KR20070019942A - 항-종양 치료용 코발라민 공액체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 관련된 질환의 치료에 적합한 코발라민-약물 공액체를 제공한다. 코발라민은 분리가능 링커 및 하나이상의 선택적 스페이서를 통하여 항-종양 약물에 간접적으로 공유 결합된다. 코발라민은 코발라민 리보오스 고리의 5'-OH를 통하여 제 1 스페이서 또는 분리가능 링커에 공유 결합된다. 약물은 약물에서 기존의 또는 부가된 기능기를 통하여 분리가능 링커의 제 2 스페이서에 결합된다. 투여이후, 공액체는 트랜스코발라민(이의 임의의 동족형)과 복합체를 형성한다. 이후, 복합체는 세포막에서 수용체에 결합하고, 세포로 흡수된다. 세포내로 들어온 복합체는 세포내 효소에 의해 분리되고 약물을 방출한다. 공액체의 구조에 따라, 특정 종류 또는 유형의 세포내 효소가 분리에 영향을 준다. 성장 세포에서 코발라민에 대한 수요가 급증하기 때문에, 종양 세포는 전형적으로, 비-성장 세포에서보다 높은 비율로 공액체를 흡수한다. 본 발명에 따른 공액체는 상응하는 유리(free) 약물에 비하여 감소된 전신 독성과 향상된 효능을 제공한다.

Description

항-종양 치료용 코발라민 공액체{COBALAMIN CONJUGATES FOR ANTI-TUMOR THERAPY}

본 발명은 코발라민의 공액체, 이의 사용 방법 및 이의 제조 방법에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 종양(암) 관련된 질환의 치료를 위한 코발라민 공액체에 관계한다.

항증식 약물, 예를 들면, 항-종양 또는 항암 약물 및 이들의 유사체, 유도체, 프로드러그는 암, 종양 및 다른 세포 증식 관련된 질환의 치료에서 널리 사용되고 있다. 이들의 투여 방법은 다양하고, 일련의 성공과 실패에 직면하고 있다. 항증식 약물을 함유하는 제약학적 조성물과 제제의 개발에서 목표에는 이들 약물로 치료되는 개체에 대한 전신 독성을 감소시키기 위한 이들 약물의 표적 전달 개선 및 유도체화 이후 이들 약물의 효능 유지가 포함된다. 암이나 종양 세포에 약물의 표적 전달을 개선하고 유도체화 이후에도 이들 약물의 효능을 유지하는데 어느 정도의 성공을 거두고 있다. 그럼에도 불구하고, 높은 효능과 공동으로 표적 전달은 항-종양 치료에서 여전히 핵심적인 목표이다.

자연적인 생물 활성 성분을 함유하는 약물의 유도체화는 이들 약물의 표적 전달을 개선하기 위한 수단으로서 평가받고 있다. 이런 목적으로, 코발라민 세포 흡수의 생물 기전을 활용하여 생체이용효율을 개선하기 위한 노력의 일환으로 약물, 단백질, 핵산, 아미노산, 펩티드, 호르몬 또는 다른 성분을 함유하는 코발라민 공액체가 개발되었다. 원칙적으로, 코발라민(CB)에 공유 결합된 약물을 함유하는 생물공액체(CBD)는 생체내에서 단백질에 결합되게 된다. 투여 부위에 따라, 단백질은 내인 인자(IF), 또는 트랜스코발라민(TCCB) I, II 또는 III이다. I는 CB에 결합하는 위장관에서 자연적으로 발생하는 단백질이다. 코발라민 생물공액체는 경구 투여이후, IF에 결합하여 복합체(IF-CBD)를 형성하는데, 상기 복합체는 위장관의 내강을 가로질러 활발하게 수송된다. 혈장에서, IF는 IF-CBD 복합체로부터 분리되고 CBD를 혈장 구획으로 방출한다. TCCB는 세포막을 통한 CD의 세포 흡수를 주도한다. TCCB는 혈장에서 CBD에 결합하여 복합체 TCCB-CBD를 형성한다. TCCB-CBD 복합체는 이후, 세포막에서 TCCB 수용체를 통하여 세포막을 가로질러 활발하게 수송된다. 주목할 점은 유리 코발라민을 인식하는 세포 표면 수용체가 존재하지 않고 TCCB-CBD 복합체를 인식하는 세포 표면 수용체만 존재한다는 것이다. 세포로 들어온 이후, TCCB는 TCCB-CBD 복합체로부터 세포내 분리되어 CBD를 세포내 방출한다. 다수의 간행물에서 전술한 목적을 위한 코발라민 공액체의 조제를 보고한다.

U.S. 특허 5,739,313; 6,004,533; 6,096,290; 6,211,355; PCT 공개 WO 97/18231에서는 자연 발생 비타민 B12에서 프로피온아마이드 부분을 통하여 비타민 B12의 방사선핵종 라벨링을 개시한다. 코린(corrin) 고리의 b-, d-, e-위치에서 프로피온아마이드 부분은 약한 가수분해를 통하여 모노카르복실산으로 전환되었고, 카르복실산은 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 이후, 이중기능성 연결 부분이 아마이드 결합을 통하여 카르복실레이트 기능기에 부착되었고, 킬레이트화제가 아마이드 결합을 통하여 연결 부분에 다시 부착되었다. 킬레이트화 부분은 비타민에 방사성핵종을 부착하는데 이용되었고, 결과의 생성물은 치료 또는 진단 목적으로 이용되었다.

Hogenkamp et al. WO 01/28595(PCT/US00/10098)에서는 종양의 영상에 유용한 검출가능 작용기에 단백질 링커를 통하여 연결된 일련의 코발라민 공액체를 개시한다. 링커는 5'-OH기를 통하여 코발라민에 부착되지 않는다. Hogenkamp 등은 이들 화합물이 종양의 치료에 유용할 수 있다고 제안한다.

Hogenkamp et al. WO 01/28592(PCT/US00/10097)에서는 비정상적인 세포 증식의 치료에 유용한 화학치료제의 잔기에 직접적으로, 또는 링커에 의해 간접적으로 연결된 일련의 코발라민 공액체를 개시한다. 링커는 5'-OH기를 통하여 코발라민에 부착되지 않는다. 상기 출원에는 독소루비신 공액체가 고려되고, 이의 합성법이 제안된다. 상기 출원에서는 넓은 범위의 항증식 약물이 적합하다고 개시하고 있긴 하지만, 화합물의 실제적인 예시는 포함되어 있지 않다. 공액은 코발라민의 카르복실산 부분을 통하여 달성되는 것으로 제안된다.

Collins et al. WO 00/62808(PCT/US00/10100)에서는 비정상적인 세포 증식의 치료에 유용한 B10 또는 Gd-157을 포함하는 분자의 잔기에 직접적으로, 또는 링커에 의해 간접적으로 연결된 일련의 코발라민 공액체를 개시한다. 중성자 포획 치료 표적이 코발라민에 연결된다. 전신 투여이후, 공액체는 종양 세포에 흡수된다. 이후, 중성자 포획 광선(neutron capture irradiation)이 투여된다. 제안된 연결 부위는 아마이드 부위와 코발트이다. 코발라민 리보오즈 고리의 5'-OH는 제안되지 않는다.

PCT 공개 WO 98/08859(Grissom et al.)에서는 생물활성제가 코발트 원자에 직접적으로, 또는 스페이서를 통하여 간접적으로 공유 결합된 생물활성제와 유기코발트 복합체를 보유하는 공액체를 개시한다. 생물활성제는 화학치료제(항-종양 약물)일수 있다. 생물활성제는 세포 친핵성 물질이나 효소 작용, 또는 외부 신호(가령, 광, 광 여기(photoexcitation), 초음파, 또는 자기장의 존재)의 적용에 의한 정상적인 분리의 결과로서 생물활성제와 코발트 원자간 약한 공유 결합의 분리에 의해 생물공액체로부터 방출된다. 이들 공액체는 세포, 조직, 또는 기관에서 생물활성제의 부위 특이적 방출을 위하여 표적되는 것으로 보고된다.

PCT 국제 공보 WO 03/025139(Collins et al.)에서는 VB12, 코발라민에 결합을 통하여 핵산의 전달을 위한 공액체를 개시한다. 분해가능 링커가 이용된다. 제안된 결합은 아마이드 부위 또는 5'-OH 부위를 통하여 달성된다. 안티센스 서열, 난센스 서열, 안티센스 모방체, 핵산과 핵산 유사체가 고려된다.

U.S. 특허 5,428,023(Russell-Jones et al.)에서는 경구 호르몬 제제를 전달하기 위한 비타민 B12 공액체를 개시한다. Russell-Jones는 비타민 B12 공액체가 내인 인자에 생체내 결합할 수 있고, 척추동물의 소장강(intestinal lumen)으로부터 전신 순환계로 복합체의 흡수와 수송을 가능하게 한다고 교시한다. 호르몬은 비타민에서 가수분해된 프로피온아마이드 결합을 통하여 비타민 B12에 부착된다. 상기 특허에서는 이런 방법이 호르몬, 생물활성 펩티드, 치료제, 항원과 합텐, 다른 치료제, 예를 들면, 네오마이신, 살부타몰 클로리딘, 피리메타민, 페니실린 G, 메티실린, 카르베니실린, 페티딘, 실라진, 케타민 하이드로클로라이드, 메파네신, 철 덱스트란을 경구 투여하는데 유효하다고 제안한다.

U.S. 특허 5,548,064와 6,262,253(Russell-Jones et al.)에서는 '023 특서에서와 동일한 방식을 이용하여, 적혈구와 과립구 콜로니 자극 인자를 전달하기 위한 비타민 B12 공액체를 개시한다.

PCT 공개 WO 94/27641(Russell-Jones et al.)에서는 중합체를 통하여 다양한 활성 약물에 연결된 비타민 B12를 개시하는데, 여기서 공액체는 전신 전달을 위하여 내인 인자에 결합할 수 있다. 특히, 상기 문헌에서는 비타민 B12 분자의 프로피온아마이드 위치에 다양한 중합성 링커의 부착 및 중합성 링커에 다양한 생물활성제의 부착을 개시한다. 전형적인 생물활성제는 호르몬, 생물활성 펩티드와 폴리펩티드, 항-종양 약물, 항생제, 해열제, 진통제, 소염제, 지혈제 등이다. 전형적인 중합체는 탄수화물 및 가지형 사슬 아미노산 중합체이다. WO 94/27641에 이용된 링커는 중합성이다(각각 대략 5000 이상의 분자량을 보유한다). 이들 링커는 이들이 제조된 중합화 공정으로 인하여, 혼성의 분자량을 보이는 것으로 기술된다.

PCT 공개 WO 99/65930과 U.S. 특허 6,150,341(Russell-Jones et al.)에서는 비타민 B12(VB12) 리보오즈 고리에서 5'-OH 위치에 다양한 약물의 부착을 개시한다. 이들 간행물에서는 상기 시스템이 중합체, 나노입자, 치료제, 단백질, 펩티드를 비타민에 부착시키는데 이용될 수 있음을 지시한다. Russell-Jones 등은 활성 카르보닐 친전자체를 이용한 5'-OH VB12 유도체의 조제를 개시한다. VB12 5'-OH를 카르보닐 친전자체와 반응시킨 이후, 링커, 디아미노 스페이서, 또는 다른 분자는 활성화된 5'-OH 부위와 반응한다. 대안으로, 5'-OH 부위는 에스테르 부위로 전환되고, 이후 유도체화된다. 약물에 VB 12 유도체의 연결이 고려된다.

PCT 국제 공개 WO 02/074171(PCT/US02/08285)과 U.S. 특허 공개 2002/0192683(Grissom et al.)에서는 형광 코발라민 유도체를 개시한다. 형광 부분은 가급적 5'-OH기의 코린 고리를 통하여 코발라민에 연결된다. 이들 화합물은 항암 치료 및 다른 치료 방법에 잠재적으로 민감한 암세포를 검출하고 확인하는데 이용된다. 이들 간행물에서는 5'-OH기에 부착되는 항암 약물을 개시하지 않는다.

U.S. 특허 5,574,018(Habberfield et al.)에서는 치료에 유효한 단백질이 리보오즈 부분의 일차 하이드록실 부위에 부착된 비타민 B12의 공액체를 개시한다. 상기 특허에서는 적혈구, 과립구-콜로니 자극 인자, 인간 내인 인자를 치료에 유효한 단백질로서 언급하고, 이들 공액체가 경구 투여에 특히 적합하다고 지시한다.

U.S. 특허 5,840,880(Morgan, Jr. et al.)에서는 비타민 B12의 세포 흡수와 대사를 지배하는 수용체 트래픽킹 경로(trafficking pathway)에 영향을 주는 수용체 조절제가 연결된 비타민 B12 공액체를 개시한다. 상기 수용체 조절제는 b-, d-, 또는 e-위치에서 비타민에 연결된다.

U.S. 특허 공개 2002/0151525(Collins et al.)에서는 항증식 약물에 연결된 일련의 VB-12 공액체를 개시한다. 약물은 5'-OH 부위를 보유하는 VB-12 분자상의 여러 부위에서 다수의 상이한 링커에 의해 연결될 수 있다. 독소루비신은 적절한 항증식 약물의 목록에 포함된다. VB-12의 카르복실산 부분에 부착된 독소루비신을 포함하는 공액체의 합성을 위한 전반적인 설명이 개시되어 있긴 하지만, 이런 화합물의 실제적인 예시는 없다. 또한, 임의의 다른 특정 공액체, 특히, 5'-OH 부위의 공액체에 대한 다른 합성 절차 역시 기재되어 있지 않다.

U.S. 특허 공개 2002/0115595와 2002/0049154(Grissom et al.)에서는 VB12의 유기코발트 유도체를 개시한다. 이들 유도체는 경구와 i.v. 투여에 적합한 것으로 개시된다. 여러 항-종양 약물, 예를 들면, 독소루비신, 메토트렉세이트, 카보플라틴이 공액에 적합한 것으로 개시된다. 자기-파괴 링커로부터 항-종양 약물의 분리는 세포 친핵성 물질이나 효소, 광 또는 소리에 의해 달성되는 것으로 제안된다. Grissom 등은 상기 공액체로 암을 치료하는 방법을 제안한다.

U.S. 특허 6,315,978(Grissom et al.)에서는 경구 또는 i.v. 투여에 적합된 VB-12의 유기코발트 유도체를 개시한다. VB-12에 공액될 수 있는 항-종양 약물은 독소루비신, 메토트렉세이트, 카보플라틴 등이다. 이들은 세포 친핵성 물질이나 효소, 광 또는 소리에 의한 링커로부터 항-종양 약물의 분리를 제안한다. 링커는 VB-12로부터 제거된 이후 약물로부터 분리되는 자기-파괴 링커이다. 이들은 또한, 상기 공액체로 암을 치료하는 방법을 제안한다.

U.S. 특허 공개 2002/0042394(Hogenkamp et al.)에서는 선택적으로 영상제(imaging agent)로서 이용되는 항생제 공액된 VB 12를 개시한다. Hogenkamp은 공액체에 사용하기 적합한 항생 화합물로서 국소 항종양제(EFUDEX: 플루오르우라실; 플루오르플렉스)를 확인한다. 이들은 5'-OH를 비롯한 다양한 부위에서 VB-12에 부착된 항생 화합물을 제안한다. 이들은 정맥내 투여가능 항-종양 공액체를 개시하지 않는다.

U.S. 특허 5,449,720(Russell-Jones et al.)에서는 VB-12와 활성 약물간 링커로서 중합체의 이용을 개시한다. 공액체는 (V-Q)_n-P(Q'-A)_m으로 정의되는데, 여기서 V는 VB-12이고; P는 선택적으로 생물분해가능 중합체이고, A는 활성 약물이고, Q와 Q'는 선택적 스페이서 또는 가교결합제이다. Russell-Jones 등은 카르복실 부분을 통하여 VB-12에 공액될 수 있는 잠재적 항-종양 약물 및 많은 다른 약물의 목록을 개시한다. 하지만, 이들은 VB-12의 5'-OH 유도체를 개시하지 않는다.

U.S. 특허 5,589,463(Russell-Jones)에서는 경구 투여이후 위장관의 내강을 가로질러 VB-12 유도체의 수송을 위한 VB-12 흡수 기전의 활용을 개시한다. VB-12 유도체는 활성 약물에 연결된다. 일련의 활성 약물이 개시되긴 하지만, 항-종양 화합물은 개시되지 않는다. 링커를 형성하는데 가교결합제가 이용된다. VB-12에 부착된 항생제는 약물의 흡수를 강화하는 것으로 개시된다. 이들 역시 VB-12의 5'-OH 유도체를 개시하지 않는다.

U.S. 특허 5,739,287(Wilbur et al.), 5,840,712(Morgan Jr. et al.), 5,840,880(Morgan Jr. et al.), 5,869,465(Morgan Jr. et al.), 6,083,926(Morgan Jr. et al.)에서는 VB-12 수용체를 차단하도록 설계된 비오틴화된 VB-12를 개시한다. 이들의 5'-OH 유도체는 Toraya(Bioinorg Chem.(1975), 4, 245-255)의 절차에 따라 조제된다. 이들은 VB-12에 링커를 부착하는데 이용될 수 있는 다양한 상이한 작용기를 개시한다. 암의 치료에서, 이들은 변형된 VB-12와 함께 메토트렉세이트, 또는 다른 항암이나 항-종양 약물을 동시 투여하여 2가지 상이한 기전을 이용하는 방법을 개시한다: 화학치료제의 투여와 공동으로 성장 암 세포에서 VB-12의 고갈. 이들은 메토트렉세이트와 VB-12의 공액을 제안하지 않는다.

U.S. 특허 5,807,832(Russell-Jones et al.)에서는 VB-12와 생물활성 분자(호르몬, 항생제, 합텐, 항원, 단백질, 분비 산물)를 공액하기 위한 가교-결합제의 이용을 개시한다. 이들은 상기 공액체의 세포내 효소 분리를 개시하지 않으며, 또한 항-종양 약물 또는 VB-12의 5'-OH 유도체를 개시하지 않는다.

U.S. 특허 5,863,900(Russell-Jones et al.)에서는 디아민이나 디티올 결합으로 카르복실레이트 결합을 통하여 VB-12에 연결된 LHRH 길항제(ANTIDE-1, ANTIDE-2, ANTIDE-3)를 개시한다. ANTIDE 성분은 위장관에서 효소 가수분해에 저항한다. 이들은 트랜스글루타미나아제에 의한 생체내 분리에서 유사체의 이용을 제안하긴 하지만, 성공하지는 못하였다. 이들은 또한, VB-12의 공액체로서 항-종양 화합물을 개시하지 않는다.

U.S. 특허 6,214,345(Firestone et al.)에서는 자기-파괴 스페이서에 의해 연결된 항-종양 약물과 표적 리간드(항체 또는 단백질) 공액체의 조제와 이용을 개시한다. VB-12는 적절한 리간드로서 개시되지 않는다. 대신에, 항생제 등과 같은 거대분자가 적절한 리간드로서 개시된다. 독소루비신은 상기 공액체에 함입될 수 있는 약물로서 청구된다.

비타민 B12의 이용을 기술하는 다른 특허에는 U.S. 특허 3,936,440(Nath, Method of Labeling Complex Metal Chelates with Radioactive Metal Isotopes); U.S. 특허 4,209,614(Bernstein et al., Vitamin B12 Derivatives Suitable for Radiolabeling); U.S. 특허 4,279,859(Simultaneous Radioassay of Folate and Vitamin B12); U.S. 특허 4,283,342(Yollees, Anticancer Agents and Methods of Manufacture); U.S. 특허 4,301,140(Frank et al., Radiopharmaceutical Method for Monitoring Kidneys); U.S. 특허 4,465,775(Houts, Vitamin B12 and labeled Derivatives for Such Assay); U.S. 특허 5,308,606(Wilson et al., Method of Treating and/or Diagnosing Soft Tissue Tumors); U.S. 특허 5,405,839(Vitamin B, Derivative, Preparation Process Thereof, and Use Thereof); U.S. 특허 5,608,060(Axworthy et al., Biotinidase-Resistant Biotin-DOTA Conjugates); U.S. 특허 5,869,465(Morgan et al., Method of Receptor Modulation and Uses Therefor); U.S. 특허 5,869,466(Russell-Jones et al., Vitamin B12 Mediated Oral Delivery systems for GCSF) 등이 포함된다. 또한, H. P. C. Hogenkamp, Douglas A. Collins, Charles B. Grissom, Frederick G. West에 의해 공저된 Ruma Banerjee, Chemistry and Biochemistry of B12 John Wiley & Sons, Inc.(1999), 특히, Part II, Section 15, "Diagnostic and Therapeutic Analogues of Cobalamin" 을 참조한다.

