JP2004504852A - ヘキソシルトランスフェラーゼを使用するマルトースシロップの製造方法 - Google Patents
ヘキソシルトランスフェラーゼを使用するマルトースシロップの製造方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理し、次いでβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理する、マルトースシロップを製造する方法に関する。本発明は、また、マルトース製造プロセスにおいて出発物質として適当な中間生成物に関する。
Description
【０００１】
本発明は、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理し、次いでβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理する、マルトースシロップを製造する方法に関する。さらに、本発明は、また、マルトースを製造するために適当な出発物質に関する。
【０００２】
発明の背景
マルトース
マルトースは４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）の化学的構造を有する二糖であり、そしてマルトースシロップの主要な成分である。
【０００３】
マルトースシロップの応用
マルトースは多数の食物および糖菓製品ならびにマルチトールへの水素化のための出発生成物である。
例えば、高い濃度の不純物の存在においてさえ結晶化することができるグルコースと対照的に、マルトースは結晶化しない。出発物質として使用するマルトースが９０％以上の純度を示さないかぎり、マルトースを結晶化させることができず、こうして、それ以上精製することができない。また、マルトースが容易に結晶化することができないという事実は、マルトースがキャンディ産業において価値のある原料である理由の１つである。
【０００４】
また、マルトースは他の応用を有し、例えば、患者に糖を提供することを意図する静脈内注射用液体の活性成分として、そして凍結デザートにおいて（マルトースの低い結晶化能力のために）、パン焼きおよび醸造産業において、および甘味剤、例えば、ソルビトールとして使用できるマルチトールを製造のための１成分として、使用される：下記の文献を参照のこと：Ｇｌｙｃｏｓｅ Ｓｉｒｕｐｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９８４， ｐｐ． １１７−１３５。
こうして、本発明の目的はマルトースシロップを製造する方法を提供することである。
【０００５】
発明の説明
本発明の目的は、高マルトースシロップを製造する方法を提供することである。
少なくとも本発明の関係において、高マルトースシロップは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のマルトース含量を有するシロップである。
【０００６】
マルトースを製造する伝統的方法
マルトース製造プロセスの出発物質（原料）は、トウモロコシ、ジャガイモ、カッサバ（ｍａｎｉｏｃ）、イネ、およびカッサバ（ｃａｓｓａｖａ）からの医学的等級のマルトースの製造において約１０〜２０％の範囲および食品等級のマルトースについて２０〜４０％の範囲の濃度の澱粉である。
【０００７】
種々のマルトース製造方法が知られてきており、そしてこれらの方法により得られるマルトースの純度は７５〜９０％の範囲である。これらの方法の典型的な例は、澱粉スラリーを加熱し、α−アミラーゼで処理し、これにより澱粉を液化し、次いで液化された澱粉をβ−アミラーゼおよびプルラナーゼ（α−１，６−グルコシダーゼ）で加水分解させてマルトース溶液を形成し、次いでこれを精製することを含んでなる。
【０００８】
このマルトース溶液中の「不純物」のより大きい部分は、グルコースおよびオリゴ糖、例えば、マルトトリオースと、３またはそれより多いグルコース単位から成る、制限されたデキストリンとを含んでなる。
【０００９】
本発明の方法
本発明者らは、澱粉スラリーをヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理し、次いでβ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）および／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理することによって、α−アミラーゼで液化するときよりも、高いマルトース含量を有するマルトースシロップを製造することができることを発見した。
【００１０】
こうして、第１の面において、本発明は、マルトースを製造する方法に関し、この方法において、澱粉を、
ｉ） ヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）、次いで
ｉｉ） β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）および／またはマルトジェニックアミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１３３）、またはそれらの変異型、
で処理する。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、下記の工程を含んでなる：
ａ） 澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理して、
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度、
を有する生成物を生成し、
ｂ） 上記工程ａ） において得られた生成物をβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理し、そして必要に応じて
ｃ） 上記工程ｂ） において得られた生成物からマルトースを回収し、そして／またはマルトースを精製する。
【００１２】
デキシトロース当量 （Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ；ＤＥ） および分枝付加度 （Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ；ＡＤＢ）
澱粉生成物の分枝度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）は、イソアミラーゼ（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）イソアミラーゼ、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ、日本国、から入手可能である）で脱分枝後、澱粉生成物のＤＥ（デキシトロース当量）を測定することによって決定される。ＤＥ（脱分枝後）が高いほど、分枝度はより高い。ヘキソシルトランスフェラーゼにより導入される分枝付加度（ＡＤＢ）は、次のようにして計算される：
分枝付加度＝［（ＤＥ−Ｘ）／Ｘ］×１００％
ここでＸは天然の澱粉（すなわち、出発物質）の脱分枝後のＤＥである。
澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理する方法
澱粉を酵素で効果的に処理するために、澱粉を好ましい態様において糊化することができる。酵素の熱安定性および特定の酵素の糊化温度に依存して、これは酵素処理と組合わせて、または酵素処理前に実施することができる。糊化はバッチシステムで、またはジェット−クッカー中で連続的に実施することができる。実験室規模において、簡単な加熱システム、例えば、油浴、圧力クッカーまたはオートクレーブを使用することができる。引き続く酵素処理または組み合わせた糊化／酵素プロセスのための特定の反応条件、すなわち、温度、ｐＨ 、％ＤＳ、投与量およびインキュベーション時間は、酵素の特性および澱粉源に依存する。
