JP4851709B2 - 可溶性の高度に分岐したグルコースポリマー - Google Patents

Description

本発明は、還元糖の含有量が低く、α−１，６グルコシド結合の含有量が著しく高く、高分子の分子量分布が狭く、非常に特殊な分岐鎖長の分布形状を有する可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーに関する。

本発明は、また、固有粘度が低い可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーに関する。

本発明は、これらの可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを、より特に食品用途に、とりわけ医療用途に適用することを予定している。

「分岐鎖長の分布形状」という表現は、本発明のためには、α−１，６分岐点によって別の直鎖状のα−１，４グルコシド鎖に結合した直鎖状のα−１，４グルコシド鎖の、重合度（つまりＤＰ）で表されるサイズの分布を意味すると解される。

本発明は、また、前記可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを製造する方法に関する。

産業上利用可能なグルコースポリマーは、従来、天然のデンプンまたはハイブリッドデンプン、およびそれらの誘導体の加水分解によって調製されている。

標準的なデンプンの加水分解物は、例えば、穀物または芋類からのデンプンの酸加水分解または酵素加水分解によって製造される。それらは、実際は、非常に様々な分子量のグルコースおよびグルコースポリマーの混合物である。

産業界で（ある平均のＤＰで）製造される、これらのデンプンの加水分解物（デキストリン、マルトデキストリンなど）は、直鎖構造および分岐構造の両方を含む、広範な分布の糖類から成る。

デンプンの加水分解物、特にマルトデキストリンは、より特に、輸送体または充填剤、テクスチャ剤、噴霧乾燥支持体、塗膜形成剤、凍結調整剤、または結晶化防止剤として使用される。

それらは、また、人工脂肪として、あるいは栄養補給のために使用することができる。

腸のレベルでは、デンプンの加水分解物は、α−１，４で結合した直鎖状の炭素鎖に直接作用する膵臓のα−アミラーゼによってこのように消化される。

このターゲットとされる酵素による消化は前記デンプンの加水分解物のサイズを限界デキストリンまで減少させ、その後、腸の粘膜に結合した多くの酵素（マルターゼ、スクラーゼおよびα−デキストリナーゼ）が直鎖状の糖類および残りの分岐状の糖類のグルコース単位への加水分解を続ける。

そして、これらの様々な酵素による消化速度は、デンプンの加水分解物の構造に直接依存する。

例えば、膵臓のα−アミラーゼは、直鎖オリゴ糖に富んでいるか、または長鎖分岐構造を持つデンプンの加水分解物により容易に作用するが、主に短鎖を持つ密な分岐構造に作用するのは非常に困難であるか、全く作用しない。

最先端の技術では、これらの２種類の構造は、一般に、意図した適用分野によって、違った風に使用されている。

デンプン（特にＤＰが短いオリゴ糖のそれ）に由来する第１のタイプの構造は、特に３つの適用分野において、身体によって直接吸収することができるグルコース源として使用されている。

第１の適用分野は、スポーツをする人々のための高エネルギーの基質の分野である。

確かに、スポーツ分野において、多くの労力を要する身体活動の間に消費される飲料は、直ちに、エネルギー、および発汗作用による液体の損失を補うのに必要な水分の両方を供給するであろう。

このことは、そのような結果を得るためには、炭水化物に関してバランスのとれた組成物が不可欠であるということに帰着する。

最適飲料のために従来提案されている解決策は、より密な分岐グルコシド構造を持つ、ＤＰが３〜６の短い直鎖オリゴ糖を調製することである。なぜなら、これらの短いオリゴ糖が最も速い速度で吸収され、同時に、浸透圧重量モル濃度を適度なレベルに保持し、それにより、液体の損失および下痢や痙攣のような副次的な影響を防ぐからである。

第２の適用分野は、栄養液を静脈経路によって供給することで、患者を健康な状態に保ち、患者の通常の消化器系を経て栄養分を供給することができない場合に栄養分を患者に供給するようにする非経口栄養補給の分野である。

ここでも、ＤＰが２〜５の直鎖オリゴ糖を投与することが選択される。なぜなら、これらの糖類は、腎臓中のマルターゼによって加水分解され、それによりグルコースが放出され、その後、このグルコースが再吸収されるからである。従って、短い直鎖オリゴ糖を使用することにより、患者を水分過剰にすることなく、等張液中の十分なエネルギーを供給することが可能になる。

第３の適用分野は、経口摂取されるか、胃または小腸内にチューブによって投与される飲料を提供することが必要な経腸栄養法の分野である。

しかしながら、これらの経腸液体について、大きな問題は、過度に高い浸透圧重量モル濃度による下痢である。

デンプンに由来する第２のタイプの構造、すなわち短鎖を持つ密な分岐構造を持つデンプンの加水分解物の誘導体またはデンプンの誘導体は、特に３つの適用分野において、吸収可能なグルコースの放出を遅らせるために、および／または一定の浸透圧重量モル濃度を与えるために使用されている。

