WO2010021570A1 - Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом - Google Patents

Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом Download PDF

Info

Publication number
WO2010021570A1
WO2010021570A1 PCT/RU2009/000396 RU2009000396W WO2010021570A1 WO 2010021570 A1 WO2010021570 A1 WO 2010021570A1 RU 2009000396 W RU2009000396 W RU 2009000396W WO 2010021570 A1 WO2010021570 A1 WO 2010021570A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
biologically active
active substance
polymer
immobilized
solution
Prior art date
Application number
PCT/RU2009/000396
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Андрей Александрович БEKAPEB
Андрей Владимирович Артамонов
Евгений Иванович Верещагин
Original Assignee
Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" filed Critical Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент"
Priority to EP09808453.6A priority Critical patent/EP2327777A4/en
Publication of WO2010021570A1 publication Critical patent/WO2010021570A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates

Definitions

  • the invention relates to medicine, biology, pharmacology.
  • WO0044785 describes a conjugate of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF, gCSF) with a molecular weight polyethylene oxide of 5000-30000 Da obtained by the method of peptide bond synthesis using active esters.
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • gCSF granulocyte colony stimulating factor
  • the conjugates described in CN 1966528 are obtained in a similar manner, but bound carriers are used. between themselves two molecules of polyethylene oxide with a molecular weight
  • the drug is used for injection.
  • the method provides a covalent bond of biologically active substances with the polymer, however, due to the use of rather aggressive chemicals, a high percentage of biologically active substances is destroyed during immobilization.
  • This technique includes a series of sequential chemical reactions, which greatly complicates the synthesis of the final compound and requires additional technological operations for the purification of the drug, because reagents used in the process are toxic to the body. As a result, this leads to a significant increase in the cost of pharmacological substance.
  • patent WO2005055946 describes a gCSF conjugate with polyethylene oxide (polypropylene oxide), the bond between which is via sialic acid. Transferase is used to synthesize such conjugates.
  • This method also provides a covalent bond of the biologically active substance with the polymer, but is also multi-stage, which significantly complicates the synthesis of the final compound and requires additional technological operations for the purification of the drug.
  • a known method of immobilizing amphotericin B on a water-soluble polymer dextran in which dextran is irradiated with a stream of accelerated electrons or ⁇ -radiation at a dose of 1-5 Mrad, achieving its activation (RU2297246). Then a biologically active substance is introduced into the activated polymer.
  • dextran with MM 30-60 kDa and a concentration of 1-10%.
  • the ratio of amphotericin B and dextran in the reaction mixture is 1 to 800.
  • the yield of the therapeutic composition is 99%.
  • a known method of immobilization of protosubtilin on polyethylene oxide in which protosubtilin in a solution of polyethylene oxide with a molecular weight of 1500-4000 Da is subjected to irradiation with bremsstrahlung radiation at a dose of 0.5 -1 Mrad (RU2270861, prototype).
  • Polyethylene oxide is added to the protosubtiline solution to a concentration by weight of 5-10% in the ratio (3-8): 1.
  • the yield of the finished product is 95-98%.
  • the drug can be applied parenterally.
  • the essence of the first variant of the method of immobilization of a biologically active substance (BAS) on a pharmacologically acceptable polymer carrier is that the BAS is dissolved in an aqueous solution of a polymer carrier having a concentration above 10% to a saturated solution, then the reaction mixture is irradiated with ionizing radiation.
  • BAS biologically active substance
  • the reaction mixture can be frozen at a temperature of (-20 °) - (-140 °) C.
  • This method can be immobilized onto a polymeric carrier, in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
  • a polymeric carrier in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • water-soluble polymer carrier in particular, polyethylene oxides, dextrans, polyvinylpyrrolidone, acrylamide, some polymeric surface-active substances (surfactants, for example, Pluronic (Pluropis), etc.) and others.
  • surfactants for example, Pluronic (Pluropis), etc.
  • N ° l The technical result of the proposed method according to the option N ° l is the possibility of immobilization on a polymer carrier of those water-soluble biologically active substances that are unstable, i.e. are destroyed when they are immobilized by other methods, in particular, in the conditions of the prototype method using ionizing radiation at a dose of 0.5-1 Mrad and a polymer concentration of 5-10%, as well as an increase in the fraction of stored biologically active substances in those cases when immobilizing biologically active substances is destroyed not completely.
  • the essence of the second variant of the method for immobilizing a biologically active substance on a pharmacologically acceptable polymer carrier is that the biologically active substance is dissolved in an aqueous solution of a polymer carrier, then the mixture is frozen to a temperature of (-20 °) - (- 140 °) C, after which it is irradiated with ionizing radiation.
  • a water-soluble pharmacologically acceptable polymeric carrier is used at a concentration above 0% to a saturated solution.
  • This method can be immobilized onto a polymeric carrier, in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
  • a polymeric carrier in particular, alkalase, insulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF), other hyaluronidase, Binotropin, Proinus.
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • water-soluble polymer carrier in particular, polyethylene oxides, dextrans, polyvinylpyrrolidone, acrylamide, some polymeric surface-active substances (surfactants, for example, Pluronic Pluripis, etc.) and others.
  • the biologically active substance covalently binds to the polymer.
  • the technical result of the proposed method according to option N ° 2 is the same as indicated above for the method according to option 1: the ability to immobilize on a polymer carrier those water-soluble biologically active substances that are unstable, i.e. are destroyed when they are immobilized by other methods, in particular, in the conditions of the prototype method using ionizing radiation at a dose of 0.5-1 Mrad and a polymer concentration of 5-10%, as well as an increase in the fraction of stored biologically active substances in cases when the biologically active substances break down not completely.
  • the technical result is provided under the conditions of the proposed method by freezing the reaction mixture at a temperature of (-20 °) - (-140 °) C before irradiation.
  • both variants of the proposed method are intended for immobilization of a water-soluble biologically active substance.
  • the pH of the solution is adjusted to the desired value using a pharmacologically acceptable substance, for example, acetic acid.
  • the BAS-carrier conjugate obtained by the above methods is characterized in that the BAS is selected from the group of: proinsulin, tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate, alkalase, hyaluronidase, somatotropin, and the carrier is a pharmacologically acceptable polymer, selected from the group: polyethylene oxide, polyvinylpyrrolidone, dextran, pluronic, acrylamide, moreover, the BAS molecule is covalently linked to at least one polymer molecule, in particular the following:
  • FIG. 1 HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500.
  • FIG. 2 HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500 after irradiation with ionizing radiation at a dose of 0.5 Mrad.
  • Fig.Z HPLC of a solution of insulin in 10% polyethylene oxide-1500 after irradiation with ionizing radiation at a dose of 1.5 Mrad.
  • FIG. 4 HPLC of a solution of insulin in a 20% solution of polyethylene oxide -1500.
  • FIG. 5 HPLC of insulin solution in 20% polyethylene oxide-1500 after irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 6 HPLC of an insulin solution in 75% polyethylene oxide-1500 after irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 7 HPLC of an aqueous solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate.
  • FIG. 8 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in an 11% Plasdone K-17 solution after irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 9 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 50% Plasdone K-17 solution after irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 10 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 50% Plasdone K-17 solution after freezing to -2O 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 11 The content of CFU-GM (A) and CFU-E (B) in the bone marrow (index-1) and in the peripheral blood (index-2) in CBA / Calac mice with physiological saline (white bars), subcutaneous injection immobilized G-CSF (oblique hatching columns), enteral administration of immobilized G-CSF (black columns) and with subcutaneous administration of unconjugated G-CSF (horizontal hatching columns).
  • the indicator values On the abscissa axis, the study time (day), on the ordinate axis, the indicator values: A - 10 5 myelocaryocytes; B - for 10 5 mononuclear cells. Confidence Intervals at p ⁇ 0.05.
  • FIG. 12 The content of CFU-F (A) and MCK (B) in the bone marrow (index-1) and in peripheral blood (index-2) in CBA / Calac mice with physiological saline (white bars), subcutaneous injection of immobilized G -KSF (columns with oblique hatching), enteral administration of immobilized G-CSF (black columns) and with subcutaneous administration of unconjugated G-CSF (columns with horizontal hatching).
  • the abscissa axis shows the duration of the study (24 hours), the ordinate axis shows the values of the indicator: Al — 2.5 ⁇ l O 5 myelocaryocytes; A2 - by 2.5 ⁇ l O 5 mononuclear cells; Bl - on 10 6 myelocaryocytes; B2 - for 10 6 mononuclear cells. Confidence intervals at p ⁇ 0.05.
  • FIG. 13 HPLC results of a hyaluronidase solution in a 25% solution of dextran 70 (dextran with a molecular weight of 70 kDa).
