MXPA01012974A - Conjugados de eritropoyetina con poletilenglicol. - Google Patents

Abstract

Se describen conjugados de la glucoproteina eritropoyetina, los conjugados comprenden una glucoproteina eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biologica in vivo con la que consigue que las celulas de la medula osea incrementen la produccion de reticulocitos y globulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y analogos de la misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada mediante la adicion de entre 1 y 6 sitios de glucosilacion o mediante la nueva disposicion de al menos un sitio de glucosilacion; la glucoproteina se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi-inferior poli(etilen glicol), cada grupo poli(etilen glicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteina mediante un conector con la formula -C(O)-X-S-Y-, con el C(O) del conector que forma un enlace de amida con uno de los grupos amino, en donde X e Y son tal como se han definido en la descripcion y reivindicaciones, el valor promedio del peso molecular de cada porcion de poli(etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 20 kilodaltons y alrededor de 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado se encuentra entre alrededor de 51 kilodaltons y alrededor de 175 kilodaltons.

Description

CONJUGADOS DE ERITROPOYETINA CON POLIETILENGLICOL e Antecedentes de la Invención 5 La eritropoyesis es la producción de glóbulos rojos, que se produce con el objetivo de contrarrestar la destrucción celular. La eritropoyesis es un mecanismo fisiológico controlado, que proporciona suficientes glóbulos rojos necesarios para una oxigenación tisular adecuada. La 10 eritropoyetina humana producida de forma natural (hEPO) es una glucoproteina que contiene 165 aminoácidos que se produce en el riñon y es el factor plasmático humoral que estimula la producción de glóbulos rojos (Carnot, P and Deflandre, C (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, AJ (1953 Blood 5 8:349; Reissmann, KR (1950) Blood 5:372; Jacobson, LO, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, LF (1957) Nature 179:6331- 4) . La EPO humana estimula la división y diferenciación de los progenitores eritrociticos o eritroides específicos en la médula ósea. La EPO humana ejerce su actividad biológica 0 mediante la unión a receptores en los precursores eritrociticos o eritroides (Krantz, BS (1991) Blood 77:419). La eritropoyetina humana que se produce de forma natural es una glucoproteina acidica presente en bajas concentraciones en el plasma, para estimular la sustitución de los glóbulos 5 rojos que se van perdiendo con el envejecimiento. REF. 134838 La eritropoyetina se ha producido biosintéticamente mediante el uso de la tecnologia del ADN recombinante (Egrie, JC, Strickland, TW, Lañe, J et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224) y es el producto de un gen clonado de la EPO humana, insertado y expresado en células de tejido de ovario de hámster chino (células CHO) . La EPO humana que se produce de forma natural en primer lugar es traducida a una cadena polipeptidica de 166 aminoácidos con arginina 166. Por una modificación post-traduccional, la arginina 166 es escindida por una carboxipeptidasa. La estructura primaria de la EPO humana (165 aminoácidos) se ilustra en la Figura 1. La estructura primaria de la EPO humana (166 aminoácidos) se ilustra en la Figura 2. Hay dos puentes disulfuro entre Cys2-Cys161 y Cys29-Cys33. El peso molecular de la cadena polipeptidica de la EPO humana sin las porciones de los azúcares es 18,236 Da. En la molécula intacta de la EPO, aproximadamente el 40% del peso molecular viene dado por los grupos de carbohidrato (Sasaki, H. Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059). Debido a que la eritropoyetina humana es esencial en la formación de glóbulos rojos, la hormona es útil en el tratamiento de los trastornos sanguineos caracterizados por la baja o defectuosa producción de glóbulos rojos. Clínicamente, la EPO es utilizada en el tratamiento por ejemplo de la anemia en pacientes con fallo renal crónico 4 ' kí?t.

(CRF) (Eschbach, JW, Egri, JC, Downing, MR et al. (1987) NEJM 316:73-78; Eschbach, JW, Abdulhadi, MH, Browne, JK et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111:992; Egrie, JC, Eschbach, JW, McGuire, T. Adamson, JW (1988) Kidney Intl. 33:262; Lim, VS, Degowin, RL, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110:108-114) y en pacientes con SIDA y cáncer que han sido tratados con quimioterapia (Danna, RP, Rudnick, SA, Abéis, Rl In: MB, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: p. 301-324) . Sin embargo, la disponibilidad biológica de agentes terapéuticos basados en proteínas disponibles comercialmente tales como EPO, se encuentra limitada por su corta vida media en el plasma y por su susceptibilidad a la degradación por parte de proteasas. Estos defectos impiden que se pueda alcanzar una potencia clínica máxima.

Sumario de la Invención Según esto, la presente invención es una nueva clase de derivados de PEG de EPO. Los conjugados de PEG-EPO fisiológicamente activos de esta invención comprenden una glucoproteina eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre y que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y mdLAt&m~..k . LA & que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación; la glucoproteina se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi-inferior poli (etilenglicol) , cada grupo poli (etilenglicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteina mediante un conector con la fórmula -C(0)-X-S- Y-, con el C(O) del conector formando un enlace de amida con uno de los grupos amino, X es -(CH2)k- o - (CH2 (0-CH2-CH2) k-, k se encuentra entre 1 y 10, Y es el valor medio del peso molecular de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 20 kilodaltons y alrededor de 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado se encuentra entre alrededor de 51 kilodaltons y alrededor de 175 kilodaltons. Esta invención también proporciona composiciones que contienen conjugados descritos aqui, en las cuales el porcentaje de los conjugados en la composición en la que n es 1 es al menos del noventa por ciento. Si se comparan con las EPO no modificadas (es decir, EPO sin un PEG unido) y con los conjugados de EPO-PEG convencionales, los presentes conjugados tienen tanto una vida media de circulación como un tiempo de residencia en el plasma mayores, un menor aclaramiento, y una mayor actividad clínica in vivo. Los conjugados de esta invención presentan los mismos usos que la EPO. En concreto, los conjugados de esta invención son útiles para tratar pacientes mediante la estimulación de la división y diferenciación de los progenitores eritrociticos o eritroides específicos en la médula ósea por la misma via por la que se utiliza EPO para el tratamiento de los pacientes. La presente invención también incluye un método para el tratamiento de anemia en humanos. La presente invención también incluye un método para la preparación de productos de la glucoproteina eritropoyetina que comprende la reacción de forma covalente de un grupo e-amino de un aminoácido de lisina de una proteina eritropoyetina con un reactivo bifuncional para formar un producto intermedio con un enlace de amida. El reactivo bifuncional contiene un grupo reactivo y un grupo tiol protegido. Entonces el producto J..UÍ.Í.,Í.» A intermedio con un enlace de amida reacciona covalentemente con un derivado de polietilen glicol activado para formar el producto de la glucoproteina eritropoyetina de la presente invención.

