JP4794735B2 - ビタミンｂ１２誘導体及びそれらの製造方法 - Google Patents
ビタミンｂ１２誘導体及びそれらの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4794735B2 JP4794735B2 JP2000554755A JP2000554755A JP4794735B2 JP 4794735 B2 JP4794735 B2 JP 4794735B2 JP 2000554755 A JP2000554755 A JP 2000554755A JP 2000554755 A JP2000554755 A JP 2000554755A JP 4794735 B2 JP4794735 B2 JP 4794735B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- spacer molecule
- group
- alkyl
- amino
- peptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7135—Compounds containing heavy metals
- A61K31/714—Cobalamins, e.g. cyanocobalamin, i.e. vitamin B12
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
- A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、一般的には、ビタミンＢ12（ＶＢ12）又はその類似体と結合させた治療物質を含む複合体を投与することにより治療物質を供給するためのビタミンＢ12担体分子の新規な誘導体に関する。また、本発明は、一般的にＶＢ12誘導体の新規な製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＶＢ12の５’ＯＨ基を求電子剤と反応させることによるこれらのＶＢ12誘導体の製造に関する。
【０００２】
【背景技術】
ペプチド用経口供給機構が、本発明者の一人により着手された最近の研究に基づく国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８６／０２９９（ＷＯ８７／０２２５１）に記載されている。この機構では、少なくとも一種の担体分子であって、これに活性物質を結合させて前記活性物質を腸内腔から循環系に輸送させるようにしたものを利用している。ＶＢ12及びその類似体は、内因子（ＩＦ）に対するＶＢ12の結合が介在する天然ＶＢ12摂取系を使用して活性物質／ＶＢ12複合体を輸送することにより理想的な担体分子として作用する。リンパドレナージ系又は血清に一旦排出されたとき、この複合体は、在来活性物質の生物活性を実質的に保持している。
【０００３】
より最近では、ＶＢ12と薬剤、細胞毒及びＭＲＩ剤との共役系が、腫瘍細胞の検出及び治療に使用されてきた。ビタミンＢ12（コバルアミン、Ｃｂｌ、ＶＢ12）が正常に細胞摂取されるには、ビタミンは、まず血漿タンパク質トランスコバルアミンＩＩ（ＴＣＩＩ）に結合しなければならない。ＣｂｌのＴＣＩＩへの結合に続いて、得られたＴＣＩＩ−Ｃｂｌ複合体は、細胞表面上のレセプターに親和性良く結合し、レセプター介在エンドサイトーシス（ＲＭＥ）と称されるプロセスを介して細胞により吸収される。細胞内部において、Ｃｂｌが酵素により変更されて２種のコエンザイムが形成されると、これら２種のコエンザイムが次に２つの必須の代謝経路に使用される。一つの経路には、メチオニンのデノボ（de novo）合成におけるホモシステインのメチル化が含まれ、メチオニンシンターゼが触媒として働く。他の経路には、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの再配列を含み、メチルマロニルＣｏＡムターゼが触媒として働く。ヒト及びネズミの白血病細胞の生体外増殖が、ＴＣＩＩとＣｂｌとの両方に依存することが最近示された（ＭｃＬｅａｎ，Ｇ．Ｒ．、Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｅ．Ｂ．、Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｃ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．及びＺｉｌｔｅｎｅｒ，Ｈ．Ｊ．、１９９７ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｃｏｂａｌａｍｉｎ ＩＩ ｂｌｏｃｋ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ（白血病細胞のトランスコバルアミンＩＩブロック生体外増殖に対する抗体）、Ｂｌｏｏｄ、８９、２３５−２４２）。何人かの研究者は、今般、放射線像形成と標的癌化学療法の両方にＣｂｌ共役系を利用することについて鋭意研究した（Ｓｍｅｌｔｚｅｒ，Ｃ．Ｃ．、Ｐｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２種の新規なコバルアミン生物共役系の細胞毒性作用）。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２３２−３；Ｃａｎｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（放射線標識コバルアミン生物共役系の合成及び取り込み）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２３０−１；Ｐｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２種のドキソルビシン−コバルアミン生物共役系の合成）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２２８−９）。
【０００４】
ＶＢ12が薬剤を腸上皮細胞層を横切り、循環系に共輸送するためには、薬剤は、まずＶＢ12分子に共有結合しなければならない。同様に、ＶＢ12により抗腫瘍剤が腫瘍を攻撃するようにするためには、抗腫瘍剤は、さらにＶＢ12分子に共有結合しなければならない。このために、ＶＢ12分子自体を、まず変更して共役するのに好適な官能基を提供しなければならない。ＶＢ12のカルボン酸誘導体は、コリン環構造1のプロピオンイミド側鎖の穏やかな酸加水分解により容易に得られる（図１参照）。この加水分解により、ＶＢ12の「ｂ」、「ｄ」及び「ｅ」モノカルボン酸が形成される。2 次に、単離されたモノカルボン酸誘導体を、工業用カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ基に直接共役することができる。これにより、ペプチドがペプチド結合を介してＶＢ12に結合される。1,3
【０００５】
ペプチドがＶＢ12へ共役する第二方法は、ＶＢ12分子のコリン環のＣｏ原子上への官能基の軸置換によるものである（式１参照）。この方法において、ＶＢ12の軸ＣＮリガンドを、官能化アルキル鎖で置き換えることができる。次に、この置換官能基を、通常の化学的方法を用いてペプチド又はタンパク質へ共役させるのに使用できる。しかしながら、この方法の一つの主要な欠点は、得られた共役系が感光性Ｃｏ−Ｃ結合を含有することである。したがって、アルキルコバルアミンの溶液を可視光に当てないように注意しなければならない。
