переносились в полиэтиленовые пакеты, герметично запаивались и облучались на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад.
Из обоих пакетов отбирались пробы для проведения повторной ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германии) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% О, IM раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ необлученного раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида -1500 представлены на фиг.4. Инсулину соответствует пик 16.
Результаты ВЭЖХ облученных растворов представлены на фиг. 5 (проба NbI) и фиг. 6 (проба N°2). Инсулину соответствует пик 15 на фиг. 5 и пик 12 на фиг. 6.
В 20%-м растворе полиэтиленоксида (проба N°2) после облучения дозой 1,0 Мрад сохранилось 9% от исходного количества инсулина, в 75%-м растворе полиэтиленоксида (проба N°3) - около 25%. Таким образом, повышение концентрации полимера в растворе приводит к большей сохранности иммобилизированных белковых молекул при действии ионизирующего излучения. Смещение пика инсулина указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата инсулин - пoлиэтилeнoкcид-1500.
Пример 4
Готовили три пробы. В пробе N°l 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата растворяли в 1 мл воды (контроль).
В пробе No2 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 11%-го раствора пласдона К- 17 (Рlаsdопе К- 17, поливинипирролидон с MM 17000 Да), в пробе N°3 - 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата смешивали с 1 мл 50%-го раствора Рlаsdопе K-17.
Растворы запаивались в герметичные полиэтиленовые пакеты, пробы облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. После этого проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 +10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 +50% ацетонитрил, детекция на 230 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 7 (контроль), фиг. 8 (проба N°2), фиг. 9 (проба N°3). Tиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетату соответствует пик 9 на фиг.7, пик 12 на фиг. 8 и пик 6 на фиг. 9.
В пробе N°2 сохранилось около 10% от исходного количества тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата, в пробе JNЪЗ - около 30%. Повышение концентрации полимера в растворе привело к большей сохранности Б AB. Смещение пика тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат - поливинилпирролидон (плacдoн K-17).
Пример 5
Готовили пробу: 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 50%-го раствора пласдон K-17 (Рlаsdопе K-17). Раствор запаивали в герметичный полиэтиленовый пакет.
Пробу в полиэтиленовом пакете помещали в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов, после чего пробу облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 +10% ацетонитрил, фаза В: 50% O5IM раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 230 нм. Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 10. Tиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетату соответствует пик 9.
По соотношению площадей пиков, относящихся к тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетату, было подсчитано, что в сравнении с аналогичной пробой, которая подвергалась воздействию ионизирующего излучения в жидком виде (пример 4, фиг. 9), количество сохранившегося иммобилизированного
тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата в пробе, облученной в замороженном виде, больше почти в 2 раза. Смещение пика тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и образование конъюгата тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат- поливинилпирролидон (пласдон K- 17).
Итак, замораживание растворов перед облучением увеличивает сохранность иммобилизированного на полимере БАВ.
Пример 6
В 5 мл 20%-го раствора полиэтиленоксида -1500 добавлялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина (ОАО «Haциoнaльныe биотехнологию), г. Оболенск). Поскольку данная марка инсулина растворяется в кислой среде и не растворяется в нейтральной, какой является раствор полиэтиленоксида, то под контролем рН-метра в смесь добавлялась ледяная уксусная кислота до значения рН 2,5-2,8. В результате кислотного титрования инсулин растворяется в пoлиэтилeнoкcидe-1500, и смесь инсулина с полиэтиленоксидом в воде становится прозрачной. Если взять пробу полученного раствора и сдвигать его рН в сторону рН 7,0, инсулин выпадает в осадок.
Раствор переносился в полиэтиленовый пакет и герметично запаивался. Пакет помещался в морозильную камеру при -7O0C на 12 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1 ,0 Мрад.
После облучения иммобилизированный инсулин не выпадал в осадок при ощелачивании раствора до pH=9. Таким образом, подтверждается возникновение ковалентных связей между БАВ и полимерным носителем и образование конъюгата инсулин - пoлиэтилeнoкcид-1500.
