JPS61171430A - ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法 - Google Patents

ラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニン―９―β―Ｄ―アラビノフラノシド５′モノホスフェートの結合体の製造方法

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JPS61171430A
JPS61171430A JP60278843A JP27884385A JPS61171430A JP S61171430 A JPS61171430 A JP S61171430A JP 60278843 A JP60278843 A JP 60278843A JP 27884385 A JP27884385 A JP 27884385A JP S61171430 A JPS61171430 A JP S61171430A
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    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ウィルス起源の肝炎症状の治療学的処置にお
いて有用な、ラクートサミン化ヒトアルプミｙ　（ｌａ
ｃｔｏａａｍｔｎａｔａｄ　　ｈｕｍａｎ　　ａｌｂｘ
−ｍｉｎ）とアデニン−９−β−Ｄ−アラビノフラノシ
ド５′モノホスフェートの結合体（ｃｏｎｊｗ−ｇａｔ
ｅｓ）に関する。
数年来、アデニン−９−β−Ｄ−アラビノシト（αデα
−、４）及びそのモノホスフェート（αデα−ＡＭＰ）
はウィルスＢによって誘発された慢性肝炎の処置におい
て使用されている。αγα−Ａ及びαγα−ＡＭＰはウ
ィルス複製を阻害する（　１ｎｈｉｂｉｔ　）。
〔（１）　　チャドウイック、アール　ソー、パラセン
ティン　エムエフ、クローフォートイーエム、トーマス
エイチシー、シャーロック　ニス０．プリティッシュ、
メディカル、ツヤ−ナル、。
１９７Ｂｓ２’、５５１−５５（ＣｈａｄｗｔａｋＲＧ
、Ｅａｓａａｎｄｉｎｇ　　ＭＦ、ＣｒａｗｆｏｒｄＥ
Ｍ、Ｔｈｏｍａｓ　　ＥＣ，５ｈａｒｌｏｅｋ　Ｓ、。
Ｂｙ、Ｍａｄ、　　／、、　　１９７８Ｈ２：５３１−
３５、）参照〕。
（２）　　ボラード　アール　ビー、スミス　ソエイ　
エル、ニール　イー　エイ、グレゴリービー　ビー、メ
リガン　ティー　エル、ロビンリンダプリュ　シー０、
ツヤ−ナル　オプ　アメリカン　メディカル　アソシエ
ーション　１９７８　。
２３９　：　１６４８−５０　ＣＰｏ１Ｌａｒｄ　　Ｒ
Ｂ。
Ｓｍ１ｔｈ　　ＪＬ、Ｍｅａｌ　　ＥＡ、Ｇｒｅｇｏｒ
ｙ　　ＰＢ。
ＭａｒイｇａｆＬ　ＴＬ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ＴＩ’Ｃ
，。
ＪＡＮＡ　　ｌ９７８．２３９：１６４Ｂ−５０，）。
（３）　　パラセンティン　エム　エフ、チャドウイッ
ク　アール　ソー、サルメロン　ジエイ。
シフ’）ン　ニー、トーツス　エイチシー、シャー四ツ
ク　ニス、カストロエンテロロジ−１９８１：８０　：
　１０１６−２２．（ＢａｓｓｇｎｄｔＲａＭＦ、Ｃｈ
ａｄｗｉｃｋ　　ＲＧ、Ｓａｌｍｅｒｏｎ　　Ｊ。
５ｈｉｐｔｏｎ　Ｕ、Ｔｈｏｔｎａａ　　ＨＣ，Ｓｈｇ
ｒｌｏｃｋＳ、、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｔｔｒｏｌｏｇｙ
　　１９８１　：１０１６−２２．）。
（４）　　スフラード　ソーエイテ、−ラード　アール
ビー、スミス　ソエイエル等、インフエクト。
ディス　１９８１　：１４３−ニア７２−８３（ＥＣ舊
−１１αデｄ　　Ｇｉ、　　Ｐｏ１ｌαデｄ　　ＲＢ、
　　５惰１ｔｈＪＬ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ
、Ｄｉｇ　　１９８１　：１４３ニア７２−８３．）。
（５）　　ウエラー　アイブイディー、ノ（ラセンディ
