RO122279B1

RO122279B1 - Amilopectină hiperramificată pentru utilizare în tratamentul chirurgical şi terapeutic la mamifere sau pentru metode de diagnostic, în special, pentru utilizare ca expandor de volum al plasmei

Info

Publication number: RO122279B1
Application number: ROA200400154A
Authority: RO
Inventors: Klaus Sommermeyer
Original assignee: Supramol Parenteral Colloids Gmbh
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2002-08-06
Publication date: 2009-03-30
Also published as: DK1421120T3; PL369363A1; MXPA04001606A; RU2303984C2; CA2456507A1; ATE360651T1; AU2002325398B2; EP1421120B1; JP2005501930A; ES2283585T3; HUP0401188A2; CN1545522A; HK1068356A1; CN100390203C; EP1421120A1; KR100898528B1; US20040157207A1; RS14704A; DE10235954A1; RU2004108122A

Abstract

Prezenta invenţie se referă la amilopectină hiperramificată şi la derivaţi ai acesteia, pentru utilizare în tratamentul chirurgical şi terapeutic la mamifere sau pentru metode de diagnostic, în special, pentru utilizare ca expandor de volum al plasmei. Amilopectina hiperramificată prezintă un grad de ramificare mediu între > 10 şi 25 mol % şi o masă moleculară medie gravimetrică în intervalul 40000 până la 800000 Dalton.

Description

Prezenta invenție se referă la utilizarea amilopectinei hiperramificate; în particular, invenția se referă la o nouă utilizare a amilopectinei hiperramificate care prezintă un grad de ramificare specific și o greutate moleculară specifică, GM în domeniul medical.

Este cunoscut faptul că, în cursul istoriei dezvoltării expandorilor de volum al plasmei, întotdeauna unul dintre scopuri a fost obținerea structurii globulare a purtătorului natural al presiunii coloidal-osmotice în ser, și anume albumina. Glicogenul care, de asemenea, apare ca o polizaharidă de retenție naturală în organismul uman, tinde spre această structură globulară. Glicogenul realizează structura sa globulară ca rezultat al gradului său de ramificare foarte ridicat. Din punct de vedere structural, glicogenul este o polizaharidă de tipul glucozei, cu legături a-1,4 glicozidice, în secțiuni lineare, la care sunt fixate punctele de ramificare a-1,6 glicozidice. Deoarece glicogenul însuși nu este disponibil ca o sursă de materie primă ieftină, Wiedersheim a sugerat în 1957 să se utilizeze în schimb amilopectină slab ramificată ca materie primă pentru producerea hidroxietilamidonului (HES) expandor de plasmă. între timp, hidroxietilamidonul s-a utilizat sub forma câtorva tipuri diferite pe scară foarte largă, ca expandor de plasmă. Această dezvoltare a dus la noi tipuri de hidroxietilamidon (tipuri de HES) care prezintă un efect de volum optim, cu efecte secundare minime, cum arfi, de exemplu, influențarea coagulării sau retenției intermediare în țesut.

Tipurile diferite de HES prezente pe piață diferă în funcție de greutatea lor moleculară, gradul mediu de substituție și schema de substituire.

în ciuda progreselor substanțiale obținute prin intermediul acestor cercetări, unele dezavantaje au rămas chiar și în cazul tipurilor de HES optimizate în ultimii câțiva ani, în special, incapacitatea de a fi metabolizate complet.

Se știe totuși că, vorbind din punct de vedere chimic, gruparea de eter hidroxietilic este extrem de stabilă din punct de vedere metabolic, astfel încât acele unități de glucoza anhidră ale hidroxietilamidonului care poartă grupări de eter hidroxietilic sunt practic imposibil de metabolizat. Mai mult, se știe că numai acele legături a-1,4 glicozidice din molecula de hidroxiletilamidon pot fi descompuse cu α-amilază serică, care sunt formate din unități de glucoză nesubstituite. Din acest motiv, s-a găsit că, chiarîn cazul tipurilor optimizate de HES, o minimă, dar încă o remarcabilă historetenție poate fi asigurată cel puțin după anumite perioade de timp.

