PT1421120E - Amilopectina hiper-ramificada para utilização em métodos para o tratamento cirúrgico ou terapêutico de mamíferos ou em métodos de diagnóstico especilamente para utilização como um dilatador do volume de plasma - Google Patents

Description

HIPER-RAMIFICADA PARA UTILIZAÇÃO EM MÉTODOS PARA O TRATAMENTO CIRÚRGICO OU TERAPÊUTICO DE MAMÍFEROS OU EM MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO ESPECIALMENTE PARA UTILIZAÇÃO COMO UM DILATADOR DO VOLUME DE PLASMA" A presente invenção refere-se a utilização de amilopectina hiper-ramifiçada.

Em particular, a invenção refere-se a uma nova utilização de amilopectina hiper-ramifiçada a qual apresenta um grau especifico de ramificação e um peso molecular especifico de Mw.

No decorrer da história do desenvolvimento de dilatadores de volume de plasma, tem sido sempre um dos objectivos conseguir a estrutura globular do portador natural da pressão osmótica coloidal no soro, a saber na albumina. 0 glicogénio, que também ocorre como um polissacárido de retenção natural no organismo humano, está perto desta estrutura globular. 0 glicogénio realiza a sua estrutura globular como um resultado do seu elevado grau de ramificação. Do ponto de vista estrutural, o gliccgeaio é um polissacárido de glicose com Xbç:aç.:b:>Ã de a-1,4 glicosídicas, em secções lineares, as quais os pnbdSb de ramificação de a-1,6 glicosídicas são fixados. Como o próprio glitbgéniv não está o; -n-b camo um,·:· fonte de matéria prima barata, Wiedersheim suqtbiu em 1957 utilizar-se em vez çía.-s..· a amilopectina menos ramificada tomo um de psrrtifM para a prtduçba dó amido de hidroxietilo do dilatador de plasma (HES). Entretanto, o amido de hidroxietilo está a ser usado na forma de vários tipos diferentes a uma escala muito larga como dilatador de plasma. Este desenvolvimento levou a novos tipos de tipos de amido de hidroxietilo (tipos de HES) os qimit apresentam um efeito de volume Óptimo de qualquer forma com efeitos colaterais mínimos tais como por exemplo a influencia na coagulação ou a retenção intermediária no tecido. Vários tipos de HES presentes no mercado diferenciaram-se quanto ao seu peso molecular, ao grau médio de substituição e ao modelo de substituição.

Apesar do progresso substancial conseguido por meio destes desenvolvimentos, algumas desvantagens permaneceram mesmo no caso dos tipos de HES optimizados nos Últimos anos, em particular a incapacidade de ser completamente metabolizado. E bem conhecido, no entanto, que quimicamente falando, o grupo de éter de hidroxietilo e metabolicamente extremamente estável para que aquelas unidades de anidrido de glicose do amido de hidroxietilo que transportam grupos de éter de hidroxietilo sejam praticamente impossíveis de metabolizar. Alem disso, é conhecido que só aquelas ligações de a-1,4 glicosídicas na molécula de amido de hidroxietilo podem ser separadas pelo soro de a-amilase as quais são formadas por unidades de glicose não substituídas. Por esta razão, foi verificado que mesmo no caso d o tipos optimizadcs dos HES uma hisco-retenção mínima não obstante ainda notável pode ser apurada pelo veitoõ em certos períodos de tempo.

Como ume desvantagem adicional, foi verificado que c HES cio possui a estrutura globular ideal da albumina e a sua viscosidade intrínseca é, por isso, consideravelmente mais alta do coe aquela da albumina. Uma viscosidade relativamente baixa é desejável no caso de um dilatador de plasma porque, depois aa sua aplicação na circulação, viscosidade total do sangue vai ser influenciada no sentido de uma redução.

Existiu, portanto, o objectivo de desenvolver novos dilatadores de plasma melhorados baseados em amilopectina que não apresentem as desvantagens de uma falta de capacidade de metabolismo completa do derivado do amido de amilopectina de hidroxietilo. Ao mesmo tempo, o novo dilatador de plasma tinha que ter uma estrutura globular maior e ser assim capaz de formar soluções de viscosidade relativamente baixas.

Também se pode considerar como sendo um dos objectivos da invenção o de abrir campos adicionais de aplicação para certas amilopectinas.