ン　エムエフ、クラキシ等、、グツド　１９８２　：２
３ニア１７−２５（ＷａｌｌｅｒＩＶＤ、Ｂα１１８ａ
％−ｄｔｎｅ　　ＭＦ、Ｃｒａｚｉ　　ａｔ　　ａｌ、
、Ｇｕｔ１９８２．２３ニア１７−２３．）。
（６）スミス　シーアイ、キシ・チヱン　エルケイ、ス
フラード　ジーエイテ、ロビンソン　〆プリュ　ニス、
グレゴリ−ビービー、メリがンティーシー、、ツヤ−ナ
ル　オプ　アメリカンメディカル　アソシエーション　
１９８２：２４７：２２６１−６５．（Ｓｍ４ｔｈ　　
Ｃ１゜Ｋｉｔｃｈａｎ　　Ｌｆ、５ｃｘＬＬａｒｄ　　
ＧＨ，Ｒｏｂｉｎ−ｓｏｎ　　ＷＥ、　　６ｒａｇｏｒ
ｙ　　ＰＢ、’　ＭａｒｉｇａｎＴＣｏ、ＪＡＮＡ　　
ｌ９８２．２４７：２２６１−６５．）。
（７）　　ツーフナ−グル　ジエイエイテ、ハンソン　
アールジー、ミヌーク　ジー　ワイ等、ガストロエンテ
ロロソ−１９８４ｉ８６：１５０−５７　（Ｈｏｏｆｎ
ａｇｌａ　　ＪＨ，Ｈａｎｔｏｓ　　ＲＧ。
１゜ Ｍｔｎｕｋ　　ＧＹ　　ａｔ　　ａｌ、　　Ｇａａｔｒ
ｏｔｔｎｔｇｒ）１ｊ１９８４　：８６　：　１５Ｏ−
５７）参照〕。
成る患者においては、これらの化合物は肝臓の組織学的
外観（ｈｔｓｔｏｌｏｇｉｅａｌ　　ａｐｐｅａ−デα
ｎｃｅ　）の改善及び感染性の低下（１ｏｓｓｏｆ　　
ｔｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　）も生じる。
〔（８）　　スフラード　ソーエイテ、アンドン　エル
エル、グリーンバーブ　エイチピー等、ヘノ９トロシー
　１９８１　：　１　：　２２８−３２．＜５ｃｘ−１
１ａｒｄ　　ＧＨ，Ａｔｓｄｒｇａｓ　　ＬＬ、Ｇｒｅ
ａｎｂ−ａｒｇ　ＨＢ　　ａｔ　　ａｌ、Ｈｇｐａｔｏ
ｌｏｇｙ１９８１　：２２８−３２）、）。
（９）　　スフラード　ジーエイテ、グリーンバーブ　
エイテビー、スミスジエイエル、グレゴリービービー、
メリガン　ティーシー、ロビンンンン／　ｆ　ＩＪユエ
ス、ヘノ母トロＮ−１９８１：２：３９−４９　（Ｓｃ
ｕｌｌａｒｄ　　ＧＨ，ＧｒｔｔｇｎｂｅｒｇＨＢ、　
　Ｓｍ１ｔｈ　　Ｊ　Ｌ、　　Ｇｒｇｇｏｒｙ　　ＰＢ
。
Ｍｔｔｒイｇａｎ　　ＴＣ，Ｒｏｂｉｎａｏｘ　Ｈ７Ｓ
。
Ｈｇｐａｔｏｌｏｇｙ　１９８１　：２：３９−４９）
参照〕。
しかしながら、これらの薬は、胃腸管及び骨髄（ｍｇｄ
ｘｌｌａ　　ｏｓｍｉｍｍ）の主として中枢神経系のレ
ベルにおいて副作用を生じ、これはしばしばそれらの投
与を中断させる。これらの副作用は、もしαγα−Ａ又
はαγα−ＡＭＰが肝細胞に選択的に運ばれるならば排
除され又は減少するかも知れない。
〔前記の文献（７）及び（１０）　サックス　ニスエル
、スミス　ソエイエル、７ｔ′９−ト　　アールビー等
、ジャーナル　オリ　アメリカン　メディカル　アソシ
エーション１９７９ｉ２１４−２８（Ｓａｃｋｓ　　Ｓ
Ｌ、５ｔｎｔｔｈ　　ＪＬ、Ｐｏ１ｌａｒｄＲＢ　　ａ
ｔ　　ａｌ、ＪＡＭＡ　　１９７９：２１４−２８）。
［１１）　　サックス　ニスエル；スクラードソーエイ
テ、ボラード　アール　ビー、ダレゴリー　ビービー、
ロビンソン　ダプリュエス、メリガン　ティーシー１．
アンチｉイクロパイアルエージェント　アンド　ヘモセ
？／譬−，１９８２：２１−９３−１００　（Ｓａｃｓ
　　ＳＬＨ５ｃｕｌｌａｒｄｃｒＨ，Ｐｏ１ｌａｒｄ　
　ＲＢ、Ｇｒｅｇｏｒｙ　　ＰＢ。
Ｒｏｂｔｎａｏｎ　　ＦＳ、Ｍａｒｉｇａｎ　　ＴＣ，
。
Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、　　Ａｇｅｎｔｓ　　Ｃ五ｅｔ
ｎｏｔｈｇｒ。
１９８２：２ｌ−９５−１００）− （１２）　　ホイトレイ　アール、アルフォード　シー
、ヘスエフ、プツシャナンアール、、トラ７グスＨ２０
−２６７−８２ＣＭ’ｈｉｔｌａｙ　　ＲｏＡｌｆｏｒ
ｄ　　Ｃ，Ｈａｍｓ　　Ｆ、Ｂｓｅｈａｎａｎ　Ｒ，。
Ｄｒｓｙａ　　１９８０　　：２Ｏ−２６７−８２）−
参照〕。
２００Ｋ・““ＡｘｐＢｉ軸１＆ａＦｉｌ　　　　　ｇ
（ｈａｐａｔｔｃ　　ｐａｒｇｎ＠ｈｔｍａ　　ｃｅｌ