분리가능 링커에 의해 항-종양 약물에 연결된 포르피린-유사 부분을 포함하는 공액체는 Han(U.S. 특허 공개 No. 2002/0155999)에 의해 기술되었다. 프로토포르피린(Protoporphyrin)은 링커로 유도체화되고, 이후 항-종양 화합물의 이용가능 기능기와 반응하여 공액체를 형성한다. 하지만, Han의 공액체는 종양 내에서보다는 종양을 둘러싸는 생리 조건에서 분리에 적합하다.

생체내 효능이 항암과 항-종양 치료에서 성공의 특징이긴 하지만, 효능은 과도한 전신 독성을 수반한다. 실제로, 암과 종양 세포에 대하여 증가된 독성 및 약물을 섭취하는 개체에 대하여 감소된 전신 독성을 보유하는 항암이나 항-종양 약물을 제공하는 것이 극히 바람직하긴 하지만, 이는 빈번하게 좌절된다. 선호되는 항암이나 항-종양 약물은 암이나 종양 세포에 대한 높은 살상률 및 호스트에 대한 낮은 사망률을 제공하는 약물이다. 선행 기술에서는 상응하는 유리(free) 약물에 비하여 감소된 전신 독성과 강화된 효능을 보유하는 VB12 공액체를 교시하거나 제안하지도 않으며, 이런 공액체가 여전히 필요하다.

따라서, 선행 기술이 암이나 종양의 치료를 위한 코발라민 유도체의 잠재적 유용성을 인식하고 있긴 하지만, 세포내 효소에 의해 분해되거나 가수분해되는 링커를 통하여 약물이 코발라민에 부착된 항증식성 코발라민 5'-OH 공액체를 제조하지는 못하였다. 특히, 선행 기술에서는 독소루비신을 포함하는 이런 공액체의 조제 및 종양이나 암의 치료를 위한 코발라민 5'-OH-독소루비신 공액체의 이용을 개시하지 않는다.

본 발명의 요약

본 발명은 세포막을 통한 활성 수송에 적합한 세포내 효소 분리가능 항-종양 약물과 코발라민의 공액체를 제시하는데, 상기 공액체는

a. 코발라민 또는 코발라민 유도체;

b. 코발라민 또는 코발라민 유도체의 5'-OH 부분에 공유 결합된 링커;

c. 상기 링커에 공유 결합되어 공액체를 형성하는 항-종양 약물을 포함하고, 여기서 세포내 효소에 의해 상기 약물이 링커로부터 분리되거나 링커가 상기 약물로부터 분리된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 1) 공액체는 하나이상의 선택적 스페이서를 포함한다; 2) 공액체는 링커와 코발라민의 5'-OH 부분 사이에 공유 결합된 스페이서를 포함한다; 3) 공액체는 링커와 항-종양 약물 사이에 공유 결합된 스페이서를 포함한다; 4) 항-종양 약물은 독소루비신, 파실리탁셀(TAXOL®에서 활성 성분) 및 본 명세서에 기술된 다른 약물에서 선택된다; 5) 링커는 카텝신, 엑소글리시다제, 엔도 효소, 글리코시다제, 메탈로프로테아제, 리보자임, 프로테아제, 에스테라제, 아미다제에서 선택되는 세포내 효소에 의해 약물 또는 코발라민으로부터 분리된다; 6) 코발라민 또는 코발라민 유도체는 본 명세서에 기술된 것들로부터 선택된다; 7) 공액체는 유리 항-종양 약물에 비하여 감소된 전신 독성을 보유한다; 8) 분리가능 링커는 리소좀 효소에 의해 분리된다; 9) 분리가능 링커는 제 1 말단에서 제 1 스페이서 및 제 2 말단에서 제 2 스페이서에 공유 결합된다; 10) 분리가능 링커는 카텝신 분리가능 펩티드이다; 11) 분리가능 링커는 카텝신 B 분리가능 펩티드이다; 및/또는 12) 분리가능 링커는 페닐알라닌과 리신을 포함한다.

본 발명은 또한, 일반식 I의 공액체를 제시한다:

VB-(SPa)_n-CL-(SPb)_m-DG(일반식 I), 여기서

CL은 한가지이상의 세포내 효소에 의해 VB, SPa, SPb 및/또는 DG로부터 분리되는 링커이고;

VB는 가능하면 VB의 리보오즈 고리의 5'-OH기를 통하여 CL 또는 SPa에 공유 결합된 코발라민, 또는 이의 유도체 또는 유사체이고;

SPa와 SPb는 각 경우에, 공유 결합, 이가 기능기, 비-펩티드 잔기, 또는 이들의 조합에서 독립적으로 선택되는 선택적 스페이서이고,

DG는 항-종양 약물이고;

n과 m은 각각 독립적으로, 0, 1, 2 또는 3이다.

선택적 스페이서 SPa와 SPb는 분리가능 링커 CL의 한쪽 측면에 위치할 수 있다. 가령, 이들은 링커의 VB 말단 또는 DG 말단에 위치할 수 있다. 적절한 스페이서와 링커는 본 명세서에서 상세히 기술한다. 각 경우에, 스페이서 SPa와 SPb는 본 명세서에 상세히 기술된 것들로부터 독립적으로 선택된다. SPa와 SPb는 동일하거나 상이할 수 있다. SPa가 공액체에서 하나이상 존재하는 경우에, 이의 정의는 각 경우에 독립적으로 선택된다. 유사하게, SPb가 공액체에서 하나이상 존재하는 경우에, 이의 정의는 각 경우에 독립적으로 선택된다.

본 발명의 다른 특징은 종양을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 세포로 전달되고 세포에 의해 흡수될 만큼 충분히 안정한 본 발명에 따른 공액체의 치료 효과량을 필요 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 공액체의 표적 치료 수준은 약리학 분야에서 인정된 프로토콜을 이용하여 원하는 임상 효과를 제공할 만큼 충분한다. 일반적으로, 공액체의 투여는 유리 약물의 동일 투약 섭생에서와 유사하게 공액체를 투여함으로써 수행될 수 있다. 공액체는 이런 공액체를 섭취하는 개체에서 관찰된 임상 반응에 따라, 유리 약물의 몰 농도의 초과 몰 농도 또는 미만 몰 농도로 투여될 수 있다. 이런 치료 방법은 전형적으로, 제 1 공액체 치료와 상이한 제 2 항-종양 치료제를 개체에 투여하는 단계를 선택적으로 포함한다. 상기 방법의 선택적 구체예는 2가지 이상의 상이한 공액체로 환자 치료를 제시한다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 한가지이상의 공액체 및 한가지이상의 공액되지 않은 항-종양 약물로 환자 치료를 제시한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 공액체 및 한가지이상의 제약학적 부형제를 함유하는 제약학적 조성물과 약형(dosage form)을 제시한다. 특정 구체예에서, 상기 약형은 경구, 협측, 안구, 귀, 직장, 질, 설하, 비강, 폐, 장관외, 경피에서 선택되는 경로에 의한 투여에 적합하다. 적절한 약형은 겔, 크림, 연고, 알약, 정제, 캡슐, 액체, 현탁액, 삼투 장치, 비드, 과립, 장구, 미립자, 페이스트, 프릴(prill), 재구성가능 고체, 분말, 또는 주사가능 액체이다.

본 발명의 다른 특징, 이점, 구체예는 아래의 상세한 설명 및 실시예에 의해 당업자에게 명백하다.

아래의 도면은 본 발명의 명세서의 일부이며, 본 발명의 특정 측면을 더욱 설명하기 위하여 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제공된 특정 구체예의 상세한 설명과 함께, 이들 도면을 참고하면 더욱 용이하게 이해될 수 있다.

도 1a에서는 본 발명에 따른 공액체의 제 1 구체예를 도시한다.

도 1b에서는 VB와 DG 사이의 링커가 세포내 효소에 의해 분리되지 않는 본 발명과 무관한 “효소 분리 안정성” 공액체를 도시한다.

도 2에서는 카텝신 B-분리가능 독소루비신-코발라민 공액체의 합성을 위한 전형적인 공정을 도시한다.

도 3a-3b에서는 카텝신 B-분리가능 독소루비신-코발라민 공액체의 합성을 위한 대안적 공정을 도시한다.

도 4a-4b에서는 파실리탁셀-코발라민 공액체의 합성을 위한 전형적인 공정을 도시한다.

도 5에서는 대안적 링커를 보유하는 독소루비신-코발라민 공액체를 도시한다.

도 6a에서는 MCF-7 세포에서 유리 독소루비신 vs. 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6b에서는 SK-BR-3 세포에서 유리 독소루비신 vs. 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6c에서는 HL-60(전골수성 백혈병) 세포에서 유리 독소루비신 vs. 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6d에서는 SK-N-MC 세포에서 유리 독소루비신 vs. 독소루비신-코발라민 공액체(본 발명에 따른)의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6e에서는 MCF-7 세포에서 유리 파실리탁셀 vs. 독소루비신-파실리탁셀(CobalaTaxel-17(중간물질 17)) 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6f에서는 SK-BR-3 세포에서 유리 파실리탁셀 vs. 독소루비신-파실리탁셀(CobalaTaxel-17(중간물질 17)) 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6g에서는 HT-29 세포에서 유리 파실리탁셀 vs. 독소루비신-파실리탁셀(CobalaTaxel-46(중간물질 46)) 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 6h에서는 MX-1 세포에서 유리 파실리탁셀 vs. 독소루비신-파실리탁셀(CobalaTaxel-46(중간물질 46)) 공액체(본 발명에 따른)의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 7에서는 정상적인 뮤린 림프절 세포에서 유리 독소루비신 vs. 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 8에서는 SK-N-MC 세포에서 유리 독소루비신 vs. “효소-분리 안정성” 독소루비신-코발라민 공액체(본 발명과 무관)의 시험관내 비교의 도표를 도시한다.

도 9에서는 MX-1 인간 유방 암종 이종이식편을 보유하는 무흉선 생쥐에서 유리 독소루비신 대조, 염수 대조, Cobalarubicin(독소루비신- 코발라민 공액체)의 생체내 비교의 도표를 도시한다. 비교는 종양 크기 vs. 투여후 일자에 기초한다.

도 10에서는 실시예 10에 따라 상이한 용량의 공액체(13)로 처리된 생쥐의 체중에서 변화율을 요약한 도표를 도시한다. 체중에서 변화율은 매일 측정하고, 공액체는 지정된 용량으로 매일 투여하였다.

도 11에서는 실시예 11의 절차에 따라 처리된 생쥐에서 종양 크기 vs. 투여후 일자의 관점에서, 유리 독소루비신 대조와 코발라민-독소루비신 공액체의 생체내 비교의 도표를 도시한다.

도 12a에서는 실시예 12의 절차에 따라 처리된 생쥐에서 종양 크기 vs. 투여후 일자의 관점에서, 샘플 대조, 유리 독소루비신 대조, 코발라민-독소루비신 공액체의 생체내 비교의 도표를 도시한다.

도 12b에서는 실시예 12의 절차에 따라 처리된 생쥐에서 체중 변화 vs. 투여후 일자의 관점에서, 유리 독소루비신 대조와 코발라민-독소루비신 공액체의 생체내 비교의 도표를 도시한다.

본 명세서에 이용된 일부 약어는 아래와 같이 정의된다:

AA: 아미노산

B₁₂-5'-OH: 시아노코발라민

CDT: 1,1'-카르보닐디(1,2,4-트리아졸)

DIC: 디이소프로필카르보디이미드

DIEA: 디이소프로필에틸아민

DCC: 디사이클로헥실카르보디이미드

DCU: 디사이클로헥실우레아

DMSO: 디메틸설폭사이드

Dox: 독소루비신

EEDQ: 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

HOSu: N-하이드록시숙시니미드

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

Lys: 리신

MMT: p-메톡시페닐디페닐메틸(모노메톡시트리틸)

PABOH: p-아미노벤질 알코올

PABC: p-아미노벤질카르보닐

PAPC: p-아미노페닐카르보닐

Phe: 페닐알라닌

PNP: p-니트로페닐

TMS: 트리메틸실릴

독소루비신 하이드로클로라이드는 2 ㎎/㎖ 0.9% 염 용액으로 Gensia Sicor Pharmaceuticals로부터 구입하였다. 상기 용액은 Waters C₁₈ Sep-Pak 카트리지(P/N WAT043345)에 흡수시키고 물(카트리지 용적의 3배)로 세척하여 염화나트륨을 제거하였다. 독소루비신 하이드로클로라이드는 메탄올로 용리하였다. 메탄올은 회전 증발로 제거하고, 물은 냉동 건조로 제거하였다. AA와 EEDQ는 Novabiochem으로부터 구입하였다. 카텝신 B는 Calbiochem(P/N 219364)으로부터 구입하였다. 모든 다른 화학약품과 용제는 Acros, Aldrich, Sigma, Fluka, Fisher 또는 VWR로부터 구입하고, 달리 명시하지 않는 경우에 추가적인 정제없이 사용하였다.

달리 명시하지 않는 경우에, 본 명세서에서 “코발라민”은 코발라민, 이의 유사체 또는 이의 유도체를 의미한다. 코발라민에는 비타민 B12(CB12, VB-12), 시아노코발라민, 아쿠오코발라민, 하이드록시코발라민, 메틸코발라민, 아데노실코발라민, 시아노코발라민 카바날리드, 데스디메틸 코발라민, 모노에틸아마이드 코발라민, 메틸아마이드 코발라민, 보조효소 B12, 5'-디옥시아데노실코발라민, 코바마마이드 유도체, 클로로코발라민, 설피토코발라민, 니트로코발라민, 티오시아나토코발라민, 벤즈이미다졸 유도체(가령, 5,6-디클로벤즈이미다졸, 5-하이드록시벤즈이미다졸, 트리메틸벤즈이미다졸), 아데노실시아노코발라민((Ade)CN-Cbl), 코발라민 락톤, 코발라민 락탐과 아닐리드, 에틸아마이드, VB12의 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산 유도체, VB12의 프로프리온아마이드 유도체, 5-o-메틸벤질코발민, 코발트가 다른 금속 원자, 예를 들면, 아연 또는 니켈로 대체된 이들의 유사체 등이 포함된다. VB12 또는 이의 유사체의 코린 고리 역시 트랜스코발라민에 대한 이의 결합을 완전히 제거하지는 않는 임의의 치환기로 대체될 수 있다. 상기한 화합물은 Sigma Aldrich Chemical Co., Roche Pharmaceuticals 및 제약학적 최종 산물, 중간물질, 출발 물질의 다른 상업적 공급업체를 통하여 상업적으로 구입가능하다.

스페이서는 본 발명에 따른 공액체, 일반식 I 화합물에서 선택적이다. 0, 1 또는 2개의 스페이서, 또는 스페이서의 조합이 포함될 수 있다. 스페이서는 코발라민과 링커, 코발라민과 약물, 또는 링커와 약물 사이의 거리를 조정하는 역할을 한다. 코발라민의 5'-O에서부터 CL 또는 스페이서에 약물의 부착 지점까지의 거리는 트랜스코발라민 및 공액의 분리를 주도하는 효소의 결합이 가능할 만큼 충분하다. 사용된 약물과 사용된 코발라민의 특정 형태에 따라, 최적 결과를 위한 거리는 변하게 된다.

스페이서는 공액체의 트랜스코발라민 친화성을 개선하거나, 부정적인 공간적 상호작용에 기인하는 코발라민, 링커 및/또는 약물의 결합에서 문제점을 극복하거나, 또는 공액체에서 약물의 생체이용효율을 증가시키기 위하여 도입될 수도 있다. 스페이서 화합물은 링커 또는 코발라민에 위치된 적절한 기능기와 반응하는 선택된 기능기를 각 말단에 보유하는 이중기능성 화합물인 연결제(linking agent)로서 기능할 수도 있다.

스페이서가 선택적이기 때문에, 공액체의 특정 구체예는 아래와 같다: VB-(SPa)_p-CL-DG(일반식 II); VB-CL-(SPb)_q-DG(일반식 III); VB-CL-DG(일반식 IV); VB-CL-(SPa)_p-(SPb)_q-DG(일반식 V); VB-(SPa)_p-(SPb)_q-CL-DG(일반식 VI); VB-(SPa²)(SPa¹)-CL-(SPb¹)(SPb²)-DG(일반식 VII), 여기서, p와 q는 각 경우에 독립적으로, 1, 2, 3에서 선택된다.

스페이서 SPa 또는 SPb는 선택적으로 치환된 포화되거나 불포화된, 가지형이나 선형, C_1-50 알킬렌, 사이클로알킬렌 또는 방향족 작용기를 포함할 수 있는데, 선택적으로 사슬 내에서 하나이상의 탄소가 N, O 또는 S로 대체되고, 선택적 치환기는 예로써 카르보닐, 카르복시, 하이드록시, 아미노 및 다른 작용기에서 선택된다. 2개의 스페이서가 공액체에 포함되는 경우에, 이들은 구조에서 상이하다. 스페이서는 표적 조직에서 CL이 분리된 이후 항-종양 약물로부터 분리되고 치료 효과적 형태로 약물을 세포내 방출하도록 적합된다. 본 발명에 따른 공액체에 포함되는데 적합한 스페이서는 Firestone et al., U.S. 특허 6,214,345 및 Katzenellenbogen, J. Med. Chem.(1981), 24(5), pp479-480에 기술된 것들이 포함된다. 이들 스페이서는 세포내 효소가 링커에 접근하여 이를 분리할 수 있도록 설계된다. 이들은 또한, 링커가 분리된 이후 약물로부터 분리되고 약물의 활성 형태가 형성되도록 설계된다. 스페이서는 CL, DG, VB에 공유 결합되고, 공액체가 표적 세포 또는 조직으로 전달될 때까지 화학적으로 충분히 안정하게 결합 상태를 유지한다. 특정 구체예에서, 스페이서는 표적 세포 또는 조직 내에서 효소 또는 다른 수단에 의해 세포내 분리된다. 분리가능 스페이서는 스페이스가 부착되는 분리가능 링커에서와 동일하거나 상이한 수단에 의해 분리될 수 있다. 대안으로, 스페이서는 분리가능 링커가 VB 또는 SPa로부터 세포내 분리된 이후, 분리가능 링커 및/또는 항-종양 약물로부터 실질적으로 스스로 분리된다. 특정 구체예에서, 세포내 효소는 초기에, VB-SPa 또는 VB로부터 CL-SPb-DG(또는 CL-DG)를 방출한다. 남아있는 잔기 CL-SPb-DG(또는 CL-DG)는 스스로 분리되어 유리 약물을 세포내 방출한다. 분리는 효소 분리가 먼저 진행되는 경우에 추가의 화학적 분리를 수반할 수 있기 때문에, 효소에만 의존하지는 않는다.

링커에 약물 또는 코발라민의 공액에 적합한 연장된 스페이서는 예로써 디숙시니미딜 수버레이트(DSS), 비스(설포숙시니미딜) 수버레이트(BSS), 에틸렌 글리콜비스(숙시니미딜숙시네이트)(EGS), 에틸렌 글리콜비스(설포숙시니미딜숙시네이트)(설포-EGS), p-아미노페닐아세트산, 디티오비스(숙시니미딜프로피오네이트)(DSP), 3,3'-디티오비스-(설포숙시니미딜프로피오네이트)(DTSSP), 디숙시니미딜 타르타레이트(DST), 디설포숙시니미딜 타르타레이트(설포-DST), 비스[2-(숙시니미도옥시카르보닐옥시)-에틸렌]설폰(BSOCOES), 비스[2-(설포숙시니미도옥시카르보닐옥시)-에틸렌]설폰(설포-BSOCOES), 디메틸 아디피미데이트 2HCl(DMA), 디메틸 피멜리미데이트.2HCl(DMP), 디메틸 수베리미데이트.2HCl(DMS)이다.

스페이서가 이가 기능기인 경우, 전방 또는 후방으로 코발라민, 분리가능 링커 또는 약물에 부착될 수 있다. 적절한 이가 기능기는 -NHNH-, -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -CONHNHCO-, -N=N-, -N=CH-, -NHCH₂-, -NHN=CH-, -NHNHCH₂-, -SCH₂-, -CH₂S-, -NHCRNH-(R은 =O, =S 또는 =NH), -COO-, 또는 -OCO-이다.

