KR20050111419A

KR20050111419A - 베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸유도체를 이용한 유착방지제, 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20050111419A
Application number: KR1020040036117A
Authority: KR
Inventors: 함종천; 이현
Original assignee: 그린텍이십일 주식회사
Priority date: 2004-05-20
Filing date: 2004-05-20
Publication date: 2005-11-25
Also published as: KR100563616B1

Abstract

본 발명은 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제에 관한 것으로, 상기 유착방지제는 생분해성 기간을 조절할 수 있으며 생체적합성이 뛰어나며 유착방지효과가 우수하며, 생체내 흡수시 면역증강의 효과가 있다.

Description

베타글루칸 유도체, 그의 제조방법 및 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제, 그의 제조방법{β-Glucan derivative, manufacture of the derivative, adhesion Barrier using β-glucan and method thereof}

본 발명은 자연계에 존재하는 베타글루칸, 특히 복령다당체인 파키만(pachyman)을 수용성조절반응을 통하여 새로운 베타글루칸 유도체(AA-파키만), 그의 제조방법과 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제에 관한 것이다. 상세하게는 본 발명은 생체의 면역 기능을 증가시켜 항종양 활성을 나타내는 다당체의 포도당 잔기에 아세트아마이드기가 결합하여 그의 안정성 및 수용성이 증가된 새로운 수용성 다당체 및 이를 복령으로부터 얻는 경제적인 제조방법에 관한 것이며, 또한 상기의 새로운 다당체를 이용하여 생체적합성이 뛰어나며 유착방지의 효과가 우수하면서 생분해성이 좋으며 생체내 흡수시 면역증강효과가 탁월한 유착방지제에 관한 것이다.

버섯 등에서 여러가지 종류의 다당체가 분리되고 그의 항종양 활성이 알려져 이를 이용한 다양한 연구가 이루어져 왔다. 실제적으로 표고버섯의 자실체에서 분리한 다당체인 렌티난(Lentinan), 구름버섯 자실체 및 배양균사체에서 분리한 단백 다당체인 크레스틴(Krestin), 치마버섯 배양여액에서 분리한 다당체인 쉬조필란(Shizophillan) 등이 항종양 활성 등을 나타내는 의약품으로 시판되고 있으며, 상황의 배양 균사체의 열수 추출물도 국내에서 생산되어 시판되고 있다.

복령은 담자균류의 구멍장이버섯과에 속하는 포리아 코코스(Poria cocos)의 균핵으로 주요성분이 파키만(Pachyman)으로, 전기한 파키만(Pachyman)은 실험을 통해 항종양 활성을 나타내는 것을 확인하였으나, 물에 잘 녹지 않는 성질이 있고 그 사용에 있어서도 어려움이 있다.

유착이란 인체의 조직이나 기관이 정상상태에서는 분리가 되어있으나 상처를 받거나 인위적인 힘이 가하여 졌을 때 섬유조직을 형성하여 서로 떨어지지 않는 상태를 말하며, 이러한 유착이 생기는 것을 방지하는 제품이 유착방지제이다.

외과적 수술로 발생한 조직의 손상부위는 자연적으로 치유가 되는데, 이 때 주변의 조직과 비정상적인 유착이 일어나는 빈도는 수술환자의 63-93%에 이르며, 이로 인한 부작용으로는 장기능장애, 장폐색, 만성통증 및 불임 등의 후유증과 더불어 재수술시 개복의 어려움 등을 들 수 있다. 이와 같은 이유로 수술 후의 장기 유착을 방지하기 위한 유착방지제에 대한 개발이 전세계적으로 진행되고 있다.

현재 시판 중인 유착방지제로는 패드타입으로는 Johnson & Johnson사의 Interceed®, 젤타입으로는 Gliatech사의 Adcon®, 필름타입으로는 Genzyme사의 Seprafilm®, Macropore사의 SurgiWrap® 등이 있다. 이 중 Gliatech사의 Adcon®은 2002년 5월 판매가 중지당하였고 이 기술을 Wright Medical Group에 판매하므로서 현재 시판중인 유착방지제품은 매우 적은 수를 보이고 있다.