【０００６】
Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4による初期の研究では、ヌクレオチドリガンドのリボース成分の５’ＯＨへのエステル結合を介してＶＢ12に共役することができることが示された。この研究で、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉは、ジオールデヒドラーゼの精製のためのアフィニティリガンドを形成するのに、この化学的性質を利用することができるどうかを検討した。５’Ｏ−エステル結合を形成するために、著者等は、ＶＢ12と５４倍過剰の無水コハク酸とを、大容量のＤＭＳＯ（ＶＢ12＝５ｍｇ／ｍｌ）＋大過剰のピリジン（１２８倍ｗ／ｗ）中で反応させた。その結果、著者等は、形成された結合は、塩基性ｐＨで不安定であるばかりでなく、酵素を精製するのにも有効でないことを見いだした。Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5は、リボースの５'ＯＨへの別の結合方法を記載している。これらの研究者は、ｐ−マレイミドフェニルイソシアネートをＶＢ12とを反応させ、続いて活性化ＶＢ12分子を使用してチオール化アルカリ性ホスファターゼと反応させる分続いて、Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等は、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4の研究をＡｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5の研究、さらにはＲｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等3、6の研究とを組み合わせて、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ及びコンセンサスインターフェロンをＶＢ12の５’Ｏ−グルタロイル誘導体へ共役させた。記載によれば、得られた共役系は、ラットＩＦに予備複合された共役系のラットへの十二指腸内ポンプ投与後に活性状態となる。Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等により記載されている方法では、シアノコバルアミン（ＶＢ12−１３５６ＭＷ）５ｍｇをＤＭＳＯ１，０００ｍｌに溶解し、無水グルタル酸（１１６ＭＷ）２００ｍｇをピリジン１６０ｍｌに添加した。生成物収量は、約６５％であった。これは、ＶＢ12に対して無水グルタル酸が４６８モル過剰であることを示す。Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4の研究において、これらの研究者は、シアノコバルアミン２００ｍｇをＤＭＳＯ４０ｍｌ＋無水コハク酸（１００ＭＷ）８ｇに溶解して使用し、ヒドロキシル基にカップリングさせた。これは、無水物が５４倍モル過剰であることを示しており、生成物収量は９０％であった。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等3、6により記載されている共役方法では、ＶＢ12一塩基酸を酸による７２時間処理により調製し、続いてＤｏｗｅｘ １Ｘ８及びＤｏｗｅｘ１Ｘ２により精製しており、この場合の収量は約５％でしかなかった。ＶＢ12一塩基酸をある種のペプチド及びタンパク質に結合するために、カルボキシル基のさらなる誘導化がしばしば必要であった。
【０００７】
Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4並びにＨａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等7並びにＡｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5により記載されている方法とは別に、ＶＢ12の５’ＯＨ基に対して共有結合を形成する他の方法がある。これらの方法では、一般的にアガロースに存在する糖残基を変更することによりアフィニティ樹脂を調製することができる。これらの方法では、オキシラン（１，４ブタン−ジオールジグリシジルエーテル）、ベンゾキノン又はシアヌリッククロリドとの反応を含む。これらの方法は、ＶＢ12誘導体の合成で試みられたが、収量が低すぎてプロセスを工業化するには不適当であったり、試薬の使用量が多すぎて同様に工業化には不適当であるものであった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、上記した従来技術の欠点の一つ以上を克服又は少なくとも軽減することである。特に、本発明の目的は、スペーサ分子との化学結合にＶＢ12の５'ＯＨ基を利用するＶＢ12担体分子の誘導体の新規な製造方法を提供することである。本発明の好ましい目的は、製造が容易であり、高収量で得られ、且つ容易に精製されることができるＶＢ12誘導体を提供することである。
【０００９】
（発明の開示）
驚くべきことに、本発明者等により、ポリマー、ナノ粒子及び薬学的に活性な薬剤へ共役するのに好適であるＶＢ12誘導体が、ＶＢ12のリボース成分上の５'ＯＨ基とカルボニル求電子剤との反応により容易に調製されることが分かった。
【００１０】
本発明の一態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ12誘導体の製造方法であって、ＶＢ12の５'ＯＨ基又はその類似体を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いて前記中間体を求核性スペーサ分子と反応させて前記ＶＢ12誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ12誘導体の製造方法であって、カルボン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いてＶＢ12の５'ＯＨ基を前記活性中間体と反応させて前記ＶＢ12誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。
【００１２】
また、本発明の方法により調製されるＶＢ12の誘導体も提供される。これらの誘導体は、理想的には生物適合性ポリマーに結合されるか、ナノ粒子と関連している。これらのポリマー及びナノ粒子を、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と混合して被験者への治療投与用医薬組成物を調製できる。
【００１３】
本明細書及び請求の範囲全体を通して、特記のない限りは、用語「含む」及び「含有する」とは、記載された完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含むが、他の完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含むことを排除するものではない。
【００１４】
（発明を実施するための最良の形態）
図面を参照して、ここで本発明を詳細に説明する。