분리가능 링커 “CL”은 포유동물의 혈장 및 선택적으로 위장관에서 효소로부터 분해에 저항하기 위한 것이다. 분리가능 링커는 세포에 흡수된 이후 세포내 분리를 겪게 된다. CL은 펩티드 또는 비-펩티드이다.

공액체의 원소 (SPa)_n-CL-(SPb)_m의 및 본 명세서에 기술된 이의 다른 구체예는 개별 원소 SPa, SPb, CL 및 변수 n과 m의 특정 정의에 의해 정의되는 구조를 보유하는 “공액 단위(conjugating unit)”를 형성한다. 다시 말하면, “공액 단위”는 (SPa)_n-CL-(SPb)_m의 임의의 가능 구체예로 정의된다.

특정 구체예에 따라, 본 발명의 공액 단위는 카르복실릭 아실 단위 및 단백질 펩티드 서열로 구성된다. 공액 단위는 또한, 약물과 단백질 펩티드 서열을 가교하는 자기-희생 스페이서를 보유할 수도 있다.

공액체의 특정 구체예에서, 공액 단위는 “A-Y-Z-X-W”(일반식 XI)로 정의되는데, 여기서 “A”는 “카르복실릭 아실 단위카르복실 단위”이고, “Y”와 “Z”는 각각 아미노산이며 서로 결합하여 단백질 펩티드 서열을 형성하고, “X”와 “W”는 개별적으로, 단백질 펩티드와 약물을 가교하는 자기-희생 스페이서이다. 공액 단위 A-Y-Z-X-W는 공액 단위(SPa)_n-CL-(SPb)_m과 공액 단위(VB-(SPa²)(SPa¹)-CL-(SPb¹)(SPb²)-DG)의 아단위이다.

특정 구체예에서,

Y는 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 바람직하게는 페닐알라닌 또는 발린에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산이고;

Z는 리신, 아세틸이나 포밀로 보호된 리신, 아르기닌, 토실이나 니트로 기로 보호된 아르기닌, 히스티딘, 오르니틴, 아세틸이나 포밀로 보호된 오르니틴, 시트룰린, 바람직하게는 리신 또는 시트룰린에서 선택되는 적어도 하나의 아미노산이다.

단백질 펩티드 서열은 종양 세포에서 한가지이상의 프로테아제에 의해 공액체로부터 선별적으로 분리될 수 있도록 특이적으로 맞춤된다.

단백질 펩티드 서열의 사슬 길이는 일반적으로, 디펩티드 내지 테트라펩티드이다. 하지만, 8개 아미노산 잔기 길이의 단백질 펩티드 서열 역시 이용될 수 있다.

적절한 전형적인 펩티드 링커 기는 예로써, Phe-Lys, Val-Lys, Phe-Phe-Lys, D-Phe-L-Phe-Lys, Gly-Phe-Lys, Ala-Lys, Val-Cit. Phe-Cit, Leu-Cit, Ile-Cit, Trp-Cit, Phe-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Ala-Leu-Ala-Leu, Phe N⁹-토실-Arg, Phe-N⁹니트로-Arg이다.

공액 단위의 다수의 특이적 구체예는 특정 종양-연관된 프로테아제에 의한 효소 분리에 대한 이들의 선택성(selectivity)에 기초하여 설계되고 최적화될 수 있다. 공액 단위의 특정 구체예에서, 프로테아제 카텝신 B, C 또는 D에 의한 가수분해에 대하여 최적화된다.

상기한 바와 같이, 공액 단위는 중간생성 자기-희생체(제 2 효소 촉매된 분리를 요구하지 않고, CL의 분리이후 DG로부터 스스로 분리되는 스페이서)를 이용할 수 있다. 자기-희생 스페이서는 2개의 이격된 화학적 부분을 정상적으로 안정적인 3부분 분자로 서로 공유 결합시키고; 효소 분리로 상기 3부분 분자로부터 상기 이격된 화학적 부분 중에서 한 부분을 방출하고; 효소 분리이후, 분자의 나머지 부분으로부터 자발적으로 분리되어 상기 이격된 화학적 부분 중에서 다른 부분을 방출할 수 있는 이중기능성 화학적 부분으로 정의된다. 본 발명에서, 자기-희생 스페이서는 제 1 말단에서 단백질 펩티드 서열에 공유 결합되고 다른 말단에서 DG 부분에 공유 결합되어 단백질 펩티드 서열과 약물을 하나의 서열로 가교하고 서로 공유 결합시키는데, 상기 서열은 안정적이긴 하지만 자기-희생 스페이서와 단백질 펩티드 서열을 공유 연결시키는 결합에서 표적 효소에 의해 효소 분리됨으로써 단백질 펩티드 서열의 방출에 영향을 준다. 이후, 이런 효소 분리는 스페이서 부분의 자기-희생 특성을 활성화시키고, 자기-희생 스페이서와 약물 부분을 공유 연결시키는 결합에서 실질적으로 자발적인 분리를 유도함으로써 약리학적 활성 형태로 약물의 방출에 영향을 준다.

일반식 XI의 공액 단위에서,

X는 약물과 펩티드 단백질 서열을 가교하고 서로 공유 결합시키는 자기-희생 스페이서 부분이고, 여기서 상기 스페이서는 T 부분을 통하여 약물 부분에 연결되고, 일반식 (XII), (XIII), (XIV) 또는 (XV)의 화합물로 대표되고:

a)

(일반식 XII), T는 O, NH, N 또는 S이다;

b) -HN-R¹-COT(일반식 XIII), T는 O, NH, N 또는 S이고, R¹은 C₁-C₅ 알킬이다;

c) -NHC(HT)CO₂R²-(일반식 XIV; J: Med. Chem., 27: 1447(1984)), T는 O, NH, N 또는 S이고, R²는 H 또는 C₁- C₅ 알킬; 또는

d)

(일반식 XV); 또는

(일반식 XVI), T는 O, S, NH 또는 N이다;

W는 스페이서 부분이다.

본 명세서에서 “C₁-C₅ 알킬”은 달리 명시하지 않는 경우에, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-프로필, sec-부틸, 이소부틸, n-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, sec-펜틸 및 다른 공지된 알킬기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 1 내지 5개의 탄소 원자를 보유하는 가지형 또는 선형 탄화수소 사슬을 의미한다.

본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, PABC, GABA(아실 형태의 γ-아미노부틸산), α,α-디메틸 GABA, β,β-디메틸 GABA가 전형적인 자기-희생 스페이서이다.

일반식(XI)의 공액 단위에서, 카르복실릭 단위 “A”는 VB의 5'-0 원자를 통하여 VB 원소에 연결될 수 있다. 원소 “A”의 전형적인 구체예는 아래와 같다:

a)

b)

숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC)(Pierce Catalog p. E-15(1992))로부터 합성됨;

c)

m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르(MBS)(Pierce Catalog p. E-16(1992))로부터 합성됨;

d)

숙시니미딜 4-(p-말레이미도페닐)부틸레이트(SMPB)(Pierce catalog p. E-18(1992)로부터 합성됨;

e)

N-숙시니미딜(4-요오드아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)(Pierce catalog p. E-17(1992))로부터 합성됨; 또는

“A”는 VB의 5'-O 산소 원자를 통하여 펩티드 단백질 서열과 VB에 공유 결합된 화합물이다. 원소 “A”의 대표적인 구체예는 예로써, 아래와 같다:

a) 5'-O-[-(CH₂)₂-C(=O)-]-;

b) 5'-O-[-CH(CH₃)-C₄H₄-C(=O)-]-; 또는

c) 5'-O-[-(CH₂)₂-C(=O)NH-(CH₂)₅-C(=O)-]-.

하기 표에서는 공액체를 세포내에서 분리하는데 이용될 수 있는 전형적인 세포내 효소를 상술한다. 아래에 상술된 효소 종류, 특정 효소, 기질의 목록은 특정 구체예의 단순한 전형일 뿐이며 본 발명을 한정하지 않는다. 공액체는 공액체내에 다른 세포내 효소 계통 및 다른 특정 세포내 효소에 의한 분리에 적합한 특정 기질을 제공함으로써 이들 다른 효소에 의한 분리에 적합될 수 있다.

계통	효소	기질	산물/작용	위치
카텝신	실례: 카텝신 B	Phe-Lys	Lys 잔기의 3' 분리	리소좀
엔도 효소**	Endo H 등	GlcNAc-GlcNAc-단백질	GlcNAc 잔기 사이를 분리	세포내; 미토콘드리아
글리코시다아제	락타아제-플로르진 가수분해효소	락토오스	D-glu와 D-gal	소장에서 I형 막 단백질
글리코시다아제	알파-아밀라아제*	올리고와 폴리사카라이드: AspGlu 기질	올리고와 폴리사카라이드에서 1,4-알파-글리코시드 결합의 엔도하이드로시스(endohydrosis)	타액과 췌장 분비물
글리코시다아제	알파-만노시다아제**	올리고사카라이드 Man (9)(GlcNAc)에서 알파 1,2-연결된 알파 D-만노오스는 Asn 링크를 필요로 한다	글리코실 가수분해효소; Asn 연결된 올리고에서 만노오스 잔기를 잘라낸다	골지
푸린(furin) 프로테아제	푸린	Arg-Xaa-Yaa-Arg-Z; Y=Arg 또는 Lys	Arg-Xaa-Yaa-Arg -Z	ER/골지/트랜스-골지/리소좀
프로테아제	그랜자임(granzyme) A	소장 기질에서 Arg-Xaa >Lys-Xaa >Phe-Xaa	Arg + X 또는Lys + X	내인성
메탈로프로테아제	메탈렌도-펩티다아제 N-Arg 이염기성전환효소	Arg-이염기성 펩티드의 N-말단	Arg + 염기성 AA	세포질
리보자임	귀상어	구조 의존성;5'GUC'를 인식한다	리보자임 구조에서 3' 분리	세포내이지만 혈액에서 분해되는 것으로 알려져 있다

ㆍ 분비된 효소. 세포내에서 특이적이지 않음*

ㆍ 펩티드 구조에 대립하는 것으로서 단백질 기질을 이용하는 효소**

인간 대사의 복합적인 특성으로 인하여, 공액체를 보유하는 투약 단위(unit dose)의 일부는 개체에 투여된 이후 세포외 분리될 가능성이 있다. 세포에 의해 흡수되고, 이후 세포내에서 분리되는 공액체의 양은 원하는 임상 효과를 제공할 만큼 충분해야 한다.

도 1에서는 본 발명에 따른 전형적인 공액체를 도시한다. 실시예 1의 공정에 따라 제조될 수 있는 공액체는 제 1 스페이서(스페이서(SPb)에 결합된 독소루비신을 포함하고, 상기 스페이서는 분리가능 링커(CL)에 결합되고, 이후 상기 링커는 제 2 스페이서(SPa)에 결합되고, 상기 스페이서는 최종적으로, 코발라민(CB)의 리보오즈 고리의 5'-OH 부분에 결합된다. 스페이서의 말단 아민기(첫 번째 SPa 잔기; 6-아미노헥사논산)는 이가 카르보닐 라디칼(제 2 SPa 잔기)에 의해 리보오즈 고리의 5'-O에 결합되어 카바메이트 결합을 형성한다. SPa의 다른 말단에서, 상기 스페이서의 카르보닐기는 아마이드 결합, 특히 링커의 페닐알라닌 잔기의 말단 아민에 의해 펩티드 링커(CL, Phe-Lys-PAB)의 말단 아민에 결합된다. 링커의 카르복시 말단은 아마이드 결합에 의해 스페이서 SPb(첫 번째 SPb 잔기, 파라-아미노벤질 알코올)에 결합된다. 첫 번째 SPb의 하이드록실기는 이후, 이가 카르보닐 라디칼(두 번째 SPb 잔기)을 통하여 독소루비신(DOX)의 일차 아민에 결합된다. 따라서, 화합물(13)은 아래의 일반식: VB-SPa²SPa¹-CL-SPb¹SPb²-DG(일반식 II)를 보유한다.

공액체(13)의 전형적인 합성 공정은 하기 실시예 1과 도 2에서 상세하게 기술한다. 합성의 첫 번째 과정은 분리가능 링커 Phe-Lys의 조제에 관한다. 합성의 두 번째 과정은 분리가능 링커의 제 1 스페이서(PABC)와 항-종양 약물(DOX)에 순차적인 부착에 관한다. 합성의 세 번째 과정은 제 2 스페이서의 코발라민에 부착 및 이후, 제 2 스페이서의 분리가능 링커의 N-말단에 결합에 관한다.

따라서, Fmoc-Lys는 트리메틸실릴 클로라이드로 처리하여 카르복실 보호된 중간물질 Fmoc-Lys(TMS)TMS를 형성하고, 이는 MMT 클로라이드로 처리하여 Fmoc-Lys(MMT)TMS를 형성하고, 이는 작업(work-up) 동안 탈보호하여 중간물질 Fmoc-Lys(MMT)(1)을 형성한다. 이런 첫 번째 전환 반응은 Dubowchik et al., Bioconjugate Chem.(2002), 13, 855-869에 기술된 절차에 따라 임의의 중간물질의 분리없이 in situ로 진행된다. 중간물질(1)의 Fmoc 보호기는 디에틸아민 처리로 제거하여 Lys(MMT)(2)를 형성한다. 다른 핵심 중간물질 Fmoc-Phe-OSu(3)은 Fmoc-Phe를 N-하이드록시숙시니미드와 DCC로 처리하여 준비한다. Lys(MMT)와 Fmoc-Phe-OSu는 디이소프로필에틸아민의 존재하에 결합시켜 Fmoc-Phe-Lys(MMT)(4)를 형성한다. 스페이서(PAB; SPb¹)의 첫 번째 부분은 에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(EEDQ)의 존재하에 p-아미노벤질 알코올을 (4)와 반응시킴으로써 분리가능 링커에 부착시켜 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH(5)를 형성한다. 상기 스페이서의 이가 카르보닐 부분(SPb²)은 중간물질(5)를 비(4- 니트로페닐)카보네이트(PNP)로 처리하여 활성화된 중간물질 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(6)을 형성한다. 이후, 독소루비신을 활성화된 중간물질(6)과 반응시켜 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(7)을 형성한다. Phe의 N-말단은 디에틸아민으로 중간물질(7)을 처리함으로써 탈보호하여 Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(8; CL-SPb¹SPb²-DG)를 형성한다.

시아노코발라민은 1,1'-카르보닐디(1,2,4-트리아졸)(CDT)로 처리하여 트리아졸 활성화된 시아노코발라민(4; B₁₂-5'-OCO-(1,2,4-트리아졸)을 형성하고, 이는 스페이서(SPa; 6-아미노헥사노일 라디칼)와 결합시켜 CB-SPa² 잔기(10, B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO₂H)를 형성한다. 상기 잔기를 분리가능 링커의 N-말단에 결합시키기에 앞서, 카르복실기는 N-하이드록시숙시니미드로 중간물질(10)을 처리함으로써 활성화시켜 활성화된 중간물질 B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅COOSu(11)을 형성한다. 이후, 2가지 핵심 중간물질 (8)과 (11)을 반응시켜 보호된 공액체(12)(B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox를 형성하고, 이는 디클로로아세트산으로 탈보호하여 공액체(13)(B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-Dox)을 형성한다.

더욱 일반적으로, 도 2에 도시된 합성 전략은 아래의 단계로 요약될 수 있다:

+ 보호된 분리가능 링커를 준비한다;

+ 분리가능 링커와 스페이서(SPb)를 포함하는 제 1 잔기를 준비한다;

+ 분리가능 링커, SPb, 항-종양 약물(DG)을 포함하는 제 2 잔기를 준비한다;

+ 코발라민과 스페이서(SPa)를 포함하는 제 3 잔기를 준비한다;

+ 제 2와 제 3 잔기를 결합시켜 본 발명에 따른 공액체를 형성한다.

제 2 잔기는 제 3 잔기 전후에 형성될 수 있다.

대안으로, 본 발명에 따른 공액체는 도 3a에 도시되고 아래에 개략적으로 기술된 합성 전략에 따라 조제될 수 있다. SPa 잔기는 활성화되고 CL의 첫 번째 아미노산(AA₁) 잔기와 결합하여 SPa-AA₁ 중간물질을 형성하고, 이는 활성화되고 CL의 두 번째 아미노산(AA₂) 잔기와 반응하여 SPa-CL 중간물질을 형성한다. SPa-CL 중간물질은 이후, 활성화되고 SPb 잔기와 반응하여 SPa-CL-SPb 중간물질을 형성하고, 이는 활성화되고 항-종양 약물과 결합하여 SPa-CL-SPb-DG 중간물질을 형성한다. 코발라민(VB)은 활성화되고 SPa-CL-SPb-DG 중간물질과 결합하여 VB-SPa-CL-SPb-DG, 일반식 I 화합물을 형성하는데, 이는 선택적으로, 하나이상의 보호기를 포함한다.

도 3a의 합성 전략은 아래에서 더욱 상세하게 기술된다. Fmoc N-보호된 6-아미노헥사논산은 HOSu로 활성화시켜 반응성 중간물질(21)을 형성하고, 이는 Phe와 반응시켜 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe(22)를 형성한다. 상기 중간물질은 HOSu로 활성화시켜 반응성 중간물질(23)을 형성하고, 이는 앞서 형성된 Lys(MMT)와 반응시켜 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)(24)를 형성한다. 이후, 제 2 스페이서 PAB를 상기 링커의 C-말단과 결합시켜 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABOH(25)를 형성하고, 이는 (PNP)₂CO(이가 카르보닐 라디칼 전구물질)로 활성화시켜 중간물질 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(26)을 형성한다. 중간물질(26)은 Dox와 결합시켜 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(27)을 형성하고, 이의 N-말단은 디에틸아민으로 탈보호하여 보호되지 않은 중간물질 H₂N(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(28)을 형성한다. 코발라민의 5'-OH 부분은 친전자성 이가 카르보닐 라디칼 전구물질, 예를 들면, CDT로 활성화시켜 B₁₂-5'-OCO(1,2,4-트리아졸)(9)를 형성한다. 2가지 중간물질(9와 28)은 결합시켜 보호된 공액체 B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(29)를 형성하고, 이는 탈보호하여 공액체(13)을 산출한다.

상기 공액체(13)은 도 3b에 도시된 합성 전략에 따라 조제될 수도 있다. 이 경우에, 중간물질 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH(5)는 DEA로 처리하여 중간물질 Phe-Lys(MMT)-PABOH(31)을 형성하고, 이는 중간물질 Fmoc-NH(CH₂)₅-COOSu(21)과 반응시켜 중간물질 Fmoc-NH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABOH(25)를 형성한다. 상기 중간물질은 이후, 도 3a에 도시된 경로를 통하여 원하는 공액체(13)로 전환시킨다.

본 명세서에 상세하게 기술된 바와 같이, 다른 항-종양 약물이 본 발명에 따른 공액체에 포함될 수 있다. 도 4a에서는 파실리탁셀을 포함하는 공액체의 조제를 위한 실시예 14에 따른 합성 전략을 도시한다. 파실리탁셀이 상이한 반응성을 갖는 3개의 하이드록실 부분을 보유하기 때문에, 공액체는 파실리탁셀에 이용되는 보호기 전략에 따라, 이들 세 부분 중에서 하나에 링커를 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 가령, 2'-OH가 보호기로 유도체화되면, 파실리탁셀은 7-OH에 의해 스페이서 또는 링커에 부착될 수 있다. 도 4a의 구체예에서, 파실리탁셀은 유기 염기, 예를 들면, 피리딘의 존재하에 MMT 클로라이드로 처리함으로써 2'-하이드록실 부분을 트리틸화(tritylation)시키고 부분적으로 보호된 중간물질(41, 파실리탁셀 2'-MMT)을 형성한다. 중간물질(41)은 이후, 트리클로로메틸 클로로포름산염으로 처리하여 활성 중간물질(42; 파실리탁셀-2'-MMT-7-OCOCl)을 형성한다. 상기 반응성 중간물질은 라이너-스페이서 잔기(5, Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH; CL-SPb)와 반응시켜 중간물질(43; Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-7 파실리탁셀-2'-MMT; CL-SPb-DG)을 형성한다. 중간물질(43)의 N-말단은 예로써 DBU로 탈보호하여 보호되지 않은 중간물질(44)를 형성하고, 이는 VB-스페이서 잔기(11; VB-SPa)에 결합시켜 보호된 공액체 B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-7-파실리탁셀-2'-MMT(45)를 형성한다. 상기 중간물질은 예로써 디클로로아세트산으로 탈보호하여 공액체 B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-7-파실리탁셀(46)을 형성한다.