第１の適用分野は、持続的携帯型腹膜透析の分野である。

特許文献１は、透析で使用するには、無色透明な１０％の水溶液を生成する、分子量（Ｍｗ）が５×１０^３〜１０^６ダルトンで、多分散指数、つまりＶｐが低い、分岐構造を含むデンプンの加水分解物の方が、ＤＰが短い直鎖オリゴ糖よりも好ましいことを教示している。

これは、５×１０^３ダルトン〜５×１０^５ダルトンの間の高分子量のグルコースポリマーを主に含み、ＤＰが３以下のグルコースまたはオリゴ糖を含まないか、ごく僅かしか含まず、Ｍｗが１０^６ダルトンを超えるグルコースポリマーを含まないか、ごく僅かしか含まない組成物に帰着する。

腹膜透析のこの適用のためには、ＤＰが短い、低分子量のオリゴ糖は急速に腹膜壁を通過し、したがって浸透圧勾配をつくることが長くはできず、また、浸透力を持たない、非常に高分子量のポリマーは、劣化の後、沈殿が生じた場合に潜在的に危険であるので、避けるべきであり、禁止するべきでさえあることは確かに容易に理解できる。

特許文献２において、出願人は、ワックス状のデンプンから、水に完全に可溶であり、２．８未満の低い多分散指数および５×１０^３ダルトン〜１×１０^６ダルトンの間のＭｗを有するデンプンの加水分解物を製造する方法を提案した。

この方法は、もっぱらアミロペクチンから成るスターチミルクを酸の経路によって加水分解し、その後、この酸加水分解を細菌α−アミラーゼを用いた酵素加水分解で補い、得られた加水分解物をアルカリまたはアルカリ土類金属の形のマクロ孔質強カチオン樹脂のクロマトグラフィーにかける。

その時に、前記方法の原料として、アミロースを無視できない割合で含むデンプンは適しておらず、ほぼ全くアミロペクチンのみから成り、一般にワックス状のデンプンと呼ばれるデンプンだけを使用することを出願人が推奨したことは注目されるべきである。

第２の適用分野は、糖尿病患者の消化または食事を調整する分野である。

特許文献３あるいは特許文献４において、α−１，６結合がα−１，４結合よりも分解するのが困難であるから、ゆっくりと吸収される炭水化物源として、高密度のα−１，６結合を有する領域だけを抽出することが確かに提案されている。

したがって、２つの系統の生成物が開発されている。第１の系統は、α−１，４結合を有する領域をα−アミラーゼのみで分解することによって調製される限界デキストリンを含み、第２の系統は、α−１，４結合を有する領域をα−アミラーゼとβ−アミラーゼとの同時作用で分解することによって調製されるデキストリンに関する。

そして、得られた限界デキストリンは、人間の消化酵素に特に耐性がある。

しかしながら、これらの化合物は、非常に低い分子量（１００００ダルトン〜５５０００ダルトン）を有しているという不利な点があり、それは、これらの化合物の他の適用分野での利用を制限している。

第３の適用分野は、代用血漿の分野である。

特許文献５は、哺乳類の外科治療あるいは治療上の処置において、または診断法において使用するために、アミロペクチンのみから高分岐化合物を生成させることを確かに推奨している。

この特許出願の教示することによれば、そして、より特に代用血漿の分野において、これらの高分岐アミロペクチンは、製造された最初の代用血漿−これらはヒドロキシエチルデンプン、すなわちＨＥＳである−の主な不利な点、つまり身体中のそれらの不完全な代謝を解決することを可能にするために必要とされるものとして示されている。

この特許出願では、前記高分岐アミロペクチンの相対的な安定性が、その高いα−１，６結合の含有量に関連して言及されている。

それで、この高いα−１，６結合の含有量が、α−アミラーゼによるアミロペクチンの分解を十分かなり減らし、分解可能であるが、なお理想的な代用血漿の特性、すなわちその薬物動態学的特性および体積効果を持つ多糖類を製造することを可能にすると思われる。

さらに、この特許文献５では、高分岐アミロペクチンの分解速度を所望の方向に制御するために、分岐点の分布を変える可能性も考えられている。

しかしながら、これらの高分岐アミロペクチンの調製は、なお重大な欠点を持っている。

実際に、過度に高度な分岐（α−１，６結合が２５％まで）、過度に短い分岐点間の距離のため、これらの高分岐アミロペクチンに対するα−アミラーゼの作用がかなり遅くなり、またはもはや全く起こることができないので、得られる結果は望ましいものと全く反対である。

分岐点の密度が高い分子の領域では、立体障害により、α−アミラーゼに接近することがもはやできない。

このような状態の下では、これらの高分岐アミロペクチンの酵素消化性の欠如は、代用血漿のような構成の使用（分解しない生成物の蓄積）に特に有利ではない。
欧州特許出願公開第２０７，６７６号明細書 欧州特許出願公開第６６７，３５６号明細書 米国特許第４，８４０，８０７号明細書 特開２００１−１１１０１号公報（特願平１１−１８７，７０８号） 国際公開第０３／１８６３９号