【００１３】
ある態様において、本発明のプロセスの工程ａ） において澱粉スラリーを５０〜１５０ ℃、好ましくは５０〜１００ ℃の範囲の温度で処理する。ヘキソシルトランスフェラーゼとして１，４−α−グルカン分枝酵素を使用する場合、処理温度は５０〜７０ ℃の範囲、好ましくは約６５ ℃であろう。ある態様において、１，４−α−グルカン分枝酵素を使用するとき、澱粉をまず１０５〜１４０ ℃において噴射し、次いで約６５ ℃に冷却することによって糊化する。
【００１４】
４−α−グルカノトランスフェラーゼ（アミロマターセまたはＤ−酵素）およびＣＧＴａｓｅの場合において、糊化工程は任意であり、省略することができる。こうして、澱粉を８０〜１００ ℃、好ましくは約９０ ℃において処理（１または２以上の酵素と直接インキュベート）することができる。
プルラナーゼを工程ｂ） において添加することができる。一般に、澱粉（原料）出発物質は１０〜５０％ＤＳの澱粉スラリー、好ましくは２０〜４０％ＤＳの澱粉スラリー、特に約３０％ＤＳを有する澱粉スラリーである。
【００１５】
本発明の方法は、また、下記の工程を含んでなる方法により得ることができる生成物に関する：
ａ） 澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理して、
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度、
を有する生成物を生成する。
【００１６】
この生成物は、マルトースプロセスのための出発物質として適当である。生成物は安定であり、逆行する傾向が減少し、水溶液中に可溶性である。
それ以上の面において、本発明は、本発明の方法により得ることができるマルトースを含有する生成物に関する。このようにして得られた生成物は、８０％以上、好ましくは８５％以上、特に９０％以上のマルトース（ＤＰ２）含量を有する。
さらに、本発明は、また、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理することによって製造された本発明の生成物を、マルトースを製造するための出発物質（原料）（基質）として使用することに関する。
【００１７】
ヘキソシルトランスフェラーゼ
ヘキソシルトランスフェラーゼの例は、１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）；４−α−グルカノトランスフェラーゼ（アミロマルターゼまたはＤ−酵素）（Ｅ．Ｃ． ２．４．２５）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１９）を包含する。
【００１８】
１，４ −α−グルカン分枝酵素
ある態様において、ヘキソシルトランスフェラーゼは、アミロペクチンの追加の１，６−グリコシド結合を形成し、アミロースをアミロペクチンに変換する１，４−α−グルカン分枝酵素である。アミロペクチン分枝酵素はしばしばＱ−酵素と命名される。
特に意図される１，４−α−グルカン分枝酵素は、ロドテルムス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、好ましくはロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、特にロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）からのｇｌｇＢ遺伝子を含んでなる受託された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １２６０７株に由来する。
【００１９】
４ −α−グルカノトランスフェラーゼ （ アミロマターセまたは Ｄ −酵素 ）
ある態様において、ヘキソシルトランスフェラーゼは４−α−グルカノトランスフェラーゼであり、これは１，４−α−Ｄ−グルカンのセグメントをアクセプター中の新しい４−位置に転移させ、ここでアクセプターはグルコースまたは１，４−α−Ｄ−グルカンであることができる。４−α−グルカノトランスフェラーゼはしばしばＤ−酵素と呼ばれる。
特に意図される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）に由来する（Ｊｅｏｎ、Ｂｅｏｎｇ−Ｓａｍ他、４−ａｌｐｈａ−Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ （１９９７）。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４８：１７１−１７８）。
【００２０】
ＣＧＴａｓｅ
ある態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の株、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）の株、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）の株、テルモアネロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）の株、テルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の株、テルモアネロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、またはテルモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の株に由来する。
【００２１】
好ましい態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス・アウトリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）の株、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の株、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の株、バシラス・サーキュランスｖａｒ． アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ｖａｒ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）の株、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の株、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）の株、バシラス・ハロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）の株、バシラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）の株、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の株、バシラス・オベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｈｂｅｎｓｉｓ）の株、
【００２２】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）の株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株、クレグシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の株、テルモアネロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）の株、テルモアネロバクター・フィンニ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｉｎｎｉ）の株、クロストリジウム・テルモアミロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株またはテルモアネロバクテリウム・テルモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）の株に由来する。
【００２３】
より好ましい態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１０１１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株３８−２、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１７−１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１−１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株Ｂ１０１８、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）株８、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）株２５１、またはテルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種ＡＴＣＣ ５３６２７の株、またはそれらの突然変異体または変異型に由来する。
意図されるＣＧＴａｓｅ変異型は、ＷＯ ９６／３３２６７ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） およびＷＯ ９９／１５６３３ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） （これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。
商業的に入手可能なＣＧＴａｓｅ製品は、ＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） である。
【００２４】
β−アミラーゼ
β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）の例は、作物のβ−アミラーゼ、例えば、オオムギβ−アミラーゼ、コムギβ−アミラーゼ、ダイズβ−アミラーゼ、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するβ−アミラーゼ、例えば、米国特許第４，９７０，１５８号 （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） に記載されているβ−アミラーゼを包含する。
商業的に入手可能なβ−アミラーゼは、ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡおよびＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＤＢＡ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．）を包含する。
【００２５】
プルラナーゼ
プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．４１）の例は、例えば、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの熱安定性プルラナーゼまたは、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、バシラス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）またはバシラス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）（例えば、遺伝子バンク受け入れ番号Ｑ ６８６９９を有するバシラス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼ）からのタンパク質操作プルラナーゼを包含する。
商業的に入手可能なプルラナーゼは、ＰｒｏｍｏｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） およびＯｐｔｉｍａｘＴＭ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．）を包含する。
【００２６】
マルトジェニックアミラーゼ
マルトジェニックアミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．１．１３３）は、多糖類中の１，４−α−Ｄ−グリコシド結合を加水分解して、連鎖の非還元性末端から連続的α−マルトース残基を除去する。マルトジェニックアミラーゼは澱粉および関係する多糖類およびオリゴ糖類に対して作用する。
【００２７】
適当なマルトジェニックアミラーゼの例は、ＥＰ特許Ｎｏ． １２０，６９３ （Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｓ）に開示されているバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ） Ｃ５９９により産生されたマルトジェニックアミラーゼである。意図されるマルトジェニックアミラーゼ変異型は、ＷＯ ９９／４３７９４およびＷＯ ９９／４３７９３（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。
商業的に入手可能なマルトジェニックアミラーゼは、商品名ＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）で販売されている。
【００２８】
材料および方法
分枝酵素：ＷＯ ００／５８４４５ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）に開示されているロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） Ｄ−酵素。
ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡ １５００は、オオムギβ−アミラーゼ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．、米国、から入手可能である）である。
ＰｒｏｍｏｚｙｍｅＴＭ Ｄは、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株に由来するプルラナーゼである（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
イソアミラーゼ：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）イソアミラーゼ（Ｈａｙａｓｉｂａｒａ、日本国、から入手可能である）。
【００２９】
ＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭは、テルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の株に由来する熱安定性シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）である（要求に応じて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ ＬＣは、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するα−アミラーゼである（要求に応じて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
ＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼは、ＷＯ ９９／１９４６７の中に配列番号４として開示されている。（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）。
【００３０】
方法
β−アミラーゼ活性 （ＤＰ ° ）
ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡ １５００の活性をアミラーゼ力の程度（ＤＰ°）で表す。それは、試料を１００ ｍｌの基質と２０ ℃（６８°Ｆ）において１時間インキュベートしたとき、５ ｍｌのフェーリング溶液を還元するために十分な還元性糖を産生する、試料酵素調製物の５％溶液の０．１ ｍｌの中に含有される酵素の量である。
【００３１】
プルラナーゼ活性 （Ｎｅｗ Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ Ｕｎｉｔ Ｎｏｖｏ（ＮＰＵＮ）
１ニュー・プルラナーゼ単位ノボ（ｎｅｗ Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ Ｕｎｉｔ Ｎｏｖｏ（ＮＰＵＮ）） は、
エンド−プルラナーゼ活性の単位であり、０．７％のレッド・プルラン（Ｒｅｄ Ｐｕｌｌｕｌａｎ）に対して４０ ℃、ｐＨ ４．５において３０分の反応時間で作られたノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に関して測定される。分析法の詳細な説明は要求に応じて入手可能である（ＳＯＰ Ｎｏ．：ＥＢ−ＳＭ． ０４２０．０２／０１）。
【００３２】
分枝酵素の活性
分枝酵素の活性は、Ｔａｋａｔａ他、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）、ｐ． ３０９７ （アッセイＡ） に記載されている手順の変更されたバージョンに従い測定する：
【００３３】
２０μｌの酵素溶液を５０ ｍｌの水および５０μｌの基質溶液と混合し、試験温度において３０分間インキュベートする。基質溶液はＴｒｉｓ緩衝液に溶解した０．１％のＩＩＩ型アミロースである。２ ｍｌのヨウ素試薬の添加により、反応を停止させる。ヨウ素試薬は０．５ ｍｌのストック溶液（１０ ｍｌの水中の０．２６ ｇのＩ２および２．６ ｇのＫＩ）から毎日調製し、０．５ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌと混合し、１３０ ｍｌに希釈する。この混合物を温室において５分間インキュベートして、色を安定化する。試験した試料と、細胞抽出物を水で置換した対照との間のＡ６６０の差として、活性を測定する。分枝酵素の活性は、アミロース−ヨウ素複合体のＡ６６０を６０ ℃、ｐＨ ７．０において１％／分だけ分解させることができる酵素の量として定義される。
【００３４】
ヘキソシルトランスフェラーゼで澱粉を処理する方法
ａ） 分枝酵素を使用するとき、下記の手順を使用することができる：
１０〜３０％ＤＳ、ｐＨ ７〜８の澱粉懸濁液をジェット−クッカーまたはオートクレーブ中で糊化する。次いでスラリーを６０〜７０ ℃に冷却し、分枝酵素を添加する。特定した変換に到達したとき（合計の時間は投与量に依存するであろう）、１００ ℃に１５分間加熱することによって反応を停止させる。
ｂ） ３０％ＤＳ、ｐＨ ５〜７の澱粉懸濁液を調製し、酵素を添加する。次いで懸濁液を７０〜９０ ℃に加熱し、４〜２４時間インキュベートする。特定した変換に到達したとき（合計の時間は投与量に依存するであろう）、１４０ ℃に５〜１５分間加熱することによって反応を停止させる。
【００３５】
実施例
実施例 １．マルトースの製造
分枝酵素で液化した３０％ＤＳのジャガイモ澱粉基質を調製した。澱粉スラリーは透明であり、安定であった。次いで澱粉スラリーをβ−アミラーゼ（１ ＤＰ°／ ｇのＤＳ）およびプルラナーゼ（１ ＮＰＵＮ／ ｇのＤＳ）で６０ ℃、ｐＨ ５．０において処理した。
７２時間インキュベートした後、８９％のマルトースが得られた。これに比較して、同一条件下にＴｅｒｍａｍｙｌ ＬＣ ＤＥ １０マルトデキストリンを使用して、わずかに７５％のマルトースが得られた。
本発明は、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理し、次いでβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理する、マルトースシロップを製造する方法に関する。さらに、本発明は、また、マルトースを製造するために適当な出発物質に関する。
【０００２】
発明の背景
マルトース
マルトースは４−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−グルコピラノース（Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１）の化学的構造を有する二糖であり、そしてマルトースシロップの主要な成分である。
【０００３】
マルトースシロップの応用
マルトースは多数の食物および糖菓製品ならびにマルチトールへの水素化のための出発生成物である。
例えば、高い濃度の不純物の存在においてさえ結晶化することができるグルコースと対照的に、マルトースは結晶化しない。出発物質として使用するマルトースが９０％以上の純度を示さないかぎり、マルトースを結晶化させることができず、こうして、それ以上精製することができない。また、マルトースが容易に結晶化することができないという事実は、マルトースがキャンディ産業において価値のある原料である理由の１つである。
【０００４】
また、マルトースは他の応用を有し、例えば、患者に糖を提供することを意図する静脈内注射用液体の活性成分として、そして凍結デザートにおいて（マルトースの低い結晶化能力のために）、パン焼きおよび醸造産業において、および甘味剤、例えば、ソルビトールとして使用できるマルチトールを製造のための１成分として、使用される：下記の文献を参照のこと：Ｇｌｙｃｏｓｅ Ｓｉｒｕｐｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９８４， ｐｐ． １１７−１３５。
こうして、本発明の目的はマルトースシロップを製造する方法を提供することである。
【０００５】
発明の説明
本発明の目的は、高マルトースシロップを製造する方法を提供することである。
少なくとも本発明の関係において、高マルトースシロップは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％のマルトース含量を有するシロップである。
【０００６】
マルトースを製造する伝統的方法
マルトース製造プロセスの出発物質（原料）は、トウモロコシ、ジャガイモ、カッサバ（ｍａｎｉｏｃ）、イネ、およびカッサバ（ｃａｓｓａｖａ）からの医学的等級のマルトースの製造において約１０〜２０％の範囲および食品等級のマルトースについて２０〜４０％の範囲の濃度の澱粉である。
【０００７】
種々のマルトース製造方法が知られてきており、そしてこれらの方法により得られるマルトースの純度は７５〜９０％の範囲である。これらの方法の典型的な例は、澱粉スラリーを加熱し、α−アミラーゼで処理し、これにより澱粉を液化し、次いで液化された澱粉をβ−アミラーゼおよびプルラナーゼ（α−１，６−グルコシダーゼ）で加水分解させてマルトース溶液を形成し、次いでこれを精製することを含んでなる。