도 4a에 도시된 합성 전략은 아래와 같이 개략적으로 요약될 수 있다. 항-종양 약물은 필요에 따라 보호되고, 스페이서(SPb) 또는 링커(CL)의 말단을 수용할 수 있는 이가 기능기로 유도체화된다. 이렇게 유도체화된 약물은 스페이서(SPb), 링커(CL), 또는 스페이서와 링커를 포함하는 잔기(CL-SPb)와 반응하여 중간물질 CL-SPb-DG를 형성한다. 상기 링커의 말단은 탈보호되고(선택적으로) 반응성 코발라민-스페이서 잔기(VB-SPa)에 결합되어 일반식 I(VB-SPa-CL-SPb-DG) 화합물을 형성하는데, 이는 선택적으로 하나이상의 보호기를 포함한다. 가능하면, 공액체의 보호기는 제거되는 보호기의 유형에 따라, 이들의 제거에 적합한 조건을 이용하여 선택적으로 제거된다.

도 4b에서는 실시예 13에 따른 파실리탁셀-포함 공액체의 조제를 위한 대안적 합성 전략을 도시한다. 도 4b의 공액체는 도 4a의 공액체와 구별되는데, 그 이유는 이들 공액체가 스페이스와의 결합에서 파실리탁셀의 상이한 하이드록실기를 이용하기 때문이다. 본 구체예에서, 앞서 형성된 반응성 중간물질(6)은 DMAP(유기 염기)의 존재하에 파실리탁셀과 반응하고 파실리탁셀의 2'-하이드록실 부분에 결합하여 부분적으로 보호된 중간물질(14, Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀)을 형성한다. Fmoc 보호기는 중간물질(14)를 DBU(1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔)로 처리함으로써 제거되고 부분적으로 보호된(Lye-보호된) 중간물질(15; Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀)을 형성한다. 중간물질(15)를 앞서 형성된 중간물질(11)과 반응시킴으로서, 보호된 공액체(16; B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-phe-Lys(MMT)-PABC-29-파실리탁셀)가 형성된다. 상기 N-보호된 공액체는 예로써, 디클로로아세트산으로 탈보호되어 보호되지 않은 공액체 B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-2'-파실리탁셀(17)을 형성하는데, 이는 염 또는 유리 염기 형태로서 분리될 수 있다.

도 4b에 도시된 합성 전략은 아래와 같이 개략적으로 요약될 수 있다. 보호되지 않은 항-종양 약물은 링커(CL)에 공유 결합된 스페이서(Sub¹)를 포함하는 중간물질에 결합된 아실 기능(SPb²) 기로 유도체화된다. 이렇게 유도체화된 약물은 스페이서 (SPa²)(SPa¹)에 공유 결합된 코발라민을 포함하는 다른 중간물질과 반응하여 하나이상의 보호기를 포함하는 일반식 VII(VB-(SPa²)(SPa¹)-CL-(SPb¹)(SPb²)-DG)를 형성한다. 가능하면, 공액체의 보호기는 제거됨으로써 보호되지 않은 형태의 일반식 VII 화합물을 형성하는 보호기의 유형에 따라, 이들의 제거에 적합한 조건을 이용하여 선택적으로 제거된다.

도 5에서는 본 발명에 따른 공액체를 조제하는 다른 대안적 합성 전략을 도시한다. VB12는 에틸 4-이소시아나토벤조에이트와 반응하여 코발라민-스페이서 중간물질 B₁₂-5'-OCO-PAPC-OEt(51)을 형성한다. 상기 중간물질은 이후, 탄산칼륨으로 탈에스테르화되어 유리산 OH(52)를 형성한다. 상기 유리산은 HOSu와 DCC로 활성화되어 반응성 중간물질(53)을 형성하고, 이는 링커-스페이서-약물 중간물질 Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(8)과 결합하여 보호된 공액체 B₁₂-5'-OCO-PAPC-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(54)를 형성한다. 상기 보호된 공액체는 디클로로아세트산으로 탈보호되어 공액체 B₁₂-5'-OCO-PAPC-Phe-Lys-PABC-Dox(55)를 형성한다.

도 5에 도시된 합성전략은 아래와 같이 더욱 개략적으로 요약될 수 있다. 코발라민-스페이서 잔기(VB-SPa)는 코발라민을 스페이서에 결합시킴으로써 조제된다. 분리가능 링커 CL, 또는 잔기 CL-SPb는 상기 잔기에 부착되어 각각, 중간물질 VB-SPa-CL, 또는 VB-SPa-CL-SPb를 형성한다. 중간물질 VB SPa-CL가 형성된 경우에, 이는 더욱 처리되어 중간물질 VB-SPa-CL-SPb를 형성한다. 이후, 약물이 VB-SPa-CL-SPb 중간물질에 부착되어 일반식 I의 공액체 VB-SPa CL-SPb-DG를 형성한다. 출발 물질, 잔기, 중간물질은 필요에 따라 하나이상의 보호기를 선택적으로 포함한다. 가능하면, 공액체의 보호기는 제거되는 보호기의 유형에 따라, 이들의 제거에 적합한 조건을 이용하여 선택적으로 제거된다. 유사한 방식으로, 출발 물질, 잔기, 중간물질의 보호기는 결합 반응을 조절하기 위하여 필요에 따라 부가되고 제거될 수 있다.

본 명세서에 기술된 합성 전략에서, 공액체의 합성은 코발라민, 약물, 스페이서 또는 링커로부터 시작될 수 있다. 공액체의 나머지 부분은 이후에 순차적으로(한 번에 1개, 2개 또는 3개) 결합되어 최종 공액체를 형성한다.

하나이상의 반응성 기능기를 보유하는 약물, 스페이서, 링커, 코발라민(본 명세서에 기술된 모든 형태)은 널리 공지되어 있다. 이의 실례는 본 명세서에서 개시된다. 일반식 I 화합물의 다양한 성분(VB, SPa, CL, SPb, DG)의 결합동안, 때때로 다른 기능기에서는 결합 반응을 허용하면서 일부 반응성 기능기를 보호하는 보호기 화학 작용을 이용하는 것이 필요하다. 이를 위하여, 임의의 공지된 보호기가 이용될 수 있는데, 단 이들은 합성 전략에 의해 필요에 따라, 후속의 결합 반응에서 역할을 수행하고 분리될 만큼 충분히 안정적이어야 한다. 전형적인 보호기는 본 명세서에 개시되어 있고, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition(Greene and Wuts eds., John Wiley & Sons, New York(1999)); Protective Groups in Organic Chemistry(J.F.W. McOmie, ed., Plenum Pub. Corp.(1973)); "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Academic Press, New York(1981)에 기재된 것들을 포괄한다.

본 명세서에서, “아민 보호기”(또는 “N-보호된”)는 아민기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 작용기를 의미한다. 본 명세서에서, “아민 보호기 반응물”은 아민과 반응하여 아민 보호기로 보호된 아민을 제공하는 아민기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 반응물을 의미한다. 전형적인 아민 보호기에는 1) 아실 유형, 예를 들면, 포밀, 트리플루오르아세틸, 프탈릴, p-톨루엔설포닐; 2) 방향족 카바메이트 유형, 예를 들면, 벤질옥시카르보닐(Cbz)과 치환된 벤질옥시카르보닐, 1-(p-비페닐)-1-메틸에톡시카르보닐, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc); 3) 지방족 카바메이트 유형, 예를 들면, tert-부틸옥시카르보닐(Boc), 에톡시카르보닐, 디이소프로필메톡시카르보닐, 알릴옥시카르보닐; 4) 환형 알킬 카바메이트 유형, 예를 들면, 사이클로펜틸옥시카르보닐과 아다만틸옥시카르보닐; 5) 알킬 유형, 예를 들며, 트리페닐메틸과 벤질; 6) 트리알킬실란, 예를 들면, 트리메틸실란; 7) 티올 보유 유형, 페닐티오카르보닐과 디티아숙시노일 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

아민 보호기에는 2,7-디-t-부틸-[9-(10,1O-디옥소-10,10,10,1O-테트라하이드로티오-산틸)]메틸옥시카르보닐; 2-트리메틸실릴-에틸옥시-카르보닐; 2-페닐에틸옥시카르보닐; 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸옥시카르보닐; 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸옥시카르보닐; 벤질옥시카르보닐; p-니트로벤질옥시카르보닐; 2-(p-톨루엔설포닐)-에틸옥시카르보닐; m-클로로-p-아실옥시벤질옥시카르보닐; 5-벤지이속사졸릴-메틸옥시카르보닐; p-(디하이드록시보릴)벤질옥시카르보닐; m-니트로페닐옥시카르보닐; o-니트로벤질옥시카르보닐; 3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐; 3,4-디메톡시-6-니트로벤질옥시-카르보닐; N'-p-톨루엔설포닐-아미노카르보닐; t-아밀옥시카르보닐; p-데실옥시벤질옥시-카르보닐; 디이소프로필메틸옥시카르보닐; 2,2-디메톡시카르보닐비닐옥시카르보닐; 디(2-피리딜)메틸옥시카르보닐; 2-푸라닐메틸옥시-카르보닐; 프탈리미드; 디티아숙시니미드; 2,5-디메틸피롤; 벤질; 5-디벤질수베릴; 트리페닐메틸; 벤질리덴; 디페닐메틸렌; 또는 메탄설폰아마이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서, “카르복실 보호기”는 카르복실기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 작용기를 의미한다. 카르복실 보호기의 실례에는 1) 치환된 메틸 에스테르 유형, 예를 들면, 메톡시메틸, 테트라하이드로피라닐, 벤질옥시메틸, N-프탈리미도메틸; 2) 2-치환된 에틸 에스테르 유형, 예를 들면, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-메틸티오에틸, t-부틸에틸, 신나밀에틸, 벤질에틸, 2-(2'-피리딜)에틸; 3) 치환된 벤질 에스테르 유형, 예를 들면, 트리페닐메틸, 9-안트릴메틸, p-니트로벤질, 4-피콜릴, 2,4,6-트리메틸벤질; 4) 실릴 에스테르 유형, 예를 들면, 트리메틸실릴, t-부틸디메틸실릴, 페닐디메틸실릴; 5) 기타 유형, 예를 들면, 옥사졸, 오르토에스테르; 6) 아마이드 유형, 예를 들면, N,N-디메틸, 피페리디닐, 피롤리디닐; 7) 하이드라지드 유형, 예를 들면, 알킬화된 하이드라지드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 명세서에서, “하이드록시 보호기”(또는 “O-보호된”)는 하이드록실기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 작용기를 의미한다. 본 명세서에서, “하이드록시 보호기 반응물”은 하이드록시와 반응하여 하이드록시 보호기로 보호된 하이드록시기를 제공하는 하이드록시기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 반응물을 의미한다. 하이드록시 보호기는 염기-안정한데, 여기에는 아실 유형, 방향족 카바메이트 유형, 알킬 유형이 포함될 수 있지만 이들에 국한되지 않는다. 전형적으로, 메틸, 메톡시메틸(MOM), 메틸티오메틸, 벤질옥시메틸, t-부톡시메틸, 2-메톡시에톡시메틸, 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸(SEM), 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, t-부틸, 트리페닐메틸, 트리메틸실릴, 트리에틸실릴, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 피발로에이트 또는 N-페닐카바메이트이다.

적절한 하이드록시 보호기는 에테르: 테트라하이드로피라닐, 트리페닐메틸, 벤질, 테트라하이드로푸라닐, 알릴, 메톡시메틸(MOM), 벤질옥시메틸, p-메톡시벤질옥시메틸, 2-트리메틸실릴에톡시메틸(SEM), t-부톡시메틸, 메틸티오메틸, 2-메톡시에톡시메틸, 트리클로로에톡시메틸, t-부틸, p-메톡시벤질, t-부틸디메틸실릴, o-니트로벤질, p-메톡시페닐디페닐메틸, p-니트로벤질, 트리이소프로필실릴, t-부틸디페닐실릴과 같은 보호기이다.

본 명세서에서, “설피드릴 보호기”(또는 “O-보호된”)는 설피드릴기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 작용기를 의미한다. 본 명세서에서, “설피드릴 보호기 반응물”은 설피드릴과 반응하여 설피드릴 보호기로 보호된 설피드릴기를 제공하는 설피드릴기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 반응물을 의미한다. 적절한 설피드릴 보호기에는 보호되는 설피드릴기와 이황화 결합을 형성할 수 있는 다른 설피드릴-보유 화합물 및 Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition(Greene and Wuts eds., John Wiley & Sons, New York(1999)); Protective Groups in Organic Chemistry(J.F.W. McOmie, ed., Plenum Pub. Corp.(1973))에 기재된 것들이 포함된다.

본 명세서에서, “케톤 보호기”(또는 “O-보호된”)는 케톤기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 작용기를 의미한다. 본 명세서에서, “케톤 보호기 반응물”은 케톤과 반응하여 케톤 보호기로 보호된 케톤기를 제공하는 케톤기의 보호를 위한 유기 합성 분야에 공지된 임의의 반응물을 의미한다. 적절한 케톤 보호기에는 환형 아세틸 및 Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition(Greene and Wuts eds., John Wiley & Sons, New York(1999)); Protective Groups in Organic Chemistry(J.F.W. McOmie, ed., Plenum Pub. Corp.(1973))에 기재된 것들이 포함된다.

본 명세서에 기술된 화합물은 비대칭 중심을 보유할 수 있다. 모든 키랄 형태, 부분입체이성질체 형태, 라셈체 형태가 본 발명에 포함된다. 올레핀, C=N 이중결합 등의 많은 기하학적 이성질체 역시 본 발명의 화합물에 포함될 수 있고, 이러한 모든 안정적인 이성질체가 본 발명에서 고려된다. 본 발명의 특정 화합물은 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 보유하고, 광학적 활성 형태 또는 라세미 형태로 분리된다. 광학적 활성 출발 물질로부터 광학적 활성 형태를 조제하는 방법, 예를 들면, 라세미 형태의 분해, 또는 합성은 당분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물의 시스와 트랜스 기하학적 이성질체는 이성질체의 혼합물로서 분리되거나, 또는 격리된 이성질체 형태로 분리될 수 있다. 특정 입체화학 형태 또는 이성질체가 형태가 구체적으로 명시되지 않는 경우에, 한 구조의 모든 키랄 형태, 부분입체이성질체 형태, 라세미 형태, 기하학적 이성질체 형태가 의도된다.

임의의 변수(가령, R. m 등)가 화합물에 대한 임의의 구조체 또는 일반식에서 한번 이상 존재하는 경우에, 각 경우에 이들의 정의는 각 다른 경우에서 이들의 정의와 무관하다. 가령, 한 작용기가 0-3 R로 치환되는 것으로 나타나는 경우, 상기 작용기는 최대 3개의 R로 치환되고, 각 경우에 R은 가능 R의 정의된 목록에서 독립적으로 선택된다. 또한, 치환기 및/또는 변수의 조합은 이런 조합이 안정적인 화합물을 결과하는 경우에만 허용된다. 안정적인 화합물 또는 안정적인 구조란 반응 혼합물로부터 유용한 수준의 순도까지 분리를 견뎌낼 만큼 충분히 강한 화합물을 의미한다. 유사하게, 예로써 -C(R)-기의 경우에, C에서 2개의 R 치환기 각각은 가능 R의 정의된 목록에서 독립적으로 선택된다.

본 발명에 따른 공액체는 고형 종양과 백혈병을 비롯하여, 아푸도마 종양(apudoma), 분리종(choristoma), 새종(branchioma), 악성 카르시노이드 증후군(malignant carcinoid syndrome), 유암 심장병(carcinoid heart disease), 암종(carcinoma)(가령, Walker, 거저 세포(basal cell), 기저 편평(basosquamous), Brown-Pearce, 도관(ductal), Ehrlich 종양, in situ, Krebs 2, Merkel 세포, 점액성(mucinous), 비소세포 폐(non-small cell lung), 귀리 세포(oat cell), 유두상(papillary), 경성(scirrhous), 세기관지(bronchiolar), 기관지원성(bronchogenic), 편평 상피 세포(squamous cell), 이행 세포(transitional cell)), 조직구성 질환(histiocytic disorder), 백혈병(가령, B 세포, 혼성 세포, 무표지 세포(null cell), T 세포, HTLV-II-연관된, 림프구 급성, 림프구 만성, 비만 세포(mast cell), 골수성(myeloid)), 조직구성 악성(histiocytosis malignant), 호지킨병(Hodgkin disease), 면역증식성 소형(immunoproliferative small), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma), 악성형질세포종(plasmacytoma), 세망내피증(reticuloendotheliosis), 흑색종(melanoma), 연골모세포종(chondroblastoma), 연골종(chondroma), 연골육종(chondrosarcoma), 섬유증(fibroma), 섬유육종(fibrosarcoma), 거대 세포 종양(giant cell tumor), 조직구증(histiocytoma), 지방종(lipoma), 지방육종(liposarcoma), 중피종(mesothelioma), 점액종(myxoma), 점액육종(myxosarcoma), 골종(osteoma), 골육종(osteosarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 활막종(synovioma), 선섬유종(adenofibroma), 선림프종(adenolymphoma), 암육종(carcinosarcoma), 척삭종(chordoma), 두개인두종(craniopharyngioma), 미분화세포종(dysgerminoma), 과오종(hamartoma), 간엽세포종(mesenchymoma), 난소중신암(mesonephroma), 근육종(myosarcoma), 에나몰모세포종(ameloblastoma), 백악종(cementoma), 치아종(odontoma), 기형종(teratoma), 흉선종(thymoma), 영양막 종양(trophoblastic tumor), 선암종(adenocarcinoma), 선종(adenoma), 담관종(cholangioma), 진주종(cholesteatoma), 원주종(cylindroma), 췌장 낭선암(cystadenocarcinoma), 낭선종(cystadenoma), 과립막(granulosa), 남녀성 세포 함유종(gynandroblastoma), 간종양(hepatoma), 한선종(hidradenoma), 섬세포 종양(islet cell tumor), 라이디히세포종(Leydig cell tumor), 유두종(papilloma), 세르톨리세포종(Sertoli cell tumor), 난포막 세포 종양(theca cell tumor), 평활근종(leiomyoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 근모세포종(myoblastoma), 근종(myoma), 근육종(myosarcoma), 횡문근종(rhabdomyoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 상의세포종(ependymoma), 신경절신경종(ganglioneuroma), 신경교종(glioma), 수모세포종(medulloblastoma), 수막종(meningioma), 신경초종(neurilemmoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 신경상피종(neuroepithelioma), 신경섬유종(neurofibroma), 신경종(neuroma), 부신경절종(paraganglioma), 비크롬친화성 부신경절종(paraganglioma nonchromaffin), 혈관각화종(angiokeratoma), 호산구증다증을 동반한 혈관림프성 증식증(angiolymphoid hyperplasia with eosinophilia), 경화성 맥관종(angioma sclerosing), 혈관종증(angiomatosis), 사구체종(glomangioma), 혈관내피종(hemangioendothelioma), 혈관종(hemangioma), 혈관주위세포종(hemangiopericytoma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 림프관종(lymphangioma), 림프관근종(lymphangiomyoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 송과체종(pinealoma), 암육종(carcinosarcoma), 연골육종(chondrosarcoma), 엽상낭육종(cystosarcoma phyllodes), 섬유육종(fibrosarcoma), 혈관육종(hemangiosarcoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈육종(leukosarcoma), 지방육종(liposarcoma), 림프관육종(lymphangiosarcoma), 근육종(myosarcoma), 점액육종(myxosarcoma), 난소 암종(ovarian carcinoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 육종(가령, 유잉, 실험적, 카포시(Kaposi), 비만 세포), 신생물(가령, 뼈, 유방, 소화계, 결장직장, 간, 췌장, 뇌하수체, 고환, 안화, 두경부, 중추신경계, 귀, 골반, 호흡기, 생식기), 신경섬유종성(neurofibromatosis), 자궁경부 이형성(cervical dysplasia)과 같은 임의 유형의 암에 대한 치료 또는 치료제의 개발 및 세포가 영속화되거나 형질전환되는 다른 이상의 치료에 유용하다. 본 발명에 따른 공액체는 다른 치료 양식, 예를 들면, 화학요법, 냉동요법(cryotherapy), 고열요법(hyperthermia), 방사선 요법 등과 병용될 수 있다.