  • FIG. 14 The HPLC results of a hyaluronidase solution in a 25% solution of dextran 70 after irradiation with inhibitory ⁇ -radiation at a dose of 0.5 Mrad.
  • FIG. 15 HPLC results of a proinsulin solution in a 20% solution of Plugopis F-68.
  • FIG. 16 The HPLC results of a solution of proinsulin in a 20% solution of Rugopis F-68 after freezing to -7O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons of 1.0 Mrad.
  • FIG. 17 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of Rugopis F-68.
  • FIG. 18 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of Rugopis F-68 after freezing to -2O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 1.5 Mrad.
  • FIG. 19 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of polyethylene oxide-1500.
  • FIG. 20 The HPLC results of an insulin solution in a 20% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -14O 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 5 Mrad.
  • FIG. 21 HPLC of a solution of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate in a 10% Plasdone K-17 solution after freezing to -70 0 C and irradiation with an accelerated electron beam at a dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 22 Results of HPLC of a solution of growth hormone in 10% dextran.
  • FIG. 23 The results of HPLC of a solution of growth hormone in 10% dextran after freezing to -2O 0 C and irradiation with bremsstrahlung ⁇ -radiation at a dose of 0.5 Mrad.
  • FIG. 24 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500.
  • FIG. 25 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -2O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons in a dose of 1 Mrad.
  • FIG. 26 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -7O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 1.5 Mrad.
  • FIG. 27 The HPLC results of an insulin solution in a 10% solution of polyethylene oxide-1500 after freezing to -14O 0 C and irradiation with a stream of accelerated electrons at a dose of 5 Mrad.
  • the time in minutes is plotted on the abscissa, and the voltage in millivolts is plotted on the ordinate.
  • Time on the X axis is plotted on the same scale, voltage on the Y axis is plotted on a different scale.
  • the numbers at the tops of the peaks mean: the bottom number is the time in minutes corresponding to the top of the peak (output of the maximum amount of substance corresponding to this peak), the top number is the number of the peak.
  • FIG. 1 stock solution
  • FIG. 2 solution after irradiation with a dose of 0.5 Mrad
  • FIG. 3 solution after irradiation with a dose of 1.5 Mrad.
  • Peak 18 in FIG. 1 time 10.77 min.
  • Peak 10 in figure 2 time 11.16 min.
  • FIG. 3 no peak corresponding to insulin.
  • reaction mixtures were sealed in plastic bags and irradiated with an electron accelerator ILU-6 with a radiation dose of 1.5 Mrad to immobilize alkalase on polyethylene oxide-300.
  • the polymer concentration has a significant effect on the preservation of an unstable biologically active substance: at a higher polymer concentration more alkalase is retained.
  • sample N ° l a sample of 10 mg of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 20% solution of polietilenoksida-1500, in sample N ° 2 a sample of 10 mg of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 75% solution of polietilenoksida- 1500.
  • the solutions were transferred into plastic bags, hermetically sealed and irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.0 Mrad.
  • FIG. 5 The HPLC results of the irradiated solutions are shown in FIG. 5 (NbI sample) and FIG. 6 (sample N ° 2).
  • the insulin corresponds to peak 15 in FIG. 5 and peak 12 in FIG. 6.
  • FIG. 7 control
  • FIG. 8 sample N ° 2
  • FIG. 9 sample N ° 3
  • Tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate corresponds to peak 9 in FIG. 7, peak 12 in FIG. 8 and peak 6 in FIG. 9.
  • Sample was prepared: 2 mg of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate was mixed with 1 ml of a 50% solution of plasdon K-17 (Plasdope K-17). The solution was sealed in a sealed plastic bag.
  • the shift of the peak of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate indicates the immobilization of the biologically active substances on the polymer and the formation of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-arginine diacetate-polyvinylpyrrolidone conjugate.
  • freezing solutions before irradiation increases the preservation of biologically active substances immobilized on a polymer.
  • the solution was transferred into a plastic bag and hermetically sealed.
  • the bag was placed in a freezer at -7O 0 C for 12 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with an irradiation dose of 1.0 Mrad.
  • the immobilization of G-CSF on polyethylene oxide-1500 was carried out as follows. 2.5 ml of the substance G-CSF produced by JSC National Biotechnologies)) (0.4 mg / ml in acetate buffer) was mixed with 2.5 ml of 20% polyethylene oxide-1500. The mixture was poured into a plastic bag and frozen at -7O 0 C degrees for 16 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with an irradiation dose of 1.5 Mrad, as a result of which immobilized G-CSF was obtained.
  • Non-immobilized G-CSF was administered subcutaneously at a dose of 100 ⁇ g / kg for 5 days.
  • Immobilized G-CSF (G-CSF conjugate - polyethylene oxide-1500) was also administered at a dose of the active substance of 100 ⁇ g / kg subcutaneously for 5 days, and reg os for 10 days.
  • Control mice in similar modes in an equivalent volume (0.2 ml) were injected with saline.
  • G-CSF as the active substance of the studied drugs, in all cases naturally led to an increase in the content of granulomonocytic precursors in hematopoietic tissue. So, when using unconjugated G-CSF and intragastric administration of immobilized G-CSF, an increase in the number of CFU-GM was observed on the 3rd, 5th, 7th day of the study (Fig. 11, Al).
  • the results of the experiment prove that biological activity is maintained, bioavailability is increased (can be used orally) and the duration of action of G-CSF is increased.
  • G-CSF immobilized by the proposed method has a pronounced biological effect that is superior to non-immobilized G-CSF.
  • phase A 95%
  • proinsulin After the action of ionizing radiation, 96% of proinsulin was preserved.
  • the peak shift on HPLC indicates a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier, which has arisen after the action of ionizing radiation, and the formation of the proinsulin-shguronik F-68 conjugate.
  • a 50 ml sample of human recombinant insulin was dissolved in 5 ml of a 20% solution of pluronic (Pluropis F-68) (concentration close to saturation).
  • a sample was taken for HPLC.
  • the solution was transferred into a plastic bag, hermetically sealed and placed in a freezer at a temperature of -7O 0 C for 16 hours. After that, the packet was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.5 Mrad.
  • a sample was repeatedly taken from the irradiated packet for HPLC.
  • Reverse-phase HPLC was carried out on a Sukam chromatographic system (made in Germany) on a Phepomepech Luna Cl 8 column 5 ⁇ m 100A (manufactured in the USA).
  • phase A 57.6%
  • phase B 42.4%
  • Sample was prepared: 2 mg of tyrosyl-2-alanyl-glycyl-phenylalanyl-leucyl-apginine diacetate was mixed with 1 ml of a 10% solution of plasdon K-17 (Plasdope K-17). The solution was sealed in a sealed plastic bag.
  • freezing solutions before irradiation increased the preservation of biologically active substances immobilized on a polymer.
  • a suspension of 2.5 mg of somatotropin was dissolved in 5 ml of a 10% dextran solution with a molecular weight of 40-60 kDa.
  • a sample was taken for HPLC. Then the solution was transferred into a plastic bag, hermetically sealed and frozen at -2O 0 C for 16 hours. After that, the packet was irradiated with bremsstrahlung radiation at a dose of 0.5 Mrad.
  • a sample was repeatedly taken from the irradiated packet for HPLC.
  • Reverse-phase HPLC was carried out on a Sukam chromatographic system (made in Germany) on a Phepomepech Luna Cl 8 column 5 ⁇ m 100A (manufactured in the USA).
  • the preservation of growth hormone after exposure to ionizing radiation was 93.5%.
  • the peak shift on HPLC indicates a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier after exposure to ionizing radiation and the formation of a somatotropin-dextran conjugate with a molecular weight of 40-60 kDa.
  • N ° l was placed in a freezer at a temperature of -2O 0 C for 16 hours.
  • Samples N ° 2 and N ° 3 were placed in the freezer at a temperature of -7O 0 C for 16 hours.
  • sample N ° 1 was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1 Mrad.
  • Sample No. 2 was irradiated on an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 1.5 Mrad.
  • the packet with the JNs 3 sample was placed in a container with liquid nitrogen until the temperature reached -14O 0 C.
  • the packet was irradiated with an ILU-6 electron accelerator with a radiation dose of 5 Mrad.
  • FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26 and FIG. 27 The results of HPLC are shown in FIG. 24, FIG. 25, FIG. 26 and FIG. 27. Insulin corresponds to peak 19 in FIG. 24, peak 15 in FIG. 25, peak 16 in FIG. 26 and Fig. 27.
  • sample N ° 1 54% of insulin was preserved, in sample N ° 2 - 41%, in sample N ° 3 - 57%.
  • the peak shift on HPLC indicates the emergence of a covalent bond between the biologically active substance and the polymer carrier after the action of ionizing radiation and the formation of the incyline-polyethylene oxide-1500 conjugate.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии и касается способа иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на фармакологически приемлемом полимерном носителе. Способ включает растворение БАВ в водном растворе полимерного носителя, имеющего концентрацию выше 0% до концентрации насыщенного раствора, и облучение реакционной смеси ионизирующим излучением. Для увеличения сохранности БАВ от разрушения ионизирующим излучением перед облучением реакционная смесь может быть заморожена при температуре (-20°)-(-140°)C. При иммобилизации предлагаемым способом БАВ ковалентно связывается с полимером. Преимуществом предлагаемого способа является возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами полностью или почти полностью, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизации БАВ разрушается не полностью. Конъюгат БАВ-носитель характеризуется тем, что БАВ выбран из группы, включающей: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера.

