JP2007505144A - 抗腫瘍療法のためのコバラミン結合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、腫瘍関連疾患の治療に適したコバラミン−薬物結合体を提供する。切断可能リンカー及び１以上の場合によるスペーサーを介して、コバラミンを抗腫瘍薬物に間接的に共有結合させる。コバラミンリボース環の５’−ＯＨを介して、第一のスペーサー又は切断可能リンカーに、コバラミンを共有結合させる。薬物上に存在するか又は付加された官能基を介して、切断可能リンカーの第二のスペーサーに薬物を結合させる。投与後、結合体は、トランスコバラミン（そのアイソフォームいずれか）と複合体を形成する。次いで、複合体が細胞膜上の受容体に結合し、そして細胞に取り込まれる。細胞に入ると、細胞内酵素が結合体を切断し、それによって薬物を放出する。結合体の構造に応じて、特定の種類又は型の細胞内酵素が、切断に作用する。増殖中の細胞において、コバラミンが非常に要求されるため、腫瘍細胞は、典型的には正常の非増殖細胞よりも、より高い率の結合体を取り込む。本発明の結合体は、好適に、対応するフリーの薬物に比較して、減少した全身毒性及び増進した有効性を提供する。

Description

発明者：
Ｎｅｄ Ｍ． Ｗｅｉｎｓｈｅｎｋｅｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｇ． Ｗｅｓｔ、Ｂａｒｂａｒａ Ａ． Ａｒａｎｅｏ、及びＷｅｉｐｉｎｇ Ｌｉ。

発明の分野
本発明は、コバラミンの結合体、その使用法、及びその調製法に関する。より具体的には、本発明は、腫瘍（癌）関連疾患を治療するためのコバラミン結合体に関する。

発明の背景
癌、腫瘍及び他の細胞増殖関連疾患の治療に使用するための、抗増殖薬物、例えば抗腫瘍薬物又は抗癌薬物、並びにその類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）、誘導体及びプロドラッグが、周知である。これらの投与法は、多様であり、そしてある範囲の成功及び失敗を経験してきた。抗増殖薬剤含有医薬組成物及び配合物を開発する目的には、これらの薬物で治療される対象に対する全身毒性を最小限にするために、これらの薬物の標的化送達を改善すること、誘導体化した際、これらの薬物の有効性を維持することが含まれる。癌又は腫瘍細胞への薬物の標的化送達を改善し、そして誘導体化後であっても薬物の有効性を維持するのには、ある程度成功してきている。そうであっても、高い有効性と組み合わせた標的化送達は、抗腫瘍療法の重要な目的であり続けている。

天然存在生物学的活性構成要素を用いた薬物の誘導体化が、これらの薬物の標的化送達を改善する手段として評価されてきている。この目的に向けて、コバラミン細胞取り込みの生物学的機構を利用することによって、生物学的利用能を改善する試みの中で、薬物、タンパク質、核酸、アミノ酸、ペプチド、ホルモン又は他の構成要素を含む、コバラミン結合体が開発されてきている。原理的には、コバラミン（ＣＢ）に共有結合した剤を含むバイオ結合体（ＣＢＤ）は、 ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質に結合するようになる。投与部位に応じて、タンパク質は、内因子（ＩＦ）、あるいはトランスコバラミン（ＴＣＣＢ）Ｉ、ＩＩ又はＩＩＩである。ＩＦは、胃腸管内の天然存在タンパク質であり、ＣＢに結合する。コバラミンバイオ結合体は経口投与されると、ＩＦに結合して、複合体（ＩＦ−ＣＢＤ）を形成し、これがＧＩ管腔を渡って能動輸送される。血漿に到達すると、ＩＦはＩＦ−ＣＢＤ複合体から解離し、それによってＣＢＤを血漿成分内に放出する。ＴＣＣＢは、細胞膜を横切るＣＢの細胞取り込みに関与する。ＴＣＣＢは血漿中のＣＢＤに結合して、複合体ＴＣＣＢ−ＣＢＤを形成する。ＴＣＣＢ−ＣＢＤ複合体は、次いで、細胞膜上のＴＣＣＢ受容体を介して、細胞膜を渡って能動輸送される。遊離コバラミンを認識する細胞表面受容体はなく；ＴＣＣＢ−ＣＢＤ複合体を認識するもののみがあることに注目すべきである。細胞に進入すると、ＴＣＣＢはＴＣＣＢ−ＣＢＤ複合体からの細胞内解離を経て、それによってＣＢＤを細胞内で放出する。いくつかの刊行物は、上記使用のためのコバラミン結合体の調製を報告する。

米国特許第５，７３９，３１３号；第６，００４，５３３号；第６，０９６，２９０号；第６，２１１，３５５号；及びＰＣＴ公報ＷＯ ９７／１８２３１は、天然存在ビタミンＢ１２上のプロピオンアミド部分を介したビタミンＢ１２の放射性核種標識を開示する。コリン環のｂ位、ｄ位及びｅ位のプロピオンアミド部分を、穏やかな加水分解を介して、モノカルボン酸に変換し、そしてカラムクロマトグラフィーによって、カルボン酸を分離した。次いで、アミド連結を介して、カルボキシレート官能に二官能性連結部分を付着させ、そして再びアミド連結を介して、連結部分にキレート剤を付着させた。キレート部分を用いて、ビタミンに放射性核種を付着させ、療法目的又は診断目的に使用可能にした。

Ｈｏｇｅｎｋａｍｐらは、ＷＯ ０１／２８５９５（ＰＣＴ／ＵＳ００／１００９８）において、タンパク質リンカーを介して、腫瘍の画像化に有用な検出可能基に連結した、一連のコバラミン結合体を開示する。該リンカーは、５’−ＯＨ基を介して、コバラミンに付着しているのではない。Ｈｏｇｅｎｋａｍｐらは、こうした化合物が腫瘍の治療に有用でありうることを示唆する。

Ｈｏｇｅｎｋａｍｐらは、ＷＯ ０１／２８５９２（ＰＣＴ／ＵＳ００／１００９７）において、直接又はリンカーによって間接的に、異常な細胞増殖の治療に有用な化学療法剤の残基に連結した、一連のコバラミン結合体を開示する。該リンカーは、５’−ＯＨ基を介して、コバラミンに付着しているのではない。ドキソルビシン結合体が意図され、そして提唱されるその合成が、該出願に含まれる。広い範囲の抗増殖剤が適切と開示されているが、該出願には、実際の化合物例は含まれていない。結合体化は、コバラミンのカルボン酸部分で起こると提唱される。

Ｃｏｌｌｉｎｓらは、ＷＯ ００／６２８０８（ＰＣＴ／ＵＳ００／１０１００）において、直接又はリンカーによって、異常な細胞増殖の治療に有用なＢ−１０又はＧｄ−１５７を含む分子の残基に連結した、一連のコバラミン結合体を開示する。中性子捕獲療法標的がコバラミンに連結される。全身投与後、結合体は腫瘍細胞に吸収される。次いで、中性子捕獲照射を適用する。提唱される連結部位には、アミド部位及びコバルトが含まれる。コバラミンリボース環の５’−ＯＨは提唱されていない。

Ｇｒｉｓｓｏｍらに対するＰＣＴ公報ＷＯ ９８／０８８５９は、生物活性剤が、直接又はスペーサーを介して間接的に、コバルト原子に共有結合している、生物活性剤及び有機コバルト複合体を含有する結合体を開示する。生物活性剤は、化学療法剤（抗腫瘍薬物）であることも可能である。細胞性求核剤又は酵素作用による正常な置換の結果、あるいは外部シグナル（例えば光、光励起、超音波、又は磁場の存在）の適用による、生物活性剤及びコバルト原子間の弱い共有結合が切断されることにより、生物活性剤がバイオ結合体から放出される。結合体は、細胞、組織、又は臓器において、生物活性剤を部位特異的に放出するために標的化されていると報告される。

Ｃｏｌｌｉｎｓらに対するＰＣＴ国際公報ＷＯ ０３／０２５１３９は、ＶＢ１２、コバラミンへのカップリングを介して、核酸を送達するための結合体を開示する。分解性のリンカーが用いられる。提唱される連結は、アミド部位又は５’−ＯＨ部位のいずれかを介したものである。アンチセンス配列、ナンセンス配列、アンチセンス模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）、核酸及び核酸類似体が意図される。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，４２８，０２３号は、経口ホルモン配合物を送達するためのビタミンＢ１２結合体を開示する。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓは、ビタミンＢ１２結合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで内因子に結合可能でなければならず、これによって脊椎動物宿主の腸管腔から宿主の全身循環に複合体が取り込まれ、そして輸送されることが可能になると解説する。ホルモンは、ビタミン上の加水分解されたプロピオンアミド連結を介して、ビタミンＢ１２に付着される。該特許は、この方法が、ホルモン、生物活性ペプチド、療法剤、抗原、及びハプテンを経口投与するのに有用であると述べ、そして療法剤として、ネオマイシン、サルブタモールクロリジン（ｃｌｏｒｉｄｉｎｅ）、ピリメタミン、ペニシリンＧ、メチシリン、カルベニシリン、ペチジン、キシラジン、ケタミン塩酸、メファネシン（ｍｅｐｈａｎｅｓｉｎ）及び鉄デキストランを列挙している。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，５４８，０６４号及び第６，２６２，２５３号は、’０２３特許と同じアプローチを用いた、エリスロポエチン及び顆粒球コロニー刺激因子を送達するためのビタミンＢ１２結合体を開示する。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対するＰＣＴ公報ＷＯ ９４／２７６４１は、ポリマーを介して多様な活性剤に連結したビタミンＢ１２を開示し、該結合体は全身送達のため、内因子に結合可能である。特に、該文書は、多様なポリマー性リンカーの、ビタミンＢ１２分子のプロピオンアミド位への付着、及びポリマー性リンカーへの多様な生物活性剤の付着を開示する。典型的な生物活性剤には、ホルモン、生物活性ペプチド及びポリペプチド、抗腫瘍剤、抗生物質、解熱剤、鎮痛剤、抗炎症剤、並びに止血剤が含まれる。典型的なポリマーには、炭水化物及び分枝鎖アミノ酸ポリマーが含まれる。ＷＯ ９４／２７６４１に用いられるリンカーは、ポリマー性である（各々、約５０００以上の分子量を有する）。リンカーは、ポリマー化プロセスで作成されるため、分子量の異なる混合物を提示すると記載される。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対するＰＣＴ公報ＷＯ ９９／６５９３０及び米国特許第６，１５０，３４１号は、ビタミンＢ１２（ＶＢ１２）リボース環上の５’−ＯＨ位への多様な剤の付着を開示する。該刊行物は、この系を用いて、ポリマー、ナノ粒子、療法剤、タンパク質、及びペプチドを、ビタミンに付着させることも可能であることを示す。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらは、活性カルボニル求電子剤の使用を介した５’−ＯＨ ＶＢ１２誘導体の調製を開示する。ＶＢ１２ ５’−ＯＨをカルボニル求電子剤と反応させた後、リンカー、ジアミノスペーサー、又は他の分子を、活性化された５’−ＯＨと反応させる。あるいは、５’−ＯＨ部位をエステル部位に変換し、次いでこれを誘導体化する。薬物へのＶＢ１２誘導体の連結が意図される。

Ｇｒｉｓｓｏｍらに対するＰＣＴ国際公報ＷＯ ０２／０７４１７１（ＰＣＴ／ＵＳ０２／０８２８５）及び米国付与前特許公報２００２／０１９２６８３は、蛍光コバラミン誘導体を開示する。好ましくはコリン環又は５’−ＯＨ基を介して、蛍光部分をコバラミンに連結する。該化合物は、癌細胞を検出し、抗癌療法及び他のこうした方法に潜在的に感受性である細胞を同定するのに用いられる。該刊行物は、５’−ＯＨ基に付着した抗癌薬物を開示しない。

Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄらに対する米国特許第５，５７４，０１８号は、臨床上に有用なタンパク質が、リボース部分の一級ヒドロキシル部位に付着している、ビタミンＢ１２の結合体を開示する。該特許は、臨床上に有用なタンパク質として、エリスロポエチン、顆粒球−コロニー刺激因子及びヒト内因子を列挙し、そして該結合体が経口投与に特によく適応することを示す。

Ｍｏｒｇａｎ， Ｊｒ．らに対する米国特許第５，８４０，８８０号は、受容体調節剤が連結したビタミンＢ１２結合体を開示し、該調節剤は、ビタミンＢ１２の細胞取り込み及び代謝を支配する受容体輸送経路に作用する。該受容体調節剤は、ｂ位、ｄ位、又はｅ位で、ビタミンに連結される。

Ｃｏｌｌｉｎｓらに対する米国付与前特許公報２００２／０１５１５２５は、抗増殖薬物に連結されたＶＢ−１２のある範囲の結合体を開示する。該薬物は、５’−ＯＨ部位を含む、ＶＢ−１２分子上のいくつかの異なる部位で、多様な異なるリンカーによって、連結されることも可能である。適切な抗増殖薬物の膨大なリストの中に、ドキソルビシンが含まれる。ＶＢ−１２のカルボン酸部分に付着したドキソルビシンを含む結合体の合成に関して、机上論的でそして一般的な説明が開示されているが、こうした化合物の実際の例示はない。また、他のいかなる特定の結合体、特に５’−ＯＨ部位の結合体に関する他の合成法もまったく開示されていない。

Ｇｒｉｓｓｏｍらに対する米国付与前特許公報第２００２／０１１５５９５号及び第２００２／００４９１５４号は、ＶＢ１２の有機コバルト誘導体を開示する。該誘導体は、経口投与及びｉ．ｖ．投与に適していると開示される。いくつかの抗腫瘍薬物、例えばドキソルビシン、メトトレキセート、及びカルボプラチンが、結合体化に適していると開示される。自己分解リンカーからの抗腫瘍薬物の切断は、細胞性求核剤、酵素、光又は音によって起こると提唱される。Ｇｒｉｓｓｏｍらは、該結合体で癌を治療する方法を提唱する。

Ｇｒｉｓｓｏｍらに対する米国特許第６，３１５，９７８号は、経口投与又はｉ．ｖ．投与に適応した、ＶＢ−１２の有機コバルト誘導体を開示する。ＶＢ−１２に結合体化可能な抗腫瘍薬物には、ドキソルビシン、メトトレキセート、及びカルボプラチンが含まれる。彼らは、リンカーからの抗腫瘍薬物の切断が、細胞性求核剤又は酵素又は光又は音によって起こると示唆する。リンカーは、ＶＢ−１２から除去された後、薬物から切断される、自己分解リンカーである。彼らは、やはり、該結合体で癌を治療する方法を提唱する。

Ｈｏｇｅｎｋａｍｐらに対する米国付与前特許公報２００２／００４２３９４は、所望により、造影剤として使用するための、抗生剤と結合体化されたＶＢ−１２を開示する。Ｈｏｇｅｎｋａｍｐは、該結合体で使用するのに適した抗生物質化合物として、局所抗新生物剤（ＥＦＵＤＥＸ：フルオロウラシル；フルオロプレックス）を特定する。彼らは、抗生物質化合物が、５’−ＯＨを含む多様な部位で、ＶＢ−１２に付着することを示唆する。彼らは、静脈内投与可能な抗腫瘍結合体を開示しない。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，４４９，７２０号は、ＶＢ−１２及び活性剤間のリンカーとしてのポリマーの使用を開示する。該結合体は、（Ｖ−Ｑ）_ｎ−Ｐ−（Ｑ’−Ａ）_ｍと定義され、式中、ＶはＶＢ−１２であり；Ｐは所望により生物分解性ポリマーであり；Ａは活性剤であり；そしてＱ、Ｑ’は場合によるスペーサー又は架橋剤である。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらは、カルボキシル部分を介して、ＶＢ−１２に結合体化可能な、潜在的な抗腫瘍剤及び多くの他の薬物のリストを開示する。しかし、彼らは、ＶＢ−１２の５’−ＯＨ誘導体を開示しない。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，５８９，４６３号は、経口投与後、ＧＩ管腔を渡って、ＶＢ−１２誘導体を輸送するための、ＶＢ−１２取り込み機構の利用を開示する。ＶＢ−１２誘導体が活性剤に連結される。ある範囲の活性剤が開示されるが、抗腫瘍化合物は開示されない。リンカーを形成するのに架橋剤が用いられる。薬物の取り込みを増進するため、ＶＢ−１２に付着される抗生物質が開示される。彼らは、やはり、ＶＢ−１２の５’−ＯＨ誘導体を開示しない。

Ｗｉｌｂｕｒらに対する米国特許第５，７３９，２８７号、Ｍｏｒｇａｎ Ｊｒ．らに対する米国特許第５，８４０，７１２号、Ｍｏｒｇａｎ Ｊｒ．らに対する米国特許第５，８４０，８８０号、Ｍｏｒｇａｎ Ｊｒ．らに対する米国特許第５，８６９，４６５号、及びＭｏｒｇａｎ Ｊｒ．らに対する米国特許第６，０８３，９２６号は、ＶＢ−１２受容体をブロッキングするよう設計されたビオチン化ＶＢ−１２を開示する。これらの５’−ＯＨ誘導体は、Ｔｏｒａｙａ（Ｂｉｏｉｎｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．（１９７５）， ４， ２４５−２５５）の方法にしたがって調製される。彼らは、ＶＢ−１２にリンカーを付着するのに使用可能な多様な異なる基を開示する。癌の治療のため、彼らは、メトトレキセート、あるいは別の抗癌薬物又は抗腫瘍薬物と、修飾ＶＢ−１２を同時に投与し、それによって、２つの異なる機構：増殖中の癌細胞におけるＶＢ−１２の枯渇と組み合わせた、化学療法剤の投与を使用する方法を開示する。彼らは、ＶＢ−１２とメトトレキセートの結合体化を示唆しない。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，８０７，８３２号は、ＶＢ−１２及び生物活性分子（ホルモン、抗生物質、ハプテン、抗原、タンパク質、分泌産物）を結合体化するための架橋剤の使用を開示する。彼らは、結合体の細胞内酵素切断も開示しないし、あるいは抗腫瘍薬物又はＶＢ−１２の５’−ＯＨ誘導体も開示しない。

Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，８６３，９００号は、ジアミンとのカルボキシレート連結又はジチオール連結を介してＶＢ−１２に連結された、ＬＨＲＨアンタゴニスト（ＡＮＴＩＤＥ−１、ＡＮＴＩＤＥ−２、ＡＮＴＩＤＥ−３）を開示する。ＡＮＴＩＤＥ構成要素は、ＧＩ管における酵素的加水分解に抵抗する。彼らは、ｉｎ ｖｉｖｏで、ＶＢ−１２からＡＮＴＩＤＥが切断されることを示唆する。彼らは、トランスグルタミナーゼによるｉｎ ｖｉｖｏ切断のための類似体の使用を示唆するが、実行には成功しなかった。彼らはまた、ＶＢ−１２の結合体としての抗腫瘍化合物も開示しない。

Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅらに対する米国特許第６，２１４，３４５号は、自己分解スペーサー（自己犠牲（ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）スペーサー）によって連結された、抗腫瘍薬物及び標的化リガンド（抗体又はタンパク質）の結合体の調製及び使用を開示する。ＶＢ−１２は、適切なリガンドとして開示されていない。その代わり、抗体等の巨大分子が適切なリガンドとして開示される。ドキソルビシンは、結合体に含まれうる薬物として請求されている。

