NO333059B1 - Hoyt opploselige forgrenede glukosepolymerer - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen angår oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer, som har et reduserende sukkerinnhold på mindre enn 1 %, et nivå av (-1,6 glukosid bindinger mellom 13 og 17 % og en Mw som har en verdi mellom 0,9 x 105 og 1,5 x 105 dalton, kjennetegnet ved at deres forgrenede kjedelengde fordelingsprofil består av 70 til 85 % av DP som er lavere enn 15, av 10 til 16 % av DP som er mellom 15 og 25 og av 8 til 13 % av DP som er høyere enn 25.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerer med et lavt reduserende sukkerinnhold, et bemerkelsesverdig høyt nivå av a-1,6 glukosidbindinger, et smalt område med høye molekylvekter, og en meget spesiell forgrenet kjedelengde fordelingsprofil.

Oppfinnelsen vedrører også oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerer med en lav iboende viskositet.

Oppfinnelsen gjør disse oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerene spesielt bestemt for matvare og spesielt medisinske, anvendelser.

Uttrykket "forgrenet kjedelengde fordelingsprofil" er ment å bety, i oppfinnelsens hensikt, størrelsesfordelingen uttrykt som grad av polymerisasjon (eller DP), til de lineære a-1,4 glukosidkjedene forbundet med andre lineære a-1,4 glukosidkjeder med a-1,6 forgreningspunkter.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av nevnte oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerer.

Glukosepolymerene som er industrielt tilgjengelige blir konvensjonelt fremstilt ved hydrolyse av naturlige hybrid stivelser og av deres derivater.

Standard stivelseshydrolysater blir derved produsert ved syre eller enzymatisk hydrolyse av stivelse fra cerealer eller rotfrukter. De er faktisk en blanding av glukose og glukosepolymerer med ekstremt varierte molekylvekter.

Disse stivelseshydrolysatene (dekstriner, maltodekstriner og lignende) som blir produsert i industrien (med en viss midlere DP) består av en bred fordeling av sakkarider som inneholder både lineære og forgrenede strukturer.

Stivelseshydrolysater, og særlig maltodekstriner, blir mer spesielt brukt som transportører eller fyllstoffer, teksturmidler, spray-tørkende bærere, filmdannende midler, fryseregulatorer og antikrystallisasjonsmidler.

De kan også bli brukt som fettsubstitutter eller for deres ernæringsmessige kilde.

På et innvollsmessig nivå, blir stivelseshydrolysater derved spaltet ved pankreatisk a-amylase som virker direkte på de lineære kjedene forbundet i a-1,4.

Denne målrettede enzymatiske spaltingen fører til at størrelsen på stivelseshydrolysatene blir redusert til begrensede dekstriner, og deretter vil et antall enzymer bundet til tarm mukosamembranen (maltase, sukrase og a-dekstrinase) fortsette med hydrolyse av de lineære sakkaridene og resterende forgrenede sakkaridene til glukose enheter.

Kinetikken til de forskjellige enzymatiske spaltingene er da direkte avhengig av strukturen til stivelseshydrolysatene.

Pankreatisk a-amylase vil for eksempel reagere mye lettere på stivelseshydrolysater som er rike på lineære oligosakkarider eller som har langkjedete forgrenede strukturer, mens den vil reagere med større vanskelighet eller ikke i det hele tatt, på kompakte strukturer som har overveiende korte kjeder.

Med den kjente teknikken blir disse to strukturtypene generelt anvendt forskjellig, i henhold til de tilsiktede anvendelsesområdene.

Den første strukturtypen som er avledet fra stivelse (særlig den av oligosakkarider med en kort DP) blir anvendt som kilde for glukose som kan bli direkte assimilert av kroppen, særlig innen tre anvendelsesområder.

Det første anvendelsesområdet er som høy-energi substrater for sportsutøvere.

I virkeligheten bør en sportsdrikk som blir konsumert under fysisk aktivitet som krever stor anstrengelse, umiddelbart skaffe til veie både energien og vannet som er nødvendig for å kompensere for tap av fluid ved perspirasjon.

Resultatet er at en sammensetning som er balansert med hensyn på karbohydrater er av vesentlig betydning for å oppnå et slikt resultat.

En oppløsning som vanligvis blir foreslått for den optimale drikken er å fremstille korte lineære oligosakkarider med en DP fra 3 til 6 som har mer kompakt forgrenede glukosid strukturer, siden disse korte oligosakkaridene blir absorbert ved høyeste hastighet, mens de bibeholder osmolaliteten ved et moderat nivå, og forhindrer på den måten tap av fluid og sideeffekter som diaré og kramper.

Det andre anvendelsesområdet er parenteral ernæring, der næringsoppløsninger som blir avlevert i den venøse veien blir utformet for å holde en pasient ved god helse og å skaffe til veie næringsstoffer når de ikke kan bli foret via sitt normale fordøyelsessystem.

Valget blir gjort her også for å administrere lineære oligosakkarider med en DP på mellom 2 og 5 fordi disse sakkaridene blir hydrolysert av maltaser i nyrene, og frigjør på denne måten glukose som deretter blir absorbert på nytt. Anvendelse av korte lineære oligosakkarider gjør det således mulig og skaffe til veie tilstrekkelig energi i en isoton oppløsning, uten å overhydratisere pasienten.

Det tredje anvendelsesfeltet er enteral ernæring, der det er nødvendig å skaffe til veie drikker som enten kan bli inntatt oralt eller administrert den tubulære veien inn i magen eller tynntarmen.

For disse enterale fluidene, er hovedproblemet imidlertid diaré, på grunn av en svært høy osmolalitet.

Den andre typen av strukturer som er avledet fra stivelse, det vil si stivelse hydrolysat derivater som har kompakt forgrenede strukturer med korte kjeder, blir anvendt for å senke frigjøring av assimilerbar glukose og/eller å skaffe til veie en grad av osmolalitet, særlig innen tre anvendelsesområder.