ｌｓ）中にのみ浸透し、そこでリンソームにより破壊さ
れるラクトサミン化アルツミン（ｌａｃｔａｍα１ｉα
ｔａｄα１ｂｘｔｐｓｔｎ）（Ｌ−５Ａ）と結合せしめ
られた。
エフトロメリアウィルス（Ｅｃｔデｏｍａｌｉαｖｉｒ
ｕｓ　）によって誘発さ′れた肝炎にかかつているマウ
スに結合体Ｌ−５Ａ−αγα−ＡＭＰ（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ　Ｌ−５Ａ−ａｒａ−ＡＭＰ）ｔｒ）投与の後、α
γα−ＡＭＰは肝細胞においてその薬理学的に活性な形
態において濃縮される。Ｌ−５Ａ−αデα−ＡＭＰ結合
体は、相同アルラミン（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ　　ａｌｂ
ｕｍｉｎ）を用いて製造されると、少なくともマウスに
おいては免疫原性（ｉｔｒＬｍｓｆＬｏｇｇｔ百Ｃ）で
はない。
−２６１−６４（Ｆｉｓｔｎｅ　　Ｌ、、　　Ｉｈｂｓ
ｔ　　Ｃ０゜ＭａｔｔｉｏｌイＡ、Ｂａ１ｂｏｎｔ　　
ＰＧ、Ｂａｒｂ、ａ−ｎｔｔ−Ｂｒｏｄａｎｏ　　Ｇ、
、ＦＥＢＳ　　Ｌｅｔｔ。
１９８１　：　１２９−２６１−６４）。
（１４）　　アシュウエル　ソー、ハルフォード　ソエ
イ、アンニス　レプ、バイオケム、１９８２：５１：５
５１−５４（Ａｓｈｗｅｌｌ　　Ｇ。
Ｈａｒｆｏｒｄ　　／、　　Ａ？＆ｓｓ　　Ｒｇｖ、　
　Ｂｉｏｃｈｔｍ。
１９８２：５１：５３１−５４）。
（１５）　フイウム　エル、ツシ　シー、マツティオリ
　ニー０．エフイービーニス　レター、１９８２：　１
４６：４２−４６（７＜ｓｍｇＬ、、Ｅａｓｔ　　Ｃ，
Ｍａｔｔｔｏｌｉ　　Ａ、、ＦＥＢＳＬｅｔｔ、１９８
２：１４６：４２−４６）。
（１６）　　フイウム　エル０．マツティオリニー、ツ
シ　シー０．　アッコルシ　シー０．グツド（Ｆｔｗｔ
ｎａ　Ｌ、、　Ｍａｔｔｔｏｌｔ　Ａ、　ＢｓａｔＣ８
ＡＣＣｏデａｉ　　Ｃ，、Ｇｓｔ　）（１７）　　フイ
ウム　エル０．マツティオリニー、ツシ　シー０．スピ
ノザ　ジー０．ライ−ランド　ティー０．エキスペリエ
ンティア１９８２：３８：１０８７−８９（Ｆ＜ｕｍＬ
、。
ＭａｔｔｉｏｌイＡ、Ｂｘａｉ　Ｃ，、Ｓｐイｎｏａａ
　Ｇ、。
１１ｔｇｌａｎｄ　　Ｔ、、　　Ｅｚｐｅｒｔａｎｔｉ
ａ　　１９８２　Ｈ２Ｓ：１０Ｂ７−８９）、参照〕。
これらの実験において使用されたＬ−５Ａ−αγα−Ａ
ＭＰ結合体を製造した方法 ［”　　＋１８）　　フイウム　エル、マツティオリニ
ー、ブシ　シー、等、エフ　イー　ビーニスレター：　
１１６　：　１８５−’８Ｂ　（Ｆｉｓｍｅ　　Ｌ。
Ｍａｔｔｉｏｌｉ　Ａ、ｆｈｂｓｉ　　Ｃ，ａｔ　　ａ
ｌ、ＦＥＢＳＬｇｔｔＨ１１６：１８５−８８）） は酸性環境（ｐＨ５，５−５，５）におけるＬ−ＨＳＡ
と活性化されたαγα−ＡＭＰの結合反応ｌ　ｃｏｎｊ
ｌＬｇａｔｉｏｎ）基づいている。
この方法は、凍結乾燥後、もし−２０℃で貯蔵されたと
しても、短い時間（室温で約１−３及び０−４℃で１週
間以下並びに−２０℃で数週間（（ｓｏｆｒＬｇ　　ｖ
Ｊｅａｋａ　）　）に不溶性になり、従って広範に治療
学的に使用するには役に立た′ない製品をもたらすとい
う欠点を有する。
本発明の主要な目的は、凍結乾燥後無期限に可溶性のま
まである結合体生成物を与える、ａｒａ−ＡＭＰとラク
トサミン化ヒトアルブミンの結合反応（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｉｏｎ）の方法を提供することである。この目的は、
カルボジイミドで活性化されたａｒａ−ＡＭＰとＬ−８
ＨＡを６．５より高いｐＨで相互に接触させることを特
徴とする、ａｒａ−Ａ　Ｍ　ＰとＬ−８ＨＡとの結合反
応方法によって達成される。
好ましい態様に従えば、水性溶液の形態にあるａｒａ−
Ａ　Ｍ　Ｐ及びＬ−３ＨＡをカルボジイミド、特に１−
エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）−カルボジ
イミドの存在下に接触させ、それによりａｒａ−ＡＭＰ