ビタミンＢ１２の使用を記載する他の特許には、Ｎａｔｈに対する米国特許第３，９３６，４４０号（放射性金属同位体で錯体金属キレートを標識する方法）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎらに対する米国特許第４，２０９，６１４号（放射標識に適したビタミンＢ１２誘導体）；米国特許第４，２７９，８５９号（葉酸及びビタミンＢ１２の同時放射アッセイ）；Ｙｏｌｌｅｅｓに対する米国特許第４，２８３，３４２号（抗癌剤及び製造法）；Ｆｒａｎｋらに対する米国特許第４，３０１，１４０号（腎臓を監視するための放射薬学的方法）；Ｈｏｕｔｓに対する米国特許第４，４６５，７７５号（こうしたアッセイのためのビタミンＢ１２及び標識誘導体）；Ｗｉｌｓｏｎらに対する米国特許第５，３０８，６０６号（軟組織腫瘍の治療法及び／又は診断法）；米国特許第５，４０５，８３９号（ビタミンＢ、その誘導体、調製プロセス、及び使用）；Ａｘｗｏｒｔｈｙらに対する米国特許第５，６０８，０６０号（ビオチニダーゼ耐性ビオチン−ＤＯＴＡ結合体）；Ｍｏｒｇａｎらに対する米国特許第５，８６９，４６５号（受容体調節法及びその使用）；Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓらに対する米国特許第５，８６９，４６６号（ＧＣＳＦのためのビタミンＢ１２が仲介する経口送達系）が含まれる。Ｒｕｍａ Ｂａｎｅｒｊｅｅ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｂ１２ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．（１９９９）及び特にＨ．Ｐ．Ｃ． Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ、Ｄｏｕｇｌａｓ Ａ． Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｂ． Ｇｒｉｓｓｏｍ、及びＦｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｇ． Ｗｅｓｔによる、この本の第ＩＩ部、セクション１５、表題「コバラミンの診断用及び療法用類似体」もまた参照されたい。

切断可能リンカーによって、抗腫瘍薬物に連結されたポルフィリン様部分を含む結合体が、Ｈａｎ（米国付与前公報第２００２／０１５５９９９号）に開示されている。プロトポルフィリンはリンカーで誘導体化され、そして続いて抗腫瘍化合物の利用可能な官能基と反応して、結合体を形成する。しかし、Ｈａｎの結合体は、腫瘍内よりむしろ、腫瘍周囲の生理学的条件における切断に適応している。

ｉｎ ｖｉｖｏ有効性は、抗癌療法及び抗腫瘍療法が成功する際の特徴であるが、有効性は、過剰な全身毒性の損害を伴って実現されるものであってはならない。実際、癌及び腫瘍細胞に対して、増加した毒性を有するが、剤を投与される宿主又は対象に対して、軽減された全身毒性を有する、抗癌剤又は抗腫瘍剤を提供することが、非常に望ましいが、しばしば維持できない（ｕｎｔｅｎａｂｌｅ）。好ましい抗癌剤又は抗腫瘍剤は、癌又は腫瘍細胞に対しては、高い殺傷率を提供するが、宿主に対して、低い死亡率しか提供しないものである。先行技術は、対応するフリーの薬物に比較した際、軽減された全身毒性及び増進した有効性を有するＶＢ１２結合体を開示せずまた示唆しないが、こうした結合体に関する必要性はいまだにある。

したがって、先行技術が癌又は腫瘍の治療のためのコバラミン誘導体の潜在的な有用性を認識しているものの、細胞内酵素で分解可能又は加水分解可能なリンカーによって、薬物がコバラミンに付着している、コバラミンの抗増殖薬物５’−ＯＨ結合体が成功裡に調製されてきてはいなかった。特に、先行技術は、ドキソルビシンを含むこうした結合体の調製も、あるいは腫瘍又は癌の治療のためのコバラミン５’−ＯＨ−ドキソルビシン結合体の使用も開示しない。

発明の概要
本発明は、細胞膜を横切る能動輸送に適した、細胞内酵素切断可能な、抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体を提供し、該結合体は：
ａ．コバラミン、又はコバラミン誘導体；
ｂ．コバラミン又はコバラミン誘導体の５’−ＯＨ部分に共有結合しているリンカー；
ｃ．リンカーに共有結合し、それによって結合体を形成している抗腫瘍薬物であって、細胞内酵素によって該薬物がリンカーから切断可能であり、そして／又はリンカーがコバラミンから切断可能である、前記抗腫瘍薬物
を含む。

本発明の特定の態様には：１）結合体が、１以上の場合によるスペーサーをさらに含むもの；２）結合体が、リンカー及びコバラミンの５’−ＯＨ部分間に、共有結合したスペーサーを含むもの；３）結合体が、リンカー及び抗腫瘍薬物間に、共有結合したスペーサーを含むもの；４）抗腫瘍薬物が、ドキソルビシン、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）の活性成分）、及び本明細書に詳述する他の薬物からなる群より選択されるもの；５）カテプシン、エキソグリコシダーゼ、エンド酵素、グリコシダーゼ、メタロプロテアーゼ、リボザイム、プロテアーゼ、エステラーゼ、及びアミダーゼからなる酵素種群から選択される、細胞内酵素によって、薬物又はコバラミンから、リンカーが切断可能であるもの；６）コバラミン又はコバラミン誘導体が、本明細書に開示するものから選択されるもの；７）結合体が、フリーの（ｆｒｅｅ）抗腫瘍薬物に対して、軽減された全身毒性を有するもの；８）切断可能リンカーが、リソソーム酵素によって切断可能であるもの；９）切断可能リンカーが、第一のスペーサーの第一の末端及び第二のスペーサーの第二の末端で共有結合しているもの；１０）切断可能リンカーが、カテプシン切断可能ペプチドであるもの；１１）切断可能リンカーが、カテプシンＢ切断可能ペプチドであるもの；及び／又は１２）切断可能リンカーが、フェニルアラニン及びリジンを含むものが含まれる。

本発明はまた、式Ｉ：
ＶＢ−（ＳＰａ）_ｎ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｍ−ＤＧ
式Ｉ
式中、
ＣＬは、１以上の細胞内酵素によって、ＶＢ、ＳＰａ、ＳＰｂ及び／又はＤＧから切断可能なリンカーであり；
ＶＢは、コバラミン、又はその誘導体若しくは類似体であり、ＶＢのリボース環の５’−ＯＨ基を介して、ＣＬに、又は存在する場合、ＳＰａに共有結合しており；
ＳＰａ及びＳＰｂは、場合によるスペーサーであり、それぞれの存在に際して、共有結合、二価官能基、非ペプチド残基、又はそれらの組み合わせからなる群より独立に選択され；そして
ＤＧは、抗腫瘍薬物である；
ｎ及びｍは、それぞれの存在に際して、０、１、２又は３から独立に選択される
の結合体も提供する。

場合によるスペーサー、ＳＰａ及びＳＰｂは、切断可能リンカーＣＬのいずれの側に位置することも可能である。例えば、どちらも、リンカーのＶＢ端にあることも、又はＤＧ端にあることも可能である。適切なスペーサー及びリンカーを本明細書に詳述する。それぞれの存在に際して、スペーサーＳＰａ及びＳＰｂは、本明細書に詳述する定義いずれかから、独立に選択される。ＳＰａ及びＳＰｂは同じであることも、また異なることも可能である。ＳＰａが結合体中に１より多く存在する場合、それぞれの存在に際して、その定義が独立に選択される。同様に、ＳＰｂが結合体中に１より多く存在する場合、それぞれの存在に際して、その定義が独立に選択される。

本発明の別の側面は、腫瘍の治療法であって、腫瘍の治療が必要な対象に、臨床上有効な量の本発明記載の結合体を投与する工程を含み、該結合体が細胞への送達及び細胞による取り込みのため十分に安定している、前記治療法を提供する。結合体の標的療法レベルは、薬理学分野で認識されるプロトコルを用いて、望ましい臨床効果を提供するのに十分である。一般的に、結合体の投与は、フリーの薬物と同じ投薬措置におおむねしたがって、結合体を投与することによって、実行可能である。結合体は、結合体を投与される対象で観察される臨床反応にしたがって、フリーの薬物より高い又は低いモル濃度で投与されることも可能である。治療法は、所望により、第一の結合体での治療と異なる、第二の抗腫瘍治療を対象に投与する工程を含む。方法の場合による態様は、２以上の異なる結合体での患者の治療を提供する。本発明はまた、本発明の１以上の結合体及び１以上の非結合体化抗腫瘍薬物で患者を治療することも含む。

本発明はまた、本発明記載の結合体及び少なくとも１つの薬物賦形剤を含む、薬物組成物及び投薬型も提供する。特定の態様において、投薬型は、経口、頬側、目、耳、直腸、膣、舌下、鼻、肺、非経口、経皮からなる群より選択される経路による投与に適応している。適切な投薬型には、ゲル、クリーム、軟膏、ピル、錠剤、カプセル、液体、懸濁物、浸透圧装置、ビーズ、顆粒、球状体、微粒子、ペースト、小球、再構成可能固体、粉末、又は注射可能液が含まれる。

本発明の他の特徴、利点及び態様は、以下の説明、付随する実施例によって、当業者には明らかとなるであろう。

発明の詳細な説明
本明細書に用いる略語のいくつかを以下に定義する：
ＡＡ：アミノ酸
Ｂ_１２−５’−ＯＨ：シアノコバラミン
ＣＤＴ：１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＵ：ジシクロヘキシル尿素
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｄｏｘ：ドキソルビシン
ＥＥＤＱ：２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＳｕ：Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＨＰＬＣ：高性能液体クロマトグラフィー
Ｌｙｓ：リジン
ＭＭＴ：ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル（モノメトキシトリチル）
ＰＡＢＯＨ：ｐ−アミノベンジルアルコール
ＰＡＢＣ：ｐ−アミノベンジルカルボニル
ＰＡＰＣ：ｐ−アミノフェニルカルボニル
Ｐｈｅ：フェニルアラニン
ＰＮＰ：ｐ−ニトロフェニル
ＴＭＳ：トリメチルシリル

ドキソルビシン塩酸を、２ｍｇ／ｍｌの０．９％生理食塩水溶液として、Ｇｅｎｓｉａ Ｓｉｃｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから得た。明治製菓（日本 東京）からも得た。該溶液を、Ｗａｔｅｒｓ Ｃ_１８ Ｓｅｐ−Ｐａｋカートリッジ（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０４３３４５）上に吸着させ、そして水（３カートリッジ体積）で洗浄して、塩化ナトリウムを除去した。ドキソルビシン塩酸をメタノールで溶出した。回転蒸発によってメタノールを除去し、そして凍結乾燥によって水を除去した。ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍからＡＡ及びＥＥＤＱを得た。ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍからカテプシンＢを得た（Ｐ／Ｎ ２１９３６４）。Ａｃｒｏｓ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｉｇｍａ、Ｆｌｕｋａ、Ｆｉｓｈｅｒ又はＶＷＲからすべての他の化学薬品及び溶媒を得て、そして別に記載しない限り、さらなる精製を伴わずに使用した。

本明細書において、そして別に明記しない限り、用語「コバラミン」は、コバラミン、その類似体又はその誘導体を意味すると解釈される。用語、コバラミンには、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン、アクオコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、シアノコバラミンカルバナリド、デスジメチルコバラミン、モノエチルアミドコバラミン、メチルアミドコバラミン、補酵素Ｂ１２、５’−デオキシアデノシルコバラミン、コバマミド誘導体、クロロコバラミン、スルフィトコバラミン、ニトロコバラミン、チオシアナートコバラミン、ベンズイミダゾール誘導体、例えば５，６−ジクロロベンズイミダゾール、５−ヒドロキシベンズイミダゾール、トリメチルベンズイミダゾールとともにアデノシルシアノコバラミン（（Ａｄｅ）ＣＮ−Ｃｂｌ）、コバラミンラクトン、コバラミンラクタム、及びＶＢ１２のアニリド、エチルアミド、モノカルボン酸、ジカルボン酸及びトリカルボン酸誘導体、プロピオンアミド誘導体、５−ｏ−メチルベンジルコバラミン、並びにコバルトが亜鉛又はニッケルなどの別の金属原子で置換されている、これらの類似体が含まれる。ＶＢ１２又はその類似体のコリン環もまた、トランスコバラミンへの結合を完全には排除しない置換基いずれかで置換されることも可能である。上述の化合物は、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．、Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、並びに薬学的最終製品、中間体及び出発材料の他の化学薬品商業的供給者などの供給者を介して、商業的に入手可能である。

スペーサーは、本発明の結合体である式１の化合物において、場合による。０、１又は２のスペーサー、あるいはスペーサーの組み合わせが含まれることも可能である。スペーサーは、コバラミン及びリンカー、コバラミン及び薬物、又はリンカー及び薬物の間の距離を調整するように働く。コバラミンの５’−Ｏから、ＣＬ又はスペーサーへの薬物の付着点までの距離は、トランスコバラミンの結合、及び結合体切断に関与する酵素の結合を可能にするのに十分である。用いる薬物及び用いるコバラミンの特定の型に応じて、性能を最適にするため、距離が多様であることも可能である。

また、結合体のトランスコバラミン親和性を改善するため、あるいは望ましくない立体相互作用から生じる、コバラミン、リンカー及び／又は薬物のカップリングにおける問題を克服するため、あるいは結合体中の薬物の生物活性を増加させるため、スペーサーを導入することも可能である。スペーサー化合物はまた、選択される官能基を両端に持つ、二官能性化合物であり、リンカー又はコバラミン上に位置する適切な官能基と反応するため、連結剤としても働くことも可能である。

スペーサーは場合によるため、結合体の特定の態様には：ＶＢ−（ＳＰａ）_ｐ−ＣＬ−ＤＧ（式ＩＩ）、ＶＢ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＤＧ（式ＩＩＩ）、ＶＢ−ＣＬ−ＤＧ（式ＩＶ）、ＶＢ−ＣＬ−（ＳＰａ）_ｐ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＤＧ（式Ｖ）、ＶＢ−（ＳＰａ）_ｐ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＣＬ−ＤＧ（式ＶＩ）、及び（ＶＢ−（ＳＰａ^２）（ＳＰａ^１）−ＣＬ−（ＳＰｂ^１）（ＳＰｂ^２）−ＤＧ）、式中、「ｐ」及び「ｑ」は、それぞれの存在に際して、１、２及び３から独立に選択される、が含まれる。

スペーサー、ＳＰａ又はＳＰｂは、所望により置換された飽和又は不飽和、分枝又は直鎖のＣ_１−５０アルキレン、シクロアルキレン又は芳香族基であって、所望により鎖内の１以上の炭素がＮ、Ｏ又はＳで置換された前記基を含むことも可能であり、そして場合による置換基は、例えばカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシ、アミノ及び他の基から選択される。２つのスペーサーが結合体に含まれる場合、これらは構造が異なる。スペーサーは、ＣＬが標的組織中で切断された後、抗腫瘍薬物から切断され、それによって臨床上に有効な型の薬物を細胞内で放出するように適応している。本発明の結合体に含まれるのに適したスペーサーには、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら（米国特許第６，２１４，３４５号）及びＫａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９８１）， ２４（５）， ｐｐ４７９−４８０）に記載されるものが含まれる。これらのスペーサーは、細胞内酵素が近づき、そしてリンカーを切断するのを可能にするよう設計されている。これらはまた、リンカーが切断された後、薬物から切断されて、薬物の活性型を形成するようにも設計されている。スペーサーは、結合体が標的細胞又は組織に送達されるまで、化学的に十分に安定に結合し続けるように、ＣＬ、ＤＧ及びＶＢに共有結合している。特定の態様において、スペーサーは、標的細胞又は組織内で、酵素又は他の手段のいずれかによって、細胞内で切断される。スペーサーが切断可能である場合、スペーサーが付着している切断可能なリンカーと同じ手段で又は異なる手段で、スペーサーが切断されることも可能である。あるいは、切断可能リンカーがＶＢ又はＳＰａから細胞内で切断された後、スペーサーは、切断可能リンカー及び／又は抗腫瘍薬物から、実質的にそれ自身を切断するであろう。特定の態様において、細胞内酵素は、まず、ＶＢ−ＳＰａ又はＶＢから、ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ（又はＣＬ−ＤＧ）を放出する。次いで、残った残基ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ（又はＣＬ−ＤＧ）がそれ自身を切断し、それによって、フリーの薬物を細胞内に放出する。酵素切断がまず起こるのであれば、さらなる化学的切断が含まれることも可能であるため、切断は、もっぱら酵素的である必要はない。

リンカーに対する薬物又はコバラミンの結合体化に適した伸長スペーサーには、例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳＳ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ−ＥＧＳ）、ｐ−アミノフェニル酢酸、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）、３，３’−ジチオビス−（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ−ＤＳＴ）、ビス［２−（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）−エチレン］スルホン（ＢＳＯＣＯＥＳ）、ビス［２−（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）−エチレン］スルホン（スルホ−ＢＳＯＣＯＥＳ）、ジメチルアジピイミデート２ＨＣｌ（ＤＭＡ）、ジメチルピメルイミデート２ＨＣｌ（ＤＭＰ）、ジメチルスベルイミデート（ＤＭＳ）が含まれる。

スペーサーが二価官能基である場合、コバラミン、切断可能リンカー又は薬物に、順方向又は逆方向で付着することも可能である。適切な二価官能基には、−ＮＨＮＨ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＣＨ_２−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨＣＨ_２−、−ＮＨＮ＝ＣＨ−、−ＮＨＮＨＣＨ_２−、−ＳＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＮＨＣＲＮＨ−（Ｒは＝Ｏ、＝Ｓ又は＝ＮＨである）、−ＣＯＯ−、又は−ＯＣＯ−が含まれる。

切断可能リンカー「ＣＬ」は、哺乳動物の血漿及び所望により胃腸管における酵素による分解に耐性であるよう意図される。切断可能リンカーは、細胞に取り込まれた後、細胞内切断を経るであろう。ＣＬは、ペプチド又は非ペプチドである。

結合体の要素（ＳＰａ）_ｎ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｍの組み合わせ、及び本明細書記載のその他の態様は、ともに、個々の要素ＳＰａ、ＳＰｂ、及びＣＬ、並びに変数ｎ及びｍの特定の定義によって定義されるような構造を有する、「結合体化単位」を形成する。言い換えると、「結合体化単位」は、（ＳＰａ）_ｎ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｍの許容しうる態様いずれによっても定義されるであろう。

特定の態様にしたがって、本発明の結合体化単位は、カルボキシルアシル単位、及びタンパク質ペプチド配列で作成される。該ユニットはまた、薬物及びタンパク質ペプチド配列間に間隔をあける、自己犠牲スペーサーも含有することも可能である。

結合体の特定の態様において、結合体化単位は、「Ａ−Ｙ−Ｚ−Ｘ−Ｗ」（式ＸＩ）として定義され、式中、「Ａ」は「カルボキシルアシル単位」であり、「Ｙ」及び「Ｚ」は各々アミノ酸であり、そしてともにタンパク質ペプチド配列を形成し、そして「Ｘ」及び「Ｗ」は、個々に、タンパク質ペプチド及び薬物間に間隔をあける自己犠牲スペーサーである。結合体化単位Ａ−Ｙ−Ｚ−Ｘ−Ｗは、結合体化単位（ＳＰａ）_ｎ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｍ及び結合体化単位（ＶＢ−（ＳＰａ^２）（ＳＰａ^１）−ＣＬ−（ＳＰｂ^１）（ＳＰｂ^２）−ＤＧ）のサブセットである。

