MX2007005640A - Moleculas que promueven la hematopoyesis. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con peptidos mimeticos de EPO y metodos de sintesis especiales para la produccion de peptidos multivalentes y/o supravalentes.

Description

MOLÉCULAS QUE PROMUEVEN LA HEMATOPOYESIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con péptidos como moléculas de unión en el receptor de eritropoyetina, métodos para la preparación de las mismas, medicamentos que contienen esos péptidos, y su uso e indicaciones seleccionadas, preferiblemente para el tratamiento de varias formas de la anemia y apoplejía.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hormona eritropoyetina (EPO) es una glicoproteina constituida por 165 aminoácidos y que tiene cuatro sitios de glicosilación. Las cuatro cadenas laterales de carbohidratos complejas comprenden 40 por ciento de todo el peso molecular de aproximadamente 35 kD. La EPO se forma en los riñones y a partir de alli migra hacia el bazo y la médula ósea, donde estimula la producción de eritrocitos. En enfermedades renales crónicas, la producción reducida de EPO da como resultado anemia eritropénica. Con la EPO recombinante preparada por ingeniería genética, las anemias pueden ser tratadas efectivamente. La EPO mejora la calidad de vida de los pacientes con diálisis. No únicamente la anemia renal, sino también la anemia en neonatos prematuros, las anemias asociadas con inflamación y tumores pueden ser mejoradas con una EPO recombinante. Por medio de la EPO, la quimioterapia con altas dosis puede ser efectuada de manera más exitosa en pacientes con tumores. De manera similar, la EPO, mejora la recuperación de pacientes con cáncer si se administra dentro del alcance de la terapia de radiación. En el tratamiento con EPO, existe el problema de que los regímenes de dosis requeridos se basan en aplicaciones intravenosas o subcutáneas frecuentes o continuas, debido a que la proteina se descompone de manera relativamente rápida en el cuerpo. Por lo tanto, la evolución de las moléculas derivadas de EPO recombinante avanza hacia la modificación selectiva de la glicoproteina, por ejemplo, por glicosilación o pegilación adicional, para incrementar la estabilidad y de este modo el tiempo de vida media biológico. Otro aspecto importante asociado con el tratamiento con la EPO recombinante es el peligro de que los pacientes desarrollen anticuerpos a la EPO recombinante durante el tratamiento. Esto se debe al hecho de que la EPO recombinante no es completamente idéntica a la EPO endógena. Una vez inducida la formación de anticuerpos, esto puede conducir a anticuerpos, los cuales comprometen la actividad de la eritropoyetina endógena también. Esto con frecuencia incrementa la dosis de la EPO recombinante para el tratamiento. Especialmente si esos anticuerpos comprometen la actividad de la EPO endógena, este efecto puede ser interpretado como una enfermedad autoinmune inducida por el tratamiento. Esto es especialmente indeseable, por ejemplo, en pacientes con diálisis sometidos a trasplante renal después de meses o años de tratamiento con EPO. Los anticuerpos pueden entonces comprometer la actividad de la EPO endógena producida por el trasplante y de este modo comprometer la actividad eritropoyética del órgano trasplantado. Actualmente existe una cuestión abierta, de si las modificaciones introducidas en la EPO recombinante para incrementar el tiempo de vida media biológica agravarán o mejorarán este problema. Generalmente, se esperarla que las modificaciones exhaustivas y el tiempo de vida media más prolongado agraven esta propiedad problemática. Una estrategia alternativa es la preparación de péptidos sintéticos a partir de aminoácidos que no compartan homología de secuencia o relación estructural con la eritropoyetina. Se mostró que los péptidos, no relacionados con la secuencia de la EPO, que son significativamente más pequeños que la eritropoyetina pueden actuar como agonistas (Wrighton et al., 1996). Los mismos autores demostraron que esos péptidos pueden ser truncados a péptidos mínimos aún activos con longitudes de 10 aminoácidos.

Los péptidos sintéticos que imitan la actividad de la EPO son objeto de la O96/40749 internacional abierta al público. Esta describe péptidos miméticos de 10 a 40 aminoácidos de un consenso distinto que contiene preferiblemente dos prolinas en la posición comúnmente referida como la posición 10 y 17, una de las cuales se considera esencial. De este modo a la fecha, todos los agonistas basados en péptidos pequeños del receptor de la EPO tenia una estructura que contenia al menos una prolina, con frecuencia dos residuos de prolina en posiciones definidas como usualmente numeradas como la posición 10 y 17, referidas a su posición en el péptido mimético de eritropoyetina muy activo EMP1 (WO96/40749 internacional, abierta al público; righton et al., 1996, Johnson et al, 1997): GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG Se considera que esas prolinas son indispensables para la efectividad de los péptidos. Para la prolina en la posición 17, esto ha sido sustanciado por interacciones con el receptor, mientras que se piensa que la prolina en la posición 10 era necesaria para el pliegue correcto de la molécula (véase también Wrighton et al. 1996, 1997) . El pliegue correcto, soportado por las propiedades estereoquímicas especificas de la prolina, es usualmente una precondición necesaria de la actividad biológica.

Generalmente, la priolina es un aminoácido que forma estructuras las cuales con frecuencia están implicadas -como en este caso- en la formación de estructuras de horquilla y vueltas beta. Debido a esta propiedad, inter alia, este es un punto frecuente de ataque para las endopeptidasas especificas de postprolina las cuales destruyen péptidos/proteinas que contienen prolina, ün número de hormonas peptidicas endógenas (angiotensinas I y II, urotensinas, treoliberinas, otras liberinas, etc.) son inactivadas por esa escisión posterior de prolina de "un solo golpe". El tiempo de vida media de los péptidos miméticos de EPO que contienen prolina es de este modo acortado por la actividad de esas enzimas frecuentes y activas. Esos péptidos pueden ser producidos químicamente y no necesitan producción recombinante, la cual es mucho más difícil de controlar y para producir productos con la calidad e identidad definida. La producción química de péptidos de ese tamaño pequeño también puede ser competitiva en términos de los costos de producción. Además, la producción química permite la introducción definida de variaciones moleculares, como la glicosilación, pegilación o cualesquier otras modificaciones definidas, que puedan tener una potencia conocida para incrementar la vida media biológica. Sin embargo, hasta ahora no ha sido aprobada ninguna terapia con los péptidos miméticos con EPO existentes.

LA INVENCIÓN De este modo, el objetivo de la presente invención es proporcionar péptidos sintéticos alternativos que exhiben al menos partes esenciales de la actividad biológica de la EPO nativa y de este modo proporcionar medios alternativos para estrategias terapéuticas eficientes, en particular para el tratamiento de la anemia o apoplejía.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo a un aspecto de la invención se proporciona un péptido de al menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unirse al receptor de EPO y que comprende una actividad agonista. El péptido describe de este modo las propiedades miméticas de la EPO. Los péptidos miméticos de EPO de acuerdo a esta invención no comprenden prolina en la posición comúnmente referida como posición 10 de los péptidos miméticos de EPO, sino un aminoácido cargado positivamente (para la numeración remítase por favor por ejemplo a Johnson et al, 1997 que describe la secuencia ancestral de EMP 1) . La prolina en la posición 10 se localiza en un motivo de aminoácido el cual es característico para la estructura plegada, es decir en un motivo de la vuelta beta (por favor remítase a Johnson, 1997). La estructura de vuelta beta se forma de la unión del receptor. Los péptidos miméticos de la EPO de acuerdo a la invención no comprenden de este modo una prolina en el motivo de la vuelta beta en la posición 10 sino un aminoácido cargado positivamente. Los ejemplos son K, R, H o aminoácidos no naturales respectivos como por ejemplo homoarginina. Además, se proporciona un péptido el cual comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8X9 10X11X12X13X1 X15 donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales y no naturales y Xs es C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es Ri H, L, W o Y o S; Xs es M, F, I, homoserinmetiléter (hsm) o norisoleucina; X9 es G o un intercambio conservativo de G; X10 es un intercambio no conservativo de prolina; o X9 y • X10 están sustituidos por un solo aminoácido; Xn es seleccionado independiente de cualquier aminoácido; XI2 es T o A; Xa3 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; Xis is C, A, K, ácido a-amino-y-bromobutírico u ho ocisteína (hoc) siempre que cualquiera de Xe o Xis sea C u hoc. La longitud del consenso del péptido descrito es preferiblemente de entre diez a cuarenta o cincuenta o sesenta aminoácidos. Los péptidos por encima de sesenta aminoácidos ' de longitud, aunque técnicamente adecuados, no necesariamente son preferidos puesto que, con el incremento de la longitud la síntesis del péptido usualmente se vuelve más complicada y de este modo costoso. En modalidades preferidas, el consenso del péptido describe una longitud de al menos 10, 15, 18 ó 20 aminoácidos. Por supuesto ellos pueden ser incluidos respectivamente comprendidos por secuencias mayores. Las secuencias peptídicas descritas pueden ser percibidas como dominio de unión por el receptor de EPO. Puesto que los péptidos miméticos de EPO son capaces de unirse al receptor de EPO. Fue muy sorprendente, que los péptidos de acuerdo a la invención exhibida en actividades iméticas de EPO aunque una o- de acuerdo a algunas modalidades - aún ambas prolinas pueden ser reemplazadas por otros aminoácidos naturales o no naturales. En efecto los péptidos de acuerdo a la invención tienen actividad comparable a la de los péptidos que contienen prolina. Sin embargo, es digno de hacer notar que los residuos de prolina que sustituyen a los aminoácidos no representan un intercambio conservativo sino un intercambio no conservativo. Preferiblemente, es usado un aminoácido cargado positivamente co o aminoácidos básicos como K, R y H y especialmente K para la sustitución. El aminoácido no conservativo usado para la sustitución también puede ser un aminoácido no natural y es preferiblemente uno con una cadena lateral cargada positivamente. También están comprendidos los análogos respectivos de los aminoácidos mencionados. Un ejemplo adecuado de un aminoácido no natural es la homoarginina. De acuerdo a una modalidad el péptido contiene un aminoácido cargado positivamente en la posición 10 excepto por la arginina del aminoácido natural. De acuerdo a esta modalidad la prolina 10 de este modo es sustituida por un aminoácido seleccionado de K, H o un aminoácido no cargado positivamente, no natural como, por ejemplo, la homoarginina. Se prefiere que los péptidos describan una lisina u homoarginina en la posición 10. Como se describió anteriormente, también la prolina en la posición 17 puede ser reemplazada por un aminoácido no conservativo. A este respecto también se prefiere que el aminoácido no conservativo sea uno con una cadena lateral cargada positivamente como K, R, H o un aminoácido no natural respectivo como por ejemplo la homoarginina. De acuerdo a una submodalidad de esta modalidad el péptido contiene un aminoácido cargado positivamente en la posición 17, excepto por el aminoácido natural arginina. De acuerdo a esta modalidad la prolina 17 es de este modo sustituida por un aminoácido seleccionado de K, H o un aminoácido cargado positivamente, no natural como la homoarginina. Se prefiere que los péptidos describan una lisina u homoarginina en la posición 17. Además, las secuencias pueden tener acetilaciones y amidaciones N-terminal y/o C-terminal. Algunos aminoácidos también pueden ser fosforilados. De acuerdo a la invención también se proporciona un péptido que se una al receptor de eritropoyetina y comprende una secuencia de los siguientes aminoácidos: X6X7X8 9X10X11X12X13X14X15 donde cada aminoácido está indicado por la abreviación de una letra estándar y X6 es C; X7 es R, H, L o W; X8 es M, F o I; X9 es G o un intercambio conservativo de G; xo es un intercambio no conservativo de prolina; Xn es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido Xi2 es T; Xi3 es W; X14 es D, E, I, L o V; Xa5 es C. Además, X7 puede ser serina, Xa puede ser hs o norisoleucina y Xi3 también puede ser 1-nal, 2-nal, A o F. La longitud del consenso del péptido es de manera preferible de entre diez hasta cuarenta o cincuenta o sesenta aminoácidos. En modalidades preferidas, el consenso del péptido comprende al menos 10, 15, 18 o 20 aminoácidos. Los péptidos de acuerdo a la invención pueden comprender además L-aminoácidos o D-aminoácidos estereoisoméricos, aminoácidos no naturales/no convencionales como por ejemplo aminoácidos alfa, alfa-disustituido, N-alquil aminoácidos o ácido láctico, por ejemplo 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, homoserin-metiléter, S-alanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-metilglicina (sarcosina) , homoarginina, N-acetilserína, N-acetilglicina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, no-lisina, ácido 5-aminolevulínico o ácido aminovalérico. El uso de N-metilglicina (MeG) y N-acetilglicina (AcG) es especialmente preferido, en particular en una posición terminal. También dentro del alcance de la presente invención se encuentran péptidos los cuales son retro, inverso, y retro/inverso péptidos de los péptidos definidos y aquellos péptidos que consisten totalmente de D-aminoácidos.