Пример 7
Иммобилизация Г-КСФ на пoлиэтилeнoкcидe-1500 осуществлялась следующим образом. 2,5 мл субстанции Г-КСФ производства ОАО «Haциoнaльныe биотехнологии)) (0,4мг/мл в ацетатном буфере) смешивалось с 2,5 мл 20%-го полиэтиленоксида- 1500. Смесь заливалась в полиэтиленовый пакет и замораживалась при -7O0C градусов в течение 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад, в результате чего получали иммобилизированный Г-КСФ.
Эксперименты были выполнены на 250 мышах линии СВА/СаLас в возрасте 2-
х месяцев. Неиммобилизированный Г- КСФ вводили подкожно в дозе по 100 мкг/кг в течение 5 дней. Иммобилизированный Г-КСФ (конъюгат Г-КСФ - пoлиэтилeнoкcид-1500) вводили также в дозе активного вещества 100 мкг/кг подкожно в течение 5 дней, и рег оs в течение 10 дней. Контрольным мышам в аналогичных режимах в эквивалентном объеме (0,2 мл) вводили физиологический раствор.
На 2, 3, 4, 5, 7, 10-е сут. эксперимента в костном мозге и периферической крови животных опытных и экспериментальных групп методом клонирования в полувязкой культуральной среде определяли содержание грануломоноцитарных (ГМ), эритроидных (Э) и фибробластных (Ф) колониеобразующих единиц (КОЕ). С помощью метода лимитирующих разведений на 3-й сут. опыта в костном мозге и периферической крови изучали количество мезенхимальных стволовых клеток (MCK).
Введение препаратов выявило их значительное влияние на состояние пула родоначальных клеток. Г-КСФ, как активное вещество исследуемых средств, во всех случаях закономерно приводил к увеличению содержания грануломоноцитарных прекурсоров в гемопоэтической ткани. Так, при использовании неконъюгированного Г-КСФ и при внутрижелудочном применении иммобилизированного Г-КСФ отмечалось возрастание количества КОЕ-ГМ на 3, 5, 7-е сутки исследования (фиг.11, Al). Вместе с тем введение иммобилизированного Г-КСФ подкожно приводило к более длительному (3, 7, 10-е сут.) и максимально выраженному (до 372,1% на 3-й сут. опыта от аналогичного параметра у контрольных мышей) увеличению числа кроветворных клеток в костном мозге (фиг. 11).
Введение иммобилизированного Г-КСФ подкожно приводит на 5-е сутки к достоверному превышению КОЕ-Э в периферической крови по сравнению с неконъюгированным Г-КСФ (фиг. 11, Б2).
Результаты эксперимента доказывают, что сохраняется биологическая активность, увеличивается биодоступность (можно применять перорально) и увеличивается продолжительность действия Г-КСФ.
Схожие изменения имели место со стороны пула фибробластных колониеобразующих единиц, содержащих в своем составе как коммитированные стромальные элементы, так и мультипотентные стволовые клетки. Введение неконъюгированного и иммобилизированного препаратов Г-КСФ (в обоих режимах) приводило к увеличению числа КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани на 3, 4, 7-е и 4, 7-е
сут. опыта соответственно. При этом прием иммобилизированного с помощью нанотехнологии препарата внутрь оказывал менее выраженный эффект (7-е сут.) по сравнению с парентеральным путем назначения стандартного Г-КСФ. Указанные изменения функциональной активности КОЕ-Ф костного мозга сопровождались усилением их выхода в периферическую кровь. Причем, наиболее существенной данная реакция была в группе животных, получавших иммобилизированного Г-КСФ подкожно, а менее значимая у мышей при внутрижелудочном применении иммобилизированной формы цитокина (фиг. 12).
Введение подкожно конъюгированного Г-КСФ приводило на 5-е сутки к достоверному повышению содержания MCK в костном мозге по сравнению с неконъюгированным Г-КСФ (фиг.12, Б2).