したがって、上記のことから、分岐鎖長の分布および固有粘度の点から注目すべき構造特性を示し、それによって、それらを含む生成物により高い貯蔵安定性能および制御された消化性を与える高度に分岐したグルコースポリマーを持つ必要性が満たされずにあることは明白である。

そして、これらの特性は、身体活動中の高エネルギーの基質の供給といった多様な適用分野において、また腹膜透析、経腸栄養法あるいは非経口的栄養法、代用血漿、消化の調整および糖尿病患者の食事といった分野において、これらの高度に分岐したグルコースポリマーを使用することを可能にするであろう。

出願人は、多くの調査研究を行って、分岐鎖長の分布および固有粘度に関してはかなり特殊な、新規な可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを発明し、製造することにより、今まで調和させることが困難であると考えられていた、これらの目的をすべて調和させるという功績を得た。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、還元糖の含有量が１％未満であり、α−１，６グルコシド結合の含有量が１３〜１７％であり、Ｍｗが０．９×１０^５ダルトン〜１．５×１０^５ダルトンの間の値であり、その分岐鎖長の分布形状が、ＤＰが１５未満のものが７０〜８５％、ＤＰが１５〜２５のものが１０〜１６％、およびＤＰが２５を超えるものが８〜１３％から成ることを特徴とするグルコースポリマーである。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、好ましくは、０．１以下のマーク・ホウィンク・サクラダ方程式（MARK,
HOUWINK and SAKURADA equation）による固有粘度係数「ａ」を有している。

出願人は、ＥＰ１，３６９，４３２において、還元糖の含有量が１％未満であり、α−１，６結合の含有量が１２〜３０％であり、Ｍｗが０．３５ダルトン〜２×１０^５ダルトンの間の値である可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーについて既に記載している。

しかしながら、以下に例証するように、前記特許出願に記載され、例示されたグルコースポリマーのいずれも、本発明の高度に分岐したグルコースポリマーの分岐鎖長の分布形状および固有粘度を持っていない。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの還元力、α−１，６グルコシド結合の含有量、および分子量の測定は、ＥＰ１，３６９，４３２に記載されているのと同じ条件下で行われる。

そして、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、還元糖の含有量が１％未満であり、α−１，６グルコシド結合の含有量が１３〜１７％であり、Ｍｗが０．９×１０^５ダルトン〜１．５×１０^５ダルトンの間の値である。

出願人によるＥＰ１，３６９，４３２の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーと比較して、本発明の新規なグルコースポリマーはα−１，６グルコシド結合の含有量および分子量の範囲がより狭い。

しかしながら、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、その鎖長の分布形状によって特に特徴づけられる。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの分岐鎖の長さの決定は、２段階で行なわれる。

第１段階は、細菌イソアミラーゼを用いて前記生成物を脱分岐（デブランチング）する（α−１，６結合に特定の加水分解）ことであり、その後に、立体排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって、既知のサイズのプルランと比較して、放出されたオリゴ糖の重合度を識別する第２段階が続く。

この方法は、分析する生成物を５０ｍｇ量りとり、それに水３．７５ｍｌを加える。この混合物を撹拌した後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．５ｍｌを加え、３０分間、撹拌しながら、混合物を沸騰温度で加熱する。その後、温度を４５℃まで下げ、１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（前もって酢酸でｐＨ３．５にされたもの）０．２５ｍｌを加える。

次に、ハヤシバラ社によって市販されたシュードモナス アミロデラソマ（Pseudomonas
amyloderasoma）から抽出されたイソアミラーゼ１０μｌを加え（５９０００Ｕ／ｍｇの量で）、４５℃で１時間作用させる。この酵素処理は連続して２回行われ、その後、３分間沸騰させることにより反応を止める。

ｎ−ブタノールを０．５ｍｌ加え、撹拌し、室温で１時間撹拌せずに置いておいた後に、反応媒体は２６００ｒｐｍで２０分間遠心分離され、上澄みは、それぞれフルカ社およびシグマ社によって市販されたアンバーライト２００樹脂およびアンバーライトＩＲＡ−６７樹脂を用いて、脱塩される。

ＨＰＳＥＣカラムに注入する前に、最後の撹拌、および０．４５μｍの孔のナイロン・フィルタによるろ過を行う。

ＨＰＳＥＣクロマトグラフィーのためのパラメーターは、以下の通りである（ＴＳＫによって市販されたＰＷＸＬ オリゴ カラム、およびＳＨＯＤＥＸによって市販されたＳＢ ８０２、８０３、８０４、８０５ カラムを用いる）：
− 注入量：２００μｌ
− 流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
− カラム温度：４０℃
− 溶離剤：０．２Ｍの硝酸ナトリウム＋０．０２％のアジ化ナトリウム
− 溶出時間：１８０分。

放出されたオリゴ糖のサイズは、既知のサイズのプルランの溶出時間に対しての、それらの溶出時間で決定される。

そして、本発明の高度に分岐したグルコースポリマーは、
− ＤＰが１５未満のもの７０〜８５％、
− ＤＰが１５〜２５のもの１０〜１６％、
− ＤＰが２５を超えるもの８〜１３％
から成る分岐鎖長の分布形状を有する。