Estes objectivos bem como os objectivos adicionais não enumeradas em detalhe que, no entanto, podem ser conseguidos livremente e facilmente a partir das explicações introdutórias são realizados pela matéria do assunto da reivindicação 1. As formas de realização preferidas da invenção são a matéria do assunto das reivindicações que se referem a reivindicação 1.

Por se utilizar a amilopectina ramificada com um grau médio de ramificação de entre > 10 e 25 % em mol e um peso molecular médio de Mw na região de 40 000 a 800 000 Dalton e, se necessário, os seus derivados em métodos para c tratamento cirúrgic-o ou terapêutico do corpo do ser humano ou do (incluindo aquele de mamíferos) ou em métodos de diagnóstico ê possível abrir-se, de uma maneira não directamente pr«virirvò por um lado um número de novas e interessantes aplicações no campo médico no campo médico para a arnilopectina hiper-ramifiçada. Por outro lado, um substituto quase Ideal para os produtos de HES à base de amido ainda usualmente utilizados na prática no momento é fornecido especificamente no que se refere ao sector "de expansão de volume de plasma", levando a muito menos efeitos colaterais perigosos.

No que se refere a expansão de volume de plasma, foi de facto verificado em relação com a invenção como um resultado de estudos extensos e investigações que as fracções residuais de amido de hidroxietilo na corrente sanguínea e na urina apresentam um forte aumento no grau de ramificação algumas horas ou mesmo dias depois da aplicação de um dilatador de plasma em comparação com o amido de hidroxietilo originalmente introduzido (produto de HES). Os graus de ramificação, expressos em I em mol do anidrido de glicose transportam pontos de ramificação assim aumentados de aproximadamente 5 % em mol a mais de 7 % em mol em 2 horas depois da aplicação e de 8 % em mol em 7 horas depois da aplicação. Ao mesmo tempo, um grau mesmo mais elevado de ramificação de 9 ou 10 % em mol ficou evidente na fracção de urina total, 48 ou 42 horas depois da infusão. Este fenómeno foi observado independente do peso molecular, do grau da substituição ou do modelo de substituição do amido de hidroxietilo aplicado. Isto significa que, quando da decomposição, estas fracções adquirem cada vez mais uma estrutura e/ou uma aproximação de ramificação que se parece com o glicc-génio, o qual é indicado na literatura como de ramificação a um nivel tão alto como aproximadamente 10 % em mol.

Bastante surpreendentemente, foi Wbií içado agora :¾¾¾ a estabilidade relativa da ramificação de d-Alo':!; em arnilopectina e nos seus derivados pode ser explorada para reduzir a degradação da amílopectína em comparação com a degradação dominante de i-Stel»so a um Psl ponro que um polissacárido capaz de se degradar completamente pode ser produzido o qual, no entanto, ainda apresenta as propriedades de um dilatador de plasma ideal no que se refere aos farmacocinéticos e/ou ao efeito de volume.

Consequentemente, a invenção compreende a utilização de amilopectinas hiper-ramifiçadas e de derivados de tais amilopectinas hiper-ramifiçadas no sector médico. 0 termo amilopectina deve ser entendido como significando em geral primeiro de tudo os amidos ramificados ou os produtos de amido com ligações de a- (1,4) e a-(1,6) entre as moléculas de glicose. Estas ramificações da cadeia realizam-se através de ligações de a- (1,6). No caso das amilopectinas que ocorrem naturalmente estas ocorrem de uma maneira irregular aproximadamente a cada 15-30 segmentos de glicose. C peso molecular da amilopectina que ocorre naturalmente é muito elevado, isto é na região de 10' a 2 x 108 Dalton. É assumido que a amilopectina, também, forma hélices dentro de certos limites. É possível definir um grau de ramificação para as amilopectinas. A proporção do numero de moléculas de anidrido de glicose que transportam pontos de ramificação (ligações de a-(1,6)) relativamente ao número total de moléculas de anidrido de glicose de amilopectina è uma medida de ramificação, sendo esta proporção expressa em mol. Naturalmente a ocorrência da amilopectina tem um grau de ramificação aproximadamente de 4 % em mol. No entanto, é conhecido que, quando considerado em isolamento, os grupos e as secções de molécula da amilopectina apresentam um grau ligeiramente maís alto de ramificação comparados com o grau médio natural da ramificação.

As amílopectinas hiper-ramíficadas de acordo com o significado da invenção são aquelas amílopectinas que apresentam um grau de ramificação que excede significativamente o grau de ramificação conhecida para a amilopectina da natureza. 0 grau de ramificação é, em todo o caso, um valor médio (o grau médio de ramificação) uma vez que as amilopectinas são substâncias poli-dispersas.