【０００８】
このマルトース溶液中の「不純物」のより大きい部分は、グルコースおよびオリゴ糖、例えば、マルトトリオースと、３またはそれより多いグルコース単位から成る、制限されたデキストリンとを含んでなる。
【０００９】
本発明の方法
本発明者らは、澱粉スラリーをヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理し、次いでβ−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）および／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理することによって、α−アミラーゼで液化するときよりも、高いマルトース含量を有するマルトースシロップを製造することができることを発見した。
【００１０】
こうして、第１の面において、本発明は、マルトースを製造する方法に関し、この方法において、澱粉を、
ｉ） ヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）、次いで
ｉｉ） β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）および／またはマルトジェニックアミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１３３）、またはそれらの変異型、
で処理する。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、下記の工程を含んでなる：
ａ） 澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理して、
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度、
を有する生成物を生成し、
ｂ） 上記工程ａ） において得られた生成物をβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理し、そして必要に応じて
ｃ） 上記工程ｂ） において得られた生成物からマルトースを回収し、そして／またはマルトースを精製する。
【００１２】
デキシトロース当量 （Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ；ＤＥ） および分枝付加度 （Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ Ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ；ＡＤＢ）
澱粉生成物の分枝度（ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ）は、イソアミラーゼ（シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）イソアミラーゼ、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ、日本国、から入手可能である）で脱分枝後、澱粉生成物のＤＥ（デキシトロース当量）を測定することによって決定される。ＤＥ（脱分枝後）が高いほど、分枝度はより高い。ヘキソシルトランスフェラーゼにより導入される分枝付加度（ＡＤＢ）は、次のようにして計算される：
分枝付加度＝［（ＤＥ−Ｘ）／Ｘ］×１００％
ここでＸは天然の澱粉（すなわち、出発物質）の脱分枝後のＤＥである。
澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理する方法
澱粉を酵素で効果的に処理するために、澱粉を好ましい態様において糊化することができる。酵素の熱安定性および特定の酵素の糊化温度に依存して、これは酵素処理と組合わせて、または酵素処理前に実施することができる。糊化はバッチシステムで、またはジェット−クッカー中で連続的に実施することができる。実験室規模において、簡単な加熱システム、例えば、油浴、圧力クッカーまたはオートクレーブを使用することができる。引き続く酵素処理または組み合わせた糊化／酵素プロセスのための特定の反応条件、すなわち、温度、ｐＨ 、％ＤＳ、投与量およびインキュベーション時間は、酵素の特性および澱粉源に依存する。
【００１３】
ある態様において、本発明のプロセスの工程ａ） において澱粉スラリーを５０〜１５０ ℃、好ましくは５０〜１００ ℃の範囲の温度で処理する。ヘキソシルトランスフェラーゼとして１，４−α−グルカン分枝酵素を使用する場合、処理温度は５０〜７０ ℃の範囲、好ましくは約６５ ℃であろう。ある態様において、１，４−α−グルカン分枝酵素を使用するとき、澱粉をまず１０５〜１４０ ℃において噴射し、次いで約６５ ℃に冷却することによって糊化する。
【００１４】
４−α−グルカノトランスフェラーゼ（アミロマターセまたはＤ−酵素）およびＣＧＴａｓｅの場合において、糊化工程は任意であり、省略することができる。こうして、澱粉を８０〜１００ ℃、好ましくは約９０ ℃において処理（１または２以上の酵素と直接インキュベート）することができる。
プルラナーゼを工程ｂ） において添加することができる。一般に、澱粉（原料）出発物質は１０〜５０％ＤＳの澱粉スラリー、好ましくは２０〜４０％ＤＳの澱粉スラリー、特に約３０％ＤＳを有する澱粉スラリーである。
【００１５】
本発明の方法は、また、下記の工程を含んでなる方法により得ることができる生成物に関する：
ａ） 澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理して、
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度、
を有する生成物を生成する。
【００１６】
この生成物は、マルトースプロセスのための出発物質として適当である。生成物は安定であり、逆行する傾向が減少し、水溶液中に可溶性である。
それ以上の面において、本発明は、本発明の方法により得ることができるマルトースを含有する生成物に関する。このようにして得られた生成物は、８０％以上、好ましくは８５％以上、特に９０％以上のマルトース（ＤＰ２）含量を有する。
さらに、本発明は、また、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼで処理することによって製造された本発明の生成物を、マルトースを製造するための出発物質（原料）（基質）として使用することに関する。
【００１７】
ヘキソシルトランスフェラーゼ
ヘキソシルトランスフェラーゼの例は、１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）；４−α−グルカノトランスフェラーゼ（アミロマルターゼまたはＤ−酵素）（Ｅ．Ｃ． ２．４．２５）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１９）を包含する。
【００１８】
１，４ −α−グルカン分枝酵素
ある態様において、ヘキソシルトランスフェラーゼは、アミロペクチンの追加の１，６−グリコシド結合を形成し、アミロースをアミロペクチンに変換する１，４−α−グルカン分枝酵素である。アミロペクチン分枝酵素はしばしばＱ−酵素と命名される。
特に意図される１，４−α−グルカン分枝酵素は、ロドテルムス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、好ましくはロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、特にロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）からのｇｌｇＢ遺伝子を含んでなる受託された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １２６０７株に由来する。