La presente invención también se relaciona con los derivados de los péptidos, por ejemplo productos de oxidación de metionina, o glutamina desamidada, arginina y amida C-terminal. De acuerdo a una modalidad de la invención los péptidos tienen un solo aminoácido sustituyendo los aminoácidos residuales X9 y X10. En esta modalidad también ambos residuos pueden ser sustituidos por un aminoácido no natural, por ejemplo- ácido 5-aminolevulínico o ácido aminovalérico. En una modalidad más, los péptidos de acuerdo a la invención comprenden la secuencia de consenso 4X5X6X7 8X9X10 11 12 13X14 15 donde X6 a Xi5 tienen los significados anteriores y donde X4 es Y; X5 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido y es preferiblemente A, H, K, L, M; S, T o I. Los péptidos de acuerdo a la invención pueden ser extendidos y pueden comprender la secuencia de consenso X3XX5X6X7X8 9X?0X11X12X13X14X15X15 17X13 donde X4 a X15 tienen un significado anterior y donde X3 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; X1S es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T, de manera más preferida K, R, S o T; X17 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, R, K, Y o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada de manera positiva, de manera más preferida K o Har; Xi8 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido. En una modalidad más de la invención los péptidos comprenden Xg como C, E, A o hoc, preferiblemente C y/o X7 como R, H o Y o S y/o X8 como F o M y/o X9 como G o A, preferiblemente G y/o X10 como K o Har y/o Xn como V, L, I, M, E, A, T o norisoleucina y/o Xi2 como T y/o Xi3 como W y/o Xi4 como D o V y/o Xi5 como C o hoc, preferiblemente C y/o X?7 como P, Y o A o un aminoácido básico natural o no natural. Sin embargo, también se prefiere que X17 es K o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada positivamente, por ejemplo homoarginina. La Figura 19 describe además secuencias peptídicas novedosas y adecuadas que describen actividad mimética de EPO. Los péptidos adicionales describen las siguientes secuencias: GGTYSCHFGALTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG GG YSCHFGKLTWVCKPQGG GGTYSCHF- (ALS) -LTWVCKPQGG GGTYSCHF- (ALS) -LTWVCKKQGG Con ácido 5-aminolevulínico (5-Als) -Als También se describen péptidos que tienen capacidad de unión al receptor de la hormona eritropoyetina y que describen un actividad agonista, los cuales se caracterizan porque los péptidos no describen una prolina. Como se describió anteriormente, esos péptidos preferiblemente no comprenden una prolina en la posición comúnmente referida como 10 y 17 sino un aminoácido natural diferente o ácido 5-aminolevulínico. Ellos preferiblemente describen una lisina en la posición 17. También se describen ácido nucleicos que codifican para los péptídos respectivos . Puede llevarse a cabo una o más sustituciones conservativas de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de acuerdo a esta invención, donde la sustitución ocurre dentro de aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares, los D-o L aminoácidos no cargados naturales o no naturales con cadenas laterales polares, aminoácidos con cadenas laterales aromáticas, los D- o L aminoácidos cargados positivamente naturales o no naturales, los D- o L aminoácidos cargados negativamente naturales o no naturales así como dentro de cualesquier aminoácidos de tamaño y peso molecular similares, donde el peso molecular del aminoácido original no deberá desviarse más de aproximadamente +/-25% de peso molecular del aminoácido original y la capacidad de unión al receptor de la hormona eritropoyetina con efecto agonístico se mantiene. Preferiblemente, se sustituyen no más de 1, 2 ó 3 aminoácidos. Las variantes de secuencia donde no es introducida prolina en las posiciones 10 y 17 son las preferidas. Las secuencias peptídicas descritas aquí pueden ser usadas como unidades peptídicas monoméricas adecuadas las cuales constituyen dominios de unión para el receptor de EPO. Ellas pueden ser usadas en forma monomérica puesto que se unen al receptor de EPO. Como se describe aquí, ellas son usadas preferiblemente como dímeros puesto que se demostró que la capacidad de inducir dimerización del receptor de EPO y de este modo actividad biológica es mejorada por la dimerización de las unidades de unión monoméricas . De este modo está claro que muchos péptidos diferentes están dentro del alcance de la presente invención. Se ha encontrado, sin embargo, que la secuencia Ac-VLPLIRCRMGRETWECMRAAGVTK-NH2 tiene ciertas desventajas y de este modo no es preferida de acuerdo a la presente invención. Al inicio (N terminal) y el fin (C terminal) de las secuencias peptídicas individuales descritas, pueden ser removidos y/o agregados hasta cinco aminoácidos. Es evidente por sí mismo que el tamaño no es de relevancia en tanto la función del péptido se preserve. Además, por favor nótese que las secuencias peptídicas individuales que pueden ser demasiado cortas para rodear su actividad como monómeros que usualmente funcionan como agonistas tras la dimerización. Esos péptidos son de este modo usados preferiblemente en su forma dimérica. Las modalidades truncadas o alargadas respectivas están de este modo también comprendidas por el espíritu de la invención. En la presente invención, las abreviaciones para el código de una letra como letras mayúsculas son aquéllas de la nomenclatura de polipéptidos estándar, extendida por la adición de aminoácidos no naturales. Código Aminoácido A L-alanina V L-valina L L-leucina I L-isoleucina M L-metionina F L-fenilalanina Y L-tirosina W L-triptófano H L-histidina S L-serina T L-treonina C L-cisteína N L-asparagina Q L-glutamina D ácido L-aspártico E ácido L-glutámico K L-lisina R L-arginina P L-prolina G glicina Ava, 5-Ava ácido 5-aminovalérico Ais, 5-A1s ácido 5-aminolevulínico MeG N-metilglicina AcG N-acetilglicina Hsm homoserin metiléter Har homoarginina lnal 1-naftilalanina 2nal 2-naftilalanina ßAla beta-alanina hoc homocisteína Como se describió anteriormente, la presente invención también incluye modificaciones de los péptidos y consensos peptídicos definidos por intercambios conservativos de un solo aminoácido. Esos intercambios alteran la estructura y función de una molécula de unión pero solo ligeramente en la mayoría de los casos. En un intercambio conservativo, un aminoácido es reemplazado por otro aminoácido dentro de un grupo con propiedades similares . Los ejemplos de grupos correspondientes son: - aminoácidos que tienen cadenas laterales no polares: A, G, V, L, I, P, F, W, M aminoácidos no cargados que tienen cadenas laterales polares: S, T, G, C, Y, N, Q - aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas: F, Y, W - aminoácidos cargados positivamente: K, Ri H - aminoácidos cargados negativamente: D, E - aminoácidos de tamaño o peso molecular similar, donde el peso molecular de los aminoácidos reemplazantes se desvía por un máximo de +/- 25% (o +/- 20%, +/- 15%, +/-10%) de peso molecular del aminoácido original. Es evidente por sí mismo, que los grupos también incluyen aminoácidos no naturales con el perfil de la cadena lateral respectiva como homoarginina en el caso del grupo que describe cadenas laterales cargadas positivamente. En el caso que una prolina 10 que sustituye una molécula, por ejemplo un aminoácido no natural no pueda ser asignada claramente a uno de los grupos anteriores caracterizado por las propiedades de su cadena lateral, usualmente se percibirá como una sustitución no conservativa de prolina de acuerdo a esta invención. Para categorizar esos aminoácidos inusuales, la clasificación auxiliar de acuerdo al peso molecular puede ser útil. De manera más específica, Wrighton et al. (Patente Estadounidense 5,773,569, y patentes asociadas) examinaron con detalle, el uso de técnicas de presentación de fagos, aminoácidos los cuales pueden ser reemplazados, aunque manteniendo la actividad. También investigaron y publicaron datos sobre una posible truncación, es decir la longitud mínima del péptido mimético de EPO dado. Sin embargo, una prolina cerca del residuo de Gli central parece ser la única posibilidad de obtener péptidos activos. De acuerdo a una modalidad de la invención se proporcionan péptidos seleccionados del grupo que consiste de las SEQ ID NOS 2, 4-9 dadas más adelante. Especialmente preferido es un péptido con una K en la posición 10 y una K en la posición 17 como es el caso en la SEQ ID NO 2. SEQ ID NO 2: GGTYSCHFGKLT VCKKQGG SEQ ID NO 4: GGTYSCHFGKLT CKPQGG SEQ ID NO 5: GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG SEQ ID NO 6: GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG Incorporación de ácido 5-aminolevulínico (Ais) -Als SEQ ID NO 7: GGTYSCHF- (AIS) -LTWVCKPQGG SEQ ID NO 8: GGTYSCHF- (AIS) -LTWVCKKQGG SEQ ID NO 9: GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG De acuerdo a una modalidad los dímeros o multímeros peptídicos se forman sobre la base de los monómeros de acuerdo a las SEQ ID NO 2 y 4 a 9 como se dio anteriormente en modificaciones de las mismas. Los péptidos descritos aquí pueden por ejemplo ser modificados también por un intercambio conservativo de un solo aminoácido, donde preferiblemente, se intercambian no más de 1, 2 ó 3 aminoácidos. Preferiblemente esos péptidos son modificados a AcG en el N-terminal y MeG en el C-terminal. Como se revisó anteriormente, los péptidos descritos de la invención pueden ser considerados como dominios de unión monoméricos que reconocen el sitio de unión del receptor de eritropoyetina. Sin embargo, como lo señaló Wrighton et al. (Wrighton 1997), dos de esos dominios de unión son generalmente necesarios para homodi erizar el receptor y para inducir la transducción de señales. De este modo, no fue muy sorprendente que una combinación de dos de esos dominios de unión en una sola molécula mejorará considerablemente la actividad, conduciendo al resultado de que los péptidos con un solo dominio de unión mostraron un mismo patrón cualitativo de actividad mientras que dos de los dominios de unión unidos en conjunto mostraron una DE50 (Dosis Efectiva al 50%, una medida de la actividad) mucho menor. Los péptidos que albergan dos dominios de unión son especificados como péptidos divalentes o diméricos dentro del contexto de esta descripción y son particularmente preferidos. Una solución técnica bien conocida para combinar dos dominios de unión monoméricos es la dimerización. Todas las soluciones siguientes a este método se caracterizan por a) el hecho de que los dominios de unión son sintetizados primero por separado como péptidos monovalentes o monoméricos, los cuales pueden ser modificados por ejemplo por grupos de unión de reacción en preparación por el paso b b) en un segundo paso de reacción, -en la mayoría de los casos idénticos - los dominios de unión son unidos en una reacción de dimerízacíón separada la cual también puede incluir moléculas enlazantes que usualmente se interponen entre los dos dominios dimerizados. ' Esos dímeros son ejemplos de péptidos divalentes y exhiben esencialmente las mismas funciones biológicas que los monómeros. Usualmente, muestran mejor actividad biológica en el caso de los péptidos miméticos de EPO. Varias técnicas son conocidas por los expertos en la técnica para dimerizar u oligomerizar los monómeros, las cuales también pueden se aplicadas de acuerdo a las enseñanzas de la presente invención. Los monómeros pueden ser dimerizados, por ejemplo por unión covalente a un enlazante. Un enlazante es una molécula de unión que crea un enlace covalente entre las unidades polipeptídicas de la presente invención.. Las unidades polipeptídicas pueden ser combinadas vía un enlazante de tal manera que la unión al receptor de EPO sea mejorada (Jonson et al. 1997; Wrighton et al. 1997) . Además se refiere a la multimerización de péptidos biotinilados monoméricos por interacción no covalente con una molécula de soporte proteínica descrita por Wrighton et al (Wrighton, 1997) . También es posible usar un sistema de biotina/estreptavidina, es decir biotinilar el C-terminal de los péptidos y una incubación subsecuente de los péptidos biotinilados con estreptavidina. De manera alternativa, se sabe como lograr la dimerización formando una estructura de dicetopiperacina. Este método conocido por el experto es descrito con detalle por ejemplo en Cavelier et al. (en: Péptidos: The wave of the Future; Michal Lebl and Richard A. Houghten (eds) ; American Peptide Society, 2001) . La descripción de esos documentos con respecto a la dimerización y multimerización no covalente se incorpora aquí como referencia. Otra forma alternativa de obtener dímeros peptídicos conocida de la técnica anterior es el uso de derivados de ácido dicarboxílico activados bifuncionales como precursores reactivos de las porciones enlazantes posteriores, las cuales reaccionan con grupos amino N-terminales, formando por lo tanto el péptido dimérico final (Johnson et al, 1997) . Los monómeros también pueden ser dimerizados por unión covalente o un enlazante. Preferiblemente el enlazante comprende NH-R-NH donde R es un alquileno inferior sustituido con un grupo funcional, un grupo carboxilico o grupo amino que permite la unión a otra porción de la molécula. El enlazante puede contener un residuo de lisina o lisina amida. También puede usarse PEG como enlazante. El enlazante puede ser una molécula que contenga dos ácidos carboxílicos y opcionalmente sustituida en uno o más átomos con un grupo funcional como una amina capaz de unirse a una o más moléculas de PEG. Una descripción detallada de los posibles pasos para la oligomerización y dimerización de péptidos con una porción enlazante también se da en la WO 2004/101606.