Tais amilopectinas hiper-ramifiçadas apresentam graus significativamente mais altos de ramificação, expressos em % em mol de glicose de anidro de ramificação, em comparação com a amilopectina não modificada ou o amido de hidroxietilo e consequentemente parece-se com o glicogénio mais estreitamente em termos da sua estrutura. 0 grau médio de ramificação das amilopectinas hiper-ramifiçadas necessário para a aplicação de acordo com a invenção está na região entre > 10 e 25 % em mol. Isto significa que as amilopectinas úteis de acordo com o significado da invenção apresentam em media uma ligação de :v·· (1,6) e consequentemente um ponto de ramificação aproximadamente a cada 10 a 14 unidades de glicose. Se o grau de ramificação for abaixo de 10 % em mol, a degradação da amilopectina ramificada é insuficientemente retardada (por exemplo no caso da sua utilização como um dilatador de plasma). Se o grau de ramificação for maior do que 25 % em mol, a degradação é excessivamente atrasada para que a sua utilização como um dilatador de volume de plasma, por exemplo se]a impedida. hm tipo de amilopectina que pode ser de ura modo preferido usado no campo médico é caracterizado por um grau de ramificação de entre 11 e i6 % em mol. O&ttâJ amilopectinas preferidas hiper-ramif içadas apresentam um grau de ramificação na região de entre 13 e 16 % em moí.

Além do mais, o peso molecuiar de Mw da amilopectina hipe-ramifiçada é também importante. 0 peso molecular de Mw indica a média de peso do peso molecular como é mensurável por métodos relevantes que fornecem este valor médio. Estes incluem GPC aquoso, HPLC, difusão da luz e semelhantes.

As amilopectinas hiper-ramifiçadas convenientes para utilização de acordo com a invenção geralmente apresentam um valor da média de peso do peso molecular de 40 000 a 800 000 Dalton. O valor de limite mais baixo para a variação do peso molecular de Mw é obtido no caso das aplicações preferidas essencialmente do assim chamado 'limiar renal' as quais devem ser estabelecidas aproximadamente a 40 000 no caso dos compostos hiper-ramifiçados. Se o Mw é menor de 40 000 Dalton, as moléculas seriam filtradas demasiado rapidamente através dos rins. Acima de um Mw de 800 000 Dalton, nennuma menção de valor de utilidade adicional seria conseguida mesmo embora a viscosidade de limite não dependa mais do peso molecuiar no caso de uma estrutura globular.

Os valores médios de Mw de entre 90 000 e 300 000 Dalton são preferidos para a utilização como dilatadores de volume de plasma, com pesas moleculares de Mw de entre 120 000 e 250 000 Dalton sendo especialmente apropriados.

Uma forma de realização preferida da invenção compreende a amilopectina híper-ramificada, sendo o gr,:;:· médio de tMíificâgsCi entre 11 e 16 % mo? e sendo o peso molecular de Mw entre 90 QOd e 300 COO Daifom, Outras informas de btái-isâçio; apropriadas da invenção incluem uma amilopectina hiper-ramificada, sendo o 00-¾¾ médio de ramificação entre 13 e 16 % em mol e tondo o or •mi-molecular de Mw entre 120 000 e 250 000 Dalton.

Os parâmetros supracitados, a saber o grau de ramificação e o peso molecuiar, permitem um efeito alvo que é exercido e os farmacocinéticos assim desejados senda estabelecidos, em particular uma degradação de α-amiiase desejada sendo conseguida. O grau de ramificação de amilopectina tem um papel chave a desempenhar nesta conexão. No entanto, 0 peso molecular, também, influencia a cinética relacionada. Além disso, também pode ser possível influenciar a cinética da degradação da amilopectina para tomar uma direcção desejada por variar a distribuição dos pontos de ramificação.

De particular importância para decompor a amilopectina pela a-amilase e consequentemente para a operação do dilatador de volume de plasma, no entanto, é o grau de ramificação. Como cm resultado do elevado grau de ramificação, o ataque da α-amilase é muito atrasada e em áreas da molécula com uma elevada densidade dos pontos de ramificação completamente eliminados uma vez que nenhum acesso da α-amilase é aí possível. Tais compostos são sem embargo capazes da degradação por outras enzimas a oligossacáridos e finalmente a glicose.