Det første anvendelsesområdet er feltet med kontinuerlig og ambulatorisk peritoneal dialyse.

Patent EP 207,676 beskriver at for anvendelse i dialyse, vil stivelse hydrolysater som inneholder forgrenede strukturer som danner klare og fargeløse oppløsninger ved 10 % i vann, hvilke har en molekylvekt (Mw) på 5 x 10<3>til 106 dalton og en lav polydispersitetsverdi eller Vp, være foretrukket til lineære oligosakkarider med en kort DP.

Dette resulterer i sammensetninger som hovedsakelig inneholder glukose polymerer med høy molekylvekt mellom 5 x 10<3>og 5 x 10<5>dalton, og som ikke inneholder eller som inneholder meget lite glukose eller oligosakkarider med en DP som er mindre enn eller lik 3, og ingen eller meget lite glukose polymerer med en Mw som er høyere enn 10<6>dalton.

Det kan faktisk bli lett forstått når det gjelder denne søknaden i peritoneal dialyse at oligosakkarider med en kort DP og med lav molekylvekt raskt krysser den peritoneale veggen og er således ingen vedvarende fordel for skapelse av en osmotisk trykkgradient, og at polymerer med meget høy molekylvekt, som ikke har noe osmotisk kraft, bør unngås og bør til og med bli forbudt siden de er potensielt farlige dersom det skjer at de utfelles etter sin tilbakegang.

I patentet EP 667,356 foreslår søkerfirmaet en fremgangsmåte for fremstilling, fra voksholdig stivelse, et stivelseshydrolysat som er fullstendig oppløselig i vann og som har en lav polydispersitetsverdi som er mindre enn 2,8 og en MW som er mellom 5 x 10<3>og 1 x 10<6>dalton. Denne fremgangsmåten består av hydrolysering ved en syrevei, av en stivelsesmelk som utelukkende består av amylopektin, og deretter supplering av denne syrehydrolysen med en enzymatisk hydrolyse ved anvendelse av en bakteriell a-amylase, og kromatografering av det oppnådde hydrolysatet på makroporøse sterke kationiske resiner i alkali eller jord-alkali metall form.

Det skal bemerkes at for tiden anbefaler søkerfimaet at man bare anvender stivelser som nesten utelukkende består av amylopektin og som vanligvis blir kalt voksholdige stivelser som råmaterialer i nevnte metode, idet stivelsene som inneholder en ikke-neglisjerbar andel av amylose er ikke egnede.

Det andre feltet for søknaden er ved regulering av fordøyelse eller diett hos diabetikere.

Det har forresten blitt foreslått i patent US 4,840,807 eller i patentsøknad JP 2001/11101 (registeringsnr. 11/187,708), å bare ekstrahere områder med tette a-1,6 bindinger som kilde for langsomt absorberte karbohydrater, siden a-1,6 bindinger er mer vanskelig å degradere enn a-1,4 bindinger.

To familier med produkter har således blitt utviklet. Den første involverer de begrensede dekstrinene fremstilt ved degradering av områder med a-1,4 bindinger med en a-amylase alene, og den andre familien angår dekstrinene fremstilt ved degradering av områder med a-1,4 bindinger ved samtidig virkning av en a-amylase og en p-amylase.

Disse begrensede dekstrinene som er oppnådd er spesielt resistente mot humane spaltningsenzymer.

Disse forbindelsene har imidlertid den ulempen at de har en meget lav molekylvekt (mellom 10 000 og 55 000 dalton), hvilket begrenser anvendelsen av disse innen andre felt.

Det tredje anvendelsesfeltet er i forbindelse med blod plasma substitutter.

Internasjonal patentsøknad WO 03/18639 anbefaler faktisk utvikling, ene og alene fra amylopektin, av hyperforgrenede forbindelser for å anvende dem i kirurgisk eller terapeutisk behandling av pattedyr eller i diagnostiske fremgangsmåter.

1 følge beskrivelsen i denne patentsøknaden, og mer spesifikt innen feltet med blodplasma substitutter, blir disse hyperforgrenede amylopektinene presentert som å være nødvendig for å gjøre det mulig å løse hovedulempen til de første blod plasma substituttene som er fremstilt -

disse er hydroksyetylstivelser eller HES - det vil si deres utilstrekkelige metabolisme i kroppen.

I denne patentsøknaden blir den relative stabiliteten til nevnte hyperforgrenede amylopektiner nevnt i forhold til deres høye innhold av a-1,6 bindinger.

Dette høye innhold av a-1,6 bindinger er antatt å gjøre det mulig i tilstrekkelig betydelig grad å redusere degraderingen av amylopektin med a-amylase og å fremstille et polysakkarid som er degraderbart, men som fremdeles innehar egenskapene til en ideell blod plasma substitutt, nemlig dens farmakokinetiske egenskaper og dens volum effekt.

Videre blir mulighet for variasjon av fordelingen av forgreningspunktene også betraktet i denne patentsøknad WO 03/018639 for kontrollering av kinetikken til degraderingen av hyperforgrenet amylopektin i den ønskede retningen.

Fremstillingen avdisse hyperforgrenede amylopektinene har fremdeles en stor ulempe.

Fordi en omfattende høy forgrening (opp til 25 % av a-1,6 bindinger) eller en svært kort avstand mellom forgreningspunktene, er den oppnådde effekten diametralt motsatt av det som er ønskelig fordi angrep av a-amylase på disse hyperforgrenede amylopektinene kan bli betraktelig senket eller ikke vil forekomme i det hele tatt.

Sterisk hindring er, i områdene på molekylet der tettheten på forgreningspunktene er høy, slik at tilgang for a-amylase ikke lenger er mulig.

Under disse betingelsene, vil fravær av enzymatisk spaltbarhet av disse hyperforgrenede amylopektinene ikke spesielt begunstige anvendelse av slike strukturer som blod plasma substitutter (akkumulering av ikke-nedbrutte produkter).