La descripción de esos documentos con respecto a la dimerización/multimerización se incorpora aquí como referencia. Un monómero o dímero peptídico puede comprender además al menos una porción separadora. Preferiblemente ese separador conecta el enlazante de un monómero o dímero a una porción polimérica soluble en agua o a un grupo protector, el cual puede ser por ejemplo PEG. El PEG tiene un peso molecular preferido de al menos 3 kD, preferiblemente de entre 20 y 60 kD. El separador puede ser una porción de Cl-12 terminada con enlaces -NH-o grupos COOH- y opcionalmente sustituido en uno o más átomos de carbono disponibles con un sustituyente de alquilo inferior. Un separador particularmente preferido se describe en la WO 2004/100997. Todos los documentos -WO 2004/100997 y WO 2004/101606- se incorporan aquí como referencia. La modificación de los péptidos con PEG se describe en la WO 2004/101600, la cual también se incorpora aquí como referencia. Aunque son de funcionalidad suficiente y de este modo útiles de acuerdo a las enseñanzas de la presente invención, los métodos de la técnica anterior de moléculas diméricas sintetizadas antes pueden tener algunas desventajas . Una desventaja potencial podría ser percibida entre los monómeros a ser conectados tienen primero que ser sintetizados por separado. Debido al apareamiento estocástico de péptidos monoméricos durante la dimerización la reacción de multimerización respectiva es en particular difícil (de manera selectiva e intencional) obtener péptidos bivalentes/multivalente diméricos con este método. Al menos esto conduciría a grandes pérdidas de rendimiento de un heterodímero pretendido, especial. Los péptidos Bi o multivalentes que albergan dos o más dominios de unión monoméricos ligeramente diferentes son muy deseables, puesto que debido a su naturaleza heterodimérica, las interacciones especiales entre los dos dominios, los cuales son capaces de estabilizar su interacción en el péptido bivalente final, pueden ser introducidos. Sin embargo, debido a las altas pérdidas en el rendimiento asociadas con las "reacciones de dimerización estocásticas" de la técnica anterior, este usualmente no es método económico ni atractivo . La aplicación de los métodos de dimerización de la técnica anterior -aún cuando técnicamente adecuados, tiene algunas desventajas económicas para proporcionar esos péptidos con domino de unión heterogéneo como se describe. La invención, sin embargo, también enseña, de manera ventajosa una estrategia mucho más eficiente para obtener péptidos multi o bivalentes altamente activos, los cuales pueden contener aún dominios de unión heterogéneos . El concepto central de esta estrategia reside en la síntesis de los péptidos monoméricos que forman parte del péptido multi o bivalente en reacciones separadas antes de la dimerización o multimerización, pero no sintetizar el péptido bi o multivalente final en el paso con un solo péptido; por ejemplo en una sola reacción en fase sólida. De este modo no es necesario ya un paso de dimerización o multimerización separado. Este aspecto proporciona una gran ventaja, es decir, el control completo e independiente sobre cada posición de la secuencia en la unidad peptídico final. El método permite albergar fácilmente al menos dos dominios de unión específicos del receptor diferente en una unidad peptídica debido al control independiente sobre cada posición de la secuencia. De acuerdo a esta modalidad, la secuencia del péptido final entre los dominios de unión (la cual es la "región enlazante") está compuesta de aminoácidos únicamente, conduciendo de este modo a un solo péptido mimético de EPO bi o multivalente continuo. En una modalidad preferida de la invención el enlazante está compuesto de aminoácidos naturales o no naturales lo cual permite una alta flexibilidad conformacional. A este respecto puede ser ventajoso usar residuos de glicina como aminoácidos enlazantes, los cuales son conocidos por su alta flexibilidad en términos de torsiones. Sin embargo, también pueden ser usados otros aminoácidos, como la alanina o beta-alanina, o una mezcla de los mismos. El número y elección de los aminoácidos usados depende de los aspectos esféricos respectivos. Esta modalidad de la invención permite el diseño hecho a medida de un enlazante adecuado por modelaje molecular para evitar distorsiones de la conformación bioactiva. Un enlazante comprendido de 3 a 5 aminoácidos es especialmente preferido. Es digno de hacer notar que el enlazante entre los dominios funcionales (o unidades monoméricas) de los péptidos bivalentes o multivalentes finales puede ser una parte distinta del péptido o puede esta compuesto -completamente o en partes - de aminoácidos que sean parte de los dominios funcionales monoméricos. Por ejemplo, los residuos de glicina en las posiciones de los aminoácidos 1 y 2 y 19 y 20 pueden formar parte del enlazante. Los ejemplos se dan con las Sec 11 a 14. De este modo, el término "enlazante" se define de este modo más funcionalmente que estructuralmente, puesto que un aminoácido puede formar parte de la unidad enlazante así como de las subunidades monoméricas. Puesto que - como se mencionó anteriormente -durante la síntesis del péptido bivalente/multivalente cada posición de la secuencia dentro del péptido final está bajo el control y de este modo puede determinarse de manera precisa si es posible adaptar o diseñar el péptido o regiones específicas o dominios del mismo, incluyendo el enlazante. Esto es de ventaja específica puesto que permite evitar la distorsión de la conformación bioactiva del péptido bivalente final debido a las interacciones intramoleculares desfavorables. El riesgo de distorsiones puede ser evaluado antes de la síntesis por modelaje molecular. Esto se aplica especialmente al diseño del enlazante entre los dominios monoméricos. Los péptidos bivalentes/multivalentes continuos de acuerdo a la invención muestran mucho mayor actividad que los péptidos monoméricos correspondientes y esto confirma la observación conocida de otros péptidos diméricos que un incremento de la eficacia está asociado con los conceptos de péptidos bivalentes. Como para los monómeros y péptidos diméricos, los péptidos bivalente/ ultivalentes continuos pueden ser modificados por ejemplo por acetilación o amidación o pueden ser alargados en las posiciones C-terminales o N-terminal. Las modificaciones de la técnica anterior para los péptidos monoméricos (monómeros) mencionadas anteriormente, incluyendo las uniones de porciones solubles como PEG, o dextranos también son aplicables para los péptidos multi o bivalentes de acuerdo a la invención.

Todas las posibles modificaciones también se aplican para modificar el enlazante. En particular, puede ser ventajoso unir las porciones poliméricas solubles al enlazante como por ejemplo PEG, almidón o dextranos. La síntesis del péptido multi o bivalente final de acuerdo a la invención puede incluir favorablemente también dos formaciones subsecuentes e independientes de enlace disulfuro u otros enlaces intramoleculares dentro de cada uno de los dominios de unión. Por lo tanto, los péptídos también pueden ser ciclizados. Las estructuras bivalentes de acuerdo a la invención se forman, de manera favorable, sobre la base de los monómeros peptídicos reportados aquí. Algunos ejemplos de unidades peptídicas apropiadas para la dimerización de algún receptor de EPO se listan posteriormente. Las barras sobre los dominios de unión simbolizan enlaces disulfuro intramoleculares opcionales pero preferidos: SEC ID NO 10 (basado en SEC ID NO 2): GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG- GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SEC ID No 11 Ao-GGTYs HFGKLT V-KKQGG-GGTYstHFGKLT v KKQGG-coNH.

El enlazante en esas estructuras bivalentes es adaptado por modelaje molecular para evitar distorsiones de la conformación bioactiva (figura 1) . SEC ID NO 12 La secuencia del enlazante puede ser acortada por un residuo de glicina. Esta secuencia también es un ejemplo de un enlazante compuesto por el residuo de glicina que forma al mismo tiempo parte del dominio de unión (véase la SEC ID NO 2) .

GGTYS¿HFGKLTWV¿KKQG-GGTYSCÍíFGKLTWVC¿KQGG El dominio de unión también puede ser usado como una secuencia monomérica (SEC ID NO 13) GGTYSCHFGKLT VCKKQG SEC ID NO 14: GGTYSCHFGKLT ¿KKKGG-^GTYSCHFGIO?TWCKKDGG Esta secuencia presenta un péptido bivalente continuo de acuerdo de la invención que alberga dos dominios de unión ligeramente diferentes (heterogéneos) . Esos péptidos bivalentes no son económicamente accesibles con un método de dimerización de la técnica anterior (véase más arriba) . También esos dominios de unión pueden ser aplicados como un monómero SEC ID NO 15: 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKKKGG . SEC ID NO 15a: GGTYSCHFGKLTWVCKKKDGG . Un ejemplo adicional es GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal- VCKKQRG De acuerdo a una modalidad adicional, el péptido contiene opcionalmente un aminoácido adicional, preferiblemente uno con una cadena lateral reactiva como la cisteína en el N-terminal como, por ejemplo en las siguientes secuencias C-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG C-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG Los ejemplos de péptidos adicionales describen la siguiente secuencia de aminoácidos: GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG La primera secuencia describe una serina en la posición X7. Se encontró que se creó un nuevo puente de hidrógeno a través de la introducción del grupo hidroxilo cuando esta secuencia se incorporó en un dímero. El uso de una serina en la posición X7 es de este modo especialmente favorable para los dimeros puesto que se estabiliza la conformación bioactiva.

La segunda secuencia que describe al aminoácido no natural homoarginina es especialmente adecuado para usarse en la composición farmacéutica para propósitos veterinarios. Se encontró de manera general que las secuencias peptídicas que contienen un aminoácido con una cadena lateral larga cargada positivamente como por ejemplo la homoarginina en las posiciones 10 y/o 17 describe una capacidad de unión fuerte para los receptores de EPO como por ejemplo el receptor de ratón/perro. Ellas son de este modo especialmente adecuadas para usarse en productos veterinarios, sin embargo, su uso no se limita a esto. Las cadenas laterales reactivas pueden servir como una atadura enlazante para modificaciones adicionales. Los péptidos comprenden opcionalmente además puentes disulfuro intramoleculares entre la primera y segunda y/o tercera y cuarta cisteína. Es importante hacer notar que los péptidos monoméricos como los ejemplificados por la SEQ ID 2, 4-9, y 12, 13, y 15, 15a son combinados favorablemente con los péptidos divalentes continuos de acuerdo a la invención. Sin embargo, también pueden ser aplicados los métodos de la técnica anterior para la dimerización de esos monómeros. Los ejemplos de esos métodos de la técnica anterior que son aplicados a los péptidos monoméricos que caen bajo el alcance de esta invención incluyen (pero no se limitan a) : 1. La dimerización vía conexión de C-terminal a C-terminal donde el C-terminal de uno de los péptidos monoméricos está unido covalentemente al C-terminal de otro péptido. El enlazante/separador entre los monómeros puede contener una unidad de dicetopiperacína. Un andamio de dicetopiperacina de Gly-Gly preferido puede ser logrado activando el monómero de glicina C-terminal. Este principio también puede ser usado para formar una dimerización C-terminal. Las siguientes fórmulas y ejemplos representan cuatro ejemplos -adaptados que fueron optimizados por modelaje molecular: (a) dímero sobre la base de la SEQ ID NO: 2 (la conformación del dimero se mostró en la Figura 2) : GGTYSC 1HFGKLTWVC'KKQGGG-G GGTYSCHFGKLTWVCKKQGGG-G l i GGTYSCHFGKLTWVCKKQGGG l I (b) dímero sobre la base de la SEQ ID NO: 2 con un enlazante acortado por una glicina; la conformación se muestra en la Figura 3.

GG GG (c) dímero sobre la base de la SEQ ID NO: 2 con una glicina sustituida con beta-alanina (Figura 4) . El monómero (SEQ ID NO: 16) también es aplicable como un péptido mimético EPO.

GGTYS GGTYS (d) dímero sobre la base de la SEQ ID NO: 2 con una glicina alternativa sustituida por beta-alanina (Figura 5) . El monómero (SEQ ID NO: 17) también puede ser aplicado como un péptido mimético de EPO. 2. La dimerización vía conexión de N-terminal a N-terminal donde el N-terminal de uno de los péptidos monoméricos es unido covalentemente al N-terminal de otro péptido, por lo que la unidad separadora es preferiblemente una ¿5 que contiene un bloque de construcción de ácido dicarboxílico. (a) en una modalidad los dímeros resultantes sobre la base de la SEQ ID NO: 2 alargados en el N-terminal por un residuo de glicina (SEQ ID NO: 18) contienen una unidad de hexandiolilo como enlazante/separador (Figura 6) : (b) en una modalidad alternativa la dimerización puede ser lograda usando una unidad de octandioilo como un enlazante/separador (Figura 7) : 3. La dimerización vía las cadenas laterales, donde una cadena lateral de aminoácidos de uno de los péptidos monoméricos es unida covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos del otro péptido con la inclusión de una molécula separadora adecuada conectando los dos monómeros peptídicos. Esta puede incluir: (a) la conexión vía un enlace amida.

I i GGT YS CHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG (b) o la conexión vía un puente disulfuro I 1 10 GGT YS CHFGKLTWVCKKXGG GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG I I I 1 GGTYSCHFGKLTWVCKKXGG GGTYS CHFGKLTWVCKKXGG 1 I 20 I 1 GGTYS CHFGKLTWVCKKXGG GGTYS CHFGKLTWVCKKXGG 25 l I La X simboliza el núcleo del esqueleto del aminoácido respectivo que participa en la formación del enlace del enlazante respectivo. Como se describió anteriormente los métodos de montaje respectivos también pueden ser usados para la preparación de multímeros. Se señala que todos los dominios de unión de los péptidos respectivos descritos aquí solos o como parte de un péptido divalente/multivalente también pueden ser usados en forma monomérica y/o pueden ser combinados con uno o más de otros dominios peptídicos idénticos o diferentes para formar péptidos bi o multivalentes homo- o heterogéneos respectivos. Los péptidos pueden ser modificados por ejemplo por acetilación o amidación o ser alargados en las posiciones C-terminal o N-terminal. La extensión con uno o más aminoácidos en uno de los dos términos, por ejemplo para la preparación de un sitio de unión de un polímero con frecuencia conduce a una unidad peptídica divalente heterodimérica la cual puede ser elaborada mejor como un péptido continuo. Los compuestos de la presente invención pueden ser usados de manera ventajosa para la preparación de composiciones farmacéuticas humanas y/o veterinarias. Puesto que los miméticos de EPO describen básicamente el mismo patrón de actividad cualitativa que la eritropoyetina. Ellos son de este modo generalmente adecuados para las mismas indicaciones que la eritropoyetina . La eritropoyetina es un miembro de la superfamilia de la citocina. Además de estimular los efectos descritos en la introducción, también se encontró que la eritroproyetina estimula las células no diferenciadas. Los miméticos de EPO descritos aquí son de este modo adecuados para todas las indicaciones causadas por efectos asociados con las células no diferenciadas. Los ejemplos no limitantes son la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con el sistema nervioso. Los ejemplos son daños neurológicos, enfermedades o trastornos, como por ejemplo Parkinsonismo, enfermedad de Alzheimer, corea de Huntington, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Tay-Sachs, una neuropatía, daño nervioso periférico, un tumor cerebral, un daño cerebral, daño de la médula espinal o un daño por apoplejía. Los péptidos miméticos de la EPO de acuerdo a la invención también son adecuados para el tratamiento preventivo y/o curativo de pacientes que padecen de, o están en riesgo de sufrir insuficiencia cardiaca. Los ejemplos son infarto cardiaco, enfermedad de la arteria coronaria, miocarditis, tratamiento con quimioterapia, alcoholismo, cardiomiopatía, hipertensión, enfermedades cardiacas valvares incluyendo insuficiencia mitral o estenosis aórtica, trastornos de la glándula tiroides, síndrome coronario crónico y/o agudo. Además, los miméticos de la EPO pueden ser usados para la estimulación de la mobilización fisiológica, proliferación y diferenciación de células precursoras endoteliales, para la estimulación de la vasculogénesis, para el tratamiento de enfermedades relacionadas con una disfunción de las células precursoras endoteliales y para la producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de esas enfermedades y composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos y otros agentes adecuados para la estimación de las células precursoras endoteliales. Los ejemplos de esas enfermedades son la hipercolesterolemia, diabetes mellitus, enfermedades inflamatorias crónicas mediadas por el endotelio, endoteliosis incluyendo la retículo endoteliosis, aterosclerosis, enfermedad cardiaca coronaria, isquemia miocárdica, angina de pecho, enfermedades cardiovasculares relacionadas con la edad, enfermedad de Raynaud, hipertonía inducida por el embarazo, insifuciencia renal crónica o aguda, insuficiencia cardiaca, cicatrización de heridas y enfermedades secundarias. Además, los péptidos de acuerdo a la invención son soportes adecuados para liberar agentes a través de la barrera sanguínea-cerebral y pueden ser usados para propósitos respectivos y/o la producción de agentes de conjugación terapéuticos respectivos capaces de pasar la barrera sanguínea-cerebral. Los péptidos descritos aquí son especialmente adecuados para el tratamiento de trastornos que se caracterizan por una deficiencia de eritropoyetina o una población de células sanguíneas rojas bajas o defectuosas y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia o apoplejía. Los péptidos también son adecuados para incrementar y/o mantener el hematocrito en un mamífero. Esas composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente soportes farmacéuticamente aceptables para adoptar la composición para el procedimiento de administración pretendido. Los métodos de liberación así como los soportes y aditivos adecuados son descritos por ejemplo en la WO 2004/101611 y la WO 2004/100997. Como se expuso anteriormente, la dimerización de los péptidos monoméricos a dímeros o aún multímeros usualmente mejora la actividad agonista mimética de EPO en comparación con los péptidos monómericos respectivos. Sin embargo, es deseable mejorar aún más la actividad. Por ejemplo, aún los péptidos miméticos de EPO miméticos son menos potentes que la EPO con respecto a la activación de los mecanismos celulares. Se produjeron varios métodos en la técnica anterior para incrementar la actividad de los péptidos, por ejemplo mediante la variación de la secuencia de aminoácidos para identificar candidatos más potentes. Sin embargo, sigue aún siendo deseable mejorar aun más la actividad de los péptidos, especialmente de los péptidos miméticos de la EPO, para mejorar la actividad biológica. Una modalidad más de la presente invención también proporciona una solución a ese problema. En ella se proporciona un compuesto que se une a moléculas blanco y comprende i) al menos dos unidades peptídicas, donde cada unidad peptídica comprende al menos dos dominios con una capacidad de unión al blanco; ii) al menos una unidad de soporte polimérica; donde las unidades peptídicas se unen a la unidad de soporte polimérica. De manera sorprendente, se ha encontrado que la combinación de dos o más péptidos bi o multivalentes de acuerdo a la invención sobre un soporte polimérico incrementa en gran medida la eficacia de los péptidos divalentes (o aún multivalentes) a su receptor de unión no solo de manera negativa sino aún sobre aditiva. De este modo se observó un efecto sinérgico.