Ca un alt dezavantaj, s-a găsit că HES nu posedă structura globulară ideală a albuminei și viscozitatea sa intrinsecă este astfel considerabil mai mare decât aceea a albuminei. O viscozitate relativ scăzută este de dorit în cazul unui expandor de plasmă, deoarece, după aplicarea sa în circulație, viscozitatea totală a sângelui ar putea fi influențată în sensul unei reduceri.

Problema pe care o prezintă invenția constă în prezentarea unei amilopectine hiperramificată care prezintă un grad de ramificare mediu.

Amilopectină hiperramificată conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că prezintă un grad de ramificare mediu, exprimat în % mol glucoză anhidră care au punct de ramificare între > 10 și 25 % mol și o medie a greutății medii a greutăților moleculare GM în intervalul 40.000 până la 800.000 Dalton și derivați ai acesteia, pentru administrare în metode pentru tratamentul chirurgical sau terapeutic al corpului uman sau animal, sau în metode de diagnostic.

Prin aplicarea invenției se obține avantajul obținerii de expandori de plasmă îmbunătățiți în care se metabolizează complet amilopectină derivată din hidroetilamidon.

De aceea, obiectivul a fost acela de a obține expandori de plasmă îmbunătățiți pe bază de amilopectină, care nu prezintă dezavantajele lipsei metabolizării complete a amilopectinei derivată din hidroxietilamidon. în același timp, noul expandor de plasmă a avut o structură mai globulară și astfel a fost capabil să formeze soluții cu viscozități relativ scăzute.

RO 122279 Β1

De asemenea, poate fi considerat a fi unul dintre scopurile invenției, deschiderea de 1 domenii suplimentare de aplicare pentru anumite amilopectine.

Aceste scopuri, precum și alte scopuri neprezentate în detaliu, care, totuși, pot fi deri- 3 vate liber și ușor din explicațiile indroductive, sunt realizate prin obiectul revendicării 1. Realizări preferate ale invenției sunt obiecte ale revendicărilor care fac referire la revendicarea 1. 5

Prin utilizarea amilopectinei hiperramificate cu un grad de ramificare mediu, exprimată în mol % de glucoze anhidre care poartă puncte de ramificare, între > 10 și 25 mol % 7 și o greutate moleculară medie GM în intervalul 40.000 până la 800.000 Dalton și, dacă este necesar, derivații săi în metode pentru tratamentul chirurgical sau terapeutic al organismului 9 uman sau animal (care include pe acel al mamiferelor) sau în metodele de diagnostic, este posibil să se deschidă, nu într-un mod direct previzibil, pe de o parte, un număr de noi și inte- 11 resante aplicații în domeniul medical pentru amilopectină hiperramificată. Pe de altă parte, un substituent aproape ideal pentru produsele HES pe bază de amidon încă utilizate de 13 obicei în practică, este asigurat în mod specific referitor la domeniul expansiune de volum al plasmei care duce la efecte secundare mai puțin periculoase. 15

Referitor la expansiunea de volum al plasmei, în fapt s-a găsit, în conformitate cu invenția, ca rezultat al studiilor și investigațiilor extinse, că fracțiunile reziduale ale 17 hidroxietilamidonului în fluxul sanguin și în urină arată o creștere puternică a gradului de ramificare câteva ore sau chiar zile după aplicarea unui expandorde plasmă în comparație cu 19 hidroxietilamidonul (produs HES) infuzat inițial. Gradele de ramificare, exprimate în mol % de glucoze anhidre care poartă puncte de ramificare, au crescut astfel de la aproximativ 21 5 mol % până la peste 7 mol %, la 2 h după aplicare, și până la 8 mol %, la 7 h după aplicare. în același timp, un grad de ramificare chiar mai ridicat decât 9 sau 10 mol% a 23 devenit evident în fracțiunea totală de urină de 48 sau 42 h după injectare. Acest fenomen a fost observat independent de greutatea moleculară, gradul de substituire sau schema de 25 substituire a hidroxietilamidonului aplicat. Aceasta înseamnă că, atunci când se divizează, aceste fracțiuni capătă din ce în ce mai mult o structură și/sau o ramificare apropiată, care 27 seamănă cu glicogenul care în literatură să arate ca fiind ramificat la un nivel la fel de ridicat de aproximativ 10 mol %. 29 în mod surprinzător, s-a găsit că stabilitatea relativă a ramificației a-(1,6) în amilopectină și în derivații săi poate fi exploatată pentru a reduce ruperea amilopectinei în 31 comparație cu ruperea α-amilazei dominante, la o asemenea extindere încât poate fi produsă o polizaharidă capabilă de rupere completă, care, totuși, prezintă proprietățile unui 33 expandor de plasmă ideal, în ceea ce privește farmacocineticile și/sau efectul de volum.