Description

СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА ПОЛИМЕРНЫХ НОСИТЕЛЯХ (ВАРИАНТЫ) И КОНЪЮГАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ДАННЫМ СПОСОБОМ
Изобретение относится к медицине, биологии, фармакологии.
Уровень техники
В настоящее время в арсенале экспериментальной и практической медицины имеются препараты, часто белковой природы, которые имеют доказанную высокую эффективность в отношении многих патологических состояний (далее - биологически активные вещества, Б AB ). Механизм их действия реализуется как на рецепторном аппарате клетки, так и посредством прямого действия на патологические субстраты, такие как тромбы, белковый детрит, остатки клеточных мембран.
При высокой эффективности данные БАВ имеют ряд нежелательных свойств. Белковые препараты могут вызывать аллергическую реакцию. Некоторые БАВ быстро разрушаются в кровяном русле или при хранении. Однако, перспектива их использования настолько привлекательна для врачей-клиницистов, что становится очевидной необходимость модификации молекул данных БАВ таким образом, чтобы обеспечить безопасность препарата, не утратив при этом его фармакологической эффективности.
Для решения этой задачи, как правило, используется иммобилизация БАВ на водорастворимом полимере-носителе (полиэтиленоксиде, полиакриламиде, декстране и т.п.). При этом увеличивается время жизни препарата в кровотоке, следовательно увеличивается длительность его воздействия; снижается иммуногенность препарата; обеспечивается полноценная активность в лекарственной форме при длительном сроке хранения.
Существуют различные способы иммобилизации БАВ на полимере.
Известны способы иммобилизации БАВ на полимере химическим путем. Например, в патенте WO0044785 описан конъюгат гранулоцит- колониестимулирующего фактора (Г-КСФ, gСSF) с полиэтиленоксидом молекулярной массы 5000-30000 Да, полученный способом синтеза пептидной связи с использованием активных эфиров. Подобным способом получены конъюгаты, описанные в патенте CN 1966528, но в качестве носителя используются связанные между собой две молекулы полиэтиленоксида молекулярной массой
5000-30000 Да. Препарат используется для инъекционного введения.
Способ обеспечивает ковалентную связь БАВ с полимером, однако, вследствие использования довольно агрессивных химических веществ, высокий процент БАВ разрушается в процессе иммобилизации. Данная методика включает серию последовательных химических реакций, что значительно усложняет синтез конечного соединения и требует дополнительных технологических операций по очистке препарата, т.к. используемые в технологическом процессе реактивы токсичны для организма. В итоге это приводит к значительному удорожанию фармакологической субстанции.
Известен способ ферментативной иммобилизации БАВ на полимере. Например, в патенте WO2005055946 описан конъюгат gСSF с полиэтиленоксидом (полипропиленоксидом), связь между которыми осуществлена через сиаловую кислоту. Для синтеза таких конъюгатов используется трансфераза.
Данный способ также обеспечивает ковалентную связь БАВ с полимером, но тоже является многостадийным, что существенно усложняет синтез конечного соединения и требует дополнительных технологических операций по очистке препарата.
Кроме указанных выше химического и ферментативного способов, для получения конъюгатов БАВ с полимером используют электронно-лучевые технологии.
Известен способ иммобилизации амфотерицина В на водорастворимом полимере декстране, при котором потоком ускоренных электронов или γ -излучением в дозе 1-5 Мрад облучают декстран, достигая его активации (RU2297246). Затем в активированный полимер вносят БАВ. Используют декстран с MM 30-60 кДа и концентрацией 1-10%. Соотношение амфотерицина В и декстрана в реакционной смеси составляет 1 к 800. Выход терапевтической композиции составляет 99%.
При таком способе иммобилизации нестойкие биологически активные вещества не подвергаются деструкции, однако данным способом не удается добиться ковалентной сшивки БАВ с полимером, следовательно, ослабляются позитивные эффекты иммобилизации.
Известен способ иммобилизации протосубтилина на полиэтиленоксиде, при котором протосубтилин в растворе полиэтиленоксида с молекулярной массой 1500- 4000 Да подвергают облучению тормозным γ-излучением в дозе 0,5 -1 Мрад (RU2270861, прототип). Полиэтиленоксид добавляют к раствору протосубтилина до концентрации по массе 5-10% в соотношении (3-8):1. Выход готового продукта составляет 95-98%. Препарат может быть применен парэнтерально.
Недостатком данного способа является то, что, ряд БАВ (полипептиды, проинсулин, инсулин, соматотропный гормон, интерферон-альфа и др.), как показали наши исследования, при иммобилизации данным способом под действием ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад разрушаются практически полностью. Меньшие дозы облучения не приводят к иммобилизации БАВ и получению конъюгата.
Раскрытие изобретения
Сущность первого варианта способа иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на фармакологически приемлемом полимерном носителе заключается в том, что БАВ растворяют в водном растворе полимерного носителя, имеющего концентрацию выше 10% до насыщенного раствора, затем реакционную смесь облучают ионизирующим излучением.
Для увеличения сохранности БАВ от разрушения ионизирующим излучением перед облучением реакционная смесь может быть заморожена при температуре (-20°)- ( -140°)C.
В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
Данным способом могут быть иммобилизированы на полимерный носитель, в частности, алкалаза, инсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гиалуронидаза, проинсулин, соматотропин, и другие БАВ.
В качестве водорастворимого полимерного носителя могут быть использованы, в частности, полиэтиленоксиды, декстраны, поливинилпирролидон, акриламид, некоторые полимерные поверхностно-активные вещества (ПАВ, например, плюроник (Рlurопiс) и др.) и др.
Далее в тексте приведены примеры осуществления данного способа и получения конъюгатов алкалазы с полиэтиленоксидом, инсулина с полиэтиленоксидом, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата с поливинилпирролидоном, Г-КСФ с полиэтиленоксидом, гиалуронидазы с декстраном, инсулина с плюроником. При иммобилизации предлагаемым способом БАВ ковалентно связывается с полимером.
Техническим результатом предлагаемого способа по варианту N°l является возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами, в частности, в условиях способа-прототипа при использовании ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад и концентрации полимера 5-10%, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизпции БАВ разрушается не полностью.
Технический результат обеспечивается в условиях предлагаемого способа концентрацией полимера выше 10% до насыщенного раствора.
Сущность второго варианта способа иммобилизации БАВ на фармакологически приемлемом полимерном носителе заключается в том, что БАВ растворяют в водном растворе полимерного носителя, затем смесь замораживают до температуры (-20°)-(-140°)C, после чего облучают ионизирующим излучением.
Водорастворимый фармакологически приемлемый полимерный носитель используют в концентрации выше 0% до насыщенного раствора.
В качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
Данным способом могут быть иммобилизированы на полимерный носитель, в частности, алкалаза, инсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), гиалуронидаза, проинсулин, соматотропин, и другие БАВ.
В качестве водорастворимого полимерного носителя могут быть использованы, в частности, полиэтиленоксиды, декстраны, поливинилпирролидон, акриламид, некоторые полимерные поверхностно-активные вещества (ПАВ, например, плюроник Рlurопiс и др.) и др.