特定の態様には、式中：
Ｙは、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンからなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸であり、好ましくはフェニルアラニン又はバリンであり；そして
Ｚは、リジン、アセチル又はホルミルで保護されたリジン、アルギニン、トシル又はニトロ基で保護されたアルギニン、ヒスチジン、オルニチン、アセチル又はホルミルで保護されたオルニチン、及びシトルリンからなる群より選択される、少なくとも１つのアミノ酸であり、好ましくはリジン又はシトルリンである
であるものが含まれる。

タンパク質ペプチド配列は、腫瘍細胞中の１以上のプロテアーゼによって結合体から選択的に、酵素的に切断可能であるように、特に調整される。
タンパク質ペプチド配列の鎖の長さは、一般的に、ジペプチドのものからテトラペプチドのものの範囲である。しかし、８アミノ酸残基と同程度に長いタンパク質ペプチド配列もまた使用可能である。

適切で典型的なペプチドリンカー基には、例えば、そして限定なしに、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ、Ｌｅｕ−Ｃｉｔ、Ｉｌｅ−Ｃｉｔ、Ｔｒｐ−Ｃｉｔ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ、Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｎ^９−トシル−Ａｒｇ、及びＰｈｅ−Ｎ^９−ニトロ−Ａｒｇが含まれる。

結合体化単位の多くの特定の態様を設計し、そして特定の腫瘍関連プロテアーゼによる酵素的切断に関する選択性を最適化することも可能である。結合体化単位の特定の態様には、プロテアーゼカテプシンＢ、Ｃ又はＤによる加水分解に最適化されたものが含まれる。

上述のように、結合体化単位は、自己犠牲中間体（ＣＬの切断後、第二の酵素に触媒される切断を必要とせずに、ＤＧからそれ自身を除去するスペーサー）を使用することも可能である。自己犠牲スペーサーは、間隔をあけた２つの化学部分をともに共有結合させて、通常は安定な三分割（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）分子にして、酵素的切断によって、三分割分子から前記の間隔をあけた化学部分の１つを放出し；そして前記酵素切断に続いて、分子の残りから自発的に切断して、前記の間隔をあけた化学部分のもう一方を放出する、二官能化学部分と定義されることも可能である。本発明にしたがって、自己犠牲スペーサーは、第一の末端でタンパク質ペプチド配列に共有結合し、そしてもう一方の末端でＤＧ部分に共有結合し、タンパク質ペプチド配列及び薬物を、間隔をあけて、そして共有結合して、安定であるが、自己犠牲スペーサー及びタンパク質ペプチド配列が共有結合する結合部分で、標的酵素によって酵素的に切断可能であり、それによってタンパク質ペプチド配列の放出が達成される配列にする。こうした酵素切断は、次に、スペーサー部分の自己犠牲特性を活性化し、そして薬物部分への自己犠牲スペーサーの共有結合の、実質的に自発的な切断を開始し、それによって薬理学的に活性である型の薬物の放出を達成する。

式ＸＩの結合体化単位において：
Ｘは自己犠牲スペーサー部分であり、薬物及びペプチドタンパク質配列間に間隔を置いて、そしてこれらをともに共有結合し、ここでスペーサーは、Ｔ部分を介して薬物部分に連結され、そしてスペーサーは、式（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）又は（ＸＶ）の化合物：
ａ）

（式ＸＩＩ）、式中、Ｔは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ又はＳである；
ｂ）−ＨＮ−Ｒ^１−ＣＯＴ（式ＸＩＩＩ）、式中、Ｔは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ又はＳであり、そしてＲ^１はＣ_１−Ｃ_５アルキルである；
ｃ）−ＮＨＣ（ＨＴ）ＣＯ_２Ｒ^２−（式ＸＩＶ；Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２７：１４４７（１９８４））、式中、Ｔは、Ｏ、ＮＨ、Ｎ又はＳであり、そしてＲ^２はＨ又はＣ_１−Ｃ_５アルキルである；又は
ｄ）

（式ＸＶ）
に代表されることも可能であり；あるいは、Ｗはスペーサー部分

（式ＸＶＩ）、式中、Ｔは、Ｏ、Ｓ又はＮＨ、Ｎである。
である。
本明細書において、「Ｃ_１−Ｃ_５アルキル」は、別に記載しない限り、１〜５の炭素原子を有する分枝鎖又は直鎖炭化水素を意味すると解釈され、限定されるわけではないが、メチル、エチル、イソプロピル、ｎ−プロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、及び他の既知のアルキル基が含まれる。

本明細書に詳述するように、ＰＡＢＣ、ＧＡＢＡ（アシル型のγ−アミノ酪酸）、α，α−ジメチルＧＡＢＡ、及びβ，β−ジメチルＧＡＢＡが典型的な自己犠牲スペーサーである。

式（ＸＩ）の結合体化単位において、カルボキシル単位「Ａ」を、ＶＢの５’−Ｏ原子を介して、ＶＢ要素に連結することも可能である。要素「Ａ」の典型的な態様には：
ａ）

ｂ）スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅカタログｐ．Ｅ−１５（１９９２））から製造される

ｃ）ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（Ｐｉｅｒｃｅカタログｐ．Ｅ−１６（１９９２））から製造される

ｄ）スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）（Ｐｉｅｒｃｅカタログｐ．Ｅ−１８（１９９２））から製造される

ｅ）Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）（Ｐｉｅｒｃｅカタログｐ．Ｅ−１７（１９９２））から製造される

が含まれるか；あるいは
「Ａ」は、ペプチドタンパク質配列に、そしてＶＢの５’−Ｏ酸素原子を介してＶＢに共有結合している化合物である。要素「Ａ」の代表的な態様には、例として、そして限定なしに：
ａ）５’−Ｏ−［−（ＣＨ_２）_２−Ｃ（＝Ｏ）−］−；
ｂ）５’−Ｏ−［−ＣＨ（ＣＨ_３）−Ｃ_４Ｈ_４−Ｃ（＝Ｏ）−］−；又は
ｃ）５’−Ｏ−［−（ＣＨ_２）_２−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ_２）_５−Ｃ（＝Ｏ）−］−
が含まれる。

以下の表は、結合体を細胞内で切断するために頼ることが可能な典型的な細胞内酵素を詳述する。以下に詳述する酵素クラス、特定の酵素及び基質のリストは、包括的ではなく、これらの特定の態様の単なる例示である。結合体内に、他の酵素による切断に適した特異的基質を提供することによって、結合体を、他の細胞内酵素ファミリー及び他の特定の細胞内酵素による切断に適応させることも可能である。

・分泌される酵素。特異的に細胞性ではない^＊
・ペプチド構造と対照的にタンパク質基質を用いる酵素^＊＊
ヒト代謝は複雑な性質を持つため、対象に投与された後、結合体を含有する単位用量の一部が、細胞外で切断されることも可能である。細胞に取り込まれ、そして続いて細胞内で切断される結合体の量は、望ましい臨床的利益を提供するのに十分であろうことが意図される。

図１は、本発明にしたがった典型的な結合体を示す。実施例１のプロセスにしたがって製造可能な結合体は、第一のスペーサー（ＳＰｂ）に結合したドキソルビシンを含み、第一のスペーサーは、切断可能リンカー（ＣＬ）に結合し、次いで、該リンカーは第二のスペーサー（ＳＰａ）に結合し、第二のスペーサーが最後に、コバラミン（ＣＢ）のリボース環の５’−ＯＨ部分に結合する。スペーサーの末端アミン基（第一のＳＰａ残基；６−アミノヘキサン酸）は、二価カルボニルラジカル（第二のＳＰａ残基）によって、リボース環の５’−Ｏに結合し、それによってカルバメート連結を形成する。ＳＰａのもう一方の端では、スペーサーのカルボニル基が、アミド結合によって、ペプチドリンカー（ＣＬ；Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢ）の末端アミン、特にリンカーのフェニルアラニン残基の末端アミンに結合する。リンカーのカルボキシ末端は、アミド連結によって、スペーサーＳＰｂ（第一のＳＰｂ残基；パラ−アミノベンジルアルコール）に結合する。次いで、第一のＳＰｂのヒドロキシル基が、二価カルボニルラジカル（第二のＳＰｂ残基）を介して、ドキソルビシン（ＤＯＸ）の一級アミンに結合する。したがって、化合物（１３）は、以下の式：ＶＢ−ＳＰａ^２ＳＰａ^１−ＣＬ−ＳＰｂ^１ＳＰｂ^２−ＤＧ（式ＩＩ）を有する。

結合体（１３）の典型的な合成プロセスを以下の実施例１及び図２に詳述する。合成の第一部は、切断可能リンカーＰｈｅ−Ｌｙｓの調製に関する。合成の第二部は、第一のスペーサー（ＰＡＢＣ）への、そして続いて抗腫瘍薬物（ＤＯＸ）への切断可能リンカーの付着に関する。合成の第三部は、コバラミンへの第二のスペーサーの付着、そして続いて切断可能リンカーのＮ末端への第二のスペーサーのカップリングに関する。

したがって、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓを塩化トリメチルシリルで処理して、カルボキシル保護中間体Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＴＭＳ）ＴＭＳを形成し、これを次いで、塩化ＭＭＴで処理して、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）ＴＭＳを形成し、これをワークアップ中に脱保護して、中間体Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（１）を形成する。この第一の変換反応は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．（２００２）， １３， ８５５−８６９）の方法にしたがって、いかなる中間体の単離も伴わずに、ｉｎ ｓｉｔｕで行う。ジエチルアミンでの処理によって、中間体（１）のＦｍｏｃ保護基を除去して、Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（２）を形成する。Ｆｍｏｃ−ＰｈｅをＮ−ヒドロキシスクシンイミド及びＤＣＣで処理することによって、他の重要な中間体Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（３）を調製する。Ｌｙｓ（ＭＭＴ）及びＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＳｕを、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でカップリングして、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（４）を形成する。ｐ−アミノベンジルアルコールを、エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）の存在下で（４）と反応させることによって、スペーサー（ＰＡＢ；ＳＰｂ^１）の第一の部分を切断可能リンカーに付着させて、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（５）を形成する。中間体（５）をビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（ＰＮＰ）で処理することによって、スペーサーの二価カルボニル部分（ＳＰｂ^２）を形成して、活性化中間体Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（６）を形成する。次いで、ドキソルビシンを活性化中間体（６）と反応させて、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（７）を形成する。中間体（７）をジエチルアミンで処理することによって、ＰｈｅのＮ末端を脱保護して、Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（８；ＣＬ−ＳＰｂ^１ＳＰｂ^２−ＤＧ）を形成する。

シアノコバラミンを１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）（ＣＤＴ）で処理して、トリアゾール活性化シアノコバラミン（４；Ｂ_１２−５’−ＯＣＯ−（１，２，４−トリアゾール））を形成し、これを次いで、スペーサー（ＳＰａ；６−アミノヘキサノイルラジカル）にカップリングして、ＣＢ−ＳＰａ^２残基（１０；Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ_２Ｈ）を形成する。この残基を切断可能リンカーのＮ末端にカップリングする前に、中間体（１０）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドで処理することによってカルボキシル基を活性化して、活性化中間体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯＯＳｕ（１１）を形成する。次いで、２つの重要な中間体（８）及び（１１）を反応させて、保護された結合体（１２）（Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ）を形成して、これを次いで、ジクロロ酢酸で脱保護して結合体（１３）（Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ―Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ）を形成する。

より一般的には、図２に示す合成スキームを以下の工程に要約することも可能である：
＋保護された切断可能リンカーを調製し；
＋切断可能リンカー及びスペーサー（ＳＰｂ）を含む第一の残基を調製し；
＋切断可能リンカー、ＳＰｂ及び抗腫瘍薬物（ＤＧ）を含む第二の残基を調製し；
＋コバラミン及びスペーサー（ＳＰａ）を含む第三の残基を調製し；
＋第二の残基及び第三の残基をカップリングして、本発明記載の結合体を形成する。

第二の残基は、第三の残基の前又は後に形成可能である。
あるいは、図３ａに示す合成スキームにしたがって、本発明の結合体を調製することも可能であり、このスキームは、一般的に以下のように記載することも可能である。ＳＰａ残基を活性化し、そしてＣＬの第一のアミノ酸（ＡＡ_１）残基にカップリングして、ＳＰａ−ＡＡ_１中間体を形成し、これを次いで活性化し、そしてＣＬの第二のアミノ酸（ＡＡ_２）残基と反応させて、ＳＰａ−ＣＬ中間体を形成する。次いで、ＳＰａ−ＣＬ中間体を活性化し、そしてＳＰｂ残基と反応させて、ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ中間体を形成し、これを次いで活性化して、そして抗腫瘍薬物にカップリングして、ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ中間体を形成する。コバラミン（ＶＢ）を活性化し、そしてＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ中間体とカップリングして、式Ｉの化合物であるＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧを形成し、該化合物は、所望により１以上の保護基を含む。

図３ａの合成スキームは、以下のようにより具体的に記載される。Ｆｍｏｃ Ｎ保護６−アミノヘキサン酸をＨＯＳｕで活性化して、反応性中間体（２１）を形成し、これを次いで、Ｐｈｅと反応させて、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ（２２）を形成する。この中間体をＨＯＳｕで活性化して、反応性中間体（２３）を形成して、これを続いて、先に調製しておいたＬｙｓ（ＭＭＴ）と反応させて、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（２４）を形成する。次いで、第二のスペーサーＰＡＢを、リンカーのＣ末端にカップリングして、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（２５）を形成し、これを次いで、（ＰＮＰ）_２ＣＯ（二価カルボニルラジカル前駆体）で活性化して、中間体Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（２６）を形成する。中間体（２６）をＤｏｘとカップリングして、Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（２７）を形成し、次いで、このＮ末端をジエチルアミンで脱保護して、脱保護中間体Ｈ_２Ｎ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（２８）を形成する。コバラミンの５’−ＯＨ部分を、ＣＤＴなどの求電子性二価カルボニルラジカル前駆体で活性化して、Ｂ_１２−５’−ＯＣＯ−（１，２，４−トリアゾール）（９）を形成する。２つの中間体（９及び２８）をカップリングして、保護結合体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（２９）を形成し、これを次いで脱保護して、結合体（１３）を得る。

結合体（１３）はまた、図３ｂに示す合成戦略にしたがっても調製可能である。この場合、中間体Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（５）をＤＥＡで処理して、中間体Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（３１）を形成して、これを次いで、中間体Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５−ＣＯＯＳｕ（２１）と反応させて、中間体Ｆｍｏｃ−ＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（２５）を形成する。次いで、図３ａに示す経路を介して、中間体を望ましい結合体（１３）に変換する。

本明細書に詳述するように、本発明の結合体には、他の抗腫瘍薬物が含まれることも可能である。図４ａは、実施例１４にしたがった、パクリタキセルを含む結合体の調製のための、合成スキームを示す。パクリタキセルには、反応性が異なる３つのヒドロキシ部分が含まれるため、パクリタキセルに関して使用した保護基戦略に応じて、３つのうちいずれか１つにリンカーをカップリングすることによって、結合体を形成することも可能である。例えば、２’−ＯＨを保護基で誘導体化する場合、７−ＯＨによって、パクリタキセルをスペーサー又はリンカーに付着させることも可能である。図４ａの態様において、ピリジンなどの有機塩基の存在下で、パクリタキセルを塩化ＭＭＴで処理して、２’−ヒドロキシル部分をトリチル化し、それによって部分的に保護された中間体（４１；パクリタキセル−２’−ＭＭＴ）を形成する。次いで、中間体（４１）をトリクロロメチルクロロホルメートと反応させて、活性中間体（４２；パクリタキセル−２’−ＭＭＴ−７−ＯＣＯＣｌ）を形成する。この反応性中間体を、次いで、リンカー−スペーサー残基（５；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ；ＣＬ−ＳＰｂ）と反応させて、中間体（４３；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ；ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ）を形成する。次いで、中間体（４３）のＮ末端を例えばＤＢＵで脱保護して、脱保護中間体（４４）を形成し、これにＶＢ−スペーサー残基（１１；ＶＢ−ＳＰａ）をカップリングして、保護結合体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（４５）を形成する。次いで、この中間体を、例えばジクロロ酢酸で脱保護して、結合体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル（４６）を形成する。

図４ａに示す合成スキームを、一般的に、以下のように要約することも可能である。必要に応じて抗腫瘍薬物を保護し、そしてスペーサー（ＳＰｂ）又はリンカー（ＣＬ）の末端を受け入れ可能な二価官能基で誘導体化する。こうして誘導体化した薬物をスペーサー（ＳＰｂ）、リンカー（ＣＬ）、又はスペーサー及びリンカーを含む残基（ＣＬ−ＳＰｂ）と反応させて、中間体ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧを形成する。リンカーの末端を脱保護し（場合による）、そして反応性コバラミン−スペーサー残基（ＶＢ−ＳＰａ）にカップリングして、所望により１以上の保護基を含む式Ｉ（ＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧ）の化合物を形成する。結合体の保護基が存在する場合、所望により、除去しようとする保護基（単数又は複数）の種類にしたがって決定されるような、除去に適した条件を使用して、保護基を除去する。

図４ｂは、実施例１３にしたがった、パクリタキセルを含む結合体の調製のための別の合成スキームを示す。図４ｂの結合体は、スペーサーとのカップリングに際して、パクリタキセルの異なるヒドロキシル基を使用しているため、図４ａの結合体とは異なる。この態様において、先に調製した反応性中間体（６）を、ＤＭＡＰ（有機塩基）の存在下で、パクリタキセルと反応させ、それによってパクリタキセルの２’−ヒドロキシル部分にカップリングして、そして部分的に保護された中間体（１４；Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル）を形成する。中間体（１４）をＤＢＵ（１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）で処理することによって、Ｆｍｏｃ保護基を除去して、部分的に保護された（Ｌｙｓ−保護）中間体（１５；Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル）を形成する。この中間体（１５）を、先に形成した中間体（１１）と反応させることによって、保護された結合体（１６；Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル）を形成する。次いで、Ｎ−保護された結合体を、例えばジクロロ酢酸で脱保護して、脱保護結合体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ_２）_５ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１７）を形成し、該化合物は、塩として又は遊離塩基型で単離可能である。

図４ｂに示す合成スキームを、一般的に、以下のように要約することも可能である。脱保護抗腫瘍薬物を、リンカー（ＣＬ）に共有結合したスペーサー（ＳＰｂ^１）を含む中間体に結合したアシル官能（ＳＰｂ^２）基で誘導体化する。こうして誘導体化された薬物を、スペーサー（ＳＰａ^２）（ＳＰａ^１）に共有結合したコバラミンを含む別の中間体と反応させて、１以上の保護基を含む、式ＶＩＩ（ＶＢ−（ＳＰａ^２）（ＳＰａ^１）−ＣＬ−（ＳＰｂ^１）（ＳＰｂ^２）−ＤＧ）を形成する。結合体の保護基が存在する場合、所望により、除去しようとする保護基（単数又は複数）の種類にしたがって決定されるような、除去に適した条件を使用して、保護基を除去して、それによって、式ＶＩＩの化合物の脱保護型を形成する。