この分岐鎖長の分布形状は、短い分岐鎖の高い含有量（ＤＰが１５未満のものが７０〜８５％）、および中くらいから長い分岐鎖のなお比較的高い含有量（ＤＰが１５を超えるものが１５〜３０％）に関して注目すべき構造になっている。

その結果、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、主に短いＤＰの炭素鎖に富み（ＤＰが１５未満のもの７０％以上）、それは主に短い炭素鎖を含む、密な分岐構造を得ることを可能にし、しかも、それにも関わらず、なお、中くらいから長い炭素鎖を十分に含み（３０％まで）、それは、身体が吸収することができるグルコースを放出するために、膵臓のα−アミラーゼが容易に消化することができる。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーはまた、マーク・ホウィンク・サクラダ方程式による固有粘度係数「ａ」の値によって特徴づけられる。

マーク・ホウィンク・サクラダ方程式による固有粘度係数「ａ」の測定は、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの緊密さの程度を明らかにするために、出願人によって使用されている。

粘度平均分子量（すなわちＭｖ）にポリマーの固有粘度（η）を関連づけるマーク・ホウィンク・サクラダの経験式が、次の方程式で与えられることは当業者に知られている：
η＝Ｋ×（Ｍｖ）^ａ
ここで、「Ｋ」および「ａ」は調べるポリマーの性質、溶媒の性質、および温度に依存する定数である。

本発明の分析条件下では、出願人によって使用される溶媒は０．２Ｍの硝酸塩水溶液である。

定数「ａ」は、検討する溶媒中のポリマーが占める平均流体力学的体積とより特に関係がある。

溶液中のポリマーについて、分子が自身により多く折り重なっていくほど、「ａ」の値が低くなることは最先端の技術において確立されている。逆に言えば、「かなり開いた」分子については、「ａ」の値がより高い。

マーク・ホウィンク・サクラダの式による係数「ａ」の測定は、次の方程式を用いて計算によって決められる：
Ｌｏｇη＝ＬｏｇＫ＋ａＬｏｇ（Ｍｖ）。

Ｌｏｇηの曲線は、原点におけるｙ軸がＬｏｇＫを与え、線の傾きが係数「ａ」であるＬｏｇ（Ｍｖ）の関数としてプロットされる。

本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの粘度および粘度平均分子量は、ＳＨＯＤＥＸ ＳＢ ８０２、８０３、８０５ カラムで分離した後、Ｒ４１０屈折計につながれたＶＩＳＣＯＴＥＸ毛細管粘度計（モデル ２５０）で測定される。

クロマトグラフィーの操作条件は以下の通りである：
− 注入：１００μｌ
− 流量：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
− カラム温度：３５℃
− 溶離剤：０．２Ｍの硝酸ナトリウムおよび０．０２％のアジ化ナトリウム
− 分析時間：１８０分。

屈折率測定検出のための操作条件は以下の通りである：
− Ｒ４１０の感度：１６ Ｘ
− 粘度計の温度：３５℃。

流量マーカーは、溶離剤中の５％のグリセリン溶液である。

検出器の検量線の作成は、分子量、濃度および固有粘度が分かっている、ビスコテックス社によって市販されたポリエチレンオキシドを用いて行なわれる。

この基準の再処理は、粘度計の「質量定数」および「粘度定数」を算定することを可能にする。

流量マーカーのための溶出ピークの再処理は、基準時間および検出器間の体積を算定することを可能にする。

そして、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、０．１未満のマーク・ホウィンク・サクラダの式によって計算される係数「ａ」を有しており、それはアミロペクチン（標準的なアミロペクチンは、実際に、同じ測定条件の下で０．３３の係数「ａ」値を有している）よりもはるかに高い、高密な状態を示している。

したがって、このようにして得られる高度に分岐したグルコースポリマーは、例えば腹膜透析または糖尿病患者の食事など、密で高濃度の構造を持っていることが必要な適用分野における使用に特によく適している。

また、食物炭水化物の消化に必要な酵素に対する本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの耐性の決定は、スポーツをする人々が使用するための配合物の組成物に入れる、または例えば経腸栄養法あるいは非経口的栄養法のために意図した食品成分を選択する際に不可欠な基準である。

出願人は、ＥＰ１，３６９，４３２に記載された可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーのそのパーセンテージ、すなわち酵素消化によるグルコースの放出を５０〜７０％の値と評価した。

加水分解に対するこの耐性は、従来のマルトデキストリンより相当に高く、グリコーゲンと同等である。

下記に例証されるように、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、最後には前記ＥＰ１，３６９，４３２に記載されているものに似た割合でグルコースを放出し、それはこれらをスポーツをする人々による使用に、または経腸栄養法および非経口的栄養法になお適したものにするが、このグルコースの放出は時間をかけて非常によりゆっくり起こり、それはこれらを糖尿病患者の食事のような血糖の調整を必要とする適用分野のために有利にする。