Fra den foregående teksten er det åpenbart at det eksisterer et utilfredsstilt behov for å ha høyt forgrenede glukose polymerer som utviser bemerkelsesverdige strukturelle egenskaper med hensyn på forgrenet kjedelengde fordeling og indre viskositet og som dermed gir produktene som inneholder dem, evner som holdbarhetstid og kontrollert spaltbarhet.

Disse egenskapene vil dermed tillate anvendelse av disse høyt forgrenede glukose polymerene innen så varierte anvendelsesfelt som tilførsel av høy-energi substrater under fysiske aktiviteter og innen feltene med peritoneal dialyse, enteral eller parenteral ernæring, blod plasma erstatninger, fordøyelsesregulering og diett til diabetikere.

Søkerfirmaet har hatt gjort seg fortjent til å avstemme alle disse målene som inntil nå har vært ansett å være vanskelig å avstemme, ved oppfinning og fremstilling, med basis i tallrike forskningsstudier, av nye oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer som er ganske spesielle når det gjelder deres forgrenede kjedelengde fordeling og deres iboende viskositet.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen er glukose polymerer som har et reduserende sukker innhold som er mindre enn 1 %, et nivå av a-1,6 glukosid bindinger på mellom 13 og 17 % og en Mw som har en verdi mellom 0,9 x 10<5>og 1,5 x 10<5>dalton, kjennetegnet ved at deres forgrenede kjedelengde fordelingsprofil består av 70 til 85 % av DP som er mindre enn 15, av 10 til 16 % av DP som er mellom 15 og 25 og av 8 til 13 % av DP som er høyere enn 25.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen har fortrinnsvis en iboende koeffisient av viskositet "a" i følge MARK, HOUWINK og SAKURADA likningen som er mindre enn eller lik 0,1.

Søkerfirmaet har allerede beskrevet i sin patentsøknad EP 1,369,432 oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer som har et reduserende sukker innhold som er lavere enn 1 %, et nivå med a-1,6 bindinger mellom 12 og 30 % og en Mw som har en verdi på mellom 0,35 til 2 x 10<5>dalton.

Ingen av glukose polymerene som er beskrevet og eksemplifisert i nevnte patentsøknad har imidlertid den forgrenede kjedelengde fordelingsprofilen og den iboende viskositeten til høyt forgrenede glukose polymerene i henhold til oppfinnelsen, slik det vil bli eksemplifisert i det etterfølgende.

Bestemmelsen av den reduserende effekten, av nivået til a-1,6 glukosid bindinger og av molekylmasser til de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen blir gjennomført under samme betingelser som de som er beskrevet i patentsøknad EP 1,369,432.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen har således et reduserende sukker innhold som er lavere enn 1 %, et nivå av a-1,6 glukosid bindinger på mellom 13 og 17 % og en Mw som har en verdi mellom 0,9 x 105 og 1,5 x 10<5>dalton.

Sammenliknet med de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i patentsøknad EP 1,369,432 til søkerfirmaet, har de nye glukose polymerene i følge foreliggende oppfinnelse smalere spektra av nivåer med a-1,6 glukosid bindinger og av molekylvekt.

Imidlertid er de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen særlig kjennetegnet ved deres kjedelengde fordelingsprofil.

Bestemmelsen av lengde på de forgrenede kjedene til de oppløselige høyt forgrenede glukose

polymerene i følge oppfinnelsen blir gjennomført i to trinn.

Et første trinn består i avgrening av nevnte produkter (spesifikk hydrolyse av a-1,6 binding) ved hjelp av en bakteriell isoamylase, etterfulgt av et andre trinn for identifisering av graden av polymerisasjon av oligosakkaridene frigjort ved sterisk utelukkelseskromatografi (HPSEC) sammenliknet med pullulaner av kjent størrelse.

Denne teknikken består i oppveiing av 50 mg av produkter som skal bli analysert og tilsetning til dette 3,75 ml vann. Etter omrøring av denne blandingen, blir 0,5 ml DiMetylSulfOksid (DMSO) tilsatt og blandingen blir oppvarmet ved koketemperatur, under omrøring, i 30 minutter. Temperaturen blir deretter redusert til 45 °C og 0,25 ml

1 M natrium acetat buffer oppløsning (på forhånd brakt til pH 3,5 med eddiksyre) blir tilsatt.

10 pl av en isoamylase ekstrahert fra Pseudomonas amyloderasoma, markedsført av HAYASHIBARA, blir deretter tilsatt (i en mengde på 59 000 U/mg) og får anledning til å virke ved 45 °C i 1 time. Denne enzymatiske behandlingen blir gjennomført to ganger etter hverandre, og deretter blir reaksjonen stoppet ved koking i 3 minutter.

Etter tilsetning av 0,5 ml n-butanol, omrøring og lagring ved romtemperatur uten omrøring i 1 time, blir reaksjonsmediet deretter sentrifugert ved 2600 rpm i 20 minutter, og supernatanten blir demineralisert ved hjelp av Amberlite 200 og Amberlite IRA-67 markedsført henholdsvis av firmaene FLUKA og SIGMA.

En endelig omrøring og filtrering på et nylon filter med porøsitet 0,45 pm blir utført før injeksjon på HPSEC kolonnen.

Parametrene for HPSEC kromatografi er som følger (på PWXL oligo kolonne markedsført av TSK og på SB 802 + 803 + 804 + 805 kolonner markedsført av SHODEX):

- Injeksjonsvolum: 200 ul

- Strømningshastighet: 0,5 ml/min

- Kolonnetemperatur: 40 °C

- Elueringsmiddel: 0,2 M natrium nitrat + 0,02 % Na azid

-Varighet på eluering: 180 minutter

Størrelsen på oligosakkaridene som blir frigjort blir bestemt av deres elueringstid relativt til elueringstiden for pullulaner av kjent størrelse.

De høyt forgrenede glukosepolymerene i følge oppfinnelsen har således en forgrenet kjedelengde fordelingsprofil bestående av:

av 70 til 85 % med en DP som er mindre 15,

av 10 til 16 % med en DP som er mellom 15 og 25,

av 8 til 13 % med en DP som er høyere enn 25.