【００１９】
４ −α−グルカノトランスフェラーゼ （ アミロマターセまたは Ｄ −酵素 ）
ある態様において、ヘキソシルトランスフェラーゼは４−α−グルカノトランスフェラーゼであり、これは１，４−α−Ｄ−グルカンのセグメントをアクセプター中の新しい４−位置に転移させ、ここでアクセプターはグルコースまたは１，４−α−Ｄ−グルカンであることができる。４−α−グルカノトランスフェラーゼはしばしばＤ−酵素と呼ばれる。
特に意図される４−α−グルカノトランスフェラーゼは、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）に由来する（Ｊｅｏｎ、Ｂｅｏｎｇ−Ｓａｍ他、４−ａｌｐｈａ−Ｇｌｕｃａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅｏｎ Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ （１９９７）。Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４８：１７１−１７８）。
【００２０】
ＣＧＴａｓｅ
ある態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の株、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ）の株、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）の株、テルモアネロビウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ）の株、テルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の株、テルモアネロバクテリウム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の株、またはテルモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）の株に由来する。
【００２１】
好ましい態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス・アウトリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｕｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）の株、バシラス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の株、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）の株、バシラス・サーキュランスｖａｒ． アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ｖａｒ． ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）の株、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）の株、バシラス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓ）の株、バシラス・ハロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）の株、バシラス・マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）の株、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）の株、バシラス・オベンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｏｈｂｅｎｓｉｓ）の株、
【００２２】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）の株、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の株、クレグシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）の株、テルモアネロバクター・エタノリカス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）の株、テルモアネロバクター・フィンニ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｉｎｎｉ）の株、クロストリジウム・テルモアミロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株、クロストリジウム・テルモサッカロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）の株またはテルモアネロバクテリウム・テルモスルフリゲネス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｕｒｉｇｅｎｅｓ）の株に由来する。
【００２３】
より好ましい態様において、ＣＧＴａｓｅまたはＣＧＴａｓｅ変異型は、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１０１１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株３８−２、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１７−１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株１−１、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種株Ｂ１０１８、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）株８、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）株２５１、またはテルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種ＡＴＣＣ ５３６２７の株、またはそれらの突然変異体または変異型に由来する。
意図されるＣＧＴａｓｅ変異型は、ＷＯ ９６／３３２６７ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） およびＷＯ ９９／１５６３３ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） （これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。
商業的に入手可能なＣＧＴａｓｅ製品は、ＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） である。
【００２４】
β−アミラーゼ
β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）の例は、作物のβ−アミラーゼ、例えば、オオムギβ−アミラーゼ、コムギβ−アミラーゼ、ダイズβ−アミラーゼ、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来するβ−アミラーゼ、例えば、米国特許第４，９７０，１５８号 （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） に記載されているβ−アミラーゼを包含する。