図５は、本発明記載の結合体を調製する、別の代替合成スキームを示す。ＶＢ１２をエチル４−イソシアナートベンゾエートと反応させて、コバラミン−スペーサー中間体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯ−ＰＡＰＣ−ＯＥｔ（５１）を形成する。次いで、この中間体を炭酸カリウムで脱エステル化して、遊離酸ＯＨ（５２）を形成する。遊離酸をＨＯＳｕ及びＤＣＣで活性化して、反応性中間体（５３）を形成し、これをリンカー−スペーサー−薬物中間体Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（８）とカップリングして、保護された結合体Ｂ_１２−５’−ＯＣＯ−ＰＡＰＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（５４）を形成する。次いで、保護された結合体をジクロロ酢酸で脱保護して、Ｂ_１２−５’−ＯＣＯ−ＰＡＰＣ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（５５）を形成する。

図５に示す合成戦略を、より一般的に、以下のように表すことも可能である。コバラミンをスペーサーにカップリングすることによって、コバラミン−スペーサー残基（ＶＢ−ＳＰａ）を調製する。切断可能リンカーＣＬ、又は残基ＣＬ−ＳＰｂを該残基に付着させ、それぞれ、中間体ＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ又はＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂを形成する。中間体ＶＢ−ＳＰａ−ＣＬが形成されたならば、これをさらに処理して、中間体ＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂを形成する。次いで、薬物をＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ中間体に付着させて、式Ｉの結合体ＶＢ−ＳＰａ−ＣＬ−ＳＰｂ−ＤＧを形成する。出発材料、残基及び中間体は、場合により、必要に応じて、１以上の保護基を含む。結合体の保護基が存在する場合、所望により、除去しようとする保護基（単数又は複数）の種類にしたがって決定されるような、除去に適した条件を使用して、保護基を除去する。類似の方式で、必要に応じて、出発材料、残基及び中間体の保護基を付加し、そして除去して、カップリング反応の調節を可能にすることも可能である。

本明細書の合成スキームを考慮して、結合体の合成をコバラミン、薬物、スペーサー又はリンカーから開始することも可能である。次いで、結合体の残りの部分を連続して（一度に１、２、又は３回）カップリングして、最終結合体を形成する。

１より多い反応性官能基を有する薬物、スペーサー、リンカー及びコバラミン（本明細書に開示されるすべての型）が周知である。これらの例を本明細書に開示する。式Ｉの化合物の多様な構成要素（ＶＢ、ＳＰａ、ＣＬ、ＳＰｂ、及びＤＧ）のカップリング中、ときには、保護基化学反応を使用して、反応性官能基のいくつかを保護しながら、他の官能基でカップリング反応が起こるのを可能にする必要がある。この目的に向けて、合成戦略によって必要とされる場合、知られる保護基いずれかが、続くカップリング反応において必要に応じて機能し、そして分離されるのに十分に安定であるならば、こうした保護基いずれかを使用することも可能である。典型的な保護基が本明細書に開示され、そしてこれらには、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第３版（Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（１９９９））、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊ．Ｆ．Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ監修， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ． Ｃｏｒｐ．（１９７３））；及び“Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｖｏｌ． ３， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ニューヨーク（１９８１）に列挙されるものが含まれ、これらの文献の開示は、本明細書に援用される。

本明細書において、用語「アミン保護基」（又は「Ｎ保護された」）は、アミン基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる基も指す。本明細書において、用語「アミン保護基試薬」は、アミンと反応して、アミン保護基で保護されたアミンを提供可能な、アミン基の保護のため、有機合成の技術分野で知られるいかなる試薬も指す。典型的なアミン保護基には、限定されるわけではないが、以下：１）ホルミル、トリフルオロアセチル、フタリル、及びｐ−トルエンスルホニルなどのアシル型；２）ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）及び置換ベンジルカルボニル、１−（ｐ−ビフェニル）−１−メチルエトキシカルボニル、及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などの芳香族カルバメート型；３）ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、エトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、及びアリルオキシカルボニルなどの脂肪族カルバメート型；４）シクロペンチルオキシカルボニル及びアダマンチルオキシカルボニルなどの環状アルキルカルバメート型；５）トリフェニルメチル及びベンジルなどのアルキル型；６）トリメチルシランなどのトリアルキルシラン；並びに７）フェニルチオカルボニル及びジチアスクシノイルなどのチオール含有型が含まれる。

アミン保護基には、限定されるわけではないが、以下：２，７−ジ−ｔ−ブチル−［９−（１０，１０−ジオキソ−１０，１０，１０，１０−テトラヒドロチオ−キサンチル）］メチルオキシカルボニル；２−トリメチルシリル−エチルオキシ−カルボニル；２−フェニルエチルオキシカルボニル；１，１−ジメチル−２，２−ジブロモエチルオキシカルボニル；１−メチル−１−（４−ジフェニリル）エチルオキシカルボニル；ベンジルオキシカルボニル；ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル；２−（ｐ−トルエンスルホニル）−エチルオキシカルボニル；ｍ−クロロ−ｐ−アシルオキシベンジルオキシカルボニル；５−ベンジルイソキサゾリル−メチルオキシカルボニル；ｐ−（ジヒドロキシボリル）ベンジルオキシカルボニル；ｍ−ニトロフェニルオキシカルボニル；ｏ−ニトロベンジルオキシカルボニル；３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；３，４−ジメトキシ−６−ニトロベンジルオキシ−カルボニル；Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル−アミノカルボニル；ｔ−アミルオキシカルボニル；ｐ−デシルオキシベンジルオキシ−カルボニル；ジイソプロピルメチルオキシカルボニル；２，２−ジメトキシカルボニルビニルオキシカルボニル；ジ（２−ピリジル）メチルオキシカルボニル；２−フラニルメチルオキシ−カルボニル；フタルイミド；ジチアスクシンイミド；２，５−ジメチルピロール；ベンジル；５−ジベンジルスベリル；トリフェニルメチル；ベンジリデン；ジフェニルメチレン；又はメタンスルホンアミドが含まれることも可能である。

本明細書において、用語「カルボキシル保護基」は、カルボキシル基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる基も指す。カルボキシル保護基の例には、限定されるわけではないが、以下：１）メトキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジルオキシメチル、Ｎ−フタルイミドメチルなどの置換メチルエステル型；２）２，２，２−トリクロロエチル、２−メチルチオエチル、ｔ−ブチルエチル、シンナミルエチル、ベンジルエチル、２（２’−ピリジル）エチルなどの２−置換エチルエステル型；３）トリフェニルメチル、９−アントリルメチル、ｐ−ニトロベンジル、４−ピコリル、２，４，６−トリメチルベンジルなどの置換ベンジルエステル型；４）トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェニルジメチルシリルなどのシリルエステル型；５）オキサゾール、オルトエステルなどの雑多な型；６）Ｎ，Ｎ−ジメチル、ピペリジニル、ピロリンジニルなどのアミド型；及び７）アルキル化ヒドラジドなどのヒドラジド型が含まれる。

本明細書において、用語「ヒドロキシ保護基」（又は「Ｏ保護された」）は、ヒドロキシル基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる基も指す。本明細書において、用語「ヒドロキシ保護基試薬」は、ヒドロキシと反応して、ヒドロキシ保護基で保護されたヒドロキシ基を提供可能な、ヒドロキシ基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる試薬も指す。ヒドロキシ保護基は、塩基安定性であり、そしてこれらには、限定されるわけではないが、アシル型、芳香族カルバメート型及びアルキル型が含まれることも可能である。例は、メチル、メトキシメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、ｔ−ブトキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭ）、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、ｔ−ブチル、トリフェニルメチル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、ピバロエート又はＮ−フェニルカルバメートである。

適切なヒドロキシ保護基には、エーテルとしての以下の保護基：テトラヒドロピラニル、トリフェニルメチル、ベンジル、テトラヒドロフラニル、アリル、メトキシメチル（ＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル、ｐ−メトキシベンジルオキシメチル、２−トリメチルシリルエトキシメチル（ＳＥＭ）、ｔ−ブトキシメチル、メチルチオメチル、２−メトキシエトキシメチル、トリクロロエトキシメチル、ｔ−ブチル、ｐ−メトキシベンジル、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ｐ−ニトロベンジル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルが含まれることも可能である。

本明細書において、用語「スルフィドリル保護基」（又は「Ｏ保護された」）は、スルフィドリル基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる基も指す。本明細書において、用語「スルフィドリル保護基試薬」は、スルフィドリルと反応して、スルフィドリル保護基で保護されたスルフィドリル基を提供可能な、スルフィドリル基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる試薬も指す。適切なスルフィドリル保護基には、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第３版（Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（１９９９））、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊ．Ｆ．Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ監修， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ． Ｃｏｒｐ．（１９７３））に開示される、スルフィドリル基が保護されているジスルフィド結合を形成可能な、別のスルフィドリル含有化合物及び他のものが含まれる。

本明細書において、用語「ケトン保護基」（又は「Ｏ保護された」）は、ケトン基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる基も指す。本明細書において、用語「ケトン保護基試薬」は、ケトンと反応して、ケトン保護基で保護されたケトン基を提供可能な、ケトン基の保護のため、有機合成の技術分野に知られるいかなる試薬も指す。適切なケトン保護基には、環状アセタール、及びＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， 第３版（Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ監修， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ニューヨーク（１９９９））、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｊ．Ｆ．Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ監修， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ． Ｃｏｒｐ．（１９７３））に開示されるものが含まれる。

本明細書に記載する化合物は、非対称中心を有することも可能である。すべてのキラル、ジアステレオマー、及びラセミ型が本発明に含まれる。オレフィン、Ｃ＝Ｎ二重結合等の多くの幾何異性体もまた、本明細書記載の化合物に存在可能であり、そしてこうした安定な異性体すべてが本発明に意図される。本発明の特定の化合物が、非対称に置換された炭素原子を含有し、そして光学活性型又はラセミ型で単離可能であることが認識されるであろう。当該技術分野には、ラセミ型を分割することによるか、又は合成によるなどで、光学活性出発物質から、光学活性型を調製する方法が周知である。また、本発明の化合物のシス及びトランス幾何異性体が記載され、そして異性体の混合物として、又は分離された異性体型として、単離可能であることも認識される。特定の立体化学又は異性体型が具体的に示されない限り、構造のすべてのキラル、ジアステレオマー、ラセミ型、及びすべての幾何異性体型が意図される。

変数いずれか（例えば、Ｒ、ｍなど）が、化合物の構成要素又は式いずれかにおいて、１より多く存在する場合、各存在の定義は、他のすべての存在に際しての定義とは独立である。したがって、例えば、基が０〜３のＲで置換されると示される場合、前記基は、所望により、３までのＲで置換され、そしてＲは、それぞれの存在に際して、ありうるＲの定義されるリストから、独立に選択される。また、置換基及び／又は変数の組み合わせは、こうした組み合わせが安定な化合物を生じる場合のみ、許容性である。安定な化合物又は安定な構造によって、本明細書において、反応混合物からの有用な度合いの純度への単離に耐えるために十分に頑強な化合物を意味する。同様に、例として、基−Ｃ（Ｒ）−に関しては、Ｃ上の２つのＲ置換基は各々、ありうるＲの定義されるリストから、独立に選択される。

本発明の結合体は、固形腫瘍及び白血病を含む、いかなる種類の癌の治療又は治療の開発にも有用であり、こうした腫瘍及び白血病には、例えば：アプドーマ、分離腫、鰓腫、悪性カルチノイド症候群、カルチノイド心疾患、癌腫（例えばウォーカー癌、基底細胞癌、基底扁平細胞癌、ブラウン−ピアース癌、管癌、エーリッヒ腫瘍、ｉｎ ｓｉｔｕ癌、クレブス２癌、メルケル細胞癌、粘液性癌、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、乳頭状癌、硬癌、細気管支癌、気管支癌、扁平上皮癌、及び移行上皮癌）、組織球性傷害、白血病（例えばＢ細胞白血病、混合細胞白血病、ヌル細胞白血病、Ｔ細胞白血病、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、リンパ球性急性白血病、リンパ球性慢性白血病、マスト細胞白血病、及び骨髄性白血病）、悪性組織球増加症、ホジキン病、免疫増殖性小、非ホジキンリンパ腫、プラズマ細胞腫、細網内皮増殖症、黒色腫、軟骨芽腫、軟骨腫、軟骨肉腫、線維腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、組織球腫、脂肪腫、脂肪肉腫、中皮腫、粘液腫、粘液肉腫、骨腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、滑膜腫、線維腺腫、線様リンパ腫、癌肉腫、脊索腫、頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫、間葉腫、中腎腫、筋肉腫、エナメル芽細胞腫、セメント腫、歯牙腫、奇形腫、胸腺腫、絨毛性腫瘍、線癌、線腫、胆管腫、コレステリン腫、円柱腫、嚢胞腺癌、嚢腺腫、顆粒膜、男女性胚腫、肝癌、汗腺腫、島細胞腫、ライディッヒ細胞腫、乳頭腫、セルトリ細胞腫、卵胞膜腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、筋原細胞腫、筋腫、筋肉腫、横紋筋腫、横紋筋肉腫、上衣細胞腫、筋神経腫、神経膠腫、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、副神経節腫、非クロム親和性副神経節腫、角化血管腫、好酸球増加症を伴う血管リンパ過形成、硬化性血管腫、血管腫症、グロムス血管症、血管内皮腫、血管腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫、松果体腫、癌肉腫、軟骨肉腫、葉状嚢肉腫、線維肉腫、血管肉腫、平滑筋肉腫、白血肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、卵巣癌、横紋筋肉腫、肉腫（例えばユーイング肉腫、実験肉腫、カポジ肉腫、及びマスト細胞肉腫）、新生物（例えば骨、乳房、消化器系、結腸直腸、肝臓、膵臓、下垂体、精巣、眼窩内、頭部及び首部、中枢神経系、聴覚、骨盤、呼吸管、及び泌尿生殖器の新生物）、神経線維腫症、及び頸部形成異常が含まれ、そして本発明の結合体は、細胞が不死化されるか又は形質転換されている他の状態の治療に有用である。結合体を、化学療法、凍結療法、加温療法、放射線療法等の他の療法様式と組み合わせて投与することも可能である。

用語「増殖の調節」は、本明細書において、温血動物における、増殖中の腫瘍の増殖及び転移を遅延させるか、中断させるか、抑止するか、又は停止することを意味する；別の細胞傷害性抗腫瘍剤の付加された効果を伴うか、又は伴わないか、いずれかで、結合体を用いた、温血動物における治療（腫瘍増殖の調節）は、必ずしも、腫瘍組織が破壊されるか、又は完全に除去されるという意味での「治療法」を提供しないことも可能であることが理解される。しかし、実験的に、いくつかの腫瘍組織は、完全に除去されている。

抗腫瘍剤を個々に、又は組み合わせて、患者に投与可能であることが一般的に知られる。さらに、抗腫瘍剤を他の抗腫瘍療法と組み合わせて用いることも可能である。例えば、抗腫瘍剤を、腫瘍の外科的切除、あるいは放射線療法、免疫療法又は局所熱療法と組み合わせて投与することも可能である。腫瘍を治療するため、こうした併用療法を使用する場合、腫瘍を治療するのに有効であることが当該技術分野に知られる投薬量で、抗腫瘍剤を投与することも可能である。あるいは、療法に１より多い抗腫瘍剤を用いる場合、剤の一方又は両方が、特定の腫瘍に対して、他の剤との相加効果又は相乗効果を生じることも可能である。したがって、こうした併用抗腫瘍療法を用いた場合、投与する抗腫瘍剤の一方又は両方の投薬量は、該抗腫瘍剤を単独で用いた場合に投与されるよりも少ないことも可能である。したがって、併用抗腫瘍剤を、単独で用いた場合に比較して、より低い投薬レベル又はより低い頻度で投与することも可能である。

抗腫瘍薬物（ＤＧ）は、化学療法剤としても知られ、１以上の型の癌又は腫瘍に対して生物学的活性を有し、そして有効性を過剰に失わずに、切断可能リンカー（ＣＬ）又は場合によるスペーサー（ＳＰｂ）に連結させることも可能な化合物である。適切な抗腫瘍薬物には、抗新生物剤、アンドロゲン阻害剤、抗生物質、抗エストロゲン、代謝拮抗剤、細胞傷害剤、免疫調節剤、ナイトロジェンマスタード、ステロイド、アルキル化剤、抗有糸分裂剤、植物アルカロイド、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、生物学的産物、ＤＮＡ損傷剤、代謝拮抗剤、天然産物及びその類似体、ホルモン、アンタゴニスト酵素阻害剤、抗腫瘍剤の他の種／型、望ましい生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチド、腫瘍療法の当業者に知られる他のもの、並びにこれらの組み合わせが含まれる。

本発明の適切な抗腫瘍化合物の典型である化合物を以下のリストに詳述する。抗腫瘍化合物の有効性（細胞傷害性）が認められている腫瘍（単数又は複数）を括弧内に囲む。以下に示す抗腫瘍薬物のフリーの型は、示した腫瘍に対して活性であることが知られるが、本発明の結合体は、類似の、異なる、より広い又はより狭い範囲の活性を有する可能性もある。したがって、結合体の抗腫瘍活性は、対応するフリーの薬物に関して示した腫瘍のみに必ずしも限定されない。

ナイトロジェンマスタード：メクロレタミン（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、シクロホスファミドイホスファミド（急性及び慢性リンパ球性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽細胞腫、乳房、卵巣、肺、ウィルムス腫瘍、子宮頸、精巣、軟組織肉腫）、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）（多発性骨髄腫、乳房、卵巣）、クロラムブシル（慢性リンパ球性白血病、原発性マクログロブリン血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）。

エチレンイミン及びメチルメラミン：ヘキサメチルメラミン（卵巣）、チオテパ（膀胱、乳房、卵巣）。
スルホン酸アルキル：ブスルファン（慢性顆粒球性白血病）。

ニトロソ尿素：カルムスチン（ＢＣＮＵ）（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、原発性脳腫瘍、多発性骨髄腫、悪性黒色腫）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、原発性脳腫瘍、小細胞肺癌）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）（原発性脳腫瘍、胃癌、結腸癌）、ストレプトゾシン（ストレプトゾシン）（悪性膵臓島細胞腫、悪性カルシノイン（ｃａｒｃｉｎｏｉｎ））。

トリアゼン（ｔｒｉａｚｅｎｅｓ）：ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミド−アゾールカルボキサミド−）（悪性黒色腫、ホジキン病、軟組織肉腫）。
葉酸類似体：メトトレキセート（アメトプテリン）（急性リンパ球性白血病、絨毛癌、菌状息肉腫、乳房、頭部及び首部、肺、骨原性肉腫）。

ピリミジン類似体：フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵＤＲ）（乳房、結腸、胃、膵臓、卵巣、頭部及び首部、膀胱、前癌性皮膚病変）（局所）、シタラビン（シトシンアラビノシド）（急性顆粒球性及び急性リンパ球性白血病）
プリン類似体及び関連阻害剤：メルカプトプリン（６−メルカプトプリン：６−ＭＰ）（急性リンパ球性白血病、急性顆粒球性白血病及び慢性顆粒球性白血病）、チオグアニン（６−チオグアニン：ＴＧ）（急性顆粒球性白血病、急性リンパ球性白血病及び慢性顆粒球性白血病）、ペントスタチン（２’−デオキシコホルマイシン（ｄｅｏｘｙｃｙｏｆｏｒｍｙｃｉｎ））（有毛細胞白血病、菌状息肉腫、慢性リンパ球性白血病）。