Denne forgrenede kjedelengde fordelingsprofilen leder til strukturer som er bemerkelsesverdige med hensyn på sitt høye innhold av korte forgrenede kjeder (70 til 85 % med en DP på mindre enn 15) og deres relativt høye innhold av medium størrelse til lange forgrenede kjeder (15 til 30 % med en DP høyere enn 15).

Som et resultat er de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen rike på kjeder med hovedsakelig kort DP (mer enn 70 % med en DP på mindre enn 15), hvilket gjør det mulig å oppnå en kompakt forgrenet struktur som hovedsakelig inneholder korte kjeder, og som ikke desto mindre fremdeles inneholder tilstrekkelige medium størrelse til lange kjeder (opp til 30 %), hvilket pankreatisk a-amylaser lett kan spalte for å frigjøre glukose som kan bli assimilert i kroppen.

De høyt oppløselige forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen er også kjennetegnet ved verdien til deres koeffisient for iboende viskositet "a" i henhold til MARK, HOUWINK og SAKURADA likningen.

Måling av koeffisienten for iboende viskositet "a" i henhold til MARK, HOUWINK og SAKURADA likningen blir av søkerfirmaet brukt til å illustrere grad av kompakthet til de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen

Det er kjent for en person med kunnskap innen fagområdet at MARK, HOUWINK and SAKURADA empiriske formel som er relatert til iboende viskositet (n) av en polymer til sin viskosimetriske gjennomsnittlige molekylmasse (eller Mv) er gitt ved følgende likning:

t|=K x (Mv)<a>

der "K" og "a" er konstanter som avhenger av egenskapene til polymeren som studeres, på egenskapene til oppløsningsmidlet og temperaturen.

Under de analytiske betingelsene i følge oppfinnelsen, er oppløsningsmidlet som benyttes av søkerfirmaet en 0,2 M vandig nitrat oppløsning.

Konstanten "a" er mer spesifikt relatert til gjennomsnittlig hydrodynamisk volum som okkuperes av polymeren i oppløsningen som betraktes.

Det er etablert som kjent teknikk innen fagområdet at for en polymer i oppløsning, dess mer molekylet er foldet opp selv, dess lavere er verdien til "a". Omvendt vil for et "betydelig åpent" molekyl, verdien til "a" være høyere.

Målingen av koeffisienten "a" i henhold til MARK, HOUWINK og SAKURADA formelen blir bestemt ved hjelp av følgende likning

Kurven Log r\blir plottet som en funksjon av Log (Mv) hvis y-akse ved startpunktet skaffer til veie Log K og helningen til linjen er koeffisienten "a".

Viskositet og viskosimetrisk gjennomsnittlig molekylær masse verdier for de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen blir bestemt på et VISCOTEX kapillært viskometer (modell 250) koblet til et R410 refraktometer, etter separasjon på SHODEX SB 802 + 803 + 805 kolonner.

De kromatografiske driftsbetingelsene er de følgende:

- Injeksjon: 100 ul

- Strømningshastighet: 0,5 ml/min

- Kolonnetemperatur: 35 °C

- Elueringsmiddel: 0,2 M natrium nitrat og 0,02 % natrium azid

-Analytisktid: 180 min

Driftsbetingelsene for refraktometrisk deteksjon er:

- Sensitivitet R410:16 X

- Temperatur på viskometer: 35 °C

Strømningshastighet markøren er en glyserin oppløsning ved 5 % i elueringsmidlet.

Kalibrering av detektoren blir gjennomført ved hjelp av en PolyEtylen Oksid markedsført av firmaet VISCOTEX, med kjent molekylvekt, konsentrasjon og indre viskositet.

Gjenbehandling av denne referansen gjør det mulig å beregne "massekonstanten" og "viskositetskonstanten" til viskometeret.

Gjenbehandlingen av elueringstoppen for strømhastighetsmarkørene gjør det mulig å beregne referansetiden og interdetektor volumene.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen har således en koeffisient "a" beregnet i henhold til MARK, HOUWINK og SAKURADA formelen som er mindre enn 0,1, hvilket indikerer en tilstand med høy kompakthet, mye høyere enn amylopektin (standard amylopektin, under samme målebetingelser har i virkeligheten en koeffisient "a" verdi på 0,33)

De høyt forgrenede glukosepolymerene som blir oppnådd på denne måten er derfor spesielt velegnet til å brukes innen anvendelsesområder der det er nødvendig å ha kompakte og tette strukturer, for eksempel i peritoneal dialyse eller i dietten til diabetikere.

Bestemmelsen av resistens til de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge foreliggende oppfinnelse mot enzymene som er involvert i spalting av diett karbohydrater er også et essensielt kriterium for valg av matingrediens som kommer i sammensetningen av formuleringer som brukes av idrettsutøvere eller som er beregnet for eksempel for enteral og parenteral ernæring.

Søkerfirmaet har estimert prosentdel eller frigjøring av glukose ved enzymatisk spalting av de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene som er beskrevet i patentsøknad EP 1,369,432 til en verdi på mellom 50 og 70 %.

Denne resistensen mot hydrolyse er betydelig høyere enn konvensjonelle maltodekstriner og sammenliknbar med glykogen.

Slik det vil bli eksemplifisert i det etterfølgende vil de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen til slutt frigjøre glukose i andeler lik de som er beskrevet i nevnte patent EP 1,369,432, hvilket fremdeles gjør dem egnet for anvendelse av idrettsutøvere eller for enteral og parenteral ernæring, men denne frigjøringen av glukose finner sted mye langsommere over tid, hvilket gjør dem fordelaktig beregnet for anvendelsesområder som krever regulering av glykemia slik som diett for diabetikere.