Johnson & Johnson사의 Inerceed®는 산화재생성셀룰로스가 주성분으로서 부직포형태를 이루고 있으며 기능적으로는 물에 대한 용해도가 높아 생체내에서의 형태유지율이 낮은 단점이 있다. Genzyme사의 Seprafilm®은 카르복시메칠셀룰로스(CMC)와 히알루론나트륨의 화학적변형물질이 주성분으로서 개복수술에 국한되어서만 사용가능하며, 기능적으로는 부스러지기 쉽고 투명성이 높지 않으며, 조직과의 점착성이 너무 높은 점 등의 단점이 있다. Macropore사의 SurgiWrap®은 Polylactide가 주성분으로 투명도가 높으며 최근 널리 사용되는 제품인데 기능적으로는 조직과의 점착성이 상대적으로 낮고 생체내 분해 최소기간이 6개월로 길어 사용범위에 제한을 받는 점, 경제적으로는 매우 고가인 점 등의 단점이 있다.

이와 함께 개발 중인 생체분해성 신소재의 예로서 히아루론산(HA, hyaluronic acid; USP 4,141,973)은 비교적 빠른 시간 내에 생체내에서 분해, 흡수되는 단점이 있으며, 가격 또한 매우 고가이다.

카르복시메칠셀룰로스(CMC, carboxymethyl cellulose)나 나트륨카르복시메칠셀룰로스(SCMC, sodium carboxymethyl cellulose)를 주성분으로 하는 기술(KR 공개 2003-55102, KR 공개 2002-11955, KR 공개 2001-10151, KR 10-316200, KR 특0135707, WO 2001/05370, WO 2000/59516, WO 1998/13927)이 많이 제시되고 있으나 이 소재는 지나치게 빨리 용해 및 흡수되기 때문에 유착방지 효과를 보이지 못한다.

알긴산나트륨(SA, sodium alginate; USP 5,266,326)과 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC, hydroxypropyl methyl cellulose; USP 5,318,780)를 이용한 제자리 젤화(in situ gelation)는 조직 접착력의 부족으로 유착방지 효율이 낮고 시술이 복잡한 단점이 있다.

위와 같이 생체내에서의 빠른 분해 및 흡수의 단점을 극복하기 위한 기술로서 생분해성 고분자간의 가교를 형성하는 방법이 제시되었다. 히아루론산(HA, hyaluronic acid)과 카르복시메틸셀룰로스(CMC)를 이용한 방법(USP 5,760,200)은 하이드로젤 구조를 유지하기 위하여 EDC[1-ethyl-3(3-dimethyaminopropyl)carbo diimide hydrochloride]를 반응시키는데 이때 사용되는 EDC는 생체독성을 가지며, 이를 제거하기위한 후속 공정이 까다로우며, 재료인 HA가 고가일 뿐만 아니라 제조된 필름은 유연성과 강도가 약하여 취급과 시술에 어려운 점이 많다.

카르복시폴리사카라이드(CPS, carboxypolysaccharide)와 폴리에테르(PE, polyether)를 주성분으로 하는 유착방지제(USP 5,906,997, KR 공개 2001-13927)는 수분으로 포화된 이후에는 조직과의 점착성이 떨어지는 단점이 있다.

그 외 젤란검(gellan gum, KR 공개 2003-55102, 공개 2002-11955), 키토산(chitosan, KR 공개 2003-71119, 공개 2001-107068), 플루란(pullulan, KR 공개 2003-71119), 커들란(curdlan, KR 공개 2003-71119), 아교(gellatin, KR 공개 2001-107601), 폴리에틸글리콜(PEG, polyethylglycol, KR 공개 2001-107067, KR 공개 2001-107068), 아가로오스(agarose, KR 공개 2001-107067, 공개 2001-107068), 덱스트란(dextran, KR 특0135707), 하이드록시에틸셀룰로스(HEC, hydroxyethyl cellulose, KR 공고 1997-10545, 공고 1995-13460), 헤파린(heparin, KR 공고 1995 -13460) 등의 소재를 이용한 기술들이 개발되어지고 있다.

그러나 상기의 소재들은 그 분해성이 매우 빠르거나 느림으로 인하여 단독 또는 여러 소재를 혼용하여 연구개발되는 시도가 이루어지고 있으나 여전히 제한적인 기능을 갖고 있는 단점이 있다.

본 발명은 상술한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 버섯에서 항종양 활성을 가지면서 사용이 용이한 수용성이 조절된 새로운 다당체와 그의 제조방법을 제공하며, 종래의 유착방지제의 생분해성 기간의 문제점을 해소하고 유착방지효능이 향상되며 분해 및 흡수 후에 면역기능을 증강시킨 새로운 소재의 유착방지제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은.