în consecință, invenția cuprinde utilizarea amilopectinei hiperramificate și a derivaților 35 săi din astfel de amilopectine hiperramificate în domeniul medical.

Termenul amilopectină se va înțelege că semnifică, în general, primul dintre toate 37 produsele din amidon ramificat sau amidon cu legături a-(1,4) și a-(1,6) între moleculele de glucoza. Aceste ramificații ale catenei au loc prin legături a-(1,6). în cazul amilopectinelor 39 naturale, acestea apar într-un mod neregulat aproximativ la fiecare 15-30 segmente de glucoză. Greutatea moleculară a amilopectinei naturală este foarte ridicată, de exemplu, în 41 intervalul 10⁷ până la 2 x 10® Dalton. Se crede în plus că amilopectină, formează spirale în anumite limite. 43

Este posibil să se definească un grad de ramificare pentru amilopectine. Raportul numărului de molecule de glucoza anhidră care au puncte de ramificare (legături a-(1,6)) 45 față de numărul total al moleculelor de glucoza anhidră ale amilopectinei este o măsură a ramificării, acest raport fiind exprimat în mol. Amilopectină naturală are un grad de ramificare 47

RO 122279 Β1 de aproximativ 4 mol %. Totuși, se știe că, atunci când este izolată, fasciculele și secțiunile de molecule ale amilopectinei prezintă un grad de ramificare ușor mai ridicat comparativ cu gradul mediu natural al ramificării.

Amilopectine hiperramificate, conform semnificației invenției, sunt acele amilopectine care prezintă un grad de ramificare care depășește semnificativ gradul de ramificare cunoscut pentru amilopectinele din natură. Gradul de ramificare este, în orice caz, o valoare medie (grad mediu de ramificare), deoarece amilopectinele sunt substanțe polidisperse.

Astfel de amilopectine hiperramificate prezintă grade de ramificare semnificativ mai ridicate, exprimate în mol % de glucoze anhidre ramificate, în comparație cu amilopectina neschimbată sau hidroxietilamidonul și, în consecință, seamănă mai mult cu glicogenul în ceea ce privește structura lor.

Gradul mediu de ramificare a amilopectinei hiperramificate, necesar pentru utilizarea conform invenției, este în intervalul > 10 și 25 mol %. Aceasta înseamnă că amilopectinele utile, conform semnificației invenției, prezintă în medie o legătură a-(1,6) și, în consecință, un punct de ramificare aproximativ la fiecare 10 până la 14 unități de glucoza. Dacă gradul de ramificare este sub 10 mol %, ruperea amilopectinei ramificate este insuficient întârziată (de exemplu, în cazul utilizării ei ca expandor de plasmă). Dacă gradul de ramificare este mai mare decât 25 mol %, ruperea este excesiv întârziată, astfel încât utilizarea ei ca expandor de volum al plasmei, de exemplu, este exclusă.

Un tip de amilopectină care poate să fie utilizată, de preferință, în domeniul medical este caracterizată printr-un grad de ramificare între 11 și 16 mol %.

Alte amilopectine hiperramificate preferate prezintă un grad de ramificare în intervalul dintre 13 și 16 mol %.