Ingen oppløselige forgrenede glukose polymerer eksisterer, så langt søkerfirmaet kjenner til, som innehar en slik fordeling av sine forgrenede kjede lengder som gjør det mulig å bruke dem innen alle anvendelsesområder som foreliggende oppfinnelse er rettet mot.

Det er foretrukket at de høyt forgrenede glukose polymerene i følge foreliggende oppfinnelse kan bli klassifisert i tre underfamilier.

De tre underfamiliene har en forgrenet kjedelengde fordelingsprofil som atskiller seg i deres innhold av medium kjeder med en DP på mellom 15 og 25.

Den første underfamilien dekker høyt forgrenede polymerer som har minst 14 % til for det meste 16 % med en DP mellom 15 og 25.

Den andre underfamilien dekker høyt forgrenede polymerer som har minst 12 % til for det meste 14 % med en DP mellom 15 og 25.

Den tredje underfamilien dekker høyt forgrenede polymerer som har minst 10 % til for det meste 12 % med en DP mellom 15 og 25.

Denne variabiliteten i fordeling av medium størrelse kjeder tillater fordelaktig anvendelse av disse underfamiliene i mat eller medisinske anvendelser der det er nødvendig å variere spaltbarheten til de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene som blir anvendt.

Disse tre underfamiliene har i virkeligheten en forgrenet struktur som består av kjeder som hovedsakelig er korte i størrelse, men der de variable andelene av medium kjeder gjør det mulig å modulere ikke bare grad av kompakthet, men også å kontrollere frigjøring av glukose, slik det vil bli eksemplifisert i det etterfølgende.

For å fremstille de oppløselige forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen, blir følgende trinn gjennomført i rekkefølge og består av: 1) fremstilling av en vandig stivelsesoppløsning som har et amylose innhold på minst 30 vekt - %, fortrinnsvis mellom 35 og 80 vekt -%, 2) behandling av nevnte oppløsning med et forgreningsenzym og deretter med en p-amylase i rekkefølge,

3) gjennomføring av en fraksjonering for å gjenvinne høy molekyl fraksjonene,

4) oppsamling av de høyt forgrenede glukose polymerene som blir oppnådd slik.

Fremstilling av de høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen blir gjennomført ved modifisering av driftsbetingelsene som allerede er beskrevet i patentsøknad EP 1,269,432 til søkerfirmaet.

Først og fremst, i motsetning til hva som er beskrevet i patentsøknad 1,369,432, er valg av en spesiell stivelseskvalitet av stor viktighet.

Søkerfirmaet har faktisk funnet at bare stivelser hvis amyloseinnhold overskrider 30 % kan tjene som råmateriale i fremgangsmåten i oppfinnelsen

Maltodekstriner, standard stivelser (som ikke inneholder mer enn 30 % av amylose) eller voks-type stivelser, uavhengig av deres botaniske opprinnelse, er absolutt ikke egnet for fremstilling av oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge oppfinnelsen.

Det er til søkerfirmaets anerkjennelse å ha overvunnet en teknisk fordom i henhold til denne for å oppnå en forgrenet struktur som er stabil, kompakt og har en kontrollert spaltbarhet, er det nødvendig å starte med stivelser som er rike på amylopektin (som patentsøknad WO 03/018639 beskriver).

Slik det vil bli eksemplifisert i det etterfølgende har søkerfirmaet funnet at i motsetning til at det er antatt at valget av stivelser som er rik på amylose som blir anvendt som utgangssubstrater at det er mulig å oppnå oppløselige høyt forgrenete glukose polymerer i følge oppfinnelsen.

Det er også antatt at valget av amyloseinnhold i stivelsene som blir anvendt som utgangsmaterialer at det er mulig å oppnå de tre underfamiliene som er definert over.

Det andre trinnet i fremgangsmåten i følge oppfinnelsen består i behandling av nevnte stivelsesoppløsning med etforgreningsenzym.

I patentsøknad EP 1,369,432 anbefaler søkerfirmaet bruk av 50 000 til 500 000 U av renset forgreningsenzym per 100 g på en tørr basis av stivelse eller stivelsederivat, ved en temperatur mellom 25 og 95 °C, fortrinnsvis mellom 70 og 95 °C, i en periode på 18 til 24 timer.

Uttrykket forgreningsenzymer er underforstått å bety forgrenede enzymer valgt fra gruppen som består av glykogen forgrenede enzymer, stivelse forgrenede enzymer og en hvilken som helst gruppe av disse enzymene.

For fremstilling av nye høyt forgrenede glukose polymerer i følge oppfinnelsen, anbefaler søkerfirmaet fortrinnsvis behandling av oppløsningen med stivelse som er rik på amylose med 40 000 til 150 000 U med forgreningsemzym per 100 g stivelse, ved en temperatur mellom 25 til

80 °C i en periode fra 7 til 24 timer, fortrinnsvis mellom 18 og 24 timer.

Det tredje trinnet i fremgangsmåten i følge oppfinnelsen består i å sørge for at en P-amylase virker på stivelsesoppløsningen som blir behandlet.

Reaksjonsbetingelsene (temperatur og pH) for dette enzymet er for å sørge for virkningen av 0,05 til 0,5 ml p-amylase med SPEZYME BBA type fra GENENCOR (ved 1500 DP7ml) per 100 g stivelse ved en temperatur på 60°C, en pH fra 4,9 til 5, i 1 til 3 timer, fortrinnsvis i 2 timer.

En DP° enhet innebærer "Degrees of Diastatic Power" ("Grad av diastatisk evne"), det vil si mengden av enzym inneholdt i 0,1 ml av en oppløsning inneholdende 5 % av enzym preparatet som vil produsere en mengde av reduserende sukkere som er tilstrekkelig til å redusere 5 ml Fehlings oppløsning når prøven blir inkubert med 100 ml substrat i 1 time ved 20 °C.

I motsetning til hva som er beskrevet i patentsøknad EP 1,369,432, blir det derfor ikke gjort bruk av noen enzymer som blir valgt fra gruppen bestående av a-amylase, p-amylase, amyloglukosidase and a-transglukosidase, men faktisk foretrekkes det å anvende p-amylase.

