RS50117B

RS50117B - Konjugati eritropoetina sa polietilenglikolom

Info

Publication number: RS50117B
Application number: YUP-899/01A
Authority: RS
Inventors: Josef Burg; Bernd Hilger; Hans-Peter Josel
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag.,
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2009-03-25
Also published as: AR024879A1; PL201754B1; DK1196443T3; DE60011087T2; BRPI0012138B1; EP1196443B1; PT1196443E; HRP20010966A2; HRP20010966B1; CZ301833B6; HK1047597B; NO20016304D0; KR100510624B1; TWI266637B; PL356065A1; WO2001002017A2; CA2378533A1; HU228478B1; AU6429900A; JP4190184B2

Abstract

Konjugat, naznačen time, što obuhvata glikoprotein eritropoetina koji ima najmanje jednu slobodnu amino grupu i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji poseduju primarnu strukturu humanog eritropoetina, modifikovanu dodavanjem od 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanima najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je navedeni glikoprotein kovalentno vezan za jednu do tri C1-C6- alkoksi poli(etilen glikol) grupe, pri čemu je svaka poli(etilen glikol) grupa kovalentno vezana za glikoprotein preko linkera formule -C(O)-X-S-Y, i pri čemu C(O) linkera formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa, X je -(CH2)k- ili -CH2(O-CH2-CH2)k-, k ima vrednost od 1 do 10, Y je prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je od 20 kilodaltona do 40 kilodaltona, a molekulska težina konjugata je od 51 kilodaltona do 175 kilodaltona. Prijava sadrži još 4 nezavisna i 30 zavisnih patentnih zahteva

Description

Osnove pronalaska

Eritropoeza predstavlja proces nastanka crvenih krvnih zrnaca sa ciljem da se kompenzuje destrukcija ovih ćelija. Eritropoeza je kontrolisani fiziološki mehanizam koji obezbeđuje dovoljan broj crvenih krvnih zrnaca za odgovarajuću oksigenaciju tkiva. Prirodno postojeći eritropoetin (hEPO) je glikoprotein, koji sadrži 165 amino kiselina i koji nastaje u bubrezima, a deluje kao humoralni faktor koji stimuliše produkciju crvenih krvnih zrnaca (Carnot, P. i Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953) Blood 8: 349; Reissmann, KR (1950) Blood 5:372; Jacobson, LO, Goldvvasser, E, Freid, W. i Plzak, LF (1957) Nature 179:6331-4). Humani EPO stimuliše deobu i diferencijaciju rodonačelnih eritroidnih ćelija u koštanoj srži. Humani EPO ispoljava svoju biološku aktivnost vezujući se za receptore na rodonačelnim eritroidnim ćelijama (Krantz, BS (1991) Blood 77:419). Prirodno postojeći humani eritropoetin je kiseli glikoprotein prisutan u niskim koncentracijama u plazmi, kako bi se stimulisala zamena crvenih krvnih zrnaca koja se gube tokom starenja.

Eritropoetin je proizveden biosintetički, primenom tehnologije rekombinantne DNK (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224), kao proizvod kloniranog humanog EPO gena, ugrađenog i eksprimiranog u ćelijama ovarijalnog tkiva kineskog hrčka (CHO ćelije). Prirodni eritropoetin se prvo translira u polipeptidni lanac sa 166 amino kiselina, sa argininom na poziciji 166. U toku posttranslacione modifikacije, delovanjem enzima karboksipeptidaze, iseca se arginin 166. Primarna struktura humanog EPO (165 amino kiselina) ilustrovana je na Slici 1. Primarna struktura humanog EPO (166 aa) ilustrovana je na Slici 2. Postoje dva disulfidna mosta između Cys<7->Cys16<1>i C<y>s<29->Cys<33>. Molekulska težina polipeptidnog lanca humanog EPO, bez polisaharidnog dela, iznosi 18,236 Da. U netaknutom EPO molekulu, oko 40% molekulske težine otpada na ugljenohidratne komponente (Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A. i Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262:12059).

S obzirom da je eritropoetin neophodan za formiranje crvenih krvnih zrnaca, ovaj hormon se može primeniti u terapiji poremećaja koji se odlikuju smanjenom ili defektnom produkcijom crvenih krvnih ćelija. U kliničkoj praksi, EPO se koristi u terapiji, na primer, anemija, kod bolesnika sa hroničnom renalnom insuficijencijom (CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Dovvning, MR et al

(1987) NEJM 316:73-78; Eschbach, Abdulhadi, MH, Browne, JK, et al (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egri, JC, Eschbach, JW, McGuire, T, Adamson, JW(1988) Kidney Intl. 33:262; Um, VS, Degovvin, RL, Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intern Med. 110:108-114), zatim kod bolesnika od AIDS-a i obolelih od kancera koji idu na hemoterapiju (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, Rl, U: MB, Garnick, ed.Erytropoietin in Clinical Applications- An International Perspective.New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p.301-324). Pa ipak, biološka dostupnost trenutno postojećih proteinskih terapeutika, kao što je EPO, ograničena je njihovim kratkim polu-životom u plazmi, kao i njihovom velikom podložnošću degradaciji enzimima proteazama. Ova ograničenja sprečavaju postizanje maksimalne kliničke efikasnosti.

Sažetak predmetnog pronalaska

Predmetni pronalazak odnosi se na novu klasu PEG derivata eritropoetina. Fiziološki aktivni PEG-EPO konjugati sastoje se od glikoproteina eritropoetina, koji sadrži najmanje jednu slobodnu amino grupu, a posedujein vivobiološku aktivnost koja utiče na to da ćelije koštane srži povećaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih zrnaca, pri čemu je glikoprotein izabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji poseduju primarnu strukturu humanog eritropoetina, modifikovanu dodavanjem 1 do 6 mesta glikolizacije; pomenuti glikoprotein je kovalentno vezan za jednu do tri niže-alkoksi poli(etilen glikol) grupe, pri čemu je svaka poli(etilen glikol) grupa je kovalentno vezana za glikoprotein preko linkera formule -C(0)-X-S-Y-, gde C(O) iz linkera formira amidnu vezu sa jednom od amino grupa, X je -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)i<-, a k ima vrednost 1 do 10, Y je prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona, a molekulska težina konjugata iznosi od oko 51 kilodalton do oko 175 kilodaltona. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje smeše koje sadrže opisane konjugate, pri čemu je procentualna zastupljenost konjugata u smeši u kome n ima vrednost 1, najmanje 90 procenata.

U poređenju sa nemodifikovanim EPO (to jest, EPO bez vezanog PEG) i konvencionalnim PEG-EPO konjugatima, konjugat iz predemetnog pronalaska odlikuje se produženim polu-životom u cirkulaciji i zadržavanjem u plazmi, smanjenim klirensom i povećanom kliničkom aktivnošćuin vivo.Konjugati iz predmetnog pronalaska imaju istu primenu kao i EPO. Konkretno, konjugati iz ovog pronalaska mogu se primeniti u terapiji, stimulisanjem deobe i diferencijacije rodonačelnih eritroidnih ćelija koštane srži, na isti način kao što se primenjuje

EPO.

Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupak terapije anemija kod čoveka. Predmetni pronalazak takođe obuhvata postupak dobijanja proizvoda glikoproteina eritropoetina, koji se sastoje od kovalentne reakcije s-amino grupe amino kiseline lizin na molekulu eritropoetina, sa bi-funkcionalnim reagensom, u cilju nastanka intermedijera sa amidnom vezom. Bifunkcionalni reagens sadrži reaktivnu grupu protektovanu tiol grupu. Amid-vezani intermedijer zatim kovalentno reaguje sa aktiviranim polietilen glikolom derivatima, čime nastaju proizvodi glikoproteina eritropoetina ovog pronalaska.

Opis crteža

Slika 1: Primarna struktura humanog EPO (165 amino kiselina).

Slika 2: Primarna struktura humanog EPO (166 amino kiselina).

Slika 3:In vivoaktivnost EPO-PEG derivata, određena primenom normocitemičnog testa na mišu.