Далее в тексте приведены примеры осуществления данного способа и получения конъюгатов тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата с поливинилпирролидоном, инсулина с полиэтиленоксидом, соматотропина с декстраном, Г-КСФ с полиэтиленоксидом, гиалуронидазы с декстраном, инсулина с плюроником.
При иммобилизации данным способом БАВ ковалентно связывается с полимером. Техническим результатом предлагаемого способа по варианту N°2 является тот же, что указан выше для способа по варианту 1 : возможность иммобилизации на полимерном носителе тех водорастворимых БАВ, которые являются нестабильными, т.е. разрушаются при иммобилизации их другими способами, в частности, в условиях способа-прототипа при использовании ионизирующего излучения в дозе 0,5-1 Мрад и концентрации полимера 5-10%, а также увеличение доли сохраненного БАВ в тех случаях, когда при иммобилизации БАВ разрушается не полностью.
Технический результат обеспечивается в условиях предлагаемого способа замораживанием реакционной смеси при температуре (-20°) - (-140°)C перед ее облучением.
Как указывалось выше, оба варианта предлагаемого способа предназначены для иммобилизации водорастворимого БАВ. В тех случаях, когда конкретное БАВ слабо растворяется в нейтральной водной среде, рН раствора доводят до необходимого значения с помощью фармакологически приемлемого вещества, например, уксусной кислоты.
Конъюгат БАВ-носитель, получаемый вышеописанными способами, характеризуется тем, что БАВ выбран из группы: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера, в частности, следующие:
• конъюгат тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат - поливинилпирролидон (Рlаsdопе К- 17) (пример 4, фиг.7,8,9; пример 5, фиг.10,9; пример 12, фиг. 21,8);
• конъюгат алкалаза - пoлиэтилeнoкcид-300 (полиэтиленоксид с молекулярной массой 300 Да) (пример 2, таблица);
• конъюгат гиалуронидаза - декстран 70 (декстран с молекулярной массой 70 кДа) (пример 8, фиг.13,14);
• конъюгат проинсулин - плюроник (Рlurопiс F-68) (пример 9, фиг. 15,16; пример 10, фиг.17, 18); • конъюгат соматотропин - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа (пример 14, фиг.22,23).
Перечень фигур иллюстративного материала:
Фиг. 1. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500.
Фиг. 2. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его ионизирующим излучением в дозе 0,5 Мрад.
Фиг.З. ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его ионизирующим излучением в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 4. ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида -1500.
Фиг. 5. ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения его потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 6. ВЭЖХ раствора инсулина в 75%-м пoлиэтилeнoкcидe-1500 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,0 Мрад.
Фиг. 7. ВЭЖХ водного раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата.
Фиг. 8. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 11%-м растворе Plasdone K- 17 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 9. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 50%-м растворе Plasdone K- 17 после облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 10. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 50%-м растворе Plasdone K- 17 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 ,0 Мрад.
Фиг. 11. Содержание КОЕ-ГМ (А) и КОЕ-Э (Б) в костном мозге (индекс- 1) и в периферической крови (индeкc-2) у мышей линии СВА/Саlас при введении физиологического раствора (белые столбики), подкожного введения иммобилизированного Г-КСФ (столбики с косой штриховкой), энтерального введения иммобилизированного Г-КСФ (чёрные столбики) и при подкожном введении неконъюгированного Г-КСФ (столбики с горизонтальной штриховкой). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: А - на 105 миелокариоцитов; Б - на 105 мононуклеаров. Доверительные интервалы при p<0,05.
Фиг. 12. Содержание КОЕ-Ф (А) и MCK (Б) в костном мозге (индекс- 1) и в периферической крови (индeкc-2) у мышей линии СВА/Саlас при введении физиологического раствора (белые столбики), подкожного введения иммобилизированного Г-КСФ (столбики с косой штриховкой), энтерального введения иммобилизированного Г-КСФ (черные столбики) и при подкожном введении неконъюгированного Г-КСФ (столбики с горизонтальной штриховкой). По оси абсцисс - сроки исследования (сутки), по оси ординат - значения показателя: Al - на 2,5 χl О5 миелокариоцитов; A2 - на 2,5 χl О5 мононуклеаров; Бl - на 106 миелокариоцитов; Б2 - на 106 мононуклеаров. Доверительные интервалы при p<0,05.
Фиг. 13. Результаты ВЭЖХ раствора гиалуронидазы в 25%-м растворе декстрана 70 (декстрана с молекулярной массой 70 кДа).
Фиг. 14. Результаты ВЭЖХ раствора гиалуронидазы в 25%-м растворе декстрана 70 после облучения его тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад.
Фиг. 15. Результаты ВЭЖХ раствора проинсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F- 68.
Фиг. 16. Результаты ВЭЖХ раствора проинсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F- 68 после замораживания до -7O0C и облучения потоком ускоренных электронов 1,0 Мрад.
Фиг. 17. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F-68.
Фиг. 18. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе Рluгопiс F-68 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 19. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида- 1500.
Фиг. 20. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -14O0C и облучения потоком ускоренных электронов дозе 5 Мрад.
Фиг. 21. ВЭЖХ раствора тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетата в 10%-м растворе Plasdone K- 17 после замораживания до -700C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,0 Мрад.
Фиг. 22. Результаты ВЭЖХ раствора соматотропина в 10%-м декстране.
Фиг. 23. Результаты ВЭЖХ раствора соматотропина в 10%-м декстране после замораживания до -2O0C и облучения тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад. Фиг. 24. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500.
Фиг. 25. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -2O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1 Мрад.
Фиг. 26. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -7O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад.
Фиг. 27. Результаты ВЭЖХ раствора инсулина в 10%-м растворе полиэтиленоксида- 1500 после замораживания до -14O0C и облучения потоком ускоренных электронов в дозе 5 Мрад.
На фигурах с ВЭЖХ по оси абсцисс отложено время в минутах, по оси ординат - напряжение в милливольтах. Время по оси X отложено в одном и том же масштабе, напряжение по оси Y отложено в разном масштабе. Числа на вершинах пиков означают: нижнее число - время в минутах, соответствующее вершине пика (выходу максимального количества вещества, соответствующего данному пику), верхнее число - номер пика.
Далее изобретение раскрывается в примерах, которые являются иллюстративными, то есть предназначены для лучшего понимания изобретения и не являются ограничивающими объем притязаний, который отражен в формуле изобретения, приведенной далее.
Пример 1. При иммобилизации способом-прототипом нестабильное БАВ (инсулин) разрушается полностью или почти полностью.
В 5-ти мл 10%-го раствора полиэтиленоксида- 1500 растворялась навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Далее раствор переносился в два полиэтиленовых пакета, герметично запаивался и облучался ионизирующим излучением. Доза облучения для первого пакета была 0,5 Мрад, для второго - 1,5 Мрад. Из облученных пакетов повторно отбирались пробы для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германии) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг.1 (исходный раствор), фиг. 2 (раствор после облучения дозой 0,5 Мрад), и фиг. 3 (раствор после облучения дозой 1,5 Мрад). Пик 18 на фиг. 1 (время 10,77 мин.), пик 10 на фиг.2 (время 11,16 мин.) соответствуют инсулину. На фиг. 3 соответствующий инсулину пик отсутствует.