Descripción de las Figuras Figura 1: Estructura primaria de la EPO humana (165 aminoácidos) . Figura 2: Estructura primaria de la EPO humana (166 aminoácidos) . Figura 3: Actividad in vivo de la EPO pegilada determinada mediante el ensayo normocitémico de ratón.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Los siguientes términos tendrán las definiciones mostradas a continuación: El término "proteina eritropoyetina", "eritropoyetina", "EPO" o "glucoproteina eritropoyetina" se refiere a una glucoproteina que presenta la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) o 2 (SEC ID NO: 2) o una proteina o polipéptido substancialmente homólogo a las mismas, cuyas propiedades biológicas se refieren a la estimulación de la producción de glóbulos rojos y a la estimulación de la división y diferenciación de los progenitores eritrociticos o eritroides específicos en la médula ósea. Tal como se emplea aqui, el término proteina EPO incluye las proteínas modificadas de forma deliberada, como por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio o de forma accidental, por mutaciones. Estos términos también incluyen análogos que presentan entre 1 y 6 sitios adicionales para la glucosilación, análogos que presentan al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la proteina, en donde el aminoácido o aminoácidos adicionales incluyen al menos un sitio de glucosilación y análogos que presentan una secuencia de aminoácidos que incluye una nueva disposición de al menos un sitio para la glucosilación, tales como por ejemplo los análogos revelados en la Publicación de Patente Europea No. 640 619. Estos términos incluyen tanto la eritropoyetina humana producida de forma natural como la producida de forma recombinante. El término "substancialmente homólogo" significa que una secuencia problema o sustancial particular, por ejemplo, una secuencia mutada, varia de una secuencia de referencia por una o más substituciones, supresiones o adiciones, el efecto neto de lo cual no da por resultado una diferencia funcional adversa entre las secuencias de referencia y problema. Para los propósitos de la presente ,^-fc fc.fcí-J invención, las secuencia con más del 95 por ciento de homología, propiedades biológicas equivalentes y caracteristicas de expresión equivalentes se consideran substancialmente homologas. Para propósitos de determinación de la homología, no se deberá considerar el truncamiento de la secuencia madura. Las secuencias con menores niveles de homología, bioactividad comparable y caracteristicas de expresión equivalentes son consideradas substancialmente equivalentes. El término "fragmento" de la proteina EPO significa cualquier proteina o polipéptido que presenta la secuencia de aminoácidos de una porción o fragmento de una proteina EPO, y la cual tiene la actividad biológica de la EPO. Los fragmentos incluyen proteínas o polipéptidos producidos por la degradación proteolitica de la proteina EPO o producida por la sintesis química mediante métodos rutinarios del campo. Una proteina EPO o un fragmento de la misma es biológicamente activa cuando la administración de la proteina o fragmento al hombre produce la estimulación de la producción de glóbulos rojos y la estimulación de la división y diferenciación de progenitores eritrociticos específicos en la médula ósea. La determinación de dicha actividad biológica de la proteina EPO se puede llevar a cabo mediante pruebas bien conocidas, convencionales, utilizadas para tales propósitos en una o más especies de mamíferos. Una prueba adecuada que se puede utilizar para demostrar ésta actividad biológica es la que se describe a continuación. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" es la cantidad de producto de la glucoproteina eritropoyetina necesaria para dar la actividad biológica in vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y de glóbulos rojos. La cantidad exacta del producto de la glucoproteina eritropoyetina es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de trastorno a tratar, el estado del paciente a tratar, asi como otros ingredientes de la composición. Las composiciones farmacéuticas que contienen los productos de la glucoproteina eritropoyetina se pueden formular con una potencia efectiva para la administración por varios medios a un paciente humano que experimente trastornos sanguíneos caracterizados por la baja o defectuosa producción de glóbulos rojos. Las cantidades promedio terapéuticamente efectivas del producto de la glucoproteina eritropoyetina pueden variar y en concreto deben estar basadas en las recomendaciones y prescripción de un médico calificado. La presente invención está dirigida a productos de la glucoproteina eritropoyetina que presentan una actividad biológica in vivo con la que consiguen que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos representados por la Fórmula 1: íkiiik ?í-Í-.-£tek-¡.l , t -'• »j*¿ fca??» >aiA.Jt-A¡ -.>.. j. - ... j.»a . -- - - --» >-. -s «. j¿matfa .<. . j-, ti tik bti P-[NH-CO-X-S-Y-(OCH2CH2)m-OR]n 1, en donde X e Y son tal como se han definido anteriormente, m se encuentra comprendido entre 450 y 900, n se encuentra comprendido entre 1 y 3, R es alquilo inferior y P es la glucoproteina eritropoyetina menos el grupo amino o grupos amino que forman un enlace de amida con X. Como se presenta en detalle a continuación, la preparación y purificación de la EPO son bien conocidos en el campo. Por EPO se denota la proteina natural o recombinante, preferiblemente humana, asi como la obtenida a partir de cualquier fuente convencional tal como tejidos, sintesis proteica, cultivo celular con células naturales o recombinantes. Se incluye cualquier proteina que presente actividad de EPO, tal como muteinas o proteínas modificadas de otra manera. La EPO recombinante se puede preparar mediante su expresión en las lineas celulares CHO-, BHK- o HeLa mediante la tecnología del ADN recombinante 0 mediante la activación génica endógena. Las especies preferidas de la EPO para la preparación de productos de la glucoproteina eritropoyetina son especies humanas de la EPO. Más preferiblemente, las especies de la EPO son la EPO humana que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) o Figura 2 (SEC ID NO: 2), siendo la más preferida la EPO humana que tiene la secuencia de aminoácidos presentada en la Figura 1 (SEC ID NO:l).

La proteina eritropoyetina humana también se puede modificar en al menos un sitio adicional para la glucosilación, por ejemplo entre 1 y 6 sitios de glucosilación adicionales, tales como, pero no limitadas a, las secuencias de aminoácidos presentadas a continuación. La siguiente anotación significa que la secuencia expuesta en la Figura 1 se ha modificado mediante la substitución del aminoácido nativo en la posición numerada con superindice por el aminoácido indicado a la izquierda del número en superindice. Asn30Thr32 Figura 1; Asn51Thr53 Figura 1; Asn57Thr59 Figura 1; Asn69 Figura 1; Asn69Thr71 Figura 1; Ser68Asn69Thr71 Figura 1 Val87Asn88Thr90 Figura 1 Ser87Asn88Thr90 Figura 1 Ser87Asn88Gly89Thr90 Figura 1; Ser87Asn88Thr90Thr92 Figura 1; Ser87Asn88Thr90Ala162 Figura 1; Asn , 6b93pThr -7'11Sc er .8B7'A, sn88Thr90 Figura 1 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90 Figura 1 ; Asn89Ile90Thr91 Figura 1 ; Ser87Asn88Ile90Thr91 Figura 1 ; fJT?ß; j¿.7rn.. t£i: ^é>S?é-J M Asn136Thr138 Figura 1; Asn138Thr140 Figura 1; Thr125 Figura 1; y Pro124Thr125 Figura 1. La proteina eritropoyetina humana también puede ser un análogo que tenga al menos un aminoácido adicional en el extremo carboxilo de la glucoproteina, en donde el aminoácido adicional incluye al menos un sitio de glucosilación, es decir la glucoproteina tiene una secuencia que comprende la secuencia de la eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al menos un sitio de glucosilación. El aminoácido adicional puede comprender un fragmento peptidico derivado del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica de humano. Preferiblemente, la glucoproteina es un análogo seleccionado del grupo que consiste en (a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln (SEC ID NO: 3), que se prolonga desde el extremo carboxilo; (b) el análogo en (a) que también comprende EPO Ser87 Asn88 Thr90; y (c) el análogo en (a) que también comprende EPO Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90. |al-ii-.*¿ U- U.

La proteina eritropoyetina humana también puede ser un análogo con una secuencia de aminoácidos que incluya una nueva disposición de al menos un sitio para la glucosilación. La nueva disposición puede comprender una supresión de cualquiera de los sitios de unión N a carbohidrato en la eritropoyetina humana y una adición de un sitio de unión N a carbohidrato en la posición 88 de la secuencia de aminoácidos de la eritropoyetina humana. Preferiblemente, la glucoproteina es un análogo seleccionado del grupo que consiste en EPO Gln24 Ser87 Asn88 Thr90; EPO Gln38 Ser87 Asn88 Thr90; y EPO Gln83 Ser87 Asn88 Thr90. Los análogos de eritropoyetina con sitios de glucosilación adicionales se revelan con más detalle en la Publicación de Patente Europea No. 640 619, de Elliot publicada el 1 de Marzo de 1995, los contenidos de la cual se encuentran incorporados aqui por referencia. En la fórmula 1, R puede ser cualquier alquilo inferior, lo que significa un grupo alquilo lineal o ramificado que presenta entre uno y seis átomos de carbono tales como metilo, etilo, isopropilo, etc. Un alquilo preferido es metilo. En la Fórmula 1, X es -(CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k-, en donde k se encuentra comprendido entre 1 y 10. Preferiblemente, k se encuentra entre 1 y 4, más preferiblemente, k es 1 o 2. Más preferiblemente, X es -(CH2).