El término "bivalente" como se usa para los propósitos de la presente invención se define como un péptido que contiene dos dominios con una capacidad de unión a blanco, aquí, en particular el receptor de EPO. Este es usado de manera intercambiable con el término "dimérico". En consecuencia, un péptido mimético de EPO "multivalente" o "multimérico" tiene varios dominios de unión respectivos para el receptor de EPO. Es evidente por sí mismo que los términos "péptido" y "unidad peptídica" no incorporan ninguna restricción con respecto al tamaño e incorporan oligo y polipéptidos así como proteínas. Los compuestos que comprenden dos o más unidades peptídicas bi o multivalentes unidas a una unidad de soporte polimérica son nombrados "supravalentes" en el contexto de esta modalidad. Esas moléculas supravalentes difieren en gran medida de las moléculas diméricas o multiméricas conocidas en el estado de la técnica. El estado de la técnica combina simplemente los péptidos miméticos de EPO monoméricos para crear un dímero. En contraste las moléculas supravalentes son generadas conectando unidades peptídicas (al menos) ya bivalentes a una unidad de soporte polimérica creando por lo tanto una molécula supravalente (los ejemplos se dan en las figuras 13 a 15) . Por lo tanto la actividad y eficacia total de los péptidos mejora en gran medida disminuyendo de este modo la dosis CE50.

En cuanto a las razones de la mayor potencia de las moléculas supravalentes en comparación con las moléculas conocidas en el estado de la técnica no son comprendidas completamente. Puede deberse el hecho de que las moléculas diméricas conocidas en el estado de la técnica proporcionan únicamente un blanco a la unidad de unión del receptor respectiva por dímero. De este modo únicamente se genera un complejo de receptor tras la unión del compuesto dimérico induciendo por lo tanto un solo proceso de transducción de señales. Por ejemplo, dos péptidos miméticos de EPO monoméricos son conectados vía PEG para formar un dímero peptídico facilitando por lo tanto la dimerización de los monómeros receptores necesarios para la transducción de señales (Johnson et al., 1997). En contraste, los compuestos supravalentes de acuerdo a la invención comprenden varias unidades de unión del receptor respectivas ya di o multiméricas. Esto puede permitir la generación de varios complejos de receptor sobre la superficie de la célula por molécula compuesta, induciendo por lo tanto varias transducciones de señales y potenciando por lo tanto la actividad y las unidades peptídicas de manera sobreaditiva. La unión de los compuestos supravalentes puede dar como resultado un agrupamiento de los complejos del receptor sobre la superficie celular.

Las unidades peptídicas miméticas de la EPO usadas en esta modalidad pueden ser homo o heterogéneas, lo que significa que son usadas unidades peptídicas idénticas o diferentes. Lo mismo se aplica a los dominios de unión (péptidos monoméricos como se describió anteriormente) de las unidades peptídicas las cuales también pueden ser homo o heterogéneas. Las unidades peptídicas bi o multivalentes unidas a la unidad de soporte se unen al mismo blanco del receptor. Sin embargo, ellas también por supuesto pueden diferir aún en su secuencia de aminoácidos. Los dominios de unión monoméricos de las unidades peptídicas bi o multivalentes pueden ser lineales o cíclicos. Una molécula cíclica puede ser creada por ejemplo por la formación de puentes de cisteína intramoleculares (véase más arriba) . La unidad de soporte polimérica comprende al menos un polímero lineal o dendrítico natural o ramificado sintético. La unidad de soporte polimérica es preferiblemente soluble en agua y fluidos corporales y es preferiblemente un polímero farmacéuticamente aceptable. Las porciones poliméricas solubles en agua incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo polialquilen glicol y derivados del mismo, incluyendo el PEG, homopolímeros de PEG, mPEG, homopolímeros de polipropilen glicol, copolímeros de etilen glicol con propilen glicol, donde los homopolímeros y copolímeros no están sustituidos o sustituidos en un extremo por ejemplo con un grupo acilo; poliglicerinas o ácido polisialínico; celulosa y derivados de celulosa, incluyendo metilcelulosa y carboximetilcelulosa; almidón (por ejemplo hidroxialquil almidón (HAS) , especialmente hidroxietil almidón (HES) y dextrinas, y derivados de los mismos; dextran y derivados de dextran, incluyendo sulfato de dextran, dextrina reticulada y carboximetil dextrina; heparina y fragmentos de heparina; alcohol polivinílico y polivinil etil éteres; polivinil-pirrolidona; a,b-poli [ (2-hidroxietil) -DL-aspartatamida; y polioles polioxietilados. Por supuesto también pueden ser usados otros polímeros solubles en agua biológicamente inertes. Un ejemplo simple, pero no obstante preferido de una unidad de soporte apropiada es un polímero homobifuncional, de por ejemplo polietilen glicol (bis-maleimida, bis-carboxi- bis-amino etc.). La unidad de soporte polimérica puede tener una amplia gama de pesos moleculares debido a la naturaleza diferente de los polímeros diferentes que son adecuados en conjunto con la presente invención. De este modo no existen restricciones de tamaño. Sin embargo, se prefiere que el peso molecular sea de al menos 3kD, de manera preferible de al menos lOkD y de aproximadamente alrededor de 20 a 500 kD y de manera más preferible alrededor de 30 a 150 o alrededor de 60 a 80 kD. El tamaño de la unidad de soporte depende del polímero elegido y de este modo puede variar. Por ejemplo, especialmente cuando son usados almidones como el hidroxietilalmidón, el peso molecular puede ser considerablemente mayor. El peso molecular promedio puede entonces ser arreglado alrededor de 100 a 4.000 kD o aún más alto. El tamaño de la unidad de soporte es elegido preferiblemente de modo que cada unidad peptídica sea unida óptimamente para unirse a sus moléculas receptoras respectivas. Para facilitar esto, una modalidad de la presente invención usa una unidad de soporte que comprende una unidad ramificante. De acuerdo a esta modalidad los polímeros, como por ejemplo PEG, son unidos a una unidad ramificante dando como resultado de este modo una molécula de soporte grande que permite la incorporación de numerosas unidades peptídicas. Los ejemplos para unidades ramificantes apropiadas son el glicerol o poliglicerol. También pueden ser usadas unidades ramificantes dendríticas como se enseña por ejemplo en Haag 2000, incorporada aquí como referencia. Preferiblemente, después de que son creadas las unidades peptídicas combinando los monómeros (ya sea cabeza a cabeza, cabeza a cola, o cola a cola) , la unidad de soporte polimérica es conectada a las unidades peptídicas. La unidad de soporte polimérica es conectada a las unidades peptídicas vía un enlace covalente o no covalente (por ejemplo un coordinado) . Sin embargo el uso de un enlace covalente es el preferido. La unión puede ocurrir por ejemplo vía un aminoácido reactivo de las unidades peptídicas por ejemplo lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serína, treonina, tirosina o el grupo amino N-terminal y el ácido carboxílico C-terminal. En el caso de que la unidad de soporte polimérica no posea un grupo de acoplamiento apropiado, pueden ser usadas varias sustancias de acoplamiento para modificar de manera apropiada el polímero de modo que pueda reaccionar con al menos un grupo reactivo sobre la unidad peptídica. Los grupos químicos adecuados que pueden ser usados para modificar el polímero son por ejemplo los siguientes: Grupos acilantes los cuales reaccionan con los grupos aminoácidos de la proteína, por ejemplo, grupos de anhídrido de ácido, grupos de N-acil imidazol, grupos azida, grupos anhídridos de N-carboxi, grupos diceteno, grupos dialquil pirocarbonato, grupos imidoéster y grupos carboxilo activados con carbodiimida. Se sabe que todos los grupos anteriores reaccionan con grupos amino sobre proteínas/péptidos para formar enlaces covalentes, incluyendo enlaces acilo o similares; los grupos alquilantes los cuales reaccionan con los grupos sulfhidrilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o amino sobre la unidad peptídica, como los grupos halo- carboxilo, grupos maleimida, grupos vinilo activados, grupos etilenimina, grupos de haluro de arilo, grupos de bromuro de 2-hidroxi-5-nitrobencilo; y grupos de aldehido y cetona alifáticos junto con agentes reductores, que reaccionan con el grupo amino del péptido; Grupos que forman éster y amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo de proteína, como grupos diazocarboxilato, y grupos carbodiimida y amina juntos; Grupos que forman disulfuros los cuales reaccionan con los grupos sulfhídrilo sobre la proteína, como grupos 5, 5 '-ditiobis (2-nitrobenzoato) y grupos alquilmercaptano (los cuales reaccionan con los grupos sulfhídrilo de la proteína en presencia de agentes oxidantes como el yodo) ; grupos dicarbonilo, como grupos ciclohexandiona, y otros grupos 1,2-dicetona los cuales reaccionan con porciones de guanidina del péptido; grupos diazo, los cuales reaccionan con los grupos fenólicos sobre el péptido; grupos reactivos de la reacción de bromuro de cianógenos con el polisacárido, los cuales reaccionan con grupos amino sobre el péptido. De este modo en resumen, el compuesto de acuerdo a la invención puede ser producido por - opcionalmente - modificando primero el polímero químicamente para producir un polímero que tenga al menos un grupo químico unido sobre él el cual es capaz de reaccionar con un grupo químico disponible o introducido sobre la unidad peptídica, y entonces haciendo reaccionar juntos - opcionalmente, el polímero modificado y la unidad peptídica para formar un complejo unido covalentemente de la misma utilizando el grupo químico - si es necesario - del polímero modificado. En el caso de que el acoplamiento ocurra vía un grupo SH libre sobre el péptido (por ejemplo, de un grupo cisteína) , el uso de un grupo maleimida en el polímero es el preferido. Para generar una molécula definida se prefiere usar un método dirigido para unir las unidades peptídicas a la unidad de soporte polimérica. En el caso de que no estén presentes aminoácidos apropiados en el sitio de unión deseado, los aminoácidos apropiados pueden ser incorporados en la unidad peptídica mimética de EPO dimérica. Para la unión polimérica específica del sitio se prefiere un grupo reactivo único, por ejemplo un aminoácido específico al final de la unidad peptidica para evitar que las fracciones de acoplamiento descontroladas a través del péptido conduzcan a una mezcla heterogénea que comprende una población de varias moléculas de polietilen glicol diferentes.