본 명세서에서, “성장 조절”은 온혈 동물에서 증식성 종양의 성장과 전이를 지연, 교란, 정지 또는 중단시키는 것을 의미한다; 다른 세포독성 항-종양 약물의 부가된 효과와 함께 또는 이런 효과 없이 온혈 동물에서 공액체 치료(종양 성장의 조절)는 종양 조직이 파괴되거나 완전히 소멸된다는 의미에서, 종양에 대한 “치료법”을 제공하지 못할 수도 있다.

일반적으로, 항-종양 약물은 개별적으로 또는 조합으로 환자에 투여될 수 있다. 부가적으로, 항-종양 약물은 다른 항-종양 요법과 병용될 수 있다. 가령, 항-종양 약물은 종양의 외과적 절개, 또는 방사선 요법, 면역 요법 또는 국소 가열 요법과 병용될 수 있다. 이런 병용 요법이 종양의 치료에 이용되는 경우에, 항-종양 약물은 종양을 치료하는데 효과적인 것으로 당분야에 알려져 있는 용량으로 투여된다. 대안으로, 한가지이상의 항-종양 약물이 치료에 사용되는 경우에, 한가지이상의 약물은 특정 종양에 대한 다른 약물과 부가적 또는 상승적 효과를 유도한다. 따라서, 이런 병용 항-종양 요법이 이용되는 경우에, 투여되는 한가지이상의 항-종양 약물의 용량은 항-종양 약물이 단독으로 사용되는 경우에 투여되는 용량보다 적다. 이런 이유로, 병용되는 항-종양 약물은 단독으로 사용되는 경우보다 적은 용량 수준 또는 축소된 빈도로 투여된다.

화학치료제로 알려져 있는 항-종양 약물(DG)은 한가지이상 형태의 암이나 종양에 생물학적 활성을 나타내고, 효능의 과도한 손실없이 분리가능 링커(CL) 또는 선택적 스페이서(SPb)에 연결될 수 있는 화합물이다. 적절한 항-종양 약물에는 항신생물제, 안드로겐 저해물질, 항생제, 항에스트로겐, 항대사물질, 세포독성제, 면역조절제, 질소 겨자, 스테로이드, 알킬화제, 항유사분열제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라제(topoisomerase) I 저해물질, 토포아이소머라제 II 저해물질, 생물학적 산물, DNA 손상제, 항대사물질, 자연 산물과 이들의 유사체, 호르몬, 길항제 효소 저해물질, 다른 종류/유형의 항-종양 약물, 원하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질이나 폴리펩티드, 종양 치료 분야에서 공지된 다른 약물, 이들의 조합 등이 포함된다.

본 발명에 따른 적절한 항-종양 화합물의 전형적인 화합물은 아래에 상세히 기술한다. 항-종양 화합물의 효능(세포독성)이 인정된 종양은 괄호 안에 표시한다. 비록, 아래에 제시된 항-종양 약물의 유리 형태가 지정된 종양에 대하여 활성을 나타내는 것으로 알려져 있긴 하지만, 본 발명에 따른 공액체는 유사한, 상이한, 더욱 넓은 또는 더욱 좁은 범위의 활성을 보유할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 공액체의 항-종양 활성은 상응하는 유리 약물에 대하여 지정된 종양에 반드시 한정되는 것은 아니다.

질소 겨자: 메클로레타민(호지킨병, 비-호지킨 림프종), 사이클로포스마이드 이포스파마이드(급성과 만성 림프구성 백혈병, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경모세포종, 유방, 난소, 폐, 윌름 종양, 경부, 고환, 연조직 육종), 멜팔란(L-사르콜리신)(다발성 골수종, 유방, 난소), 클로람부실(만성 림프성 백혈병, 원발성 마크로글로불린 혈증(primary macroglobulinemia), 호지킨병, 비-호지킨 림프종).

에틸렌이민과 메틸멜라민: 헥사메틸멜라민(난소), 티오테파(방광, 유방, 난소).

알킬 설포네이트(alkyl sulfonate): 부설판(만성 과립구성 백혈병).

니트로소우레아(nitrosourea): 카르무스틴(BCNU)(호지킨병, 비-호지킨 림프종, 원발성 뇌종양, 다발성 골수종, 악성 흑색종), 로무스틴(CCNU)(호지킨병, 비-호지킨 림프종, 원발성 뇌종양, 소세포 폐), 세무스틴(메틸-CCNU)(원발성 뇌종양, 위, 결장), 스트렙토조신(악성 췌장 인슐린증(malignant pancreatic insulinoma), 악성 칼시노인(malignant carcinoin)).

트리아젠(Triazenes): 데카르바진(DTIC; 디메틸트리아제노이미드-아졸레카르복사마이드)(악성 흑색종, 호지킨병, 연조직 육종).

엽산(folic acid) 유사체: 메토트렉세이트(아메토프테린)(급성 림프성 백혈병, 융모막암종(choriocarcinoma), 균상식육증(mycosis fungoides), 유방, 두경부, 폐, 골원성 육종(osteogenic sarcoma)).

피리미딘(pyrimidine) 유사체: 플루오르우라실(5-플루오르우라실; 5-FU) 플록수리딘(플루오르디옥시우리딘; FUDR)(유방, 결장, 위, 췌장, 난소, 두경부, 방광, 전암성 피부 병소(premalignant skin lesions))(국소), 시타라빈(시토신 아라비노시드)(급성 과립구성과 급성 림프성 백혈병).

퓨린(purine) 유사체 및 관련 저해물질: 멀캡토퓨린(6-멀캡토퓨린, 6-MP)(급성 림프구성, 급성 과립구성과 만성 과립구성 백혈병), 티오구아닌(6-티오구아닌: TG)(급성 과립구성, 급성 림프성과 만성 과립구성 백혈병), 펜토스타틴(2'-디옥시코포마이신)(털 세포 백혈병(hairy cell leukemia), 균상식육증, 만성 림프성 백혈병).

빈카 알칼로이드(vinca Alkaloid): 빈블라스틴(VLB)(호지킨병, 비-호지킨 림프종, 유방, 고환), 빈크리스틴(급성 림프성 백혈병, 신경모세포종, 윌름 종양, 횡문근육종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 소세포 폐).

에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin): 에토포시드(고환, 소세포 폐와 다른 폐, 유방, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 급성 과립구성 백혈병, 카포시 육종), 테니포시드(고환, 소세포 폐와 다른 폐, 유방, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 급성 과립구성 백혈병, 카포시 육종).

항증식제/항생제: 닥티노마이신(악티노마이신 D)(융모막암종, 윌름 종양, 횡문근육종, 고환, 카포시 육종), 다우노루비신(다우노마이신; 루비도마이신)(급성 과립구성과 급성 림프성 백혈병), 독소루비신(연조직, 골원성, 다른 육종; 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 급성 백혈병, 유방, 생식비뇨기, 갑상선, 폐, 위, 신경모세포종), 블레오마이신 I(고환, 두경부, 피부, 식도, 폐, 비뇨생식기, 호지킨병, 비-호지킨 림프종), 필리카마이신(미트라마이신)(고환, 악성 고칼슘혈증(malignant hypercalcema)), 미토마이신(미토마이신 C)(위, 경부, 결장, 유방, 췌장, 방광, 두경부).

효소: L-아스파라기나아제(급성 림프성 백혈병).

생물학적 반응 조절제(biological response modifier): 인터페론-알파(털 세포 백혈병, 카포시 육종, 흑색종, 유암종, 신장 세포, 난소, 방광, 비-호지킨 림프종, 균상식육증, 다발성 골수종, 만성 과립구성 백혈병).

에스트로겐: 디에틸스티베스트롤 에티닐 에스트라디올(유방, 전립선)

안티에스트로겐: 타목시펜(유방).

안드로겐: 테스토스테론 프로피오네이트 플룩소미에스테론(유방).

안티안드로겐: 플루타마이드(전립선).

생식선자극호르몬방출호르몬 유사체: 레우프롤리드(전립선).

백금 동위 착화물(platinum coordination complex): 시스플라틴(cis-DDP) 카보플라틴(고환, 난소, 방광, 두경부, 폐, 흉선, 경부, 자궁 내막, 신경모세포종, 골원성 육종).

안트라세네디온(anthracenedione): 믹토잔트론(급성 과립구성 백혈병, 유방).

치환된 요소: 하이드록시요소(만성 과립구성 백혈병, 적혈구 증가증(polycythemia Vera), 본태성 혈소판증가증(essential thrombocytosis), 악성 흑색종).

메틸하이드라진 유도체: 프로카르바진(N-메틸하이드라진, MIH)(호지킨병).

부신피질 억제제(adrenocortical suppressant): 미토탄(o,p'-DDD)(부신 피질), 아미노글루테티마이드(유방).

부신피질스테로이드(adrenocorticosteroid): 프레드니손(급성과 만성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 호지킨병, 유방).

프로제스틴(progestin): 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 메게스트롤 아세테이트(자궁 내막, 유방)

본 발명에 따른 공액체는 단독으로, 또는 한가지이상의 항-종양 항원과 공동으로 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 공액체와 병용될 수 있는 세포독성 항-종양 항원의 전형적인 예에는 암 세포에 대하여 세포독성과 효능을 보유하는 것으로 공지된 임의의 약물이 포함된다.

본 발명의 공액체는 링커 또는 스페이서가 공유 결합될 수 있는 기능기를 보유하는 항-종양 약물을 포함한다. 대안으로, 항-종양 약물이 기능기를 포함하도록 유도체화될 수 있다. 당업자는 원하는 화합물에 화학적 변화를 부여함으로써, 상기 화합물의 반응이 본 발명에 따른 공액체를 조제하기 위한 목적에 더욱 적합하도록 만들 수 있다. 필수적으로, 공액에 적합한 항-종양 약물은 스페이서 또는 분리가능 링커가 공유 결합될 수 잇는 적어도 하나의 기능기를 보유하거나, 또는 이들 기능기를 보유하도록 유도체화될 수 있다. 공액체가 형성될 수 있는 항암 약물의 기능기는 일차 또는 이차 아민, 하이드록실, 설피드릴, 카르복실, 하이드라지드, 니트릴, 알데하이드 또는 케톤에서 선택될 수 있다. 대안으로, 약물이 유도체화 부위, 예를 들면, 방향족 탄소, 불포화 결합, 또는 불포화 결합에 인접한 탄소를 포함할 수 있다.

대표적 아미노-보유 약물에는 예로써 아시비딘, 아메탄트론, 아미노프테린, 9-아미노캄포테신, N⁸-아세틸스페르미딘, 악티노마이신, 아조토마이신, 비스나피드, 블레오마이신, 카루비신, 1-(2-클로로에틸)1,2-디메탄설포닐 하이드라지드, 크리스나톨, 다우노루비신, 독소루비신, 데자구아닌, 에플로르니틴, 엘사미트루신, 에피루비신, 에소루비신, 엑사테칸, 이다루비신, 멜팔란, 멀캡토퓨린, 미토마이신 A, 미토마이신, C, 미톡산트론, 노코다졸, 펠데신, 페플로마이산, 푸로마이신, 탈리소마이신, 티아미프린, 티오구아닌, 바프레오티드, 조루비신, 아미노글루테티미드, 아자시티딘, 브로피리민, 시타라빈, 닥티노마이신, 에다트렉세이트, 에토프린, 펜레티니드, 플루다라빈, 젬시타빈, 메토트렉세이트, 메토프린, 피리트렉심, 포르피로마이신, 트리시리빈, 트리메트렉세이트, 이들의 유사체와 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

대표적인 알코올(하이드록실)-보유 약물에는 예로써 아구이딘, N-(5,5-디아세톡시펜틸) 독소루비신, 아클라루비신, 아메탄트론, 아파지쿠온, 아지시티딘, 비칼루타마이드, 칼루스테론, 캄프토테신, 카루비신, 카르젤레신, 크리스나톨, 시타라빈, 1,8-디하이드록시-비사이클로[7.3.1]트리데카-4,9-디엔-2,6-디인-13-원(US Pat. No. 5,198,560), 엘사미트루신, 에피루비신, 에스페라마이신, 에소루비신, 에토포시드, 엑사테칸, 펜레티니드, 플록수리딘, 플루다라빈, 플루로시타빈, 포스트리에신, 젬시타빈, 하이드록시요소, 이다루비신, 렌티난, 레우프롤리드, 메이탄신, 메노가릴, 미톡산트론, 몬텍사핀 가돌리늄, 모르폴린-독소루비신, 페플로마이신, 플리카마이신, 포도필로톡신, 프레드니무스틴, 퓨로마이신, 피라조푸린, 리보프린, 스트렙토조신, 파실리탁셀, 테니포시드, 티아조푸린, 토포테칸, 트리시리빈, 트립토렐린, 우레데파, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 빈글리시네이트, 빈로시딘, 빈조리딘, 조루비신, 비젤레신, 드롤록시펜, 펜레티니드, 미코페놀산, 마소프로콜, 테모포르핀, 토포테칸, 이들의 유사체와 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

대표적인 설피드릴-보유 약물에는 예로써 에스페라마이신, 6-멀캡토퓨린, 이들의 유사체와 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

대표적인 카르복실-보유 약물에는 예로써 아시비딘, 아조토마이신, 브레퀴나르, 부틸산, 카르베티메르, 캄프토테신(락톤의 고리-개방 형태), 클로람부실, 에다트렉세이트, 에플로르니틴, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미코페놀산, 레틴산, 티오구아닌, 베르테포르핀, 이들의 유사체와 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

대표적인 알데하이드 또는 케톤-보유 약물에는 예로써 아클라루비신, 안구이딘, 안트라사이클린, 칼루스테론, 카루비신, 독소루비신, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 메게스트롤, 노코다졸, 옥시수란, 플로메스탄, 드레드니무스틴, 테스토락톤, 티오구아닌, 트레스톨론, 이들의 유사체와 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

대표적인 하이드라진-보유 약물에는 예로써 프로카르바진이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.

신생물 질환의 치료에서, 공액체는 세포독성제와 동시에 투여되는데, 세포독성제의 치료 효과가 강화된다. 세포독성제 의해 유도되는 완화가 강화되고, 종양 조직의 재성장이 지연되거나 예방된다. 이런 이유로, 이런 병용 요법의 활용은 사용되는 세포독성제의 감소된 용량 또는 축소된 투약을 가능하게 한다. 따라서, 세포독성제의 유해 및/또는 약화 효과가 최소화되고, 이와 동시에 항-종양 효과가 강화된다. “병용 요법”은 세포독성제 치료의 시작에 앞서, 이런 치료와 동시에, 또는 이런 치료의 중단이후 기간동안 공액체의 투여를 의미한다.

본 발명의 특정 구체예에 따라, 환자는 일일, 격일, 주2회, 주1회, 격주, 월1회, 격월 또는 반년 주기로 1-10회 공액체로 치료된다. 공액체 치료는 예로써 1 내지 365일동안 지속될 수 있다. 상기한 바와 같이, 공액체의 투여 양식 또는 투약 섭생은 상응하는 유리 약물에서와 유사할 수 있다. 한 구체예에서, 공액체는 유리 약물에 비하여 강화된 임상 효능을 제공한다. 본 발명의 변형된 방법은 공액체의 주기적인 투여를 수반한다. 가령, 공액체는 원하는 임상 종점이 달성될 때까지 일정 기간동안 반복적으로 투여될 수 있다. 치료 의사는 항-종양 치료 분야에 통상적으로 이용되는 방법을 이용하여 원하는 임상 종점을 결정할 수 있다. 특정 구체예에서, 1차 과정의 공액체가 투여되고, 개체는 일차 기간동안 관찰된다. 이후, 2차 과정의 공액체가 투여되고 이차 기간이 시작된다. 1차 과정과 2차 과정 사이의 시간 간격은 전술한 바와 동일할 수 있다.

이런 병용 요법이 종양의 완화를 결과하지만 모든 종양 세포를 파괴하지는 못하는 경우에, 공액체 또는 다른 항-종양 약물을 이용한 지속 치료 또는 반복 치료로 종양의 재성장을 예방하거나 지연할 수 있다. 각 경우에, 의사는 개별 환자의 상태를 고려하여, 효과적인 비-독성 용량을 결정할 수 있다.

공액체는 원하는 효과를 달성하기 위하여 본 명세서에 상세히 기술된 다양한 경로를 통하여 환자에 투여될 수 있다. 투여되는 화합물의 양은 넓은 범위에서 변하되는 임의의 효과량일 수 있다. 치료되는 환자, 치료되는 질환의 심각도, 투여 양식, 투약 섭생, 환자 건강, 환자 반응, 사용된 특정 공액체에 따라, 투여되는 화합물의 양은 변한다. 공액체를 이용한 최초 치료의 가이드로서, 유리(공액되지 않은) 약물에서 전형적으로 투여되는 용량이 고려되는데, 공액의 초기량은 유리 약물의 몰량에 근접한다(0.5 내지 2.0 배). 가령, 유리 약물이 일일 체중 ㎏당 대략 0.1 mmole의 용량으로 투여되는 경우, 공액체는 일일 체중 ㎏당 대략 0.05 내지 0.2 mmole의 용량으로 초기에 투여될 수 있다. 공액체의 투여를 위한 이런 지침은 실제 치료량이 알려져 있지 않지만 상응하는 유리 약물의 전형적인 치료 용량이 알려져 있는 공액체에 적용될 수 있다. 공액체의 최적 용량은 상응하는 공액되지 않은 항-종양 약물의 몰량의 대략 0.001 내지 100 배, 대략 0.01 내지 10 배, 대략 0.01 내지 2 배, 또는 대략 0.1 내지 4 배일 수 있다.

본 명세서에서, 환자는 온혈 동물, 예를 들면, 개, 쥐, 생쥐, 고양이, 기니피그, 말, 소, 양, 말과 같은 포유동물을 의미한다.

증식성 종양 조직의 성장률을 조절하는 공액체의 효능은 표준 시험관내와 생체내 동물 종양 모델에서 평가할 수 있다. 가령, 공액체의 항-종양 효과는 아래의 동물 종양 모형에서 확인할 수 있다: (a) 생쥐에서 L1210 백혈병; (b) Balb/C 생쥐에서 EMT6 종양; (c) 쥐에서 7,12-디메틸벤잔트라센-유도된(DMBA-유도된) 유방암; (d) 버팔로 쥐에서 Morris 7288C 또는 5123 간암; (e) 기타. 이에 더하여, 다양한 세포독성제와 병용되는 공액체의 항-종양 효과는 동일하거나 상이한 모형에서 확인할 수 있다.

공액체(13)는 암과 종양 세포주에 대한 이의 활성을 확립하기 위하여 다수의 상이한 세포형에서 시험관내 세포 배양 검사로 평가하였다. 다양한 농도의 독소루비신 또는 공액체(CobalaRubicin 200)로 처리이후 시험관내에 남아있는 생존 세포의 비율을 측정하였다. 양성 항암이나 항-종양 활성은 일정 배양 기간이후 생존 세포의 수에서 감소로 표시된다. 일반적으로, 시험관내에서 약물 농도가 증가함에 따라 세포의 살상률이 높아지고, 따라서 세포 생존 비율이 낮아진다. 동몰 농도의 약물을 비교하여 유리 약물 vs. 공액체의 활성을 결정한다.

도 6a-6d에서는 4가지 세포주에 대한 CobalaRubicin 공액체의 시험관내 검사의 결과를 도시한다. 도 6a는 인간 유방암 세포주로부터 유래된 MCF-7 세포에 대한 공액체의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6b는 백인 유방 선암종 세포주로부터 유래된 SK-BR-3 세포에 대한 공액체의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6c는 인간 전골수성 백혈병 세포주로부터 유래된 HL-60 세포에 대한 공액체의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6d는 인간 뇌 신경모세포종(신경상피종) 세포주로부터 유래된 SK-N-MC 세포에 대한 공액체의 결과를 도시하는 도표이다. 이용된 검사법은 CellTiter-Glo^TM 발광 세포 생존 검사(Luminescent Cell Viability Assay)(Promega Corporation)인데, 이는 당분야에서 세포 생존능에 대한 화합물 효과의 전조로서 인정되고 있다. 상기 검사법은 실시예 4-7에서 상세하게 기술한다. Promega Corporation(Technical Bulletin No. 288)에 의해 보고된 상기 방법은 예외 없이 적용되었다. 이의 결과는 CobalaRubicin 200이 독소루비신과 동일한 효능을 보유하면서도 독소루비신보다 독성이 적음을 암시한다.