商業的に入手可能なβ−アミラーゼは、ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡおよびＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＤＢＡ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．）を包含する。
【００２５】
プルラナーゼ
プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．４１）の例は、例えば、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）からの熱安定性プルラナーゼまたは、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、例えば、バシラス・アシドプルリチカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）またはバシラス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）（例えば、遺伝子バンク受け入れ番号Ｑ ６８６９９を有するバシラス・デラミフィカンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓ）プルラナーゼ）からのタンパク質操作プルラナーゼを包含する。
商業的に入手可能なプルラナーゼは、ＰｒｏｍｏｚｙｍｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ） およびＯｐｔｉｍａｘＴＭ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．）を包含する。
【００２６】
マルトジェニックアミラーゼ
マルトジェニックアミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．１．１３３）は、多糖類中の１，４−α−Ｄ−グリコシド結合を加水分解して、連鎖の非還元性末端から連続的α−マルトース残基を除去する。マルトジェニックアミラーゼは澱粉および関係する多糖類およびオリゴ糖類に対して作用する。
【００２７】
適当なマルトジェニックアミラーゼの例は、ＥＰ特許Ｎｏ． １２０，６９３ （Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ Ａ／Ｓ）に開示されているバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ） Ｃ５９９により産生されたマルトジェニックアミラーゼである。意図されるマルトジェニックアミラーゼ変異型は、ＷＯ ９９／４３７９４およびＷＯ ９９／４３７９３（これらは引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されている。
商業的に入手可能なマルトジェニックアミラーゼは、商品名ＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）で販売されている。
【００２８】
材料および方法
分枝酵素：ＷＯ ００／５８４４５ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）に開示されているロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ） Ｄ−酵素。
ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡ １５００は、オオムギβ−アミラーゼ （Ｇｅｎｅｃｏｒ Ｉｎｔ．、米国、から入手可能である）である。
ＰｒｏｍｏｚｙｍｅＴＭ Ｄは、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の株に由来するプルラナーゼである（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
イソアミラーゼ：シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）イソアミラーゼ（Ｈａｙａｓｉｂａｒａ、日本国、から入手可能である）。
【００２９】
ＴｏｒｕｚｙｍｅＴＭは、テルモアネロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）の株に由来する熱安定性シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）である（要求に応じて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ ＬＣは、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）に由来するα−アミラーゼである（要求に応じて、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
ＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅＴＭ （Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国、から入手可能である）。
野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼは、ＷＯ ９９／１９４６７の中に配列番号４として開示されている。（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓ、デンマーク国）。
【００３０】
方法
β−アミラーゼ活性 （ＤＰ ° ）
ＳｐｅｚｙｍｅＴＭ ＢＢＡ １５００の活性をアミラーゼ力の程度（ＤＰ°）で表す。それは、試料を１００ ｍｌの基質と２０ ℃（６８°Ｆ）において１時間インキュベートしたとき、５ ｍｌのフェーリング溶液を還元するために十分な還元性糖を産生する、試料酵素調製物の５％溶液の０．１ ｍｌの中に含有される酵素の量である。
【００３１】
プルラナーゼ活性 （Ｎｅｗ Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ Ｕｎｉｔ Ｎｏｖｏ（ＮＰＵＮ）
１ニュー・プルラナーゼ単位ノボ（ｎｅｗ Ｐｕｌｌｕｌａｎａｓｅ Ｕｎｉｔ Ｎｏｖｏ（ＮＰＵＮ）） は、
エンド−プルラナーゼ活性の単位であり、０．７％のレッド・プルラン（Ｒｅｄ Ｐｕｌｌｕｌａｎ）に対して４０ ℃、ｐＨ ４．５において３０分の反応時間で作られたノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）に関して測定される。分析法の詳細な説明は要求に応じて入手可能である（ＳＯＰ Ｎｏ．：ＥＢ−ＳＭ． ０４２０．０２／０１）。
【００３２】
分枝酵素の活性
分枝酵素の活性は、Ｔａｋａｔａ他、Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ （１９９４）、ｐ． ３０９７ （アッセイＡ） に記載されている手順の変更されたバージョンに従い測定する：
【００３３】
２０μｌの酵素溶液を５０ ｍｌの水および５０μｌの基質溶液と混合し、試験温度において３０分間インキュベートする。基質溶液はＴｒｉｓ緩衝液に溶解した０．１％のＩＩＩ型アミロースである。２ ｍｌのヨウ素試薬の添加により、反応を停止させる。ヨウ素試薬は０．５ ｍｌのストック溶液（１０ ｍｌの水中の０．２６ ｇのＩ２および２．６ ｇのＫＩ）から毎日調製し、０．５ ｍｌの１ Ｎ ＨＣｌと混合し、１３０ ｍｌに希釈する。この混合物を温室において５分間インキュベートして、色を安定化する。試験した試料と、細胞抽出物を水で置換した対照との間のＡ６６０の差として、活性を測定する。分枝酵素の活性は、アミロース−ヨウ素複合体のＡ６６０を６０ ℃、ｐＨ ７．０において１％／分だけ分解させることができる酵素の量として定義される。