버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 베타글루칸 유도체을 제공한다.

상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH₂CONH₂)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.

상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체이다.

또한, 본 발명은 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 버섯의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 다당체를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 추출분리한 다당체에 이소프로판올을 포함하는 저급알코올의 반응용매를 가하여 교반시키는 단계; (c) 상기 (b)단계의 용액에 수산화나트륨 또는 수산화칼슘을 포함하는 알칼리용액 중에서 선택하여 전체 중량의 0.1 내지 50%를 중화제로 첨가하여 교반시키는 단계; (d) 상기 (c)단계의 용액에 클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산 등의 클로로화합물 중 1선택하여 반응물질로 가하여 30 내지 80℃의 반응온도에서 반응시키는 단계; (e) 상기 (d)단계의 용액을 원심분리하여 얻은 침전물을 알코올 용매로 씻어낸 후 감압건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 하기 화학식1로 표시되는 베타글루칸 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.

화학식 1.

또한, 본 발명은 상기 베타글루칸 유도체는 중량비 1 내지 30%의 금속이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 베타글루칸 유도체를 포함하여 분말, 젤, 박막 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 유착방지제를 제공한다.

또한, 본 발명은 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계;상기 현탁액을 마이크로플루다이저(microfluidizer)로 균질화시키는 단계; 상기 균질화된 현탁액을 유리판에 부어 클린벤치내에서 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박막형 유착방지제의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 면역증강 활성 및 수용성질을 갖는 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계: 상기 현탁액을 균질화시키는 단계; 상기 균질화된 현탁액을 코팅기에 의해 박막을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 박막형 유착방지제의 제조방법을 제공한다.

상기의 베타글루칸 유도체는 면역증가 활성이 있으며 세포 독성이 거의 없으며 수용성이 조절된 것이다.

본 발명의 베타글루칸 유도체는 아세트아마이드기의 치환도가 0.01-1.0인 것이 바람직하며, 치환도가 0.2~0.4일때가 가장 바람직하다. 본 발명의 베타글루칸 유도체의 물리화학적 특성은 다음과 같다.

(1) 성상

본 발명의 베타글루칸 유도체는 백색 또는 담황백색을 띠며 무미이면서 무취이다.

(2) 분자량

본 발명의 베타글루칸 유도체의 분자량 범위는 5-20 x 10⁶이며 평균분자량은 8.7 x 10⁶이다.

(3) 융해점

본 발명의 베타글루칸 유도체는 융해점이 나타나지 않고 170℃ 이상의 고온에서 탄화되는 특징이 있다.

(4) 용해도

본 발명의 베타글루칸 유도체는 물에 대한 용해도가 매우 낮으며 수분 함유시 젤을 형성하며, 메탄올, 에타올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 에테르 및 석유에테르에는 용해되지 않는다.

(5) 적외선 흡수 스펙트럼

본 발명의 베타글루칸 유도체는 브롬화칼륨 디스크법을 이용한 적외선 흡수 스펙트럼으로 분석하면 파수 3,400cm^-1, 2,920cm^-1, 1,650cm^-1, 1,600cm^-1, 1,470-1,400cm^-1, 1,100 - 1,000cm^-1, 890cm^-1에서 흡수대가 나타난다. 이 때 890cm^-1의 흡수대는 베타-글리코사이드에 의한 것이다.

(6) 총당 분석

본 발명의 베타글루칸 유도체의 총당은 페놀-황산법으로 분석하며, 그 분석 결과 100% 모두 당류인 것으로 나타난다.

(7) 총단백질 분석

본 발명의 베타글루칸 유도체의 총단백질은 로우리-폴린(Lowry-Folin)법으로 분석하며, 그 분석 결과는 0%로 나타난다.

또한 본 발명은 유착방지효과를 나타내는 베타글루칸 유도체를 제조하는 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은 복령의 건조 분말을 사이토(Saito) 등의 방법에 따라 알칼리로 추출하여 복령다당체를 분리한다. 상기 복령 다당체에 반응용매를 가하여 교반시키고, 다시 중화제를 첨가하여 교반시킨 다음 반응물질을 가하여 반응시키고 이를 원심분리하여 얻어진 침전물을 적당한 용매로 씻어낸 다음 감압 건조시킴으로서 상기 베타글루칸 유도체를 제조한다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 베타글루칸 유도체 제조

[비교예 1]아세트아미노기 치환도 0.5

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 4.6㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.375g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 20㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.85g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대한 용해도가 5% 이상이었으며, 5% 수용액 상태로 3개월 보관하여도 침전물이 생성되지 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 1번 시료로 하였다.