En la Fórmula 1, Y es Preferiblemente Y es Más preferiblemente Y es 1*' A._.._.?«_ .k<-- En la Fórmula 1, el número m se selecciona tal que el conjugado resultante de la Fórmula 1 tiene una actividad fisiológica comparable a la EPO no modificada, cuya actividad puede representar la misma, más de, o una fracción de la actividad correspondiente de la EPO no modificada. m representa el número de residuos de óxido de etileno en la unidad de PEG. Una única sub-unidad PEG de -(OCH2CH2)- tiene un peso molecular de alrededor de 44 daltons. Asi, el peso molecular del conjugado (excluyendo el peso molecular de la EPO) depende del número m. Un peso molecular de "alrededor" de un cierto número significa que se encuentra dentro de un rango razonable de ese número tal como se ha determinado mediante técnicas analíticas convencionales, m es un número entero que se encuentra entre 450 y alrededor de 900 (correspondiendo al peso molecular de entre 20 y 40 kDa) , preferiblemente m se encuentra entre alrededor de 550 y alrededor de 800 (alrededor de 24 a 35 kDa) , y más preferiblemente m se encuentra entre alrededor de 650 y alrededor de 700 (alrededor de 29 y alrededor de 31 kDa) . En la Fórmula 1, el número n es el número de grupos e-amino de un aminoácido de lisina en una proteina eritropoyetina unida covalentemente a una unidad de PEG mediante un enlace de amida. Un conjugado de esta invención puede tener una, dos o tres unidades de PEG por molécula de EPO. n es un número entero que se encuentra comprendido entre JíL-t .i. ¿L ,«..»- . A I ALAJ 1 y 3, preferiblemente n es 1 o 2, y más preferiblemente n es 1. Los productos preferidos de la glucoproteina eritropoyetina se encuentran representados por las fórmulas: en donde P, R, X, m y n son tal como se han definido anteriormente . Los productos de la glucoproteina eritropoyetina más preferidos se encuentran representados por la fórmula: en donde P, R, X, M y n son tal como se han definido anteriormente . Otros productos de la glucoproteina eritropoyetina preferidos se encuentran representados mediante las fórmulas: en donde P y n son como se han definido anteriormente. Los productos de la glucoproteina eritropoyetina más preferidos se encuentran representados por la fórmula: en donde P y n son como se han definido anteriormente.

Los compuestos preferidos son aquellos en los que X es -(CH2)k-, especialmente aquellos en los que k se encuentra entre 1 y 4, más preferiblemente aquellos en los que X es -CH2-. La invención también se refiere a los conjugados anteriores en donde m es un número entero que se encuentra comprendido entre 550 y 800, preferiblemente m es un número entero entre 650 y 700. Los compuestos preferidos de la presente invención son aquellos en los que n es 1 y/o R es metilo. Además, la invención se refiere a los compuestos anteriores en los que el peso molecular medio de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 24 kilodaltons y alrededor de 35 kilodaltons, más preferiblemente alrededor de 30 kilodaltons. Además, la presente invención se refiere a compuestos en los que la glucoproteina se encuentra unida covalentemente a una o dos porciones de poli (etilen glicol) cuyo extremo es un alcoxilo inferior, más preferiblemente a una porción de poli (etilen glicol) cuyo extremo es un alcoxilo inferior. En una modalidad preferida, las porciones de poli (etilen glicol) presentan en su extremo un grupo metoxilo.

En la modalidad más preferida, la invención se refiere a los compuestos anteriores en los que X es -CH2-, m es un número entero que se encuentra entre 650 y 700, n es 1, R es metilo, y en los que el peso molecular promedio de cada porción de poli (etilen glicol) es alrededor de 30 kilodaltons. Todavia en otra modalidad, la invención se refiere a un método para el tratamiento de la anemia en humanos que comprende la administración a humanos de una cantidad terapéuticamente efectiva de un producto de la glucoproteina eritropoyetina representado por la Fórmula 1. Todavia en otra modalidad, la invención se refiere a un método para la preparación de un producto de la glucoproteina eritropoyetina, que presenta una actividad biológica in vivo que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos, dicho método comprende los pasos de: (a) la reacción de forma covalente entre un grupo e-amino de un aminoácido de lisina de una proteína eritropoyetina representada por la fórmula P-[NH2]n, con un reactivo bifuncional representado por la fórmula Z-CO-X-S-Q, para formar un producto intermedio que presenta un enlace de amida representado por la fórmula: P-[NH-CO-X-S-Q]n en donde P es una proteína eritropoyetina menos el grupo amino que forma un enlace de amida; n es un número entero que se encuentra comprendido entre 1 y 3; Z es un grupo reactivo, por ejemplo un éster del ácido carboxílico-NHS; X es (CH2)k- o -CH2 (0-CH2-CH2) k-, en donde k se encuentra comprendido entre alrededor de 1 y alrededor de 10; y Q es un grupo protector, como alcanoilo, por ejemplo acetilo. b) la reacción de forma covalente entre el producto intermedio que presenta un enlace de amida del paso (a) y un derivado de polietilen glicol activado, representado por la fórmula, W- [OCH2CH2]m-OR, para formar un producto de la glucoproteína eritropoyetina representado por la fórmula: en donde w es una forma reactiva sulfhidrila de Y; m es un número entero que se encuentra comprendido entre alrededor de 450 y alrededor de 900; R es alquilo inferior; e Y es ÍAttí&. .^kA.S.tiÉ^^^ En esta modalidad, el reactivo bifuncional es preferiblemente N-succinimidil-S-acetiltiopropionato o N-succinimidil-S-acetiltioacetato, Z es preferiblemente N-hidroxisuccinimida, y el derivado de polietilen glicol activado W- [OCH2CH2]m-OR se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en yodo-acetil-metoxi-PEG, metoxi-PEG-vinilsulfona y metoxi-PEG-maleimida. Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a una composición que comprende conjugados, cada uno de los conjugados comprende una glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre y que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo que consiste en la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la Í,,l AttA ,kk¿¿i*í-*l. - .. . . Zj*i ti. l:¡j eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o mediante la nueva disposición de al menos un sitio de glucosilación; la glucoproteína se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi inferior poli (etilenglicol) , cada grupo poli (etilenglicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un conector con la fórmula -C(0)-X-S-Y-, con el C(O) del conector que forma un enlace de amida con uno de los grupos amino, X es -(CH2) - o -CH2(0-CH2-CH2)k-, k se encuentra entre 1 y 10, Y es el valor promedio del peso molecular de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 20 kilodaltons y alrededor de 40 kilodaltons y el peso molecular del conjugado se encuentra entre alrededor de 51 kilodaltons iiíkíiS t.kÍ?Á.ít*¡ ...t.. k:,s¿*xíí.¿, .. .... a.^ &* &k y alrededor de 175 kilodaltons; y el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa por ciento. Preferiblemente la composición comprende conjugados como se han definido anteriormente en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa por ciento, más preferiblemente en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa y dos por ciento, e incluso más preferiblemente en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa y seis por ciento, y siendo la forma más preferida en donde el porcentaje de conjugados donde n es 1 se encuentra entre noventa y noventa y seis por ciento. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un conjugado o una composición tal como se ha definido anteriormente y un excipiente farmacéuticamente aceptable y al uso de un conjugado o una composición tal como se ha definido anteriormente para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) , y para el tratamiento de pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a quimioterapia. Además, la invención se refiere a un método para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de trastornos relacionados con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) , y pacientes con SIDA y cáncer que han la«iAajt>ájfa?á*a sido sometidos a la quimioterapia, que comprende el paso de administrar a un paciente una composición tal como se ha descrito anteriormente. La invención también se refiere a un proceso para la preparación de conjugados o una composición tal como se ha definido anteriormente, donde el proceso comprende la unión covalente de grupos tiol a una glucoproteína eritropoyetina y el acoplamiento de la glucoproteína eritropoyetina activada, resultante con un derivado de poli (etilen glicol) (PEG). Además, la invención se refiere a conjugados y composiciones tal como se han definido anteriormente siempre que se preparen mediante los procesos descritos anteriormente y a conjugados y composiciones tal como se han definido anteriormente para le tratamiento de enfermedades que están asociadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) y pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a la quimioterapia.