本発明がターゲットとする適用分野すべてにおいて使用することを可能にするような、このようなその分岐鎖長分布を持つ可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、出願人の知っている限りでは、存在しない。

本発明の高度に分岐したグルコースポリマーは、３つのサブファミリーに分類することが有利であろう。

これらの３つのサブファミリーは、ＤＰが１５〜２５の中くらいの炭素鎖の含有量に関して異なる分岐鎖長の分布形状を有している。

第１のサブファミリーは、ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１４％、多くとも１６％である高度に分岐したポリマーを包含する。

第２のサブファミリーは、ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１２％、多くとも１４％である高度に分岐したポリマーを包含する。

第３のサブファミリーは、ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１０％、多くとも１２％である高度に分岐したポリマーを包含する。

中くらいのサイズの炭素鎖の分布におけるこのばらつきは、使用する可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの消化性を変えることが必要である食品または医療への応用において、これらのサブファミリーの使用を有利にする。

実際に、これらの３つのサブファミリーはすべて、主にサイズが短い炭素鎖から成る分岐構造を持っているが、その中で、中くらいの炭素鎖の割合を変えられることは、下記に例証されるように、その緊密さの程度を調整することを可能にするだけでなく、グルコースの放出を制御することも可能にする。

本発明の可溶性の分岐したグルコースポリマーを調製するためには、次にある以下の工程が連続的に行なわれる：
１）アミロースの含有量が少なくとも３０重量％、好ましくは３５〜８０重量％であるデンプン水溶液を調製すること、
２） この溶液を分枝酵素で処理し、その後、引き続いてβ−アミラーゼで処理すること、
３） 高分子量分画を回収するために分取を行なうこと、
４） このようにして得られた、高度に分岐したグルコースポリマーを集めること。

本発明の高度に分岐したグルコースポリマーの調製は、出願人によってＥＰ１，２６９，４３２に既に記載された操作条件を部分的に変更することによって行なわれる。

まず第１に、ＥＰ１，２６９，４３２に記載されたものとは異なり、特別のデンプンの品質を選択することが非常に重要である。

実際に、アミロースの含有量が３０％以上のデンプンのみが本発明の方法の原料として使用できることを出願人は見出した。

マルトデキストリン、標準的なデンプン（それらはアミロースを３０％以上含まない）またはワックスタイプのデンプンは、その植物の源に関係なく、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの製造に絶対に適しているとは限らない。

さらに、賞賛されるべきことに、安定で、密な、また制御された消化性を持つ分岐構造を得るためには、アミロペクチンに富むデンプンを原料にすることが必要である（ＷＯ０３／０１８６３９が教示するように）という技術的な先入観を出願人は克服した。

下記に例証されるように、これに反して、出発基質として使用される、アミロースに富むデンプンを選択することにより、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを得ることが可能であることを出願人は見出した。

また、出発基質として使用されるデンプンのアミロース含有量を選択することにより、上記に定義された３つのサブファミリーを得ることが可能である。

本発明の方法の第２の工程は、前記デンプン溶液を分枝酵素で処理することにある。

ＥＰ１，３６９，４３２では、２５〜９５℃の温度で、好ましくは７０〜９５℃の温度で、１８〜２４時間、乾量基準で１００ｇのデンプンまたはデンプンの誘導体につき５００００〜５０００００Ｕの精製された分枝酵素を使用することを出願人は推奨した。

分枝酵素という表現は、グリコーゲン分枝酵素、スターチ分枝酵素、およびこれらの酵素の混合物すべてからなる群より選ばれる分枝酵素を意味すると解される。

本発明の新規な高度に分岐したグルコースポリマーの製造については、好ましくは、２５〜８０℃の温度で、７〜２４時間、好ましくは１８〜２４時間、１００ｇのデンプンにつき４００００〜１５００００Ｕの分枝酵素でアミロースに富むデンプンの溶液を処理することを出願人は推奨する。

本発明の方法の第３の工程は、このように処理したデンプン溶液にβ−アミラーゼを作用させることにある。

この酵素が作用するための条件（温度およびｐＨ）は、１００ｇのデンプンにつき、ジェネンカーのスペザイム ＢＢＡタイプのβ−アミラーゼ（１５００ＤＰ°／ｍｌ）０．０５〜０．５ｍｌをｐＨ４．９〜５、６０℃の温度で、１〜３時間、好ましくは２時間作用させる。

ＤＰ°単位は、「ジアスターゼ力の程度」、すなわち試料を２０℃で１時間１００ｍｌの基質とともに培養させた場合に、フェーリング液５ｍｌを還元するのに十分な量の還元糖を製造する酵素製剤５％を含む溶液０．１ｍｌに含まれる酵素の量を意味する。

したがって、ＥＰ１，３６９，４３２に記載されているものに反して、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびα−トランスグルコシダーゼからなる群より選ばれる任意の酵素は使用されず、実は好ましくはβ−アミラーゼを使用する。

実際に、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを容易に得ることが可能なのは、他ならぬこの酵素の選択によるものであったことを出願人は見出した。