El acoplamiento de las unidades peptídicas a la unidad de soporte polimérica, por ejemplo, PEG o HES, es efectuada usando reacciones principalmente conocidas por el experto en la técnica. Por ejemplo, existe un número de métodos de unión de PEG y HES disponibles a aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo la WO 2004/ 100997 que da referencias adicionales, Roberts et al., 2002; US 4,064,117; EP 1 398 322; EP 1 398 327; EP 1 398 328; WO 2004/024761; todas incorporadas aquí como referencia) . Es importante comprender que el concepto de supravalencia descrito aquí es diferente del concepto conocido de la PEGilación o HESilación. En el estado de la técnica por ejemplo, la PEGilación únicamente es usada para producir dímeros peptídicos o para mejorar parámetros farmacocinéticos. Sin embargo, como se expuso anteriormente, la unión de dos o más unidades peptídicas divalentes al menos a por ejemplo PEG como una unidad de soporte polimérica también mejora en gran medida la eficacia (disminuyendo de este modo la dosis CE50) . El concepto de esta invención tiene de este modo fuertes efectos sobre los parámetros farmacodinámicos y no solo sobre los parámetros farmacocinéticos como es el caso con los conceptos de PEGilación conocidos en el estado de la técnica. Sin embargo, por supuesto, la incorporación de por ejemplo PEG como unidad de soporte polimérica también tiene ventajas conocidas con respecto a la farmacocinética: La PEGilación usualmente es efectuada para mejorar las propiedades biofarmacéuticas de los péptidos. Las alteraciones más relevantes de la molécula de proteína después de la conjugación con PEG son el agrandamiento del tamaño, enmascaramiento de la función de la superficie de la proteína y glicosilación, modificación de la carga y protección del epítope. En particular, el agrandamiento del tamaño disminuye la ultrafiltración en el riñon y promueve la acumulación en tejidos permeables por el mecanismo de permeación y retención mejorada pasiva. La protección de la proteína reduce la proteólisis y reconocimiento por el sistema inmune, las cuales son rutas importantes de eliminación. El efecto específico de la PEGilación sobre las propiedades fisicoquímicas y biológicas de la proteína es determinada estrictamente por la proteína y las propiedades del polímero así como por la estrategia de PEGilación adoptada. Sin embargo, el uso de PEG u otros polímeros no biodegradables como unidad de soporte para una molécula supravalente puede conducir a nuevos problemas. Durante aplicaciones in vivo, los intervalos de dosis en un escenario clínico son dirigidos por la pérdida de efecto del fármaco. Las dosis de rutina y los intervalos de dosificación son adaptados de modo que el efecto no se pierda durante los intervalos de dosificación. Debido al hecho de que los péptidos unidos a una unidad polimérica grande, no biodegradable (por ejemplo, una porción de PEG) pueden ser degradados más rápidamente que la molécula de soporte pueda ser eliminada por el cuerpo, puede surgir un riesgo de acumulación de la unidad de soporte. Puesto que siempre ocurre un riesgo de acumulación cuando el tiempo de vida de efecto medio del fármaco se acorta más que el tiempo de vida media de eliminación del fármaco en sí o uno de sus componentes/metabolitos. De este modo, la acumulación de la molécula de soporte deberá ser evitada debido a que los péptidos usualmente son PEGilados con porciones de PEG muy grandes (~20-40kD) las cuales de este modo muestran una eliminación renal lenta. La porción peptídica en sí experimenta degradación enzimática y una escisión aún parcial puede ser suficiente para desactivar al péptido. Para encontrar una solución a este problema una modalidad de la presente invención enseña el uso de una unidad de soporte polimérica que está comprendida de al menos dos subunidades. Las subunidades poliméricas están conectadas vía estructuras enlazantes covalentes biodegradables. De acuerdo a esta modalidad el peso molecular de la molécula de soporte grande (por ejemplo 40 kD) es creada por varias subunidades de tamaño pequeño o intermedio (por ejemplo, cada unidad teniendo un peso molecular de 5 a 10 kD) , que son conectadas vía enlazantes biodegradables. Los pesos moleculares de las subunidades modulares se suman generando por lo tanto el peso molecular deseado de la molécula de soporte. Sin embargo, las estructuras enlazantes biodegradables pueden ser degradadas en el cuerpo liberando por lo tanto las subunidades de soporte más pequeñas (por ejemplo de 5 a 10 kD) . Las subunidades de soporte pequeñas muestran una mejor eliminación renal que una molécula polimérica que tiene un peso molecular total (por ejemplo de 40 kD) . Un ejemplo se da en la Figura 16. Las estructuras enlazantes son seleccionadas de acuerdo a propiedades de degradación y escalas de tiempo de degradación conocidas en los fluidos corporales. Las estructuras degradables pueden, por ejemplo, contener grupos escindibles como derivados de ácido carboxílico como enlaces amida/peptídicos o esteres los cuales pueden ser escindidos por hidrólisis (véase por ejemplo Roberts, 2002 incorporada aquí como referencia) . Los PEG succinimidil esteres también pueden ser sintetizados con varios enlaces éster en el esqueleto de PEG para controlar la velocidad de degradación a pH fisiológico (Zaho, 1997, incorporado aquí como referencia) . Otras estructuras degradables como los disulfuros y bencil uretanos pueden ser escindidas bajo ambientes moderadamente reductores, como en los compartimientos endosomales de una célula (Zalipsky, 1999) y de este modo también son adecuadas. Otros criterios para la selección de enlazantes apropiados son la selección de la degradación rápida (con frecuencia enzimática) o degradación lenta (con frecuencia descomposición no enzimática) . La combinación de esos dos mecanismos en fluidos corporales también es factible. Está claro que este concepto altamente ventajoso no se limita a las unidades peptídicas específicas descritas o referidas aquí sino que también se aplica a otras moléculas farmacéuticas que se unen a unidades poliméricas grandes como moléculas de PEG donde surgen los mismos problemas de acumulación. De acuerdo a una modalidad el hidroxialquil almidón y preferiblemente HES es usado como unidad de soporte polimérica. El HES tiene varias ventajas importantes. Primero que todas, el HES es biodegradable. Además, la biodegradabilidad del HES puede ser controlada vía la relación de grupos etilo y puede de este modo ser influenciada. Del 30 al 50% de los grupos etilo, es muy adecuado para los propósitos de la presente invención. Debido a la biodegradabilidad, los problemas de acumulación como se describió anteriormente en conjunto con el PEG usualmente no ocurren. Además, el HES ha sido usado durante un largo tiempo en el tratamiento médico, por ejemplo en forma de una expansor del plasma. Es inocuo y de este modo está aprobado. Además, los derivados de los productos de la hidrólisis de HES son detectables por cromatografía de gases. Los conjugados de HES-péptido pueden ser hidrolizados bajo condiciones bajo las cuales las unidades peptídicas sean aún estables. Esto permite la cuantificación y verificación de los productos de degradación y permite evaluaciones y estandarizaciones de los péptidos activos. De acuerdo a una modalidad más, es usado un primer tipo de unidad de soporte polimérica y cargada con unidades peptídicas . Este primer soporte es de manera preferible fácilmente biodegradable como lo es por ejemplo el HES. Sin embargo, no todos los puntos de unión del primer soporte son ocupados por unidades peptídicas sino solo por ejemplo alrededor del 20 al 50%. Dependiendo del tamaño del polímero usado, pueden ser acoplados varios cientos de unidades peptídicas a la molécula de soporte. El resto de los puntos de unión del primer soporte son ocupados con diferentes soportes, por ejemplo, unidades pequeñas de PEG que tienen un peso molecular menor que el primer soporte. La modalidad tiene la ventaja de que se crea una composición supravalente debido al primer soporte el cual es sin embargo, muy durable debido a la presencia del segundo soporte, el cual está constituido preferiblemente por unidades de PEG de 3 a 5 o 10 kD. Sin embargo, toda la entidad es muy degradable, puesto que el primer soporte (por ejemplo HES) y las unidades peptídicas son biodegradables y el segundo soporte, por ejemplo PEG es suficientemente pequeño para ser fácilmente eliminado del cuerpo. Los monómeros que constituyen los dominios de unión de las unidades peptídicas reconocen al receptor de eritropoyetina homodimérico. La última propiedad de ser un receptor homodimérico diferente al receptor de EPO de muchos otros receptores de citocina. Las unidades peptídicas que comprenden al menos dos dominios de unión monoméricos miméticos de EPO como se describió anteriormente se unen al receptor de EPO y preferiblemente son capaces de di o multimerizar respectivamente su blanco y/o estabilizar este en consecuencia, creando por lo tanto un complejo que induce la transducción de señales. La presente invención también comprende métodos de producción del compuesto respectivo, donde las unidades peptídicas están conectadas a las unidades de soporte respectivas. La presente invención comprende además métodos de producción del compuesto respectivo, donde las unidades peptídicas son conectadas a las unidades de soporte poliméricas respectivas. Los compuestos de la presente invención pueden ser usados de manera ventajosa para la preparación de composiciones farmacéuticas humanas y/o veterinarias. Ellas pueden ser especialmente adecuadas para el tratamiento de trastornos que se caractericen por una deficiencia de eritropoyetina o una población de células rojas sanguíneas baja o defectuosa y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia y apoplejía. Ellas también son adecuadas para todas las indicaciones descritas anteriormente. Esas composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente soportes farmacéuticamente aceptables para adaptar la composición al procedimiento de administración pretendido. Los métodos de liberación así como los soportes y aditivos adecuados son descritos por ejemplo en la WO 2004/100997 y la WO 2004/101611, incorporadas aquí como referencia.

EJEMPLOS El concepto de moléculas supravalentes deberá ser explicado por medio de ejemplos. La Figura 13 muestra un ejemplo de una molécula supravalente simple de acuerdo a la invención. Dos péptidos miméticos de EPO bivalentes continuos son conectados N-terminalmente por una porción de PEG bifuncional que contiene grupos maleimida. La cisteína fue elegida como sitio de unión reactivo para la unidad de soporte de PEG.

Sin embargo, las moléculas supravalentes pueden comprender más de dos unidades peptídicas bi o multivalentes continuas. La Figura 14 es un ejemplo que se basa en una unidad de soporte con una unidad de glicerol central como unidad ramificante que comprende tres péptidos bivalentes continuos. Nuevamente se usó cisteína para la unión. La Figura 20 muestra un ejemplo que usa HES como unidad de soporte polimérica. La HES fue modificada de modo que contenga grupos maleimida que reaccionen con los grupos SH de las unidades peptídicas. De acuerdo al ejemplo, todos los sitios de unión se unen a las unidades peptídicas. Sin embargo, también las unidades de PEG pequeñas (por ejemplo, de 3 a 10 kD) podrían ocupar al menos algunos de los sitios de unión. Como se explicó anteriormente, el concepto supravalente también puede extenderse a los polímeros dendríticos polivalentes, donde una unidad de soporte dendrítica y/o polimérica es conectada a un mayor número de péptidos bivalentes continuos. Por ejemplo, la unidad de ramificación dendrítica puede basarse en poliglicerol (por favor remítase a Haag 2000, incorporado aquí como referencia) . Un ejemplo para una molécula supravalente basada en una unidad de soporte con una unidad que se ramifica dendrítica que contiene seis péptidos bivalentes continuos se muestra en la Figura 15. Otros ejemplos de moléculas supravalentes comprenden unidades de soporte con almidones o dextranos, los cuales son oxidados usando por ejemplo ácido periódico para alojar un mayor número de funciones aldehido. En un segundo paso, muchos péptidos bivalentes son unidos a la unidad de soporte y juntos forman la molécula final. Por favor nótese que aún varios cientos (por ejemplo de 50 a 1000, de manera preferible de 150 a 800, de manera más preferible de 250 a 700) unidades peptídicas pueden acoplarse a la molécula de soporte, la cual es por ejemplo HES. La Figura 16 demuestra el concepto de molécula supravalente biodegradable simple. Dos péptidos miméticos de EPO bivalentes continuos son conectados N-terminalmente por dos porciones de PEG bifuncionales que son conectadas vía un enlazante biodegradable que tiene una posición de escisión intermedia. Los enlazantes permiten la degradación de la unidad de PEG grande en las subunidades facilitando por lo tanto la iluminación renal.

I . Síntesis Peptidica de Monómeros Síntesis Manual La síntesis se lleva a cabo mediante el uso del sistema de microondas Discover (CEM) usando PL-Rink-Amida-Resina (sustitución de 0.4 mmol/g) sobre Resinas de Wang precargadas a una escala de 0.4 mmol. La remoción del grupo Fmoc se logra mediante la adición de 30 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 100 W durante 3X30 seg. El acoplamiento de los aminoácidos se logra mediante la adición de 5 veces el exceso de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50 W durante 5X30 seg. Entre todos los ciclos de irradiación, la solución es enfriada manualmente con la ayuda de un baño de hielo. Después de la desprotección y acoplamiento, la resina es lavada 6 veces con 30 ml de DMF. Después de la desprotección del último aminoácido algunos péptidos son acetilados por incubación con 1.268 ml de solución colorante (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en 100 ml de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la escisión, la resina es entonces lavada 6 veces con 30 ml de DMF y 6 veces con 30 ml de DCM. La escisión de los péptidos crudos es lograda por tratamiento con 5 ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución es filtrada en 40 ml de éter frío. El precipitado es disuelto en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido es purificado por RP-CLAP (Kromasil 100 C 18 lOµm, 250x4.6 mm) .

Síntesis Automatizada La síntesis es llevada a cabo mediante el uso de un sistema de microondas Odyssey (CEM) usando PL-Rink- Amida-Resina (sustitución de 0.4 mmol/g) sobre Resinas de Wang precargadas a una escala de 0.25 mmol. La remoción del grupo Fmoc se logra mediante la adición de 10 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 100 W durante 10X10 seg. El acoplamiento de los aminoácidos se logra mediante la adición de 5 veces el exceso de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento de irradiación con 50 W durante 5X30 seg. Entre todos los ciclos de irradiación la solución es enfriada burbujeando nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de la desprotección y acoplamiento, la resina es lavada 6 veces con 10 ml de DMF. Después de la desprotección del último aminoácido, algunos péptidos son acetilados por incubación con 0.793 ml de solución colorante (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en 100 ml de DMSO) durante 5 minutos. Antes de la escisión, la resina es entonces lavada 6 veces con 10 ml de DMF y 6 veces con 10 ml de DCM. La escisión de los péptidos crudos es lograda por tratamiento con 5 ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución es filtrada en 40 ml de éter frío, el precipitado es disuelto en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido es purificado por RP-CLAP (Kromasil 100 C 18 lOµm, 250x4.6 mm) .

Purificación Todos los péptidos fueron purificados usando el sistema Nebula-LCMS (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos fue disuelto en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido es purificado por RP-CLAP (Kromasil 100 C 18 lOµm, 250x4.6 mm) . La velocidad de flujo fue de 20 ml/min y la relación de separación de LCMS 1/1000.

II . Formación de los puentes disulfuro intramoleculares Ciclización con K3[(FeCN6) Solución 1: Se disolvieron 10 mg del péptido en TFA al 0.1%/acetonitrilo y se diluyeron con agua hasta que se alcanzó una concentración de 0.5 mg/ml. Se agregó bicarbonato de amonio sólido para alcanzar un pH de aproximadamente 8. Solución 2: En un segundo frasco se diluyeron 10 ml de TFA al 0.1%/acetonitrilo con 10 ml de agua. Se agregó bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanzó un pH de 8 y se agregó una gota de solución de 0.1 M de K3[(FeCN6)]. Las soluciones 1 y 2 se agregaron una por goteo durante un periodo de 3 horas a una mezcla de acetonitrilo/agua (1/1; pH=8). La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante la noche y la mezcla se concentró y purificó por LCMS.

Ciclización con resina CLEAR-OXMR A 100 ml de acetonitrilo/agua (1/1; TFA al 0.1%), se agregó bicarbonato de amonio sólido hasta que se alcanzó un pH de 8. Esta solución se desgasificó burbujeando Argón durante 30 minutos. Ahora se agregan 100 mg de resina CLEAR-0XMR-. Después de 10 minutos, se agregan 10 mg del péptido como un sólido. Después de 2 horas de incubación, la solución es filtrada, concentrada y purificada por LCMS.

Purificación de los péptidos cíclicos: Todos los péptidos fueron purificados usando un sistema Nebula-LCMS (Gilson) . El material crudo de todos los péptidos fue disuelto en acetonitrilo/agua (1/1) o DMSO y el péptido fue purificado por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 o C8 lOµm, 250x4.6 mm) . La velocidad de flujo fue de 20 ml/min y la relación de separación de la LCMS de 1/1000.