Métodos de Expresión de Proteínas EPO La eritropoyetina (EPO) es una glucoproteína humana que estimula la formación de eritrocitos. Su preparación y aplicación terapéutica son descritas en detalle por ejemplo en las patentes norteamericanas Nos. 5,547,933 y 5,621,080, EP-B 0 148 605, Huang, S.L., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B 0 205 564, EP-B 0 209 539 y EP-B 0 411 678 así como también por Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, y Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076. La eritropoyetina para usos terapéuticos se puede producir de forma recombinante (EP-B 0 148 605, EP-B 0 209 539 y Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lañe, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224). La expresión de proteínas, inclusive la EPO, mediante la activación génica endógena, es bien conocida en el campo y se revela, por ejemplo en las patentes norteamericanas Nos. 5,733,761, 5,641,670 y 5,733,746 y las publicaciones de patente internacionales Nos. WO 93/09222, WO 94/12650, WO 95/31560, WO 90/11354, WO 91/06667 y WO 91/09955, los contenidos de las cuales están incorporados aquí por referencia. Los métodos para la expresión y preparación de la eritropoyetina en un medio sin suero están descritos por ejemplo en WO 96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre de 1996, y en la Publicación de Patente Europea No. 513 738, de Koch publicada el 12 de Junio de 1992.

Métodos Para la Purificación de la Proteína EPO Humana Además de las referencias mencionadas anteriormente, se sabe que se puede llevar a cabo una fermentación libre de suero de células CHO recombinantes que contengan un gen de EPO. Tales métodos están descritos por ejemplo en EP-A 0 513 738, EP-A 0 267 678 y de forma general por Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A 0 248 656, Kowar, J. and Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B., Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A 0 481 791, EP-A 0 307 247, EP-A 0 343 635, WO 88/00967. En EP-A 0 267 678 se describe una cromatografía de intercambio iónico en S-Sepharose, una HPLC en fase inversa preparativa en una columna C8 y una cromatografía de filtración en gel para la purificación de la EPO producida en un cultivo sin suero tras realizar una diálisis. En esta relación, el paso de la cromatografía de filtración en gel se puede sustituir por la cromatografía de intercambio iónico en S-Sepharose fast flow. También se propone realizar una cromatografía con pigmento en una columna de Azul de Trisacrilo antes de la cromatografía de intercambio iónico. Se describe un proceso para la purificación de la EPO recombinante por Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359. En este proceso sin embargo, la EPO se trata con una solución de Tween® 20, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, etilmaleimida, pestatina A, sulfato de cobre y ácido oxámico de forma previa a los pasos de purificación. Múltiples referencias como WO 96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre de 1996, revelan un proceso para la preparación de eritropoyetina en un proceso de fermentación libre de suero (EPOsf) . A continuación se explica a modo de ejemplo un método para producir la EPO como material de partida para la pegilación.

Ensayo Biológico para Determinar la Actividad Específica de la EPO y Conjugados de EPO La actividad específica de la EPO o conjugados de EPO de acuerdo con esta invención se puede determinar mediante varios ensayos conocidos en el campo. La actividad biológica de las proteínas EPO purificadas de esta invención es tal que la administración de la proteína EPO por inyección a pacientes humanos consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos comparado con los grupos de sujetos no inyectados o de control. La actividad biológica de las proteínas EPO, o fragmentos de las mismas, obtenidas y purificadas de acuerdo con esta invención se pueden determinar por métodos de acuerdo con Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2) . Otro ensayo biológico para determinar la actividad de la proteína EPO, el ensayo normocitémico de ratón, se describe en el Ejemplo 4. lii?Á.¡k,tí. .-át Procesos Para la Preparación de la EPO Pegilada Los procesos para la preparación de productos de la glucoproteína eritropoyetina representada por la Fórmula 1 comprende la unión covalente de grupos tiol a la EPO ("activación") y el acoplamiento de la EPO activada resultante con un derivado de poli (etilen glicol) (PEG). El primer paso para la preparación de la EPO pegilada de acuerdo con la presente invención comprende la unión covalente de grupos tiol por grupos NH2 de la EPO. Esta activación de la EPO se lleva a cabo con reactivos bifuncionales que llevan un grupo tiol protegido y un grupo reactivo adicional, tal como esteres activos (por ejemplo un succinimidiléster) , anhídridos, esteres de ácido sulfónico, halogenuros de ácidos carboxílicos y ácidos sulfónicos, respectivamente. El grupo tiol está protegido por grupos conocidos en el campo, por ejemplo grupos acetilo. Estos reactivos bifuncionales son Capaces de reaccionar con los grupos ?-amino de los aminoácidos de lisina formando un enlace de amida. El primer paso de la reacción se presenta a continuación: EPO, n y X son tal como se han definido anteriormente y Z es un grupo reactivo conocido en el campo, por ejemplo un sustituyente N-hidroxi-succinimida (NHS) de la fórmula En una modalidad preferida, la activación de los grupos e-amino se lleva a cabo por la reacción con reactivos bifuncionales que tienen una porción de succinimidilo. Los reactivos bifuncionales pueden llevar diferentes especies de espaciadores, por ejemplo las porciones -(CH2)k- o -CH2- (0-CH2-CH2-) k-, en donde k se encuentra comprendido entre 1 y alrededor de 10, preferiblemente entre 1 y alrededor de 4 y más preferiblemente 1 o 2, y la forma más preferida donde es 1. Ejemplos de estos reactivos son N-succinimidil-S-acetiltiopropionato (SATP) y N-succinimidil-S-acetiltioacetato (SATA) Tipo acetiltioalquil-carboxílico-NHS-éster 2- (Acetiltio) - (etoxi) k-ácido acético-NHS-éster con k como se ha definido anteriormente.