[비교예 2]아세트아미노기 치환도 0.4

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 3.68㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.3g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.82g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대한 용해도가 0.5%였으며, 0.5% 수용액 상태로 3개월 보관하여도 침전물이 생성되지 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 2번 시료로 하였다.

[비교예 3]아세트아미노기 치환도 0.3

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 10% 수산화나트륨 용액 2.76㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.225g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.83g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 용해되지 않고 젤을 형성하였다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 3번 시료로 하였다.

[비교예 4]아세트아미노기 치환도 0.2

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 9.2㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.15g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.7g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 4번 시료로 하였다.

[비교예 5]아세트아미노기 치환도 0.1

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 4.6㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.075g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.7g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 5번 시료로 하였다.

[비교예 6]아세트아미노기 치환도 0.06

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 2.8㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.045g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.74g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 6번 시료로 하였다.

[비교예 7]아세트아미노기 치환도 0.03

복령에서 얻어진 베타글루칸 1g을 반응기에 넣고 이소프로판올 30㎖을 가하여 실온에서 30분간 진탕한 다음 2% 수산화나트륨 용액 1.4㎖를 10분에 1㎖의 속도로 첨가하였다. 이 때 젤이 형성되지 않도록 90분간 격렬하게 진탕시키고 다시 클로로아세트아마이드 0.0225g을 넣어 50-60℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 아세트산 10㎖이 첨가된 70% 에탄올 200㎖로 씻고 다시 80% 에탄올 및 무수에탄올로 차

례대로 씻어 내었다. 침전된 다당체를 분리하고 감압건조시켜 0.76g의 백색분말인 베타글루칸 유도체를 얻었다. 상기 유도체는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체의 유착방지효과를 조사하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 7번 시료로 하였다.

[비교예 8]복령의 베타글루칸

복령에서 얻어진 베타글루칸 자체를 사용하였으며. 이는 물에 대하여 용해되지 않았으며 젤을 형성하지도 않았다.

본 비교예에서 제조한 베타글루칸 유도체와의 유착방지효과를 비교하기 위하여 박막을 제조하였으며, 이를 8번 시료로 하였다.

[실시예 2] 베타글루칸 유도체의 박막 제조

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체 및 베타글루칸 0.5g을 50㎖의 물에 현탁시키고 마이크로플루다이저(microfluidizer)를 이용하여 균질화를 시킨다음 가로세로 각각 18cm인 유리판에 부어 클린벤치내에서 하루 동안 건조시켜 박막을 제조하여 1 - 8번 시료를 얻었다.

[실험예1]베타글루칸 유도체의 안전성(in vitro, 세포독성)시험

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체의 세포독성의 여부를 조사하기 위하여 3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움브로마이드(MTT)를 이용한 MTT 검색법을 실시하였다. 인체 정상세포 유래인 HS27 세포를 1 x 105세포/㎖의 농도가 되도록 인산완충용액(PBS)으로 조정하여 96-웰 마이크로플레이트(Falcon, USA)에 웰(well) 당 100㎕ 씩 넣었다. 다음 상기 1 - 8번 유도체 분말을 1㎎/㎖ 농도로 인산완충용액에 현탁시키고 1/10씩 희석하여 0.1㎍/㎖ 농도가 되는 때까지 계속 희석하고 최종 부피가 200㎕가 되도록 맞추어 37℃, 5% CO2 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 다음 MTT 시약이 5㎎/㎖ 농도로 들어있는 인산완충용액을 20㎕씩 첨가하여 4시간동안 배양하고, 상층액 180㎕를 제거하고 0.04N 염산-이소프로판올 100㎕를 첨가하여 하루밤동안 방치한 다음 이를 자동 엘리자판독기(Molecular Devices Corp., USA)를 이용하여 560㎚에서 흡광도를 측정하므로서 세포생존율을 측정하였다.

평균 생존율(%) = 시료처리군의 흡광도/대조군의 흡광도 x 100

그 결과, 본 발명의 글루칸 유도체는 직접적인 세포독성을 나타내지 않아 안전한 물질임을 알 수 있었다(표 1 참조).