この追加の処理の終わりに、主にグルコースとマルトースとから成る、酵素分解の生成物を含む混合物として、可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーが得られる。

本方法の第４の工程は、出願人によってＥＰ１，３６９，４３２に記載されたように、高分子量分画および低分子量分画を分取するために、膜分離およびクロマトグラフィーを含む群より選ばれる手法を用いて分留を行なうことにある。

使用する方法に関係なく、得られる分布は、主にグルコースとマルトースとから成る低分子量のオリゴ糖の分画から、本発明の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーに対応する高分子量の多糖類の分画を分離させる。

本発明の方法の最終工程は、その結果、高度に分岐したグルコースポリマーに対応する高分子量分画を集めることにある。

高分子量の生成物は、当業者に知られている任意の手法によって、そのものとして集められるか、エタノールで沈殿させ、精製し、２４時間真空下で乾燥させるか、または、噴霧乾燥される。

下記に例証されるように、本発明の可溶性の分岐したグルコースポリマーの中くらいの分岐鎖（ＤＰが１５〜２５のもの）の含有量を変えるためには、デンプンのアミロース含有量を変えることが必要であることを出願人はついに見出した。

実際に、出発物質として使用するデンプンのアミロース含有量が高くなると、得られる生成物のＤＰが１５〜２５の分岐鎖の含有量が低くなる。

ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１４％、多くとも１６％である本発明の第１のファミリーのポリマーを得るためには、アミロース含有量が少なくとも３０％、多くとも４０％の間にあるデンプンが好ましくは選ばれるであろう。標準的なエンドウ豆のデンプンは、この第１のファミリーの製造に特に適している。

ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１２％、多くとも１４％である本発明の第２のファミリーのポリマーを得るためには、アミロース含有量が少なくとも４０％、多くとも６０％の間にあるデンプンが好ましくは選ばれるであろう。

ＤＰが１５〜２５のものが少なくとも１０％、多くとも１２％である本発明の第２のファミリーのポリマーを得るためには、アミロース含有量が少なくとも６０％、多くとも８０％の間にあるデンプンが最終的には選ばれるであろう。

本発明のポリマーは、その独特の物理化学的特性により、食品用途および医療用途に、さらに特に身体活動中の高エネルギーの基質の源として、腹膜透析、経腸栄養法あるいは非経口的栄養法、代用血漿、消化の調整および糖尿病患者の食事といった分野で有利である。

本発明の他の特徴および利点は、本発明を制限しない下記の実施例を読むと明らかになるであろう。

実施例１
１０％の乾燥固形分含有量のデンプン溶液を、デンプンリッチネスが９５％以上、アミロース含有量が３６．７％のエンドウ豆デンプンから調製する。

そのために、乾量重量で１００ｇのエンドウ豆デンプンを、室温で、撹拌しながら水１リットル中に再分散させる。

調理具の中で、１４５℃で３〜４分間でデンプンを完全に可溶化し、その後、７０℃に冷却する。ステアロサーモフィルス菌（Bacillus stearothermophilus）を精製したグリコーゲン分枝酵素を、乾量基準で１００ｇの基質あたり、５００００Ｕ／ｍｌの酵素溶液の１ｍｌの量を連続的に加える。

酵素反応は７０℃、ｐＨ６．８で２１時間実行され、次に、９０℃で加熱することにより止められる。

乾量基準でデンプン１００ｇあたり、０．１５ｍｌのβ−アミラーゼ（ジェネンカーのスペザイム ＢＢＡ （１５００ ＤＰ°／ｍｌ））による追加の処理を、温度６０℃およびｐＨ４．９〜５にされた前の反応媒体中で実行する。

その培養を２時間行い、９０℃で１時間加熱することにより反応が止められる。

その後、反応媒体を、カットオフ値９０００のダルトンを有するろ過膜（ＰＣＩからのＥＳ２０９メンブレン）で超ろ過され、超ろ過されたろ液をスプレードライする。

下の表１に、本発明に従ってこのようにして得られた可溶性分岐グルコース・ポリマーの物理化学的な特性（α−１，６結合の含有量、Ｍｗおよび還元糖含有量）の結果を示す。

還元糖のパーセンテージは、Ｎ．ネルソンにより「グルコース測定用のためのＳＯＭＯＧＯＹＩ方法の測光の適応」（1944, J. Biol. Chem., 153, pp.
375-380）に記載されたＳＯＭＯＧＯＹＩの方法によって決定される。

その後、分岐鎖長の分布プロフィールは、上に示したように決定される。

下の表２は得られた結果を示す。

得られた可溶性分岐グルコース・ポリマーは、７０％をわずかに超える短鎖（ＤＰ１５より小さい）と、３０％未満の中から長鎖（１５を越えるＤＰ）という特筆すべき分枝鎖の鎖長分布を有している。

上述の方法論によって決定されたマーク・ホウィンク・サクラダパラメーター「ａ」の値は、０．１である。

したがって、本発明に従う可溶性分岐グルコース・ポリマーは、それ自体の上で折り重ねられているコンパクトな構造を有しながら、酵素の攻撃に利用可能な鎖をいまだ有している。