La preparación de los reactivos bifuncionales es conocida en el campo. Los precursores de 2- (acetiltio) - (etoxi) k-ácido acético-NHS-ésteres se describen en DE-3924705, mientras que la derivación al compuesto de acetiltio está descrita por March, J. , Advanced Organic Chemistry, McGraw-Hill, 1977, 375-376. SATA se encuentra disponible comercialmente (Molecular Probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL) . El número de grupos tiol que se añaden a una molécula de EPO se pueden seleccionar mediante el ajuste de los parámetros de reacción, tales como la concentración de la proteína (EPO) y la relación proteína/reactivo bifuncional. Preferiblemente, la EPO se activa mediante la unión covalente de entre 1 y 5 grupos tiol por molécula de EPO, más preferiblemente entre 1.5 y 3 grupos tiol por molécula de EPO. Estos rangos se refieren a la distribución estadística del grupo tiol sobre la población de la proteína EPO. La reacción se lleva a cabo, por ejemplo, en una solución tampón acuosa, pH 6.5-8.0, por ejemplo en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.3. El reactivo bifuncional se puede añadir en DMSO. Tras la finalización de la reacción, preferiblemente tras 30 minutos, la reacción se detiene mediante la adición de lisina. El exceso de reactivo bifuncional se puede separar por métodos conocidos en el campo, por ejemplo, por la diálisis o filtración en columna. El número promedio de grupos tiol añadidos a la EPO se pueden determinar mediante métodos fotométricos descritos en, por ejemplo, Grasetti, D.R. and Murray, J.F. en J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, 41-49 (1967). La reacción anterior es seguida por el acoplamiento covalente de un derivado de polietilen glicol (PEG) activado. Los derivados de PEG adecuados son moléculas de PEG activadas con un peso molecular promedio de entre alrededor de 20 y alrededor de 40 kDa, más preferiblemente entre alrededor de 24 y alrededor de 35 kDa, y siendo la forma más preferida alrededor de 30 kDa. Los derivados activados de PEG son conocidos en el campo y están descritos en, por ejemplo, Morpurgo, M. et al. J. Bioconj . Chem. (1966) 1_, página 363 ff para PEG-vinilsulfona. Las especies de PEG de cadena lineal y de cadena ramificada son adecuadas para la preparación de los compuestos de la Fórmula 1. Los ejemplos de los reactivos de PEG reactivos son yodo-acetil-metoxi-PEG y metoxi-PEG-vinilsulfona: El uso de estas sustancias activadas con yodo se conoce en la técnica y se describe por ejemplo por Hermanson, G. T. en Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148. Más preferiblemente, las especies de PEG son activadas por maleimida utilizando (alcoxi-PEG-maleimida) , tal como metoxi-PEG-maleimida (Peso molecular 30000; Shearwater Polymers, Inc.). La estructura de alcoxi-PEG-maleimida es la siguiente: con R y m tal como se han definido anteriormente, El derivado más preferido es en donde R y m son tal como se han definido anteriormente. La reacción de acoplamiento con alcoxi-PEG-maleimida tiene lugar tras la escisión in si tu del grupo protector tiol en una solución tampón acuosa, por ejemplo fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6,2. La escisión del grupo protector se puede realizar, por ejemplo, con hidroxilamina en DMSO a 25 °C, pH 6.2 durante alrededor de 90 minutos. Para la modificación del PEG, la relación molar de EPO activada/alcoxi-PEG-maleimida debe ser entre alrededor de 1 : 3 y alrededor de 1:6 y preferiblemente 1:4. La reacción 7£¿7ií& , Ü A. se puede detener mediante la adición de cisteína y la reacción de los grupos tiol (-SH) restantes con N-metilmaleimida u otros compuestos apropiados capaces de formar puentes de disulfuro. Debido a la reacción de cualquier grupo tiol activo, restante con un grupo protector tal como N-metilmaleimida u otro grupo protector adecuado, las glucoproteínas EPO en los conjugados de esta invención pueden contener tales grupos protectores. Generalmente, el procedimiento descrito aquí producirá una mezcla de moléculas con números variables de tioles protegidos por diferentes números del grupo protector, dependiendo del número de grupos tiol activados en la glucoproteína que no se han conjugado con PEG-maleimida. Mientras que la N-metilmaleimida forma el mismo tipo de enlace covalente cuando se utiliza para bloquear los grupos tiol restantes en la proteína pegilada, los compuestos con puentes disulfuro darán lugar a una reacción de intercambio de sulfuro/disulfuro intermolecular a un acoplamiento con puente de disulfuro del reactivo de bloqueo. Los reactivos de bloqueo preferidos para ese tipo de reacción de bloqueo son glutationa oxidado (GSSG) , cisteína y cistamina. Mientras que con la cisteína no se introduce una carga neta adicional en la proteína pegilada, el uso de los reactivos de bloqueo GSSG o cistamina da por resultado una carga adicional negativa o positiva. --í5É3 ¡r»> , La purificación posterior de los compuestos de la Fórmula 1, incluyendo la separación de las especies mono-, di- y tripegiladas, se puede llevar a cabo por métodos conocidos en el campo, por ejemplo, la cromatografía en columna.

Composiciones Farmacéuticas Los productos de la glucoproteína eritropoyetina preparados de acuerdo con esta invención se pueden preparar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la inyección con un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable mediante métodos conocidos en el campo. Por ejemplo, se han descrito composiciones adecuadas en WO 97/09996, WO 97/40850, WO 98/58660, y WO 99/07401. Entre los portadores preferidos, farmacéuticamente aceptables que se prefieren para la formulación de los productos de la invención se encuentran la albúmina de suero humano, proteínas de plasma humano, etc. Los compuestos de la presente invención se podrían formular en tampón de fosfato de sodio/potasio 10 mM a pH 7 que contiene un agente de tonicidad, por ejemplo cloruro de sodio 132 mM. De forma opcional, la composición farmacéutica puede contener un conservador. La composición farmacéutica puede contener diferentes cantidades de eritropoyetina, por ejemplo 10-1000 µg/ml, por ejemplo 50 µg o 400 µg.