の活性化を直接に反応媒体中で行なう。
下記の詳細な説明かられかる通り、本発明の方法によっ
て得られた結合体は分光光度法により計算して、５乃至
２０間で変るａｒａ−ＡＭＰとタンパク質のモル比を示
す１本発明の主な利点は、治療的活性は同じであるが、
本発明の結合体は製造及び凍結乾燥の後可溶性のままで
あり、従ってそれが室温で貯蔵されたとしても治療学的
に有用であり、このことは工業的製造が可能であり、及
び工業的製造を可能ならしめ及び工業的製造を予測する
ことができることを意味し、これに対して従来ニの結合
体は、それが短い時間に不溶性になることにより製造の
殆んど直後使用されなければならなかったということに
ある。かくして、この目的は、アデニン−９−β−Ｄ−
アラビノフラノシド５′モノホスフェートをラクトサミ
ン化ヒトアルブミンと結合させることを含む方法におい
て、水性溶液中の結合されるべ外上記２つの成分をカル
ボッイミド、好ましくは１−エチル−３−（ジメチル−
アミノプロピル）−カルボッイミドの存在下に攪拌シナ
力らインキュベートすること及び反応混合物ｐＨを６．
５より高い値に調節し、次いで反応混合物を分離するこ
とを特徴とする前記本発明の方法により達成される。
たとえ室温に保持されたとしても凍結乾燥後可溶性のま
まである結合体が本発明の方法によって得られる理由は
まだ解明されていないけれども、かかる結果について下
記理論的説明を与えることは持つとものように思われる
。
ラクトサミン化ヒトアルブミンと、式 ％式％ を有するカルボッイミドで活性化されたａｒａ−ＡＭＰ
の結合反応において、それは式 ％式％ （式中Ｒ及びＲ′はカルボジイミド上に存在する特定の
化学的基を表わす） を有するカルボッイミドによっても活性化され、５つの
誘導体が形成され得る。即ち、 １　）Ｌ−ＨＳ　Ａ　−ＣＯ−０−Ｐ　−０−ａｒａ−
Ａ■ ２　）Ｌ　−ＨＳ　Ａ−Ｎ　Ｈ−Ｐ　−０−ａｒａ−Ａ
ｔ Ｏ−（ホスホアミド） ３　）Ｌ　−ＨＳ　Ａ　−０−Ｐ　−０−ａｒａ−Ａｔ ０　　　　（ホスホエチル） Ｏ″″ ４　）Ｌ−ＨＳ　Ａ−３−Ｐ　−０−ａｒａ−Ａｔ ０−　　　　（チオホスフェート） −Ｐ−ＯＨ （式中形成されているバンド（ｂｉｎｄ）の種類はかっ
こ内に示されている）。
始めの４つの誘導体は、それぞれ、Ｌ−Ｈ６Ａノ基、Ｃ
ＯＯ−１ＮＨ，、ＯＨ％ＳＨ，とｌｙルポノイミドによ
り活性化されたａｒａ−ＡＭＰの反応から生じる。
ＩＪｆＪ５ノ誘導体は、ａｒａ−ＡＭＰの糖（アラビノ
ース）のＯＨ基とＬ−Ｈ３Ａ（カルボッイミドにより活
性化された）のカルボキシル基の反応に白米する。しか
しながら、この第５の誘導体の形成はありそうもない。
何故ならば、ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐにおいて利用し得る７
ラビ／−スのＯＨ基は、強い条件下でのみエステル化す
ることができる２級ＯＨ基であるからである。
ｔｊ＆１ノ誘導体においては、ａｒａ−ＡＭＰのホス７
二−トはホスホ無水物結合を介してタンパク質のカルボ
キシル基に結合している。これは、ＮＦ２基の存在下に
おいてアミツリシスを受ける非常に反応性の結合であり
、それによりカルボアミドバンド（ｃａｒｂｏａｍｉｄ
ｉｃ　　ｂａｎｄ）が形成されそしてホスフェートが放
出されるＥノ、ディ　サパト、グプリュ、ビー、ジエン
クス、ジャーナル　オプ　アメリカン　ケミカル　ソサ
イエテイ、８３巻、４３９３−４４００　、１９６１（
Ｇ、Ｄｉ　５ａｂａｔｏ、　　　　、ＦＷ、　　Ｐ、　
　Ｊｅｎｃｋｓ、　　　Ｊ、Ａｖｂ、　　Ｃｈｅｗ、Ｓ
ｏｃ、　　８　３゜４３９３−４４００−．１９６１）
］。
酸性ｐＨにおいて製造された結合体においては、ホスホ
７ンハイドライド結合は、他のＬ−Ｈ３Ａ分子のＮＦ２
基と凍結乾燥後に反応することによって、Ｌ−ＨＳＡ分
子の付随する重合を伴なってカルボアミド結合を形成す
る。
この徐々に進行する重合は誘導体の溶解性損失の原因で
ある。３１ｐのＲＭＮスペクトル分析によって、５．５