Søkerfirmaet har i virkeligheten funnet at det var gjennom valg av dette spesielle enzymet at det er mulig på enkel måte å oppnå oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerer i følge oppfinnelsen.

Etter denne tilleggsbehandlingen, blir de oppøselige høyt forgrenede glukose polymerene oppnådd som en blanding av sine produkter fra enzymatisk degradering, hovedsakelig bestående av glukose og maltose.

Det fjerde trinnet i fremgangsmåten består i gjennomføring av en fraksjonering ved hjelp av en teknikk som blir valgt fra gruppen som omfatter membran separasjoner og kromatografier, for å utvinne høy molekylvektsfraksjoner og lav molekylvektsfraksjoner, som beskrevet i patentsøknad EP 1,369,432 til søkerfirmaet.

Uavhengig av fremgangsmåten som bli benyttet, tillater de oppnådde profilene separasjon av høy molekylvekt polysakkaridfraksjonen som tilsvarer de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen, fra lav molekylvekt oligosakkarid fraksjonene som hovedsakelig består av glukose og maltose.

Det siste trinnet i fremgangsmåten i følge oppfinnelsen består derfor i oppsamling av høy molekylvektsfraksjonene som tilsvarer de høyt forgrenede glukose polymerene.

Høy molekylvektsproduktene kan bli oppsamlet slik de er, utfelt med etanol, renset og tørket under vakuum i 24 timer eller spray-tørket, ved en hvilken som helst teknikk som er kjent for

personer med kunnskap innen fagområdet.

Slik det vil bli eksemplifisert i det etterfølgende, har søkerfirmaet endelig funnet at å variere innholdet av forgrenede medium kjeder (DP mellom 15 og 25) av de oppløselige forgrenede glukosepolymerene i følge oppfinnelsen, er det nødvendig å variere amyloseinnholdet i stivelsen.

Dess høyere amyloseinnholdet i stivelsen som blir anvendt som utgangsmateriale, dess lavere er innholdet av forgrenede kjeder med en DP på mellom 15 og 25 av de oppnådde produktene.

En stivelse vil fortrinnsvis bli valgt hvis amyloseinnhold er mellom minst 30 % og for det meste 40 % for å oppnå den første familien av polymerer i følge oppfinnelsen, som har minst 14 % til det meste 16 % med en DP mellom 15 og 25. Standard stivelser fra ert er spesielt velegnet for fremstilling av den første familien.

En stivelse vil fortrinnsvis bli valgt hvis amyloseinnhold er mellom minst 40 % og for det meste 60 % for å oppnå den andre familien av polymerer i følge oppfinnelsen, som har minst 12 % til for det meste 14 % med en DP mellom 15 og 25.

En stivelse vil endelig bli valgt hvis amyloseinnhold er mellom minst 60 % og for det meste 80 % for å oppnå den andre familien av polymerer i følge oppfinnelsen, som har minst 10 % til for det meste 12 % med en DP mellom 15 og 25.

De spesielle fysiokjemiske egenskapene til polymerene i følge oppfinnelsen gjør dem fordelaktig bestemt for mat og medisinske anvendelser og enda mer spesielt som en kilde til høy-energi substrater under fysisk aktivitet og innenfor feltet med peritoneal dialyse, enteral eller parenteral ernæring, blod plasma substitutter, regulering av fordøyelse og diett for diabetikere.

Andre egenskaper og fordeler med oppfinnelsen vil fremkomme ved gjennomgang av de ikke-begrensende eksemplene som er beskrevet t det etterfølgende.

Eksempel 1

En stivelse oppløsning ved 10 % tørrstoff innhold blir fremstilt fra en ertestivelse som har en stivelsesrikhet som er høyere enn 95 % og et amyloseinnhold på 36,7 %

For dette blir 100 g med ertestivelse på en tørr basis suspendert på nytt i en liter vann ved romtemperatur og under omrøring.

Fullstendig oppløseliggjøring av stivelsen blir oppnådd i en koker ved 145 °C i 3 til 4 minutter, etterfulgt av avkjøling til 70 °C. Glykogen forgreningsenzym renset fra Bacillus stearothermophilus blir kontinuerlig tilsatt i en mengde av 1 ml enzym oppløsning ved 50 000 U/ml per 100 g substrat på tørr basis.

Den enzymatiske reaksjonen blir gjennomført i 21 timer ved 70 °C og ved pH 6,8 og deretter stoppet ved oppvarming til 90 °C i 1 time.

Ytterligere behandling med 0,15 ml med p-amylase (BBA SPE ZYME fra GENENCOR ved 1500 DP7ml) per 100 g stivelse på en tørr basis blir gjennomført i foregående reaksjonsmedium brakt til temperaturen 60 °C og til pH 4.9 to 5.

Inkubasjonen blir gjennomført i 2 timer, og reaksjonen blir stoppet ved oppvarming i 1 time ved 90 °C.

Reaksjonsmediet blir deretter ultrafiltrert på en membran med en avkutting ved 9000 dalton (ES209 membran fra PCI), og ultrafiltratet blir samlet og spray-tørket.

Tabell 1 under viser resultatene av de fysisk-kjemiske egenskapene (nivå av a-1,6 bindinger, Mw og reduserende sukkerinnhold) til den oppløselige forgrenede glukose polymeren i overensstemmelse med oppfinnelsen som er oppnådd på den måten.

Prosentdel av reduserende sukkere blir bestemt i henhold til fremgangsmåten til SOMOGOYI, beskrevet av N. NELSON i A photometric adaptation of the SOMOGOYI method for the determination of glucose, 1944, J. Biol. Chem., 153, pp. 375-380.

Den forgrenede kjedelengde fordelingsprofilen blir bestemt som angitt over.

Tabell II under presenterer resultatene som ble oppnådd.