III. Ensayos in vitro con monómeros Ensayo de proliferación con células TF-1 por incorporación de BrdU Células TF-1 en fase de crecimiento logarítmico (-2.105 - 1.106 células/ml; medios RPMI; 20% de suero de carnero fetal; suplementado con penicilina, estreptomicina, L-Glutamina; 0.5ng/ml de Interleucina 3) se lavaron (se centrifugaron 5 min. a 1500 rpm y se resuspendieron en RPMI completo si IL3 a 500.000 células/ml) y se precultivaron antes de iniciar el ensayo durante 24 h sin IL-3. Al siguiente día las células son sembradas en placas de 24 o 96 pozos usualmente usando al menos 6 concentraciones y 4 pozos por concentración con un contenido de al menos 10.000 células/pozo por agente a ser probado. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinantes como un agente de control positivo y pozos sin adición de citocina como agente de control negativo. Los péptidos y controles de EPO son prediluidos en medio hasta las concentraciones deseadas y agregados a las células, comenzando en un periodo de cultivo de 3 días bajo condiciones de cultivo estándar (37°C, 5% de dióxido de carbono en la fase gaseosa, atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones siempre se refieren a la concentración final del agente en el pozo durante este periodo de cultivo de 3 días. Al final de este periodo de cultivo, se agregó FdU a una concentración final de 8ng/ml de medio de cultivo y el cultivo continuo durante 6 horas. Entonces se agregaron BrdU (bromodeoxiuridina) y dCd (2-deoxicitidina) a sus concentraciones finales (lOmg/ml de BrdU; 8mg/ml de dCD; concentraciones finales en el medio de cultivo) y el cultivo continúo durante 2 horas adicionales. Al final de este periodo de incubación y cultivo, las células son lavadas una vez con solución salina amortiguada con fosfato con un contenido de 1.5% de BSA y resuspendidas en una cantidad mínima de líquido. De esta suspensión, las células son agregadas por goteo en etanol al 70% a -20°C. De ahí, las células son incubadas durante 10 minutos sobre hielo y entonces analizadas directamente o pueden ser almacenadas a 4°C antes del análisis. Antes del análisis, las células son sedimentadas por centrifugación, el sobrenadante es desechado y las células resuspendidas en la cantidad minima de fluido remanente. Las células son entonces suspendidas e incubadas durante 10 min. en 0.5 ml de HCl 2M/0.5% de tritón X-100. Entonces, son sedimentadas nuevamente y resuspendidas en uña cantidad mínima de fluido restante, con 0.5 ml de Na2B407 0.1 N, pH 8.5 antes de la resedimentación inmediata de las células. Finalmente, las células son resuspendidas en 40 µl de solución salina amortiguada con fosfato (1.5% BSA) y divididas en dos tubos de reacción con un contenido de 20 µl de suspensión celular cada uno. Se agregan 2 µl de anti-Brd U-FITC (DAKO, clona Bu20a) a un tubo y 2 µl de mlgGl-FITC (Sigma) control al segundo tubo comenzando un periodo de incubación de 30 min. A temperatura ambiente. Entonces, se agregan 0.4 ml de solución salina amortiguada con fosfato y 10 µg/ml de Yoduro de Propidio (concentración final) . El análisis en el citómetro de flujo se refiere a la fracción de 40 células o células con una mayor ploidez y a la fracción de células positivas a BrdU, determinando de este modo la fracción de las células en las etapas relevantes del ciclo celular. Ensayo de proliferación con células TF-1 por MTT Las células TF-1 en fase de crecimiento logarítmica (-2.105 - 1.106 células/ml; medio RPMI; 20% de suero de carnero fetal; suplementado con Penicilina, estreptomicina, L-Glutamina; 0.5ng/ml de Interleucina 3) son lavadas (centrifugadas 5 min. a 1500 rpm y resuspendidas en RPMI completo sin IL3 a 500.000 células/ml) y precultivadas antes de iniciar el ensayo durante 24 horas sin IL-3. Al siguiente día las células son sembradas en placas de 24- o 96- pozos usando usualmente al menos 6 concentraciones y 4 pozos por concentración con contenido de al menos 10.000 células/pozo a ser probado. Cada experimento incluye controles que comprenden EPO recombinante como agente de control positivo y pozos sin adición de citocina como agente de control negativo. Los péptidos y controles EPO son prediluidos en medio a las concentraciones deseadas y adicionadas a las células, comenzando un periodo de cultivo de tres días bajo condiciones de cultivo estándar (37°C, dióxido de carbono al 5% en la fase gaseosa, atmósfera saturada con agua) . Las concentraciones se refieren siempre a la concentración final del agente en el pozo durante este periodo de cultivo de cuatro días.

Al día 4, antes de comenzar el análisis, se prepara una serie de dilución de un número conocido de células TF-1 en un número de pozos (0/2500/5000/10000/20000/50000 células/pozo en 100 µl de medio) . Esos pozos son tratados de la misma manera que los pozos de prueba y posteriormente proporcionan una curva de calibración de la cual puede determinarse el número de células. Habiendo establecido esos pozos de referencia, el MTS y PMS del equipo de proliferación MTT (Promega, ensayo de proliferación de células no radioactivo, acuoso CellTiter 96) son descongelados en un baño de agua a 37°C y se agregan 100 µl de solución de PMS a 2 ml de solución de MTS. Se agregan 20 µl de esta mezcla a cada pozo de las placas de ensayo y se incuban a 37 °C durante 3-4h. Se agregan 25 µl de docecilsulfato de sodio al 10% en agua a cada pozo antes de la medición de E492 en un lector de ELISA. Usando evaluaciones gráficas como se muestra en las figuras 17 y 18 sobre la base de los cálculos de la relación dosis-respuesta usando el programa GraphPad se determinaron los siguientes valores de CE50 sobre la base de los datos de ensayo de MTT: La siguiente tabla muestra los valores de CE50 de algunos péptidos ejemplares: SEQ ID NO 2: GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG 3284 nmol/1 SEQ ID NO 4: GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG 4657 nmol/1 SEQ ID NO 5: GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG 5158 nmol/1 SEQ ID NO 6: GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG 4969 nmol/1 SEQ ID NO 7 GGTYSCHF- (Ais) -LTWVCKPQGG 5264 nmol/1 SEQ ID NO 8 GGTYSCHF- (Ais) -LTWVCKKQGG 4996 nmcl/1 GGTYSCHFGPLTWVCKKQGG 2518 nmol/1 GGTYSCHFAKLTWVCKKQGG 5045 nmol/1 GGTYSCHFGGLTWVCKPQGG sin actividad detectable Las figuras 17 y 18 muestran curvas de respuesta de péptidos miméticos de eritropoyetina determinadas de los datos sin tratar obtenidos por los ensayos descritos en el ejemplo 3b y las curvas ajustadas con el programa GraphPrism versión 4.

IV. Síntesis de péptidos miméticos de EPO bivalentes Síntesis automatizada de la SEQ ID NO 11 (AGEMll) La síntesis se lleva a cabo mediante un sistema de microondas Liberty (CEM) usando Rink-Amida-Resina (tasa de sustitución de 0.19 mmol/g) a una escala de 0.25 mmol.

La remoción e los grupos Fmoc se logra por el tratamiento doble con 10 ml de piperidina/DMF (1:3) e irradiación con 50W durante 10x10 seg. El acoplamiento de los aminoácidos se logra por tratamiento doble con un exceso de 4 veces de aminoácido en DMF PyBOP/HOBT/DIPEA como aditivos de acoplamiento e irradiación con 50W durante 5x30 seg. Entre todos los ciclos de irradiación la solución es enfriada burbujeando nitrógeno a través de la mezcla de reacción. Después de la desprotección y acoplamiento, la resina es lavada 6 veces con 10 ml de DMF. Después del ciclo de acoplamiento doble todos los grupos amino sin reaccionar son bloqueados por tratamiento con un exceso de 10 veces de N- (2-Clorobenciloxicarboniloxi) succinimida (solución al 0.2M en DMF) e irradiación con 50W durante 3x30 seg. Después de la desprotección del último aminoácido, el péptido es acetilado por incubación con 0.793 ml de solución coronante (4.73 ml de anhídrido acético y 8.73 ml de DIEA en lOOml DMSO) durante 5 minutos. Antes de la escisión la resina es entonces lavada 6 veces con lOml de DMF y 6 veces con lOml de DCM. La escisión del péptido crudo se logra por tratamiento con 5ml de TFA/TIS/EDT/H20 (94/1/2.5/2.5) durante 120 minutos bajo una atmósfera inerte. Esta solución es filtrada en 40ml de éter frío, el precipitado disuelto en acetonitrilo/agua (1/1) y el péptido es purificado por RP-CLAP (Kromasil 100 C18 107'm, 250x4.6mm). El esquema de purificación de AGEMll lineal, Kromasil 100 C18 lOUm, 250x4.6mm y el gradiente usado es descrito por lo tanto en las figuras 8 y 9 de 5% a 50% de acetonitrilo (TFA al 0.1%) en 50 minutos Ciclización del AGEMll lineal GG-cotra.

Se disuelven 30mg del péptido lineal en 60ml de solución A. Esta solución y 60ml de DMSO se agrega por goteo a 60ml de solución A (tiempo total para la adición: 3h) . Después de 48h los solventes son removidos por evaporación y el residuo restante disuelto en 30ml de DMSO/agua (1/1) . Se agregan 30ml de ácido acético y 17mg de yodo (disuelto en DMSO/agua (1/1) y la solución es mezclada durante 90 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se agregan 20mg de ácido ascórbico y los solventes son removidos por evaporación. La mezcla cruda es disuelta en acetonitrilo/agua (2/1) y el péptido es purificado por RPHPLC (Kromasil 100 C18 lOµ , 250x4.6mm). Solución A: Acetonitrilo/agua (1/1) que contiene 0.1% de TFA. El pH es ajustado a 8.0 mediante la adición de bicarbonato de amonio. Los parámetros de purificación de AGEMll cíclicos se dan en las figuras 10 y 11 (esquema: Purificación de AGEMll cíclico, Kromasil 100 C18 lOµm, 250x4.6mm, gradiente de 5% a 35% de acetonitrilo (0.1% TFA) en 50 minutos).

V. Ensayo de proliferación in vitro para determinar la actividad de la EPO Las células TF1 en fase de crecimiento logarítmica (2.105 -1.106 células/ml crecidas en RPMI con 20% de suero de carnero fetal (FCS) y 0.5 ng/ml de IL-3) fueron contadas, y el número de células necesarias para efectuar el ensayo fue centrifugada (5 min. 1500 rpm) y resuspendidas en RPMI con 5% de FCS sin IL-3 a 300 000 células/ml. Las células fueron precultivadas en este medio (agotamiento) sin IL-3 durante 48 horas. Antes de comenzar el ensayo las células fueron contadas nuevamente. Brevemente antes de comenzar la solución patrón de ensayo de péptidos y EPO fueron preparadas. Los péptidos fueron pesados y disueltos en RPMI con 5% de FCS hasta una concentración de ImM, 467 µM o 200 µM. Las soluciones patrón de EPO fueron de 10 nM o 20 nM. Doscientos noventa y 2 µl de esas soluciones patrón fueron pipeteados en un pozo de una placa de cultivo de 96 pozos - se tomó una placa para cada sustancia a ser probada. Se pipetearon 200 µl de RPMI con 5% de FCS en otros diecisiete pozos en cada placa. Se pipetearon a noventa y dos µl de solución patrón en un pozo que contenía 200 µl de medio. El contenido fue mezclado, y se transfirieron 92 µl de este pozo al siguiente, y así sucesivamente. De esta manera se prepare una solución en serie (18 diluciones) de cada sustancia de modo que en cada pozo consecutivo hubiera una concentración de l:VlO de la concentración del pozo anterior. De cada pozo se transfirieron 3 x 50 µl a 3 pozos vacíos. De esta manera se midió la concentración de cada sustancia por cuadruplicado. Nótese que la línea más superior y la más inferior de pozos de cada placa se dejó vacía. Las células pretratadas (agotadas) fueron centrifugadas (5 min. 1500 rpm) y resuspendidas en RPMI con 5% de FCS a una concentración de 200 000 células por ml . Se agregaron cincuenta µl de suspensión celular (con un contenido de 10 000 células) a cada pozo. Nótese que debido a la adición de las células, las concentraciones finales de las sustancias en los pozos fueron la mitad del intervalo de dilución original. Las placas fueron incubadas durante 72 h a 37°C en 5% de C02. Antes de comenzar la evaluación, se prepara un intervalo de dilución de cantidades conocidas de células de TF-1 en pozos: 0/2500/5000/10000/20000/50000 células/pozo fueron pipeteadas (en 100 µl de RPMI + 5% de FCS) por cuadruplicado . Para medir el número de células vivas por pozo, se descongeló el reactivo MTT listo para usarse (Promega, Ensayo de Proliferación Celular en Una Solución Acuosa es el CellTiter 96) en un baño de agua a 37°C. Por pozo, se agregaron 20 µl de reactivo MTT, y las placas fueron incubadas a 37°C en 5% de CO? durante otras 1-2 horas. Se agregaron veinticinco µl de una solución de SDS al 10%, las placas fueron medidas en un lector de ELISA (Genios, Tecan) . Los datos fueron procesados en hojas de cálculo (Excel) y graficados en Graphpad. Los datos se resumen en la figura 12. ED50 (nM) : EPO 0.0158 BB49 (monómero, SEC. ID NO 2) 4113 AGEMll (bivalente) 36.73 VI . Ensayos Peptídicos Extendidos En un ensayo extendido, se probaron aproximadamente 200 secuencias peptídicas por su actividad mimética de EPO. Los péptidos fueron sintetizados como amidas peptídicas sobre un sistema sintetizador LIPS-Vario. La síntesis fue efectuada en placas de síntesis MTP especiales, la escala fue de 2 µmol por péptido. La síntesis siguió el protocolo de Fmoc estándar usando HOBT como reactivo activador. Los pasos de acoplamiento fueron efectuados como un acoplamiento de 4 veces. Cada paso de acoplamiento tomó 25 min y el exceso de aminoácidos por paso fue de 2.8. La escisión y desprotección del péptido se efectuó con una solución de escisión que contenía 90% de TFA, 5% de TIPS, 2.5% de H:0 y 2.5% de DDT. La placa de síntesis que contenía el péptido terminado unido a las resinas fue almacenada en la parte superior de una placa de 96 pozos profundos, se agregaron 50 µl de solución de escisión a cada pozo y la escisión fue efectuada durante 10 minutos, este procedimiento fue repetido tres veces. El péptido escindido fue eluido con 200 µl de solución de escisión por flujo por gravedad hacia la placa de pozos profundos. La desprotección de la función de la cadena lateral se efectuó durante otras 2.5 h dentro de la placa de pozos profundos. Posteriormente el péptido fue precipitado con éter/hexano enfriado en hielo y centrifugado. Los péptidos fueron disueltos en solución acuosa neutra y la cicli?ación se efectuó durante la noche a 4°C. Los péptidos fueron liofilizados. La Figura 19 da una vista general sobre los monómeros peptídicos sintetizados y probados. Los péptidos fueron probados por su actividad mimética de EPO en un ensayo de proliferación in vi tro . El ensayo fue efectuado como se describe bajo V. En cada día de ensayo, se prepararon 40 placas microtituladoras para medir la actividad in vi tro de 38 péptidos de prueba, 1 ejemplo de referencia y EPO en paralelo. Las soluciones patrón de EPO fueron de 20 nM. Los resultados se dan en la Figura 19. Como puede observarse de los resultados, los péptidos probados que no satisfacen el consenso de la presente invención no describieron actividad mimética de EPO.