本発明のＶＢ12誘導体は、ポリマー、ナノ粒子、治療剤、タンパク質及びペプチド並びに他のこのような薬学的に活性な薬剤へ共役する又は結合するのに好適である。これらのＶＢ12誘導体の製造方法により、一般的に高収量で且つ純度がよい誘導体を得ることができる。
【００１５】
一般的に、これらの誘導体は、ＶＢ12又はその類似体を溶媒、好ましくは好適な非水性溶媒、例えば、乾燥ＤＭＦ、乾燥ＴＨＦ又は乾燥ＤＭＳＯ等に溶解し、カルボニル求電子剤、好ましくは１，１'−カルボニルジイミダゾール（１〜５モル過剰）との反応によりＶＢ12の５'ＯＨ基を活性化することにより得られる。５モル過剰以上の量を使用できるが、一般的には必要としない。好ましくは、ＶＢ12を、ＤＭＳＯに高濃度で溶解させる。次に、活性化ＶＢ12中間体を、ペプチド又はタンパク質に直接カップリングさせてもよいし、ジアミノ−スペーサ若しくはアミノ−スペーサー酸又はアミノ−アルキル鎖と反応させて、ミクロ粒子若しくはナノ粒子の疎水性表面又は脂質若しくはリポソームに挿入させるのに好適なＶＢ12の疎水性誘導体を形成してもよい。
【００１６】
また、本発明の別法によれば、ＶＢ12の５'ＯＨエステル誘導体の製造にＶＢ12の５'ＯＨ基を利用する。５'ＯＨエステル誘導体の合成において、まず、カルボン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性求電子中間体を調製する。次に、ＶＢ12又はその類似体を、求電子中間体との反応に附することにより、ＶＢ12の５'ＯＨ基が、カルボニル求電子剤を攻撃し、離脱基に取って代わってＶＢ12誘導体が得られる。好ましくは、ＶＢ12の５'ＯＨエステル誘導体の調製において、ＶＢ12をアミノ酸スペーサ又は酸脂質に結合させる。これらの誘導体は、製造が容易であり、且つ血清エステラーゼにより容易に開裂されて生体内で在来ＶＢ12を再生するスペーサ又は結合をこれらの誘導体から生成するのが容易であるという更なる利点がある。
【００１７】
本発明者等は、カルボニル求電子剤を利用して、強陽性カルボニル基を、カルボニル基に結合した良好な離脱基と組み合わせることにより弱い５'ＯＨ求核剤の攻撃を可能にした。これらの方法により、強塩基性（強塩基によりＶＢ12が変性されることがある）を使用して架橋剤をＶＢ12分子に結合させていた従来技術の問題を克服できる。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、前記カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネート、カルボニルジピペリジン、１，１'−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネート、より好ましくはカルボニルジイミダゾールから選択される二官能カルボニル求電子剤である。
【００１９】
また、本発明によれば、式（Ｉ）で表されるＶＢ12誘導体、又はその塩が提供される：
ＶＢ12−５'Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ1 （Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、Ｃ1-24アルキル、Ｃ2-24アルケニル、Ｃ2-24アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、（Ｃ3-8シクロアルキル）アルキル、アミノ、−（Ｃ1-12アルキル）Ｃ（Ｏ）Ｒ2、−（Ｃ2-12アルケニル）Ｃ（Ｏ）Ｒ2、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ1-8アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2又は−ＣＨ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4（これらの全ては、任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）であり、
Ｒ2は、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ又はＣ2-6アルケニルオキシであり、
Ｒ3は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、
Ｒ4は、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ、アミノ酸又はペプチドである）。
【００２０】
好ましくは、Ｒ1が、ヘキシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミノエチル、アミノブチル、アミノヘキシル、アミノドデカニル、ｔ−ブチル−Ｐｈｅ、スクシニルヒドラジジル、アジピルヒドラジジル、Ｇｌｙ−ＯＭｅ又はＧｌｙ−ＯＨである。
【００２１】
また、本発明によれば、式（ＩＩ）で表されるＶＢ12誘導体、又はその塩が提供される：
ＶＢ12−５'Ｏ−ＣＯ−Ｒ1 （ＩＩ）
（式中、
Ｒ1は、Ｃ1-24アルキル若しくはＣ2-24アルケニル（任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）であるか、又は
Ｒ1は、−ＣＨ（Ｒ2）−ＮＨＲ3であり、
Ｒ2は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、
Ｒ3は、水素、アミン保護基、アミノ酸又はペプチドである）。
【００２２】
好ましくは、Ｒ1はＣ8-24アルキル、Ｃ8-24アルケニル又は−ＣＨ（Ｒ2）−ＮＨＲ3（式中、Ｒ2はグリシンであり且つＲ3はＢｏｃ又は水素であるか、又はＲ2はフェニルアラニンであり且つＲ3はＢｏｃ又は水素である）である。当業者には、他のアミノ酸又はタンパク質を使用してＶＢ12分子又はその類似体を誘導化できることが明らかであろう。さらに、アミノ酸又はタンパク質が、これらの反応剤を本発明のカップリング反応に附する前に、ペンダント官能基の保護又は他のこのようなマスキングを必要とする場合があることが明らかであろう。
【００２３】
本発明のＶＢ12誘導体を、当業者には公知であり、且つ特許又は科学文献に公表されている標準的方法に準じてポリマーに結合させるか、ナノ粒子等と関連させてビタミン複合体を調製できる。このような方法は、例えば、欧州特許第０ ２２０ ０３０号、オーストラリア特許第６６４３６５号、米国特許第５４４９７２０号及び第５５４８０６４号に記載されている。
【００２４】
ビタミン複合体は、薬剤又は活性物質、特にホルモン、薬剤、プロドラッグ、酵素、タンパク質、ペプチド、トキシン、免疫抗原又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体を被験者に導出するのに使用される。被験者は、好ましくは脊椎動物宿主、より好ましくは獣、家畜、農業用動物及びヒトである。
【００２５】
本発明のＶＢ12誘導体から調製されるポリマー又はナノ粒子は、当業者に公知の標準的配合方法に準じてポリマー又はナノ粒子を薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と組み合わせることにより、医薬組成物として配合できる。医薬組成物は、当業者により決定される所望の投与形態を満たすようにいずれかの許容できる方法で配合してよい。