ビンカアルカロイド：ビンブラスチン（ＶＬＢ）（ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、乳房、精巣）、ビンクリスチン（急性リンパ球性白血病、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、小細胞肺癌）
エピポドフィロトキシン（Ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌ−ｌｏｔｏｘｉｎ）：エトポシド（精巣、小細胞肺癌及び他の肺癌、乳房、２５ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性顆粒球性白血病、カポジ肉腫）、テニポシド（精巣、小細胞肺癌及び他の肺癌、乳房、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性顆粒球性白血病、カポジ肉腫）。

抗増殖／抗生物質：ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）（絨毛癌、ウィルムス腫瘍、横紋筋肉腫、精巣、カポジ肉腫）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）（急性顆粒球性白血病及び急性リンパ球性白血病）、ドキソルビシン（軟組織肉腫、骨原性肉腫、及び他の肉腫；ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性白血病、乳房、尿生殖器、甲状腺、肺、胃、神経芽細胞腫）、ブレオマイシン（精巣、頭部及び首部、皮膚及び食道、肺、及び尿生殖管、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、プリカマイシン（ミトラマイシン）（精巣、悪性高カルシウム血症）、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）（胃、子宮頸、結腸、乳房、膵臓、膀胱、頭部及び首部）。

酵素：Ｌ−アスパラギナーゼ（急性リンパ球性白血病）。
生物学的反応修飾剤：インターフェロン−アルファ（有毛細胞白血病、カポジ肉腫、黒色腫、カルチノイド、腎細胞、卵巣、膀胱、非ホジキンリンパ腫、菌状息肉腫、多発性骨髄腫、慢性顆粒球性白血病）。

エストロゲン：ジエチルスチベストロールエチニルエストラジオール（乳房、前立腺）。
抗エストロゲン：タモキシフェン（乳房）。

アンドロゲン：プロピオン酸テストステロン、フルキソミエステロン（Ｆｌｕｘｏｍｙｅｓｔｅｒｏｎｅ）（乳房）。
抗アンドロゲン：フルタミド（前立腺）。

ゴナドトロピン放出ホルモン類似体：ロイプロリド（前立腺）。
白金配位複合体：シスプラチン（シス−ＤＤＰ）、カルボプラチン（精巣、卵巣、膀胱、頭部及び首部、肺、甲状腺、子宮頸、子宮内膜、神経芽細胞腫、骨原性肉腫）。

アントラセンジオン：ミクストザントロン（Ｍｉｘｔｏｚａｎｔｒｏｎｅ）（急性顆粒球性白血病、乳房）。
置換尿素：ヒドロキシ尿素（慢性顆粒球性白血病、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、悪性黒色腫）。

メチルヒドラジン誘導体：プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）（ホジキン病）。
副腎皮質抑制剤：ミオタン（Ｍｉｏｔａｎｅ）（ｏ，ｐ’−ＤＤＤ）（副腎皮質）、アミノグルテチミド（乳房）。

アデノコルチコステロイド：プレドニゾン（急性及び慢性リンパ球性白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキン病、乳房）。
プロゲスチン：カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール（ｍｅｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）（子宮内膜、乳房）。

本発明記載の結合体を、単独で、又は１以上の抗腫瘍剤と組み合わせて、投与することも可能である。本発明記載の結合体と組み合わせて使用可能な細胞傷害性抗腫瘍剤の実例となる例には、癌細胞に対して細胞傷害性及び有効性を有することが知られるいかなる剤も含まれる。

本発明の結合体は、リンカー又はスペーサーが共有結合することも可能な官能基を含む抗腫瘍薬物を含む。そうでなければ、こうした官能基を含むように抗腫瘍薬物を誘導体化することも可能である。当業者は、本発明の結合体を調製する目的で、より好適にその化合物の反応を行うため、望ましい化合物に化学的修飾を行うことも可能である。抗腫瘍薬物が、スペーサー又は切断可能リンカーが共有結合することも可能な少なくとも１つの官能基を含むか、あるいは含むように誘導体化されることも可能である限り、本質的にいかなる抗腫瘍薬物も結合体化に適している。結合体を形成可能な抗癌薬物の官能基は、一級又は二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、カルボキシル、ヒドラジド、ニトリル、アルデヒド又はケトンから選択可能である。そうでなければ、薬物は、芳香族炭素、不飽和結合、又は不飽和結合に隣接する炭素などの、誘導体化可能部位を含むことも可能である。

代表的なアミノ含有薬物には、例として、そして限定なしに、アシビシン、アメタントロン、アミノプテリン、９−アミノカンプトテシン、Ｎ^８−アセチルスペルミジン、アクチノマイシン、アゾトマイシン、ビスナフィド、ブレオマイシン、カルビシン、１−（２−クロロエチル）１，２−ジメタンスルホニルヒドラジド、クリスナトール、ダウノルビシン、ドキソルビシン、デザグアニン、エフロルニチン、エルサミトルシン、エピルビシン、エソルビシン、エキサテカン、イダルビシン、メルファラン、メルカプトプリン、マイトマイシンＡ、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ノコダゾール、ペルデシン、ペプロマイシン、ピューロマイシン、タリソマイシン、チアミプリン、チオグアニン、バプレオチド、ゾルビシン、アミノグルテチミド、アザシチジン、ブロピリミン、シタラビン、ダクチノマイシン、エダトレキセート、エトプリン、フェンレチニド、フルダラビン、ゲムシタビン、メトトレキセート、メトプリン、ピリトレキシム、ポルフィロマイシン、トリシリビン、トリメトレキセート、並びにこれらの類似体及び誘導体が含まれる。

代表的なアルコール（ヒドロキシル）含有薬物には、例えば、そして限定なしに、オーグイジン、Ｎ−（５，５−ジアセトキシペンチル）ドキソルビシン、アクラルビシン、アメタントロン、アパジキオン、アザシチジン、ビカルタミド、カルステロン、カンプトテシン、カルビシン、カルゼレシン、クリスナトール、シタラビン、１，８−ジヒドロキシ−ビシクロ［７．３．１］トリデカー４，９−ジエン−２，６−ジイン−１３−オン（米国特許第５，１９８，５６０号）、エルサミトルシン、エピルビシン、エスペラミシン、エソルビシン、エトポシド、エキサテカン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルロシタビン、ホストリエシン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、レンチナン、ロイプロリド、メイタンシン、メノガリル、ミトキサントロン、モテキサフィンガドリニウム、モルホリン−ドキソルビシン、ペプロマイシン、プリカマイシン、ポドフィロトキシン、プレドニムスチン、ピューロマイシン、ピラゾフューリン、リボプリン、ストレプトゾシン、パクリタキセル、テニポシド、チアゾフューリン、トポテカン、トリシリビン、トリプトレリン、ウレデパ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビングリシネート、ビンロシジン、ビンゾリジン、ゾルビシン、ビゼレシン、ドロロキシフェン、フェンレチニド、ミコフェノール酸、マソプロコール、テモポルフィン、トポテカン、並びにこれらの類似体及び誘導体が含まれる。

代表的なスルフィドリル含有薬物には、例えば、そして限定なしに、エスペラミシン及び６−メルカプトプリン、並びにこれらの類似体及び誘導体が含まれる。
代表的なカルボキシル含有薬物には、例えば、そして限定なしに、アシビシン、アゾトマイシン、ブレキナール、酪酸、カルベチマー、カンプトテシン（ラクトンの開環型）、クロラムブシル、エダトレキセート、エフロルニチン、メルファラン、メトトレキセート、ミコフェノール酸、レチノイン酸、チオグアニン、ベルテポルフィン、並びにその類似体及び誘導体が含まれる。

代表的なアルデヒド又はケトン含有薬物には、例えば、そして限定なしに、アクラルビシン、アングイジン、アントラサイクリン、カルステロン、カルビシン、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、メゲストロール、ノコダゾール、オキシスラン、プロメスタン、プレドニムスチン、テストラクトン、チオグアニン、トレストロン、並びにその類似体及び誘導体が含まれる。

代表的なヒドラジン含有薬物には、例えば、そして限定なしに、プロカルバジンが含まれる。
新生物疾患の治療において、細胞傷害剤と組み合わせて結合体を投与する場合、細胞傷害剤の療法効果が、増強される可能性もある。細胞傷害剤が生じる寛解が増進され、そして腫瘍組織の再増殖が遅延されるか又は妨げられることも可能である。こうした併用療法の使用によって、細胞傷害剤をより少数の用量で、又はより少量の個々の用量で、使用することが可能になる。したがって、細胞傷害剤の有害な、そして／又は衰弱させる副作用が最小限になる一方、同時に、抗腫瘍効果が増進される。用語「併用療法」は、細胞傷害剤療法開始前の、こうした療法と同時の、又はこうした療法停止後の期間中の、結合体の投与を意味する。

本発明の特定の態様にしたがって、患者を結合体で、毎日１〜１０回、１日おき、半週ごと、毎週、隔週、毎月、隔月、又は半年ごとに、治療する。結合体での治療を、例えば１〜３６５日の期間、続けることも可能である。上述のように、結合体の投与様式又は投薬措置は、対応するフリーの薬物のものに近い可能性もある。１つの態様において、結合体はフリーの薬物より増進した臨床的利点を提供する。本発明の修飾法には、結合体の時間的及び空間的に離れた投与が含まれる。例えば、望ましい臨床的終点が達成されるまで、一定期間、結合体を反復投与することも可能である。治療中の医師は、抗腫瘍療法の技術分野で容易に利用可能な方法を用いて、望ましい臨床的終点を決定することが可能であろう。特定の態様において、結合体の第一の治療単位を投与し、そして対象を、第一の期間、観察する。次いで、結合体の第二の治療単位を、第二のそして間隔をあけた期間に始まって、投与することも可能である。第一の治療単位及び第二の治療単位間の時間間隔は、上述のとおりであることも可能である。

こうした併用療法が、腫瘍の寛解を生じ、そしてすべての腫瘍細胞が破壊されるのではない場合、該結合体又は別の抗腫瘍薬物を用いた連続治療又は反復治療によって、腫瘍の再増殖を、無期限に妨げるか、又は遅延させることも可能である。各場合で、医師が個々の患者の状態を考慮して、有効で、そして毒性でない投薬量を決定することも可能である。

本明細書に詳述する多様な経路を介して、結合体を患者に投与して、望ましい効果を達成することも可能である。投与する化合物量は、広い範囲に渡って多様であろうし、そしていかなる有効量であることも可能である。治療しようとする患者、治療しようとする状態の重症度、投与様式、投薬措置、患者の健康状態、患者の応答及び使用する特定の結合体に応じて、投与する化合物の有効量は多様であろう。結合体を用いた最初の療法の指針として、フリーの（非結合化（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ））薬物の典型的に投与される投薬量を考慮して、結合体の最初の用量が、フリーの薬物のモル量を近似する（０．５〜２．０倍）ようにする。例えば、フリーの薬物が、１日あたり、体重ｋｇあたり、約０．１ｍｍｏｌの用量で投与されるならば、１日あたり、体重ｋｇあたり、約０．０５〜０．２ｍｍｏｌの用量で、結合体を投与することも可能である。結合体投与のためのこの指針は、実際の療法用量が知られていないが、対応するフリーの薬物の典型的な療法用量が知られている結合体に関して、したがうことも可能である。結合体の最適用量は、対応する非結合化抗腫瘍薬物のモル量の約０．００１〜約１００倍、約０．０１〜約１０倍、約０．０１〜約２倍、又は約０．１〜約４倍の範囲であることも可能である。

本明細書において、用語、患者は、哺乳動物などの温血動物、例えばイヌ、ラット、マウス、ネコ、モルモット、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヒトを意味すると解釈される。
増殖中の腫瘍組織の増殖速度を調節するための結合体の有効性を、標準的ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ動物腫瘍モデルで評価することも可能である。例えば、結合体の抗腫瘍効果を以下の動物腫瘍モデルで立証することも可能である：（ａ）マウスにおけるＬ１２１０白血病；（ｂ）Ｂａｌｂ／ＣマウスにおけるＥＭＴ６腫瘍；（ｃ）ラットにおける７，１２−ジメチルベンズアントラセン誘導性（ＤＭＢＡ誘導性）乳房腫瘍；（ｄ）バッファローラットにおけるモリス７２８８Ｃ又は５１２３肝癌；（ｅ）及び他のもの。さらに、多様な細胞傷害剤と組み合わせた際の結合体の抗腫瘍効果を、同じモデル又は他のモデルで立証することも可能である。

いくつかの異なる細胞種中のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイにおいて、結合体（１３）を評価して、癌及び腫瘍細胞株に対する活性を確立した。多様な濃度のドキソルビシン又は結合体（コバラルビシン２００と示す）で処理した後、ｉｎ ｖｉｔｒｏで残っている生存細胞の割合を決定した。既定のインキュベーション期間後の生存細胞数が減少していることによって、抗癌活性又は抗腫瘍活性が陽性であることが示される。一般的に、ｉｎ ｖｉｔｒｏの薬物濃度を増加させると、殺傷される細胞の率がより高くなり、そしてしたがって、生存する細胞の割合が低下する。フリーの薬物対結合体の活性を決定する際に、等モル濃度の薬物を比較する。

図６ａ〜６ｄは、４つの細胞株に対するコバラルビシン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。図６ａは、ヒト乳癌細胞株由来の細胞であるＭＣＦ−７細胞に対する結合体の結果を示すグラフである。図６ｂは、ヒトコーカソイド乳腺癌細胞株由来の細胞であるＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する結合体の結果を示すグラフである。図６ｃは、ヒト前骨髄球性白血病細胞株由来の細胞であるＨＬ−６０細胞に対する結合体の結果を示すグラフである。図６ｄは、ヒト脳神経芽細胞腫（神経上皮腫）細胞株由来の細胞であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対する結合体の結果を示すグラフである。使用したアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存度アッセイであり、該アッセイは、当該技術分野において、細胞生存度に対する化合物の影響を予測すると認識される。該アッセイを実施例４〜７に詳述する。例外を伴わず、Ｐｒｏｍｅｇａ社に記載される方法（技術告示、第２８８号）にしたがった。結果によって、コバラルビシン２００が、ドキソルビシンと同じ有効性を有し、そしてドキソルビシンよりわずかにより強力でないことが示唆された。

図６ｅ〜６ｈは、４つの細胞株に対するコバラタキセル結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示す。図６ｅは、ヒト乳癌細胞株由来の細胞であるＭＣＦ−７細胞に対する結合体（１７、図４ｂ）の結果を示すグラフである。図６ｆは、ヒトコーカソイド乳腺癌細胞株由来の細胞であるＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する結合体（１７）の結果を示すグラフである。図６ｇは、ヒト結腸腺癌細胞株由来の細胞であるＨＴ−２９細胞に対する結合体（４６、図４ａ）の結果を示すグラフである。図６ｈは、ヒト乳癌細胞株由来の細胞であるＭＸ−１細胞に対する結合体（４６）の結果を示すグラフである。使用したアッセイを実施例１５に詳述する。結果によって、コバラタキセル、特に試験した２つの態様が、パクリタキセルと同じ有効性を有し、そしてパクリタキセル（パクリタキセル）よりわずかにより強力でないことが示唆された。

図７は、正常ネズミリンパ節細胞に対する結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。使用したアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存度アッセイであり、該アッセイは、当該技術分野において、細胞生存度に対する化合物の影響を予測すると認識される。該アッセイを実施例８に詳述する。例外を伴わず、Ｐｒｏｍｅｇａ社に記載される方法（技術告示、第２８８号）にしたがった。結果によって、コバラルビシン−２００が、正常細胞に対して、ドキソルビシンと同じ有効性を有し、そしてドキソルビシンよりわずかにより強力でないことが示唆された。

ドキソルビシンの切断及び放出が、コバラルビシン−２００の活性に重要であるかどうかを試験するため、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対するＢ１２−ドキソルビシン（図１ｂ；「酵素切断安定性」ドキソルビシン−コバラミン結合体（本発明にしたがわない））の活性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生存度アッセイで試験した。図８は、ヒト脳神経芽細胞腫（神経上皮腫）細胞株由来の細胞であるＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対する安定結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。使用したアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存度アッセイであり、該アッセイは、当該技術分野において、細胞生存度に対する化合物の影響を予測すると認識される。図８は、実施例９にしたがって行ったアッセイの結果を示す。例外を伴わず、Ｐｒｏｍｅｇａ社に記載される方法（技術告示、第２８８号）にしたがった。Ｂ１２−ドキソルビシン（安定）は、カテプシンによって切断不能であり、そしてその結果、有意な量のドキソルビシンは細胞内で放出されない。このグラフは、切断されないＢ１２−ドキソルビシン結合体が、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対して、ほとんど又はまったく細胞傷害性又は有効性を所持しないことを示す。対照的に、切断可能リンカーを有する結合体（１３）は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対して、非常に有効である（図６ｄを参照されたい）。結果によって、十分な細胞傷害活性が存在するためには、リンカーを切断して、Ｂ１２からのドキソルビシンの放出を可能にしなければならないことが示される。

ＭＸ−１ヒト乳癌異種移植片を有する無胸腺マウスを３群に分けて、そしてフリーのドキソルビシン対照、生理食塩水対照及びコバラルビシンいずれかで処置した、ｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおいてもまた、結合体（１３）の有効性を確立した。実施例３にしたがって、このｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。比較は、投与後の日数に対する腫瘍サイズに基づいた。図９に示す結果は、結合体がフリーの薬物よりはるかに高い有効性を有することを示す。単一用量の結合体を投与した約２〜４週間後、腫瘍サイズの実質的な減少が観察された。

本発明の発明者らは、本発明記載の結合体が、腫瘍細胞株に対して高い有効性（細胞傷害性）を有するが、宿主に対して軽減された全身毒性を提供することを発見した。該結合体を、対応するフリーの抗腫瘍薬物よりも、モル基準で（ｏｎ ａ ｍｏｌａｒ ｂａｓｉｓ）、より高い用量で投与することも可能である。結合体（１３）を、フリーのドキソルビシンのものよりも、モルに基づいて、少なくとも２．３倍高い用量で投与して、そしてなお、より少ない全身毒性及び改善された臨床上の利点を示すことも可能である。フリーのドキソルビシンをドキソルビシン結合体と同じ高モル用量で投与すると、フリーのドキソルビシンではマウスが死亡したが、ドキソルビシン結合体では死亡しなかった。したがって、本発明は、コバラミンの５’−ＯＨ結合体としての抗腫瘍薬物を投与することによって、抗腫瘍薬物の全身毒性を減少させる方法であって、コバラミン−５’−Ｏ−抗腫瘍薬物結合体が、モル基準で非結合化抗腫瘍薬物に比較した際、対象に対して、軽減された全身毒性を示す、前記方法を提供する。本発明はまた、抗腫瘍薬物の最大許容用量を増加させる方法であって、コバラミンの５’−ＯＨ結合体として抗腫瘍薬物を投与する工程を含み、コバラミン−５’−Ｏ−抗腫瘍薬物結合体が、モル基準で非結合化抗腫瘍薬物に比較した際、対象に対して、軽減された全身毒性を示し、そして結合体の最大許容用量が、モル基準で非結合化抗腫瘍薬物の最大許容用量より高い、前記方法も提供する。