VII. Síntesis de conjugados de HES peptídicos El esquema de reacción principal se explica en la Figura 21. El propósito principal del método descrito es la producción de un derivado de un almidón, de acuerdo a este ejemplo HES, el cual reacciona selectivamente con grupos tiol bajo condiciones de reacción acuosas, moderadas. Esta selectividad se logra con grupos maleimida. El HES es funcionalizado primero con grupos amino y convertido posteriormente al derivado de maleimida respectivo. Los lotes de reacción fueron liberados de reactivos moleculares inferiores vía ultramembranas . El producto, los productos intermedios así como todos los eductos están polidispersos .

Síntesis de amino-HES (AHES) El Hidroxietilalmidón (Voluven©) se logró vía diafiltración y posterior secado por congelamiento. El peso molecular promedio fue de aproximadamente 130 kDa con un grado de sustitución del 40 %. La síntesis fue efectuada de acuerdo a la síntesis descrita para amino dextran en la disertación de Jacob Piehler, "Modifizierung von Oberflachen fur die thermodynamische und kinetische Charakterisierung biomolekularer Erkennung mit optischen Transducem", 1997, incorporada aquí como referencia en su totalidad. La HES fue activada por oxidación selectiva parcial de los grupos hidroxilo diólicos a grupos aldehido con peryodato de sodio como el descrito en Floor et . al (1989). Los grupos aldehido fueron convertidos vía aminación reductiva con cianoborohidruro de sodio (NaCNBH3) en presencia de amoníaco hasta grupos amino (Yalpani and Brooks, 1995) . Abertura con peryodato: La cantidad usada de peryodato representa el 20% del número de bloques de construcción de glucosa (aplicando una masa del bloque de construcción de glucosa de 180 g/mol, DS = 0,4). El trabajo se efectuó vía ultrafiltración y secado por congelamiento. Aminación reductiva con NH4C1/Na [BH3CN] (en exceso) Trabajo vía precipitación del producto y diafiltración.

Análisis Cualitativo: Reacción con ninhidrina (prueba Kaiser) Cuantitativo: con ácido 2, 4 , 6-trinitrobenzol suifónico (TNBS) en comparación con un amino dextrano. El grado de sustitución logrado fue de alrededor el 2.8%. Esto da como resultado una masa molar de un bloque de construcción que contiene un grupo amino de aproximadamente 6400g/mol. 7 Síntesis de maleimidopropionil-amino- idroxietil almidón ("MalPA- HES") Síntesis Se usó ácido 3-maieimidopropiónico-N-hidroxí-succinimidéster (MalPA-OSu) en exceso (10 veces) (amortiguador de fosfato 50 mM, pH 7, 20% de DMF, durante la noche) , trabajando vía ultrafiltración y secado por congelamiento .

Análisis La reacción del grupo amino fue verficada con ninhidrina y TNBS. El número de grupos maleimida introducidos se demostró por reacción de glutation (GSH) y la detección del grupo tiol excesivos con reactivo de Ellmans (DNTB) y vía espectroscopia de :H-RMN a 700 MHz. El grado de sustitución logrado fue de aproximadamente 2% y corresponde a 8500 g/mol por bloque de construcción de maleimida (180 g/mol de masa de bloque de construcción de glucosa, DS= 0,4).

Conjugado de péptido-hidroxietilalmidón (Pep-AHES) Síntesis Se usó un péptido que contenía cisteína el cual tenía un Nd-terminal libre (Pep-IA) o biotinilado (Pep-IB) . Se convirtió una mezcla a 4:1 de Pep-IA/B durante la noche en exceso (aproximadamente 6 equivalentes con MalPA-HES en amortiguador de fosfato, 50 mM, pH 6.5/DMF 80:20; trabajando hasta que ocurrió con ultrafiltración y secado por congelamiento.

Análisis La absorción de UV fue determinada a 280 nm y el contenido restante de grupos maleimida fue determinado con GSH/DNTB. El rendimiento del péptido fue casi cuantitativo. Casi no fueron detectables grupos maleimida libres .

VIII . Ensayo de reactividad cruzada del anticuerpo Como se describió en la introducción de esta solicitud, los pacientes algunas veces desarrollaron anticuerpos contra rhuEPO. Esto conduce a las severas consecuencias descritas en la introducción. Para explorar mejor las propiedades de los péptidos de acuerdo a la invención se analizó si los péptidos en efecto reaccionan de manera cruzada con los anticuerpos anti-EPO. Se usaron sueros de conejo y humano que contenían anticuerpos anti-EPO para la prueba. Esos sueros fueron pretratados con EPO o los siguientes péptidos miméticos de EPO: Ac-C-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-Am (péptido de prueba 1) Ac-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-ñ (péptido de prueba 2) Ac= N-terminal acetilado Am= C-terminal anidado lnal = 1-naftilalanina Se usaron diferentes concentraciones de eritropoyetina y péptidos miméticos de EPO en el análisis. Después del pretratamiento los sueros con la sustancia de prueba para absorber los anticuerpos anti-EPO presentes en los sueros, los sueros fueron tratados con eritropoyetina marcada radioactivamente . Los anticuerpos restantes en los sueros después del paso de preadsorción son unidos por la eritropoyetina y nuevamente inmunoprecipitados. El protocolo usado para esta prueba se describe en Tacey et al., 2003, incorporado aquí como referencia. Los resultados de la preadsorción efectuada con los sueros que contienen anticuerpos anti-EPO usando EPO o péptidos miméticos de EPO de acuerdo a la invención se describen en la Figura 22. Cuando los sueros fueron pretratados con péptidos miméticos de EPO, los sueros probaron posteriormente ser positivos cuando se pusieron en contacto con eritropoyetina marcada radioactivamente. De este modo fueron detectados los anticuerpos anti-EPO en los sueros sin importar el pretratamiento. Esto significa que los péptidos miméticos de EPO no fueron capaces de unirse a los anticuerpos anti-EPO durante el pretratamiento. En ausencia de una actividad de unión, los anticuerpos anti-EPO no fueron eliminados del suero junto con los péptidos miméticos de EPO y de este modo permanecieron en los sueros. Los anticuerpos anti-EPO no fueron capaces de reconocer y de este modo unirse a los péptidos miméticos de EPO. La EPO humana recombinante (rhuEPO) fue usada como control. Cuando los sueros fueron pretratados con eritropoyetina, muchos anticuerpos no fueron detectables en el ensayo subsecuente incorporando eritropoyetina marcada radioactivamente puesto que los anticuerpos todavía estaban unidos y fueron eliminados por el pretratamiento con eritropoyetina . Los valores numéricos descritos en la Figura 22 representan el %cpm de los conteos totales usados en IP. Un suero es evaluado como positivo cuando el valor del %cpm es > 0.9. 100% de cpm representa la cantidad de conteos usados totales (el trazador radioactivo) , actualmente el EPO marcado radioactivamente. El ensayo demuestra que los péptidos miméticos de EPO de acuerdo a la invención describen, de manera ventajosa la ausencia de radioactividad cruzada a anticuerpos anti-EPO. Los péptidos miméticos de EPO descritos aquí describirán de este modo un efecto terapéutico aún en pacientes que desarrollaron anticuerpos contra rhuEPO. Además, se espera que los anticuerpos contra péptidos miméticos de EPO no se unan a la eritropoyetina. Los péptidos miméticos de EPO de acuerdo a esta invención son de este modo, preferiblemente, también caracterizados porque no muestran reactividad cruzada significativa con anticuerpos anti EPO.

Referencias : Wrighton NC, Balasubramanian P, Barbone FP, Kashyap AK, Farrell FX, Jolliffe L, Barrett RW, Dower WJ (1997) Increased potency of an erythropoietin peptide mimetic through covalend dimerization . Nature Biotechnology :1261-1265 Wrighton MC, Farrell FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barrett RW, Jolliffe LK, Dower WJ (1996) Small Peptides as Potent Mimetics of the Protein Hormone Erythropoietin. Science 273:458-463 Johnson, D. L., F. X. Farrell, et al. (1997). "Amino-terminal dimerization of an erythropoietin mimetic peptide results in increased erythropotietic activity." Chemistry and Biology 4: 939-950.

Haag R, Sunder A, Stumbe JF, J. Am. Chem. Soc. (2000), 122, 2954. Roberts, M. J. , M. D. Bentley, et al. (2002). "Chemistry for peptide and protein PEGylation." Advanced Drug Delivery Review 54(4): 459-476. Richard Tacey, Anthony Greway, Janice Smiell, David Power, Arno Kromminga, Mohamed Daba, Nicole Casadevall and Marian Kelley: The detection of anti-erythropoietin antibodies in human serum and plasma - Part I. Validation of the protocol for a radíoi munoprecípitation assay; J Immunol "Methods. 2003 Dec;283(l-2) :317-29. Zalipsky S, Qazen, S, Walker II JA, Mullah N, Quinn YP, (1999) "New detachable poly (ethylene glycol) conjugates: Cystei e-cleavable lipopolymers regenerating natural phospholipid, diacyl phosphatidylethanolamine, Bioconjug. Chem. 10: 703- 707. Zhao, X. et al (1997), "Novel Degradable Poly (ethylene glycol) esters for drug delivery." In "Poly (ethylene glycol) chemistry and biological applications; Harris JM, Zalipsky, S. Eds.; ACS Symposium Series 680; American Chemical Society: Washington DC, 1997; 458-472.

Claims (55)