în plus, greutatea moleculară GM a amilopectinei hiperramificate este, de asemenea, importantă. Greutatea moleculară GM arată greutatea medie a greutății moleculare deoarece este măsurabilă prin metode corespunzătoare, care asigură această valoare medie. Acestea includ GPC apos, HPLC, difuzie a luminii și altele asemenea.

Amilopectinele hiperramificate corespunzătoare pentru utilizarea conform invenției prezintă, în general, o valoare pentru greutatea medie a greutății moleculare de 40.000 până la 800.000 Dalton. Valoarea limită mai scăzută pentru intervalul de greutate moleculară GM este obținută în cazul aplicațiilor preferate în principal de la așa-numitul prag renal care trebuie să se situeze la aproximativ 40.000 în cazul compușilor hiperramificați. Dacă GM este mai mică de 40.000 Dalton, moleculele vor fi separate prin filtrare prea rapidă prin rinichi. Peste o GM de 800.000 Dalton, nici o valoare de utilitate adițională care se menționează nu va fi atinsă, chiar dacă viscozitatea limită nu mai depinde de greutatea moleculară în cazul unei structuri globulare.

Valori medii GM între 90.000 și 300.000 Dalton sunt preferate pentru utilizare ca expandori de volum al plasmei, fiind corespunzătoare mai ales greutăți moleculare GM între 120.000 și 250.000 Dalton.

O realizare specială a invenției cuprinde amilopectină hiperramificată, gradul de ramificare mediu între 11 și 16 mol % și greutatea moleculară GM fiind între 90.000 și 300.000 Dalton. Alte realizări corespunzătoare ale invenției includ o amilopectină hiperramificată, gradul de ramificare mediu fiind între 13 și 16 % mol și greutatea moleculară fiind între 120.000 și 250.000 Dalton.

Parametrii menționați mai sus, și anume gradul de ramificare și greutatea moleculară, permit să fie exercitat un efect țintă (obiectiv) și astfel farmacocineticile dorite să fie stabilite, în particular, pentru obținerea unei ruperi dorite a α-amilazei. Gradul de ramificare a

RO 122279 Β1 amilopectinei are un rol cheie de îndeplinit în această chestiune. Mai mult, de asemenea, 1 poate fi posibilă influențarea cineticilor ruperii amilopectinei pentru a lua o direcție dorită variind distribuția punctelor de ramificare. 3

De o importanță specială pentru ruperea amilopectinei prin α-amilază și, în consecință, pentru funcționarea expandorului de volum al plasmei, este totuși gradul de râmi- 5 ficare. Ca rezultat al gradului ridicat de ramificare, atacul α-amilazei este mult întârziat și în suprafețele moleculei cu densitate ridicată a punctelor de ramificare eliminate complet, 7 deoarece nici un acces al α-amilazei nu este posibil acolo. Astfel de compuși sunt, cu toate acestea, capabili de rupere cu alte enzime complet până la oligozaharide și, în final, glucoza. 9

Dacă este nevoie, amilopectine hiperramificate pentru a fi utilizate conform invenției, pot fi obținute sub formă de derivați. Astfel de derivați cuprind derivați chimici ai amilopectinei 11 cum ar fi, de exemplu, cei care se pot obține prin transformări chimice sau conversii biotehnologice. 13

Derivații preferați de amilopectină hiperramificată sunt hidroxietilamilopectina, hidroxipropilamilopectina și acetilamilopectina. în schimb dintre acestea, este avantajos să 15 se utilizeze în special hidroxietilamilopectina. De asemenea cineticile ruperii amilopectinei pot, în consecință, să fie influențate prin derivatizare. Totuși, este avantajos pentru gradul 17 de derivatizare, de exemplu, gradul de hidroxietilare să fie considerabil mai scăzut în aceste cazuri pentru a obține un efect de volum comparabil sau farmacocinetici similare față de 19 hidroxietilamidonul (HES) produs din amilopectină ramificată normal.

