POLIMEROS SOLUBLES DE GLUCOSA ALTAMENTE RAMIFICADOS
La invención tiene por objeto polímeros solubles de glucosa altamente ramificados que presentan un bajo contenido de azúcares de reducción, una tasa de enlaces glucosídicos a-1 ,6-remarcablemente elevada, una gama estrecha de altos pesos moleculares, y un perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas particulares. La invención se refiere igualmente a polímeros solubles de glucosa altamente ramificados que presentan una baja viscosidad intrínseca. La invención destina más particularmente estos polímeros solubles de glucosa altamente ramificados a aplicaciones alimenticias y sobre todo médicas. Por "perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas" se entiende en el sentido de la invención la repartición en tamaño, expresada en grado de polimerización (o DP), de cadenas glucosídicas lineales a-1 ,4 unidas a otras cadenas glucosídicas lineales a-1 ,4 por los puntos de ramificación a-1 ,6. La invención se refiere igualmente a un procedimiento de fabricación de dichos polímeros solubles de glucosa altamente ramificados. Los polímeros de glucosa accesibles ¡ndustrialmente se preparan de manera clásica por hidrólisis de almidones naturales o híbridos y sus derivados.
Los hidrolisatos de almidón estándar son así producidos por hidrólisis ácida o enzimática de almidón de cereales o tubérculos. Se hacen de una mezcla de glucosa y de polímeros de glucosa, de pesos moleculares extremadamente variados. Estos hidrolisatos de almidón (dextrinas, maltodextrinas
...) producidos en la industria (con un cierto DP promedio) consisten en una larga distribución de sacáridos que contienen a la vez estructuras lineales y ramificadas. Los hidralisatos de almidón, y notablemente las maltodextrinas se utilizan más particularmente como transportadores o agentes de carga, agentes de texturización, soportes de atomización, agentes filmógenos, agentes de control de congelación o agentes anti-cristalisadores. Se pueden igualmente utilizar como agentes de reemplazo de materias grasas o por su aportación nutricional. Al nivel intestinal, los hidrolisatos de almidón se digieren así por -amilasa pancreática que se trata directamente sobre las cadenas laterales unidas en oc-1 ,4. Esta digestión enzimática objetivo conduce a reducir el tamaño de dichos hidrolisatos de almidón hasta las dextrinas limitadas, después un cierto número de enzimas unidas a la mucosa intestinal (maltasa, sucrasa y a-dextrinasa) continúan hidrolizando los sacáridos lineales y los sacáridos ramificados residuales en unidades de glucosa. La cinética de estas diferentes digestiones enzimáticas es directamente entonces una función de la estructura de hidrolisatos de almidón. Por ejemplo, a-amilasa pancreática se va a tratar más fácilmente sobre los hidrolisatos de almidón ricos en oligosacárídos lineales o que presentan estructuras ramificadas a las cadenas largas, mientras que se va a tratar más difícilmente o no del todo sobre las estructuras ramificadas compactas que presentan principalmente las cadenas cortas. En el estado de la técnica, estos dos tipos de estructuras se emplean generalmente de manera diferente, en función de los dominios de aplicación contemplados. El primer tipo de estructuras derivadas del almidón, (notablemente aquel de los oligosacárídos de DP corto) se utiliza como fuente de glucosa directamente asimilable por el organismo, notablemente en tres dominios de aplicación. El primer dominio de aplicación es aquel de los substratos energéticos para deportes. En efecto, en el dominio deportivo, una bebida, consumida durante una actividad física que requiere demasiado esfuerzo, debe aportar instantáneamente la energía y el agua necesarias para compensar la pérdida de fluido por perspiración. Resulta que una composición equilibrada en hidratos de carbono es esencial para obtener tal resultado. Una solución clásicamente propuesta para la bebida óptima es preferir oligosacárídos cortos lineales de DP 3 a 6 en lugar de las estructuras glucosídicas ramificadas más compactas, ya que estos oligosacáridos cortos se absorben a la frecuencia más elevada, conservando la osmolalidad a un nivel moderado, impidiendo así la pérdida de fluidos y los efectos secundarios tales como la diarrea y los calambres. El segundo dominio de aplicación es aquel de la alimentación parenteral, en donde las soluciones nutritivas aportadas por vía venosa son conocidas para mantener un paciente en buen estado y para proporcionarle los nutrimientos cuando no se puede alimentarse a través de su sistema digestivo normal. Se elige aquí igualmente administrar los oligosacáridos lineales con un DP comprendido entre 2 y 5, ya que estos sacáridos se hidrolizan por maltasas en el riñon, y la glucosa liberada se reabsorbe entonces. Así es como la utilización de oligosacáridos cortos lineales permite aportar suficientemente la energía en una solución isotónica, sin sobrehidratar al paciente. El tercer dominio de aplicación es aquel de la nutrición entérica, en donde es necesario proporcionar bebidas que puedan ya sea ingerirse oralmente o administrarse