도 6e-6h에서는 4가지 세포주에 대한 CobalaTaxel 공액체의 시험관내 검사의 결과를 도시한다. 도 6e는 인간 유방암 세포주로부터 유래된 MCF-7 세포에 대한 공액체(17, 도 4b)의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6f는 백인 유방 선암종 세포주로부터 유래된 SK-BR-3 세포에 대한 공액체(17)의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6g는 인간 결장 선암종 세포주로부터 유래된 HT-29 세포에 대한 공액체(46, 도 4a)의 결과를 도시하는 도표이다. 도 6h는 인간 유방 암종 세포주로부터 유래된 MX-1 세포에 대한 공액체(46)의 결과를 도시하는 도표이다. 이용된 검사법은 실시예 15에서 상세하게 기술한다. 이의 결과는 CobalaTaxel, 특히 검사된 2가지 구체예가 파실리탁셀과 동일한 효능을 보유하면서도 파실리탁셀보다 독성이 적음을 암시한다.

도 7은 정상적인 뮤린 림프절 세포에 대한 공액체의 시험관내 검사의 결과를 도시하는 도표이다. 이용된 검사법은 CellTiter-Glo^TM 발광 세포 생존 검사(Promega Corporation)인데, 이는 당분야에서 세포 생존능에 대한 화합물 효과의 전조로서 인정되고 있다. 상기 검사법은 실시예 8에서 상세하게 기술한다. Promega Corporation(Technical Bulletin No. 288)에 의해 보고된 상기 방법은 예외 없이 적용되었다. 이의 결과는 CobalaRubicin 200이 독소루비신과 동일한 효능을 보유하면서도 독소루비신보다 독성이 적음을 암시한다.

독소루비신의 분리와 방출이 CobalaRubicin-200의 활성에 중요한 지를 검사하기 위하여, SK-N-MC 세포에 대한 시험관내 생존능 검사에서 B12-독소루비신(도 1b; “효소-분리 안정성” 독소루비신-코발라민 공액체(본 발명과 무관))의 활성을 검사하였다. 도 8은 인간 뇌 신경모세포종(신경상피종) 세포주로부터 유래된 SK-N-MC 세포에 대한 상기 안정성 공액체의 시험관내 검사의 결과를 도시하는 도표이다. 이용된 검사법은 CellTiter-Glo^TM 발광 세포 생존 검사(Promega Corporation)인데, 이는 당분야에서 세포 생존능에 대한 화합물 효과의 전조로서 인정되고 있다. 도 8에서는 실시예 9에 따라 수행된 검사의 결과를 도시한다. Promega Corporation(Technical Bulletin No. 288)에 의해 보고된 상기 방법은 예외 없이 적용되었다. B12-독소루비신(안정성)은 카텝신에 의해 분리되지 않고, 결과적으로 상당한 양의 독소루비신이 세포내에서 방출되지 않는다. 상기 도표는 분리되지 않은 B12-독소루비신 공액체가 SK-N-MC 세포에 대하여 세포독성 및 효능을 전혀 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 대조적으로, 분리가능 링커를 보유하는 공액체(13)은 SK-N-MC 세포에 대하여 매우 효과적이다(참조: 도 6d). 이들 결과는 충분한 세포독성 활성이 존재하기 위하여, B12로부터 독소루비신이 방출되도록 링커가 분리되어야 한다는 것을 암시한다.

공액체(13)의 효능은 생체내 동물 모형에서도 확립되었는데, 여기서 MX-1 인간 유방 암종 이종이식편을 보유하는 무형선 생쥐는 세 군으로 나누고 유리 독소루비신 대조, 염수 대조, Cobalarubicin으로 처리되었다. 이런 생체내 연구는 실시예 3에 따라 수행되었다. 비교는 종양 크기 vs. 투여후 일자에 기초하였다. 도 9에 도시된 결과는 상기 공액체가 유리 약물보다 훨씬 높은 효능을 보유한다는 것을 암시한다. 공액체의 1회 분량의 투여후 대략 2-4주시점에, 종양 크기에서 실질적인 감소가 관찰되었다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 공액체가 종양 세포주에 대하여 높은 효능(세포독성)을 보유하면서도 숙주에 감소된 전신 독성을 유발한다는 사실을 발견하였다. 본 발명에 따른 공액체는 몰 기초에서 상응하는 유리 항-종양 약물보다 높은 용량으로 투여될 수 있다. 공액체(13)은 몰 기초에서 유리 독소루비신의 용량보다 적어도 2.3 배 높은 용량으로 투여될 수 있고, 낮은 전신 독성 및 개선된 치료 이점을 제공한다. 유리 독소루비신이 상기 독소루비신 공액체와 동일한 높은 몰량으로 투여되는 경우에, 생쥐는 유리 독소루비신에 의해 폐사되는 반면, 독소루비신 공액체에 의해서는 폐사되지 않았다. 따라서, 본 발명은 코발라민의 5'-OH 공액체로서 항-종양 약물을 투여함으로써 항-종양 약물의 전신 독성을 감소시키는 방법을 제시하는데, 여기서 코발라민-5'-O-항-종양 약물 공액체는 몰 기초에서 공액되지 않은 항-종양약물에 비하여 개체에 감소된 전신 독성을 보인다. 또한, 본 발명은 항-종양 약물의 최대 허용량(maximum tolerated dose)을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 코발라민의 5'-OH 공액체로서 항-종양 약물을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 코발라민-5'-O-항-종양 약물 공액체는 몰 기초에서 공액되지 않은 항-종양약물에 비하여 개체에 감소된 전신 독성을 보이고, 공액체의 최대 허용량은 몰 기초에서 공액되지 않은 항-종양약물의 최대 허용량보다 높다.

도 10에서는 실시예 10의 절차에 따라 생쥐에서 공액체(13)의 최대 허용량(MTD)을 결정하는 연구 결과를 도시한다. 공액체는 일일 체중 ㎏당 8, 16, 32, 48 또는 64 ㎎의 용량(㎎/㎏/d)으로 투여되었다. 도 10에 도시된 결과는 평균 체중 감소율(percent mean body weight loss)에 의한 측정에서, 패턴이 다소 불규칙하지만 용량이 증가함에 따라 독성이 증가하는 분명한 추세를 보였다. 상기 데이터는 공액체가 최대 48 ㎎/㎏/d의 용량까지 충분히 관용된다는 것을 암시한다. 별개의 연구에서, 공액되지 않은 독소루비신에 대한 MTD는 몰 기초에서 공액체에 대한 MTD보다 적어도 2.3 배 높은 것으로 밝혀졌다.

실시예 11에 따라, 무흉선 생쥐에서 MX-1 인간 유방 암 이종이식편에 대한 공액체와 유리 항-종양 약물의 종양 성장 지연과 종양 크기 감소 효과를 결정하는 연구를 수행하였는데, 여기서 공액체와 독소루비신은 2회 주기로 투여되었다. 연구 90일에서 본 연구의 결과는 도 11에 도시한다. 이들 결과는 공액체로 2회-주기 처리가 종양 크기를 감소시키고 종양 성장을 지연시키는데 극히 효과적이라는 것을 암시한다. 비-처리군은 처리군보다 훨씬 적은 27.1일의 평균 종점 도달 시간을 보였고, 어떤 개체에서도 부분적인 퇴행, 완전 퇴행 또는 장기간 종양 없는 생존이 관찰되지 않았다. 체중 변화는 유의하지 않았고, 처리 또는 비-처리 관련된 폐사는 관찰되지 않았다. 2회-주기 3 ㎎/㎏/day의 독소루비신 처리군은 대조 생쥐보다 긴 적어도 44일의 종점 도달 시간을 보였다. 2회 주기동안 24 ㎎/㎏의 생물공액체로 4 군 생쥐의 처리는 1 군 대조에 비하여 현저하게 유의한 62.5-일(227%) TGD에 상응하는 최대 90-일 평균 TTE를 결과하였다(P < 0.0001). 4 군에서 10마리 모두 완전한 종양 퇴행 반응을 보이고, 7마리는 장기 종양 없는 생존자로서 분류되었다. 4 군은 피셔의 직접 분석(Fisher's exact analysis)에서 독소루비신-처리된 동물보다 훨씬 완전한 퇴행 반응을 보였다(P =0.0007). 도 11에서는 4 군의 평균 종양 체적이 40일에 비-검출 수준으로 감소되고 이후 연구 기간동안 비-검출 상태로 유지된다는 것을 보여준다. 4 군 생존은 90일에 100%이었다. 최대 체중 감소는 10%이고, 처리 또는 비-처리 관련된 폐사는 관찰되지 않았다.

단일-주기 연구(실시예 3)로부터 데이터는 도표로 작성하고, 도 12a에 요약 형태로 도시한다. 유사하게, 2회-주기 연구(실시예 11)로부터 데이터는 도표로 작성하고, 도 12b에 요약 형태로 도시한다. 임의 형태의 독소루비신 투여가 대조 동물에 비하여 체중 감소에서 현저한 변화를 유도하긴 했지만, 공액체에서 독소루비신의 증가((2.3-배 증가)는 추가적인 독성을 유발하지 않았다. 실시예 11에 기술된 연구는 체중에 대한 2회-주기 독소루비신의 극적인 효과를 예증한다. 독소루비신 또는 생물공액체로 처리는 현저한 체중 감소를 유도하였다. 하지만, 공액체로 처리된 동물은 공액체에서 독소루비신의 당량이 2배 높음에도 불구하고, 원형 독소루비신이 제공된 군보다 더욱 빨리 체중 감소로부터 회복되었다. 이들 결과는 공액체의 효능이 원형(공액되지 않은, 유리) 독소루비신의 용량보다 2배 이상(또는 대략 2.3배) 높은 용량으로 투여되는 경우에도, 투여된 용량에서 유리 독소루비신의 효능에 필적한다는 것을 암시한다.

제약 분야에 사용되는 화합물은 다양한 기능이나 목적을 수행하게 된다. 따라서, 본 명세서에 언급된 화합물이 1회만 언급되거나, 또는 하나이상의 용어를 정의하는데 이용되는 경우에도, 이의 기능이나 목적은 본 명세서에 언급된 기능이나 목적에만 한정되지 않는다.

본 명세서에서, “제약학적으로 허용되는 염”은 본 명세서에 개시된 화합물의 유도체를 의미하는데, 여기서 치료 화합물은 산이나 염기 염으로 제조된다. 제약학적으로 허용가능 염의 예는 제약학적 활성 약물의 무기산이나 유기산 염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 제약학적으로 허용가능 염에는 예로써 비-독성 무기산이나 유기산으로부터 통상적인 비-독성 염이 포함된다. 가령, 이런 통상적인 비-독성 염은 염산, 브롬산, 황산, 설폰산, 설팜산, 인산, 질한 등과 같은 무기산으로부터 조제된 염; 아미노산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 구연산, 아스코르브산, 팜산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄 디설폰산, 옥살산, 이세티온산 및 제약 분야의 당업자에게 공지된 다른 유기산과 같은 유기산으로부터 조제된 염이다. 적절한 염의 목록은 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(Alfonso R. Gennaro, ed.; Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990); Remington: the Science and Practice of Pharmacy 19th Ed.(Lippincott, Williams & Wilkins, l99S); Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed.(Arthur H. Kibbe, ed.; Amer. Pharmaceutical Assoc., 1999); the Pharmaceutical Codex: Principles and Practice of Pharmaceutics 12th Ed.(Walter Lund ed.; Pharmaceutical Press, London, 1994); The United States Pharmacopeia: The National Formulary(United States Pharmacopeial Convention); Goodman and Gilman's: the Pharmacological Basis of Therapeutics(Louis S. Goodman and Lee E. Limbird, eds.; McGraw Hill, 1992)와 같은 문헌에서 제시한다.

본 명세서에서, “제약학적으로 허용되는”은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제점이나 합병증 없이 인간과 동물의 조직에 이용하기 적합하고 합리적인 이익/위험 비율로 균형잡힌 화합물, 물질, 조성물 및/또는 약형(dosage form)을 의미한다. 항-종양, 또는 항암 약물은 종양 또는 암 세포에 본질적으로 세포독성이다. 하지만, 이런 약물을 함유하는 조성물이나 약형은 투여된 개체에 과도한 전시 독성 없이 의도된 치료 효과를 제공하는 경우에, 여전히 제약학적으로 허용되는 것으로 간주된다. 전신 독성의 허용되는 수준은 종양과 암 치료 분야에서 공지된 원칙에 따라 결정된다.

본 명세서에서, “효과량”은 예로써 약제와 관련하여, 치료 효과량을 의미한다. 치료 효과량은 요구되거나 원하는 치료 반응을 유도할 만큼 충분한 공액체 또는 항-종양 약물의 양, 다시 말하면, 환자에 투여되는 경우에 상당한 수준의 원하는 임상 반응을 유도할 만큼 충분한 양이다.

아래의 실시예는 본 발명에서 고려되는 다수 구체예 중에서 일부를 설명하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하지 않는다. 본 명세서에 기술된 방법은 본 발명에 따른 공액체를 조제하는데 적용될 수 있다.

Delta 600 펌프를 보유하고 모델 600 제어장치와 2996 PDA 검출기가 장착된 Waters HPLC 장치가 분석과 제조 작업 모두에 이용되었다. 물에 녹인 0.1% 아세트산과 아세토니트릴은 각각, 수성 완충액과 유기 완충액으로 사용되었다. Waters Delta-Pak C₁₈ 15㎛ 100Å 3.9x300 ㎜ 칼럼(P/N WAT011797)과 1 ㎖/min 유속이 분석 작업에 이용되었다; Waters Delta-Pak Radial Compression C₁₈ 15㎛ 100Å 25x100 ㎜ 칼럼(P/N WAT011797)과 20 ㎖/min 유속이 조제 작업에 이용되었다. 질량 스펙트럼은 양이온 모드(positive ion mode)의 Applied Biosystems API 2000 전자분사 질량 분광계(electospray mass spectrometer)에서 획득하였다.

실시예 1

아래의 절차를 이용하여 도 1의 전형적인 독소루비신-VB 공액체를 조제하였다.

단계 1. Fmoc-Lys(MMT)(1)

염화메틸렌(75㎖)에 녹인 Fmoc-Lys(5.1067g, 13.8618mmol, 1.0eq)의 교반 현탁에 실온에서, 트리메틸실릴 클로라이드(3.8㎖, 29.7312mmol, 2.14eq)를 첨가하였다. 혼합물은 50℃에서 1시간동안 환류시켜, 반응 혼합물에서 고체의 외형을 변화시켰다. 얼음조(ice bah)에서 냉각시킨 이후, DIEA(7.5㎖, 43.0561mmol, 3.11eq)를 첨가하고, 혼합물은 균질화시키고, 아니실디페닐에틸 클로라이드(4.4955g, 14.5580mmol, 1.05eq)를 첨가하였다. 오렌지-적색 용액은 실온에서 하룻밤(20 hrs)동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 에틸 아세테이트(200㎖)와 pH5 완충액(0.05M 프탈산, 1ON KOH로 pH 5.0으로 조정) 사이에 분할하였다. 유기상은 추가의 pH5 완충액(50㎖ x 2), 물(50㎖ x 1), 염수(50㎖ x 2)로 세척하고 황산마그네슘에서 건조시켰다. 용제를 제거하고 진공에서 건조시킨 이후, 9.7336g의 연한 황색 거품을 수득하였다.

단계 2. Lys(MMT)(2)

염화메틸렌과 아세토니트릴(1:1)의 100O㎖ 혼합물에 녹인 Fmoc-Lys(MMT)(9.7336g)의 교반 용액에 디에틸아민(100㎖)을 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 1.5 시간동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 60℃에서 아세토니트릴(9O㎖ x 2)을 부어 넣고, 아세토니트릴(20㎖ x 3)과 에테르(20㎖ x 3)로 세척하였다. 이후, 고체는 1:1 CH₂Cl₂/CH₃OH(200㎖)에 가능한 용해시키고, 일부 고체 부산물은 여과 종이를 통한 여과로 제거하였다. 용제를 제거하고 진공에서 건조시킨 이후, 4.7707g(82.2%, Fmoc-Lys에 기초)의 연한 황색 거품을 수득하였다. ES(+)-MS: 147(Lys+1), 273(MMT).

단계 3. Fmoc-Phe-OSu(3)

얼음조에서 냉각된 염화메틸렌(50㎖)에 녹인 Fmoc-Phe(1.9442g, 5.0186mmol, 1.0eq)와 N-하이드록시숙시니미드(0.6095g, 5.2959mmol, 1.06eq)의 현탁액에 DCC(1.0880g, 5.2731mmol, 1.05eq)를 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 생성된 DCU는 여과로 제거하고, 여과액은 농축하고 진공에서 건조시켜 2.7664g의 백색 거품을 수득하였다.

단계. 4. Fmoc-Phe-Lys(MMT)(4)

DMF(30㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-OSu(2.0702g, 4.2728mmol, 1.0eq)와 Lys(MMT)(1.7995g, 4.2995mmol, 1.01eq)의 교반 용액에 DIEA(1.5㎖, 8.6112mmol, 2.02eq)를 첨가하였다. 고체는 점진적으로 용해시키고, 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트(100㎖)와 pH5 완충액(0.05M 프탈산, 10N KOH로 pH 5.0으로 조정, 200㎖) 사이에 분할하였다. 수성 용액은 추가의 에틸 아세테이트(50㎖ x 2)로 추출하였다. 모아진 유기상은 염수(50㎖ x 3)로 세척하고 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제를 제거하고 진공에서 건조시킨 이후, 3.3014g(98.1%)의 연한 황색 거품을 수득하였다. ES(+)-MS: 516(M-MMT+1), 273(MMT).

단계 5. Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH(5)

염화메틸렌(20㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)(3.3014g, 4.1898mmol, 1.0eq)와 4-아미노벤질 알코올(0.6219g, 5.0495mmol, 1.21eq)의 교반 용액에 2-에톡시-1-에톡시카르보닐-1,2-디하이드로퀴놀린(1.5589g, 6.3037mmol, 1.50eq)을 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 에테르(50㎖)로 분쇄하였다. 혼합물은 실온에서 2 시간동안 방치하고, 생성된 고체는 수거하고 에테르(15㎖ x 3)로 세척하며 진공에서 건조시켰다. 2.1071g(56.3%)의 백색 고체를 수득하였다. 에테르 여과액은 농축하였다. 잔류물은 벤젠(1O㎖)에 부유시키고 헥산(1O㎖)으로 침전시켰다. 상기 과정은 2회 더 반복하였다. 생성된 고체는 수거하고 벤젠/헥산(1:1, 10㎖ x 3)으로 세척하며 진공에서 건조시켰다. 추가로 0.8864g(23.7%)의 백색 고체를 수득하였다. 전체 수율: 80.0%. ES(+)-MS: 893(M), 915(M+Na), 810(M-PABOH+Na), 273(MMT).

단계 6. Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(6)

염화메틸렌(50㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH(1.1182g, 1.2520mmol, 1.0eq)와 비스(4-니트로페닐)카보네이트(1.9102g, 6.2792mmol, 5.02eq)의 교반 용액에 DIEA(0.65㎖, 3.7315mmol, 2.98eq)를 첨가하였다. 황색 용액은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 에틸 아세테이트(150㎖)에 용해시키고 pH 5 완충액(0.05M 프탈산, 10N KOH로 pH 5.0으로 조정)(100㎖ x 1, 50㎖ x 1), 염수(50㎖ x 2)로 세척하며 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제의 제거이후, 잔류물은 실리카 칼럼(2.4 x 20㎝)으로 정제하고 CH₂Cl₂/에테르(9:1-8:2)로 용리하여 0.8027g(60.6%)의 연한 황색 거품을 수득하였다. ES(+)-MS: 1058(M), 786(M-MMT), 273(MMT).

단계 7. Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(7)

N-메틸피롤리디논(15㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(0.6414g, 0.6061mmol, 1.0eq)와 독소루비신 하이드로클로라이드(0.3465g, 0.5974mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 DIEA(0.12㎖, 0.6889mmol, 1.15eq)를 첨가하였다. 적색 용액은 암흑 상태(알루미늄 호일로 둘러쌈)로 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 에틸 아세테이트(150㎖)로 희석하고 물(100㎖ x 1, 50㎖ x 2), 염수(5O㎖ x 1)로 세척하며 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제의 제거이후, 잔류물은 실리카 칼럼(2.4 x 19㎝)로 정제하고 염화메틸렌에 녹인 5% 메탄올로 용리하여 0.8700g(99.6%)의 적색 유리질 고체를 수득하였다.