По соотношению площадей пиков, относящихся к инсулину, было подсчитано, что в растворе после облучения дозой 0,5 Мрад сохранилось 2,3% исходного количества инсулина (фиг.2). При дозе 1,5 Мрад инсулин разрушен полностью (фиг.З).
Таким образом, при иммобилизации его в условиях способа-прототипа нестабильное БАВ (инсулин) разрушается почти полностью.
Пример 2
Готовили две пробы. В пробе .NbI 5 мл концентрированной алкалазы (производство «Novozymes A/S») растворяли в 45-ти мл 50%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-300 (полиэтиленоксид с молекулярной массой, равной 300 Да), в пробе N°2 - 5 мл концентрированной алкалазы растворяли в 45 мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-300. Контролем служил раствор 5 мл концентрированной алкалазы в 45-ти мл воды. Измеряли исходную протеолитическую активность алкалазы в полученных растворах по гидролизу 1%-го раствора казеината натрия.
Реакционные смеси запаивали в полиэтиленовые пакеты и облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад для иммобилизации алкалазы на пoлиэтилeнoкcидe-300.
После облучения растворов повторно измеряли протеолитическую активность алкалазы в пробах. Результаты представлены в таблице (ниже).
Результаты измерения протеолитической активности алкалазы (Ед/мл)
Figure imgf000011_0001
Из данных, представленных в таблице, видно, что активность иммобилизированной алкалазы значительно снизилась в пробе с 20%-ным пoлиэтилeнoкcидoм-300 в отличие от пробы с 50%-ным полиэтиленоксид ом.
Таким образом, концентрация полимера оказывает существенное влияние на сохранение нестабильного БАВ: при более высокой концентрации полимера сохраняется большее количество алкалазы.
Пример 3
Готовили две пробы. В пробе N°l навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина растворялась в 5-ти мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500, в пробе N°2 навеска 10 мг человеческого рекомбинантного инсулина растворялась в 5-ти мл 75%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500.
Из пробы NoI отбиралась проба для проведения ВЭЖХ.
Растворы переносились в полиэтиленовые пакеты, герметично запаивались и облучались на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад.
Из обоих пакетов отбирались пробы для проведения повторной ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германии) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% О, IM раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ необлученного раствора инсулина в 20%-м растворе полиэтиленоксида -1500 представлены на фиг.4. Инсулину соответствует пик 16.
Результаты ВЭЖХ облученных растворов представлены на фиг. 5 (проба NbI) и фиг. 6 (проба N°2). Инсулину соответствует пик 15 на фиг. 5 и пик 12 на фиг. 6.
В 20%-м растворе полиэтиленоксида (проба N°2) после облучения дозой 1,0 Мрад сохранилось 9% от исходного количества инсулина, в 75%-м растворе полиэтиленоксида (проба N°3) - около 25%. Таким образом, повышение концентрации полимера в растворе приводит к большей сохранности иммобилизированных белковых молекул при действии ионизирующего излучения. Смещение пика инсулина указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата инсулин - пoлиэтилeнoкcид-1500.
Пример 4
Готовили три пробы. В пробе N°l 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата растворяли в 1 мл воды (контроль).
В пробе No2 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 11%-го раствора пласдона К- 17 (Рlаsdопе К- 17, поливинипирролидон с MM 17000 Да), в пробе N°3 - 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата смешивали с 1 мл 50%-го раствора Рlаsdопе K-17. Растворы запаивались в герметичные полиэтиленовые пакеты, пробы облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. После этого проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 +10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 +50% ацетонитрил, детекция на 230 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 7 (контроль), фиг. 8 (проба N°2), фиг. 9 (проба N°3). Tиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетату соответствует пик 9 на фиг.7, пик 12 на фиг. 8 и пик 6 на фиг. 9.
В пробе N°2 сохранилось около 10% от исходного количества тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата, в пробе JNЪЗ - около 30%. Повышение концентрации полимера в растворе привело к большей сохранности Б AB. Смещение пика тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат - поливинилпирролидон (плacдoн K-17).
Пример 5
Готовили пробу: 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 50%-го раствора пласдон K-17 (Рlаsdопе K-17). Раствор запаивали в герметичный полиэтиленовый пакет.
Пробу в полиэтиленовом пакете помещали в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов, после чего пробу облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 +10% ацетонитрил, фаза В: 50% O5IM раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 230 нм. Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 10. Tиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетату соответствует пик 9.
По соотношению площадей пиков, относящихся к тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетату, было подсчитано, что в сравнении с аналогичной пробой, которая подвергалась воздействию ионизирующего излучения в жидком виде (пример 4, фиг. 9), количество сохранившегося иммобилизированного тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата в пробе, облученной в замороженном виде, больше почти в 2 раза. Смещение пика тиpoзил-2- аланил-глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и образование конъюгата тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат- поливинилпирролидон (пласдон K- 17).
Итак, замораживание растворов перед облучением увеличивает сохранность иммобилизированного на полимере БАВ.
Пример 6
В 5 мл 20%-го раствора полиэтиленоксида -1500 добавлялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина (ОАО «Haциoнaльныe биотехнологию), г. Оболенск). Поскольку данная марка инсулина растворяется в кислой среде и не растворяется в нейтральной, какой является раствор полиэтиленоксида, то под контролем рН-метра в смесь добавлялась ледяная уксусная кислота до значения рН 2,5-2,8. В результате кислотного титрования инсулин растворяется в пoлиэтилeнoкcидe-1500, и смесь инсулина с полиэтиленоксидом в воде становится прозрачной. Если взять пробу полученного раствора и сдвигать его рН в сторону рН 7,0, инсулин выпадает в осадок.
Раствор переносился в полиэтиленовый пакет и герметично запаивался. Пакет помещался в морозильную камеру при -7O0C на 12 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1 ,0 Мрад.
После облучения иммобилизированный инсулин не выпадал в осадок при ощелачивании раствора до pH=9. Таким образом, подтверждается возникновение ковалентных связей между БАВ и полимерным носителем и образование конъюгата инсулин - пoлиэтилeнoкcид-1500.
Пример 7
Иммобилизация Г-КСФ на пoлиэтилeнoкcидe-1500 осуществлялась следующим образом. 2,5 мл субстанции Г-КСФ производства ОАО «Haциoнaльныe биотехнологии)) (0,4мг/мл в ацетатном буфере) смешивалось с 2,5 мл 20%-го полиэтиленоксида- 1500. Смесь заливалась в полиэтиленовый пакет и замораживалась при -7O0C градусов в течение 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад, в результате чего получали иммобилизированный Г-КСФ.
Эксперименты были выполнены на 250 мышах линии СВА/СаLас в возрасте 2- х месяцев. Неиммобилизированный Г- КСФ вводили подкожно в дозе по 100 мкг/кг в течение 5 дней. Иммобилизированный Г-КСФ (конъюгат Г-КСФ - пoлиэтилeнoкcид-1500) вводили также в дозе активного вещества 100 мкг/кг подкожно в течение 5 дней, и рег оs в течение 10 дней. Контрольным мышам в аналогичных режимах в эквивалентном объеме (0,2 мл) вводили физиологический раствор.