por vía tubular en el estómago o el intestino delgado. Para estos fluidos entéricos, el problema principal es sin embargo la diarrea, debido a una osmolalidad muy fuerte. El segundo tipo de estructuras derivadas del almidón, es decir, aquel de hidrolisatos de almidón o de derivados de almidón que presentan las estructuras ramificadas compactas a cadenas cortas, se utiliza para disminuir la liberación de glucosa asimilable y/o aportar una cierta osmolalidad, notablemente en tres dominios de aplicaciones. El primer dominio de aplicación es aquel del dominio de la diálisis peritoneal continua y ambulatoria. La patente EP 207.676 enseña que para un uso en diálisis, se prefieren los oligosacáridos lineales de DP corto, hidrolisatos de almidón encerrando las estructuras ramificadas que forman las soluciones límpidas e incoloras, a 10% en el agua, teniendo un peso molecular (Mw) de 5.103 a 106 daltones y un índice de polimolecularidad o Ip bajo. Aquello se traducirá por las composiciones que encierran principalmente los polímeros de glucosa de alto peso molecular comprendido entre 5.103 a y 5.105 daltones, que no encierran nada o poca glucosa u oligosacáridos de DP inferior o igual a 3, y nada o pocos políemeros de glucosa de Mw superior a 106 daltones. Se concluye en efecto fácilmente para esta aplicación en diálisis peritoneal, que los oligosacáridos de DP corto y de bajo peso molecular atraviesan rápidamente la pared peritoneal y son así sin interés durable para la creación de un gradiente de presión osmótica, y que los polímeros de muy alto peso molecular, privados de poder osmótico, se evitan e igualmente proscriben ya que son potencialmente peligrosos si se precipitan consecutivamente a su retrogradación. En su patente EP 667.356, la sociedad solicitante propone un proced imiento de fabricación , a partir de almidón ceroso, de un hidrolisato de almidón completamente soluble en agua y de bajo índice de polimolecularidad, inferior a 2.8, teniendo un Mw comprendido entre 5.1 03 a 1 .1 06 daltones Este procedimiento consiste en hidrolizar por vía acida un lecho de almidón constituido exclusivamente de amilopectina, después completar esta hidrólisis ácida por una hidrólisis enzimática con la ayuda de a-amilasa bacteriana, y cromatografiar el hidrolisato obtenido sobre resinas catiónicas fuertes, macroporosas bajo forma alcalina o alcalino-térrea . Se debe observar que en la época, la sociedad solicitante recomienda no' utilizar más q ue almidones exclusivamente compuestos de amilopectina y corrientemente denominados almidones cerosos o almidones de cera como materia prima en dicho procedimiento, los almidones o féculas conteniendo una proporción no despreciable de amilosa no convienen. El segundo dominio de aplicación es aquel de la regulación de la d igestión o de la alimentación de diabéticos. Se ha propuesto en efecto, en la patente U S 4.840.807 o en la solicitud de patente JP 2001 /1 1 1 01 (no de registro 1 1 /1 87.708), extraer las únicas zonas densas en enlaces a- ,6, como fuente de glúcidos de absorción lenta, en el sentido en donde los enlaces a-1 ,6 son más difíciles de degradar que los enlaces a-1 ,4. Dos familias de productos se han desarrollado así. La primera se refiere a las dextrinas limitadas preparadas por la degradación de zonas de enlaces a-1 ,4 por una a-amilasa sola, y la segunda familia se refiere a las dextrinas preparadas por la degradación de zonas de enlaces a-1 ,4 por la acción simultánea de una a-amilasa y una ß-amilasa. Estas dextrinas limitadas obtenidas son entonces particularmente resistentes a las enzimas digestivas humanas. Sin embargo, estos compuestos tienen el inconveniente de presentar un peso molecular muy bajo (comprendido entre 10.000 y 55.000 daltones), lo que limite el uso en otros dominios de aplicaciones. El, tercer dominio de aplicación es aquel de substitutos de plasma sanguíneo. La solicitud de patente internacional WO 03/18639 recomienda en efecto desarrollar, únicamente a partir de amilopectina, compuestos hiperramificados para utilizarlos en el tratamiento quirúrgico o terapéutico de mamíferos o en los métodos de diagnóstico. Según una enseñanza de esta solicitud de patente, y más particularmente en el dominio de substitutos de plasma sanguíneo, estas amilopectinas hiperramificadas se presentan como permitiendo resolver el inconveniente principal de los primeros substitutos de plasma sanguíneo elaborados, se trata de hidroxietilalmidones o HEA, es decir, su metabolización imperfecta en el organismo. En esta solicitud de patente, la estabilidad relativa de dichas amilopectinas hiperramificadas se evoca en relación con su contenido elevado en enlaces a-1 ,6. Este contenido elevado en enlaces -1 ,6 permitirá entonces reducir suficientemente de manera fuerte la degradación de amilipectina a a-amilasa y producir un polisacárido degradable pero que posee aún las propiedades de un substituito de plasma sanguíneo ideal, es decir, sus propiedades farmacocinéticas y su efecto volúmico. Por otra parte, la posibilidad de hacer variar la repartición de puntos de ramificación es igualmente