단계 8. Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(8)

염화메틸렌(5O㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(0.6472g)의 교반 용액에 디에틸아민(12.5㎖)을 첨가하였다. 혼합물은 짙은 갈색으로 변하였고, 고체는 용해시켰다. 이는 실온에서 3 시간동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 염화메틸렌(4㎖)에 용해시키고 교반된 에테르 용액(100㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 에테르(1O㎖ x 3)로 세척하며 진공에서 건조시켜 0.5292g(96.4%)의 오렌지-적색 고체를 수득하였다. ES(+)-MS: 1241.2(M+1), 968.8(M-MMT+1).

단계 9. B₁₂-5'-OCO-(1,2,4-트리아졸)(9)

DMSO(30㎖)에 녹인 시아노코발라민(2.0380g, 1.5036mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 1,1'-카르보닐디(1,2,4-트리아졸)(0.3759g, 2.2903mmol, 1.52eq)를 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 30분간 교반하고, 이후 CH₂Cl₂/에테르(1:1, 200㎖)의 교반 혼합물에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 아세톤(50㎖ x 3)과 에테르(50㎖ x 1)로 세척하고 진공에서 건조시켜 2.3706g의 적색 분말을 수득하였다.

단계 10. B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅COOH(10)

상기 중간물질 9는 DMSO(30㎖)에 녹인 6-아미노헥사논산(0.2180g, 1.6620mmol, 1.11eq)과 DIEA(0.54㎖, 3.100mmol, 2.06eq)의 교반 현탁액에 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 유리면(glass wool)을 통하여 여과하여 반응하지 않은 6-아미노헥사논산을 제거하였다. 여과액은 CH₂Cl₂/에테르(1:1, 200㎖)의 교반 혼합물에 첨가하고, 생성된 침전물은 수거하고 아세톤(50㎖ x 3)과 에테르(50㎖ x 1)로 세척하며 진공에서 건조시켜 2.3562g의 적색 분말을 얻었다. 이는 실리카 칼럼으로 정제하고 물로 용리하여 1.3546g(59.6%)의 적색 분말을 수득하였다. ES(+)-MS: 1513.8(M+1).

단계 11. B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅COOSu(11)

DMSO(10 ㎖)에 녹인 화합물 10(0.5706g, 0.3772mmol, 1.0eq)과 N-하이드록시숙시니미드(0.2789g, 2.4233mmol, 6.42eq)의 교반 용액에 디이소프로필카보디이미드(1.O㎖, 6.3867mmol, 16.93eq)를 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 100㎖의 교반된 에테르/CH₂Cl₂(1:1)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 아세톤(1O㎖ x 2), 에테르(1O㎖ x 2)로 세척하며 진공에서 건조시켜 0.6314g의 적색 분말을 수득하였다. ES(+)-MS: 1610.7(M+1).

단계 12. B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-Dox(12)

DMSO(1O㎖)에 녹인 화합물 8(0.5400g, 0.4353mmol, 1.0eq)과 화합물 11(0.8491g, 0.5275mmol, 1.21eq)의 용액은 실온에서 1 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물은 100㎖의 교반된 에테르/CH₂Cl₂(1:1)에 첨가하고, 생성된 침전물은 수거하고 아세톤(15㎖ x 2), 염화메틸렌(15㎖ x 2), 에테르(15㎖ x 2)로 세척하며 진공에서 건조시켜 1.1040g(92.7%)의 적색 분말을 수득하였다. ES(+)-MS: 1368.3[(M+1)/2].

단계 13. B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-Dox(13)

메탄올(15㎖), 물(15㎖), 염화메틸렌(15㎖)에 녹인 화합물 12(0.5715g, 0.2090mmol, 1.0eq)의 교반 현탁액에 아니솔(2.4㎖, 21.9715mmol, 105.1eq)과 디클로로아세트산(1.8㎖, 21.9035mmol, 104.9eq)을 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 2 시간동안 교반하였다. HPLC는 소비된 출발 물질의 대부분을 지시하였다. 유기 용제는 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물은 물(50㎖)로 희석하였다. 수상은 분리 깔때기에 부어넣었다. 점성 고체는 에테르(25㎖ x 3)로 씻어내고 메탄올(4㎖)에 용해시키며 교반된 에테르(100㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 에테르(1O㎖ x 3)로 세척하며 진공에서 건조시켜 0.2353g의 적색 분말을 얻었다. 수상은 에테르(25㎖ x 3)로 추출하였다. 수용액에 용해된 유기 용제는 회전 증발기로 제거하였다. 이후, 수용액은 원심분리하고 Waters Sep-Pak tC18 카트리지(P/N WAT036810)로 탈염하였다. 정제되지 않은 산물의 다른 분량(0.262g)을 얻었다. 상기 정제되지 않은 산물은 HPLC로 정제하여 85.6 ㎎(16.6%)의 적색 분말을 수득하였다. ES(+)-MS: 1232.3[(M+1)/2].

실시예 2

아래의 방법을 이용하여 카텝신 B에 의한 항-종양 공액체, 특히 (13)의 분리가능성을 확인하였다. 독소루비신-CB 공액체(13)(1.0 mM)를 함유하는 공액체 저장 용액(물에서 5% DMSO)을 조제하였다. 카텝신 B(인간 간, Calbiochem, #219364, MW: 27500; 특이 활성(specific activity): 274unit/㎎ 단백질, 5 unit)는 32.1 ㎕의 NaOAc(20mM, 1mM EDTA, pH 5.0)에 위치시켰다. 이후, 1 ㎕의 카텝신 B를 4 ㎕의 30mM DTT/15mM EDTA로 실온에서 15분간 활성화시켰다. 상기 용액은 665 ㎕의 25mM NaOAc/1mM EDTA 완충액(pH5.0, 37℃에서 사전 배양)으로 희석하여 효소 저장 용액을 조제하였다. 96 ㎕의 효소 저장 용액은 1 ㎕의 공액체 저장 용액과 혼합하고 37℃에서 60분간 배양하였다. 최종 농도: [카텝신 B]=30nM, [기질]=1OμM. 반응 정도는 주기적 샘플링과 후속의 HPLC 분석(완충액 A: 0.1%HOAc, 완충액 B: 아세토니트릴, 20분간 20-50%B, 495nm, B₁₂-Phe-Lys에 대한 Tr=7.2분, 독소루비신에 대한 Tr=15.8분, 기질에 대한 Tr=18.8분)으로 모니터하였다. 전형적인 결과는 공액체의 83%가 60분의 시간동안 분리된다는 것을 암시하였다.

카텝신 B에 의한 본 발명에 다른 공액체의 분리가능성을 평가하는데 유사한 절차가 이용될 수 있다. 다른 세포내 효소에 의한 분리가능성을 평가하기 위하여, 본 발명에 따른 공액체가 임의의 특정 효소의 고유 기질을 대체하는 점을 제외하고 Methods in Enzymoloy과 같은 문헌에 기술된 검사법이 적용될 수 있다. 상기 효소에 의한 공액체 분리의 확증은 종양 치료를 위한 상기 공액체의 추가적인 시험관내 및/또는 생체내 평가를 충분히 담보한다.

실시예 3

아래의 절차를 이용하여 종양 성장, 특히 무흉선 생쥐에서 MX-1 인간 유방 암종 이종이식편의 성장 지연에 대한 코발라민-독소루비신 공액체의 효과를 조사하였다. 암컷 누드 Harlan 생쥐는 옆구리에 1㎜³ MX1 고형 종양 단편을 피하 이식하였다. 투약이전 이식과 성장 단계동안, 종양은 초기에는 주2회 모니터하고, 이후 신생물이 80-120 ㎎의 원하는 크기에 접근하면 매일 모니터하였다. 대부분의 종양이 목표한 중량 범위(80-120 ㎎)에 도달하면, 생쥐는 각각 10마리씩 4가지 처리군: 처리 없음, 3 ㎎/㎏/day x 5일 정맥내 독소루비신(활성 대조), 64 ㎎/㎏/day x 5일 정맥내 생물공액체, 32 ㎎/㎏/day x 5 days 정맥내 생물공액체로 페어-매칭(pair-matching)하였다. 검사 물질은 페어 매칭 당일(1일)에 투여하였다. 종양 성장 지연 종점은 생쥐에서 종양이 아래의 공식: 종양 중량(㎎) = w² x l/2 x 1㎎/㎜³(w = 종양의 너비(㎜), l = 종양의 길이(㎜))에 의한 산정에서 1.5 gm 중량에 도달하는 때이다. 평균 종점 도달 시간은 각 처리군에서 계산한다. 본 연구의 결과는 도 9에 도시한다. 비-처리군은 17.8일의 평균 종점 도달 시간을 보이고, 어떤 개체에서도 부분적인 퇴행, 완전 퇴행 또는 장기간 종양 없는 생존이 관찰되지 않았다. 체중 변화는 미미하였고, 처리 또는 비-처리 관련된 폐사는 관찰되지 않았다. 독소루비신 처리(활성 대조, 3 ㎎/㎏/day)는 대조에 비하여 21.7일(122%) 증가된 39.5일의 평균 종양 성장 지연을 유도하였다. 부분적인 또는 완전한 종양 퇴행 및 장기 종양-없는 생존자는 관찰되지 않았다. 9일에 평균 체중 감소는 -10.5%로 관찰되었고, 처리 또는 비-처리 관련된 폐사는 관찰되지 않았다. 64 ㎎/㎏/day 처리군은 삼한 독성이 발생하였고 4일에 종결되었다. 32 ㎎/㎏/day 처리군은 대조보다 44.3일, 독소루비신 활성 대조보다 22.6일 길어진 62.1일의 평균 종점 도달 시간을 보였다. 전체 연구 기간동안, 상기 군에서 6마리 생쥐는 종양이 완전히 퇴행되었고, 4마리는 장기 종양-없는 생존자이었다. 9일에 관찰된 최대 체중 감소는 -8.4%이고, 처리 또는 비-처리 관련된 폐사는 관찰되지 않았다.

실시예 4

아래의 절차를 이용하여 MCF-7 세포에 대한 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 이의 결과는 도 6a에 도시한다. MCF-7 세포주는 ATCC로부터 입수하고, 37℃, 5% CO₂하에 배양하였다. MCF-7 세포는 GlutaMAX, 고 글루코오스, 피리독신 하이드로클로라이드가 존재하고 소디움 피로베이트(Gibco)가 존재하지 않으며 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone), ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 추가의 2 mM L-글루타민(Gibco)으로 보충된 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. MCF-7 세포는 웰당 5000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다.

물에 담긴 5% DMSO에서 조제된 독소루비신과 CobalaRubicin-200 원료와 저장 용액은 -20℃에 보관하고 광으로부터 보호하였다. 각 화합물은 100 μM에서 10 nM로 10-배 희석에 걸쳐있는 6가지 최종 농도에서 검사하였다. 1Ox 저장 용액을 제조하고, 10 ㎕를 세포를 보유하는 3개의 웰 각각에 도입하였다. 화합물은 세포를 도말한 이후 대략 24 시간시점에 첨가하였다. 처리되지 않은 대조 세포는 10 ㎕의 5% DMSO로 처리하였다. 배지 단독을 보유하는 3개의 웰 역시 배경 대조(background control)로서 포함되었다. 평판은 37℃ 배양기에 다시 위치시켰다.

96 시간후, 세포 생존능에 대한 독소루비신과 CobalaRubicin-200(B12-s-dox) 세포 생존능은 Promega로부터 입수된 검사법을 이용하여 측정하였다. CellTiter-Glo^TM 발광 세포 생존능 검사는 배양액에 존재하는 ATP를 정량하는데, ATP는 대사 활성 세포와 상관한다. ATP 농도에 의존하는 발광은 Wallac MicroBeta® JET 액체 신틸레이션과 발광 카운터로 개별 웰에서 측정하였다. 배지 단독을 보유하는 3개의 웰의 평균 발광 수치는 기초 데이터 수치를 감하여 교정된 수치를 얻었다. 높은 농도의 독소루비신과 B12-S-dox의 적색에 의해 부여된 배경을 교정하기 위하여, 10 또는 100 μM 로 처리된 세포에 대한 감수된 배경 값은 단순한 배지 단독이 아닌 10 또는 100 μM의 독소루비신 또는 B12-S-dox를 보유하는 배지의 발광이어다. 동일한 농도의 화합물이 도입된 웰에 대한 3가지 교정된 수치는 평균하고, 표준편차를 계산하였다. 세포 생존 비율은 처리되지 않은 세포를 100% 생존으로 가주하여 계산하였다. 교정된 발광 수치는 처리되지 않은 세포의 평균 교정된 발광으로 나누고, 여기에 100을 곱하여 세포 생존 비율을 얻었다. 삼중 웰의 평균 세포 생존 비율과 표준 편차를 계산하였다. 상기 데이터는 평균 세포 생존 비율(Av. 생존 %) vs. 화합물의 농도로서 도면을 작성하였다.

실시예 5

아래의 절차를 이용하여 SK-BR-3 세포에 대한 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 이의 결과는 도 6b에 도시한다. SK-BR-3 세포주는 ATCC로부터 입수하고, 37℃, 5% CO₂하에 배양하였다. SK-BR-3 세포는 GlutaMAX, 고 글루코오스, 피리독신 하이드로클로라이드가 존재하고 소디움 피로베이트(Gibco)가 존재하지 않으며 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone), ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 추가의 2 mM L-글루타민(Gibco)으로 보충된 D-MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. SK-BR-3 세포는 웰당 10000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다. 생존 검사와 후속 산정은 실시예 4에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 6

아래의 절차를 이용하여 HL-60 세포에 대한 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 이의 결과는 도 6c에 도시한다. HL-60 세포주는 ATCC로부터 입수하고, 37℃, 5% CO₂하에 배양하였다. HL-60 세포는 GlutaMAX(Gibco)가 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone)과 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)으로 보충된 RPMI 배지 1640에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. HL-60 세포는 웰당 5000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다. 생존 검사와 후속 산정은 실시예 4에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 7

아래의 절차를 이용하여 SK-N-MC 세포에 대한 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 이의 결과는 도 6d에 도시한다. SK-N-MC 세포주는 ATCC로부터 입수하고, 37℃, 5% CO₂하에 배양하였다. SK-N-MC 세포는 Earle 염, L-글루타민(Gibco)이 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone), ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 추가의 2 mM L-글루타민(Gibco)으로 보충된 최소 필수 배지(MEM)에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. SK-N-MC 세포는 웰당 20000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다. 생존 검사와 후속 산정은 실시예 4에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 8

아래의 절차를 이용하여 정상 뮤린 림프절 세포에 대한 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 림프구는 37℃, 5% CO₂하에 배양하고, GlutaMAX(Gibco)가 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone)과 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)으로 보충된 RPMI 배지 1640에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. 세포는 웰당 1.5 x 10⁵개 세포의 최초 밀도로 접종하였다. 생존 검사와 후속 산정은 실시예 4에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 9

아래의 절차를 이용하여 SK-N-MC 세포에 대한 카텝신 절단 안정성 독소루비신-코발라민 공액체의 시험관내 평가를 수행하였다. 이의 결과는 도 8에 도시한다. SK-N-MC 세포주는 ATCC로부터 입수하고, 37℃, 5% CO₂하에 배양하였다. SK-N-MC 세포는 Earle 염, L-글루타민(Gibco)이 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone), ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco), 추가의 2 mM L-글루타민(Gibco)으로 보충된 최소 필수 배지(MEM)에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. SK-N-MC 세포는 웰당 20000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다.

물에 담긴 5% DMSO에서 조제된 독소루비신과 B12-독소루비신(안정성) 원료와 저장 용액은 -20℃에 보관하고 광으로부터 보호하였다. 각 화합물은 100 μM에서 10 nM로 10-배 희석에 걸쳐있는 6가지 최종 농도에서 검사하였다. 1Ox 저장 용액을 제조하고, 10 ㎕를 세포를 보유하는 3개의 웰 각각에 도입하였다. 생존 검사와 후속 산정은 실시예 4에 기술된 바와 동일하게 수행하였다.

실시예 10

아래의 절차를 이용하여 Charles River(무흉선) 생쥐에서 비타민 B12-독소루비신 공액체의 최대 허용량을 조사하였다. 각각 5마리씩 다섯 군은 칭량하고, 이후 첫 5일간 일일 용량의 공액체를 정맥내 투여하였다; 용량 수준은 8, 16, 32, 48, 54 ㎎/㎏/day이었다. 전체 독성은 투약 1일(첫 투약)부터 주2회 생쥐를 칭량하고 임상적 징후와 증상을 빈번하게 검사함으로써 평가하였다. 생쥐에서 암 화학요법에 대한 MTD의 NCI 정의가 본 연구에 채택되었다. 바람직한 MTD는 ≤10%의 최대 평균 체중 감소와 독성 폐사 없음을 제공하는 약물의 용량이다. MTD의 상한선은 군에서 평균 20% 체중 감소 및 10마리당 1마리 폐사를 유도하는 용량이다. 5일 연속으로 1일 1회 투약이후, 동물은 재발성 독성과 잠재성 독성을 조사하기 위하여 추가로 5일동안 모니터하였다.

실시예 11

아래의 절차를 이용하여 특히 2회-주기 투약 섭생을 이용한 무흉선 생쥐에서 MX-1 인간 유방 암종 이종이식편의 치료에 대한 공액체의 종양 성장 지연 효과를 조사하였다. 암컷 누드 Harlan 생쥐는 옆구리에 1㎜³ MX1 고형 종양 단편을 피하 이식하였다. 투약이전 이식과 성장 단계동안, 종양은 초기에는 주2회 모니터하고, 이후 신생물이 80-120 ㎎의 원하는 크기에 접근하면 매일 모니터하였다. 대부분의 종양이 목표한 중량 범위(80-120 ㎎)에 도달하면, 생쥐는 각각 10마리씩 5가지 처리군으로 페어-매칭(pair-matching)하였다. 2회-주기 치료의 효과에 관한 설명의 목적으로, 세 군으로부터 데이터를 도시한다: 처리 없음, 3 ㎎/㎏/day(1-5일, 21-25) 정맥내 독소루비신(활성 대조), 24 ㎎/㎏/day(1-5일, 21-25) 정맥내 생물공액체. 검사 물질은 페어 매칭 당일(1일)에 투여하였다. 종양 성장 지연 종점은 생쥐에서 종양이 아래의 공식: 종양 중량(㎎) = w² x l/2 x 1㎎/㎜³(w = 종양의 너비(㎜), l = 종양의 길이(㎜))에 의한 산정에서 1.5 gm 중량에 도달하는 때이다. 평균 종점 도달 시간은 각 처리군에서 계산한다.

실시예 12

아래의 절차를 이용하여 종양-보유 생쥐에서 독소루비신 처리와 연관된 체중 감소와 회복을 조사하였다. 이런 분석은 실시예 3과 11에 명시된 효능 연구의 일환이었다. 생쥐에서 암 화학치료에 대한 MTD의 NCI 정의는 생쥐에서 사망률의 심각도를 평가하는 지침으로 이용된다. 허용가능한 상한선은 20% 체중 손실이다. 동물은 종양을 측정하면서 동시에 칭량하였다.

실시예 13

아래의 절차를 이용하여 전형적인 도 4b의 전형적인 파실리탁셀-VB 공액체를 조제하였다

Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀(14)

염화메틸렌(1O㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-PNP(0.6559g, 0.6198mmol, 1.0eq)와 파실리탁셀(0.5406g, 0.6331mol, 1.02eq)의 교반 용액에 DMAP(0.0898g, 0.7350mmol, 1.19eq)를 첨가하였다. 황색 용액은 RT에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 염화메틸렌(200㎖)으로 희석하고 염수(50㎖ x 3)로 세척하며 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제의 제거이후, 잔류물은 실리카 칼럼 크로마토그래피(2.4 x 16㎝)로 정제하고 헥산/에틸 아세테이트(2:3, 100㎖, 3:7, 200㎖)로 용리하여 1.0286g(93.6%)의 백색 고체(14)를 수득하였다. ES(+)-MS: 1773.6(M+H), 1795.8(M+Na).

Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀(15)

건성 THF(50㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀(1.0286g, 0.5801mmol)의 교반 용액에 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔(DBU, 0.5㎖, 최종 농도 ~1%)을 첨가하였다. 용액은 RT에서 5분간 교반하였다. 반응 혼합물은 교반된 에테르(200㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 에테르(10㎖ x 3)로 세척하며 진공에서 건조시켜 0.6180g(68.7%)의 연한 황색 고체(15)를 수득하였다. ES(+)-MS: 1550.9(M+H).