На 2, 3, 4, 5, 7, 10-е сут. эксперимента в костном мозге и периферической крови животных опытных и экспериментальных групп методом клонирования в полувязкой культуральной среде определяли содержание грануломоноцитарных (ГМ), эритроидных (Э) и фибробластных (Ф) колониеобразующих единиц (КОЕ). С помощью метода лимитирующих разведений на 3-й сут. опыта в костном мозге и периферической крови изучали количество мезенхимальных стволовых клеток (MCK).
Введение препаратов выявило их значительное влияние на состояние пула родоначальных клеток. Г-КСФ, как активное вещество исследуемых средств, во всех случаях закономерно приводил к увеличению содержания грануломоноцитарных прекурсоров в гемопоэтической ткани. Так, при использовании неконъюгированного Г-КСФ и при внутрижелудочном применении иммобилизированного Г-КСФ отмечалось возрастание количества КОЕ-ГМ на 3, 5, 7-е сутки исследования (фиг.11, Al). Вместе с тем введение иммобилизированного Г-КСФ подкожно приводило к более длительному (3, 7, 10-е сут.) и максимально выраженному (до 372,1% на 3-й сут. опыта от аналогичного параметра у контрольных мышей) увеличению числа кроветворных клеток в костном мозге (фиг. 11).
Введение иммобилизированного Г-КСФ подкожно приводит на 5-е сутки к достоверному превышению КОЕ-Э в периферической крови по сравнению с неконъюгированным Г-КСФ (фиг. 11, Б2).
Результаты эксперимента доказывают, что сохраняется биологическая активность, увеличивается биодоступность (можно применять перорально) и увеличивается продолжительность действия Г-КСФ.
Схожие изменения имели место со стороны пула фибробластных колониеобразующих единиц, содержащих в своем составе как коммитированные стромальные элементы, так и мультипотентные стволовые клетки. Введение неконъюгированного и иммобилизированного препаратов Г-КСФ (в обоих режимах) приводило к увеличению числа КОЕ-Ф в гемопоэтической ткани на 3, 4, 7-е и 4, 7-е сут. опыта соответственно. При этом прием иммобилизированного с помощью нанотехнологии препарата внутрь оказывал менее выраженный эффект (7-е сут.) по сравнению с парентеральным путем назначения стандартного Г-КСФ. Указанные изменения функциональной активности КОЕ-Ф костного мозга сопровождались усилением их выхода в периферическую кровь. Причем, наиболее существенной данная реакция была в группе животных, получавших иммобилизированного Г-КСФ подкожно, а менее значимая у мышей при внутрижелудочном применении иммобилизированной формы цитокина (фиг. 12).
Введение подкожно конъюгированного Г-КСФ приводило на 5-е сутки к достоверному повышению содержания MCK в костном мозге по сравнению с неконъюгированным Г-КСФ (фиг.12, Б2).
Из представленных фигур видно, что иммобилизированный предложенным способом Г-КСФ обладает выраженным биологическим эффектом, превосходящим неиммобилизированный Г-КСФ.
Пример 8
В 3 мл 25%-го раствора декстрана 70 (декстран с молекулярной массой 70 кДа) растворяли навеску 100 мг гиалуронидазы. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -2O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luпа C18 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 95%, фаза В 5%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОДМ раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 13 и фиг. 14. Гиалуронидазе соответствует пик 10 на фиг. 13, 14.
После действия ионизирующего излучения сохранилось около 85% гиалуронидазы. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата галуронидаза-декстран 70.
Пример 9
В 5 мл 20%-го раствора плюроника (Рlurопiс F-68) растворялась навеска 10 мг рекомбинантного проинсулина (ОАО ((Национальные биотехнологию), г. Оболенск). Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -7O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Градиентный режим: фаза А 58,8%, к 16 минуте - 32,5%, к 18 минуте - 0%, фаза В 41,2%, к 16 минуте 67,5%, к 18 минуте 100%, где фаза А: 90% O,1M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОДМ раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 15 и фиг. 16. Проинсулину соответствует пик 16 на фиг.15 и пик 17 на фиг.16.
После действия ионизирующего излучения сохранилось 96% проинсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем, возникшей после действия ионизирующего излучения, и образовании конъюгата проинсулин-шгюроник F-68.
Пример 10
В 5 мл 20%-го раствора плюроника (Рlurопiс F-68) (концентрация, близкая к насыщению) растворялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и помещался в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад. Из облученного пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 17 и фиг. 18. Инсулину соответствует пик 12 на фиг.17 и пик 10 на фиг. 18.
После действия ионизирующего излучения сохранилось около 50% инсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и получении конъюгата проинсулин-плюроник F-68. Пример 11
В 5 мл 20%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500 растворялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и помещался в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов. Непосредственно перед облучением пакет помещался в ёмкость с жидким азотом до достижения температуры -14O0C. Сразу же после этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 5 Мрад. Из облученного пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0, IM раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 19 и фиг. 20. Инсулину соответствует пик 15 на фиг.19 и пик 14 на фиг. 20.
После действия ионизирующего излучения сохранилось 59% инсулина. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата инсулин-полиэтиленоксид- 1500.
Пример 12
Готовили пробу: 2 мг тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата смешивали с 1 мл 10% раствора пласдона К- 17 (Рlаsdопе К- 17). Раствор запаивали в герметичный полиэтиленовый пакет.
Пробу в полиэтиленовом пакете помещали в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов, после чего пробу облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 55%, фаза В 45%, где фаза А: 90% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% ОД M раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 230 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 21. Tиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетату соответствует пик 8.
В сравнении с пробой, которая подвергалась воздействию ионизирующего излучения в жидком виде (фиг. 8), количество сохранившегося иммобилизированного тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил- лейцил-аргинина диацетата почти в 7 раз больше. Смещение пика тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетата указывает на иммобилизацию БАВ на полимере и получение конъюгата тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат - поливинилпирролидон (пласдон К- 17).
Таким образом, замораживание растворов перед облучением увеличивало сохранность иммобилизированного на полимере БАВ.
Пример 13
В 5 мл 10%-го раствора полиэтиленоксида -1500 добавлялась навеска 50 мг человеческого рекомбинантного инсулина (ОАО ((Национальные биотехнологию), г. Оболенск). Поскольку данная марка инсулина растворяется в кислой среде и не растворяется в нейтральной среде, какой является раствор полиэтиленоксида, то под контролем рН-метра в смесь добавлялась ледяная уксусная кислота до значения рН 2,5-2,8. В результате кислотного титрования инсулин растворяется в пoлиэтилeнoкcидe-1500 и смесь инсулина с полиэтиленоксидом в воде становится прозрачной. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет и герметично запаивался. Пакет помещался в морозильную камеру при -7O0C на 12 часов. После этого пакет облучался на ускорителе электронов ИJIУ-6 дозой облучения 1,0 Мрад.