Из представленных фигур видно, что иммобилизированный предложенным способом Г-КСФ обладает выраженным биологическим эффектом, превосходящим неиммобилизированный Г-КСФ.
Пример 8
В 3 мл 25%-го раствора декстрана 70 (декстран с молекулярной массой 70 кДа) растворяли навеску 100 мг гиалуронидазы. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -2O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luпа C18 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 95%, фаза В 5%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОДМ раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 13 и фиг. 14. Гиалуронидазе соответствует пик 10 на фиг. 13, 14.
После действия ионизирующего излучения сохранилось около 85% гиалуронидазы. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата галуронидаза-декстран 70.
Пример 9
В 5 мл 20%-го раствора плюроника (Рlurопiс F-68) растворялась навеска 10 мг рекомбинантного проинсулина (ОАО ((Национальные биотехнологию), г. Оболенск).
Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -7O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Градиентный режим: фаза А 58,8%, к 16 минуте - 32,5%, к 18 минуте - 0%, фаза В 41,2%, к 16 минуте 67,5%, к 18 минуте 100%, где фаза А: 90% O,1M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОДМ раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 15 и фиг. 16. Проинсулину соответствует пик 16 на фиг.15 и пик 17 на фиг.16.
После действия ионизирующего излучения сохранилось 96% проинсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем, возникшей после действия ионизирующего излучения, и образовании конъюгата проинсулин-шгюроник F-68.
Пример 10
В 5 мл 20%-го раствора плюроника (Рlurопiс F-68) (концентрация, близкая к насыщению) растворялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и помещался в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад. Из облученного пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 17 и фиг. 18. Инсулину соответствует пик 12 на фиг.17 и пик 10 на фиг. 18.
После действия ионизирующего излучения сохранилось около 50% инсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и получении конъюгата проинсулин-плюроник F-68.
Пример 11
В 5 мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500 растворялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и помещался в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов. Непосредственно перед облучением пакет помещался в ёмкость с жидким азотом до достижения температуры -14O0C. Сразу же после этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 5 Мрад. Из облученного пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0, IM раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 19 и фиг. 20. Инсулину соответствует пик 15 на фиг.19 и пик 14 на фиг. 20.
После действия ионизирующего излучения сохранилось 59% инсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата инсулин-полиэтиленоксид- 1500.
Пример 12
Готовили пробу: 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 10% раствора пласдона К- 17 (Рlаsdопе К- 17). Раствор запаивали в герметичный полиэтиленовый пакет.
Пробу в полиэтиленовом пакете помещали в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов, после чего пробу облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОД M раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 230 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 21. Tиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетату соответствует пик 8.
В сравнении с пробой, которая подвергалась воздействию ионизирующего излучения в жидком виде (фиг. 8), количество сохранившегося иммобилизированного
тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата почти в 7 раз больше. Смещение пика тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат - поливинилпирролидон (пласдон К- 17).
Таким образом, замораживание растворов перед облучением увеличивало сохранность иммобилизированного на полимере БАВ.
Пример 13
В 5 мл 10%-го раствора полиэтиленоксида -1500 добавлялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина (ОАО ((Национальные биотехнологию), г. Оболенск). Поскольку данная марка инсулина растворяется в кислой среде и не растворяется в нейтральной среде, какой является раствор полиэтиленоксида, то под контролем рН-метра в смесь добавлялась ледяная уксусная кислота до значения рН 2,5-2,8. В результате кислотного титрования инсулин растворяется в пoлиэтилeнoкcидe-1500 и смесь инсулина с полиэтиленоксидом в воде становится прозрачной. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет и герметично запаивался. Пакет помещался в морозильную камеру при -7O0C на 12 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИJIУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад.
После облучения иммобилизированный инсулин не выпадал в осадок при ощелачивании раствора до pH=9. Таким образом, подтверждается возникновение ковалентных связей между БАВ и полимерным носителем и образование конъюгата инсулин-полиэтил еноксид- 1500.