Den oppløselige forgrenede glukose polymeren som er oppnådd har en bemerkelsesverdig forgrenet kjedelengde fordeling som resulterer i litt mer enn 70 % av korte kjeder (DP mindre enn 15) og litt mindre 30 % av medium til lange kjeder (DP større enn 15).

Verdien til MARK HOUWINK SAKURADA parameteren "a", bestemt med metodologien som er beskrevet over, er 0,1.

Den oppløselige forgrenede glukose polymeren i følge oppfinnelsen har derfor en kompakt struktur, som er foldet av seg selv, som ikke desto mindre fremdeles har kjeder som er tilgjenglige for enzymatiske angrep.

Eksempel 2

En sammenliknende studie blir gjennomført på de forgrenede kjedelengde fordelingsprofilene til produktene fra reaksjonen med forgreningsenzymet og p-amylase på substrater som inneholder variable innhold av amylose.

Voksaktig mais stivelse (Stivelse A), standard mais stivelse (Stivelse B), og to varieteter av stivelse som er rik på amylose inneholdende henholdsvis 50 og 70 % stivelse (Stivelser D og E) blir deretter behandlet på samme måte som beskrevet i Eksempel 1.1 denne tabellen blir det også presentert resultatene oppnådd med ertestivelse (Stivelse C) oppnådd i eksempel 1.

Tabell III under presenterer mengdene avforgreningsenzymer (inkubasjon av 18 til 21 timer) og av p-amylase (behandling i 2 timer) anvendt for behandlingen av de forskjellige varietetene av stivelse.

Tabell IV presenterer resultatene oppnådd på basis av nivået av a-1,6 forgrening, molekyl vekter og reduserende sukker innhold av de høyt forgrenede glukose polymerene som er fremstilt.

Forbindelsene er identifiserte produkter F, G, H, I og J oppnådd fra stivelsene henholdsvis A, B, C, D og E. Egenskapene til produktet F er reprodusert i eksempel 1.

De enzymatiske behandlingene på de tre substratene som er rike på amylose (respektive amyloseinnhold på 37,5 og 70 %) gjør det mulig å fremstille oppløselige forgrenede glukose polymerer som har et nivå av a-1,6 forgrening i det smale området fra 13 til 15 %, for en molekylvekt mellom 0,9 og 1,5 x 10<5>dalton.

Behandlingen av voksholdig maisstivelse og av standard maisstivelse, hvilket dessuten er beskrevet i patentsøknad EP 1,369,432 fører til forgrenede glukose polymerer som har et nivå av a-1,6 bindinger i området fra 11 til 13 % og en molekylvektsverdi i området fra 0,7 til 0,9 x 10<5>dalton.

Anvendelse av stivelser som er rike på amylose som utgangsmateriale gjør det derfor mulig, på en bemerkelsesverdig måte, å oppnå oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer som har nivåer av a-1,6 glukosid bindinger og molekylvekter som er høyere enn de som er oppnådd fra substrater som er rikere på amylopektin, hvilket i seg selv er bemerkelsesverdig.

Tabell V under samler de forskjellige kjedelengde fordelingsprofilene til de forskjellige produktene som er oppnådd. Verdiene til koeffisienten av iboende viskositet "a" i følge MARK HOUWINK SAKURADA blir også presentert der.

Det blir observert at de oppløselige høyt forgrenede glukosepolymerene oppnådd fra stivelser som er rike på amylose har fra 70 til 85 % korte kjeder, fra 10 til 16 % medium kjeder og fra 8 til 13 % lange kjeder.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene oppnådd fra stivelser som er rike på amylopektin inneholder mindre enn 72 % korte kjeder, mer enn 16 % medium kjeder og mellom 11 og 15 % lange kjeder.

Det blir også observert at dess høyere amyloseinnhold i de behandlede stivelsene, dess mer oppløselig høyt forgrenede glukose polymerer oppnådd har en komponent med et lavt innhold av medium størrelse kjeder.

De oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen har derfor særlig et medium kjedeinnhold som er lavere enn 16 %, og fortrinnsvis mellom 10 og 16 % (hvilket ikke er tilfelle for de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene fremstilt fra standard mais stivelse og voksholdig stivelse).

Målingene av koeffisient til iboende viskositet "a" i henhold til MARK HOUWINK SAKURADA reflekterer også forskjellen i grad av kompakthet til de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene som blir oppnådd.

Det blir observert at bare stivelsene som er rike på amylose gjør det mulig å oppnå oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer som har en koeffisient av iboende viskositetsverdi som er mindre enn eller lik 0,1.

Videre blir det også observert at det er mulig å variere graden av kompakthet til de oppløselige forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen ved variering av amyloseinnhold til stivelsene som blir benyttet som substrater for enzymatiske reaksjoner.

Som en konsekvens blir de mest kompakte strukturene faktisk oppnådd fra stivelser som er mest rike på amylose.

Eksempel 3

For å bestemme grad av glukose frigjøring, blir de vandige oppløsningene med oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge oppfinnelsen fremstilt, hvilke blir brakt i kontakt med en amylase av pankreatisk opprinnelse og en tarm amyloglukosidase (intestinal aceton pulver).

Hydrolysen blir overvåket som en funksjon av tid ved måling av glukosen som fremkommer over tid i reaksjonsmediet.

Denne testen gjør det også mulig å evaluere resistensen til polymerene mot hydrolyse fra enzymet som er involvert i spalting av karbohydrater fra mat.

To polymerer i følge oppfinnelsen (produktene H og I fra Eksempel 2) blir testet for sammenlikning med glukose polymerene oppnådd fra standard stivelse (produkt G fra eksempel 2) hvis analyse ble gjort i patentsøknad EP 1,369,432 til søkerfirmaet, sammenliknet med glykogen.

Driftsbetingelsene for den enzymatiske spaltingen er som følger:

0,6 g av produktet som skal bli testet blir oppveid nøyaktig.

150 ml natrium maleat buffer 0,1 mol/l ved pH 7 blir tilsatt og mediet blir omrørt inntil produktet oppløses.