После облучения иммобилизированный инсулин не выпадал в осадок при ощелачивании раствора до pH=9. Таким образом, подтверждается возникновение ковалентных связей между БАВ и полимерным носителем и образование конъюгата инсулин-полиэтил еноксид- 1500.
Пример 14
В 5 мл 10%-го раствора декстрана с молекулярной массой 40-60 кДа растворялась навеска 2,5 мг соматотропина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор переносился в полиэтиленовый пакет, герметично запаивался и замораживался при -2O0C в течение 16 часов. После этого пакет облучался тормозным γ-излучением в дозе 0,5 Мрад. Из облучённого пакета повторно отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Градиентный режим: фаза А 10%, к 40 минуте - 0%, фаза В 90%, к 40 минуте 100%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0,1M раствор Na2SO4 pH=2,3 + 50% ацетонитрил, детекция на 220 нм. Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 22 и 23. Соматотропину соответствует пик 4 на фиг. 22 и пик 3 на фиг. 23.
Сохранность соматотропина после действия ионизирующего излучения составила 93,5%. Сдвиг пика на ВЭЖХ свидетельствует о ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата соматотропин - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа.
Пример 15
В 10 мл 10%-го раствора пoлиэтилeнoкcидa-1500 растворялась навеска 100 мг человеческого рекомбинантного инсулина. Отбиралась проба для проведения ВЭЖХ. Далее раствор разделялся на 3 пробы, пробы переносили в полиэтиленовые пакеты и герметично запаивали.
Проба N°l помещалась в морозильную камеру при температуре -2O0C на 16 часов. Пробы N° 2 и N° 3 помещалась в морозильную камеру при температуре -7O0C на 16 часов.
После замораживания пробу N° 1 облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1 Мрад. Пробу N° 2 облучали на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 1,5 Мрад. Непосредственно перед облучением пакет с пробой JNs 3 помещали в ёмкость с жидким азотом до достижения температуры -14O0C. Сразу же после этого пакет облучался на ускорителе электронов ИЛУ-6 дозой облучения 5 Мрад.
Из облученных пакетов повторно отбирались пробы для проведения ВЭЖХ. Проводилась обращенно-фазовая ВЭЖХ на хроматографической системе Sуkаm (производства Германия) на колонке Рhепоmепех Luna Cl 8 5мкм 100A (производство США). Изократический режим: фаза А 57,6%, фаза В 42,4%, где фаза А: 90% 0,1 M раствор Na2SO4 pH=2,3+10% ацетонитрил, фаза В: 50% 0ДM раствор Na2SO4 pH=2,3+50% ацетонитрил, детекция на 214 нм.
Результаты ВЭЖХ представлены на фиг. 24, фиг. 25, фиг. 26 и фиг. 27. Инсулину соответствует пик 19 на фиг. 24, пик 15 на фиг. 25, пик 16 на фиг. 26 и фиг.27.
В пробе N° 1 сохранилось 54% инсулина, в пробе N°2 - 41%, в пробе N°3 - 57%. Сдвиг пиков на ВЭЖХ свидетельствует о возникновении ковалентной связи между БАВ и полимерным носителем после действия ионизирующего излучения и образовании конъюгата инcyлин-пoлиэтилeнoкcид-1500.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ иммобилизации биологически активного вещества (БАВ) на водорастворимом фармакологически приемлемом полимерном носителе, включающий растворение БАВ в растворе указанного носителя, облучение реакционной смеси ионизирующим излучением, отличающийся тем, что полимерный носитель используют в концентрации выше 10% до насыщенного раствора.
2. Способ по п.l, в котором, перед облучением реакционную смесь замораживают до температуры (-20°)-( -140° )C.
3. Способ по п.l или 2, в котором в качестве БАВ используют вещество, выбранное из группы, включающей: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронизаза, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-aprининa диацетат, алкалаза, соматотропин.
4. Способ по п.l, в котором в качестве полимерного носителя используют полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, плюроник, декстран, поливинилпирролидон, акриламид.
5. Способ по п.l, в котором в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
6. Способ по п.l, котором иммобилизируют алкалазу на полиэтиленоксиде.
7. Способ по п.l или 2, в котором иммобилизируют инсулин на полиэтиленоксиде.
8. Способ по п.l или 2, в котором иммобилизируют тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат на поливинилпирролидоне.
9. Способ по п.2, в котором иммобилизируют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор на полиэтиленоксиде.
10. Способ по п.2, в котором иммобилизируют гиалуронидазу на декстране.
11. Способ по п.2, в котором иммобилизируют проинсулин на плюронике.
12. Способ по п.2, в котором иммобилизируют инсулин на плюронике.
13. Способ иммобилизации БАВ на водорастворимом фармакологически приемлемом полимерном носителе, включающий растворение БАВ в растворе указанного носителя, облучение реакционной смеси ионизирующим излучением, отличающийся тем, что перед облучением смесь замораживают до температуры (- 20°)-(-140°)C.
14. Способ по п.13, в котором водорастворимый фармакологически приемлемый полимерный носитель используют в концентрации выше 0% до насыщенного раствора.
15. Способ по п. 13, в котором в качестве БАВ используют вещество, выбранное из группы, включающей: инсулин, проинсулин, Г-КСФ, гиалуронизаза, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил-apгининa диацетат, алкалаза, соматотропин.
16. Способ по п.13, в котором в качестве полимерного носителя используют полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтил еноксид, плюроник, декстран, поливинилпирролидон, акриламид.
17. Способ по п.13, в котором в качестве ионизирующего излучения используют поток ускоренных электронов или тормозное γ-излучение в дозе 0,5-5 Мрад.
18. Способ по п.13, в котором иммобилизируют тиpoзил-2-aлaнил-глицил- фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат на поливинилпирролидоне.
19. Способ по п. 13, в котором иммобилизируют инсулин на полиэтиленоксиде.
20. Способ по п.13, в котором иммобилизируют соматотропин на декстране.
21. Способ по п. п. 13, в котором иммобилизируют проинсулин на акриламиде.
22. Способ по п.13, в котором иммобилизируют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор на полиэтиленоксиде.
23. Способ по п.13, в котором иммобилизируют гиалуронидазу на декстране.
24. Способ по п.13, в котором иммобилизируют инсулин на плюронике.
25. Конъюгат БАВ-носитель, характеризущийся тем, что БАВ выбран из группы, включающей: проинсулин, тиpoзил-2-aлaнил-глицил-фeнилaлaнил-лeйцил- аргинина диацетат, алкалаза, гиалуронидаза, соматотропин, а носитель представляет собой фармакологически приемлемый водорастворимый полимер, выбранный из группы, включающей: полиэтиленоксид, поливинилпирролидон, декстран, плюроник, акриламид, причем, молекула БАВ соединена ковалентно, по меньшей мере, с одной молекулой полимера.
26. Конъюгат по п.25, в котором БАВ представляет собой тиpoзил-2-aлaнил- глицил-фенилаланил-лейцил-аргинина диацетат, а полимер - поливинилпирролидон (п л ас дон К- 17).
27. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой алкалазу, а полимер - полиэтил еноксид с молекулярной массой 300 Да.
28. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой гиалуронидазу, а полимер - декстран с молекулярной массой 70 кДа.
29. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой проинсулин, а полимер - плюроник (Рluгопiс F-68).
30. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой соматотропин, а полимер - декстран с молекулярной массой 40-60 кДа.
31. Конъюгат по п. 25, в котором БАВ представляет собой проинсулин, а полимер - акриламид 4K.
PCT/RU2009/000396 2008-08-18 2009-08-07 Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом WO2010021570A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09808453.6A EP2327777A4 (en) 2008-08-18 2009-08-07 METHOD FOR IMMOBILIZING A BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCE ON POLYMERIC (AND VARIANT) AND CONJUGATED MEDIA OBTAINED THEREFROM