の如き酸性ｐＨで製造された結合体においては、ａｒａ
−ＡＭＰとＬ−Ｈ３Ａの間のすべての結合はホスホ無水
物型であり、これに対して製造がより高いｐＨ１例えば
７．５で行なわれるときはａｒａ−ＡＭＰとＬ−Ｈ３Ａ
−との間の結合は２つの型である： ａ）　　ａｒａ−ＡＭＰホスフェートとタンパク質のり
ノン残基ε−ＮＨ２との間のホスホアミド型、ｂ）ａｒ
ａＡＭＰホスフェートとタンパク質のカルボキシル残基
（グルタミン及び／又はアスパラギン酸の）との開のホ
スホ無水物型。
かくして、２つの型の結合の割合は結合反応のｐＨに依
存しているように思われる。
これは酸性ｐＨでは十分にプロトン和してお９（ｐｒｏ
ｔｏｎａｔｅｄ）（−Ｎ　Ｈｆｆ”）従ってカルボッイ
ミドにより活性化されているａｒａ−ＡＭＰと反応する
ことはできないＬ−Ｈ８ＡのＮＦ２基は、アルカリ性ｐ
Ｈにおいては反対に少な（とも−邪説プロトン化され（
ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｅｄ）、従って活性化されたａｒ
ａ−ＡＭＰとの反応にいてＣＯＯ−基と首尾良く競合す
ることができ、かくして第２誘導体（ホスホアニドライ
ドバンド）の形成に導くということにより極めて確から
しい。これは、カルボジイミドによってヒトアルブミン
とチミジル酸の結合反応をＰＨ７，５で行ない、そして
これらの条件下ではホスホ７ミデートのみが形成される
（化合物２におけると同じ結合）ことを証明することが
できたハロラン（Ｈａｌｌｏｒａｎ）及びパーカー（Ｐ
　ａｒｋｅｒ）［ジャーナル　イムノロノー（Ｊ、Ｉｍ
ｍｕｎ、９６，３７３．３７８．１９６６）］の実験に
よって確かめられる。
ラクトサミン化アルブミンとａｒａＡの結合体は、上記
方法とは異なる反応経路によっても得ることができ、そ
の場合には、ホスホリル化されていないヌクレオシドか
ら出発して、ａｒａ−Ａは無水コハり酸によってａｒａ
−Ａスクシネートに又は無水グルタル酸によってａｒａ
−Ａグルタレートに転化することができる。しかる後、
これらの誘導体は、それらのスクシンイミドエステルを
介して又は混合無水物法によって又はカルボジイミドに
よってＬ−ＨＳＡに結合することができる。これらの方
法の１つによって、ａｒａ−Ａはａｒａ−Ａゲルタレ＝
）に転化され、このものはそのヒドロキシスクシンイミ
ドエステルを介してアジア０７エチユイン（ａｓｉａｌ
ｏｆｅｔｕｉｎｅ）（Ａ　Ｆ　）に結合された（ＡＦは
、Ｌ−ＨＳＡと同様に、肝細胞に選択的に浸透する糖タ
ンパク質である）。かくしてａｒａ−Ａの肝標的化（ｂ
ｅｐａｔｉｃ　　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）をマウスにおい
て生じるのに薬理学的に活性であることが見出されたａ
ｒａ−Ａ−ｇｌｕｔ−Ａ　Ｆ結合体が得られた［フイウ
ム等（Ｆｉｕｍｅｅｔ　　ａｔ、、　　ＦＥＢＳレター
（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ　　Ｌｅｔｔ）。
１１６．１８８（１９８０）］。
下記実施例は本発明の方法を限定することなく説明する
ものである。
実施例１ ａｒａ−ＡＭＰ　７５ｍｇ（２１６μモル）をｊ’Ｊ　
ａ　ＨＣＯｓ（粉末）を添加して８２０１　、５　ａａ
ｌ中に溶解する。
この溶液にＬ−ＨＳＡ　７５ｍｇ（０，９４６ｆｉモル
）を加える（モル比ラクトース／アルブミン＝２９−３
１）、Ｌ−ＨＳＡが溶解すると、ｐＨを電位差計の制御
下に１ＯＮＮａＯＨで７．５に至らしめ、モして１−エ
チル−３−（ジメチル−アミツブａビル）カルボジイミ
ド７５．（３９１μモル）を加える。
混合物を暗所で攪拌下に２５℃で２４時間インキュベー
トし、次いで、２容量の０．９％ＮＩＬＣＩを加えた後
、セファデックスＧ−１００カラム（４０−１２０μ）
１．９Ｘ１３０ｃ鎗でクロマトグラフィーにかけ、平衡
化しセしてＮａＣｌの０．９％溶液で溶出する。
Ｌ−ＨＳＡのモノマー及びオリゴマーに相当する両分を
一緒にしそしてそのｐＨがＮ　ａ　ＨＣＯ３で７．５−