図１０は、実施例１０の方法にしたがって、マウスにおいて、結合体（１３）の最大許容用量（ＭＴＤ）を決定する研究結果のグラフを示す。結合体を、１日あたり、体重ｋｇあたり、６、１２、３２、４８又は６４ｍｇ（ｍｇ／ｋｇ／日）の用量で投与した。図１０に示す結果は、平均体重損失パーセントによって測定されるように、いくぶん不規則ではあるが、用量が増加するにつれて毒性が増加する、明らかな傾向を示した。このデータによって、結合体は、約４８ｍｇ／ｋｇ／日までの用量でよく許容されたことが示唆される。別個の研究において、非結合化ドキソルビシンのＭＴＤが、結合体のものより、モル基準で少なくとも２．３倍低いことが決定された。

実施例１１にしたがって、結合体及びドキソルビシンを２周期で投与する研究を行って、無胸腺マウスにおけるＭＸ−１ヒト乳癌異種移植片に対する、結合体及びフリーの抗腫瘍薬物の腫瘍増殖遅延及び腫瘍サイズ減少効果を決定した。研究日数９０日でのこの研究の結果を図１１に示す。結果によって、結合体での２周期の治療が、腫瘍サイズを減少させて、そして腫瘍増殖を遅延させるのに非常に有効であったことが示される。未処置群は、終点まで、２７．１日の中央値を示し、これは処置群より有意に短い日数であり、部分的後退、完全後退又は長期腫瘍不含生存を発展させるメンバーはなかった。体重変化は有意でなく、そして処置関連又は未処置関連の死亡はなかった。２周期、３ｍｇ／ｋｇ／日のドキソルビシン処置群は、処置に反応し、対照マウスより、終点までの時間が少なくとも４４日長かった。２周期２４ｍｇ／ｋｇのバイオ結合体での第４群のマウスの処置は、最大達成可能９０日の中央値ＴＴＥを生じ、第１群の対照に比較して、非常に有意な６２．５日（２２７％）のＴＧＤに相当した（Ｐ＜０．０００１）。第４群の１０匹の動物はすべて、完全な腫瘍後退、反応を示し、そして７匹はさらに、長期腫瘍不含生存に分類された。第４群は、フィッシャーの正確な検定によって、ドキソルビシン処置動物より、有意により完全な後退反応を示した（Ｐ＝０．０００７）。図１１は、第４群の腫瘍体積中央値が、第４０日までに検出不能レベルに減少し、そして研究の残りの間、検出不能のままであったことを示す。第４群の生存は、第９０日で１００％であった。最大体重損失は１０％であり、処置関連又は未処置関連の死亡はなかった。

単一周期研究からのデータ（実施例３）を表にし、そして簡潔に図１２ａに示す。同様に、２周期研究からのデータ（実施例１１）を表にし、そして簡潔に図１２ｂに示す。いずれの型のドキソルビシンの投与も、対照動物に比較して、体重損失において有意な変化を引き起こしたが、結合体型のドキソルビシンの量を増加させても（２．３倍増加）、さらなる毒性とは関連しなかった。実施例１１に記載する研究は、２周期のドキソルビシンが体重に及ぼす劇的な効果を例示する。ドキソルビシン又はバイオ結合体いずれかでの処置は、有意な体重損失を引き起こした。しかし、結合体で処置した動物は、天然ドキソルビシンを投与した群より、体重損失からより早く回復する傾向があり、これは結合体中のドキソルビシンの同等用量が２倍高い場合も当てはまった。結果によって、結合体が、天然（非結合化、フリーの）ドキソルビシンの用量の２倍より高い（又は約２．３倍）の用量で投与されていてさえ、結合体（１３）の性能が、投与された用量のフリーのドキソルビシンのものと似た経過をたどる（ｔｒａｃｋｓ）ことを示す。

薬物配合の技術分野で用いられる化合物が、一般的に、多様な機能又は目的を果たすことを理解しなければならない。したがって、本明細書に挙げた化合物が一度しか言及されていないか、又は本明細書において１より多い用語を定義するのに用いられていても、その目的又は機能は、挙げられた目的（単数又は複数）又は機能（単数又は複数）のみに限定されると見なしてはならない。

本明細書において、「薬学的に許容しうる塩」は、酸性塩又は塩基性塩を製造することによって療法化合物が修飾されている、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容しうる塩の例には、限定されるわけではないが、薬学的活性剤のミネラル又は有機酸塩が含まれる。薬学的に許容しうる塩には、慣用的な非毒性塩、例えば非毒性無機酸又は有機酸由来のものが含まれる。例えばこうした慣用的な非毒性塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルホン酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸等の無機酸由来のもの；並びにアミノ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸、及び薬物科学の一般の当業者に知られる他のものなどの有機酸から調製される塩が含まれる。適切な塩のリストは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第１８版（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ． Ｇｅｎｎａｒｏ監修；Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ペンシルバニア州イーストン， １９９０）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ 第１９版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， １９９５）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ， 第３版（Ａｒｔｈｕｒ Ｈ．Ｋｉｂｂｅ監修；Ａｍｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃ．， １９９９）；ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｄｅｘ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ 第１２版（Ｗａｌｔｅｒ Ｌｕｎｄ監修；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ， ロンドン， １９９４）；Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）；及びＧｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｌｏｕｉｓ Ｓ． Ｇｏｏｄｍａｎ及びＬｅｅ Ｅ． Ｌｉｍｂｉｒｄ監修；ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， １９９２）などの教科書に見られ、これらの文献は本明細書に援用される。

句「薬学的に許容しうる」は、本明細書において、確かな医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、あるいは他の問題又は合併症を伴わずに、合理的な利益／リスク比に相応して、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適している、化合物、材料、組成物、及び／又は投薬型を指す。抗腫瘍又は抗癌薬物は、腫瘍又は癌細胞に対して本質的に細胞傷害性である。しかし、投与される対象に過度な全身毒性を伴わずに意図される臨床上の利益を提供する限り、こうした薬物を含有する組成物又は投薬型は、なお、薬学的に許容しうると見なされる。全身毒性の許容しうるレベルは、腫瘍及び癌療法の分野に知られる原理にしたがって、決定されるであろう。

用語「有効量」によって、例えば薬物に関して、臨床上有効量が意図されることが理解される。臨床上有効量は、必要な又は望ましい療法反応を引き出すのに十分な結合体又は抗腫瘍薬物の量であり、あるいは言い換えると、患者に投与した際、認識しうる望ましい臨床的反応を引き出すのに十分な量である。

以下の例は、包括的と見なすべきではなく、本発明に意図される多くの態様のいくつかの例示にすぎないと見なすべきである。本明細書記載の方法にしたがって、本発明記載の結合体を調製することも可能である。

モデル６００制御装置及び２９９６ ＰＤＡ検出装置を備えた、Ｄｅｌｔａ ６００ポンプを含むＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ系を、分析研究及び分取研究両方に用いた。水及びアセトニトリル中の０．１％酢酸を、それぞれ水性緩衝液及び有機緩衝液として用いた。Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ_１８ １５μｍ １００Å ３．９ｘ３００ｍｍカラム（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０１１７９７）及び１ｍｌ／分の流速を分析研究に用い；Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ放射圧縮Ｃ_１８ １５μｍ １００Å ２５ｘ１００ｍｍカラム（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０１１７９７）及び２０ｍｌ／分の流速を分取研究に用いた。陽イオンモードで、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＰＩ ２０００エレクトロスプレー質量分析装置上で、マススペクトルを獲得した。

以下の方法を用いて、図１の典型的なドキソルビシン−ＶＢ結合体を調製した。
工程１．Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（１）
室温の塩化メチレン（７５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（５．１０６７ｇ、１３．８６１８ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌懸濁物に、塩化トリメチルシリル（３．８ｍｌ、２９．７３１２ｍｍｏｌ、２．１４当量）を添加した。混合物を５０℃で１時間還流し、そして反応混合物中の固体の外見が変化した。氷槽中で冷却した後、ＤＩＥＡ（７．５ｍｌ、４３．０５６１ｍｍｏｌ、３．１１当量）を添加し、混合物が均質になり、そして次に、ｐ−アニシルジフェニルメチルクロリド（４．４９５５ｇ、１４．５５８０ｍｍｏｌ、１．０５当量）を添加した。橙赤色の溶液を室温で一晩（２０時間）攪拌した。溶媒を除去した後、残渣を、酢酸エチル（２００ｍｌ）及びｐＨ５緩衝液（０．０５Ｍフタル酸、１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．０に調整）の間で分配した。有機相をさらにｐＨ５緩衝液（５０ｍｌｘ２）、水（５０ｍｌｘ１）、塩水（５０ｍｌｘ２）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を除去してそして真空で乾燥させた後、９．７３３６ｇの淡黄色の泡を得た。

工程２．Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（２）
室温の塩化メチレン及びアセトニトリル（１：１）の混合物１００ｍｌ中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（９．７３３６ｇ）の攪拌溶液に、ジエチルアミン（１００ｍｌ）を添加した。混合物を室温で１．５時間攪拌した。溶媒を除去した後、残渣を６０℃のアセトニトリル（９０ｍｌｘ２）で勢いよく洗浄し、アセトニトリル（２０ｍｌｘ３）及びエーテル（２０ｍｌｘ３）で洗浄した。次いで、１：１のＣＨ_２Ｃｌ_２／ＣＨ_３ＯＨ（２００ｍｌ）中に、固体を可能な限り溶解し、そしてろ紙を通じてろ過することによって、何らかの固体副産物を除去した。溶媒を除去し、そして真空で乾燥させた後、４．７７０７ｇ（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓに基づくと８２．２％）の淡黄色の泡を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１４７（Ｌｙｓ＋１）、２７３（ＭＭＴ）。

工程３．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（３）
氷槽中で冷却された、塩化メチレン（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ（１．９４４２ｇ、５．０１８６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．６０９５ｇ、５．２９５９ｍｍｏｌ、１．０６当量）の懸濁物に、ＤＣＣ（１．０８８０ｇ、５．２７３１ｍｍｏｌ、１．０５当量）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。生じたＤＣＵをろ過によって除去し、そしてろ液を濃縮し、そして真空で乾燥させて、２．７６６４ｇの白色泡を得た。

工程４．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（４）
ＤＭＦ（３０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＳｕ（２．０７０２ｇ、４．２７２８ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＬｙｓ（ＭＭＴ）（１．７９９５ｇ、４．２９９５ｍｍｏｌ、１．０１当量）の攪拌懸濁物に、ＤＩＥＡ（１．５ｍｌ、８．６１１２ｍｍｏｌ、２．０２当量）を添加した。固体は次第に溶解し、そして溶液を室温で一晩攪拌した。反応混合物を、酢酸エチル（１００ｍｌ）及びｐＨ５緩衝液（０．０５Ｍフタル酸、１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．０に調整、２００ｍｌ）の間で分配した。さらに酢酸エチル（５０ｍｌｘ２）で水溶液を抽出した。合わせた有機相を塩水（５０ｍｌｘ３）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去し、そして真空で乾燥させた後、３．３０１４ｇ（９８．１％）の淡黄色の泡を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：５１６（Ｍ−ＭＭＴ＋１）、２７３（ＭＭＴ）。

工程５．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（５）
塩化メチレン（２０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）（３．３０１４ｇ、４．１８９８ｍｍｏｌ、１．０当量）及び４−アミノベンジルアルコール（０．６２１９ｇ、５．０４９５ｍｍｏｌ、１．２１当量）の攪拌溶液に、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（１．５５８９ｇ、６．３０３７ｍｍｏｌ、１．５０当量）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、残渣にエーテル（５０ｍｌ）を加えてすりつぶした（ｔｒｉｔｕｒａｔｅｄ）。混合物を室温で２時間静置し、そして生じた固体を収集し、エーテル（１５ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させた。２．１０７１ｇ（５６．３％）の白色固体を得た。エーテルろ液を濃縮した。残渣をベンゼン（１０ｍｌ）に懸濁し、そしてヘキサン（１０ｍｌ）で沈殿させた。このプロセスをさらに２回反復した。生じた固体を収集し、ベンゼン／ヘキサン（１：１、１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させた。さらに０．８８６４ｇ（２３．７％）の白色固体を得た。総収率：８０．０％。ＥＳ（＋）−ＭＳ：８９３（Ｍ）、９１５（Ｍ＋Ｎａ）、８１０（Ｍ−ＰＡＢＯＨ＋Ｎａ）、２７３（ＭＭＴ）。

工程６．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（６）
塩化メチレン（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（１．１１８２ｇ、１．２５２０ｍｍｏｌ、１．０当量）及びビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１．９１０２ｇ、６．２７９２ｍｍｏｌ、５．０２当量）の攪拌溶液に、ＤＩＥＡ（０．６５ｍｌ、３．７３１５ｍｍｏｌ、２．９８当量）を添加した。黄色溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、残渣を酢酸エチル（１５０ｍｌ）に溶解し、ｐＨ５緩衝液（０．０５Ｍフタル酸、１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．０に調整）（１００ｍｌｘ１、５０ｍｌｘ１）、塩水（５０ｍｌｘ２）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカカラム（２．４ｘ２０ｃｍ）で精製し、ＣＨ_２Ｃｌ_２／エーテル（９：１〜８：２）で溶出し、０．８０２７ｇ（６０．６％）の淡黄色の泡を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１０５８（Ｍ）、７８６（Ｍ−ＭＭＴ）、２７３（ＭＭＴ）。

工程７．Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（７）
Ｎ−メチルピロリジノン（１５ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（０．６４１４ｇ、０．６０６１ｍｍｏｌ、１．０当量）及びドキソルビシン塩酸（０．３４６５ｇ、０．５９７４ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌溶液に、ＤＩＥＡ（０．１２ｍｌ、０．６８８９ｍｍｏｌ、１．１５当量）を添加した。赤色溶液を暗所（アルミニウムホイルにくるむ）中、室温で一晩攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍｌ）で希釈し、水（１００ｍｌｘ１、５０ｍｌｘ２）、塩水（５０ｍｌｘ１）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカカラム（２．４ｘ１９ｃｍ）で精製し、塩化メチレン中の５％メタノールで溶出して、０．８７００ｇ（９９．６％）の赤色ガラス状固体を得た。

工程８．Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（８）
塩化メチレン（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（０．６４７２ｇ）の攪拌懸濁物に、ジエチルアミン（１２．５ｍｌ）を添加した。混合物は濃茶色に変色し、そして固体が溶解した。これを室温で３時間攪拌した。溶媒を除去した後、塩化メチレン（４ｍｌ）中に残渣を溶解し、そして攪拌エーテル溶液（１００ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、エーテル（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させて、０．５２９２ｇ（９６．４％）の橙赤色固体を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１２４１．２（Ｍ＋１）、９６８．８（Ｍ−ＭＭＴ＋１）。

工程９．Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯ−（１，２，４−トリアゾール）（９）
ＤＭＳＯ（３０ｍｌ）中のシアノコバラミン（２．０３８０ｇ、１．５０３６ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌溶液に、１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）（０．３７５９ｇ、２．２９０３ｍｍｏｌ、１．５２当量）を添加した。混合物を室温で３０分間攪拌し、そして次いで、ＣＨ_２Ｃｌ_２／エーテル（１：１、２００ｍｌ）の攪拌混合物に添加した。生じた沈殿物を収集し、アセトン（５０ｍｌｘ３）及びエーテル（５０ｍｌｘ１）で洗浄し、真空で乾燥させて、２．３７０６ｇの赤色粉末を得た。

工程１０．Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯＯＨ（１０）
上記中間体９を、ＤＭＳＯ（３０ｍｌ）中の６−アミノヘキサン酸（０．２１８０ｇ、１．６６２０ｍｍｏｌ、１．１１当量）及びＤＩＥＡ（０．５４ｍｌ、３．１００ｍｍｏｌ、２．０６当量）の攪拌懸濁物に添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。グラスウールを通じて反応混合物をろ過して、未反応６−アミノヘキサン酸を取り除いた。ろ液をＣＨ_２Ｃｌ_２／エーテル（１：１、２００ｍｌ）の攪拌混合物に添加した。生じた沈殿物を収集し、アセトン（５０ｍｌｘ３）及びエーテル（５０ｍｌｘ１）で洗浄し、真空で乾燥させて、２．３５６２ｇの赤色粉末を得た。シリカカラムで精製し、水で溶出して、１．３５４６ｇ（５９．６％）の赤色粉末を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１５１３．８（Ｍ＋１）。

工程１１．Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯＯＳｕ（１１）
ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中の化合物１０（０．５７０６ｇ、０．３７７２ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２７８９ｇ、２．４２３３ｍｍｏｌ、６．４２当量）の攪拌溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（１．０ｍｌ、６．３８６７ｍｍｏｌ、１６．９３当量）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。反応混合物を、１００ｍｌの攪拌エーテル／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１）に添加した。生じた沈殿物を収集し、アセトン（１０ｍｌｘ２）、エーテル（１０ｍｌｘ２）で洗浄し、真空で乾燥させた。０．６３１４ｇの赤色粉末を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１６１０．７（Ｍ＋１）。

工程１２．Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（１２）
ＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中の化合物８（０．５４００ｇ、０．４３５３ｍｍｏｌ、１．０当量）及び化合物１１（０．８４９１ｇ、０．５２７５ｍｍｏｌ、１．２１当量）の溶液を室温で１時間攪拌した。次いで、反応混合物を１００ｍｌの攪拌エーテル／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１）に添加し、生じた沈殿物を収集し、アセトン（１５ｍｌｘ２）、塩化メチレン（１５ｍｌｘ２）及びエーテル（１５ｍｌｘ２）で洗浄し、真空で乾燥させた。１．１０４０ｇ（９２．７％）の赤色粉末を得た。ＥＸ（＋）−ＭＳ：１３６８．３［（Ｍ＋１）／２］。

工程１３．Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−Ｄｏｘ（１３）
メタノール（１５ｍｌ）、水（１５ｍｌ）及び塩化メチレン（１５ｍｌ）中の化合物１２（０．５７１５ｇ、０．２０９０ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌懸濁物に、アニソール（２．４ｍｌ、２１．９７１５ｍｍｏｌ、１０５．１当量）及びジクロロ酢酸（１．８ｍｌ、２１．９０３５ｍｍｏｌ、１０４．９当量）を添加した。混合物を室温で２時間攪拌した。ＨＰＬＣは、大部分の出発材料が消費されたことを示した。回転蒸発装置を用いて、有機溶媒を除去した。残渣を水（５０ｍｌ）で希釈した。水相を分液漏斗に注いだ。粘着性固体をエーテル（２５ｍｌｘ３）でリンスし、メタノールに溶解し（４ｍｌ）、攪拌エーテル（１００ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、エーテル（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させて、０．２３５３ｇの赤色粉末を得た。水相をエーテル（２５ｍｌｘ３）で抽出した。回転蒸発装置を用いて、水溶液に溶解した有機溶媒を除去した。水溶液を遠心分離し、そしてＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｔＣ１８カートリッジ（Ｐ／Ｎ ＷＡＴ０３６８１０）を用いて脱塩した。未精製産物の別の一部（０．２６２ｇ）を得た。ＨＰＬＣによって未精製産物を精製して、８５．６ｍｇ（１６．６％）の赤色粉末を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１２３２．３［（Ｍ＋１）／２］。