実施例２
種々のアミロース含有量を含む基質に対しての、分枝酵素とアミラーゼによる反応生成物の分岐鎖長の分布プロファイルの比較研究を行った。

ワックス状トウモロコシデンプン（デンプンＡ）、標準トウモロコシデンプン（デンプンＢ）、それぞれアミロースがデンプンの５０％および７０％を含むアミロースに富むデンプン２種類（デンプンＤおよびＥ）を実施例１と同様に処理する。また、実施例１中で得られたエンドウ豆デンプン（デンプンＣ）に得られた結果も、この表で示される。

下の表３に、異なる種類のデンプンの処理のために使用された分枝酵素（１８〜２１時間の培養）とアミラーゼ（２時間の処理）の量を示す。

表４に、このように合成された高度に分岐したグルコースポリマーの、α−１，６分岐の含有量、分子量および還元糖含有量について得られた結果を示す。

デンプンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥからそれぞれ得られた化合物を、生成物Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪとする。生成物Ｆの特性は実施例１中で再現される。

アミロースに富む３つの基質（それぞれ３７．５％、５０％および７０％のアミロース含有量）に酵素処理をすることにより、分子量が０．９から１．５×１０^５ダルトンの間のもので、α−１，６分岐の含有量が１３〜１５％の狭い範囲の可溶性分岐グルコース・ポリマーの製造が可能になった。

ワックス状トウモロコシデンプンおよび標準トウモロコシデンプンの処理（特許出願ＥＰ １，３６９，４３２号にさらに記述されている）により、α−１，６分岐の含有量が１１〜１３％の範囲で、分子量が０．７から０．９×１０^５ダルトンの範囲の分岐グルコース・ポリマーが製造された。

したがって、アミロースに富むデンプンを出発物質として使用することにより、特筆すべきことに、α−１，６グルコシド結合の含有量および分子量がアミロペクチンにより富む基質（それ自身特筆される）から得られるものより高い可溶性の分岐グルコース・ポリマーを得ることが可能になった。

下記の表５に、得られた異なる生成物の異なる鎖長分布プロフィールを集めた。マーク・ホウィンク・サクラダによる固有粘度係数の値「ａ」もそこに示した。

アミロースに富むデンプンから得られた可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、７０〜８５％の短鎖と１０〜１６％の中鎖と８〜１３％の長鎖を有することが観察された。

アミロペクチンに富むデンプンから得られた可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、７２％未満の短鎖と、１６％を超える中程度の鎖と、１１〜１５％の長鎖を含んでいる。

また、処理されるデンプンのアミロース含有量が高いほど、得られた可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、中程度の鎖の含有量が低い成分を有することが多いことも観察された。

したがって、本発明に従う可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーは、中程度の鎖を、特に１６％未満、好ましくは１０〜１６％の間で有する（それらは標準トウモロコシデンプンおよびワックスデンプンから調製された可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーには該当しないものである）。

マーク・ホウィンク・サクラダによる固有粘度係数「ａ」の測定もまた、得られた可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの緊密さの程度の差を反映している。

アミロースに富むデンプンを用いたときのみ、０．１以下の固有粘度係数値を有する可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを得ることが可能であることが観察された。

さらに、酵素反応のために基質として使用されたデンプンのアミロース含有量を変えることにより、本発明に従う可溶性の分岐グルコース・ポリマーの緊密さの程度を変えることが可能であることが観察された。

従って、最も密な構造は、実際のところ、最もアミロースに富むデンプンから得られる。

実施例３
グルコース放出の程度を決定するために、本発明に従う可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの水溶液を調製し、膵臓起源のアミラーゼおよび腸のアミログルコシダーゼ（腸のアセトン粉末）と接触させる。

加水分解は、反応媒体に時間とともに現われるグルコースを測定することにより、時間の関数としてモニターされる。

この試験により、食物炭水化物の消化に関連する酵素による加水分解に対するポリマーの耐性を評価することができる。

本発明に従う２つのポリマー（実施例２のうちの生成物ＨおよびＩ）を、標準デンプン（実施例２の生成物Ｇ）から得られたグルコース・ポリマーと比較しながら、出願人会社による特許出願ＥＰ１，３６９，４３２によりグリコーゲンと比較して分析してテストした。

酵素消化の操作条件は以下のとおりである：
テストされる生成物０．６ｇを正確に量る。

１５０ｍｌのマレイン酸ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌ、ｐＨ７）を加え、生成物が溶けるまで、媒体を撹拌する。