B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-2'-파실리탁셀(16)

DMSO(9㎖)에 녹인 화합물 15(0.5965g, 0.3846mmol, 1.0eq)와 화합물 11(0.7667g, 0.4763mmol, 1.24eq)의 용액은 실온에서 3 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물은 교반된 에테르/CH₂Cl₂(1:1, 100㎖)에 첨가하고, 생성된 침전물은 수거하고 아세톤(1O㎖ x 2), 염화메틸렌/에테르(1:1, 1O㎖ x 2)로 세척하며 진공에서 건조시켜 1.0g의 적색 분말(16)을 수득하였다.

B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-2'-파실리탁셀(17)

메탄올(20㎖), 염화메틸렌(20㎖), 물(20㎖)에 녹인 화합물 16(1.0g, 0.3284mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 아니솔(O.1㎖, 0.9155mmol, 2.79eq)과 디클로로아세트산(2.5㎖, 최종 농도 ~0.5M)을 첨가하였다. 고체는 용해시키고, 혼합물은 RT에서 2 시간동안 교반하였다. 반응 혼합물은 물(20㎖)로 희석하고, 유기 용제는 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물은 물(50㎖)로 희석하고 수층은 따라버렸다. 점성 잔류물은 에테르(1O㎖ x 4)로 씻어냈다. 생성된 고체는 메탄올(5㎖)에 용해시키고 교반된 에테르/CH₂Cl₂(1:1, 90㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 염화메틸렌/에테르(1:1, 1O㎖ x 2)로 세척하며 진공에서 건조시켜 0.6546g의 적색 분말을 수득하였다. 정제되지 않은 산물은 HPLC로 정제하였다:

칼럼: Waters Delta-Pak C18 l5um(P/N: WAT038506) 25x300㎜.

유속: 41㎖/min.

용제: 50mM H₃PO₄/NH₄0H, pH3.0(A)과 아세토니트릴/물(9:1, B).

구배: 0-20분, 40-50%B.

정제되지 않은 샘플은 완충액 A(6㎖)에서 40% 용제 B에 용해시키고 0.45㎛ Nylon 주사기용 필터를 통하여 여과하였다. 5개의 주사액을 만들었다. 대략 12분 내지 14분의 체류 시간(retention time)을 보유하는 분획물은 수거하고 Waters Sep-Pak tC18 카트리지(P/N: WAT043365)로 농축(탈염)하였다. 산물은 냉동 건조시켜 172.7㎎의 적색 분말(17)을 수득하였다. ES(+)-MS: 1387[(M+2H)/2], 1398[(M+H+Na)/2].

상기 시험관내와 생체내 검사를 이용하여 항-종양 약물로서 공액체의 활성을 먼저 평가하고 약물 공액체 vs. 이의 상응하는 유리 약물의 활성을 비교할 수 있다. 이들 둘 간의 상관관계의 결정이후, 인간 개체에서 본 발명에 따른 공액체에 대한 적절한 초기 투약 섭생을 결정할 수 있다.

실시예 14

아래의 절차를 이용하여 도 4a의 전형적인 파실리탁셀-VB 공액체를 조제하였다.

파실리탁셀-2'-MMT(41)

CH₂Cl₂(20㎖)에 녹인 파실리탁셀(1.0033g, 1.1749mmol, 1.0eq)과 p-아니실클로로디페닐메탄(2.8972g, 9.3821mmol, 7.98eq)의 교반 용액에 피리딘(0.78㎖, 9.5651mmol, 8.14eq)을 첨가하였다. 용액은 RT에서 하룻밤동안 교반하였다. 용제의 제거이후, 잔류물은 에틸 아세테이트(200㎖)와 차가운 pH5 완충액(0.05M 프탈산, 1ON KOH로 pH 5.0으로 조정, 100㎖)에 용해시켰다. 유기상은 분리하고 차가운 pH 5 완충액(100㎖ x 2), 물(100㎖ x 1), 염수(100㎖ x 1)로 세척하며 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제의 제거이후, 잔류물은 실리카 칼럼(5 x 100㎝, 4:1 헥산/에틸 아세테이트로 채워짐; 샘플은 에틸 아세테이트에 용해되고 10g의 실리카 겔에 흡수되며 대기 건조되고 칼럼에 적하된다)으로 정제하고 헥산/에틸 아세테이트(1:1, 160㎖, 2:3, 400㎖)로 용리하여 1.2451g(94.1%)의 백색 고체를 수득하였다.

Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-7-파실리탁셀-2'-MMT(43)

염화메틸렌(18㎖)에 녹인 파실리탁셀-2'-MMT(1.3825g, 1.1795mmol, 1.0eq)의 냉각 용액에 DIEA(0.205㎖, 1.1769mmol, 1.00eq), 피리딘(0.096㎖, 1.1772mmol, 1.00eq), 디포스겐(diphosgene)(0.071㎖, 0.5886mmol, 0.50eq)을 순차적으로 첨가하였다. 얼음조는 제거하고, 용액은 RT에서 2시간동안 교반하였다. 얼음조에서 재-냉각이후, 염화메틸렌(60㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABOH(1.0540g, 1.1801mmol, 1.00eq)와 DIEA(0.205㎖, 1.1769mmol, 1.00eq)의 용액을 주사기를 통하여 첨가하였다. 용액은 RT에서 하룻밤동안 교반하였다. 반응 혼합물은 대략 10 ㎖로 농축하고, 이후 에틸 아세테이트(200㎖)로 희석하고 pH 5 완충액(0.05M 프탈산, 1ON KOH로 pH 5.0으로 조정, 100㎖ x 3), 물(100㎖ x 1), 염수(100㎖ x 1)로 세척하며 MgSO₄에서 건조시켰다. 용제의 제거이후, 잔류물은 실리카 칼럼(5 x 11㎝, 9:1 염화메틸렌/에틸 아세테이트로 채워짐, 샘플은 9:1 염화메틸렌/에틸 아세테이트에 용해됨)으로 정제하고 염화메틸렌/에틸 아세테이트(3:1, 500㎖)로 용리하여 1.4410g(59.7%)의 백색 고체를 수득하였다.

Phe-Lys(MMT)-PABC-7-파실리탁셀-2'-MMT(44)

건성 THF(20㎖)에 녹인 Fmoc-Phe-Lys(MMT)-PABC-7-파실리탁셀-2'-MMT(1.4410g, 0.7045mmol, 1.Oeq)의 교반 용액에 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔(DBU, 0.215㎖, 1.4264mmol, 2.02eq, 최종 농도: 1%)을 첨가하였다. 용액은 RT에서 8분간 교반하였다. 반응 혼합물은 교반된 헥산(9O㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 헥산(1O㎖ x 3)으로 세척하며 진공에서 건조시켜 1.2015g(93.5%)의 백색 고체를 수득하였다.

B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys(MMT)-PABC-7-파실리탁셀-2'-MMT(45)

DMSO(20㎖)에 녹인 화합물 11(1.4251g, ~86% 순도, 0.7614mmol, 1.16eq)의 교반 용액에 화합물 44(1.2015g, 0.6590mmol, 1.0eq)를 첨가하였다. 용액은 실온에서 1.5 시간동안 교반하였다. 에테르(9O㎖)를 첨가하고 유층이 발생하였다. 에테르는 따라버리고, 잔류물은 염화메틸렌/에테르(1:1, 80㎖)로 고체화시켰다. 생성된 고체는 수거하고 에테르(20㎖ x 3)로 세척하며 대기 건조시키고, 이후 물(1O㎖ x 3)로 세척하고 진공에서 하룻밤동안 건조시켜 1.2735g(58.2%)의 적색 분말을 수득하였다.

B₁₂-5'-OCONH(CH₂)₅CO-Phe-Lys-PABC-7-파실리탁셀(46)

메탄올(40㎖), 염화메틸렌(40㎖), 물(40㎖)에 녹인 화합물 45(1.2735g, 0.3839mmol, 1.0eq)의 교반 용액에 아니솔(0.2㎖, 1.8310mmol, 4.77eq)과 디클로로아세트산(4.7㎖, 57.2187mmol, 149.06eq, 대략 0.5 M 최종 농도)을 첨가하였다. 고체는 용해시키고, 혼합물은 RT에서 1.5 시간동안 교반하였다. 유기 용제는 회전 증발기로 제거하였다. 수용액은 따라버렸다. 점성 잔류물은 에테르(1O㎖ x 4)로 씻어냈다. 생성된 고체는 메탄올(1O㎖)에 용해시키고 교반된 에테르(9O㎖)에 첨가하였다. 생성된 침전물은 수거하고 에테르(1O㎖ x 3)로 세척하며 진공에서 건조시켜 1.09g의 적색 분말을 수득하였다.

정제되지 않은 산물은 HPLC로 정제하였다:

칼럼: Waters Delta-Pak C18 l5um(P/N: WAT038506) 25x300㎜.

유속: 41㎖/min.

용제: 50mM H₃PO₄/NH₄0H, pH3.0(A)과 9:1 아세토니트릴/물(B).

구배: 0-20분, 40-50%B.

샘플은 완충액 A(10㎖)에서 40% 용제 B에 용해시키고 0.45㎛ Nylon 주사기용 필터를 통하여 여과하였다. 7개의 주사액을 만들었다(일부 불순한 분획물은 재-정제하였다). 원하는 분획물(분석 HPLC로 모니터됨)은 합치고 Waters Sep-Pak tC18 카트리지(P/N: WAT043365)로 탈염하였다. 산물은 냉동 건조시켜 0.66g(60%)의 적색 분말을 수득하였다. ES(+)-MS: 2773.3[(M+H)⁺], 1387.3[(M+2H)²⁺], 1398.3[(M+H+Na)²⁺].

아래에서는 본 발명에 따른 CobalaTaxel 공액체의 효능을 평가하는데 이용된 세포 배양 조건을 설명한다.

세포주에 관한 설명:

MX-1 세포는 NCI-Frederick Cancer DCT Tumor Repository로부터 입수하였다. 이들은 인간 유방 암종으로부터 유래된다. MX-1 세포는 30℃, 5% CO₂하에 배양하고, GlutaMAX(Gibco)가 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone)과 ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)으로 보충된 RPMI 배지 1640에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. MX-1 세포는 웰당 3000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다.

HT-29 세포는 ATCC로부터 입수하였다. 이들은 인간 결장 암종으로부터 유래된다. HT-29 세포는 30℃, 5% CO₂하에 배양하고, L-글루타민(Gibco)이 존재하고 10% 열 불활화된 정의된 소 태아 혈청(HyClone)과 ㎖당 10 unit 페니실린과 10 ㎍ 스트렙토마이신의 최종 농도로 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)으로 보충된 McCoy's Modified 5A 배지에 유지시켰다. 생존능 검사를 위하여, 세포는 96-웰 평판에서 100 ㎕ 배지에 도말하였다. HT-29 세포는 웰당 5000개 세포의 최초 밀도로 접종하였다.

SK-BR-3과 MCF-7 세포주를 판독하는 정보는 CobalaRubicin-200 세포 생존능 검사에서와 동일하다.

검사를 위한 저장 용액과 투약에 관한 설명

파실리탁셀, CobalaTaxel-17, CobalaTaxel-46 원료는 DMSO에서 제조하고 -20℃에서 보관하며 광으로부터 보호하였다. 각 화합물은 1 μM에서 0.01 nM로 10-배 희석에 걸쳐있는 6가지 최종 농도에서 검사하였다. 세포 배양 배지에서 조제된 1Ox 저장 용액은 각 실험에서 새로 만들었다. 화합물은 세포를 도말한 이후 대략 24 시간시점에 첨가하였다. 처리되지 않은 세포의 3개의 웰은 양성 성장 대조로 포함되었다. 배지 단독을 보유하는 3개의 웰 역시 배경 대조(background control)로서 포함되었다. 투약이후, 평판은 37℃ 배양기에 다시 위치시켰다.

생존능 검사에 관한 설명:

이들 4가지 검사는 CellTiter 96® 비-방사성 세포 증식 검사법(Non-Radioactive Cell Proliferation Assay)(Promega Corporation)을 이용하여 수행하였다. Promega Corporation(Technical Bulletin No. 112)에 의해 보고된 방법은 아래와 같이 변형되었다. Dye 용액과의 배양 기간이 37℃에서 1 시간으로 축소되었다. 용해화/중단 용액의 첨가이후, 평판은 37℃에 30분간 위치시켰다. 웰의 내용물은 혼합하고, 평판은 추가로 1시간동안 37℃로 환원시켜 포르마잔 결정을 완전히 용해시켰다. 570 nm에서 흡광도를 측정하고, 650 nm를 참고 파장(reference wavelength)으로 이용하였다. 계산과 데이터 표시는 CellTiter-Glo^TM 발광 세포 생존 검사에서 기술된 바와 동일하다.

상기한 내용은 본 발명의 특정 구체예에 관한 상세한 설명이다. 개시된 구체예로부터 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 다양한 개변이 가능하며, 이들 개변은 당업자에게 명백하다. 본 발명의 개시에 비추어, 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 동일하거나 유사한 결과를 달성할 수 있는 다양한 개변이 가능하다. 본 발명에서 개시되고 청구된 모든 구체예는 본 발명의 개시에 비추어 과도한 실험 없이 달성될 수 있다.

Claims (21)

1. 항-종양 약물과 코발라민의 공액체에 있어서,

   a. 코발라민, 또는 이의 유도체 또는 유사체;

   b. 코발라민 또는 코발라민 유도체의 5'-OH 부분에 공유 결합된 링커;

   c. 상기 링커에 공유 결합되어 공액체를 형성하는 항-종양 약물을 포함하고, 여기서 세포내 효소에 의해 상기 약물이 링커로부터 분리되거나 링커가 상기 약물로부터 분리되고;

   상기 공액체는 코발라민과의 복합화이후 세포막을 통한 수송에 적합하고, 세포내 효소에 의해 분리되며, 하나이상의 보호기를 선택적으로 보유하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
2. 제 1 항에 있어서, 코발라민은 비타민 B12, 시아노코발라민, 아쿠오코발라민, 하이드록시코발라민, 메틸코발라민, 아데노실코발라민, 시아노코발라민 카바날리드, 데스디메틸 코발라민, 모노에틸아마이드 코발라민, 메틸아마이드 코발라민, 보조효소 B12, 5'-디옥시아데노실코발라민, 코바마마이드 유도체, 클로로코발라민, 설피토코발라민, 니트로코발라민, 티오시아나토코발라민, 벤즈이미다졸 유도체(가령, 5,6-디클로벤즈이미다졸, 5-하이드록시벤즈이미다졸, 트리메틸벤즈이미다졸), 아데노실시아노코발라민((Ade)CN-Cbl), 코발라민 락톤, 코발라민 락탐과 아닐리드, 에틸아마이드, VB12의 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산 유도체, VB12의 프로프리온아마이드 유도체, 5-o-메틸벤질코발민, 코발트가 다른 금속으로 대체된 이들의 유사체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
3. 제 1항에 있어서, 항-종양 약물은 독소루비신과 파실리탁셀에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
4. 제 1항에 있어서, 링커는 카텝신, 엔도 효소, 글리코시다제, 메탈로프로테아제, 리보자임, 프로테아제, 에스테라제, 아미다제에서 선택되는 세포내 효소에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
5. 제 1항에 있어서, 공액체는 상응하는 유리(free) 항-종양 약물에 비하여 감소된 전신 독성을 보유하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
6. 종양 관련된 질병이나 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제 1항에 따른 공액체의 치료 효과량을 필요 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 일반식 I의 항-종양 약물과 코발라민의 공액체:

   VB-(SPa)_n-CL-(SPb)_m-DG(일반식 I), 여기서

   a. CL은 세포내 효소에 의해 VB, SPa, SPb 또는 DG로부터 분리되는 링커이고;

   b. VB는 가능하면 VB의 리보오즈 고리의 5'-OH기를 통하여 CL 또는 SPa에 공유 결합된 코발라민, 또는 이의 유도체 또는 유사체이고;

   c. SPa와 SPb는 각 경우에, 공유 결합, 이가 기능기, 또는 비-펩티드 잔기에서 독립적으로 선택되는 선택적 스페이서이고, 여기서 SPa와 SPb는 CL의 한쪽 측면에 위치할 수 있고,

   d. DG는 스페이서 또는 CL에 공유 결합되는 수단으로 하나이상의 기능기를 보유하는 항-종양 약물이고;

   e. n과 m은 각각 독립적으로, 0, 1, 또는 2이고;

   상기 공액체는 선택적으로 하나이상의 보호기를 보유한다.
8. 제 7항에 있어서, 이가 기능기는 -NHNH-, -NH-, -O-, -S-, -SS-, -CH₂-, -NHCO-, -CONH-, -CONHNHCO-, -N=N-, -N=CH-, -NHCH₂-, -NHN=CH-, -NHNHCH₂-, -SCH₂-, -CH₂S-, -NHCRNH-(R은 =O, =S 또는 =NH), -COO-, -OCO-에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
9. 제 7항에 있어서, 코발라민은 비타민 B12, 시아노코발라민, 아쿠오코발라민, 하이드록시코발라민, 메틸코발라민, 아데노실코발라민, 시아노코발라민 카바날리드, 데스디메틸 코발라민, 모노에틸아마이드 코발라민, 메틸아마이드 코발라민, 보조효소 B12, 5'-디옥시아데노실코발라민, 코바마마이드 유도체, 클로로코발라민, 설피토코발라민, 니트로코발라민, 티오시아나토코발라민, 벤즈이미다졸 유도체(가령, 5,6-디클로벤즈이미다졸, 5-하이드록시벤즈이미다졸, 트리메틸벤즈이미다졸), 아데노실시아노코발라민((Ade)CN-Cbl), 코발라민 락톤, 코발라민 락탐과 아닐리드, 에틸아마이드, VB12의 모노카르복실산, 디카르복실산, 트리카르복실산 유도체, VB12의 프로프리온아마이드 유도체, 5-o-메틸벤질코발민, 코발트가 다른 금속으로 대체된 이들의 유사체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
10. 제 7항에 있어서, n과 m은 독립적으로 1, 2 또는 3에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
11. 제 7항에 있어서, 비-펩티드 잔기는 -NH-C₆H₄-CH₂-O-와 -NH(CH₂)₅C(=O)-에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
12. 제 7항에 있어서, 항-종양 약물은 독소루비신과 파실리탁셀에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
13. 제 7항에 있어서, 아래의 일반식 중에서 하나를 보유하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체:

    a. VB-(SPa)_p-CL-DG(일반식 II);

    b. VB-CL-(SPb)_q-DG(일반식 III);

    c. VB-CL-DG(일반식 IV);

    d. VB-CL-(SPa)_p-(SPb)_q-DG(일반식 V);

    e. VB-(SPa)_p-(SPb)_q-CL-DG(일반식 VI);

    f. VB-(SPa²)(SPa¹)-CL-(SPb¹)(SPb²)-DG(일반식 VII),

    g. 여기서 p와 q는 각 경우에 독립적으로, 1, 2, 3에서 선택된다.

    스페이서는
14. 제 13항에 있어서,

    a. (SPa¹)과 (SPb¹)은 각 경우에 독립적으로 이가 기능기와 공유 결합에서 선택되고;

    b. (SPa²)와(SPb²)는 각 경우에 독립적으로 비-펩티드 잔기에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
15. 제 14항에 있어서,

    a. (SPa²)와 (SPb²)는 각각 이가 카르보닐이고,

    b. (SPa¹)과 (SPb¹)은 각각 비-펩티드 잔기를 보유하는 -NH-, -S- 또는 -O-인 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
16. 제 7항에 있어서, 링커는 카텝신, 엔도 효소, 글리코시다제, 메탈로프로테아제, 리보자임, 프로테아제, 에스테라제, 아미다제에서 선택되는 세포내 효소에 의해 분리되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
17. 제 7항에 있어서, 공액체는 상응하는 유리(free) 항-종양 약물에 비하여 감소된 전신 독성을 보유하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
18. 제 17항에 있어서, 공액체는 상응하는 유리 항-종양 약물에 비하여 몰 기초에서 개선된 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
19. 제 7항에 있어서, 하나이상의 기능기는 일차 또는 이차 아민, 하이드록실, 설피드릴, 카르복실, 하이드라지드, 니트릴, 알데하이드, 케톤에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
20. 제 7항에 있어서, 하나이상의 기능기는 DG에서 유도체화 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-종양 약물과 코발라민의 공액체.
21. 종양 관련된 질병이나 질환을 치료하는 방법에 있어서, 제 7항에 따른 공액체의 치료 효과량을 필요 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.