Detaljan opis pronalaska

Definicije

Naredni uzrazi imaće sledeća definisana značenja:

Izrazi "protein eritropoetina", "eritropoetin", "EPO" ili "glikoprotein eritropoetin" odnose se na glikoprotein, koji ima sekvencu predstavljenu na Slici 1 (SEQ ID NO:1) ili 2 (SEQ ID NO:2), ili na protein ili polipeptid koji je suštinski homolog, čija se biološka svojstva odnose na stimulaciju proizvodnje crvenih krvnih zrnaca i na stimulaciju deobe i diferencijacije predodređenih eritroidnih ćelija u koštanoj srži. Izraz EPO protein, ovde je primenjen u značenju koje obuhvata proteine koji su namemo modifikovani, na primer, usmerenom tačkastom mutagenezom ili slučajno modifikovani mutacijama. Ovi izrazi takođe, obuhvataju analoge koji poseduju 1 do 6 dodatnih mesta glikolizacije, zatim analoge koji poseduju najmanje jednu dodatnu amino grupu na karboksi-terminalnom kraju proteina, pri čemu dodatna(e) amino kiselina(e) obuhvataju najmanje jedno mesto glikolizacije, kao i analoge koji poseduju redosled amino kiselina koji obuhvata rearanžman najmanje jednog mesta glikolizacije, kao stoje na primer analog opisan u Evropskoj patentnoj publikaciji Br. 640 619 (European Patent Publication No. 640 619). Ovi izrazi obuhvataju kako prirodni, tako i rekombinovano proizveden humani eritropoetin.

Izraz "suštinski homolog" označava da se izvesna sekvenca, na primer, mutirana sekvenca, razlikuje od referentne sekvence usled jedne ili više supstitucija, delecija ili adicija, ali da ukupan efekat ne rezultuje brojnim funkcionalnim razlikama između referentne sekvence i sekvence o kojoj je reč. Za svrhe predmetnog pronalaska, sekvence koje pokazuju više od 95 procenata homologije, ekvivalentna biološka svojstva i ekvivalentne ekspresione karakteristike, smatraju se međusobno suštinski homologim sekvencama. Za svrhe određivanja homologije ne treba uzimati u obzir sekvence nastale skraćivanjem definitivne sekvence. Sekvence koje pokazuju manji stepen homologije, sličnu bioaktivnost i ekvivalentne ekspresione karakteristike, smatraju se suštinskim ekvivalentima.

Termin "fragment" EPO proteina, označava bilo koji polipeptid koji poseduje amino kiselinsku sekvencu dela ili fragmenta EPO proteina, a koji takođe ispoljava biološku aktivnost EPO. Fragmenti obuhvataju proteine ili polipeptide nastale proteolitičkom degradacijom EPO proteina ili hemijskom sintezom primenom rutinskih postupaka. Neki EPO protein ili njegov fragment smatra se biološki aktivnim, kada primena proteina ili fragmenta uslovljava stimulaciju proizvodnje crvenih krvnih zrnaca i stimulaciju deobe i diferencijacije predodređenih eritroidnih progenitora u koštanoj srži čoveka. Određivanje biološke aktivnosti EPO proteina može se izvršiti primenom konvencionalnih, poznatih testova, koji se koriste za ove svrhe, na jednoj ili više vrsta sisara. Odgovarajući test koji se može koristiti kako bi se pokazala biološka aktivnost biće kasnije opisan.

Izraz "terapeutski efektivna količina" je ona količina produkta glikoproteina eritropoetina koja je neophodna zain vivobiološku aktivnost, koja utiče na ćelije koštane srži da povećaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih zrnaca. Tačna količina proizvoda glikoproteina eritropoetina zavisiće kod svakog subjekta od faktora, kao što su težina bolest koja se tretira, stanje pacijenta koji se tretira, kao i od ostalih sastojaka smeše. Farmaceutske kompozicije koje sadrže proizvod glikoprotein eritropoetina mogu se formulisati u jačini koja je efikasna za različite vrste primene kod pacijenata sa krvnim poremećajima koji se karakterišu slabom ili defektnom produkcijom crvenih krvnih zrnaca. Prosečne terapeutski efektivne količine proizvoda glikoproteina eritropoetina mogu varirati, a u svakom konkretnom slučaju zavisiće od preporuke koje da kvalifikovani lekar.

Predmetni pronalazak je usmeren na produkte glikoproteina eritropoetina koji posedujein vivobiološku aktivnost koja utiče na ćelije koštane srži da povećaju produkciju retikulocita i crvenih krvnih zrnaca, pri čemu se produkt glikoproteina eritropoetina može predstaviti formulom 1:

naznačen time što X i Y imaju isto značenje kao što je prethodno defnisano, m ima vrednost od 450 do 900, n je od 1 do 3, R je niži alkil, a P predstavlja eritropoetin glikoprotein, umanjen za amino grupu ili amino grupe koje formiraju amidnu vezu sa X. Pod EPO se podrazumeva prirodni ili rekombinantni protein,

poželjno humani, koji je dobijen iz nekog konvencionalnog izvora, kao što su tkiva, proteinska sinteza, ćelijska kultura sa prirodnim ili rekombinantnim ćelijama. Obuhvaćen je svaki protein koji poseduje aktivnost EPO, bilo da je to mutirani protein ili drugačije modifikovani protein. Rekombinantni EPO može se dobiti ekspresijom u CHO-, BHK- ili HeLa ćelijskim linijama, primenom tehnologije rekombinantne DNK ili aktivacijom endogenog gena, tj. kada se glikoprotein eritropoetin eksprimira endogenom genskom aktivacijom. Poželjne EPO vrste za dobijanje proizvoda glikoproteina eritropoetina su humane EPO vrste. Još je poželjnija da je EPO vrsta humani EPO, sa amino kiselinskom sekvencom predstavljenom na Slici 1 (SEQ ID NO:1) ili na Slici 2 (SEQ ID NO:2), a najpoželjniji je humani EPO sa amino kiselinskom sekvencom predstavljenom na Slici 1 (SEQ ID NO:1).

Humani protein eritopoetin može takođe biti modifikovan na još najmanje jednom mestu glikolizacije, na primer, najednom do 6 dodatnih mesta glikolizacije, kao što su, ali ne samo one, kasnije date amino kiselinske sekvence. Oznake na sekvencama odnose se na to da su na određenim, superskriptom naznačenim pozicijama, amino kiselinske sekvence predstavljene na Slici 1, modifikovane supstitucijom prirodne amino kiseline, amino kiselinom označenom sa leve strane broja u superskriptu.

Humani protein eritropoetina može biti i neki analog sa najmanje jednom dodatnom amino kiselinom na karboksi terminusu glikoproteina, naznačen time što dodatna amino kiselina obuhvata najmanje jedno mesto glikolizacije, tj. glikoprotein ima sekvencu koja se sastoji od sekvence humanog eritropoetina i druge sekvence na karboksi terminusu humanog eritropoetina, naznačenu time što druga sekvenca sadrži najmanje jedno mesto glikolizacije.

Dodatna amino kiselina može biti deo peptidnog fragmenta nastalog od karboksi terminusa humanog horionskog gonadotropina. Poželjno je da je glikoprotein analog izabran iz grupe koja se sastoji od (a) humanog eritropoetina koji poseduje amino kiselinsku sekvencu, Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), koja se pruža od karboksi terminusa; (b) analog (a) koji se dodatno sadrži Ser87 Asn88 Thr<90>EPO; i (c) analog (a) koji dalje sadrži Asn^hr^VaPAsn^Thr90EPO.

Humani protein eritropoetin može takođe biti analog sa amino kiselinskom sekvencom koja obuhvata rearanžmane najmanje jednog mesta glikolizacije. Rearanžman može sadržati deleciju nekog od N-vezanih karbohidratnih mesta u humanom eritropoetinu, kao i adiciju N-vezanih karbohidratnih mesta na poziciji 88 amino kiselinske sekvence humanog eritropoetina. Poželjno, glikoprotein je analog izabran iz grupe koja se sastoji od Gln<24>Ser<87>Asn<88>Thr<90>EPO; Gln<38>Ser87 Asn38Thr9<0>EPO; i Gln<83>Ser87 Asn88Thr<90>EPO.