contemplada en esta solicitud de patente WO 03/018639 para controlar la cinética de la degradación de amilopectina hiperramificada en la dirección deseada. Sin embargo, la preparación de estas amilopectinas hiperramificadas sufre todavía de un inconveniente mayor. En efecto, en razón de un grao de ramificación demasiado elevado (hasta 25% de enlaces a-1 ,6) o de una distancia muy corta entre los puntos de ramificación, el efecto obtenido es diamétricamente opuesto a aquel deseado ya que el ataque por a-amilasa de estas amilopectinas hiperramificadas puede retardarse fuertemente o no intervenir del todo. El impedimento estérico es tal, en las regiones de la molécula en donde la densidad de los puntos de ramificación es elevada, que el acceso a a-amilasa no es posible. En estas condiciones, la ausencia de digestión enzimática de estas amilopectinas hiperramificadas no favorece particularmente el uso de tales estructuras como substituitos de plasma sanguíneo (acumulación de productos no degradados). Conforme a lo anterior, resulta que existe una necesidad no satisfecha de colocar los polímeros de glucosa altamente ramificados que presentan propiedades estructurales remarcables en términos de repartición de longitudes de cadenas ramificadas y de viscosidad intrínseca y que confieren a los productos que los contienen, capacidades más grandes de duración de vida y de digestión controlada. Estas propiedades permiten entonces el uso de estos polímeros de glucosa altamente ramificados en los dominios de aplicación también variados, tales como la aportación de substratos energéticos cuando las actividades físicas y en los dominios de la diálisis peritoneal, la nutrición entérica o parenteral, los substitutos de plasma sanguíneo, la regulación de la digestión y la alimentación de diabéticos. La sociedad solicitante ha tenido el mérito de conciliar todos estos objetivos reputados hasta ahora difícilmente conciliables imaginando y elaborando, a costo de numerosas búsquedas, nuevos polímeros solubles de glucosa altamente ramificados particulares porque se refiere a su distribución de longitudes de cadenas ramificadas y su viscosidad intrínseca. Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, son polímeros de glucosa que presentan un contenido de azúcares de reducción inferior a 1 %, una tasa de enlaces glucosídicos a-1 ,6 comprendida entre 13 y 17% y un w de un valor comprendido entre 0.9.105 y 1 .5. ? 05 daltones, caracterizados por el hecho de que su perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas es constituido de 70 a 85% de DP inferior a 15, de 10 a 16% de DP comprendido entre 15 y 25% y de 8 a 13% de DP superior a 25. De manera preferencial, los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención presentan un coeficiente de viscosidad intrínseca "a" según la relación de ARK HOUWINK SAKURADA inferior o igual a 0.1 . La sociedad solicitante ha descrito ya en su solicitud de patente EEP 1 .369.432 polímeros solubles de glucosa altamente ramificados teniendo un contenido de azúcares de reducción inferior a 1 %, una tasa de enlaces a-1 ,6 comprendida entre 12 y 30% y un Mw de un valor comprendido entre 0.35 y 2.105 daltones. Sin embargo, ninguno de estos polímeros de glucosa se describe y ejemplifica en dicha solicitud de patente ni presenta el perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas y la viscosidad intrínseca de polímeros de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, como se ejemplificará a continuación. La determinación de poder reductor, de tasa de enlaces glucosídicos a-1 ,6 y de masas moleculares de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, se realizan en las mismas condiciones que aquellas descritas en la solicitud de patente EP 1 .369.432. Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención presentan entonces un contenido de azúcares de reducción inferior a 1 %, una tasa de enlaces glucosídicos a-1 ,6 comprendida entre 13 y 17% y un Mw de un valor comprendido entre » 0.9.105 y 1 .5.1 05 daltones. Con respecto a los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados de la solicitud de patente EP 1 .369.432 de la sociedad solicitante, los nuevos polímeros de glucosa conforme a la invención presentan espectros más estrechos de tasas de enlaces glucosídicos a-1 ,6 y de pesos moleculares. Pero los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención se caracterizan sobre todo por su perfil de distribución de longitudes de cadenas. La determinación de la longitud de las cadenas ramificadas de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención se realiza en dos etapas. Una primer etapa consiste en desramificar dicho productos (hidrólisis específica del enlace a-1 ,6) con la ayuda de una isoamilasa bacteriana, seguida por una segunda etapa de identificación de grado de polimerización de oligosacáridos liberados por cromatografía de exclusión esférica (HPSEC) en comparación con los pululantes de tamaño conocido. Esta técnica consiste en pesar 50 mg de productos a analizar y agregar 3.75 mi de agua. Después de la agitación de esta mezcla, se agregan 0.5 