Tratamiento de Trastornos Sanguíneos Caracterizados por la Producción Baja o Defectuosa de Glóbulos Rojos La administración de los productos de la glucoproteína eritropoyetina de la presente invención provoca la formación de glóbulos rojos en humanos. Por lo tanto, la administración de los productos de la glucoproteína eritropoyetina repone esta proteína EPO que es importante en la producción de glóbulos rojos. Las composiciones farmacéuticas que contienen los productos de la glucoproteína eritropoyetina se pueden formular a una potencia efectiva para la administración por varios medios a un paciente humanos que sufra trastornos sanguíneos caracterizados por la producción baja o defectuosa de glóbulos rojos, mostrándose solo o formando parte de un estado o enfermedad. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar mediante la inyección tal como por inyección subcutánea o intravenosa. Las cantidades promedio del producto de la glucoproteína eritropoyetina pueden variar y en particular se deben basar en las recomendaciones y prescripciones de un médico calificado. La cantidad exacta de conjugado es una cuestión de preferencia sujeta a factores tales como el tipo exacto de estado a tratar, el estado del paciente a tratar, así como otros ingredientes en la composición. Por ejemplo, entre 0.01 y 10 µg por kg de peso corporal, preferiblemente entre 0.1 y 1 µg por kg de peso corporal, se pueden administrar por ejemplo una vez a la semana. A lo largo de esta solicitud se ha hecho referencia a varias publicaciones. Las descripciones en estas publicaciones se han incorporado aquí por referencia para describir más completamente el estado del campo. La presente invención también está ilustrada por los siguientes ejemplos que se han presentado con el propósito de demostrar la preparación de los compuestos y las composiciones de esta invención sin la intención de limitarla.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Fermentación y Purificación de la EPO Humana a) Preparación y Fermentación del Inoculo Se tomó un frasquito o vial del Working Cell Bank, originado a partir de una línea celular CHO que produce EPO (se puede utilizar ATCC CRL8695, revelada en EP 411 678 (Genetics Institute) ) de la fase gaseosa del depósito de almacenamiento de nitrógeno liquido. Las células se transfirieron a tubos de vidrio para centrífuga y se cultivaron en un medio tamponado con carbonato ácido en un incubador humidificado de C02. Los típicos medios sin suero ?& . - .,i.-ii.¿ií.l usados para la preparación y la fermentación del inoculo se describen en la Solicitud de Patente Europea 513 738, de Koch publicada el 12 Junio de 1992, o WO 96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre de 1996, por ejemplo contienen como medio DMEM/F12 (por ejemplo JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, No. 57-736) y de modo adicional carbonato ácido de sodio, L+glutamina, D+glucosa, insulina recombinante, selenita sódica, diaminobutano, hidrocortisona, sulfato de hierro (II) , asparagina, ácido aspártico, serina y un estabilizante para células de mamífero tal como por ejemplo alcohol polivinílico, metil celulosa, polidextrano, polietilen glicol, Pluronic F68, expansor de plasma poligelina (HEMACCEL®) o polivinil pirrolidona (WO 96/35718). Los cultivos se inspeccionaron microscópicamente para detectar la ausencia de microorganismos contaminantes y se determinaron las densidades celulares. Estos ensayos se realizaron en cada paso de fraccionamiento. Tras el período de crecimiento inicial, el cultivo celular se diluyó con un medio fresco hasta conseguir la densidad celular inicial y se comenzó otro ciclo celular. Este procedimiento se repitió hasta que se obtuvo un volumen de cultivo de aproximadamente 2 litros por tubo de vidrio para centrífuga. Tras aproximadamente 12 duplicaciones, se encontraron disponibles entre 1 y 5 litros de este cultivo, los cuales entonces se usaron como inoculo para el fermentador de inoculo de 10 litros. Tras entre 3 - 5 días, el cultivo del fermentador de 10 litros se pudo usar como inoculo para el fermentador de inoculo de 100 litros. Tras otros 3 - 5 días de cultivo, el cultivo en el fermentador de 100 litros se puede usar como inoculo para el fermentador de inoculo de 1000 litros. b) Recolección y Separación Celular Se utilizó un proceso de realimentación en lotes, es decir cuando se alcanza la densidad celular deseada, se recolecta aproximadamente el 80% del cultivo. El cultivo remanente es rellenado con medio de cultivo fresco y se hace crecer hasta la siguiente recolección. Una ronda de producción consiste de un máximo de 10 ciclos de recolección: 9 ciclos de recolección parciales y 1 ciclo de recolección completa al final de la fermentación. El ciclo de recolección tiene lugar cada 3 - 4 días. El volumen de recolección determinado es transferido a un recipiente enfriado. Las células son separadas por centrifugación o filtración y son eliminadas. La EPO que contiene el sobrenadante del paso de la centrifugación se filtró en línea y se recolecta en un 'jl itíÁ.ikl?l?^ segundo recipiente enfriado. Cada cultivo recolectado se procesa de modo separado durante la purificación. Un proceso típico para la purificación de la proteína EPO se revela en WO 96/35718, de Burg publicada el 14 de Noviembre de 1996. El proceso de purificación se explica de modo ejemplar a continuación. a) Cromatografía de Blue Sepharose La Blue Sepharose (Pharmacia) consiste en bolitas de Sepharose, en la superficie de las cuales el colorante azul Cibacron se encuentra unido covalentemente. Como la EPO se une con más fuerza a la Blue Sepharose que a muchos de los contaminantes no proteicos, algunas impurezas proteicas y PVA, la EPO se puede enriquecer en este paso. La elución de la columna de Blue Sepharose se lleva a cabo al incrementar la concentración de sales, así como el pH. La columna se rellenó con entre 80-100 litros de Blue Sepharose, se regeneró con NaOH y se equilibró con tampón de equilibrado (cloruro de sodio/calcio y acetato sódico) . Se cargó el sobrenadante de la fermentación acidificado y filtrado. Tras finalizar la carga, la columna se lavó en primer lugar con un tampón similar al tampón de equilibrado, que contenía una mayor concentración de cloruro de sodio y posteriormente con un tampón de Tris-base. El producto se eluyó con un tampón de Tris-base y se recolectó en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón. b) Cromatografía de Butyl Toyopearl El Butyl Toyopearl 650 C (TosoHaas) es una matriz basada en poliestireno a la cual están acoplados covalentemente residuos alifáticos de butilo. Como la EPO se une con más fuerza a este gel que a muchas de las impurezas y PVA, se eluyó con un tampón que contiene isopropanol. La columna se empaquetó con entre 30-40 litros de Butyl toyopearl 650 C, se regeneró con NaOH, se lavó con un tampón de Tris-base y se equilibró con un tampón de Tris-base que contenía isopropanol. El eluido de Blue Sepharose se ajustó a la concentración del isopropanol en el tampón de equilibrado de la columna y se cargó en la columna. Entonces la columna se lavó con el tampón de equilibrado siguiendo una concentración creciente de isopropanol. El producto se eluyó con el tampón de elución (tampón de Tris-base con un mayor contenido de isopropanol) y se recolectó en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón. c) Cromatografía de Hydroxyapatite Ultrogel h?l&.it jA?j.em. íi?tb mt.™ *. t. - J~«. > t t „ ,, -«« k? ~- k « - Jr . -~ *. 1 ¿* Jr . -*-»-•* A h-Ú El Hydroxyapatite Ultrogel (Biosepra) consiste en hidroxiapatita que se incorpora en una matriz de agarosa para mejorar las propiedades mecánicas. La EPO tiene una menor afinidad por la hidroxiapatita y se puede eluir por tanto a concentraciones menores de fosfato que las impurezas proteicas . La columna se rellenó con entre 30-40 litros de Hydroxyapatite Ultrogel y se regeneró con un tampón de fosfato potásico/cloruro calcico y NaOH seguido por un tampón de Tris-base. Entonces se equilibró con un tampón de Tris-base que contiene una cantidad menor de isopropanol y cloruro sódico. El eluido que contenía la EPO de la cromatografía de Butyl Toyopearl se introduce en la columna. Posteriormente, la columna se lavó con un tampón de equilibrado y un tampón de Tris-base sin isopropanol y cloruro sódico. El producto se eluyó con un tampón de Tris-base que contenía una menor concentración de fosfato potásico y se recolectó en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón. d) HPLC de Fase Inversa en Vydac C4 El material de la RP-HPLC Vydac C4 (Vydac) consiste de partículas de gel de sílice, las superficies de las cuales llevan cadenas de alquilo C4. La separación de la EPO de las Í*t???Mt ..... ?-. ..Al ib impurezas proteicas se basa en las diferencias en cuanto a la fuerza de las interacciones hidrofóbicas. La elución se lleva a cabo con un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. La HPLC preparativa se realizó mediante una columna de acero inoxidable (rellenada con entre 2.8 y 3.2 litros de gel de silice Vydac C4). El eluido de Hydroxyapatite Ultrogel se acidificó mediante la adición de ácido trifluoroacético y se introdujo en la columna Vydac C4. Para el lavado y la elución se utilizó un gradiente de acetonitrilo en ácido trifluoroacético diluido. Las fracciones se recolectaron e inmediatamente se neutralizaron con tampón de fosfato. Las fracciones de EPO que se encontraron dentro de los limites IPC se combinaron. e) Cromatografía de DEAE Sepharose El material de DEAE Sepharose (Pharmacia) consiste en grupos dietilaminoetilo (DEAE) que se encuentran covalentemente unidos a la superficie de las bolas de Sepharose. La unión de la EPO a los grupos DEAE está mediada por interacciones iónicas. El acetonitrilo y el ácido trifluoroacético pasaron a través de la columna sin ser retenidos. Después de que se lavaron estas substancias, se eliminaron las trazas de impurezas mediante el lavado de la columna con un tampón de acetato a un pH bajo. Entonces la columna se lavó con un tampón de fosfato neutro y la EPO se eluyó con un tampón con fuerza iónica incrementada. La columna se empaquetó con DEAE Sepharose fast flow. El volumen de la columna se ajustó para asegurar una carga de EPO en el rango de 3-10 mg de EPO/ml de gel. La columna se lavó con agua y tampón de equilibrado (fosfato sódico/potásico) . Las fracciones combinadas del eluido de la HPLC se cargaron y la columna se lavó con tampón de equilibrado. Entonces la columna se lavó con tampón de lavado (tampón de acetato sódico) y posteriormente por el lavado con tampón de equilibrado. Posteriormente, la EPO se eluyó de la columna con tampón de elución (cloruro sódico, fosfato sódico/potásico) y se recolectó en una fracción única de acuerdo con el perfil de elución patrón. El eluido de la columna de DEAE Sepharose se ajustó a la conductividad especificada. La sustancia de fármaco resultante se filtró quedando estéril en botellas de Teflon y se conservó a -70°C.

EJEMPLO 2: Unión covalente de grupos tiol a la EPO Este ejemplo revela la determinación de estados de reacción para la unión covalente de grupos tiol con la EPO.

Para determinar estos estados, se añadieron deferentes cantidades de un reactivo que contenía un grupo tiol bloqueado, aquí SATA o SATP (disuelto en DMSO hasta 10 mg/ml) a la solución de EPO, aquí a 1 ml de EPO 5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, pH 7.3. La reacción se agitó durante 30 minutos (25°C) y se detuvo mediante la adición de una solución de lisina 1M a 10 mM. La cantidades en exceso de SATA y SATP se eliminaron por diálisis contra fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM y EDTA 2 mM, pH 6.2. Tras la eliminación del grupo acetilo protector con hidroxilamina, el número de grupos tiol unidos covalentemente a la EPO se determinó fotométricamente con ditiodipiridina según el método descrito por Grasetti, D.R. and Murray, J.F. en J. Appl. Biochem. Biotechnol. 119, página 41-49 (1967) . El número de grupos tiol unidos covalentemente por molécula de EPO se muestra a continuación.