Analozi eritropoetina sa dodatnim mestima glikolizacije opisani su u Evropskoj patentnoj publikaciji Br. 640 619, od Elliota, objavljenoj 1. marta 1995, čiji je sadržaj ovde priključen u vidu referenci.

U Formuli 1, R može biti neki niži alkil, pod kojim se podrazumeva linearna ili razgranata alkil grupa, koja sadrži jedan do šest atoma ugljenika, kao što su metil, etil, izopropil, i td. Poželjni alkil je metil grupa.

U Formuli 1, X je -(CH2)irili -CH2(0-CH2-CH2)k-, naznačeno time što k ima vrednost a do oko 10. Poželjno, k ima vrednost od 1 do oko 4, još poželjnije, k je 1 ili 2. Najpogodnije je da X predstavlja -(CH2).

U Formuli 1, Yje

Poželjno, Yje Najpoželjnije Y je

U Formuli 1, broj m je izabran tako da rezultujući konjugat Formule 1 ima fiziološku aktivnost sličnu nemodifikovanom EPO, pri čemu aktivnost može biti jednaka, veća ili deo aktivnosti odgovarajućeg nemodifikovanog EPO. m predstavlja broj etilen oksidnih ostataka u jednoj PEG. Pojedinačna PEG subjedinica -(OCH2CH2)- ima molekulsku težinu od 44 daltona. Stoga molekulska težina konjugata (bez molekulske težine EPO) zavisi od broja m. Molekulska težina od "oko" nekog broja označava da je ta vrednost u okviru nekog razumnog opsega tog broja, određenog konvencionalnim analitičkim postupcima, m je ceo broj u opsegu od oko 450 do oko 900 (što odgovara molekulskoj težini od oko 20 do 40 kDa), poželjno je m od oko 550 do oko 800 (od 24 do 35 kDa), a najpoželjnije je da je m od oko 650 do oko 700 (od 29 do 31 kDa).

U Formuli 1, broj n predstavlja broj e-amino grupa amino kiseline lizin u proteinu eritropoetinu, koje su kovalentno vezane za PEG jedinice preko amidne veze. Konjugat iz ovog pronalaska može imati jednu, dve ili tri PEG jedinice po molekulu EPO. n je ceo broj u opsegu od 1 do 3, poželjno n je 1 ili 2, a najpoželjnije je da je n jednako 1.

Poželjni prozivodi proteina eritropoetina predstavljeni su sledećim formulama:

pri čemu P, R, X, m i n imaju prethodno definisano značenje. Najpoželjnija produkti proteina eritropoetina su predstavljeni formulom

pri čemu P, R, X, m i n imaju prethodno definisana značenja.

Ostali poželjni produkti glikoproteina eritropoetina predstavljeni su formulama:

gde P i n imaju prethodno definisano značenje.

Poželjniji produkti glikoproteina eritropoetina predstavljeni su formulom:

gde P i n imaju prethodno definisano značenje.

Poželjna jedinjenja su ona naznačena time što X predstavlja -(CH2)k->i naročito ona u kojima k ima vrednost od 1 do 4, poželjno ona u kojima X ima značenje -CH2-.

Pronalazak se takođe odnosi na pomenute konjugate, naznačene time što je m ceo broj u opsegu 550 do 800, a poželjno ceo broj od 650 do 700.

Poželjna jedinjenja predmetnog pronalaska su ona u kojima n ima vrednost 1 i/ili R predstavlja metil grupu.

Pronalazak se takođe odnosi na pomenuta jedinjenja u kojima je prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka iznosi od 24 kilodaltona do oko 35 kilodaltona, a poželjnije oko 35 kilodaltona.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na jedinjenja, naznačena time što je glikoprotein kovalentno vezan za jedan ili dva niži-alkoksi vezana poli(etilen glikol) ostatka, a poželjnije za jedan niži-alkoksi vezan poli(etilen glikol) ostatak.

U poželjnom bliku izvođenja, poli(etilen glikol) ostaci su pokriveni metoksi grupom.

U najpoželjnijem obliku izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja u kojima X predstavlja -CH2-, m je ceo broj od 650 do 700, n je 1, R je metil grupa, a prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je oko 30 kilodaltona.

U još jednom obliku izvođenja, pronalazak je usmeren na postupak terapije anemije kod čoveka, koji se sastoji od primene terapeutski efektivne količine produkta glikoproteina eritropoetina predstavljenog Formulom 1.

U narednom obliku izvođenja, postupak je usmeren na postupak dobijanja produkta glikoproteina eritropoetina, koji posedujein vivobiološku aktivnost koja stimuliše ćelije koštane srži da povećaju proizvodnju retikulocita i crvenih krvnih ćelija, koji se sastoji iz sledećih faza: (a) kovalentne reakcije s-amino grupe amino kiseline lizin na proteinu eritropoetina, predstavljenog formulom P-[NH]2, sa bifunkcionalnim reagensom predstavljenim formulom Z-CO-X-S-Q, čime nastaje intermedijer sa amidnom vezom, predstavljen formulom:

P-[NH-CO-X-S-Q]n

pri čemu P predstavlja protein eritropoetin bez amino grupe koja formira amidnu vezu; n je ceo broj od 1 do 3; Z je reaktivna grupa, na pr. karboksil-NHS estar; X je -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)ic, pri čemu k ima vrednost od 1 do 10; i Q predstavlja protektivnu grupu, kao što je alkanoil, na pr. acetil.

(b) kovalentne reakcije intermedijera sa amidnom vezom iz faze (a) sa nekim aktiviranim derivatom polietilen glikola, predstavljenim formulom W-[OCH2CH2]m-OR, čime nastaje produkt glikoproteina eritropoetina, predstavljen formulom: gde VV predstavlja sulfhidril reaktivnu formu Y; m je ceo broj od 450 do oko 900; R je niži alkil; Y je

U ovom obliku izvođenja, poželjno je da je bifunkcionalni reagens N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat ili N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat, Zje poželjno N-hidroksi-sukcinimid, a aktivirani derivat polietilen glikola W-[OCH2CH2]nrOR je poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od jod-acetil-emtoksi-PEG, metoksi-PEG-vinilsulfon i metoksi-PEG-maleimid.

Sledeći oblik izvođenja predmetnog pronalaska odnosi se na smešu koja sadrži konjugate, pri čemu svaki konjugat sadrži glikoprotein eritropoetin sa najmanje jednom slobodnom amino grupom i sa biološkom aktivnošćuin vivo,koja stimuliše ćelije koštane srži na povećanu produkciju retikulocita i crvenih krvnih ćelija, a koji je izabran iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji poseduju primarnu strukturu humanog eritropoetina, modifikovanu adicijom 1 do 6 mesta glikolizacije ili rearanžmanom najmanje jednog mesta glikolizacije; taj glikoprotein kovalentno je vezan za jednu do tri niži-alkoksi-poli(etilen gliko) grupe, a svaka poli(etilen glikol) grupa je kovalentno vezana za glikoprotein preko linkera formule -C(0)-X-S-Y, pri čemu C(O) linker formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa,

X je -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)k-,

k ima vrendost od 1 do 10,

Yje

prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je od oko 20 kilodaltona do oko 40 kilodaltona, a molekulska težina konjugata je od oko 51 kilodalton do oko 175 kilodaltona; procentualni sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1 je najmanje devedeset procenata. Poželjno je da smeša sadrži prethodno definisane konjugate u kojima je procentualni sadržaj konjugata, u

kojima je n jednako 1, najmanje devedest procenata, još poželjnije da je sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1, najmanje devedesetdva procenta, naročito je poželjno da je sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1 najmanje devedesetšest procenata, a najpoželjnije je da je sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1 od devedeset do devedesetšest procenata.