mi de Dirnetilsulfóxido (DMSO) y se lleva a ebullición bajo agitación durante 30 minutos. Se baja enseguida la temperatura a 45°C y se agregan 0.25 mi de solución de tampón de acetato de sodio 1 M (previamente llevado a pH 3.5 con el ácido acético). Se agregan enseguida 1 0 µ? de una isoamilasa extra ída de Pseudomonas amyloderasoma comercializada por la sociedad HAYASH IBARA (en razón de 59.000 U/mg) y dejar tratar a 45°C durante 1 hora. Se procede a este tratamiento enzimático sucesivamente dos veces, después se detiene la reacción por ebullición durante 3 minutos. Después de agregar 0.5 mi de n-butanol, la agitación y conservación a temperatura ambiente bajo agitación durante 1 hora, el medio reacción se centrífuga entonces a 2600 tr/min durante 20 minutos , y el sobrenadante se desmineraliza con la ayuda de resinas Amberlite' 200 y Amberlite I RA-67 comercializadas respectivamente por las sociedades FLUKA y SIG A. Una última agitación y una filtración sobre el filtro de nylon de 0.45 µ?? de porosidad se realizan antes de inyectar sobre la columna HPSEC. La cromatografía HSPEC es define de la manera siguiente (sobre la columna PWXL oligo comercializada por TSK y sobre la columna SB802 + 803 + 804 + 805 comercializada por SHODEX): Volumen de inyección: 200 µ? Producción: 0.5 ml/min Temperatura de las columnas: 40°C - Eluyente: Nitrato de sodio 0.2 M + azida de Na 0.02% Duración de elusión: 180 min. El tamaño de los oligosacáridos liberados se determina por su tiempo de elusión con respecto al tiempo de elusión de polulantes de tamaño conocido. Los polímeros de glucosa altamente ramificados conforme a la invención presentan entonces un perfil de distribución de longitudes de cadena ramificadas constituido: de 70 a 85% de DP inferior a 1 5 - de 10 a 16% de DP comprendido entre 15 y 25, de 8 a 13% de DP superior a 25. Este perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas conduce a obtener estructuras remarcables por su contenido elevado de cadenas ramificadas cortas (70 a 85% de DP inferior a 1 5) y su contenido aún relativamente importante de cadenas ramificadas de tamaño promedio de longitud (15 a 30% de DP superior a 15). De esta manera, los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención son ricos en cadenas de DP principalmente cortas (más de 70% de DP inferior a 15), lo que permite obtener una estructura ramificada compacta principalmente a cadenas cortas, y encierran sin embargo aún suficientemente las cadenas de tamaño promedio de longitud (hasta 30%), que las a-amilasas pancreáticas pueden digerirse fácilmente para liberar la glucosa asimilable por el organismo.
Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención son igualmente caracterizados por el valor de su coeficiente de viscosidad intrínseca "a" según la relación de MARK, HOUWINK y SAKURADA. La medición del coeficiente de viscosidad intrínseca "a" según la relación de MARK, HOUWI NK y SAKURADA se utiliza por la sociedad solicitante para ilustrar el grado de compacidad de los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención. Se conoce por el experto en la materia que la relación empírica de MARK, HOUWINK y SAKURADA que comunica la viscosidad intrínseca (r¡) de un polímero a su masa molecular promedio viscosimétrica (o Mv) se proporciona por la siguiente ecuación: ? = K x (Mv)a en donde "K" y "a" son constantes que dependen de la naturaleza de polímero estudiado, de la naturaleza del solvente y de la temperatura. En las condiciones de análisis según la invención, el solvente utilizado por la sociedad solicitante es una solución acuosa de nitrato 0.2 M. La constante "a" se relaciona más particularmente al volumen hidrodinámico promedio ocupado por el polímero en el solvente considerado. Se establece en el estado y de la técnica que para un polímero en solución, más la molécula dobla ella misma, más el valor de "a" es bajo. Inversamente, para una molécula "fuertemente desplegada", más el valor de "a" se eleva. La medición del coeficiente "a" según la relación de MARK, HOUWINK y SAKURADA se determina por cálculo, con la ayuda de la siguiente ecuación: Log ? = Log K + a Log (Mv) Se traza la curva Log ? en función de Log (Mv), del cual el orden al origen proporciona Log K y la pendiente de la derecha es el coeficiente "a". Los valores de viscosidad y de masa molecular promedio viscométrica de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención se determinan sobre un viscometro capilar VISCOTEK (modelo 250) acoplado a un refractometro R410, después de la separación sobre columnas SHODEX SB 802 + 803 + 805. Las condiciones operativas cromatográficas son las siguientes: Inyección: 100 µ? Producción: 0.5 ml/min Temperatura de columnas: 35°C Eluyente: Nitrato de sodio 0.2 M y azida de sodio 0.02% Tiempo de análisis: 1 80 min Las condiciones operativas para la detección refractromética son: Sensibilidad R410: 16X Temperatura de viscosimetría: 35°C El marcador de producción es una solución de glicerina a 5% en el eluyente. La calibración del detector se realiza con la ayuda de un polietilenoóxido comercializado por la sociedad VISCOTEX, de peso molecular, de concentración y de viscosidad intrínseca conocida. La recuperación de esta referencia permite calcular la "masa constante" y la "viscosidad constante" del viscosímetro. La recuperación del pico de elusión del marcado de producción permite el cálculo de los tiempos de referencia y de volúmenes inter-detectores. Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención presentan entonces un coeficiente "a" calculado según la relación de MA K, HOUWINK y SAKURADA inferior a 0.1 , lo que traducirá un estado de compacidad elevado, muy superior a amilopectina (amilopectina estándar, en las mismas condiciones de medición, presente en efecto un valor de coeficiente "a" de 0.33). Los polímeros de glucosa altamente ramificados así obtenidos se adaptan particularmente bien a su uso en los dominios de aplicación en donde es necesario colocar de estructuras compactas y densas, por ejemplo, en diálisis peritoneal o en alimentación para diabéticos. La determinación de la resistencia de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, a las enzimas implicadas en la digestión de glúcidos alimenticios, es igualmente un criterio esencial en la elección de un ingrediente alimenticio entrando en la composición de formulaciones al uso en deportes o destinadas por ejemplo a la nutrición entérica y parenteral. La sociedad solicitante habiendo estimado el porcentaje de liberación de glucosa por digestión enzimática de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados descritos en su solicitud de patente EP 1 :369.432, a un valor comprendido entre 50 y 70%. Esta resistencia a la hidrólisis es notablemente superior a maltodextrinas clásicas y comparable con glucógeno. Como se ejemplificará a continuación, los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, se liberan al final de glucosa en las proporciones similares a aquellas descritas en dicha patente EP 1 .369.432, lo que los vuelve aptos para utilizares por los deportes o para las nutriciones, entérica y parenteral, pero esta liberación de glucosa se efectúa de manera demasiado más retardada en el tiempo, lo que los destina ventajosamente a los dominios de aplicación que necesitan regular la glicemia como la alimentación de diabéticos. No existe, en el conocimiento de la sociedad solicitante, polímeros solubles de glucosa altamente ramificados que poseen tan distribución de sus longitudes de cadenas ramificadas que permiten emplearlos en todos los dominios de aplicación contemplados por la presente invención. De manera ventajosa, los polímeros de glucosa altamente ramificados conforme a la invención pueden clasificarse en tres subfamilias. Estas tres subfamilias presentan un perfil de distribución de longitudes de cadenas ramificadas que difieren en su contenido de cadenas promedio, DP comprendido entre 1 5 y 25. La primera subfamilia cubre los polímeros altamente ramificados que presentan al menos 14% a lo mucho 16% DP comprendido entre 15 y 25. La segunda subfamilia cubra los polímeros altamente ramificados que presentan al menos 12% a lo más 14% de DP comprendido entre 15 y 25. La tercer subfamilia cubre los polímeros altamente ramificados que presentan al menos 10% a lo más 12% de DP comprendido entre 15 y 25. Esta variación en la repartición de cadenas de tamaño promedio autoriza la utilización ventajosa de estas subfamilias en el centro de las aplicaciones alimenticias o médicas en donde es necesario hacer variar la digestión de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados, utilizados. Estas tres subfamilias presentan en efecto una estructura ramificada constituida de cadenas de tamaño principalmente corto, pero de las cuales las proporciones variables de cadenas promedio permiten modular no solamente el grado de compacidad, sino que igualmente controlar la liberación de glucosa, como se ejemplificará a continuación.
Para preparar los polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención, se realiza la sucesión de las siguientes etapas que consisten de: 1 ) preparar una solución acuosa de almidón que presenta un contenido de amilosa de al menos 30% en peso, de preferencia comprendido entre 35 y 80% en peso, 2) tratar sucesivamente dicha solución con una enzima de ramificación después una ß-amilasa, 3) efectuar un fraccionamiento a manera de recuperar las fracciones de alto peso molecular, 4) recoger los polímeros de glucosa altamente ramificados así obtenidos. La preparación de polímeros de glucosa altamente ramificados conforme a la invención se realiza al modificar las condiciones operativas ya descritas en la solicitud de patente EP 1 .269.432 de la sociedad solicitante. Además, contrario a lo que se ha descrito en la solicitud de patente EP 1 .269.432, la elección de una calidad de almidón particular asume una gran importancia. La sociedad solicitante a, en efecto, encontrado que solo los almidones de los cuales el contenido de amilosa excede el 30%, pueden servir como material prima en el procedimiento de la invención. La maltodextrinas, los almidones estándar (que no encierran más del 30% de amiiosa) o los almidones de tipo