Relación Molar de Mol Grupos tiol/ EPO: SATA o SATP mol EPO EPO: SATA = 1:3 1,5 EPO: SATA = 1:5 2.4 EPO: SATA = 1:6 3.2 EPO: SATP = 1:3 1.3 EPO: SATP = 1:4 2.5 EPO: SATP = 1:6 3.7 t¿¿--¿.i.„i¿ > * .í¿ kt,AA EJEMPLO 3: Modificación de la EPO activada con metoxi-PEG- maleimida A) Activación de la EPO: Se activaron 100 mg de EPO producidos según el Ejemplo 1 (190,000 IU/mg determinado según el ensayo normocitémico de ratón) con SATA (relación molar: EPO/SATA= 1/5) según el Ejemplo 2. La EPO resultante ("EPO activada") que lleva unidos covalentemente los grupos tiol bloqueados fue separada de los productos secundarios como N-hidroxi-succinimida o SATA que no reaccionó por diálisis como se describe en el Ejemplo 1. Se obtuvo una solución de EPO activada 4.5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6.2.

B) Pegilación de la EPO activada: Se disolvieron 380 mg de metoxi-PEG-maleimida con la estructura "más preferida" mostrada anteriormente (PM 30.000; Shearwater Polymers, Inc. Huntsville (Alabama, USA)) en la solución anterior que contenía 95 mg de EPO activada (4.5 mg/ml en fosfato potásico 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 2 mM, pH 6.2). La relación molar resultante entre la EPO activada y metoxi-PEG-maleimida en la solución fue de 1:4. Mediante la adición de una solución acuosa de hidroxilamina 1M hasta 30 mM, pH 6.2 a la solución anterior, los grupos tiol bloqueados unidos covalentemente de la EPO activada se desbloquearon. La EPO activada resultante en la mezcla de reacción de la solución contenía grupos tiol (-SH) libres. Inmediatamente después del desbloqueo de los grupos tiol, se llevó a cabo la reacción de acoplamiento entre la EPO activada que ahora contenía grupos tiol (-SH) libres y metoxi-PEG-maleimida durante 90 minutos (agitación, 25°C) . La reacción de acoplamiento se detuvo mediante la adición de una solución acuosa de cisteína 0.2 M hasta 2 mM a la mezcla de reacción. Tras 30 minutos, los grupos tiol libres en exceso de la EPO activada que no reaccionaron con metoxi-PEG-maleimida se bloquearon mediante la adición de una solución de N-metilmaleimida 0.5 M en DMSO para conseguir una concentración de 5 mM. Tras 30 minutos, la mezcla de reacción resultante que ahora contenía especies pegiladas de la EPO se dializó con fosfato potásico 10 mM, pH 7.5 durante > 15 horas.

C) Purificación de especies de EPO pegiladas: Para la separación de las especies de EPO pegiladas de la mezcla de reacción, se llevó a cabo al siguiente proceso de purificación: Una columna de Q-Sepharose ff de 50 ml se equilibró con fosfato potásico 10 mM, pH 7.5. La mezcla de reacción obtenida en el paso B) se introdujo en la columna (tasa del flujo: 3 volúmenes de columna (VC) por hora) . Con la finalidad de separar el reactivo de metoxi-PEG-maleimida que no había reaccionado, la columna se lavó con 5 VC's de fosfato potásico 10 mM, pH 7.5. Las especies de EPO pegiladas se separaron mediante la elución con un gradiente de sal creciente que consistía en 5 VC's de tampón A (fosfato potásico 10 mM, pH 7.5) y 5 VC's de tampón B (fosfato potásico 10 mM, NaCl 500 mM, pH 7.5) con una tasa de flujo de 3 VC por hora. Según el gradiente de NaCl, las especies de EPO pegiladas (especies de EPO tri-, di- y mono-pegiladas) se eluyeron en primer lugar, seguidas por las especies de EPO no pegiladas. La fracción del eluido que contenía las especies de EPO pegiladas (especies de EPO tri-, di- y mono-pegiladas) se combinó y se filtró (filtración estéril con un filtro de 0.2 µm) . El contenido y pureza de las especies de EPO tri-, di- y mono-pegiladas se evaluó en geles SDS-PAA teñidos con Coomassie (Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)) mientras que las concentraciones de proteína se midieron a 280 nm según la ley de Beer-Lambert . Los pesos moleculares aparentes de las especies de EPO determinados por la electroforesis con SDS- P7AA se encontraban alrededor de 68 kDa (especies de EPO monopegiladas) , alrededor de 98 kDa (especies de EPO di- pegiladas) y alrededor de 128 kDa (especies de EPO tri- pegiladas) . La separación posterior de las especies de EPO tri- di- y mono-pegiladas se puede conseguir mediante cromatografía, por ejemplo mediante la cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex, pq 200; Pharmacia) . La determinación de la actividad biológica in-vivo del eluido que contenía las especies tri- di- y mono-pegiladas se llevó a cabo por el método descrito en el Ejemplo 4.

EJEMPLO 4: Actividad in-vivo de la EPO pegilada determinada mediante el ensayo normocitémico de ratón El bioensayo normocitémico de ratón es conocido en el campo (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) y un método en la monografía de la eritropoyetina de Ph. Eur. BRP. Las muestras se diluyeron con BSA-PBS. A ratones sanos de 7-15 semanas de edad, se les administraron s.c. 0.2 ml de la fracción de EPO que contenía EPO tri-, di-o mono-pegilada tal como se describe en el ejemplo 2. Durante un período de 4 días, empezando 72 horas después de la administración, se les extrajo sangre por punción de la vena de la cola y se diluyó de forma que 1 µl de sangre se encontraba presente en 1 ml de una solución de tinción naranja de acridina 0.15 µmol. El tiempo de tinción oscila entre 3 y 10 minutos. Los conteos de reticulocitos se llevaron a cabo de forma microfluorométrica en un citómetro de flujo mediante el análisis del histograma de fluorescencia rojo. Los conteos de reticulocitos se dieron en términos de valores absolutos (por 30,000 células sanguíneas analizadas). Para los datos presentados, cada grupo consistió de 5 ratones por día, y los ratones fueron sangrados sólo una vez. A los ratones se les administró metoxi-PEG- maleimida acoplada a la EPO según el Ejemplo 3, EPO no modificada y solución tampón. Los resultados se muestran en la Figura 3. Los resultados muestran mayor actividad y vida media prolongada de las especies de EPO pegiladas, indicados por las cantidades significativamente incrementadas de reticulocitos y el cambio del valor máximo del conteo de reticulocitos suministrando la misma dosis por ratón.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: F.Hoffmann-La Roche AG (B) CALLE: 124 Grenzacherstrasse (C) CIUDAD: Basilea (E) PAÍS: Suiza (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G) TELÉFONO: (61) 688 11 11 (H) FAX: (61) 688 13 95 (I) TELEX: 962 292 hlr ch (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN : Conjugados de Eritropoyetina (iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 3 (iv) FORMA LEGIBLE PARA COMPUTADORA: (A) TIPO DE SOPORTE: Disco flexible (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: WORD (D) SOFTWARE: Patentln Reléase 2.0 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens i*- é '"Í?Al Á?.At.kM HÍ. <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu 1 5 10 Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr 15 20 25 Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie 30 35 Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys 40 45 50 Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln 55 60 65 Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln 70 75 Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu 80 85 90 Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 95 100 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 105 110 115 Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu 120 125 130 Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 135 140 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 145 150 155 *• ? - ,? j i..,ÍJLik-r?t*.,.i Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 160 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu 1 5 10 Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr 15 20 25 Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie 30 35 Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys 40 45 50 Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln 55 60 65 Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln 70 75 Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu 80 85 90 Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser 95 100 Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu 105 110 115 Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu 120 125 130 Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg 135 140 Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 145 150 155 Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 160 165 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser 1 5 10 Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu 15 20 25 Pro Gln Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. t