Пример 14
В 5 мл 10%-го раствора декстрана с молекулярной массой 40-60 кДа растворялась навеска 2,5 мг соматотропина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -2O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Градиентный режим: фаза А 10%, к 40 минуте - 0%, фаза В 90%, к 40 минуте 100%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 220 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 22 и 23. Соматотропину соответствует пик 4 на фиг. 22 и пик 3 на фиг. 23.
Сохранность соматотропина после действия ионизирующего излучения составила 93,5%. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата соматотропин - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа.
Пример 15
В 10 мл 10%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500 растворялась навеска 100 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор разделялся на 3 пробы, пробы переносили в полиэтиленовые пакеты и герметично запаивали.
Проба N°l помещалась в морозильную камеру при температуре -2O0C на 16 часов. Пробы N° 2 и N° 3 помещалась в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов.
После замораживания пробу N° 1 облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1 Мрад. Пробу N° 2 облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад. Непосредственно перед облучением пакет с пробой JNs 3 помещали в ёмкость с жидким азотом до достижения температуры -14O0C. Сразу же после этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 5 Мрад.
Из облученных пакетов повторно отбирались пробы для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0ДM раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 24, фиг. 25, фиг. 26 и фиг. 27. Инсулину соответствует пик 19 на фиг. 24, пик 15 на фиг. 25, пик 16 на фиг. 26 и фиг.27.
В пробе N° 1 сохранилось 54% инсулина, в пробе N°2 - 41%, в пробе N°3 - 57%. Сдвиг пиков на ВЭЖХ свидетельствует о возникновении ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата инcyлин-пoлиэтилeнoкcид-1500.
Claims
1. Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на водорастворимом фармакологически приемлемом полимерном носителе, включающий растворение БАВ в растворе указанного носителя, облучение реакционной смеси ионизирующим излучением, отличающийся тем, что полимерный носитель используют в концентрации выше 10% до насыщенного раствора.
2. Способ по п.l, в котором, перед облучением реакционную смесь замораживают до температуры (-20°)-( -140° )C.
3. Способ по п.l или 2, в котором в качестве БАВ используют вещество, выбранное из группы, включающей: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронизаза, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-aprининa диацетат, алкалаза, соматотропин.
4. Способ по п.l, в котором в качестве полимерного носителя используют полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, плюроник, декстран, поливинилпирролидон, акриламид.
5. Способ по п.l, в котором в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
6. Способ по п.l, котором иммобилизируют алкалазу на полиэтиленоксиде.
7. Способ по п.l или 2, в котором иммобилизируют инсулин на полиэтиленоксиде.
8. Способ по п.l или 2, в котором иммобилизируют тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат на поливинилпирролидоне.
9. Способ по п.2, в котором иммобилизируют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор на полиэтиленоксиде.
10. Способ по п.2, в котором иммобилизируют гиалуронидазу на декстране.
11. Способ по п.2, в котором иммобилизируют проинсулин на плюронике.
12. Способ по п.2, в котором иммобилизируют инсулин на плюронике.
13. Способ иммобилизации БАВ на водорастворимом фармакологически приемлемом полимерном носителе, включающий растворение БАВ в растворе указанного носителя, облучение реакционной смеси ионизирующим излучением, отличающийся тем, что перед облучением смесь замораживают до температуры (- 20°)-(-140°)C.
14. Способ по п.13, в котором водорастворимый фармакологически приемлемый полимерный носитель используют в концентрации выше 0% до насыщенного раствора.
15. Способ по п. 13, в котором в качестве БАВ используют вещество, выбранное из группы, включающей: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронизаза, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат, алкалаза, соматотропин.
16. Способ по п.13, в котором в качестве полимерного носителя используют полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтил еноксид, плюроник, декстран, поливинилпирролидон, акриламид.
17. Способ по п.13, в котором в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
18. Способ по п.13, в котором иммобилизируют тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат на поливинилпирролидоне.
19. Способ по п. 13, в котором иммобилизируют инсулин на полиэтиленоксиде.