８に調節されているＨ、Ｏに対して２−４℃で透析する
。次いで、結合体を凍結乾燥する（５０−５５ｓ＋ｇ）
、結合体は生理学的溶液（０，９％ＮａＣ１）中に１０
０　ｍｇ／　ｗｒｌ　（最大試験濃度＞＊で可ｓである
。
ポリアクリルアミドデル中の電気泳動をウェーバ−ケイ
　（Ｗｅｂｅｒ　　Ｋ＞及びオスボーン　エム（Ｏ５ｂ
ｏｒｎ　　Ｍ　）の方法、ジャーナル　オプ　ノイイオ
ロジカルケミスト’Ｊ−（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　
＞。
１９６９．２４．４４０６−１７、の方法に従ってドデ
シル硫酸ナトリウムの存在下に行なった。
電気泳動の後、ゲルをクーマシー　ブリリアンＦブルー
（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　　ｂｌ
ｕｅ）で着色しそしてデンシトメーター法による結合解
析を行なった。最も高い割合の結合はラクトサミン化ヒ
トアルブミンの移動度を有してお、す、次の結合はラビ
ットの７Ｓγ−グロブリンの移動度を有している。横座
標に電気泳動移動度を、そして縦座標にＬ−ＨＳＡ及び
そのオリゴマー形！！！（モノマー・ダイマー、トリマ
ー及びテトラマー）の分子量の対数をチャートにプロッ
トすることによって直線が得られる。この事実は第７、
第３及び第４ノインド（割合が減少する順に）はそれぞ
れＬ−ＨＳＡのダイマー、トリマー及びテトラマーに相
当することを示唆する。
電気泳動は結合体がＬ−Ｈ３Ａモノマー約３７％、ダイ
マー２２％、トリマー１５％及びテトラマー８％を含み
、残りの１８％はＬ−Ｈ！３Ａのより高級オリゴマー（
添付図に示された如き）から成ることを示す、これらの
百分率は凍結乾燥の４ケ月後に行なわれた電気泳動分析
により示された如く長期間において変化しない、かくし
て、上記方法に従って製造された結合体は公知方法に従
って製造された結合体と異なって凍結乾燥後に重合を起
こさないことが証明される。
凍結された結合体のモル比ａｒａＡＭＰ／タンパク質を
測定するために、結合体を再びセフ７デツクスＧ−１０
０カラムでクロマトグラフィーに付し、平衡化しそして
０．９％ＮａＣｌで溶離する。
モル比は下記の方法により分光光度法により決定する。
アルブミンの濃度はロウリー等（Ｌｏｗｒｙｅｔ　　ａ
ｌ）の方法Ｉジャーナル　オプ　バイオロジカル　　ケ
ミスト　リー（Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　
１　９５　１．１９３．２６６−７５）により測定され
、次いで２６０＋ａμにおける光学密度が分光光度計で
読み取られる。次いで、その波長におけるアルブミンに
よる寄与（Ｅ１ｃＩｆｉ２６ｏ　＝３．８６）は差し引
かれ、そして得られる値からａｒａ−ＡＭＰの濃度（Ｅ
ｌ。ｌｌ１２６ｏ　＝４２０）が計ヰされる。上記方法
によって得られた結合体の６つの異なる調製物のモル比
は１３−１　ｓであることが見出された。
０−４°Ｃ又は室温に保持された結合体の溶解性及びモ
ル比ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐ　／　Ｌ　−ＨＳ　Ａは長期間
（今日までに試験された最大の時間である少なくとも４
ケ月まで）において減少しない。
実施例２ ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐ　１５０　ｍｇをＮ　ａ　ＨＣＯ３
（粉末）を添加して３ｍｆＨ２０中に溶解する。この溶
液にり、。−）（ＳＡ１５０ｍｇを加える。Ｌ−Ｈ３Ａ
が溶解すると、ｐＨを電位差計による制御下にＩＯＮ　
　ＮａＯＨで７．５に調節し、しかる後１−エチル−３
−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド１５０ｍ
ｇを加える。混合物を暗所で攪拌下に２５℃で２４時間
インキュベートする。
混合物（約３ＩＩｌｌ）を磁気手段によって攪拌下に保
持されたＮａＣ１の０．３％水溶液５１を含有するフラ