【００３４】
ヘキソシルトランスフェラーゼで澱粉を処理する方法
ａ） 分枝酵素を使用するとき、下記の手順を使用することができる：
１０〜３０％ＤＳ、ｐＨ ７〜８の澱粉懸濁液をジェット−クッカーまたはオートクレーブ中で糊化する。次いでスラリーを６０〜７０ ℃に冷却し、分枝酵素を添加する。特定した変換に到達したとき（合計の時間は投与量に依存するであろう）、１００ ℃に１５分間加熱することによって反応を停止させる。
ｂ） ３０％ＤＳ、ｐＨ ５〜７の澱粉懸濁液を調製し、酵素を添加する。次いで懸濁液を７０〜９０ ℃に加熱し、４〜２４時間インキュベートする。特定した変換に到達したとき（合計の時間は投与量に依存するであろう）、１４０ ℃に５〜１５分間加熱することによって反応を停止させる。
【００３５】
実施例
実施例 １．マルトースの製造
分枝酵素で液化した３０％ＤＳのジャガイモ澱粉基質を調製した。澱粉スラリーは透明であり、安定であった。次いで澱粉スラリーをβ−アミラーゼ（１ ＤＰ°／ ｇのＤＳ）およびプルラナーゼ（１ ＮＰＵＮ／ ｇのＤＳ）で６０ ℃、ｐＨ ５．０において処理した。
７２時間インキュベートした後、８９％のマルトースが得られた。これに比較して、同一条件下にＴｅｒｍａｍｙｌ ＬＣ ＤＥ １０マルトデキストリンを使用して、わずかに７５％のマルトースが得られた。
Claims (17)
- マルトースを製造する方法において、澱粉を、
ｉ） ヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）、次いで
ｉｉ） β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．２）および／またはマルトジェニックアミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１３３）、またはそれらの変異型、
で処理することを特徴とする方法。 - 工程：
ａ） 澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理して、
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度、
を有する生成物を生成し、
ｂ） 上記工程ａ） において得られた生成物をβ−アミラーゼおよび／またはマルトジェニックアミラーゼ、またはそれらの変異型で処理し、そして必要に応じて
ｃ） 上記工程ｂ） において得られた生成物からマルトースを回収し、そして／またはマルトースを精製する、
を含んでなる、請求項１に記載の方法。 - 工程ａ） において澱粉を５０〜１５０ ℃、好ましくは５０〜１００ ℃の範囲の温度において処理する、請求項２に記載の方法。
- さらにプルラナーゼを、工程ｂ） において添加する、請求項１または２に記載の方法。
- １０〜５０％ＤＳ、好ましくは２０〜４０％ＤＳ、特に約３０％ＤＳの澱粉スラリーを出発物質として使用する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
- ヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）が、１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）；４−α−グルカントランスフェラーゼ（アミロマルターゼまたはＤ−酵素）（Ｅ．Ｃ． ２．４．２５）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１９）から成る群から選択される酵素の１または２以上である、請求項１に記載の方法。
- 工程ａ） において澱粉をＤ−酵素とマルトジェニックアミラーゼまたはそれらの変異型との組み合わせで処理する、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
- 前記β−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．２）がオオムギβ−アミラーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記プルラナーゼがバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プルラナーゼである、請求項１に記載の方法。
- 前記１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）がロドテルムス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、好ましくはロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項６に記載の方法。
- 下記の性質を有する生成物が得られるまで、澱粉をヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）で処理することによって得ることができる生成物：
ｉ） 分枝酵素を使用する場合、１０〜１５０％の分枝付加度（ＡＤＢ）、および／または
ｉｉ） ８〜１５の範囲のＤＥ、好ましくは１０〜１２の範囲のＤＥが得られるまで、３０％ＤＳの澱粉を野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼで処理して得ることができる液化澱粉の粘度に対応する粘度。 - 前記ヘキソシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ． ２．４．１）が、１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）；４−α−グルカノトランスフェラーゼ（アミロマルターゼまたはＤ−酵素）（Ｅ．Ｃ． ２．４．２５）；シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１９）から成る群から選択される酵素の１または２以上である、請求項１１に記載の生成物。
- 前記１，４−α−グルカン分枝酵素（Ｅ．Ｃ． ２．４．１．１８）が、ロドテルムス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ）、好ましくはロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）、特にロドテルム・オバメンシス（Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｏｂａｍｅｎｓｉｓ）からのｇｌｇＢ遺伝子を含んでなる受託された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＤＳＭ １２６０７株に由来する、請求項１２に記載の生成物。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載の方法により得ることができるシロップ生成物。
- マルトース（ＤＰ２）含量が８０％以上、好ましくは８５％以上、特に９０％以上である、請求項１４に記載のシロップ生成物。
- マルトースを製造するための出発物質（基質）としての、請求項１１〜１３のいずれかに記載の生成物の使用。
- 生成物の一部分をマルトース製造用出発物質（基質）として使用する、請求項１６に記載の使用。
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