20. Способ по п.13, в котором иммобилизируют соматотропин на декстране.
21. Способ по п. п. 13, в котором иммобилизируют проинсулин на акриламиде.
22. Способ по п.13, в котором иммобилизируют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор на полиэтиленоксиде.
23. Способ по п.13, в котором иммобилизируют гиалуронидазу на декстране.
24. Способ по п.13, в котором иммобилизируют инсулин на плюронике.
25. Конъюгат БАВ-носитель, характеризущийся тем, что БАВ выбран из группы, включающей: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера.
26. Конъюгат по п.25, в котором БАВ представляет собой тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, а полимер - поливинилпирролидон (п л ас дон К- 17).
27. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой алкалазу, а полимер - полиэтил еноксид с молекулярной массой 300 Да.
28. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой гиалуронидазу, а полимер - декстран с молекулярной массой 70 кДа.
29. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой проинсулин, а полимер - плюроник (Рluгопiс F-68).
30. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой соматотропин, а полимер - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа.
31. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой проинсулин, а полимер - акриламид 4K.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP09808453.6A EP2327777A4 (en) | 2008-08-18 | 2009-08-07 | METHOD FOR IMMOBILIZING A BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE ON POLYMERIC (AND VARIANT) AND CONJUGATED MEDIA OBTAINED THEREFROM |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008133940 | 2008-08-18 | ||
RU2008133940/10A RU2409669C9 (ru) | 2008-08-18 | 2008-08-18 | Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2010021570A1 true WO2010021570A1 (ru) | 2010-02-25 |
Family
ID=41707331
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/RU2009/000396 WO2010021570A1 (ru) | 2008-08-18 | 2009-08-07 | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP2327777A4 (ru) |
RU (1) | RU2409669C9 (ru) |
WO (1) | WO2010021570A1 (ru) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2452509C1 (ru) * | 2011-01-31 | 2012-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Средство для стимуляции роста организма |
RU2452510C1 (ru) * | 2011-02-08 | 2012-06-10 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Анальгетическое средство |
RU2461389C1 (ru) * | 2011-02-14 | 2012-09-20 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Средство, увеличивающее продолжительность жизни |
RU2458126C1 (ru) * | 2011-02-21 | 2012-08-10 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" | Противовоспалительное средство |
RU2554495C2 (ru) * | 2013-03-11 | 2015-06-27 | Илья Александрович Марков | Цитокинсодержащее лекарственное средство, обладающее противовирусным, противомикробным, иммуномодулирующим и противовоспалительным действием для профилактики и лечения инфекционных заболеваний |
RU2678332C1 (ru) * | 2017-09-08 | 2019-01-28 | Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") | Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения |
Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2112542C1 (ru) * | 1997-02-28 | 1998-06-10 | Аркадий Васильевич Некрасов | Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани |
RU2137835C1 (ru) * | 1998-11-10 | 1999-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Биолекс" | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата |
WO2000044785A1 (en) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Gcsf conjugates |
RU2169565C1 (ru) * | 1999-10-26 | 2001-06-27 | Краснов Владимир Александрович | Фармацевтическая композиция, обладающая пролонгированным противотуберкулезным действием |
WO2004083234A2 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Nobex Corporation | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
WO2005055946A2 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
RU2270861C1 (ru) * | 2004-07-23 | 2006-02-27 | Закрытое акционерное общество "Аксис" | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз |
CN1966528A (zh) | 2005-11-16 | 2007-05-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 以脲烷键连接的peg-w结合物及其制备方法 |