スコに入れられた６、３１の直径を有するビスキング管
（Ｖ　ｉｓｋｉｎｇ　　ｔｕｂｅ）中で透析する。
これらの条件下では結合体の沈澱は起こらない。
透析は０−４℃で２４時間続け、モしてＮａＣ１の０．
３％溶液を２回変える。２４時間及び２回のこの変更の
後遊離ａｒａ−ＡＭＰは最早存在しない。
結合体を集め、そしてその容量を測定する。結合体（１
５０ｍｇ）は今やＮａＣｌを含有する溶液（３ｍｇ／ｍ
１）中に溶解した状態で含まれている。結合体各１００
＋ａｇ当り９ｍｇのＮａＣｌが存在しているように更に
ＮａＣ１を加え、次いで凍結乾燥を行なう。
この状態において、凍結乾燥された調製物１１０９Ｉ１
を１ｍｊ！Ｈ２０で溶解することによって（溶解性は最
適である）、注射にいつでも使用できる状態の生理学的
溶液（０・９％８“Ｃ１）１・ｌ中の結合体　　　　　
　１１００ｍｇの溶液が得られ、又はこのものは生理学
的溶液で更に希釈することができる。
実　　１に　って製゛されたａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐ　−Ｌ
　−Ｈ３Ａ結合体の一物学・性 ａｒａ−ＡＭＰとの結合反応は、ガラクトースで終るタ
ンパク質に特異的な肝細胞の受容体とのし−Ｈ８Ａの相
互作用能力に影響を与えない。
事実、マウスにおいて（以下に報告したデータかられか
る通り）、血漿からの放射性アシアロ７エチユイン（Ａ
Ｆ）の消失は結合体及び等量の結合されていないＬ３＋
Ｈ３Ａ（ｎｏｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ　　Ｌｓ＋Ｈ３
Ａ）によって同じ速度で競合的に阻止される（７エチユ
インは、シアル酸の除去の後はガラクトース残基を露出
し七して肝細胞中に選択的に浸透するウシ胎仔血清（ｂ
ｏｖｉｎｅ　　ｐｈｏｅｔａｊ　　ｓｅｒｕｍ）のタン
パク質である）（既に記載したアシュウエル等の論文（
１４）参照）。　　　表１ ［”ＣＩアシアロ７エチユイン（ＡＦ）の血漿からの消
失に対するＬ　＝１−ＨＳ　Ａ−ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐ　
、、の作用なし　　　　　　　　　　３，７９５±６０
９Ｌ３．−Ｈ８Ａ　　　　　　　９，４４６±１，４６
２７エチユインは酵素により脱シアル化され（ｄｅｓｉ
ａｌａｔｅｄ）巨２２）モレル　ニーノー、７アンデル
ハマー　シーノエ仁シャインバーグ　’ＩＨ。
アシュエウル　ジー、ジャーナル　オブ　バイオロジカ
ル　ケミストリー、１９６６；２４１：３７４５　４９
（（２２）Ｍｏｒｅｌｌ　　ＡＧ、　Ｖａｎ　　ｄｅｒ
Ｈａｍｅｒ　　ＣＪ、　Ｓｃｈｅｉｎｂｅｒｇ　　ＩＨ
％ＡｓｈｗｅｌｌＧ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、１９６
６；２４１：３７４５−４９）］、次いで［”ＣＩホル
ムアルデヒドで標識された［（２３）コックス　アール
ニー、グリーンウェル　ピー、バイオケミカル　ジャー
ナル。
１９８０；１８６　８６１−７２（Ｃｏｘ　　ＲＡ、Ｇ
ｒｅｅｎｗｅｌｌ　　　Ｐ、　　Ｂｉｏｃｈｅｍ　　　
Ｊ　、　　１　９　８　０：１　８　６−８６１−７２
）］。
２８−３０ｇの雌のスイスマウス（Ｓ　ｍ１ｓｓ　　ｍ
１ｃｅ）にｌ’ｃＡＦ（４，９Ｘ１０＠ｄｐ髄／ｍｇ）
２μｓ／ｇを静脈内に注射した。　Ｌ　３１−　ＨＳ　
Ａまたは結合体を２μｓ／ｇの投与量でｌ’ｃＡＦと同
時に静脈内に投与した。すべての場合に、注射した容量
は１０μｍ／ｇであった。１０分後この動物を殺しそし
て血漿の放射能を測定した。各値は１０匹のマウスから
得られた結果の平均（±Ｓ、Ｅ、）を表わす。
表２は、エフトロメリア　ウィルス （Ｅｃｔｒｏｍｅｌｉａ　　ｖｉｒｕｓ）により誘発さ
れた肝炎にかかったマウスのＨｌｌ（ｉｎｔｅｓｔｉｎ
ｅ）及び骨１ｉ　（ｍｅｄｕ　ｌ　ｌ　ａｏｓｓｉｕｍ
）における細胞Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｃｅｌｌｕｌａｒ　　Ｄ