【００２６】
本明細書で教示される方法の主要な利点には、ＶＢ12誘導体の収量の増加、及びＶＢ12の活性化の間に使用される化学薬品の減少又は活性化される酸の増加によるコストの低下などがある。
【００２７】
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
【００２８】
実施例１：５'ＯＨ−（ヘキシル）−ＶＢ12の調製
材料：ＶＢ12は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。
【００２９】
【化１】
【００３０】
ＶＢ12 ＦＷ １３５５．４
ＣＤＩ ＦＷ １６２．２
ＤＭＳＯ
【００３１】
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率６０％；融点２１３〜２１５℃（分解）；Ｃ70Ｈ101Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４８２、実測値１５０５（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１０５００）。
【００３２】
実施例２：５'ＯＨ−（ドデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ドデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率５２％；融点２１５〜２１８℃（分解）；Ｃ76Ｈ113Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５６６、実測値１５８９（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１６９００）。
【００３３】
実施例３：５'ＯＨ−（テトラデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。テトラデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率４６％；融点２２８〜２３３℃（分解）；Ｃ78Ｈ119Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５９５、実測値１６１８（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１３０００）。
【００３４】
実施例４：５'ＯＨ−（ヘキサデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキサデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率４８％；融点２２３〜２２７℃（分解）；Ｃ80Ｈ121Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６２３、実測値１６４６（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝２００００）。
【００３５】
実施例５：５'ＯＨ−（オクタデシル）−ＶＢ12の調製
材料：ＶＢ12は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。
【００３６】
【化２】
【００３７】
ＶＢ12 ＦＷ １３５５．４
ＣＤＩ ＦＷ １６２．２
ＤＭＳＯ
【００３８】
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解させた。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ:４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。反応混合物を、４等分し、オクタデシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）５００ｍｇをアセトン、エタノール、ジクロロメタン又はクロロホルムに溶解したものに添加した。２時間反応させた後、反応を、ＴＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより監視して、生成物（５'ＯＨ−（オクタデシル）−ＶＢ12）の量を求めた。
【００３９】
次に、等容積の水とＤＣＭを添加することにより生成物を未反応ＶＢ12から分離した後、Ｂｅｃｋｍａｎ高速遠心分離機で遠心分離した（５Ｋ、１０分）。ＤＣＭ相を除去し、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）により未変更ＶＢ12から分離した後、凍結乾燥した：収率６６％；融点２２０〜２２３℃（分解）；Ｃ82Ｈ125Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６５１、実測値１６７４（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１７５００）。
【００４０】
実施例６：５'ＯＨ−（アミノエチル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１.０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノエタン（３．３当量）を、反応混合物に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いてシリカカラムによるフラッシュクロマトグラフィで精製した。次に、得られた生成物を、凍結乾燥した：収率６３％；融点２０６〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．２２；Ｃ66Ｈ94Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４４１、実測値１４４１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１９９００）。
【００４１】
実施例７：５'ＯＨ−（アミノブチル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノブタン（３．３当量）を一度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（シリカ、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した：収率７０％；融点２４２〜２４４℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．０８；Ｃ68Ｈ98Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４６９、実測値１４６９（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１５５００）。
【００４２】