본 발명의 글루칸 유도체의 HS27 세포주에 대한 직접적인 세포독성 실험

시료명	시료농도(㎍/㎖)	세포 평균 생존율(%)
1번 시료	1,000	102.5
	100	101.7
	10	107.7
	1	100.2
	0.1	101.5
2번 시료	1,000	110.2
	100	102.3
	10	100.8
	1	100.2
	0.1	108.9
3번 시료	1,000	105.4
	100	103.7
	10	100.2
	1	100.9
	0.1	111.1
4번 시료	1,000	108.2
	100	100.7
	10	105.3
	1	104.7
	0.1	107.3
5번 시료	1,000	104.2
	100	100.9
	10	108.1
	1	106.4
	0.1	107.7
6번 시료	1,000	100.1
	100	102.2
	10	108.5
	1	104.3
	0.1	102.7
7번 시료	1,000	108.4
	100	109.2
	10	100.8
	1	102.9
	0.1	106.5
8번 시료	1,000	104.7
	100	107.9
	10	108,2
	1	100.3
	0.1	105.4

[실험예2]

베타글루칸 유도체의 안전성(in vivo, 동물경구독성)시험

실시예 1의 비교예 1 - 8에서 얻은 각각의 유도체의 안전성을 조사하기 위하여 경구독성시험을 실시하였다. 동물은 흰쥐(ICR mouse)를 사용하였으며, 평균체중 18g의 흰쥐를 구입하여 1주일간 적응시킨 후 1군에 10마리로하여 모두 8군으로 실험하였다. 보사 상세하게는 8개의 유도체를 물에 현탁시킨 후, 1주일간 적응시킨 흰쥐에 1,000㎎/㎏의 용량을 강제로 경구투여 시킨 후 2주일간 치사율, 행동특성, 탈모 및 피부발진 등의 이상증상을 조사하였다. 그 결과 8군의 80마리 모두 이상증상을 보이지 않았다.

[실험예3]

베타글루칸 유도체 필름의 유착방지효과(in vivo, 동물모델)시험

실시예 1의 비교예 3에서 얻은 3번 시료와 3번 유도체의 5%(W/W)중량의 금속이온인 칼슘이온(Ca²⁺)을 첨가한 3-1번 시료를 사용하였고, 평균체중 230g의 SD(Sprague-Dawley) 래트 암컷을 시험에 사용하였다. SD 래트를 디에틸에테르(diethyl ether)로 마취시킨 후 깨끗한 수술기구를 사용하여 복부 중앙을 개복하여 소장을 노출시키고 표면에 찰과상을 내어 출혈이 생기도록 하였으며, 이에 상응하는 복벽을 사포로 마찰시켜 출혈반점을 일으킨 다음 대조군은 그대로, 3번 시료의 처리군은 박막을 상처부위에 점착한 다음 장기의 찰과상 부위와 복벽의 상처부위가 인접하도록 복강내에 재배치하고 복벽과 피부층을 일반외과 수술법에 의하여 봉합하였다. 이 때 각 처리군은 10마리로 하였으며, 7일 후 쥐를 안락사시킨다음 개복하여 유착방지율, 형태유지율 및 장기의 이상변화 유무를 확인하였다.

유착의 정도는 아래의 등급체계를 이용하였으며 유착발생의 기준은 복벽에 대한 유착을 기준으로 하였다.

0등급 : 유착발생 없음

1등급 : 복강내 지방질이 상처부위에 약간 붙어 있음

2등급 : 장간막 등과 상처부위가 유착되어 실 같은 형태를 나타냄

3등급 : 혈관성조직이 발달하였고 소장과 복벽이 심하게 유착됨

박막형태유지 정도는 박막의 형태를 기준으로 하였다.

0등급 : 형태의 변화 없음

1등급 : 약간의 젤화가 일어나 박막의 두께가 두꺼워졌으나 형태는 유지하고 있음

2등급 : 젤화가 일어나 박막의 형태를 유지하지 못하나 젤화된 물질은 그대로 있음

3등급 : 젤화가 일어나며 일부의 물질이 분해 및 흡수가 일어남

그 결과 대조군의 평균유착정도에 비하여 현저한 유착방지효과를 나타내었으며, 장기의 이상변화가 나타나지 않았다. 특히 칼슘이 첨가된 3-1번 시료의 경우 형태유지율이 3번 시료보다 우수한 것으로 나타났다.