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku smešu koja se sastoji od konjugata ili smeše, kao što je prethodno opisano i farmaceutski prihvatljivog nosača, kao i na primenu konjugata ili smeše, kao što je prethodno opisano za dobijanje medikamenata za terapiju ili profilaksu oboljenja povezanih sa anemijom, kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom (CRF), AIDS-om i za terapiju obolelih od kancera tokom hemoterapije. Uz ovo, pronalazak se odnosi na postupak profilaktičkog i/ili terapeutskog tretmana poremećaja koji uključuju anemiju kod pacijenata sa hroničnom bubrežnom insuficijencijom (CRF), AIDS-om i obolelil od kancera koji primaju hemoterapiju, a koji se postupak sastoji od administracije pacijentima prethodno opisanih smeša.

Pronalazak se takođe odnosi na postupak dobijanja konjugata ili smeše, kao što je prethodno opisano, pri čemu se postupak sastoji od kovalentnog vezivanja tiol grupa za glikoprotein eritropoetin i vezivanja tako aktiviranog glikoproteina eritropoetina za poli(etilen glikol) (PEG) derivate. Dalje se pronalazak odnosi na prethodno opisane konjugate i smeše, kad god su dobijeni ovde opisanim postupkom i na na prethodno opisane konjugate i smeše, za terapiju oboljenja povezanih sa anemijom u pacijenata sa hroničnom renalnom insuficijencijom (CRF), AIDS-om i tumorom koji podležu hemoterapiji.

Postupci ekspresije EPO proteina

Eritropoetin (EPO) je humani glikoprotein koji stimuliše formiranje eritrocita. Njegovo dobijanje i terapeutska primena detaljno su opisani u U.S. Patent Nos. 5,547,933 i 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, SL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

(1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 i EP-B 0 411 678, kao i kod Lai, P.H. etal. J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121 i Sasaki, H. et a!. J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. za terapeutske svrhe, eritropoetin se može dobiti primenom rekombinantnih sredstava (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 i Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. etal. (1986) Immunobiol. 72:213-224). Ekspresija proteina, uključujući i EPO, aktivacijom endogenog gena je takođe poznat postupak, opisan na primer u U.S. Patent Nos. 5,733,761, 5,641,670 i 5,733,746, kao i u međunarodnim patentnim publikacijama No. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 i WO 91/09955, čiji su sadržaji uključeni referencama.

Postupci ekspresije i dobijanja eritropoetina u medijumu bez seruma opisani su na primer u WO 96/35718 od Burga, objavljenom 14. novembra 1996, kao i u European Patent Publication No. 513 738, od Kocha, objavljenoj 12. juna 1992.

Postupci prečišćavanja humanog EPO proteina

Uz prethodno navedene reference, poznato je da je moguće sprovesti fermentaciju rekombinantnih CHO ćelija koje sadrže EPO gen u medijumu bez

seruma. Ovi postupci opisani su na primer u EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 i, u opštem obliku, kod Kavvamoto, T. et al., Analvtical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. i Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology271 (1981)45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967.

U EP-A 0 267 678 kao postupci za prečišćavanje EPO, proizvedenog u kulutri bez seruma, nakon dijalize, opisane su jon-izmenjivačka hromatografija na S-Sefarozi, preparativna reverzno fazna HPLC na C8koloni i hromatografija gel filtracijom. Sa ovim u vezi, faza gel filtracione hromatografije može se zameniti brzo-protočnom jon-izmenjivačkom hromatografijom na S-Sefarozi. Takođe je predloženo da se pre jon-izmenjivačke hromatografije, obavi hromatografija na koloni od plavog trisakrila (Blue Trisacrvl).

Postupak prečišćavanja rekombinantnog EPO opisan je kod Nobuoa , I. i sar., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. U ovom postupku EPO je tretiran rastvorom Tvveen<®>20, fenilmetilsulfonil fluorida, etilmaleimida, pepstatina A, bakar sulfata i oksamične kiseline, pre faze prečišćavanja.

Brojne reference, kao što je WO 96/35718 od Burga, publikovana 14. novembra 1996, opisuju postupke dobijanja eritropoetina u fermentacionom procesu bez seruma (EPOsf). Jedan postupak za proizvodnju EPO kao polaznog materijala za pegilaciju, ilustrovan je u narednom tekstu.

Biološki test za određivanje specifične aktivnosti EPO i EPO- konjugata

Specifična aktivnost EPO i EPO-konjugata u skladu sa ovim pronalaskom, može se odrediti primenom različitih testova poznatih u praksi. Biološka aktivnost prečišćenih EPO proteina iz ovog pronalaska je takva da injekcija EPO proteina kod pacijenata rezultuje većom produkcijom retikulocita i crvenih krvnih ćelija u koštanoj srži u poređenju sa netretiranim ili kontrolnim grupama subjekata. Biološka aktivnost EPO proteina ili njihovih fragmenata, dobijenih i prečišćenih u skladu sa ovim pronalaskom, može se testirati postupcima koji su saglasni sa Pharm. Europa Spec. Issue Ervthropoietin BRP Bio 1997(2).

Drugi biološki test za određivanje aktivnosti EPO proteina, normocitemični test kod miševa, opisan je u Primeru 4.

Postupci dobijanja pegilovanih EPO

Postupci dobijanja produkta glikoproteina eritropoetina, predstavljenih Formulom 1, sastoje se od kovalentnog vezivanja tiol grupa za EPO ("aktivacija") i vezivanja tako aktiviranog EPO sa poli(etilen glikol) (PEG) derivatom. Prva faza dobijanja pegilovanih EPO u skladu sa predmetnim pronalaskom sastoji se od kovalentnog vezivanja tiol grupa preko NH2-grupa EPO. Ova aktivacija EPO odvija se uz pomoć bifunkcionalnog reagensa koji nosi protektovanu tiol grupu i dodatnu reaktivnu grupu, kao što su aktivni estri (na pr. sukcinimidilestri), anhidridi, estri sulfonskih kiselina, halogenidi karboksilnih kiselina, odnosno sulfonskih kiselina. Tiol grupa je protektovana grupama poznatim u praksi, na primer, acetil grupom. Ovi bifunkcionalni reagensi su sposobni da reaguju sa\-amino grupama amino kiseline lizin, formirajući amidnu vezu. Prva faza reakcije može se predstaviti na sledeći način:

gde EPO, n i X imaju značenje kao što je ranije opisano, a Z je reaktivna grupa poznata u praksi, na primer, neki N-hidroksi-sukcinimid (NHS) supstituent formule: U poželjnom obliku izvođenja aktivacija q-amino grupa lizina se odvija reakcijom sa bifunkcionalnim reagensom koji sadrži sukcinimidil ostatak. Bifunkcionalni reagens može nositi različite spejserske vrste, na primer, -(CH2)i<- ili -CH2-(0-CH2-CH2)k- ostatke, pri čemu k ima vrednost 1 do oko 10, poželjno od 1 do 4, poželjnije 1 ili 2, a najjpoželjnije 1. Primeri ovih reagenasa su N-sukcinimidil-S-acetiltiopropionat (SATP) i N-sukcinimidil-S-acetiltioacetat (SATA) Acetiltioalkjl-karbiksilni-NHS-estar, kao što je

2-(Acetiltio)-(etoksi)|<-NHS estar sircetne kiseline

sa vrednošću k, kao što je ranije opisano.

Dobijanje bifunkcionalnih reagenasa je poznato u praksi. Prekursori 2-(acetiltio)-(etoksi)«-sirćetna-kise!ina-NHS-estara opisani su u DE-3924705, dok je derivizacija u acetiltio-jedinjenje opisana kod March, J. Advanced Organic Chemistrv, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA je komercijalno dostupno jedinjenje (Molecular Probes, Eugene, OR, USA i Pierce, Rockford, IL).