実施例８：５'ＯＨ−（ｔ−ブチル−Ｐｈｅ）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。固形ｔ−ブチル−Ｐｈｅ（３．３当量）を一度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカ、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した。
【００４３】
実施例９：５'ＯＨ−（アミノヘキシル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノヘキサン（３．３当量）を反応混合物に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率９８％；融点２３０〜２３３℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．１１；Ｃ70Ｈ102Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４９７、実測値１４９７（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１７０００）。
【００４４】
実施例１０：５'ＯＨ−（アミノドデカニル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、ジアミノドデカン（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）に再懸濁し、５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いたシリカ樹脂）で精製した後、凍結乾燥した:収率６８％；融点１５６〜１５８℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．２７；Ｃ76Ｈ114Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５８１、実測値１５８１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝３３０００）。
【００４５】
実施例１１：５'ＯＨ−（スクシニルヒドラジジル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形スクシニルジヒドラジド（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率６８％；融点２０６〜２０８℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．３６；Ｃ68Ｈ96Ｎ18Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５８１、実測値１５８１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１５７００）。
【００４６】
実施例１２：５'ＯＨ−（アジピルヒドラジジル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形アジピルジヒドラジド（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、シリカカラムフラッシュクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率７３％；融点２０８〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．３３；Ｃ70Ｈ100Ｎ18Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５５５、実測値１５５５（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝２１１００）。
【００４７】
実施例１３：エステル結合ＶＢ12−フェニルアラニンの調製
Ｂｏｃ−フェニルアラニン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニルジイミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、得られた溶液をＣＯ2の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した。ＶＢ12（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性エステル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９ｍｏｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶＢ12を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除去した。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と、ＤＷ２３％と、ＮＨ4ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．５×５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生成物を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加することにより１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈殿させ、乾燥させた。
【００４８】
実施例１４：エステル結合ＶＢ12−グリシンの調製
Ｂｏｃ−グリシン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニルジイミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、得られた溶液をＣＯ2の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した。ＶＢ12（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性エステル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９ｍｏｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶＢ12を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除去した。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と、ＤＷ２３％と、ＮＨ4ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．５×５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生成物を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加することにより１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈殿させ、乾燥させた。
【００４９】
実施例１５：ＶＢ12−グリシン酸の 調製
シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及び１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、３０℃のジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に順次添加し、混合物を２０分間攪拌した。ＯＭｅ−Ｇｌｙ（２．７ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、トリエチルアミン（２００μＬ）を添加し、得られた混合物を、室温で２４時間攪拌した。混合物を、酢酸エチル（３０ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を濾過し、固形物を、アセトンで洗浄した。次に、残留物を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に溶解し、３０分間攪拌した。次に粗製酸を、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ４樹脂において、２％酢酸で溶出させて精製した：収率９５％；融点２３９〜２４２℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．４１；Ｃ66Ｈ90Ｎ15Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４５６、実測値１４５６（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１９８００）。
【００５０】
実施例１６：種々の５'Ｏ−ＶＢ12誘導体の相対的ＩＦアフィニティの測定
試薬
ＩＦ緩衝液：ＢＳＡ（ＶＢ12及びＩＦ欠失）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ−３９０２）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌで溶解した。
【００５１】
57ＣｏＶＢ12：57Ｃｏストック（５０μｌ）（Ｋｏｄａｋ）を、ストック５０μｌをＩＦ緩衝液２５ｍｌに添加したものに希釈して、１ｎｇ57ＣｏＶＢ12／２５ｍｌ溶液を得た。冷ＶＢ12２５０ｎｇを、熱57ＣｏＶＢ12溶液２５ｍｌに添加して１０ｎｇ／ｍｌ溶液を得た。
【００５２】
ブタ内因子：ブタＩＦ（シグマ）を、ＩＦ緩衝液に２００単位／ｍｌで溶解し、必要となるまで５００μｌロット（１００ＩＵアリコット）で凍結させた。
【００５３】
ＢＳＡ塗布チャコール：ＢＳＡ（１％）を、等容積の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の５％チャコール溶液に添加し、３０分間穏やかに攪拌した。
【００５４】
手順：
ＶＢ12又はＶＢ12誘導体の１０倍順次希釈液を、ＩＦ緩衝液で１ｎｇ／ｍｌまで調製した。等容積の希釈ＩＦを、各試料に添加し、室温で２０分間インキュベーションした。等容積のＢＳＡ塗布チャコールを、各試料に添加し、混合してから遠心分離した。遠心分離後、上清と各試料のペレットとを分離し、57ＣｏＶＢ12を、ガンマカウンターでカウントすることにより求めた。データは、未変更ＶＢ12と比較したときの57ＣｏＶＢ12結合の阻害％として表す。
【００５５】
【表１】
【００５６】
当業者は、ここに記載の本発明は、具体的に記載以外の修正及び変更をおこなうことが分かるであろう。また、本発明は、全てのこのような修正及び変更を含む。また、本発明は、本明細書で個々に又はまとめて言及又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全て並びに前記工程又は特徴のいずれかの２以上の組み合わせのいずれか及び全てを含む。
【００５７】
参考文献
１．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ Ｇ．Ｊ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ(ビタミンＢ12輸送系のペプチド、タンパク質及びナノ粒子の経口導出用担体としての使用)． Ｐｒｏｃ． ２３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９６．
２．Ａｎｔｏｎ， Ｄ．Ｌ．Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ， Ｈ．Ｐ．Ｃ．，Ｗａｌｋｅｒ， Ｔ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍａｔｗｉｙｏｆｆ，Ｎ．Ａ． Ｃａｒｂｏｎ−１３ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ． Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂ−， ｄ−， ａｎｄ ｅ−ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ（シアノコバルアミンのモノカルボン酸の炭素１３核磁気共鳴の研究。ｂ−、ｄ−及びｅ−モノカルボン酸の帰属）． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １０２：２２１５，１９８０．
３．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ， Ｇ．Ｊ．， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， Ｓ．Ｗ ａｎｄ Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ， Ａ．Ｄ． Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（顆粒球体−コロニー刺激因子及びエリスロポイエチン用ビタミンＢ12介在経口導出システム）． Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ， ６， ４５９−４６５，１９９５．
４．Ｔｏｒａｙａ， Ｔ． ａｎｄ Ｆｕｋｕｉ， Ｓ． Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｃｏｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｅｎｚｙｍｅ（ビタミンＢ12コエンザイムの数種の固定化誘導体合成及びそれらのジオールデヒドラーゼとコエンザイムとの相互作用の研究用アフィニティ吸収剤としての使用）． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５５，３５２０，１９８０．