以下の方法を用いて、カテプシンＢによる、抗腫瘍結合体、特に（１３）の切断可能性を確認した。ドキソルビシン−ＣＢ結合体（１３）を含有する結合体ストック溶液（水中の５％ＤＭＳＯ）（１．０ｍＭ）を調製した。カテプシンＢ（ヒト肝臓；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、＃２１９３６４；ＭＷ：２７５００；比活性：２７４単位／ｍｇタンパク質、５単位）を３２．１μｌのＮａＯＡｃ（２０ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ５．０）に入れた。次いで、カテプシンＢ １μｌを、４μｌの３０ｍＭ ＤＴＴ／１５ｍＭ ＥＤＴＡで、室温で１５分間活性化した。この溶液を６６５μｌの２５ｍＭ ＮａＯＡｃ／１ｍＭ ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ５．０、あらかじめ３７℃にインキュベーション）で希釈して、酵素ストック溶液を調製した。９６μｌの酵素ストック溶液を１μｌの結合体ストック溶液と混合し、そして３７℃で６０分間インキュベーションした。最終濃度：［カテプシンＢ］＝３０ｎＭ、［基質］＝１０μＭ。定期的に試料採取し、そして続いてＨＰＬＣ解析する（緩衝液Ａ：０．１％ＨＯＡｃ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル、２０分間に渡って２０〜５０％Ｂ、４９５ｎｍで監視、Ｂ１２−Ｐｈｅ−Ｌｙｓに関してはＴｒ＝７．２分、ドキソルビシンに関してはＴｒ＝１５．８分、そして基質に関してはＴｒ＝１８．８分）ことによって、反応の度合いを監視した。典型的な結果は、６０分間で結合体の８３％が切断されることを示した。

類似の方法を用いて、カテプシンＢによる、本発明記載の結合体の切断可能性を評価することも可能である。他の細胞内酵素による切断可能性を評価するため、特定の酵素いずれかの天然基質を、本発明の結合体と交換することを例外として、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙと題する一連の書籍などの教科書に記載されるようなアッセイにしたがうことも可能である。腫瘍治療のための結合体のさらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ評価を行うことを保証するには、この酵素による結合体の切断を確認すれば十分である。

以下の方法を用いて、腫瘍増殖、特に無胸腺マウスのＭＸ−１ヒト乳癌異種移植片の増殖遅延に対する、コバラミン−ドキソルビシン結合体の影響を調べた。メスヌードハーランマウスの横腹に、１ｍｍ^３のＭＸ１固形腫瘍断片を皮下移植する。移植及び増殖の適用前（ｐｒｅ−ｄｏｓｅ）の段階の間に、まず、腫瘍を週２回監視し、そして次いで新生物が８０〜１２０ｍｇの望ましいサイズに近づくにつれて、毎日監視する。大部分の腫瘍が、標的とされる重量範囲（８０〜１２０ｍｇ）に到達したら、未処置、３ｍｇ／ｋｇ／日ｘ５日間の静脈内ドキソルビシン（活性対照）、６４ｍｇ／ｋｇ／日ｘ５日間の静脈内バイオ結合体及び３２ｍｇ／ｋｇ／日ｘ５日間の静脈内バイオ結合体で構成される、各１０匹の４つの処置群に、マウスをペアマッチさせる。ペアマッチの日、第１日に、試験物品を投与した。腫瘍増殖遅延終点は、マウス上の腫瘍が１．５ｇ重量に到達した際であり、腫瘍重量は、式：腫瘍重量（ｍｇ）＝ｗ^２ｘｌ／２ｘ１ｍｇ／ｍｍ^３、式中、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ）及びｌ＝長さ（ｍｍ）である、によって概算される。各処置群に関して、終点までの時間の中央値を計算する。この研究の結果を図９に示す。未処置群は、終点までの時間が１７．８日の中央値を示し、部分的後退、完全後退又は長期腫瘍不含生存を発展させたメンバーはなかった。体重変化は無視できる程度であり、そして処置関連又は未処置関連の死亡はなかった。ドキソルビシン（活性対照、３ｍｇ／ｋｇ／日）での処置は、３９．５日の腫瘍増殖遅延中央値を生じ、対照より２１．７日増加した（１２２％）。部分的又は完全腫瘍後退、及び長期腫瘍不含生存もなかった。平均体重損失は、第９日に−１０．５％観察され、他の処置関連又は未処置関連の死亡はなかった。６４ｍｇ／ｋｇ／日の処置群は、重症の毒性を発展させ、そして第４日で終結させた。３２ｍｇ／ｋｇ／日の処置群は処置に反応し、終点までの時間の中央値は６２．１日であり、対照よりも４４．３日長く、そしてドキソルビシン活性対照よりも２２．６日長かった。研究経過に渡って、この群の６匹のマウスが、完全後退を発展させ、そして４匹は、長期腫瘍不含生存者であった。最大体重損失は、第９日で観察され、−８．４％であり、処置関連又は未処置関連の死亡はなかった。

ＭＣＦ−７細胞に対するドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。結果を図６ａに詳述する。ＭＣＦ−７細胞株をＡＴＣＣから得て、そして５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションした。ＧｌｕｔａＭＡＸ、高グルコース、ピリドキシン塩酸を含み、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含まず、そして１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、並びにさらなる２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ダルベッコの修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で、ＭＣＦ−７細胞を維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり５０００細胞の最初の密度で、ＭＣＦ−７細胞を植え付けた。

水中の５％ＤＭＳＯ中で調製したドキソルビシン及びコバラルビシン−２００ストック及びストック溶液を、−２０℃で保存し、そして遮光した。１００μＭから減少して１０ｎＭまでの１０倍希釈を含む６つの最終濃度で、各化合物を試験した。１０ｘストック溶液を作成し、そして細胞を含有する３つのウェルそれぞれに、１０μｌを添加した。細胞を蒔いてからおよそ２４時間後、化合物を添加した。未処理対照細胞には、１０μｌの５％ＤＭＳＯを添加した。培地のみを含有する３つのウェルもまた、バックグラウンド対照として含んだ。プレートを３７℃インキュベーターに戻した。

９６時間後、Ｐｒｏｍｅｇａのアッセイを用いて、細胞生存度に対するドキソルビシン及びコバラルビシン−２００の影響を決定した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存度アッセイは、培養中に存在するＡＴＰ量を定量化し、ＡＴＰ量は、代謝的に活性な細胞と相関する。ＡＴＰ濃度に依存する発光を、Ｗａｌｌａｃ ＭｉｃｒｏＢｅｔａ（登録商標）ＪＥＴ液体シンチレーション及び発光計測装置上、個々のウェル各々に関して測定した。培地のみを含有する３つのウェルの平均発光値を生データから減じて、補正した値を得た。高濃度のドキソルビシン及びＢ１２−Ｓ−ｄｏｘの赤色によって生じるバックグラウンドを補正するため、１０又は１００μＭで処理した細胞に関して、減じるバックグラウンドは、ただ培地のみのものではなく、１０又は１００μＭのドキソルビシン又はＢ１２−Ｓ−ｄｏｘを含む培地の発光であった。同じ濃度の化合物を添加したウェルの３つの補正値を平均し、そして標準偏差を計算した。未処理細胞を１００％生存と見なすことによって、細胞生存度パーセントを計算した。補正した発光値を、未処理細胞の補正平均発光値で割り、そして１００を乗じて細胞生存度パーセントを得た。３つ組ウェルの平均細胞生存度パーセント及び標準偏差を計算した。このデータを、平均細胞生存度パーセント（平均生存度％）対化合物濃度としてプロットした。

ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対するドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。結果を図６ｂに示す。ＳＫ−ＢＲ−３細胞株をＡＴＣＣから得て、そして５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションした。ＧｌｕｔａＭＡＸ、高グルコース、ピリドキシン塩酸を含み、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含まず、そして１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、並びにさらなる２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ダルベッコの修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）中で、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり１００００細胞の最初の密度で、ＳＫ−ＢＲ−３細胞を植え付けた。実施例４に記載するように、生存度アッセイ及び続く計算を行った。

ＨＬ−６０細胞に対するドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。結果を図６ｃに示す。ＨＬ−６０細胞株をＡＴＣＣから得て、そして５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションした。ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含み、１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ＲＰＭＩ培地１６４０中で、ＨＬ−６０細胞を維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり５０００細胞の最初の密度で、ＨＬ−６０細胞を植え付けた。実施例４に記載するように、生存度アッセイ及び続く計算を行った。

ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対するドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。結果を図６ｄに示す。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞株をＡＴＣＣから得て、そして５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションした。アールの塩、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含み、そして１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、並びにさらなる２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり２００００細胞の最初の密度で、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を植え付けた。実施例４に記載するように、生存度アッセイ及び続く計算を行った。

正常ネズミリンパ節細胞に対するドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。リンパ球を、５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションし、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含み、１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）及びペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ＲＰＭＩ培地１６４０中で維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり１．５ｘ１０^５細胞の最初の密度で、細胞を植え付けた。実施例４に記載するように、生存度アッセイ及び続く計算を行った。

ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対するカテプシン切断安定性ドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価のため、以下の方法を用いた。結果を図８に示す。ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞株をＡＴＣＣから得て、そして５％ＣＯ_２とともに、３７℃でインキュベーションした。アールの塩、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含み、そして１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、並びにさらなる２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、最小必須培地（ＭＥＭ）中で、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を維持した。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり２００００細胞の最初の密度で、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞を植え付けた。

水中の５％ＤＭＳＯ中で調製したドキソルビシン及びＢ１２−ドキソルビシン（安定）ストック及びストック溶液を、−２０℃で保存し、そして遮光した。１００μＭから減少して１０ｎＭまでの１０倍希釈を含む６つの最終濃度で、各化合物を試験した。１０ｘストック溶液を作成し、そして細胞を含有する３つのウェルそれぞれに、１０μｌを添加した。実施例４に記載するように、生存度アッセイ及び続く計算を行った。

以下の方法を用いて、チャールズリバーヌード（無胸腺）マウスにおいて、ビタミンＢ１２−ドキソルビシン結合体の最大許容用量を調べた。５つの群の各５匹のマウスの体重を測定し、そして次いで、最初の連続５日間、静脈内結合体の１日用量を投与した；用量レベルは、８、１６、３２、４８及び５４ｍｇ／ｋｇ／日であった。投与第１日（初回投与）から始まって、週２回、マウスの体重を測定することによって、そして臨床的徴候及び症状に関して頻繁に検査することによって、全体の毒性を評価した。マウスにおける癌化学療法のＭＴＤのＮＣＩ定義を、この研究に採用した。望ましいＭＴＤは、１０％以下の最大平均体重損失を仲介し、そして毒性による死亡がない、薬物用量である。ＭＴＤの上限は、群において、平均２０％の体重損失を引き起こし、そして１０匹の動物あたり１匹が死亡する、用量である。１日１回、連続５日間、投薬した後、さらに５日間、動物を監視して、再発及び潜在毒性に対処した。

以下の方法を用いて、特に２周期投薬措置を用いた無胸腺マウスにおけるＭＸ−１ヒト乳癌異種移植片の治療のため、結合体の腫瘍増殖遅延効果を調べた。メスヌードハーランマウスの横腹に、１ｍｍ^３のＭＸ１固形腫瘍断片を皮下移植する。移植及び増殖の適用前の段階の間に、まず、腫瘍を週２回監視し、そして次いで新生物が８０〜１２０ｍｇの望ましいサイズに近づくにつれて、毎日監視する。大部分の腫瘍が、標的とされる重量範囲（８０〜１２０ｍｇ）に到達したら、各１０匹の５つの処置群に、マウスをペアマッチさせる。２周期処置の効果に関するこの例の目的のため、３群からのデータを示す：未処置、３ｍｇ／ｋｇ／日（第１日〜５日、第２１日〜２５日）の静脈内ドキソルビシン及び２４ｍｇ／ｋｇ／日（第１日〜５日、第２１日〜２５日）の静脈内バイオ結合体。第１日とするこの日に、試験物品投与を開始した。腫瘍増殖遅延終点は、マウス上の腫瘍が１．５ｇ重量に到達した際であり、腫瘍重量は、式：腫瘍重量（ｍｇ）＝ｗ^２ｘｌ／２ｘ１ｍｇ／ｍｍ^３、式中、ｗ＝腫瘍の幅（ｍｍ）及びｌ＝長さ（ｍｍ）である、によって概算される。各処置群に関して、終点までの時間の中央値を計算する。

以下の方法を用いて、腫瘍所持マウスにおけるドキソルビシン処置に関連する体重損失及び回復を調べた。この解析は、実施例３及び１１に明記する有効性研究の一部であった。マウスにおける癌化学療法のＭＴＤのＮＣＩ定義を指針として用いて、動物における病的状態（ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ）の重症度を評価する。許容度の上限は、２０％の体重損失である。腫瘍を測定する際、同時に動物の体重を測定した。

以下の方法を用いて、図４ｂの典型的なパクリタキセル−ＶＢ結合体を調製した。
Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１４）
塩化メチレン（１０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−ＰＮＰ（０．６５５９ｇ、０．６１９８ｍｍｏｌ、１．０当量）及びパクリタキセル（０．５４０６ｇ、０．６３３１ｍｏｌ、１．０２当量）の攪拌溶液に、ＤＭＡＰ（０．０８９８ｇ、０．７３５０ｍｍｏｌ、１．１９当量）を添加した。黄色溶液をＲＴで一晩攪拌した。反応混合物を、塩化メチレン（２００ｍｌ）で希釈し、塩水（５０ｍｌｘ３）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカカラム（２．４ｘ１６ｃｍ）で精製し、ヘキサン／酢酸エチル（２：３、１００ｍｌ；３：７、２００ｍｌ）で溶出して、１．０２８６ｇ（９３．６％）の白色固体（１４）を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１７７３．６（Ｍ＋Ｈ）、１７９５．８（Ｍ＋Ｎａ）。

Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１５）
乾燥ＴＨＦ（５０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１．０２８６ｇ、０．５８０１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、０．５ｍｌ、最終濃度〜１％）を添加した。溶液をＲＴで５分間攪拌した。反応混合物を攪拌エーテル（２００ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、エーテル（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させて、０．６１８０ｇ（６８．７％）の淡黄色固体（１５）を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１５５０．９（Ｍ＋Ｈ）。

Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１６）
ＤＭＳＯ（９ｍｌ）中の化合物１５（０．５９６５ｇ、０．３８４６ｍｍｏｌ、１．０当量）及び化合物１１（０．７６６７ｇ、０．４７６３ｍｍｏｌ、１．２４当量）の溶液を室温で３時間攪拌した。反応混合物を攪拌エーテル／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１、１００ｍｌ）に添加し、生じた沈殿物を収集し、アセトン（１０ｍｌｘ２）、塩化メチレン／エーテル（１：１、１０ｍｌｘ２）で洗浄し、真空で乾燥させた。１．０ｇの赤色粉末（１６）を得た。

Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−２’−パクリタキセル（１７）
メタノール（２０ｍｌ）、塩化メチレン（２０ｍｌ）及び水（２０ｍｌ）中の化合物１６（１．０ｇ、０．３２８４ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌懸濁物に、アニソール（０．１ｍｌ、０．９１５５ｍｍｏｌ、２．７９当量）及びジクロロ酢酸（２．５ｍｌ、最終濃度〜０．５Ｍ）を添加した。固体は溶解し、そして混合物をＲＴで２時間攪拌した。反応混合物を水（２０ｍｌ）で希釈し、そして回転蒸発装置によって、有機溶媒を除去した。残渣を水（５０ｍｌ）で希釈し、そして水相をデカントした。粘着性残渣をエーテル（１０ｍｌｘ４）でリンスした。生じた固体をメタノール（５ｍｌ）に溶解し、攪拌エーテル／ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：１、９０ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、塩化メチレン／エーテル（１：１、１０ｍｌｘ２）で洗浄し、真空で乾燥させた。０．６５４６ｇの赤色粉末を得た。未精製産物をＨＰＬＣによって精製した：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ１８ １５μｍ（Ｐ／Ｎ：ＷＡＴ０３８５０６）２５ｘ３００ｍｍ。
流速：４１ｍｌ／分。
溶媒：５０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４／ＮＨ_４ＯＨ、ｐＨ３．０（Ａ）及びアセトニトリル／水（９：１、Ｂ）。
勾配：０〜２０分、４０〜５０％Ｂ。

未精製試料を、緩衝液Ａ（６ｍｌ）中の４０％溶媒Ｂに溶解し、０．４５μｍナイロンシリンジフィルターを通じてろ過した。５回の注入を行った。ほぼ１２分〜１４分の間の保持時間を有する分画を収集し、そしてＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｔＣ１８カートリッジ（Ｐ／Ｎ：ＷＡＴ０４３３６５）で濃縮（脱塩）した。産物を凍結乾燥して、１７２．７ｍｇの赤色粉末（１７）を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：１３８７［（Ｍ＋２Ｈ）／２］、１３９８［（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ）／２］。

上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、まず、抗腫瘍剤としての結合体の活性を評価し、そして対応するフリーの薬物のものに対して、薬物結合体の活性を比較することも可能である。２つの間の相関を決定したら、ヒト対象における結合体の適切な初回投薬措置を決定することも可能である。

以下の方法を用いて、図４ａの典型的なパクリタキセル−ＶＢ結合体を調製した。
パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（４１）
ＣＨ_２Ｃｌ_２（２０ｍｌ）中のパクリタキセル（１．００３３ｇ、１．１７４９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びｐ−アニシルクロロジフェニルメタン（２．８９７２ｇ、９．３８２１ｍｍｏｌ、７．９８当量）の攪拌溶液に、ピリジン（０．７８ｍｌ、９．５６５１ｍｍｏｌ、８．１４当量）を添加した。溶液をＲＴで一晩攪拌した。溶媒を除去した後、残渣を、酢酸エチル（２００ｍｌ）及び冷ｐＨ５緩衝液（０．０５Ｍフタル酸、１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．０に調整、１００ｍｌ）に溶解した。有機相を分離し、そして冷ｐＨ５緩衝液（１００ｍｌｘ２）、水（１００ｍｌｘ１）及び塩水（１００ｍｌｘ１）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカカラム（５ｘ１０ｃｍ、４：１ヘキサン／酢酸エチルで充填；試料を酢酸エチルで溶解して、１０ｇのシリカゲルに吸着させ、風乾し、そしてカラムに装填した）で精製し、ヘキサン／酢酸エチル（１：１、１６０ｍｌ；２：３、４００ｍｌ）で溶出して、１．２４５１ｇ（９４．１％）の白色固体を得た。

Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（４３）
塩化メチレン（１８ｍｌ）中のパクリタキセル−２’−ＭＭＴ（１．３８２５ｇ、１．１７９５ｍｍｏｌ、１．０当量）の氷冷溶液に、ＤＩＥＡ（０．２０５ｍｌ、１．１７６９ｍｍｏｌ、１．００当量）、ピリジン（０．０９６ｍｌ、１．１７７２ｍｍｏｌ、１．００当量）、そして次いでジホスゲン（０．０７１ｍｌ、０．５８８６ｍｍｏｌ、０．５０当量）を添加した。氷槽を除去し、そして溶液をＲＴで２時間攪拌した。次いで、氷槽で再び冷却し、シリンジを介して、塩化メチレン（６０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＯＨ（１．０５４０ｇ、１．１８０１ｍｍｏｌ、１．００当量）及びＤＩＥＡ（０．２０５ｍｌ、１．１７６９ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。溶液をＲＴで一晩攪拌した。反応混合物を約１０ｍｌに濃縮し、そして次いで酢酸エチル（２００ｍｌ）で希釈して、ｐＨ５緩衝液（０．０５Ｍフタル酸、１０Ｎ ＫＯＨでｐＨ５．０に調整、１００ｍｌｘ３）、水（１００ｍｌｘ１）及び塩水（１００ｍｌｘ１）で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶媒を除去した後、残渣をシリカカラム（５ｘ１１ｃｍ、９：１の塩化メチレン／酢酸エチルで充填、９：１塩化メチレン／酢酸エチルに試料を溶解）で精製し、塩化メチレン／酢酸エチル（３：１、５００ｍｌ）で溶出して、１．４４１０ｇ（５９．７％）の白色固体を得た。

Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（４４）
乾燥ＴＨＦ（２０ｍｌ）中のＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（１．４４１０ｇ、０．７０４５ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌溶液に、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（ＤＢＵ、０．２１５ｍｌ、１．４２６４ｍｍｏｌ、２．０２当量、最終濃度：１％）を添加した。溶液をＲＴで８分間攪拌した。反応混合物を攪拌ヘキサン（９０ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、ヘキサン（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させて、１．２０１５ｇ（９３．５％）の白色固体を得た。

Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＭＭＴ）−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル−２’−ＭＭＴ（４５）
ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）中の化合物１１（１．４２５１ｇ、〜８６％純粋、０．７６１４ｍｍｏｌ、１．１６当量）の攪拌溶液に、化合物４４（１．２０１５ｇ、０．６５９０ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。溶液を室温で１．５時間攪拌した。エーテル（９０ｍｌ）を添加し、そして油性層が生じた。エーテルをデカントし、そして残渣を塩化メチレン／エーテル（１：１、８０ｍｌ）で凝固させた。生じた固体を収集し、エーテル（２０ｍｌｘ３）で洗浄し、風乾し、そして次いで水（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で一晩乾燥させた。１．２７３５ｇ（５８．２％）の赤色粉末を得た。

Ｂ _１２ −５’−ＯＣＯＮＨ（ＣＨ _２ ） _５ ＣＯ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＰＡＢＣ−７−パクリタキセル（４６）
メタノール（４０ｍｌ）、塩化メチレン（４０ｍｌ）及び水（４０ｍｌ）中の化合物４５（１．２７３５ｇ、０．３８３９ｍｍｏｌ、１．０当量）の攪拌懸濁物に、アニソール（０．２ｍｌ、１．８３１０ｍｍｏｌ、４．７７当量）及びジクロロ酢酸（４．７ｍｌ、５７．２１８７ｍｍｏｌ、１４９．０６当量、約０．５Ｍの最終濃度）を添加した。固体は溶解し、そして混合物をＲＴで１．５時間攪拌した。回転蒸発装置によって、有機溶媒を除去した。水溶液をデカントした。粘着性残渣をエーテル（１０ｍｌｘ４）でリンスした。生じた固体をメタノール（１０ｍｌ）に溶解し、そして攪拌エーテル（９０ｍｌ）に添加した。生じた沈殿物を収集し、エーテル（１０ｍｌｘ３）で洗浄し、真空で乾燥させた。１．０９ｇの赤色粉末を得た。

未精製産物をＨＰＬＣによって精製した：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ Ｃ１８ １５μｍ（Ｐ／Ｎ：ＷＡＴ０３８５０６）２５ｘ３００ｍｍ。
流速：４１ｍｌ／分。
溶媒：５０ｍＭ Ｈ_３ＰＯ_４／ＮＨ_４ＯＨ、ｐＨ３．０（Ａ）及び９：１アセトニトリル／水（Ｂ）。
勾配：０〜２０分、４０〜５０％Ｂ。

試料を、緩衝液Ａ（１０ｍｌ）中の４０％溶媒Ｂに溶解し、０．４５μｍナイロンシリンジフィルターを通じてろ過した。７回の注入を行った（いくつかの不純な分画を再精製した）。望ましい分画（分析用ＨＰＬＣで監視）を合わせ、そしてＷａｔｅｒｓ Ｓｅｐ−Ｐａｋ ｔＣ１８カートリッジ（Ｐ／Ｎ：ＷＡＴ０４３３６５）で脱塩した。産物を凍結乾燥して、０．６６ｇ（６０％）の赤色粉末を得た。ＥＳ（＋）−ＭＳ：２７７３．３［（Ｍ＋Ｈ）^＋］、１３８７．３［（Ｍ＋２Ｈ）^２＋］、１３９８．３［（Ｍ＋Ｈ＋Ｎａ）^２＋］。

以下は、本発明のコバラタキセル結合体の有効性を評価するのに用いた細胞培養条件の説明である。
細胞株の説明：
ＮＣＩ−Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ癌ＤＣＴ腫瘍貯蔵所からＭＸ−１細胞を得た。これらはヒト乳癌由来である。ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）を含み、１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、並びに１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、ＲＰＭＩ培地１６４０中で、ＭＸ−１細胞を５％ＣＯ_２とともに３ ℃でインキュベーションした。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり３０００細胞の最初の密度で、ＭＸ−１細胞を植え付けた。

ＨＴ−２９細胞をＡＴＣＣから得た。これらはヒト結腸腺癌由来である。Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）を含み、１０％の定義された熱不活性化ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、並びに１ｍｌあたり最終濃度１０単位のペニシリン及び１０μｇのストレプトマイシンのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補った、修飾ＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で、ＨＴ−２９細胞を５％ＣＯ_２とともに３□℃でインキュベーションした。生存度アッセイのため、９６ウェルプレート中、１００μｌの培地中に細胞を蒔いた。ウェルあたり５０００細胞の最初の密度で、ＨＴ−２９細胞を植え付けた。

ＳＫ−ＢＲ−３細胞及びＭＣＦ−７細胞株に関する情報は、コバラルビシン−２００細胞生存度アッセイに関するものと同じである。

アッセイのためのストック溶液及び投薬の説明：
パクリタキセル、コバラタキセル−１７及びコバラタキセル−４６のストックをＤＭＳＯ中で作成し、そして遮光して−２０℃に保存した。培地中で調製した、１μＭから減少して０．０１ｎＭまでの１０倍希釈を含む６つの最終濃度で、各化合物を試験した。１０ｘストック溶液を細胞培地中で調製し、各実験のため、細胞培地中で新鮮に作成した。細胞を蒔いておよそ２４時間後、化合物を添加した。未処理細胞の３つのウェルを陽性増殖対照として含んだ。培地のみを含有する３つのウェルもまた、バックグラウンド対照として含んだ。投薬後、プレートを３７℃インキュベーターに戻した。

生存度アッセイの説明
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６（登録商標）非放射性細胞増殖アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、これらの４つのアッセイを行った。以下の修飾を伴って、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに記載される方法（技術告示、第１１２号）を用いた。染色溶液でのインキュベーション期間を３７℃１時間に減少した。可溶化／停止溶液を添加した後、プレートを３７℃で３０分間放置した。ウェルの内容物を混合し、そしてプレートをさらに１時間、３７℃に戻し、ホルマザン結晶の完全な可溶化を確実にした。５７０ｎｍでの吸光度を測定し、そして６５０ｎｍを参照波長として用いた。計算及びデータ提示は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ^ＴＭ発光細胞生存度アッセイに関して記載したものと同じである。

上記は、本発明の特定の態様の詳細な説明である。本発明の範囲内で、開示する態様からの逸脱を行うことも可能であり、そして当業者には明らかな修飾が思い浮かぶであろうことが認識される。当業者は、本開示を考慮して、本明細書に開示する特定の態様に多くの変化を行って、そしてなお本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、同様の又は類似の結果を得ることが可能であることを認識するはずである。本明細書に開示し、そして請求する態様すべてを、本開示を考慮して過度な実験を伴わずに、製造し、そして実行することも可能である。

以下の図は、本明細書の一部であり、そして本発明の特定の側面をさらに立証するために含まれる。本発明は、本明細書に提示する特定の態様の詳細な説明と組み合わせて、１以上のこれらの図を参照することによって、よりよく理解することも可能である。
図１ａは、本発明の結合体の第一の態様を示す。 図１ｂは、ＶＢ及びＤＧ間のリンカーが細胞内酵素によって切断不能であるため、本発明にしたがって作成されていない「酵素切断安定性」結合体を示す。 図２は、カテプシンＢで切断可能なドキソルビシン−コバラミン結合体合成のための典型的なプロセスを示す。 図３ａ〜３ｂは、カテプシンＢで切断可能なドキソルビシン−コバラミン結合体合成のための別の典型的なプロセスを示す。 図４ａ〜４ｂは、パクリタキセル−コバラミン結合体合成のための典型的なプロセスを示す。 図５は、代替リンカーを用いた、ドキソルビシン−コバラミン結合体を示す。 図６ａは、ＭＣＦ−７細胞に対する、フリーのドキソルビシン対ドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｂは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する、フリーのドキソルビシン対ドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｃは、ＨＬ−６０（前骨髄球性白血病）細胞に対する、フリーのドキソルビシン対ドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｄは、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対する、フリーのドキソルビシン対ドキソルビシン−コバラミン結合体（本発明記載）のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｅは、ＭＣＦ−７細胞に対する、フリーのパクリタキセル対ドキソルビシン−パクリタキセル（コバラタキセル−１７（中間体１７））結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｆは、ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対する、フリーのパクリタキセル対ドキソルビシン−パクリタキセル（コバラタキセル−１７（中間体１７））結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｇは、ＨＴ−２９細胞に対する、フリーのパクリタキセル対ドキソルビシン−パクリタキセル（コバラタキセル−４６（中間体４６））結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図６ｈは、ＭＸ−１細胞に対する、フリーのパクリタキセル対ドキソルビシン−パクリタキセル（コバラタキセル−４６（中間体４６））結合体（本発明記載）のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図７は、正常ネズミリンパ節細胞に対する、フリーのドキソルビシン対ドキソルビシン−コバラミン結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図８は、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ細胞に対する、フリーのドキソルビシン対「酵素切断安定性」ドキソルビシン−コバラミン結合体（本発明にしたがわない）のｉｎ ｖｉｔｒｏ比較のグラフを示す。 図９は、ＭＸ−１ヒト乳癌異種移植片を有する無胸腺マウスにおける、フリーのドキソルビシン対照、生理食塩水対照、及びコバラルビシン（ドキソルビシン−コバラミン結合体）のｉｎ ｖｉｖｏ比較のグラフを示す。比較は、投与後の日数に対する腫瘍サイズに基づく。 図１０は、異なる用量の結合体（１３）を用い、実施例１０にしたがって処置したマウスの体重変化パーセントを要約するグラフを示す。体重変化パーセントを毎日決定し、そして示した用量で、結合体を毎日投与した。 図１１は、実施例１１の方法にしたがって処置したマウスにおいて、投与後の日数に対する腫瘍サイズに関する、フリーのドキソルビシン対照及びコバラミン−ドキソルビシン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ比較のグラフを示す。 図１２ａは、実施例１２の方法にしたがって処置したマウスにおいて、投与後の日数に対する平均体重変化に関する、生理食塩水対照、フリーのドキソルビシン対照及びコバラミン−ドキソルビシン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ比較のグラフを示す。 図１２ｂは、実施例１２の方法にしたがって処置したマウスにおいて、投与後の日数に対する体重変化に関する、フリーのドキソルビシン対照及びコバラミン−ドキソルビシン結合体のｉｎ ｖｉｖｏ比較のグラフを示す。

Claims (21)

1. 以下を含む、抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体：
   ａ．コバラミン、又はその誘導体若しくは類似体；
   ｂ．コバラミン又はコバラミン誘導体の５’−ＯＨ部分に共有結合しているリンカー；
   ｃ．リンカーに共有結合し、それによって結合体を形成している抗腫瘍薬物であって、薬物が細胞内酵素によってリンカーから切断可能であり、及び／又はリンカーが薬物から切断可能であり；結合体がトランスコバラミンとの複合体形成後、細胞膜を横切る輸送に適しており；結合体が細胞内酵素によって切断可能であり；そして結合体が所望により１以上の保護基を有する、前記抗腫瘍薬物。
2. コバラミンが、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン、アクオコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、シアノコバラミンカルバナリド、デスジメチルコバラミン、モノエチルアミドコバラミン、メチルアミドコバラミン、補酵素Ｂ１２、５’−デオキシアデノシルコバラミン、コバマミド誘導体、クロロコバラミン、スルフィトコバラミン、ニトロコバラミン、チオシアナートコバラミン、ベンズイミダゾール誘導体、例えば５，６−ジクロロベンズイミダゾール、５−ヒドロキシベンズイミダゾール、トリメチルベンズイミダゾール及びアデノシルシアノコバラミン（（Ａｄｅ）ＣＮ−Ｃｂｌ）、コバラミンラクトン、コバラミンラクタム、及びＶＢ１２の、アニリド、エチルアミド、モノカルボン酸、ジカルボン酸及びトリカルボン酸誘導体、ＶＢ１２のプロピオンアミド誘導体、５−ｏ−メチルベンジルコバラミン、並びにコバルトが別の金属で置換されている、それらの類似体からなる群より選択される、請求項１の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
3. 抗腫瘍薬物が、ドキソルビシン及びパクリタキセルからなる群より選択される、請求項１の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
4. カテプシン、エンド酵素、グリコシダーゼ、メタロプロテアーゼ、リボザイム、プロテアーゼ、エステラーゼ、及びアミダーゼからなる酵素種群から選択される、細胞内酵素によって、リンカーが切断可能である、請求項１の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
5. 対応するフリーの抗腫瘍薬物に比較して軽減された全身毒性を有する、請求項１の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
6. 腫瘍関連障害又は疾患の治療が必要な対象に、臨床上有効な量の請求項１記載の結合体を投与する工程を含む、腫瘍関連障害又は疾患の治療方法。
7. 式Ｉの抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体：
   ＶＢ−（ＳＰａ）_ｎ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｍ−ＤＧ
   式Ｉ
   （式中、
   ａ．ＣＬは、細胞内酵素によって、ＶＢ、ＳＰａ、ＳＰｂ及び／又はＤＧから切断可能なリンカーであり；
   ｂ．ＶＢは、コバラミン、又はその誘導体若しくは類似体であり、ＶＢのリボース環の５’−ＯＨ基を介して、ＣＬ又は存在する場合ＳＰａに共有結合しており；
   ｃ．ＳＰａ及びＳＰｂは、所望によるスペーサーであり、それぞれの存在に際して、共有結合、二価官能基、又は非ペプチド残基からなる群より独立に選択され、ＳＰａ及びＳＰｂは、ＣＬのいずれかの側に存在することができ；そして
   ｄ．ＤＧは、１以上の官能基を有し、それによってスペーサー又はＣＬに共有結合している抗腫瘍薬物であり；
   ｅ．ｎ及びｍは、それぞれの存在に際して、０、１、又は２から独立に選択され；そして結合体は、所望により１以上の保護基を有する。）。
8. 二価官能基が、−ＮＨＮＨ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＳ−、−ＣＨ_２−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨＮＨＣＯ−、−Ｎ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＮＨＣＨ_２−、−ＮＨＮ＝ＣＨ−、−ＮＨＮＨＣＨ_２−、−ＳＣＨ_２−、−ＣＨ_２Ｓ−、−ＮＨＣＲＮＨ−（Ｒは＝Ｏ、＝Ｓ又は＝ＮＨである）、−ＣＯＯ−、及び−ＯＣＯ−からなる群より選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
9. コバラミンが、ビタミンＢ１２、シアノコバラミン、アクオコバラミン、ヒドロキシコバラミン、メチルコバラミン、アデノシルコバラミン、シアノコバラミンカルバナリド、デスジメチルコバラミン、モノエチルアミドコバラミン、メチルアミドコバラミン、補酵素Ｂ１２、５’−デオキシアデノシルコバラミン、コバマミド誘導体、クロロコバラミン、スルフィトコバラミン、ニトロコバラミン、チオシアナートコバラミン、ベンズイミダゾール誘導体、例えば５，６−ジクロロベンズイミダゾール、５−ヒドロキシベンズイミダゾール、トリメチルベンズイミダゾール及びアデノシルシアノコバラミン（（Ａｄｅ）ＣＮ−Ｃｂｌ）、コバラミンラクトン、コバラミンラクタム、及びＶＢ１２の、アニリド、エチルアミド、モノカルボン酸、ジカルボン酸及びトリカルボン酸誘導体、ＶＢ１２のプロピオンアミド誘導体、５−ｏ−メチルベンジルコバラミン、並びにコバルトが別の金属で置換されている、それらの類似体からなる群より選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
10. ｎ及びｍが１、２又は３から独立に選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
11. 非ペプチド残基が、−ＮＨ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−Ｏ−及び−ＮＨ（ＣＨ_２）_５Ｃ（＝Ｏ）−からなる群より選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
12. 抗腫瘍薬物が、ドキソルビシン及びパクリタキセルからなる群より選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
13. 以下の式の１つを有する、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体：
    ａ．ＶＢ−（ＳＰａ）_ｐ−ＣＬ−ＤＧ（式ＩＩ）；
    ｂ．ＶＢ−ＣＬ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＤＧ（式ＩＩＩ）；
    ｃ．ＶＢ−ＣＬ−ＤＧ（式ＩＶ）；
    ｄ．ＶＢ−ＣＬ−（ＳＰａ）_ｐ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＤＧ（式Ｖ）；
    ｅ．ＶＢ−（ＳＰａ）_ｐ−（ＳＰｂ）_ｑ−ＣＬ−ＤＧ（式ＶＩ）；
    ｆ．ＶＢ−（ＳＰａ）^２（ＳＰａ）^１−ＣＬ−（ＳＰｂ）^１（ＳＰｂ）^２−ＤＧ（式ＶＩＩ）；
    ｇ．このとき、ｐ及びｑは、１、２及び３から独立に選択される。
14. ａ．（ＳＰａ）^１及び（ＳＰｂ）^１が、それぞれの存在に際して、二価官能基及び共有結合から各々独立に選択され；そして
    ｂ．（ＳＰａ）^２及び（ＳＰｂ）^２が、それぞれの存在に際して、非ペプチド残基から各々独立に選択される、
    請求項１３の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
15. ａ．（ＳＰａ）^２及び（ＳＰｂ）^２が、各々、二価カルボニルであり；そして
    ｂ．（ＳＰａ）^１及び（ＳＰｂ）^１が、各々、−ＮＨ−、−Ｓ−及び／又は−Ｏ−含有非ペプチド残基である、
    請求項１４の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
16. カテプシン、エンド酵素、グリコシダーゼ、メタロプロテアーゼ、リボザイム、プロテアーゼ、エステラーゼ、及びアミダーゼからなる酵素種群から選択される、細胞内酵素によって、リンカーが切断可能である、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
17. 対応するフリーの抗腫瘍薬物に比較して軽減された全身毒性を有する、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
18. 対応するフリーの抗腫瘍薬物より、モル基準で改善された有効性を有する、請求項１７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
19. １以上の官能基が、一級又は二級アミン、ヒドロキシル、スルフィドリル、カルボキシル、ヒドラジド、ニトリル、アルデヒド、及びケトンからなる群より選択される、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
20. １以上の官能基が、ＤＧ上の誘導体化可能部位を含む、請求項７の抗腫瘍薬物及びコバラミンの結合体。
21. 腫瘍関連障害又は疾患の治療が必要な対象に、臨床上有効な量の請求項７記載の結合体を投与する工程を含む、腫瘍関連障害又は疾患の治療法。

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