Producerea de amilopectină hiperramificată care este corespunzătoare în conformitate 21 cu semnificația invenției - printre alte lucruri și, de preferință - pentru utilizare ca un expandor de volum al plasmei, are loc într-un mod cunoscut, cum arfi prin conversie enzimatică cu așa- 23 numitele enzime de ramificare care catalizează hidroliza legăturilor a-1,4 glicozidice și conversia lor la compuși a-1,6 glicozidici. Astfel, așa-numitele enzime de transfer pot fi extrase în mod 25 cunoscut, de exemplu, din alge, în conformitate cu PCT WO 0018893. Totuși, din brevetele US 4454161 și EP 0418945 sunt cunoscute alte enzime de ramificare a glicogenului care pot, 27 de asemenea, să fie utilizate corespunzător. Efectuarea transglicozilării enzimatice are loc într-un mod cunoscut cum ar fi, de exemplu, prin incubarea amidonului de porumb ceros cu 29 enzime corespunzătoare, în condiții blânde, la un pH de aproximativ 7,5 și temperaturi de aproximativ 30°C, în soluție apoasă. Realizarea preparatului de reacție are loc ulterior din 31 nou pe cale obișnuită, enzimele fiind mai întâi dezactivate sau îndepărtate prin schimbarea pH-ului sau prin etape de filtrare. 33 într-o etapă de hidroliză ulterioară, care are loc, de preferință, prin intermediul acidului clorhidric, este corectată greutatea moleculară dorită a produsului. Prin diafiltrare pe 35 membrane de aproximativ 3000 Dalton, produsul este eliberat ulterior din compușii moleculari inferiori și sarea obișnuită formată în timpul neutralizării preparatului de hidroliza 37 acide. Produsul este izolat, de exemplu, prin liofilizare.

Independent de utilizarea ca expandori de volum al plasmei, amilopectinele 39 hiperramificate pot să fie utilizate, de asemenea, în alte domenii ale medicinei. Amilopectină hiperramificată poate fi astfel utilizată pentru toate acele aplicații din domeniul terapiei și 41 chirurgiei în care pot fi folosite produsele HES standard pe bază de tipuri de amidon ramificate normal. 43

Independent de utilizarea ca expandor de volum al plasmei, aceasta implică de preferință utilizarea pentru îmbunătățirea microcirculației, utilizarea ca auxiliar de sedimentare 45 în separarea celulară în legătură cu leucafereza sau pentru utilizarea în crioconservarea componentelor din sânge, cum ar fi eritrocite sau granulocite. 47

RO 122279 Β1 în continuare se prezintă 2 exemple de realizare a invenției

Exemplul 1. Teste comparative de rupere cu α-1-4/α-1-6 glucozaharide ramificate diferit

Glicogen de stridie de la SIGMA s-a tăiat cu α-amilază termorezistentă BAN 480 L de la NOVOZYMES într-un amestec de DMSO și apă cu un conținut de 30% DMSO la 70°C și un pH de 6,0. Desfășurarea reacției s-a monitorizat prin măsurarea schimbărilor în greutatea moleculară prin cromatografie de gaz și reacția a fost stopată după aproximativ 2 h prin adaos de soluție de sodă caustică pentru activarea enzimei. După neutralizare, produsul s-a fracționat prin ultrafiltrare prin intermediul unui ultrafiltru din acetat de celuloză cu o secțiune nominală de 1.000 D și 25.000 D pentru îndepărtarea fracțiunilor moleculare inferioare și păstrarea fracțiunilor moleculare superioare. Produsul s-a tratat ulterior cu schimbătorul de ioni Amberlite IR 200 C și cărbune activ, s-a precipitat cu etanol și s-a uscat la 80°C.

Gradul de ramificare determinat prin spectroscopie 1H RMN (integrarea semnalelor protonilor anomerici) a dat un grad de ramificare de 15 mol %. Greutatea moleculară medie GM a fost 7.000 Dalton.

Amidonul de porumb ceros subțiat la fierbere (> 95 % amilopectină) (Cerestar) s-a tratat în modul descris mai sus. Fracțiunea multiplu, ramificată, izolată, a fasciculului ramificat a prezentat un grad de ramificare de 11 mol %, greutatea moleculară medie GM a fost 8.000 Dalton.