５．Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ， Ｍ．Ｅ．， Ｐａｔｅｌ， Ｕ．Ｓ．， Ｒａｎａｄｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｕｍｂｏ， Ｐ．Ｓ． ｐ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ： Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｔｏ ｔｈｉｏｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ(ｐ−マレイミドフェニルイソシアネート：ヒドロキシルのチオールへのカップリング用の新規なヘテロ二官能リンカー)． Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，４，２１２，１９９３．
６．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， Ｓ．Ｗ．， ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ， Ｇ．Ｊ． Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ＧＣＳＦ ａｎｄ ＥＰＯ（ＧＣＳＦ及びＥＰＯ用ビタミンＢ12介在導出システム）． （ＵＳＰ ０８／０６４，８７３；５，５４８，０６４），１９９３．
７．Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ， Ａ．Ｄ．， Ｋｉｎｓｔｌｅｒ， Ｏ．Ｂ．， ａｎｄ Ｐｉｔｔ， Ｃ．Ｇ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ＶＢ12 ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＶＢ12とタンパク質との共役系）．（米国特許第５，５７４，０１８号）１９９６．
【図面の簡単な説明】
【図１】薬剤及びペプチドがＶＢ12に共役する可能性のある３つの部位を持つＶＢ12分子を示す。これらの共役する部位は以下の通りである：ａ）コリン環のＣｏ原子上の置換を介した軸で共役する；ｂ）ｅプロピアンイミド側鎖の酸修飾により直接共役する；及びｃ）ヌクレオチド残基のリボース成分が５'ＯＨ基へ共役する。
（技術分野）
本発明は、一般的には、ビタミンＢ12（ＶＢ12）又はその類似体と結合させた治療物質を含む複合体を投与することにより治療物質を供給するためのビタミンＢ12担体分子の新規な誘導体に関する。また、本発明は、一般的にＶＢ12誘導体の新規な製造方法に関する。より詳細には、本発明は、ＶＢ12の５’ＯＨ基を求電子剤と反応させることによるこれらのＶＢ12誘導体の製造に関する。
【０００２】
【背景技術】
ペプチド用経口供給機構が、本発明者の一人により着手された最近の研究に基づく国際出願ＰＣＴ／ＡＵ８６／０２９９（ＷＯ８７／０２２５１）に記載されている。この機構では、少なくとも一種の担体分子であって、これに活性物質を結合させて前記活性物質を腸内腔から循環系に輸送させるようにしたものを利用している。ＶＢ12及びその類似体は、内因子（ＩＦ）に対するＶＢ12の結合が介在する天然ＶＢ12摂取系を使用して活性物質／ＶＢ12複合体を輸送することにより理想的な担体分子として作用する。リンパドレナージ系又は血清に一旦排出されたとき、この複合体は、在来活性物質の生物活性を実質的に保持している。
【０００３】
より最近では、ＶＢ12と薬剤、細胞毒及びＭＲＩ剤との共役系が、腫瘍細胞の検出及び治療に使用されてきた。ビタミンＢ12（コバルアミン、Ｃｂｌ、ＶＢ12）が正常に細胞摂取されるには、ビタミンは、まず血漿タンパク質トランスコバルアミンＩＩ（ＴＣＩＩ）に結合しなければならない。ＣｂｌのＴＣＩＩへの結合に続いて、得られたＴＣＩＩ−Ｃｂｌ複合体は、細胞表面上のレセプターに親和性良く結合し、レセプター介在エンドサイトーシス（ＲＭＥ）と称されるプロセスを介して細胞により吸収される。細胞内部において、Ｃｂｌが酵素により変更されて２種のコエンザイムが形成されると、これら２種のコエンザイムが次に２つの必須の代謝経路に使用される。一つの経路には、メチオニンのデノボ（de novo）合成におけるホモシステインのメチル化が含まれ、メチオニンシンターゼが触媒として働く。他の経路には、メチルマロニルＣｏＡのスクシニルＣｏＡへの再配列を含み、メチルマロニルＣｏＡムターゼが触媒として働く。ヒト及びネズミの白血病細胞の生体外増殖が、ＴＣＩＩとＣｂｌとの両方に依存することが最近示された（ＭｃＬｅａｎ，Ｇ．Ｒ．、Ｑｕａｄｒｏｓ，Ｅ．Ｂ．、Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ｐ．、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．Ｃ．、Ｓｃｈｒａｄｅｒ，Ｊ．Ｗ．及びＺｉｌｔｅｎｅｒ，Ｈ．Ｊ．、１９９７ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｃｏｂａｌａｍｉｎ ＩＩ ｂｌｏｃｋ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌｓ（白血病細胞のトランスコバルアミンＩＩブロック生体外増殖に対する抗体）、Ｂｌｏｏｄ、８９、２３５−２４２）。何人かの研究者は、今般、放射線像形成と標的癌化学療法の両方にＣｂｌ共役系を利用することについて鋭意研究した（Ｓｍｅｌｔｚｅｒ，Ｃ．Ｃ．、Ｐｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２種の新規なコバルアミン生物共役系の細胞毒性作用）。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２３２−３；Ｃａｎｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｕｐｔａｋｅ ｏｆ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ（放射線標識コバルアミン生物共役系の合成及び取り込み）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２３０−１；Ｐｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．、Ｍｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｅｓｔ，Ｆ．Ｇ．及びＧｒｉｓｓｏｍ，Ｃ．Ｂ．、１９９９ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｗｏ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ−ｃｏｂａｌａｍｉｎ ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（２種のドキソルビシン−コバルアミン生物共役系の合成）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎｉｎｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｐｐ２２８−９）。
【０００４】