본 발명의 글루칸 유도체의 유착방지효과, 박막형태유지율시험

시료	등급	유착방지효과		박막형태유지율
시료	등급	개체수	평균등급	개체수	평균등급
대조군	0	0	(1×1 + 2×2 +3×7)/10 = 2.6	-	-
	1	1		-
	2	2		-
	3	7		-
3번시료	0	7	(1×2 + 2×1)/10 = 0.4	8	(1×2)/10=0.2
	1	2		2
	2	1		0
	3	0		0
3-1시료	0	8	(1×2)/10=0.2	10	0.0
	1	2		0
	2	0		0
	3	0		0

본 발명에 따른 베타글루칸 유도체는 생체의 면역활성을 강화시켜 항종양 활성을 나타내므로 세포 독성이 거의 없고, 각 포도당 잔기를 아세트아마이드기로 치환시켜 안정성이 향상되고 파키만에 비하여 수용성 조절의 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 베타글루칸 유도체는 간단한 제조방법을 통해 얻을 수 있으며, 상기의 제조방법은 비용이 적게 들므로 경제적 효과가 있으며, 반응물질로 클로로아세트아마이드를 사용하여 제조한 베타글루칸 유도체는 제조의 용이성, 우수한 안정성, 면역효과의 증강의 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 유착방지제는 생분해성의 기간을 조절할 수 있으며, 생체적합성이 뛰어나고 유착방지의 효과가 우수하며 생체내 흡수시 면역증강효과가 있다.

Claims

다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 그의 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 것을 특징으로 하는 하기 화학식1으로 표시되는 베타글루칸 유도체.

화학식1

상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH₂CONH₂)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.
제1항에 있어서, 상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체.
제1항에 있어서, 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체.
(a) 버섯의 건조 분말을 알칼리로 추출하여 다당체를 분리하는 단계;

(b) 상기 (a)단계에서 추출분리한 다당체에 이소프로판올을 포함하는 저급알코올의 반응용매를 가하여 교반시키는 단계;

(c) 상기 (b)단계의 용액에 수산화나트륨 또는 수산화칼슘을 포함하는 알칼리용액 중에서 선택하여 전체 중량의 0.1 내지 50%를 중화제로 첨가하여 교반시키는 단계;

(d) 상기 (c)단계의 용액에 클로로아세트산, 클로로아세트아마이드, 디클로로아세트아마이드, 트리클로로아세트아마이드, 클로로아세틸클로라이드, 클로로아크릴산 등의 클로로화합물 중 1선택하여 반응물질로 가하여 30 내지 80℃의 반응온도에서 반응시키는 단계;

(e) 상기 (d)단계의 용액을 원심분리하여 얻은 침전물을 알코올 용매로 씻어낸 후 감압건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체의 제조방법.
장기의 비정상적인 유착을 방지하는 유착방지제에 있어서,

상기 유착방지제는 버섯에서 얻은 다당체인 파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 하기 화학식1으로 표시되는 베타글루칸 유도체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.

화학식1

상기 화학식1에서 R 및 R′는 아세트아마이드기(-CH₂CONH₂)이고, m 및 n은 각 단량체의 개수로서 m은 40~60이고, n은 60~100 범위이다.
제5항에 있어서, 상기 베타글루칸 유도체는 중량비 0.1 내지 30%의 금속이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.
제5항에 있어서, 상기 다당체는 복령다당체, 저령다당체 및 효모다당체를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.
제5항에 있어서, 상기 아세트아마이드의 치환도는 0.01 내지 0.5인 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제
제5항에 있어서, 상기의 유착방지제는 분말, 젤, 박막 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.
제5항에 있어서,

상기 베타글루칸 유도체는 면역증강 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제.
파키만(pachyman)구조를 기본으로 하여 포도당 잔기를 아세트아마이드로 치환시킨 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계:

상기 현탁액을 균질화시키는 단계; 및

상기 균질화된 현탁액을 클린벤치내에서 건조시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.
면역증강 활성 및 수용성질을 갖는 베타글루칸 유도체를 물에 현탁시키는 단계:

상기 현탁액을 균질화시키는 단계;및

상기 균질화된 현탁액을 코팅기에 의해 박막을 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.
제11항 또는 제12항에 있어서,

상기 현탁액을 균질화하는 단계는 마이크로플루다이저(microfluidizer)를 이용하는 것을 특징으로 하는 베타글루칸 유도체를 이용한 유착방지제의 제조방법.