Fasciculul de fracțiuni multiplu ramificate ale aminopectinei și glicogenului s-au supus ulterior la un test de rupere prin intermediul α-amilazei din pancreas de porc (Roche) în tampon fosfat de pH 7,2 într-o soluție 1 % la 37°C și cu 0,5 Ul/ml enzimă și cineticile de divizare s-au monitorizat prin măsurarea schimbărilor în greutatea moleculară prin cromatografie în gel. S-a realizat, de asemenea, un test comparativ al ruperii prin intermediul unui expandor de volum al plasmei din hidroxietilamidon comercial (Voluven, Fresenius Kabi). S-au obținut diferențe clare în cineticile de divizare. Timpul de înjumătățire al greutății moleculare (reducerea greutății moleculare medii GM a substanței de plecare până la jumătatea valorii inițiale) a fost de 60 min în cazul fracțiunii cu un grad de ramificare de 15% și, în consecință, s-a atins timpul de înjumătățire determinat în aceleași condiții de test ca acelea ale expandorului de plasmă Voluven.

Timpul de înjumătățire pentru fracțiunea cu un grad de ramificare mediu de 11 % mol pe de altă parte a fost de numai 25 min și astfel a fost considerabil micșorat.

Exemplul 2. Amidonul de porumb ceros de la Cerestar cu un grad de ramificare mediu determinat prin RMN de 4 mol % s-a supus la un test de divizare cu α-amilază din pancreas de porc, conform datelor prezentate în exemplul 1. Pentru acest scop, o soluție 1 % s-a gelatinizatîn tampon fosfat la pH 7,2 prin încălzire scurtă până la 90°C și după răcire, s-a adăugat enzima într-o cantitate care are drept rezultat 0,5 UI per ml.

Temperatura de test a fost 37°C.

Cineticile de divizare s-au monitorizat prin determinarea schimbărilor în greutatea moleculară prin cromatografie în gel. Greutatea moleculară a substanței de plecare s-a redus la jumătate din valoare în 10 min în aceleași condiții ca în exemplul 1.

în comparație cu α-1-4/α-1-6 glucozaharidele hiperramificate din exemplul 1, amidonul de porumb ceros subțire la fierbere, relativ slab-ramificat mediu este astfel rupt cu α-amilază atât de rapid încât nu poate fi utilizabil ca expandor de plasmă. în acest fel, cele două exemple 1 și 2 demonstrează că, chiar dacă greutățile moleculare sunt scăzute, niveluri mai ridicate ale ramificării duc la o întârziere a ruperii α-amilazei și că acest efect poate fi utilizat pentru fabricarea unui expandor de plasmă.

Claims

Revendicări 1

1. Amilopectină hiperramificată, care prezintă un grad de ramificare mediu, exprimat 3 în mol % glucoze anhidre care au punct de ramificare, între > 10 și 25 mol % și o medie a greutății medii a greutăților moleculare GM în intervalul 40.000 până la 800.000 Dalton și 5 derivații acesteia pentru administrare în metode pentru tratamentul chirurgical sau terapeutic al corpului uman sau animal sau în metode de diagnostic. 7
2. Amilopectină hiperramificată, conform revendicării 1, ca expandor de volum al plasmei. 9
3. Amilopectină hiperramificată, conform revendicării 1, pentru îmbunătățirea microcirculației. 11
4. Amilopectină hiperramificată, conform revendicării 1, ca auxiliar de sedimentare în separarea celulară legată de leucafereză. 13
5. Amilopectină hiperramificată, conform revendicării 1, pentru crio-conservarea componentelor din sânge, cum ar fi eritrocitele sau granulocitele. 15
6. Amilopectină hiperramificată, conform uneia dintre revendicările precedente, gradul de ramificare mediu fiind între 11 și 16 mol % și greutatea moleculară GM între 90.000 și 17 300.000 Dalton.
7. Amilopectină hiperramificată, conform uneia dintre revendicările precedente de la 1 19 până la 5, gradul de ramificare mediu fiind între 13 și 16 mol % și greutatea moleculară GM între 120.000 și 250.000 Dalton. 21