Broj tiol grupa koje će biti dodate na EPO molekul može se odrediti podešavanjem reakcionih parametara, tj. koncentracije proteina (EPO) i odnosa protein/bifunkcionalni reagens. Poželjno je da se EPO aktivira kovalentnim vezivanjem 1 do 5 tiol grupa po jednom molekulu EPO, još poželjnije 1.5 do 3 tiol grupe po jednom molekulu EPO. Ovi opsezi odnose se na statističku distribuciju tiol grupa u populaciji EPO proteina.

Reakcija se odvija, na primer, u vodenom rastvoru pufera, pH 6.5-8.0, na primer u 10 mM kalijum fosfatu, 50 mM NaCI, pH 7.3. Bifunkcionalni reagens može se dodati u DMSO. Nakon završetka reakcije, poželjno nakon 30 minuta, reakcija se zaustavlja dodavanjem lizina. Suvišak bifunkcionalnog reagensa može se izdvojiti poznatim postupcima, na primer dijalizom ili filtracijom na koloni. Prosečan broj tiol grupa dodatih na EPO može se odrediti fotometrijskom metodom, opisanom na primer kod Grasetti, D.R. i Murrav, J.F., J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967).

Prethodna reakcija je praćena kovalentnim vezivanjem aktiviranog derivata polietilen glikola (PEG). Pogodni PEG derivati su aktivirani PEG molekuli sa prosečnom molekulskom težinom od oko 20 do oko 40 kDa, još je poželjnija molekulska težina od 24 do 35 kDa, a najpoželjnija je molekulska težina od 30 kDa.

Aktivirani PEG derivati su poznati u praksi, a opisani su u na primer Morpurgo, M et al. J. Bioconj. Chem. (1996) 7, 363, za PEG-vinilsulfon. Za dobijanje jedinjenja formule 1, pogodni su linearni ili razgranati lanci PEG vrsta. Primeri reaktivnih PEG reagenasa su jodo-acetil-metoksi-PEG i metoksi-PEG-vinilsulfon:

Primena ovih jodo-aktiviranih supstanci poznata je u praksi, na primer kod Hemanson, G.T u Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) str. 147-148.

Najpoželjnije je da se PEG vrste aktiviraju maleimidom, primenom (alkoksi-PEG-maleimida), kao što je metoksi-PEG-maleimid (MW 30000; Shearvvater Polvmers, Inc.). Struktura alkoksi-PEG-maleimida je sledeća:

pri čemu R i m imaju isto značenje kao što je prethodno definisano.

Najpoželjniji su derivati

gde R i m imaju isto značenje kao što je prethodno definisano.

Reakcija kuplovanja sa alkoksi-PEG-maleimidom odvija se nakonin situisecanja tiol protektivne grupe u vodenom rastvoru pufera, na pr. 10 mM kalijum fosfat, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6.2. Isecanje protektivne grupe može se izvesti, na primer, primenom hidroksilamina u DMSO na 25°C, pH 6.2, tokom 90 minuta. Za modifikaciju PEG, molarni odnos aktiviranog EPO/alkoksi-PEG-maleimida trebalo bi da bude od oko 1:3 do oko 1:6, poželjno oko 1:4. Reakcija se može zaustaviti dodavanjem cisteina i rekacijom preostalih tiol (-SH) grupa sa N-metilmaleimidom ili drugim odgovarajućim jedinjenjima, sposobnim da formiraju disulfidne veze. Zbog reakcije preostalih aktiviranih tiol grupa sa protektivnom grupom, kao što je N-metilmaleimid ili sa nekom drugom pogodnom grupom, EPO glikoproteini u konjugatima iz ovog pronalaska mogu sadržati ove protektivne grupe. Načelno, postupak koji je ovde opisan proizvešće smešu molekula koji sadrže različiti broj tiol grupa, protektovanih različitim brojem protektivnih grupa, što će zavisiti od broja aktiviranih tiol grupa na glikoproteinu koje nisu konjugovane sa PEG-maleimidom.

S obzirom da N-metilmaleimid formira isti tip kovalentne veze kad god se primeni za blokiranje preostalih tiol grupa na pegilovanom proteinu, kod disulfidnih jedinjenja doći će do reakcija izmene intermolekularnih sulfid/disulfid veza u disulfidne mostove kuplovane sa blokirajućim agensom. Poželjni blokirajući agensi za ovaj tip blokirajućih reakcija su oksidovani glutation (GSSG), cistein i cistamin. lako se primenom cisteina na pegilovani protein ne unosi dodatno neto naelektrisanje, primena blokirajućih agenasa, kao što su GSSG i cistamin, rezultira dodatnim negativnim ili pozitivnim naelektrisanjem.

Dalje prečišćavanje jedinjenja Formule I, uključujući razdvajanje mono-, di-i tri-pegilovanih EPO-vrsta, može se sprovesti postupcima koji su poznati u praksi, na pr. hromatografijom na koloni.

Farmaceutske smeše

Produkti glikoproteina eritropoetina dobijeni saglasno ovom pronalasku, mogu se pripremiti u vidu farmaceutskih smeša pogodnih za injektovanje sa farmaceutski pogodnim ekscipijentom ili nosačem, primenom poznatih postupaka. Odgovarajuće smeše opisane su, na primer u WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660 i WO 99/07401. Među poželjnim farmaceutski pogodnim nosačima za formulisanje produkta iz ovog pronalaska su humani serum albumin, proteini humane plazme i td. Jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu se formulisati u 10 mM natrijum/kalijum fosfatnom puferu na pH 7.4, uz prisustvo toničnog agensa, na primer, 132 mM natrijum hlorida. Opciono, farmaceutske smeše mogu sadržati prezervative. Farmaceutske smeše mogu sadržati različite količine eritropoetina, na pr. 10-1000 ug/ml, na primer 50 i±g ili 400 |ug.

Tretiranje krvnih poremećaja koji se karakterišu smanjenom ili defektnom

produkcijom crvenih krvnih ćelija

Primena produkuta glikoproteina eritropoetina iz predmetnog pronalaska rezultira produkcijom crvenih krvnih ćelija kod čoveka. Stoga, primena produkata glikoproteina eritropoetina dopunjava količinu EPO proteina koji su važni za produkciju crvenih krvnih ćelija. Farmaceutske smeše koje sadrže produkte glikoproteina eritropoetina mogu se formulisati u jačini koja će biti efikasna za primenu na različite načine, osobama koji boluju od različitih krvnih poremećaja okarakterisanih smanjenom ili defektnom produkcijom crvenih krvnih ćelija, bilo pojedinačno, bilo kao deo stanja ili bolesti. Farmaceutske smeše mogu se primeniti injekcijom, kao što su potkožna ili intravenska injekcija. Prosečne količine produkta glikoproteina eritropoetina mogu varirati, a konkretno će zavisiti od preporuke i recepta kvalifikovanog lekara. Tačna količina konjugata zavisiće od faktora, kao što su težina stanje koje se tretira, stanja pacijenta koji se tretira, kao i od ostalih sastojaka u smeši. Na primer, od 0.01 do 10 ug po kilogramu telesne težine, poželjno 0.1 do 1 u.g po kilogramu telesne težine može se primeniti na primer, jednom nedeljno.

U okviru ove prijave navedene su različite reference. Tekst ovih referenci inkorporiran je u ovoj prijavi, u cilju potpunijeg opisa trenutnih znanja u ovoj oblasti.

Predmetni pronalazak dalje je ilustrovan primerima koji su prezentovani u cilju boljeg predstavljanja postupaka dobijanja jedinjenja i smeša iz ovog pronalaska a ne njihovog ograničavanja.

PRIMER!