Den oppnådde oppløsningen blir plassert på et vannbad i 15 minutter, slik at temperaturen i oppløsningen er 37 °C.

1,5 ml av oppløsningen blir fjernet, 0,15 g pankreatin fra svin blir tilsatt og mediet blir inkubert i 30 minutter.

Den enzymatiske reaksjonen blir stoppet ved plassering av prøvene på et bad til tørrhet ved 100 °C i 10 minutter.

0,75 g pankreatin fra svin blir tilsatt og mediet inkubert i 3 timer og 30 minutter ved 37 °C på et termostatbad under omrøring.

Prøver blir samlet regelmessig under den enzymatiske hydrolysen.

Glukosen i prøvene blir deretter analysert for å beregne prosentvis hydrolyse av det studerte produktet.

Denne analysen blir gjennomført ved hjelp av en kolorimetrisk metode på en HITACHI 704 automatisk maskin (ROCHE). Reagenset som blir anvendt er et reagens som inneholder enzymene glukose oksidase/peroksidase (GOD/PAP). Volumet av reagenset som blir anvendt er 500 ul, prøvevolumet er 5 |xl og reaksjonstemperaturen er 30 °C.

Resultatene er presentert i Tabell IV under.

Det blir observert at mellom 30 og 60 minutter av reaksjon, vil de oppløselige høyt forgrende glukose polymerene i følge oppfinnelsen (produktene H og I) fremstilt fra henholdsvis standard ertestivelse og stivelse inneholdende 50 % amylose, frigjøre sin glukose mindre raskt enn glukose polymerene (produkt G) fremstilt fra standard mais stivelse.

Dette fenomenet blir imidlertid reversert mellom 60 og 120 minutter, idet produktet H frigjør mer glukose enn produkt G.

Det synes klart at de to oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene H og I i følge oppfinnelsen, fremstilt fra stivelse som er rik på amylose, kan bli anvendt både i ernæring til idrettsutøvere (produktet H som frigjør etter to timers spalting 63 % av glukose med en forsinket effekt), men også i anvendelser der det er nødvendig å regulere glykemi (produkt I som frigjøres overtid en mindre mengde glukose enn de andre produktene).

Det blir observert at valg av amyloseinnhold i utgangstivelsen bestemmer anvendelsen av de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge oppfinnelsen i veldefinerte anvendelsesområder.

Claims (12)

1. Oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer, som har et reduserende sukker innhold på mindre enn 1 %, et nivå av a-1,6 glukosid bindinger mellom 13 og 17 % og en molekylvekt som har en verdi mellom 0,9 x 10<5>og 1,5 x 10<5>dalton, karakterisert vedat deres forgrenede kjedelengde fordelingsprofil består av 70 til 85 % av DP som er lavere enn 15, av 10 til 16 % av DP som er mellom 15 og 25 og av 8 til 13 % av DP som er høyere enn 25.

2. Polymerer i følge krav 1, karakterisert vedat de har en iboende koeffisient av viskositet "a" i henhold til MARK, HOUWINK og SAKURADA likningen på mindre enn eller lik 0,1.

3. Polymerer i følge et av kravene 1 og 2, karakterisert vedat de har minst 14 % og for det meste 16 % med en DP mellom 15 og 25.

4. Polymerer i følge et av kravene 1 og 2, karakterisert vedat de har mellom minst 12 % og for det meste 14 % med en DP høyere enn 25

5. Polymerer i følge et av kravene 1 og 2, karakterisert vedat de har mellom minst 10 % og for det meste 12 % med en DP som er høyere enn 25.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av de oppløselige høyt forgrenede glukose polymerene i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved: 1) fremstilling av en vandig stivelsesoppløsning som har et amyloseinnhold på minst 30 vekt - %, fortrinnsvis mellom 35 og 80 vekt - %, 2) behandling av nevnte oppløsning med et forgreningsenzym og deretter en p"-amylase etter hverandre, 3) gjennomføring av en fraksjonering for å utvinne høy molekylvektsfraksjonene, 4) oppsamling av de høyt forgrenede glukose polymerene som er oppnådd på denne måten.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge krav 6, karakterisert vedat den vandige stivelsesoppløsningen blir behandlet: - med 40 000 til 150 000 U forgreningsenzym per 100 g stivelse, ved en temperatur mellom 25 og 80 °C i en periode fra 7 til 24 timer, fortrinnsvis mellom 18 og 24 timer, - og deretter med 0,05 til 0,5 % ml p-amylase per 100 g stivelse, ved en temperatur på 60 °C, ved en pH fra 4,9 til 5, i en tidsperiode mellom 1 og 3 timer, fortrinnsvis i 2 timer.

8. Fremgangsmåte i følge et hvilket som helst av kravene 6 og 7, med evne til fremstilling av oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge krav 3,karakterisert vedat den vandige stivelsesoppløsningen har mellom minst 30 % og for det meste 40 vekt - % amylose, og er fortrinnsvis standard ertestivelse.

9. Fremgangsmåte i følge et hvilket som helst av kravene 6 og 7, med evne til fremstilling av oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge krav 4,karakterisert vedat den vandige stivelsesoppløsningen har mellom minst 40 % og for det meste 60 vekt - % amylose.

10. Fremgangsmåte i følge et hvilket som helst av kravene 6 og 7, med evne til fremstilling av oppløselige høyt forgrenede glukose polymerer i følge krav 5,karakterisert vedat den vandige stivelsesoppløsningen har mellom minst 60 % og for det meste 80 vekt - % av standard amylose.

11. Anvendelse av høyt forgrenede glukose polymerer i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 eller kan bli oppnådd i følge fremgangsmåten i kravene 6 til 10, i mat og særlig medisinske anvendelser.

12. Anvendelse ifølge krav 11 som kilde for høy-energi substrater under fysisk aktivitet og innen feltene peritoneal dialyse, enteral eller parenteral ernæring, blod plasma erstatninger, regulering av fordøyelse og diett for diabetikere.