Se necessário, às amilopectinas híper-ramificadas a serem usadas de acordo ecos a invenção ser obtidas na forma de derivados. Taís derivados compreendem derivados químicos de amilopectina tais como por exemplo m conseguíveis por conversões de biotecnologia ou

Os derivados preferidos de amilopectina hiper-ramifiçada sãc a amiiopectina de hídroxietilo, a amilopectina de hidroxipropilo e a amilopectina de acetilo. Destes, a amilopectina de hídroxietilo por sua vez é especialmente vantajosa de usar. A cinética da degradação da amilopectina também pode ser ccnsequentemente influenciada pela derivação. No entanto, é vantajoso que o grau de derivação, por exemplo o grau de hidroxietilação seja consideravelmente mais baixo nestes casos com a finalidade de se conseguir um efeito de volume comparável ou farmacocineticoç semelhantes em comparação com o amido de hídroxietilo (HES) produzido a partir de amilopectina normalmente ramificada. A produção de amilopectina hiper-ramifiçada que é conveniente de acordo com o significado da invenção entre outras coisas e de um modo preferido para a utilização como um dilatador de volume de plasma realiza-se de uma maneira conhecida como tal pela conversão enzimática pelas assim chamadas enzimas de ramificação que catalisam a hidrólise das ligações de a-1,4 glicosídicas e a sua conversão em compostos de a-1,6 glicosídicos. Tais assim chamadas enzimas de transferência podem ser extraídas de modo conhecido por exemplo a partir de algas de acordo com o documento PCT WO 0018893. No entanto, a partir da patente norte americana No. 4 454 161 e da patente europeia EP 0418 945, outras enzimas de ramificação de glicogénio são conhecidas as quais também pode ser usadas de modo correspondente. A execução da transglicosilação enzimatica realiza-se de uma maneira conhecida tal como por exemplo pela incubação do amido de milho de cera com as enzimas correspondentes em condições suaves a um pH a volta de cerca de 1, 5 e a temperaturas de cerca de 30 °C em <··:.I .1 .:·· aquosa, O trabalho na preparação da reacção realiza-se posteriormente mais uma vez de modo conhecido, tendo as enzimas sido primeiro desactivadas oo removidas por se modificar o pH ou por passos de filtração.

Em um passo de hidrólise subsequente que de um modo preferido se realiza por meio de ácido clorídrico, o peso molecular desejado do produto é ajustado. Por diafíltração com membranas com um corte de cerca de 3 000 Dalton, o produto é posteriormente libertado de compostos moleculares baixos e sal comum formado durante a neutralização da preparação da hidrólise acídica. 0 produto e isolado por exemplo por secagem por pulverização. A parte de serem usadas como dilatador de volume de plasma, as amilopectinas hiper-ramifiçadas também podem ser utilmente empregues em outras áreas da medicina. A amilopectina hiper-ramifiçada pode ser assim usada para todas aquelas aplicações no campo da terapia e da cirurgia na qual os produtos de HES padrão baseados em tipos normalmente ramificados do amido podem ser usados. A parte da utilização como dilatador de volume de plasma, isto implica de um modo preferido a utilização para o melhoramento da micro-circulação, a utilização como ajuda a sedimentação na separação da célula em conexão com a leucaferese ou a utilização para a crio-conservação de componentes de sangue tais como os eritrócitos e os granulócitos.

Exemplo de Modelo 1

Testes de Degradação Comparativos Com Giucossacáridos a-1-4 / a-1-6 Diferentemente femificados O glicogénio de ostras da firma SIGMA foi decomposto tsds a-amilse termo-resistente BAN 4 80 L da firma fCVCtAGo..;: em 'roa niiófofa fé: DMSO e água com um conteúdo d© 30 '1 de DMSO a ?ΰ í;C e cm pH de 6,0. O curso da jffe&eçlç foi controlado por se medirem as modificações no peso molecular por cromatografia de gâ© e a reacção foi parada depois de cerca de 2 horas através da adição de solução de soda cáustica para a activação da enzima. Depois da neutralização, o produto foi fraccionado por ultrafiltração por meio de um ultrafiltro de acetato de celulose com um corte nominal de 1 000 D e 25 000 D para a remoção de fracções moleculares baixas e das fracções mcleculares elevadas que permanecem. O produto foi posteriormente tratado com o permutador de iões Amberlite IR 200 C e carbono activado, precipitado com etanol e seco a 80 °C. O grau de ramificação determinado por espectroscopia de 1H RMN (integração dos sinais de protóes anoméricos) deu um grau de ramificação de 15 % em mel. O peso molecular médio de Mw foi de 7 000 Dalton. 0 amido de milho de cera em ebulição fino (> = 95 % de amilopectina) (Cerestar) foi tratado do mesmo modo como o descrito em cima. A fraeção altamente ramificada isolada, do grupo de ramificação apresentou um grau de ramificação de 11 % cu mol, o peso molecular médio de Mw foi de 8 000 Dalton.