PRIMER 1: Fermentacija i prečišćavanje humanog EPO

a) Priprema inokuluma i fermentacija

Iz gasovite faze rezervoara sa tečnim azotom, uzeta je jedna vajla VVorking

Cell Banke, koja potiče od CHO ćeiijske linije koja proizvodi EPO (može se koristiti ATCC CRL8695, opisana u EP 411 678 (Genetic Institute)). Ćelije su transferirane u staklene flaskove za centrifugu i kultivisane u vodonik karbonatom puferisanom medijumu u C02inkubatoru sa odgovarajućim stepenom vlažnosti. Tipični medijum bez seruma, korišćen za dobijanje inokuluma i fermentaciju, opisan na primer, u Evropskoj patentnoj publikaciji 513 738, od Kocha, publikovanoj 12. juna 1992. ili u WO 96/35718, od Burga, publikovanoj 14. novembra 1996, na primer, tipično kao medijum sadrži DMEM/F12 (na pr. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, br. 57-736) i još natrijum vodonikkarbonat, L+glutamin, D+glukoza, rekombinantni insulin, natrijum selenit, diaminobutan, hidrokortizon, gvožđe(ll) sulfat, asparagin, aspartatna kiselina, serin i stabilizatore za sisarske ćelije, kao što su polivinil alkohol, metil celuloza, polidekstran, polietilen glikol, Pluronic F68, plazma ekspander poligelin (HEMACCEL<®>) ili polivinil pirolidin (WO 96/35718).

Kulture su mikroskopski proverene na prisustvo kontaminirajućih mikroorganizama, a određena je i gustina ćelija. Ovi testovi urađeni su nakon svake faze razdvajanja.

Nakon perioda inicijalnog rasta, ćelijska kultura je razblažena do početne ćeiijske gustine dodavanjem svežeg medijuma, a zatim puštena da uđe u sledeći ciklus rasta. Ovaj postupak je ponavljan sve dok nije dobijena zapremina ćeiijske kulture od oko 2 I po staklenom flasku. Nakon otprilike 12 dupliranja, dobijeno je 1 do 5 litara ove kulture, koja je zatim korišćena kao inokulum za fermentator

inokuluma od 10 I.

Nakon 3-5 dana, kultura iz 10 I fermentatora može se koristiti kao inokulum za fermentator od 100 I.

Nakon sledećih 3-5 dana kultivacije, kultura iz 100 I fermentatora može se koristiti kao inokulum za 1000 I produkcioni fermentator.

b) Prikupljanje i razdvajanje ćelija

Primenjen je postupak dopune bačeva, tj. kada se postigne odgovarajuća ćelijska gustina, prikuplja se oko 80% ćeiijske kulture. Ostatak kulture se obogaćuje svežim medijumom, a zatim se kultiviše sve do sledećeg prikupljanja ćelija. Jedan produkcioni ciklus sastoji se od najviše 10 uzastopnih prikupljanja: 9 delimičnih prikupljanja i 1 totalno prikupljanje na kraju fermentacije. Prikupljanje se dešava svaka 3-4 dana.

Određena prikupljena zapremina transferira se u hladne sudove. Ćelije se uklanjaju centrifugranjem ili filtriranjem, a zatim se odbacuju. Nakon faze centrifugiranja, supernatant koji sadrži EPO se odmah filtrira i prikuplja u drugom ohlađenom sudu. Svako prikupljanje se sprovodi odvojeno tokom prečišćavanja.

Tipični postupak za prečišćavanje EPO proteina opisan je u WO 96/35718, od Burga, objavljen 14. novembra 1996. Postupak prečišćavanja je opisan u narednim primerima.

a) Hromatografija na plavoj sefarozi

Plava sefaroza (Pharmacia) sastoji se od zrnaca Sefaroze, za čiju je površinu

kovalentno vezana boja cibakron plava. S obzirom da se EPO jače vezuje za plavu sefarozu od većine ne-proteinskih kontaminanata, u ovoj fazi koncentruju se proteinske nečistoće, PVA i EPO. Elucija kolone od plave sefaroze vrši se rastvorima rastuće koncentracije soli, kao i rastućih pH vrednosti.

Kolona se puni sa 80 - 100 I plave sefaroze, regeneriše se natrijum hidroksidom i ekvilibrira ekvilibracionim puferom (natrijum/kalcijum hiorid i natrijum acetat). Na kolonu se nanosi acidifikovan i profiltriran supernatant iz fermentatora. Nakon završetka dodavanja, kolona je najpre isprana puferom koji je sličan ekvilibracionom puferu, samo sa većim sadržajem natrijum hlorida, a nakon toga Tris puferom. Proizvod je eluiran Tris puferom i prikupljen u vidu pojedinačne frakcije, saglasno glavnom elucionom profilu.

b) Hromatografija na koloni od butil Tovopearl 650

Butil Tovopearl 650 c (TosoHaas) je matriks od polistirena za koji su

kovalentno vezani alifatični butil-ostaci. S obzirom da se EPO snažnije vezuje za ovaj gel, od većine ostalih nečistoća i PVA, potrebno ga je eluirati puferom koji sadrži izopropanol.

Kolona se pakuje sa 30-40 I Butil Tovopearl 650 C, regeneriše se natrijum hidroksidom, ispira se Tris puferom i ekvilibrira se Tris puferom koji sadrži izopropanol.

Koncentracija eluata sa plave sefaroze se usaglašava sa koncentracijom izopropanola u ekvilibracionom puferu, a zatim se eluat sa plave sefaroze nanosi na kolonu. Ova se kolona zatim ispira ekvilibracionim puferom sa većom koncentracijom izopropanola. Proizvod se eluira elucionim puferom (Tris-pufer sa visokom koncentracijom izopropanola), i prikuplja se kao jedna frakcija, saglasno glavnom elucionom profilu.

c) Hromatografija na Hidroksiapatit ultrogelu

Hidroksiapatit Ultrogel (Biosepra) se sastoji od hidroksiapatita koji je

inkorporiran u agarozni matriks, kako bi mu se poboljšala mehanička svojstva. EPO pokazuje nizak afinitet za hidroksiapatit, pa se eluira ispiranjem ratsvorima nižih koncentracija fosfatnog pufera, nego proteinske nečistoće.

Kolona se puni sa 30-40 I Hidroksiapatit Ultrogela i regeneriše se kalijum fosfat/kalcijum hlorid puferom i NaOH, nakon čega sledi Tris-pufer. Zatim se kolona ekvilibrira Tris-puferom koji sadrži manju količinu izopropanola i natrijum hlorida.

Eluat sa Butil Tovopearl hromatografije koji sadrži EPO, nanešen je na kolonu. Zatim je kolona isprana ekvilibracionim puferom i Tris-puferom bez izopropanola i natrijum hlorida. Proizvod je eluiran Tris-puferom koji sadrži nižu koncentraciju kalijum fosfata, a prikupljen je kao jedna frakcija, saglasno glavnom elucionom profilu.

d) Reverzno fazna HPL hromatografija na Vydac C4

RP-HPLC materijal Vydac C4 (Vydac) sastoji se od partikula silika gela, na

čijoj su površini C4-alkil lanci. Razdvajanje EPO od proteinskih nečistoća zasnovano je na razlikama u jačini hidrofobnih interakcija. Elucija se sprovodi sa gradijentom rastvora acetonitrila u razblaženoj trifluorosirćetnoj kiselini.

Preparativna HPLC odvija se primenom nerđajućih čeličnih kolona (ispunjenih sa2.8do 3.2 I Vydac C4 silikagela). Eluat sa Hidroksiapatit ultrogela se zakišeljava dodavanjem trifluorosirćetne kiseline, a zatim se nanosi na Vydac C4 kolonu. Za ispiranje i eluiranje koristi se gradijent acetonitrila u razblaženoj trifluorosirćetnoj kiselini. Frakcije se prikupljaju i odmah zatim neutrališu fosfatnim puferom. Frakcije koje sadrže EPO su u okviru 1PC limita i one se spajaju.

e) Hromatografija na DEAE sefarozi

DEAE sefaroza (Pharmacia) se sastoji od dietilaminoetil (DEAE)-grupa,

koje su kovalentno vezane za površinu sefaroznih zrnaca. Vezivanje EPO za DEAE grupe posredovano je jonskim interakcijama. Acetonitril i trifluorosirćetna kiselina prolaze kroz kolonu bez zadržavanja. Nakon ispiranja ovih supstanci, tragovi nečistoća uklanjaju se ispiranjem kolone acetatnim puferom na niskom pH. Zatim se kolona ispira neutralnim fosfatnim puferom, a EPO se eluira puferom sa većom jonskom jačinom.