得られた溶液を１５分間水浴に置き、溶液の温度を３７℃とする。

１．５ｍｌの溶液を除去し、０．１５ｇのブタ・パンクレアチンを加え、３０間培養する。

酵素反応を、１００℃で１０分間、試料を浴上に置いて乾燥させることで停止する。

０．７５ｇのブタ・パンクレアチンを加え、温調された浴上で媒体を撹拌しながら、３７℃で３時間３０分培養する。

酵素加水分解中に試料を定期的に集める。

そして試料中のグルコースを、対象の生成物の加水分解の率を計算するために分析する。

この分析を、ＨＩＴＡＣＨＩ ７０４自動測定器（ＲＯＣＨＥ）を使用した比色法により、実行する。使用される試薬は、酵素グルコースオキシダーゼ／ペルオキシダーゼ（ＧＯＤ／ＰＡＰ）を含んでいる試薬である。使用される試薬の体積は５００μｌ、試料体積は５μｌ、および反応温度は３０℃である。

結果を、下の表６に示す。

反応の３０分から６０分の間では、標準のエンドウ豆デンプンと５０％のアミロースを含有するデンプンからそれぞれ調製された本発明に従う可溶性の高度に分岐したグルコースポリマー（生成物ＨおよびＩ）は、標準トウモロコシデンプンから調製されたグルコース・ポリマー（生成物Ｇ）ほど急速にグルコースを放出しないことが観察された。

しかしながら、この現象は、６０から１２０分の間では、逆転し、生成物Ｈの方が生成物Ｇより多くのグルコースを放出する。

本発明に従うアミロースに富むデンプンから調製された２つの可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーＨおよびＩは、スポーツ人のための栄養（生成物Ｈは２時間の消化の後に６３％のグルコースを放出し遅延効果を備えている）に加えて、血糖を調整することが必要な用途（生成物Ｉは、全時間に渡り他の生成物よりグルコース放出量が小さい）の両方に使用されてもよいことが明白である。

出発デンプンのアミロース含有量の選択により、本発明に従う可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの十分に規定される応用分野での使用が決定されることが観察される。

Claims (12)

1. 還元糖の含有量が１％未満であり、
   α−１，６グルコシド結合の含有量が１３〜１７％であり、
   分子量が０．９×１０^５ダルトン〜１．５×１０^５ダルトンの間の値であり、
   その分岐鎖長の分布が、ＤＰが１５未満のものが７０〜８５％、ＤＰが１５〜２５のものが１０〜１６％、およびＤＰが２５を超えるものが８〜１３％から成り、ただし、それらの合計が１００％である、可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーであって、
   １）アミロースの含有量が少なくとも３０重量％であるデンプン水溶液を調製する工程と、
   ２）この溶液を分枝酵素で処理し、その後、引き続いてβ−アミラーゼで処理する工程と、
   ３）前記可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーに対応する高分子量の分画を分離するために分取を行なう工程と、
   ４）このようにして得られた高度に分岐したグルコースポリマーを集める工程と
   を有する方法により得られることを特徴とする可溶性の高度に分岐したグルコースポリマー。
2. ０．１以下のマーク・ホウィンク・サクラダ式による固有粘度係数「ａ」を有する請求項１記載のポリマー。
3. ＤＰが１５〜２５のものを、少なくとも１４％から最大１６％の間で有する請求項１または２記載のポリマー。
4. ＤＰが１５〜２５のものを、少なくとも１２％から最大１４％の間で有する請求項１または２記載のポリマー。
5. ＤＰが１５〜２５のものを、少なくとも１０％から最大１２％の間で有する請求項１または２記載のポリマー。
6. 請求項１〜５のいずれかに記載の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの製造方法であって、
   １）アミロースの含有量が少なくとも３０重量％であるデンプン水溶液を調製する工程と、
   ２）この溶液を分枝酵素で処理し、その後、引き続いてβ−アミラーゼで処理する工程と、
   ３）前記可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーに対応する高分子量の分画を分離するために分取を行なう工程と、
   ４）このようにして得られた高度に分岐したグルコースポリマーを集める工程と
   を有することを特徴とする方法。
7. 前記デンプン水溶液を、
   デンプン１００ｇあたり、４００００〜１５００００Ｕの分枝酵素で、２５〜８０℃の温度で、７〜２４時間処理し、
   デンプン１００ｇあたり、β−アミラーゼ０．０５〜０．５％ｍｌで、温度６０℃、ｐＨ４．９〜５にて、１〜３時間処理すること
   を特徴とする請求項６記載の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーの製造方法。
8. 前記デンプン溶液が少なくとも３０重量％から多くても４０重量％の間でアミロースを含有し、請求項３記載の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを製造できる請求項６または７記載の方法。
9. 前記デンプン溶液が少なくとも４０重量％から多くても６０重量％の間でアミロースを含有し、請求項４記載の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを製造できる請求項６または７記載の方法。
10. 前記デンプン溶液が少なくとも６０重量％から多くても８０重量％の間でアミロースを含有し、請求項５記載の可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを製造できる請求項６または７記載の方法。
11. 請求項１〜５のいずれかの、または請求項６〜１０のいずれかの方法で得られる、可溶性の高度に分岐したグルコースポリマーを含有する、食物用途、または医療用途に使用される組成物。
12. 身体活動中の高エネルギーの基質の源として、および腹膜透析、経腸栄養法あるいは非経口的栄養法、代用血漿、消化の調整および糖尿病患者の食事の分野において使用が意図される請求項１１記載の組成物。