ceroso, cualquiera q ue sea su origen botánico, no convienen absolutamente para la fabricación de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención. Es además mérito de la sociedad solicitante haber vencido un prejuicio técnico que observa que para la obtención de estructura ramificada estable, compacta y que presenta una digestión controlada, falla en partir los almidones ricos en amilipectina (como la enseñanza de la solicitud de patente WO 03/018639). Como se ejemplificará a continuación, la sociedad solicitante ha encontrado que por el contrario, es por la elección de almidones ricos en amiiosa utilizados como substratos de partida que es posible obtener los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención. Es igualmente por la elección del contenido en amiiosa de almidones utilizados como substratos de partida que es posible obtener las tres subfamilias definidas a continuación. La segunda etapa del procedimiento conforme a la invención consiste en tratar dicha solución de almidón con una enzima de ramificación. En la solicitud de patente EP 1 .369.432, la sociedad solicitante recomienda utilizar de 50.000 a 500.000 U de enzima de ramificación purificada para 100 g secos de almidón o de derivado de almidón, a una temperatura comprendida entre 25 y 95°C, de preferencia a una temperatura comprendida entre 70 y 95°C, durante una duración de 18 a 24 horas. Por enzimas de ramificación, se entienden las enzimas de ramificación elegidas en el grupo constituido por las enzimas de ramificación de glucógeno, las enzimas de ramificación de almidón y las mezclas de cualquiera de estas enzimas. Para la obtención de nuevos polímeros de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, la sociedad solicitante recomienda tratar preferentemente la solución de almidón rica en amilosa con 40.000 a 1 50.000 U de enzima de ramificación para 1 00 g de almidón, a una temperatura comprendida entre 25 y 80°C durante una duración de 7 a 24 horas, de preferencia entre 18 y 24 horas. La tercer etapa del procedimiento conforme a la invención consiste en tratar una ß-amilasa en la solución de almidón así tratada. Las condiciones de acción (temperatura y pH) de esta enzima se hacen reaccionar de 0.05 a 0.5 mi de ß-amilasa de tipo SPEZYME BBA de GENENCOR (a 1500 Dp ml) para 100 g de almidón a una temperatura de 60°C, un pH de 4.9 a 5, durante 1 a 3 horas, de preferencia durante 2 horas. La unidad DP° significa "Grado de energía diaestática", es decir, la cantidad de enzima contenida en 0.1 mi de una solución al 5% de la preparación de enzima que producirá una cantidad de azúcares de reducción suficiente para reducir 5 mi de solución madre de Fehling cuando la muestra se incuba con 100 mi de substrato durante 1 hora a 20°C. Contrariamente a lo que se describe en la solicitud de patente EP 1.369.432, no se utiliza entonces cualquiera de las enzimas elegidas del grupo constituido de a-amilasa, ß-amilasa, amiloglucosidadsa, e a-transglucosidasa, sino que emplea preferentemente ß-amilasa. La sociedad solicitante en efecto, ha encontrado que debido a la elección de esta enzima particular, es posible obtener fácilmente los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención. En el término de este tratamiento complementario, los polímeros de glucosa altamente ramificados solubles se obtienen en mezcla con sus productos de degradación enzimáticas, principalmente constituidos dé glucosa y de maltosa. La cuarta etapa del procedimiento consiste en efectuar un fraccionamiento con la ayuda de una técnica elegida en el grupo de separaciones en la membrana y cromatografías, a manera de recuperar las fracciones de alto peso molecular y las fracciones de bajo peso molecular, como se describe en la solicitud de patente EP 1.369.432 de la sociedad solicitante. Cualquiera que sea el método empleado, los perfiles obtenidos permiten la separación de la fracción de polisacárido de alto peso molecular correspondiente a los polímeros de glucosa altamente ramificados solubles conforme a la invención, fracciones de oligosacárido de bajo peso molecular, constituidas para lo esencial de glucosa y maltosa. La última etapa del procedimiento conforme a la invención consiste entonces en recolectar las fracciones de alto peso molecular correspondientes a los polímeros de glucosa altamente ramificados. Los productos de alto peso molecular pueden reunirse mientras como tales, precipitarse por etanol, purificarse y secarse al vacío durante 24 horas o aún atomizarse, por toda la técnica conocida por el experto en la materia. Como se ejemplificará a continuación, la sociedad solicitante ha encontrado al fin que para hacer variar el contenido de cadenas promedio ramificadas (DP comprendido entre 1 5 y 25) los polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención, falta variar el contenido de amilosa de almidón. En efecto, más el contenido de amilosa de almidón utilizado como substrato de partida se elevada, más el contenido de cadenas ramificadas de DP comprendido entre 15 y 25 de productos obtenidos es bajo. Se elige preferentemente un almidón del cual el