EA008505B1 (ru) * | 2001-11-20 | 2007-06-29 | Фармация Корпорейшн | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2213557C2 (ru) * | 2001-12-26 | 2003-10-10 | Закрытое акционерное общество "Аксис" | Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами |
RU2297246C1 (ru) * | 2005-10-27 | 2007-04-20 | Закрытое акционерное общество "Интеграция" | Способ снижения токсичности амфотерицина в |
-
2008
- 2008-08-18 RU RU2008133940/10A patent/RU2409669C9/ru active
-
2009
- 2009-08-07 WO PCT/RU2009/000396 patent/WO2010021570A1/ru active Application Filing
- 2009-08-07 EP EP09808453.6A patent/EP2327777A4/en not_active Withdrawn
Patent Citations (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2112542C1 (ru) * | 1997-02-28 | 1998-06-10 | Аркадий Васильевич Некрасов | Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани |
RU2137835C1 (ru) * | 1998-11-10 | 1999-09-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Биолекс" | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата |
WO2000044785A1 (en) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Gcsf conjugates |
RU2169565C1 (ru) * | 1999-10-26 | 2001-06-27 | Краснов Владимир Александрович | Фармацевтическая композиция, обладающая пролонгированным противотуберкулезным действием |
EA008505B1 (ru) * | 2001-11-20 | 2007-06-29 | Фармация Корпорейшн | Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека |
WO2004083234A2 (en) * | 2003-03-14 | 2004-09-30 | Nobex Corporation | Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same |
WO2005055946A2 (en) | 2003-12-03 | 2005-06-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
RU2270861C1 (ru) * | 2004-07-23 | 2006-02-27 | Закрытое акционерное общество "Аксис" | Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз |
CN1966528A (zh) | 2005-11-16 | 2007-05-23 | 中国科学院过程工程研究所 | 以脲烷键连接的peg-w结合物及其制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
See also references of EP2327777A4 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2409669C2 (ru) | 2011-01-20 |
RU2008133940A (ru) | 2010-02-27 |
RU2409669C9 (ru) | 2012-05-27 |
EP2327777A1 (en) | 2011-06-01 |
EP2327777A4 (en) | 2014-09-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CA2843504C (en) | Protein carrier-linked prodrugs | |
CA2843503C (en) | Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs | |
RU2139732C1 (ru) | Амплификация системы поглощения витамина b12 при помощи полимеров | |
WO2010021570A1 (ru) | Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом | |
EP2459226B1 (en) | Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins | |
US20020155992A1 (en) | Poly (dipeptide) as a drug carrier | |
JP2002526383A (ja) | 薬物分子と生分解性高分子の共有結合を用いた薬物分子伝達システム | |
US5736519A (en) | Peptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the peptide | |
CA2301799C (en) | Novel conjugates of opioids and endogenous carriers | |
JP2000509394A (ja) | 細胞膜を横切って物質を輸送するためのポリペプチド結合体 | |
CZ320497A3 (cs) | Použití činidel, uvolňujících oxid dusnatý, k léčení impotence | |
CA2395132A1 (en) | Pharmaceutical formulations for the delivery of drugs having low aqueous solubility | |
US20220001021A1 (en) | Method of making oral dosage forms | |
KR101078302B1 (ko) | 약물전달체 | |
US8329435B2 (en) | Methods for improved uptake of biological molecules | |
CN101780281B (zh) | N-精氨酸壳聚糖作为透皮吸收促进剂的应用 | |
RU2751192C2 (ru) | Липосомальные композиции и содержащие их твердые пероральные лекарственные формы | |
US20040121954A1 (en) | Poly(dipeptide) as a drug carrier | |
WO2023066980A1 (de) | 4-aminophenylphosphorylcholin-verbindungen zur blockade von c-reaktivem protein | |
WO2008033058A2 (fr) | Procédé permettant de produire une préparation d'insuline pour administration orale | |
CN111848736A (zh) | 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用 | |
CN112245590A (zh) | 一种基于巯基化甜菜碱修饰的阿霉素衍生物、纳米药物及其制备方法 | |
EA012982B1 (ru) | Стабилизированная фармацевтическая композиция лейкотриен в(ltb) агента | |
JPH09124512A (ja) | 肝臓ターゲティングのための水溶性の薬物−プルラン結合体製剤 | |
ES2360811T3 (es) | Composición para inhibición de proteasoma. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 09808453 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
WWE | Wipo information: entry into national phase |
Ref document number: 2009808453 Country of ref document: EP |