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un conjugado, el conjugado está caracterizado porque comprende una glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o mediante la nueva disposición de al menos un sitio de glucosilación; la glucoproteína se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi-inferior poli (etilen glicol), cada grupo poli (etilen glicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un conector con la fórmula -C (0) -X-S-Y-, con el C(0) del conector que forma un enlace de amida con uno de los grupos amino, X es - (CH2 ) k- o -CH2 (0-CH2-CH2 ) k- , k se encuentra entre 1 y 10 , Y es el valor promedio del peso molecular de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 20 kilodaltons y alrededor de 40 kilodaltons y el peso molecular del conjugado se encuentra entre alrededor de 51 kilodaltons y alrededor de 175 kilodaltons. 2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene la fórmula
2. P- [NH-CO-X-S-Y- (OCH2CH2) m-OR] n en donde X e Y son tal como se han definido en la reivindicación 1, m se encuentra comprendido entre 450 y 900, n se encuentra comprendido entre 1 y 3, R es alquilo inferior y P es la glucoproteína eritropoyetina menos el grupo amino o grupos amino que forman un enlace de amida con X. Í.AÁJ-,Á,tiÁ^?l?¿i k~a.kÉi t.
3. 3. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque tiene la fórmula en donde P, R, X, m y n son tal y como se han definido en la reivindicación 2.
4. 4. El conjugado de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque tiene la fórmula en donde P, R, X, m y n son tal y como se han definido en la reivindicación 2.
5. 5. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X es -(CH2)k-.
6. 6. El conjugado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque k está comprendido entre 1 y 4. ¿¿AAjA. -. i- Í L&M
7. 7. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X es -CH2-.
8. 8. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque m es un número entero que se encuentra comprendido entre 550 y 800.
9. 9. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque m es un número entero que se encuentra comprendido entre 650 y 700.
10. 10. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque n es 1.
11. 11. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque R es metilo.
12. 12. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el peso molecular promedio de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra comprendido entre alrededor de 24 kilodaltons y alrededor de 35 kilodaltons.
13. 13. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el peso molecular promedio de cada porción de poli (etilen glicol) es de alrededor de 30 kilodaltons.
14. 14. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la glucoproteína se encuentra unida covalentemente a una o dos porciones de poli (etilen glicol) cuyo extremo es alcoxilo inferior.
15. 15. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque las porciones de poli (etilen glicol) presentan en su extremo un grupo metoxilo.
16. 16. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque X es -CH2-, m es un número entero comprendido entre 650 y 700, n es 1, R es metilo, y en donde el peso molecular promedio de cada porción de poli (etilen glicol) es de alrededor de 30 kilodaltons.
17. 17. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la glucoproteína eritropoyetina es una eritropoyetina humana.
18. 18. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la glucoproteína eritropoyetina se expresa mediante activación génica endógena.
19. 19. El conjugado de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque la glucoproteína eritropoyetina tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO: 1) o en la Figura 2 (SEC ID NO:2).
20. 20. El conjugado de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la glucoproteína Í?í.j ¿. &á.?.!.í7 ? . i... naMfafcJ»». ,.^ . eritropoyetina tiene la secuencia mostrada en la Figura 1 (SEC ID NO:l) .
21. 21. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación.
22. 22. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 8 y 10, caracterizado porque la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada del grupo que consiste en: Asn30Thr32; Asn51Thr53; Asn 69 , Asn69Thr71 ; Ser68Asn69Thr71; Val87Asn88Thr90; Ser87Asn88Thr90; Ser87Asn88Gly89Thr90; Ser87Asn88Thr90Thr92 ; Ser87Asn88Thr90Ala162 ; Asn69Thr71Ser87Asn88Thr90 ; Asn30Thr32Val87Asn88Thr90; ? -->. >.k. ^ -jfc Asn89Ile90Thr91; Ser87Asn88Ile90Thr91; Asn136Thr138 ; Asn138Thr140; Thr 125 y Pro124Thr125.
23. 23. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la glucoproteína tiene una secuencia que comprende la secuencia de la eritropoyetina humana y una segunda secuencia en el extremo carboxilo de la secuencia de la eritropoyetina humana, en donde la segunda secuencia contiene al menos un sitio de glucosilación.
24. 24. El conjugado de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la segunda secuencia comprende una secuencia derivada de la secuencia del extremo carboxilo de la gonadotropina coriónica humana.
25. 25. El conjugado de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la glucoproteína tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de: (a) eritropoyetina humana que tiene la secuencia de aminoácidos Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gln (SEC ID NO: 3), que se prolonga desde el extremo carboxilo; t?A*aJ &&=i*-t.-»-*Mfaia'--"" - - a-* . . - -*«*,«.. — .^^tt^ ^, (b) la secuencia en (a) modificada por Ser87 Asn88 Thr90; y (c) la secuencia en (a) modificada por Asn30 Thr32 Val87 Asn88 Thr90.
26. 26. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada mediante una nueva disposición de al menos un sitio de glucosilación.
27. 27. El conjugado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la nueva disposición comprende la supresión de cualquiera de los sitios de unión N a carbohidrato en la eritropoyetina humana y la adición de un sitio de unión N a carbohidrato en la posición 88 de la secuencia de la eritropoyetina humana.
28. 28. El conjugado de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la glucoproteína tiene la secuencia de la eritropoyetina humana modificada por una modificación seleccionada del grupo que consiste de: EPO Gln24 Ser17 Asn88 Thr90; EPO Gln38 Ser87 Asn88 Thr90; y EPO Gln83 Ser87 Asn88 Thr90.
29. 29. Una composición caracterizada porque comprende conjugados, cada uno de los conjugados comprende una glucoproteína eritropoyetina que presenta al menos un grupo amino libre, que presenta una actividad biológica in vivo con la que consigue que las células de la médula ósea incrementen la producción de reticulocitos y glóbulos rojos y que se selecciona del grupo de la eritropoyetina humana y análogos de la misma que presentan la estructura primaria de la eritropoyetina humana modificada mediante la adición de entre 1 y 6 sitios de glucosilación o por la nueva disposición de al menos un sitio de glucosilación; la glucoproteína se encuentra unida de forma covalente a de uno a tres grupos alcoxi inferior poli (etilenglicol) , cada grupo poli (etilenglicol) se encuentra unido covalentemente a la glucoproteína mediante un conector con la fórmula -C(0)-X-S- Y-, con el C(O) del conector que forma un enlace de amida con uno de los grupos amino, X es -(CH2)k- o -CH2(0-CH2-CH2)k-, k se encuentra entre 1 y 10, Y es el valor promedio del peso molecular de cada porción de poli (etilen glicol) se encuentra entre alrededor de 20 kilodaltons y alrededor de 40 kilodaltons, y el peso molecular del conjugado se encuentra entre alrededor de 51 kilodaltons y alrededor de 175 kilodaltons; y el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa por ciento.
30. 30. La composición que comprende conjugados de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, caracterizada porque el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa por ciento.
31. 31. La composición de conformidad con las reivindicaciones 28 o 29, caracterizada porque el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa y dos por ciento.
32. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 30, caracterizada porque el porcentaje de conjugados donde n es 1 es al menos del noventa y seis por ciento.
33. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 29 o 32, caracterizada porque el porcentaje de conjugados donde n es 1 está comprendido entre el noventa por ciento y el noventa y seis por ciento.
34. 34. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un conjugado o una composición de j iJ«¿?.k»>, Ufc,. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
35. 35. El uso de un conjugado o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 para la preparación de medicamentos para el tratamiento o profilaxis de enfermedades relacionadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) , SIDA y para el tratamiento de pacientes de cáncer que han sido tratados con quimioterapia .
36. 36. Un proceso para la preparación de un conjugado o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, el proceso está caracterizado porque comprende la unión covalente de grupos tiol a una glucoproteína eritropoyetina y el acoplamiento de la glucoproteína eritropoyetina activada, resultante con un derivado de poli (etilen glicol) (PEG).
37. 37. Los conjugados y las composiciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizados porque se preparan mediante el proceso de la reivindicación 36.
38. 38. Los conjugados y las composiciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, caracterizados porque son para el tratamiento de enfermedades que están asociadas con la anemia en pacientes con fallo renal crónico (CRF) , y pacientes con SIDA y cáncer que han sido sometidos a la quimioterapia. i—' ?.?.. .,í..,í..-?> . ,