Kolona se pakuje sa DEAE sefarozom brzog protoka. Zapremina kolone se podešava tako da se obezbedi nanošenje EPO u opsegu od 3-10 mg EPO/ml gela. Kolona se ispira vodom i ekvilibracionim puferom (natrijum/kalijum fosfat). Spojene frakcije sa HPLC eluata se nanose na kolonu, a kolona se zatim ispira ekvilibracionim puferom. Zatim se kolona ispira puferom za ispiranje (natrijum acetatni pufer), nakon čega sledi ispiranje ekvilibracionim puferom. Nakon toga, EPO se eluira sa kolone elucionim puferom (natrijum hlorid, natrijum/kalijum fosfat) i prikuplja se kao jedna frakcija, saglasno glavnom elucionom profilu.

Eluat sa kolone od DEAE sefaroze se podešava do specifične provodljivosti. Nastala supstanca se sterilno filtrira u tefionske boce i čuva se na - 70°C.

PRIMER 2: Kovalentno vezivanje tiol grupa za EPO

Ovaj primer opisuje određivanje reakcionih uslova za kovalentno vezivanje tiol grupa za EPO. Za određivanje uslova, različite količine reagensa koji sadrži blokiranu tiol grupu, u ovom slučaju SATA-a ili SATP (rastvoreni u DMSO u koncentraciji od 10 mg/ml), dodate su rastvoru EPO (ovde 1 ml rastvora 5 mg/ml EPO u 10 mM kalijum fosfatu, 50 mM NaCI, pH 7.3). Reakcija je mešana oko 30 minuta (25°), a zaustavljena je dodavanjem 1 M rastvora lizina do finalne koncentracije od 10 mM. Višak količine SATA i SATP uklonjen je dijalizom nasuprot 10 mM kalijum fosfata, 50 mM NaCI i 2 mM EDTA, pH 6.2. Nakon uklanjanja protektivnih acetil grupa, hidroksilaminom, broj tiol grupa kovalentno vezanih za EPO određuje se fotometrijski sa ditiodipiridinom, saglasno metodi opisanoj kod Grasetti, D.R. i Murrav, J.F. u J.Appl. Biochem. Biotechnol. 119, strane 41-49 (1967).

Broj tiol grupa kovalentno vezanih po jednom EPO molekulu prikazanje na sledećoj tabeli:

PRIMER 3: Modifikacija aktiviranih EPO sa metoksi-PEG-maleimidom A) Aktivacija EPO

100 mg EPO, dobijenog saglasno Primeru 1 (190,000 lU/mg, kao što je određeno normocitemičnimtestom na mišu), aktivirano je primenom SATA (molarmi odnos: EPO/SATA = 1/5), saglasno Primeru 2. Tako nastali EPO ("aktivirani EPO"), koji nosi kovalentno vezane blokirane tiol grupe, razdvojen je od sporednih proizvoda, kao što je N-hidroksi-sukcinimid ili od intaktnog SATA, dijalizom, kao što je opisano u Primeru 1. Dobijen je rastvor 4.5 mg/ml aktiviranog EPO u 10 ml kalijum fosfata, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6.2.

B) Pegilacija aktiviranog EPO

380 mg metoksi-PEG-maleimida, koji poseduje prethodno ilustrovanu "najpoželjniju" strukturu (MW 30.000; Shearvvater Poh/mers, Inc., Huntsville (Alabama, USA)), rastvoreno je u prethodno navedenom rastvoru, koji je sadržao 95 mg aktiviranog EPO (4.5 mg/ml u 10 mM kalijum fosfatu, 50 mM NaCI, 2 mM EDTA, pH 6.2). Rezultujući molarni odnos između aktiviranog EPO i metoksi-PEG-maleimida u rastvoru bio je 1:4. Dodavanjem 1 M vodenog rastvora hidroksilamina do koncentracije od 30 mM, pH 6.2, navedena smeša kovalentno vezanih blokiranih tiol grupa aktiviranog EPO je deblokirana. Nastali aktivirani EPO u reakcionoj smeši rastvora sadržao je slobodne tiol (-SH) grupe.Po

deblokiranju tiol grupa sledila je reakcija kuplovanja između aktiviranog EPO, koji je sada sadržavao slobodne tiol (-SH) grupe, i metoksi-PEG-maleimida, tokom 90 minuta (mešanje, na 25°C). Reakcija kuplovanja zaustavljena je dodavanjem 0.2 M vodenog rastvora cisteina, do koncentracije od 2 mM u reakcionoj smeši.

Nakon 30 minuta, višak slobodnih tiol grupa na aktiviranom EPO koje nisu reagovale sa metoksi-PEG-maleimidom, blokirane su dodavanjem 0.5 M rastvora N-metilmaleimida u DMSO, do finalne koncentracije od 5 mM. Nakon 30 minuta, rezultujuća reakciona smeša koja je sadržavala pegilovane EPO vrste, dijalizovana je nasuprot 10 mM kalijum fosfata, pH 7.5 tokom > 15 sati.

C) Prečišćavanje pegilovanih EPO vrsta

Za razdvajanje pegilovanih EPO vrsta iz reakcione smeše, sproveden je sledeći postupak prečišćavanja: 50 ml Q-Sefaroza ff kolone ekvilibrirano je sa 10 mM kalijum fosfatom, pH 7.5. Reakciona smeša dobijena u fazi B), nanešena je na kolonu (brzina protoka: 3 zapremine kolone (CV) na sat). U cilju razdvajanja metoksi-PEG-maleimid reagensa koji nije reagovao, kolona je isprana sa 5 CV 10 mM kalijum fosfata, pH 7.5. Pegilovane EPO vrste su odvojene elucijom rastvorima rastućeg gradijenta koncentracije soli, koja su se sastojali od 5 CV pufera A (10 mM kalijum fosfat, pH 7.5) i 5 CV pufera B (10 mM kalijum fosfat, 500 mM NaCI, pH 7.5), brzinom protoka od 3 CV na sat. Na osnovu gradijenta NaCI, pegilovane EPO vrste (tri-, di- i mono-pegilovane EPO vrste) eluirane su prve, a zatim su eluirane ne-pegilovane EPO vrste. Frakcija eluata koji sadrži pegilovane EPO vrste (tri-, di- i mono-pegilovane EPO vrste) prikupljena je i profiltrirana (sterilna filtracija kroz 0.2 um filtre).

Sadržaj i prečišćenost tri-, di- i mono-pegilovanih EPO vrsta procenjena je na SDS-PAA gelovima, obojenim komazi plavom (Coomassie-biue) (Leammli, Nature 227, 680-685 (1970)), dok su koncentracije proteina izmerene na 280 nm, saglasno zakonu Beer-Lamberta. Molekulska težina EPO vrsta određena SDS-PAA elektroforezom bila je oko 68 kDa (za mono-pegilovane EPO vrste), oko 98 kDa (di-pegilovane EPO vrste) i oko 128 kDa (tri-pegilovane EPO vrste).

Dalje razdvajanje tri-, di- i mono-pegilovanih EPO vrsta može se postići hromatografijom, na primer, hromatografijom eliminacijom na osnovu veličine (Superdex, pg 200; Pharmacia).

Određivanjein vivobiološke aktivnosti eluata koji sadrži tri-, di- i mono-pegilovanih vrsta određena je metodom opisanom u Primeru 4.

PRIMER 4:In vivoaktivnost pegilovanih EPO određena normocitemičnim testom kod miša

Normocitemični biotest na mišu poznat je u praksi (Pharm. Europa Spec. Issue Ervthropietin BRP Bio 1997 (2)), a postupak je opisan u monografiji o eritropoetinu Ph. Eur. BRP. Uzorci su razblaženi sa BSA-PBS. Normalnim, zdravim miševi, 7-15 nedelja starosti,administrirano je s. c.0.2 ml EPO-frakcije koja je sadržavala tri-, di- i mono-pegilovane EPO, kao stoje opisano u Primeru 2. Tokom perioda od 4 dana, počevši 72 časa nakon primene, uzimana je krv, punktuacijom repne vene, a zatim je krv razblažena, tako da je 1 ul krvi prisutan u 1 ml 0.15 umol rastvora akridin oranž boje. Vreme bojenja bilo je 3 do 10 minuta. Brojanje retikulocita sprovedeno je mikrofluorometrijski u protočnom citometru, analizom histograma crvene fluorescencije. Broj retikulocita izražen je u apsolutnim vrednostima (na svakih 30 000 analiziranih krvnih ćelija). Za predstavljene podatke, svaka grupa se sastojala od 5 miševa na dan, a miševima su uzimani uzorci samo po jednom.