contenido de amilosa se comprende entre al menos 30% y a lo más 40% para obtener la primer familia de polímeros conforme >a la invención, presentando al menos 14% a lo más 16% de DP comprendido entre 15 y 25. Los almidones en peso estándar convienen particularmente bien para la obtención de esta primer familia. Se elige preferentemente un almidón del cual el contenido de amilosa se comprende entre al menos 40% y a lo más 60% para obtener la segunda familia de polímeros conforme a la invención, que presentan al menos 12% a lo más 14% de DP comprendido entre 1 5 y Se elige en fin un almidón del cual el contenido de amilosa se comprende entre al menos 60% y a lo más 80% para obtener la segunda familia de polímeros conforme a la invención, presentando al menos 10% a lo más 12% de DP comprendido entre 1 5 y 25. Las características fisicoquímicas particulares de polímeros según la invención los destinan ventajosamente a las aplicaciones alimenticias y médicas y más particularmente aún como aportación de substratos energéticos cuando las actividades físicas y en los dominios de la diálisis peritoneal, la nutrición entérica o parenteral, los substitutos de plasma sanguíneo, la regulación de la digestión y la alimentación de diabéticos. Otras características y ventajas de la invención aparecerán con la lectura de ejemplos no limitativos descritos a continuación. Ejemplo 1 Se prepara una solución de almidón a 10% de materia seca a partir de almidón de peso que presenta una riqueza en almidón superior a 95% y un contenido de amilosa de 36.7%. Para esto, se colocan en suspensión 1 00 g secos de almidón de peso en un litro de agua a temperatura ambiente y bajo agitación. La solubilización total del almidón se realiza en una caldera a 145°C durante 3 a 4 minutos, después se enfría a 70QC. Se agrega continuamente la enzima de ramificación de glucógeno purificado de Bacillus stearothermophilus en razón de 1 mi de solución de enzima a 50.000 U/ml para 1 00 g secos de substrato. La reacción enzimática se cond uce durante 21 horas a 70°C y a pH 6.8 después se detiene por calentamiento a 90°C durante 1 h. El tratamiento complementario con 0.15 mi de ß-amilasa (BBA SPEZYME de GENENCOR a 1500 DP°/ml) para 100 g secos de almidón se efectúa en el medio reaccional precedentemente llevado a la temperatura de 60°C y a pH de 4.9 a 5. La incubación se realiza d urante 2 horas, y la reacción se detiene por calentamiento 1 h a 90°C. El medio de reacción se ultrafitra enseguida en la membrana con una sola cortadura de 9000 daltones (membrana ES209 de PCI), y el ultrafiltrado se recolecta y atomiza. La tabla 1 sig uiente presenta los resultados de las características fisicoq uímicas (tasa de enlaces a-1 ,6, Mw y contenido de azucares de red ucción) del polímero soluble de glucosa ramificado conforme a la invención así obtenido. Tabla 1
El porcentaje de azúcares de reducción se determina siguiendo el método de SOMOGOYI , descrito por N . NELSON en A photometrlc adaptation of the SOMOGOYI method for the determination of glucose, 1 944, J. Biol. Chem. , 153 , pp 375-380. El perfil de distribución de las longitudes de cadenas ramificadas se determina entonces como se ind ica a continuación. La tabla I I siguiente presenta los resultados obtenidos. Tabla I I
El polímero soluble de glucosa ramificado obtenido presenta una distribución remarcable de sus longitudes de cadenas ramificadas que se traduce por un poco más del 70% de cadenas cortas (D P inferior a 15) y un poco menos del 30% de cadenas promedio a long itudes (DP superior a 1 5). El valor del parámetro "a" de MARK HOUW I N K SAKURADA, determina por la metodología descrita anteriormente es de 0.1 . El polímero soluble de glucosa ramificado conforme a la invención presenta entonces una estructura compacta, doblada sobre ella misma, sin embargo aún con cadenas accesibles a ataques enzimáticos. Ejemplo 2 Se realiza un estud io comparativo de perfiles de distribución de longitudes de cadenas ramificadas de productos de la reacción por enzima de ramificación y ß-amilasa en los substratos que encierran los contenidos variables de amilosa. Se tratan entonces de la misma manera que se describe en el ejemplo 1 , del almidón de maíz ceroso (Almidón A), del almidón de maíz estándar (almidón B), y dos variedades de almidón rico en amilosa encerrando respectivamente 50 y 70% de almidón (Almidones D y E). Figuran igualmente en esta tabla los resultados obtenidos con el almidón de peso (almidón C) obtenido en el ejemplo 1 . La tabla II I siguiente presenta las cantidades de enzimas de ramificación (incubación de 1 8 a 21 horas) y ß-amilasa (tratamiento de 2 horas) utilizadas para el tratamiento de diferentes variantes de almidón. Tabla II I
La tabla IV presenta los resultados obtenidos en términos de tasa de ramificación a-1 ,6-, peso moleculares y contenidos de azúcares de reducción de polímeros de glucosa altamente ramificados así preparados. Los compuestos son productos identificados F, G. H, l y J, obtenidos respectivamente a partir de los almidones A, B, C, D y E. Las características del producto F se toman del ejemplo 1.