　Ｎ　Ａ　）の合成並びに肝臓におけるウィルスＤＮＡ
の合成に対して、放射性チミジンの２時間前に注射され
た２つの投与量の結合体の作用を示す。結合体は他の２
つの器官における阻害を引き起こすことなく肝臓におけ
るＤＮＡの合成を阻害する。体重１８当り１．３３ｍｇ
の投与量でマウスに静脈内経路により投与された結合体
は毒性の明白な徴候を何ら引き起こさない、結合体のこ
の投与量の注射に続く１０日間における体重増加の曲線
及び食物消費の曲線は生理学的溶液を静脈内投与された
対照マウスのそれに等しかった。１．３３ｍｇ／ｇの投
与量は試験された最大投与量であり、そしてエフトロメ
リアウィルスにより誘発された肝炎の処置にたいして使
用される投与量より４０−５０倍大きいく表２参照）。
４影 エフトロメリアウィルスに感染したマウスの肝臓、腸及
び骨髄におけるＤＮＡの合成に対する結合体Ｌ　３１−
ＨＳ　Ａ−ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐ　１４の効果。実験は（
１６）に報告された変更を伴なって（１３）に記載の如
くして行なわれた。結合体は放射性チミジンの２時間前
に注射した。結果は特別研究員（Ｓ　ｔｕｄｅｎｔ）の
ｔ試験（ｔ　　ｔｅｓｔ）によって統計的に評価された
。
（ｐ＜ｏ、ｏｉ） （Ｐ＜０．０１） ”　　Ｌ　−ＨＳ　Ａ　−ａｒａ−Ａ　Ｍ　Ｐの６５　
　　いＨこれらの実施例下記表３に報告されたデータか
ら再び始められ及び再び始めることができる（その製造
が実施例１に記載された結合体は表の結合体Ｎｏｌに相
当する）。使用したカルボジイミド、Ｌ−Ｈ８Ａのラク
トース／アルブミン　モル比、反応時間及び温度、反応
体濃度及びｐＨ値（それらは常に６．５より大きいとの
条件下に）を変えることによって、たとえ室温に保持さ
れたとしても凍結乾燥後可溶性のままである結合体が常
に得られる。
【図面の簡単な説明】
添付図面は実施例１に記載の電気泳動のグラフ図である
。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、カルボジイミドで活性化されたαγα−ＡＭＰとラ
    クトサミン化ヒトアルブミン（Ｌ−ＨＳＡ）とを反応さ
    せることを含むラクトサミン化ヒトアルブミンとアデニ
    ン−９−β−Ｄ−アラビノフラノシド５′モノホスフェ
    ート（αγα−ＡＭＰ）の結合体の製造方法において、 結合反応を６．５より高いｐＨで行なうことを特徴とす
    る方法。 ２、カルボジイミドによるαγα−ＡＭＰの活性化は、
    αγαＡＭＰ及びＬ−ＨＳＡを含有する反応媒体中で該
    反応媒体中にカルボジイミドを導入することによつて直
    接行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 ３、該カルボジイミドが１−エチル−３−（ジメチル−
    アミノプロピル）−カルボジイミドであることを特徴と
    する特許請求の範囲第１及び／又は２項記載の方法。 ４、該ｐＨは６．５乃至９．５であることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５、該ｐＨは７．５であることを特徴とする特許請求の
    範囲第４項記載の方法。 ６、該反応を２５℃の温度で行なうことを特徴とする特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、特許請求の範囲第１−５項の何れかに記載の方法に
    より得られた、分離して取り出されたラクトサミン化ヒ
    トアルブミンとアデニン−９−β−Ｄ−アラビノフラノ
    シド５′モノホスフェートの結合体。 ８、アデニン−９−β−Ｄ−アラビノフラノシド５′モ
    ノホスフェートとラクトサミン化ヒトアルブミンのモル
    比が５乃至２０であることを特徴とする特許請求の範囲
    第７項記載の結合体。
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