Miševi su tretirani metoksi-PEG-maleimidom vezanim za EPO, saglasno Primeru 3, nemodifikovanim EPO i puferskim rastvorom. Rezultati su predstavljeni na Slici 3. Rezultati pokazuju da pegilovane EPO vrste imaju superiorno veću aktivnost i produženi polu-život, na šta ukazuje značajno veći broj retikulocita i promena maksimalnog broja retikulocita primenom iste doze po mišu.

Claims

1. Konjugat, naznačen time što obuhvata glikoprotein eritropoetina koji ima najmanje jednu slobodnu amino grupu i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga koji poseduju primarnu strukturu humanog eritropoetina, modifikovanu dodavanjem od 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanima najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je navedeni glikoprotein kovalentno vezan za jednu do tri C1-C6- alkoksi polifetilen glikol) grupe, pri čemu je svaka poli(etilen glikol) grupa kovalentno vezana za glikoprotein preko linkera formule -C(0)-X-S-Y, i pri čemu C(O) linkera formira amidnu vezu sa jednom od navedenih amino grupa, X je -(CH2)k- ili -CH2(0-CH2-CH2)k- k ima vrednost od 1 do 10, Yje prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je od 20 kilodaltona do 40 kilodaltona, a molekulska težina konjugata je od 51 kilodaltona do 175 kilodaltona.

2. Konjugat prema zahtevu 1, formule P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n naznačen time što X i Y imaju značenje kao što je definisano u zahtevu 1, m predstavlja ceo broj od 450 do 900, n ima vrednost od 1 do 3, R je Ci-C6 - alkil a P je glikoprotein eritropoetin, bez amino grupe ili amino grupa koje formiraju amidnu vezu sa X.

3. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, formule naznačen time što P, R, X, m i n imaju značenje kao što je definisano u zahtevu 2.

4. Konjugat prema zahtevima 1 ili 2, formule naznačen time što P, R, X, m i n imaju značenje kao što je definisano u zahtevu 2.

5. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što X predstavlja -(CH2)k--

6. Konjugat prema zahtevu 5, naznačen time što k ima vrednost od 1 do 4.

7. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što X predstavlja -CH2-.

8. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je m ceo broj od 550 do 800.

9. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je m ceo broj od 650 do 700.

10. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što n ima vrednost 1.

11. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što R predstavlja metil.

12. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka od 24 kilodaltona do 35 kilodaltona.

13. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) dela 30 kilodaltona.

14. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je glikoprotein kovalentno vezan za jedan ili dva Ci-C6-alkoksi-poli(etilen glikol) ostatka.

15. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je poli(etilen glikol) ostatak vezan za metoksi grupu.

16. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što X predstavlja -CH2-, m je ceo broj od 650 do 700, n ima vrednost 1, R je metil, i što je prosečna molekulska težina svakog ploi(etilen glikol) ostatka 30 kilodaltona.

17. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što je glikoprotein eritropoetin, humani eritropoetin.

18. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što glikoprotein eritropoetin ima sekvencu predstavljenu na Slici 1 (SEQ ID NO:1) ili na Slici 2 (SEQ ID NO:2).

19. Konjugat prema zahtevu 18, naznačen time što glikoprotein eritropoetin ima sekvencu predstavljenu na Slici 1 (SEQ ID NO:1).

20. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 16, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, modifikovanu adicijom 1 do 6 mesta glikozilacije.

21. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 6, 8 i 10, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, promenjenu modifikacijama izabranim iz grupe koja se sastoji od:

22. Konjugat prema bilo kojem od prethodnih zahteva, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu koja se sastoji od sekvence humanog eritropoetina i druge sekvence na karboksi-terminalnom delu sekvence humanog eritropoetina, pri čemu druga sekvenca sadrži najmanje jedno mesto glikozilacije.

23. Konjugat prema zahtevu 22, naznačen time što druga sekvenca sadrži sekvencu nastalu od karboksi terminainog dela sekvence humanog horionskog gonadotropina.

24. Konjugat prema zahtevu 23, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: a) humanog eritropoetina, koji ima sekvencu Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lle Leu Pro Gln (SEQ ID NO:3), koja se pruža od karboksi terminainog dela; b) sekvence pod (a) modifikovane izmenama Ser^Asn^Thr<90>;i c) sekvence pod (a) modifikovane izmenama

25. Konjugat prema bilo kojem od zahteva 1 do 16, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, modifikovanu rearanžmanima najmanje jednog mesta glikozilacije.

26. Konjugat prema zahtevu 24, naznačen time što rearanžman obuhvata deleciju nekog od N-vezanih karbohidratnih mesta na humanom eritropoetinu i adiciju N-vezanog karbohidratnog mesta na poziciji 88 na sekvenci humanog eritropoetina.

27. Konjugat prema zahtevu 14, naznačen time što glikoprotein ima sekvencu humanog eritropoetina, modifikovanu izmenama izabranim iz grupe koja se sastoji od:

28. Kompozicija koja sadrži konjugate, naznačena time što svaki od pomenutih konjugata obuhvata glikoprotein eritropoetina koji ima najmanje jednu slobodnu amino grupu i izabran je iz grupe koja se sastoji od humanog eritropoetina i njegovih analoga, koji poseduju primarnu strukturu humanog eritropoetina, modifikovanu adicijom 1 do 6 mesta glikozilacije ili rearanžmanom najmanje jednog mesta glikozilacije; pri čemu je pomenuti glikoprotein kovalentno vezan za jednu do tri Ci-C6- alkoksi-poli(etilen glikol) grupe, pri čemu je svaka poli(etilen glikol) grupa kovalentno vezana za glikoprotein preko linkera formule -C(0)-X-S-Y, i pri čemu C(O) iz linker grupe formira amidnu vezu sa jednom od pomenutih amino kiselina, Xje -(CH2)k- k ima vrednost od 1 do 10, Yje prosečna molekulska težina svakog poli(etilen glikol) ostatka je od 20 kilodaltona do 40 kilodaltona, a molekulska težina konjugata je od 51 kilodalton do 175 kilodaltona.

29. Kompozicija koja sadrži konjugate prema zahtevima 2 do 26, naznačena time što je procentualni sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1, najmanje devedeset procenata.

30. Kompozicija prema zahtevima 28 i 29, naznačena time što što je procentualni sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1, najmanje devedesetdva procenata.

31. Kompozicija prema zahtevu 29, naznačena time što je procentualni sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1, najmanje devedesetšest procenata.

32. Kompozicija prema zahtevima 28 ili 31, naznačena time što je procentualni sadržaj konjugata u kojima je n jednako 1, od devedeset do devedesetšest procenata.

33. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata konjugat ili kompoziciju prema bilo kojem od zahteva 1 do 32 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

34. Upotreba konjugata ili kompozicije prema bilo kojem od zahteva 1 do 32, za dobijanje medikamenata za terapiju ili preventivu oboljenja povezanih sa anemijom u hroničnoj renalnoj insuficijenciji (CRF), AIDS-u ili za terapiju pacijenata obolelih od kancera koji primaju hemoterapiju.

35. Postupak dobijanja konjugata ili kompozicije prema bilo kojem od zahteva 1 do 32, koji postupak obuhvata kovalentno vezivanje tiol grupa za glikoprotein eritropoetina i kuplovanje tako aktiviranog glikoproteina eritropoetina sa poli(etilen glikol) (PEG) derivatom.