Tabla IV
Los tratamientos enzimáticos en los tres substratos ricos en amilosa (contenidos respectivos en amilosa de 37.5, 50 y 70%) permiten fabricar polímeros solubles de glucosa ramificados que presentan una tasa de ramificación a-1 ,6 en la gama estrecha de 13 a 15%, para un peso molecular comprendido entre 0.9 a 1 .5.105 daltones. El tratamiento de almidón de maíz ceroso y del almidón de maíz estándar, además descrito en la solicitud de patente EP 1.369.432, conduce a los polímeros de glucosa ramificados, que presentan una tasa de enlaces a-1 ,6, en la gama de 1 1 a 13% y un valor de peso molecular comprendido en la gamma de 0.7 a 0.9 105 daltones. La utilización de almidones ricos en amilosa como substrato de partida permite entonces, de manera remarcable, obtener los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados presentando tasas de enlaces glucosídicos -1 ,6 y pesos moleculares más elevados q ue aq uellos obtenidos a partir de substratos más ricos en amiiopectina , lo que es remarcable. La tabla V siguiente reúne los diferentes perfiles de distribución de las longitudes de cadenas de diferentes productos obtenidos. Figuran igualmente los valores de coeficiente "de viscosidad intrínseca "a" según MARK HOUWI NK SAKURADA. Tabla V
Se constata q ue los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados obtenidos a partir de almidones ricos en a'milosa, presentan de 70 a 85% de cadenas cortas, de 10 a 16% de cadenas promedio y de 8 a 13% de cadenas largas. Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados obtenidos a partir de almidones ricos en amiiopectina contienen menos de 72% de cadenas cortas, más del 16% de cadenas promedio y entre 1 1 y 15% de cadenas largas. Se constata ig ualmente q ue además el contenido de amilosa de almidones tratados es importante, además los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados obtenidos presentan un componente bajo de cadenas de tamaño promedio. Los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención presentan entonces sobre todo un contenido en cadenas promedio inferior a 16%, y de preferencia comprendido entre 10 y 16% (lo que no es el caso de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados preparados a partir de almidón de maíz estándar y almidón ceroso). Las mediciones del coeficiente de viscosidad intrínseca "a" según MA K HOUWIK SAKURADA traduce igualmente la diferencia en el grado de compacidad de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados obtenidos. Se constata que solo los almidones ricos en amilosa permiten obtener los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados que presentan un valor de coeficiente de viscosidad intrínseca inferior o igual a 0.1 . Además, se constata igualmente que es posible hacer variar el grado de compacidad de polímeros solubles de glucosa ramificados conforme a la invención al hacer variar el contenido en amilosa de los almidones utilizados como substratos de reacciones enzimáticas. En consecuencia, las estructuras más compactas se obtienen a partir de almidones más ricos en amilosa. Ejemplo 3 Para determinar el grado de liberación de glucosa, se preparan las soluciones acuosas de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención, que se emplea en contacto con una amilasa de origen pancreático y de amiiogiucosidasa intestinal (polvo acetónico del intestino). La hidrólisis se sigue en el tiempo por la medición de glucosa que aparece en el curso del tiempo en el medio reaccional. Esta prueba permite evaluar la resistencia de polímeros a la hidrólisis por las enzimas implicadas en la digestión de glúcidos alimenticios. Dos polímeros conforme a la invención (los productos H e
I del ejemplo 2) se prueban en comparación con los polímeros de glucosa obtenidos a partir de almidón estándar (el producto G del ejemplo 2) del cual el análisis se ha hecho en la solicitud de patente EP 1.369.432 de la sociedad solicitante, en comparación con glucógeno. Las condiciones operativas para la digestión enzimática son las siguientes: Se pesan precisamente 0.6 g del producto a probar. Se agregan 150 mi de tampón de maleato de sodio 0.1 mol/l a pH 7 y se agita hasta la disolución del producto. Se coloca la solución obtenida a baño maría durante 15 minutos, para que la temperatura de la solución sea de 37°C. Se toman 1 .5 mi de la solución, agregan 0.15 g de pancreatina de puerco e incuban durante 30 min. Se detiene la reacción enzimática al colocar las tomas en un baño seco a 1 00°C, durante 10 minutos. Se agregan 0.75 g de pancreatina de puerco e incuban durante 3 h 30 a 37°C bajo baño termofijo y bajo agitación. Las tomas se realizan regularmente en el curso de la hidrólisis enzimática. Se dosifica entonces la glucosa de las tomas para calcular ei porcentaje de hidrólisis del producto estudiado. Esta dosificación se realiza con la ayuda de un método colorimétrico en un H ITACHI 704 automático (ROCHE). El reactivo utilizado es un reactivo que contiene las enzimas de glucosa oxidasa/peroxidasa (GOD/PAP). El volumen de reactivo utilizado es de 500 µ?, el volumen de la muestra es de 5 µ? y la temperatura de reacción es de 30°C. Los resultados se presentan en la tabla VI siguiente. Tabla VI
Se consta que entre 30 y 60 minutos de reacción, los polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención (productos H e I) preparados respectivamente a partir de almidón estándar de peso y de almidón conteniendo 50% de amilosa, liberan menos rápidamente su glucosa que los polímeros de glucosa (producto G) preparado a partir de almidón de maíz estándar. Sin embargo, este fenómeno se invierte entre 60 y 120 minutos, el producto H liberando más la glucosa que el producto G. Aparecerá claramente que los dos polímeros solubles de glucosa altamente ramificados H e I conforme a la invención, preparados a partir de almidón rico en amilosa, pueden emplearse también en nutrición para deportes (el producto Liberando después de dos horas de digestión 63% de glucosa con un efecto retardado), pero igualmente en las aplicaciones en donde es necesario regular la glicemia (el producto I liberando en el curso del tiempo una cantidad más baja de glucosa que los otros productos). Se consta que la elección del contenido de amilosa del almidón de partida condiciona la utilización de polímeros solubles de glucosa altamente ramificados conforme a la invención en los dominios de aplicación bien definidos.