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2008133940 2008-08-18
RU2008133940/10A RU2409669C9 (ru) 2008-08-18 2008-08-18 Способ иммобилизации биологически активного вещества (бав) на носитель (варианты) и конъюгат бав-носитель, полученный данными способами

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010021570A1 true WO2010021570A1 (ru) 2010-02-25

Family

ID=41707331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2009/000396 WO2010021570A1 (ru) 2008-08-18 2009-08-07 Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP2327777A4 (ru)
RU (1) RU2409669C9 (ru)
WO (1) WO2010021570A1 (ru)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2452509C1 (ru) * 2011-01-31 2012-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" Средство для стимуляции роста организма
RU2452510C1 (ru) * 2011-02-08 2012-06-10 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" ООО "Саентифик Фьючер Менеджмент" Анальгетическое средство
RU2461389C1 (ru) * 2011-02-14 2012-09-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" Средство, увеличивающее продолжительность жизни
RU2458126C1 (ru) * 2011-02-21 2012-08-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" Противовоспалительное средство
RU2554495C2 (ru) * 2013-03-11 2015-06-27 Илья Александрович Марков Цитокинсодержащее лекарственное средство, обладающее противовирусным, противомикробным, иммуномодулирующим и противовоспалительным действием для профилактики и лечения инфекционных заболеваний
RU2678332C1 (ru) * 2017-09-08 2019-01-28 Общество с ограниченной ответственностью "Саентифик Фьючер Менеджмент" (ООО "СФМ") Пегилированный интерферон лямбда, обладающий высокой биодоступностью при пероральном применении, и способ его получения

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2137835C1 (ru) * 1998-11-10 1999-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "Биолекс" Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата
WO2000044785A1 (en) 1999-01-29 2000-08-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Gcsf conjugates
RU2169565C1 (ru) * 1999-10-26 2001-06-27 Краснов Владимир Александрович Фармацевтическая композиция, обладающая пролонгированным противотуберкулезным действием
WO2004083234A2 (en) * 2003-03-14 2004-09-30 Nobex Corporation Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
RU2270861C1 (ru) * 2004-07-23 2006-02-27 Закрытое акционерное общество "Аксис" Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз
CN1966528A (zh) 2005-11-16 2007-05-23 中国科学院过程工程研究所 以脲烷键连接的peg－w结合物及其制备方法
EA008505B1 (ru) * 2001-11-20 2007-06-29 Фармация Корпорейшн Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2213557C2 (ru) * 2001-12-26 2003-10-10 Закрытое акционерное общество "Аксис" Фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическими, противовоспалительными и цитопротективными свойствами
RU2297246C1 (ru) * 2005-10-27 2007-04-20 Закрытое акционерное общество "Интеграция" Способ снижения токсичности амфотерицина в

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2112542C1 (ru) * 1997-02-28 1998-06-10 Аркадий Васильевич Некрасов Препарат для лечения патологических состояний соединительной ткани
RU2137835C1 (ru) * 1998-11-10 1999-09-20 Общество с ограниченной ответственностью "Биолекс" Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата
WO2000044785A1 (en) 1999-01-29 2000-08-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Gcsf conjugates
RU2169565C1 (ru) * 1999-10-26 2001-06-27 Краснов Владимир Александрович Фармацевтическая композиция, обладающая пролонгированным противотуберкулезным действием
EA008505B1 (ru) * 2001-11-20 2007-06-29 Фармация Корпорейшн Конъюгаты химически модифицированного гормона роста человека
WO2004083234A2 (en) * 2003-03-14 2004-09-30 Nobex Corporation Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
WO2005055946A2 (en) 2003-12-03 2005-06-23 Neose Technologies, Inc. Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor
RU2270861C1 (ru) * 2004-07-23 2006-02-27 Закрытое акционерное общество "Аксис" Способ получения водорастворимого иммобилизованного ферментного препарата протеаз
CN1966528A (zh) 2005-11-16 2007-05-23 中国科学院过程工程研究所 以脲烷键连接的peg－w结合物及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2327777A4

Also Published As

Publication number Publication date
RU2008133940A (ru) 2010-02-27
RU2409669C2 (ru) 2011-01-20
EP2327777A1 (en) 2011-06-01
EP2327777A4 (en) 2014-09-10
RU2409669C9 (ru) 2012-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2843504C (en) Protein carrier-linked prodrugs
CA2843503C (en) Polymeric hyperbranched carrier-linked prodrugs
US6589548B1 (en) Controlled drug delivery system using the conjugation of drug to biodegradable polyester
RU2139732C1 (ru) Амплификация системы поглощения витамина b12 при помощи полимеров
WO2010021570A1 (ru) Способ иммобилизации биологически активных веществ на полимерных носителях (варианты) и конъюгаты, полученные данным способом
EP2459226B1 (en) Glycopolysialylation of proteins other than blood coagulation proteins
US20020155992A1 (en) Poly (dipeptide) as a drug carrier
CA2301799C (en) Novel conjugates of opioids and endogenous carriers
JP2000509394A (ja) 細胞膜を横切って物質を輸送するためのポリペプチド結合体
CZ320497A3 (cs) Použití činidel, uvolňujících oxid dusnatý, k léčení impotence
EP1246608A1 (en) Pharmaceutical formulations for the delivery of drugs having low aqueous solubility
KR101078302B1 (ko) 약물전달체
US8329435B2 (en) Methods for improved uptake of biological molecules
CN101780281B (zh) N-精氨酸壳聚糖作为透皮吸收促进剂的应用
US20220001021A1 (en) Method of making oral dosage forms
RU2751192C2 (ru) Липосомальные композиции и содержащие их твердые пероральные лекарственные формы
US20040121954A1 (en) Poly(dipeptide) as a drug carrier
WO2023066980A1 (de) 4-aminophenylphosphorylcholin-verbindungen zur blockade von c-reaktivem protein
WO2008033058A2 (fr) Procédé permettant de produire une préparation d&#39;insuline pour administration orale
CN111848736A (zh) 自组装多肽、制备方法、自组装多肽制剂及应用
EA012982B1 (ru) Стабилизированная фармацевтическая композиция лейкотриен в(ltb) агента
JPH09124512A (ja) 肝臓ターゲティングのための水溶性の薬物−プルラン結合体製剤
CN104971357A (zh) Peg修饰的棘白菌素类抗真菌药物复合物及其制备
ES2360811T3 (es) Composición para inhibición de proteasoma.
CN116687836A (zh) 一种金纳米颗粒/顺铂双交联聚氨基酸水凝胶及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09808453

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009808453

Country of ref document: EP