1. REIVINDICACIONES 1. Péptido de al menos 10 aminoácidos de longitud, capaz de unirse al receptor de EPO, que comprende una actividad agonista, caracterizado porque el 5 peptidomimético de EPO no comprende prolina en la posición referida como en la posición 10 del peptidomimético de EPO, sino un aminoácido cargado positivamente.
2. 2. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque el peptidomimético de EPO contiene un 10 motivo de aminoácido característico para una estructura plegada (motivo de vuelta beta) , donde el péptido no comprende una prolina en el motivo de vuelta beta, en la posición 10 sino un aminoácido cargado positivamente, preferiblemente K. ^.5
3. 3. Péptido según la reivindicación 1, caracterizado porque las posiciones 9 y 10 están ocupadas por ácido 5-aminolevulínico (5-Als) 5-Als
4. 4. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el péptido contiene un aminoácido cargado positivamente, preferiblemente K o Har, en la 5 posición 17.
5. 5. Péptido que es capaz de unirse al receptor de EPO que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8X9X10 11 12X13 14 15 donde cada aminoácido se selecciona de aminoácidos naturales y no naturales y X6 es C, A, E, ácido a-amino-y-bromobutírico u homocisteína (hoc) ; X7 es R, H, L, W o Y o S; Xß es M, F, I, homoserinmetiléter o norisoleucina; Xs es G o un intercambio conservativo de G; Xao es un intercambio no conservativo de prolina; o Xg y X10 están sustituidos por un solo aminoácido; Xn es seleccionado independiente de cualquier aminoácido; X12 es T o A; X13 es W, 1-nal, 2-nal, A o F; X14 es D, E, I, L o V; X15 is C, A, K, ácido ee-amino-y-bromobutírico u homocisteína (hoc) siempre que cualquiera de X6 o X?5 sea C u hoc. 6. Péptido según la reivindicación 5, caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos: X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15 donde cada aminoácido está indicado por la abreviación de una letra estándar y X6 es C;
6. X7 es R, H, L o W; X8 es M, F o I; X9 es G o un intercambio conservativo de G; X10 es un intercambio no conservativo de prolina; Xn es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido X12 es T; X13 es W; X?4 es D, E, I, L o V; X15 es C; O donde X9 y X10 están sustituidos por un aminoácido solo O donde dicho péptido está caracterizado por la siguiente secuencia de aminoácidos: X5X7X8X9X10X11X12X13X14 15 Xe es C; X7 es R, H, L o W; Xa es M, F o hsm (metiléter de homoserina) ; X9 es G o un intercambio conservativo de G; X10 es un intercambio no conservativo de prolina; Xn es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido; X12 es T; X?3 es W; X14 es D, E, I , L o V, 1-nal (1-naftílalanina) o 2-nal (2-naftilalanina) ; X15 es C;
7. 7. Péptido según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizado porque Xio es un aminoácido con una cadena lateral cargada positivamente, preferiblemente, R, K o un aminoácido no natural respectivo preferiblemente Har, o X9 y Xio están sustituidos por un solo aminoácido, preferiblemente por ácido 5-aminolevulínico (Ais) o ácido aminovalérico.
8. 8. Péptido según una de las reivindicaciones precedentes que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos X4X5XgX7X8X9 l?Xl 1X12 13X14 15 donde Xg a X15 tienen los significados anteriores y donde X4 es Y; X5 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido y es preferiblemente A, H, K, L, M; S, T o I.
9. 9. Péptido según la reivindicación 8, que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 3XX5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18 donde X a X3.5 tienen un significado anterior y donde X3 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente D, E, L, N, S, T o V; Xi6 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente G, K, L, Q, R, S o T, X17 es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido, preferiblemente A, G, P, R, K, Y o un aminoácido no natural con una cadena lateral cargada de manera positiva, de manera más preferida homoarginina; Xxs es seleccionado independientemente de cualquier aminoácido.
10. 10. Péptido según una de las reivindicaciones precedentes, donde Xß es C, E, A o hoc, preferiblemente C y/o X7 es R, H o Y y/o X8 es F o M y/o X9 es G o A, preferiblemente G y/o X?o es K o Har y/o Xn es V, L, I, M, E, A, T o norisoleucina y/o Xi2 es T y/o X?3 es W y/o X?4 es D o V y/o X?5 es C o hoc, preferiblemente C y/o Xi7 es P, Y o A o K o Har.
11. 11. Péptido según la reivindicación 1 ó 5 que comprende una secuencia de aminoácidos que es seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO 2: GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG SEQ ID NO 4: GGTYSCHFGKLTWVCKPQGG SEQ ID NO 7: GGTYSCHF- (Ais) -LTWVCKPQGG SEQ ID NO 8: GGTYSCHF- (AIS) -LTWVCKKQGG Con ácido 5-aminolevulínico (Ais) : 5-Als
12. 12. Péptido según al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, donde el péptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de: GGTYSCHFGRLTWVCKPQGG
13. GGTYSCHFGRLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG CGGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG CGGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG GGTYSCSFGKLTWVCK-Har-QGG GGTYSCHFG-Har-LTWVCK-Har-QGG GGTYSCHMGKLTXVCKKQGG GGTYTCHFGKLTXVCKKLGG
14. GGLYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHMGKLTWVCRKQGG GGLYSCHFGKLTXVCQKQGG GGTYSCHFGKLTWVCQKQRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQRG
15. GGLYACHFGKLTWDCQKQGG GGTYTCHFGKLTUVCKKQGG GGTYSCHFGKLTUVCKKLGG GGTYSCHFGKITXVCKKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKLGG
16. GGLYACHFGKLTUVCKKQGG GGLYSCHMGKLTWLCKKLGG GGTYSCRFGKLTWVCKKQGG GGTYTCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCKKQGG
17. GGLYACHFGKLTULCKKQGG GGLYSCHFGKLTWVCKKQRG GGTYTCHFGKITXVCKKQGG GGTYTCHMGKLTWVCKKQRG GGLYSCHFGKLTXVCKKQRG
18. GGTYTCHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHFGKITUVCKKQGG GGLYSCHFGKLTXVCRKQGG GGTYACHFGKLTXVCKKLGG GGLYACHFGKLTXVCRKQGG
19. GGTYACHFGKLTXVCKKQGG GGLYSCHMGKLTXVCRKQGG GGLYSCHFGKLTUVCKKQRG GGLYSCHMGKLTXVCKKQGG GGTYTCHMGKLTXVCKKQGG
20. GGLYSCHFGKLTXVCRKQRG GGTYSCHFGKLTXVCKKQGG GGTYSCHFGKLTWVCKKQRG GGTYACHFGKLTWVCKKQRG GGLYSCHFGKLTWVCQKQRG
21. GGTYTCHFGKLTXVCKKQRG donde X es 1-naftilalanina y U es 2-naftilalanina. 13. Péptido según al menos una de las reivindicaciones 1 a 12 anteriores, caracterizado porque el péptido es modificado por un intercambio conservativo de un solo aminoácido, donde, preferiblemente, no más de 1, 2 ó 3 aminoácidos son intercambiados. 14. Péptido según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque el péptido no reacciona de manera cruzada con anticuerpos anti-EPO. 15. Péptido según al menos una de las reivindicaciones 1 a 14, donde el péptido es modificado, donde la modificación es seleccionada preferiblemente del grupo que consiste de acetilación (Ac) y/o amidación (Am) N-terminal y/o C-terminal, ciclización intramolecular, preferiblemente vía enlaces disulfuro intramoleculares y/o fosforilación, donde una modificación de la glicina C-terminal como N-metilglicina (meG) y glicina N-terminal como N-acetilglicina (AcG) es especialmente preferida y/o donde el péptido es unido a una porción polimérica, donde la porción es selecciona preferiblemente del grupo que consiste de polietilen glicol, dextran y almidones. 16. Péptido según al menos una de las reivindicaciones precedentes, donde el péptido forma un monómero, dímero o multímero de las secuencias peptídicas definidas anteriormente. 17. Péptido según la reivindicación 16, donde los dímeros o multímeros son homo- o heterodímeros con una estructura ramificada o no ramificada y donde las unidades peptídicas monoméricas se enlazan entre sí N-terminal a N-terminal, C-terminal a C-terminal o N-terminal a C-terminal. 18. Péptido según una de las reivindicaciones 15 ó 17, donde el péptido comprende un enlazante y/o unidad separadora. 19. Péptido sintético con una cadena peptídica continua que comprende al menos dos dominios con una capacidad de unión a un receptor donde los dominios comprenden una secuencia de aminoácidos como se define en las reivindicaciones 1 a 14 y 55. 20. Péptido sintético según la reivindicación 19, que comprende al menos dos dominios de unión heterogéneos , 21. Péptido sintético según las reivindicaciones 19 ó 20, que comprende una porción enlazante (enlazante) de aminoácidos residuales naturales o no naturales.
22. 22. Péptido sintético según una de las reivindicaciones 19 a 21, donde la porción enlazante comprende de 3 a 5 residuos de glicina y/o alanina y derivados de los mismos.
23. 23. Péptido sintético según una de las reivindicaciones 19 a 22, donde el enlazante es proporcionado por aminoácidos que forman parte del dominio de unión.
24. 24. Péptido sintético según la reivindicación 19, donde el péptido comprende una secuencia peptídica seleccionada de GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG-GGTYSCHFGKLTWVCKKQGG GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG-GGTYSCHFGKLT-lnal-VCKKQRG o una de las secuencias peptídicas definidas en las reivindicaciones 1 a 14, donde el péptido contiene opcionalmente un aminoácido adicional, preferiblemente uno con una cadena lateral reactiva como la cisteína en el N-terminal y donde el péptido comprende opcionalmente un puente disulfuro intramolecular entre la primera y segunda y/o tercera y cuarta cisteínas si están presentes en la secuencia respectiva.
25. 25. Dímero o multímero peptídico que comprende al menos a. un primer péptido b. un segundo péptido y c. preferiblemente una porción enlazante (enlazante) conectando el primer y segundo péptidos, donde al menos uno de los péptidos comprende una unidad peptídica que comprende una secuencia de aminoácidos como se define en una de las reivindicaciones 1 a 14, 24 ó 55.
26. 26. Dímero o multímero peptídico según la reivindicación 25, donde el C-terminal del primer péptido está unido covalentemente al N-terminal del segundo péptido o el C-terminal del péptido está unido covalentemente al C- terminal del segundo péptido o el N-terminal del primer péptido está unido covalentemente al N-terminal del segundo péptido.
27. 27. Dímero o multímero peptídico según la reivindicación 25 ó 26, donde el enlazante comprende una secuencia de aminoácidos naturales y/o no naturales, preferiblemente glicina, alanina o derivados de los mismos.
28. 28. Dímero o multímero peptídico según la reivindicación 25 a la reivindicación 27, donde el enlazante/unidad separadora contiene una unidad de dicetopiperacina .
29. 29. Dímero o multímero peptídico según la reivindicación 26, donde el enlazante es un bloque de construcción de diacilo bivalente, preferiblemente un bloque de construcción de diacilo derivado de un ácido dicarboxílico alifático.
30. 30. Dímero o multímero peptídico según la reivindicación 25, donde la cadena lateral de aminoácidos del primer péptido está unida covalentemente a una cadena lateral de aminoácidos del segundo péptido.
31. 31. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 30, que comprende además un polímero soluble en agua unido covalentemente al péptido, siendo preferiblemente el polímero soluble en agua seleccionado del grupo que consiste de polietilen glicol, dextranos o almidones.
32. 32. Péptido según la reivindicación 31, donde la porción soluble en agua es PEG, preferiblemente con un peso molecular de al menos 10 kD, de manera más preferible de entre 20 y 60 KD.
33. 33. Compuesto que se une a moléculas objetivo, que comprende (i) al menos dos unidades peptídicas donde cada unidad peptídica comprende al menos dos dominios con una capacidad de unión a un blanco, y donde los dominios de unión comprenden una secuencia de aminoácidos definida en una de las reivindicaciones 1 a 14 ó 55; (ii) al menos una unidad de soporte polimérica; donde las unidades peptídicas están unidas a la unidad de soporte polimérica.
34. 34. Compuesto según la reivindicación 33, donde la unidad de soporte es o está comprendida de al menos un polímero dendrítico o lineal natural o sintético ramificado y es seleccionado preferiblemente del grupo que consiste de poliglicerinas, ácido polisialínico, dextranos, almidones o polietilen glicol o de otros polímeros solubles en agua biológicamente inertes.
35. 35. Compuesto según la reivindicación 33 o 34, donde la unidad de soporte comprende una unidad ramificante .
36. 36. Compuesto según la reivindicación 35, donde la unidad ramificante comprende glicerol o poliglicerol.
37. 37. Compuesto según al menos una de las reivindicaciones precedentes 33 a 36, donde la molécula de soporte tiene un peso molecular de al menos 5 kD, de manera preferible de 20 a 200 o 4000 kD y de 20 a 80 kD en el caso de que sean usados soportes más pequeños como el polietilen glicol.
38. 38. El compuesto según al menos una de las reivindicaciones precedentes 33 a 37, donde la unidad de soporte comprende al menos dos subunidades poliméricas, donde las subunidades poliméricas están conectadas entre sí vía al menos una estructura de enlazante covalente biodegradable .
39. 39. Compuesto según al menos una de las reivindicaciones precedentes 33 a 38, que comprende una primera unidad de soporte biodegradable, donde las unidades peptídicas y las segundas unidades de soporte poliméricas están unidas a la primera unidad de soporte polimérica.
40. 40. Compuesto según la reivindicación 39, donde la segunda unidad de soporte tiene un peso molecular más bajo que la primera unidad de soporte y donde de aproximadamente del 20 al 50% de los sitios de unión de la primera unidad de soporte, la cual es preferiblemente un hidroxialquilalmidón como el HES, están ocupadas con las segundas unidades de soporte las cuales son preferiblemente polietilen glicol de un peso molecular de aproximadamente 3 a lOkD.
41. 41. Compuesto según al menos una de las reivindicaciones anteriores 33 a 40, donde es usada una unidad de soporte polimérica modificada.
42. 42. Compuesto según la reivindicación 41, donde la unidad peptídica se une vía un enlace covalente a la unidad de soporte polimérica y . la unión ocurre vía un aminoácido reactivo, el grupo amino N-terminal y/o el ácido carboxílico C-terminal de las unidades peptídicas, donde el aminoácido reactivo seleccionado preferiblemente del grupo que consiste de lisina, cisteína, histidina, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, treonina y tirosina y donde en el caso de que el polímero no posea un grupo de acoplamiento reactivo apropiado, es usada una sustancia de acoplamiento para modificar la unidad de soporte polimérica, donde la sustancia de acoplamiento es seleccionada preferiblemente del grupo que consiste, preferiblemente de grupos acilantes que reaccionan con los grupos amino de la unidad peptídica, grupos alquilantes los cuales reaccionan con grupos sulfhidrilo (mercapto) , tiometilo, imidazo o amino sobre la unidad peptídica, de manera más preferible grupos maleimida, grupos que forman éster y amida los cuales reaccionan con un grupo carboxilo de la unidad peptídica, grupos que forman disulfuro los cuales reaccionan con los grupos sulfhidrilo sobre la unidad peptídica, como los grupos 5, 5' -ditiobis (2- nitrobenzoato) y grupos alquilmercaptano, y grupos dicarbonilo, como los grupos ciclohexandiona, y otros grupos de 1,2-dicetona los cuales reaccionan con las porciones de guanidina de la unidad peptídica, grupos diazo, los cuales reaccionan con grupos fenólicos sobre el péptido; y grupos reactivos de la reacción de bromuro de cianógenos con el polímero, los cuales reaccionan con grupos amino sobre la unidad peptídica.
43. 43. Compuesto según la reivindicación 42, donde el aminoácido reactivo es cisteína y donde el grupo de acoplamiento es maleimida.
44. 44. Compuesto según al menos una de las reivindicaciones precedentes 33 a 43, donde los dominios de unión de las unidades peptídicas se conectan internamente vía una estructura del enlazante.
45. 45. Compuesto según la reivindicación 44, donde el enlazante es un enlazante peptídico continuo.
46. 46. Uso de un péptido y/o compuesto según al menos una de las reivindicaciones 1 a 45 o 55 para la preparación de una composición farmacéutica.
47. 47. Uso de un péptido y/o compuesto según al menos una de las reivindicaciones 1 a 45 o 55 para la preparación de una composición farmacéutica para la prevención o tratamiento de un trastorno que se caracteriza por una deficiencia de eritropoyetina o una población de células sanguíneas rojas baja o defectuosa o es tratable por la administración de eritropoyetina y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia o apoplejía.
48. 48. Uso de un péptido y/o compuesto según al menos una de las reivindicaciones 1 a 45 o 55 para la prevención o tratamiento de un trastorno que se caracteriza por una deficiencia de eritropoyetina o una población de células sanguíneas rojas baja o defectuosa o es tratable por la administración de eritropoyetina y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia o apoplejía.
49. 49. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según al menos una de las reivindicación 1 a 45 o 55 y opcionalmente un soporte farmacéuticamente aceptable.
50. 50. Composición farmacéutica según la reivindicación 49, para la prevención o tratamiento de un trastorno que se caracteriza por una deficiencia de eritropoyetina o una población de células sanguíneas rojas baja o defectuosa o es tratable por la administración de eritropoyetina y especialmente para el tratamiento de cualquier tipo de anemia o apoplejía.
51. 51. Método para la producción de un compuesto según al menos una de las reivindicaciones 33 a 45, que comprende (i) generar al menos dos unidades peptídicas, donde cada unidad peptídica comprende al menos dos dominios con una capacidad de unión a un receptor; (ii) generar al menos una unidad de soporte polimérica; (iii) unir las unidades peptídicas a la unidad de soporte polimérica.
52. 52. Método según la reivindicación 51, donde las unidades peptídicas son sintetizadas como una cadena peptídica continua.
53. 53. Método según la reivindicación 51 o 52, donde la unidad de soporte polimérica que es usada tiene al menos un grupo químico sobre la misma el cual es capaz de reaccionar con un grupo químico disponible sobre la unidad peptídica, y entonces reaccionar junto con la unidad de soporte polimérica reactiva y la unidad peptídica para formar un complejo unido covalentemente de los mismos utilizando el grupo químico de la unidad de soporte polimérica.
54. 54. Acido nucleico que codifica para un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y 16.
55. 55. Péptido, caracterizado porque es un péptido inverso y/o retro/inverso de los péptidos según al menos una de las reivindicaciones 1 a 14 o un péptido respectivo que consiste totalmente de D-aminoácidos. 10 15 Z O 25