As fracções de grupo altamente ramificadas de amilopectina e glieogénio foram posteriormente submetidas a um teste de degradação por meio de alfa-amiiase ; do pâncreas de ©uinos em tampão de fosfato a pH ?,2 em 1 % de uma solução a 37 fi;€ e com 0,5 IS/&Í de mzi.ma e a cinética de ©cg ;· ,:1.:-:0- foram controlados per se me d: ; cm as modificações mo peso molecular pèlu cmmtlmpruilu de gel. Um oes te cs ·:©·. : vo da degradação por meio do dilatador de ssslcms os plasma de amido de hidroxietilc comercial tsmhfe foi executado íVviÃi?enf Frcsenius Kabi) . As diferenças claras na cinética de degradação itrâm obtidas. A meia vida do peso molecular (a redução do peso molecular médio de Mw da substância de partida à metade do valor inicial) foi ât 60 minutos no caso da fracção com um grau de ramificação de 15 % e consequentemente conseguiu a meia vida determinada nas mesmas condições de teste que aquele para o dilatador de plasma Voluven. A meia vida da fracção com um grau mkdio de ramificação de 11 % em mol, por outro lado, foi só de 25 minutos e foi assim consideravelmente mais curto.

Exemplo de Modelo 2 0 amido de milho de cera em ebulição fino de Cerestar com um grau mkdio de ramificação determinado por RMN de 4 % em mol foi submetido a um teste de degradação por dc pâncreas de suínos de acordo com os dados no exemplo 1. Com esta finalidade, 1 % de uma solução foi gelatinisada em tampão de fosfato a pH 7,2 por breve aquecimento a cerca de 90 C'C e, depois de arrefecimento, a enzima foi adicionada à preparação numa quantidade que resulta em 0,£ IU por ml. A temperatura de teste foi de 37 °C. A cinética de degradação foi controlada por se determinarem as modificações no peso molecular pela cromatografía de gel. O peso molecular da substância de partida fui reduzido para metade do bslar ao fim de 16 minutos nas mesmas condições ggo no exemplo 1, ramificados do txaosmio I, o amido de milho de cera em ebulição fino, de ramificação média relativamente baixa, é assim decomposto pela a-amilase tão rapidamente que não seria usável como dilatador de plasma.

Deste modo, os dois extiçlos de modelo 1 e 2 demonstram que mesmo se os pesos moleculares forem baixos, níveis mais altos de ramificação levam a um atraso na degradação da a-amilase e que este efeito pode ser usado para a fabricação de um dilatador de plasma.

Lisboa, 24 de Julho de 2007

Claims (6)

1. Amilopectina hiper-ramifiçada a qual õpresenta um grau médio de ramificação, expresso somo % em mol de glicoses de anidro que transportam pontos de ramificação, de entre > 10 e 25 % em mol e têm uma média de peso médio do peso molecular de Mw na região de 40 000 a 800 000 Daiton e os seus derivados para a utilização em métodos para o tratamento cirúrgico ou terapêutico do corpo do ser humano ou do animal ou em métodos de diagnóstico.
2. 2. Amilopectina hiper-ramifiçada de acordo com a reivindicação 1 como um dilatador de volume de plasma.
3. 3. Amilopectina hiper-ramifiçada de acordo com a reivindicação 1 para o melhoramento da micro-circulação.
4. 4. Amilopectina hiper-ramifiçada de acordo com a reivindicação 1 como um auxiliar de sedimentação na separação da célula em conexão com a leucaferese.
5. 5. Amilopectina hiper-ramifiçada de acordo com a reivindicação i para a crio-conservação de componentes do sangue tais como os eritrócitos ou os granulócitos.
6. 6. Amilopectina hiper-ramifiçada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o grau médio de ramificação está entre 11 e 16 % em ítol e o peso molecular de Mw entre 90 300 ?. Andlopectína hiper-ramificada de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores I a 5, em que o grau médio de ramificação está entre 13 e 16 % em moi e o peço molecular de Mw entre 120 000 e 250 000 Dalton. Lisboa, 24 de Julho de 2007