ＶＢ12が薬剤を腸上皮細胞層を横切り、循環系に共輸送するためには、薬剤は、まずＶＢ12分子に共有結合しなければならない。同様に、ＶＢ12により抗腫瘍剤が腫瘍を攻撃するようにするためには、抗腫瘍剤は、さらにＶＢ12分子に共有結合しなければならない。このために、ＶＢ12分子自体を、まず変更して共役するのに好適な官能基を提供しなければならない。ＶＢ12のカルボン酸誘導体は、コリン環構造1のプロピオンイミド側鎖の穏やかな酸加水分解により容易に得られる（図１参照）。この加水分解により、ＶＢ12の「ｂ」、「ｄ」及び「ｅ」モノカルボン酸が形成される。2 次に、単離されたモノカルボン酸誘導体を、工業用カルボジイミド、例えば、１−エチル−３−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）又はジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて、タンパク質又はペプチドのアミノ基に直接共役することができる。これにより、ペプチドがペプチド結合を介してＶＢ12に結合される。1,3
【０００５】
ペプチドがＶＢ12へ共役する第二方法は、ＶＢ12分子のコリン環のＣｏ原子上への官能基の軸置換によるものである（式１参照）。この方法において、ＶＢ12の軸ＣＮリガンドを、官能化アルキル鎖で置き換えることができる。次に、この置換官能基を、通常の化学的方法を用いてペプチド又はタンパク質へ共役させるのに使用できる。しかしながら、この方法の一つの主要な欠点は、得られた共役系が感光性Ｃｏ−Ｃ結合を含有することである。したがって、アルキルコバルアミンの溶液を可視光に当てないように注意しなければならない。
【０００６】
Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4による初期の研究では、ヌクレオチドリガンドのリボース成分の５’ＯＨへのエステル結合を介してＶＢ12に共役することができることが示された。この研究で、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉは、ジオールデヒドラーゼの精製のためのアフィニティリガンドを形成するのに、この化学的性質を利用することができるどうかを検討した。５’Ｏ−エステル結合を形成するために、著者等は、ＶＢ12と５４倍過剰の無水コハク酸とを、大容量のＤＭＳＯ（ＶＢ12＝５ｍｇ／ｍｌ）＋大過剰のピリジン（１２８倍ｗ／ｗ）中で反応させた。その結果、著者等は、形成された結合は、塩基性ｐＨで不安定であるばかりでなく、酵素を精製するのにも有効でないことを見いだした。Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5は、リボースの５'ＯＨへの別の結合方法を記載している。これらの研究者は、ｐ−マレイミドフェニルイソシアネートをＶＢ12とを反応させ、続いて活性化ＶＢ12分子を使用してチオール化アルカリ性ホスファターゼと反応させる分続いて、Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等は、Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4の研究をＡｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5の研究、さらにはＲｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等3、6の研究とを組み合わせて、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ及びコンセンサスインターフェロンをＶＢ12の５’Ｏ−グルタロイル誘導体へ共役させた。記載によれば、得られた共役系は、ラットＩＦに予備複合された共役系のラットへの十二指腸内ポンプ投与後に活性状態となる。Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等により記載されている方法では、シアノコバルアミン（ＶＢ12−１３５６ＭＷ）５ｍｇをＤＭＳＯ１，０００ｍｌに溶解し、無水グルタル酸（１１６ＭＷ）２００ｍｇをピリジン１６０ｍｌに添加した。生成物収量は、約６５％であった。これは、ＶＢ12に対して無水グルタル酸が４６８モル過剰であることを示す。Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4の研究において、これらの研究者は、シアノコバルアミン２００ｍｇをＤＭＳＯ４０ｍｌ＋無水コハク酸（１００ＭＷ）８ｇに溶解して使用し、ヒドロキシル基にカップリングさせた。これは、無水物が５４倍モル過剰であることを示しており、生成物収量は９０％であった。Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ等3、6により記載されている共役方法では、ＶＢ12一塩基酸を酸による７２時間処理により調製し、続いてＤｏｗｅｘ １Ｘ８及びＤｏｗｅｘ１Ｘ２により精製しており、この場合の収量は約５％でしかなかった。ＶＢ12一塩基酸をある種のペプチド及びタンパク質に結合するために、カルボキシル基のさらなる誘導化がしばしば必要であった。
【０００７】
Ｔｏｒａｙａ及びＦｕｋｕｉ4並びにＨａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ等7並びにＡｎｎｕｎｚｉａｔｏ等5により記載されている方法とは別に、ＶＢ12の５’ＯＨ基に対して共有結合を形成する他の方法がある。これらの方法では、一般的にアガロースに存在する糖残基を変更することによりアフィニティ樹脂を調製することができる。これらの方法では、オキシラン（１，４ブタン−ジオールジグリシジルエーテル）、ベンゾキノン又はシアヌリッククロリドとの反応を含む。これらの方法は、ＶＢ12誘導体の合成で試みられたが、収量が低すぎてプロセスを工業化するには不適当であったり、試薬の使用量が多すぎて同様に工業化には不適当であるものであった。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、上記した従来技術の欠点の一つ以上を克服又は少なくとも軽減することである。特に、本発明の目的は、スペーサ分子との化学結合にＶＢ12の５'ＯＨ基を利用するＶＢ12担体分子の誘導体の新規な製造方法を提供することである。本発明の好ましい目的は、製造が容易であり、高収量で得られ、且つ容易に精製されることができるＶＢ12誘導体を提供することである。
【０００９】
（発明の開示）
驚くべきことに、本発明者等により、ポリマー、ナノ粒子及び薬学的に活性な薬剤へ共役するのに好適であるＶＢ12誘導体が、ＶＢ12のリボース成分上の５'ＯＨ基とカルボニル求電子剤との反応により容易に調製されることが分かった。
【００１０】
本発明の一態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ12誘導体の製造方法であって、ＶＢ12の５'ＯＨ基又はその類似体を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いて前記中間体を求核性スペーサ分子と反応させて前記ＶＢ12誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適なＶＢ12誘導体の製造方法であって、カルボン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いてＶＢ12の５'ＯＨ基を前記活性中間体と反応させて前記ＶＢ12誘導体を得る工程と、を含む方法が提供される。
【００１２】
また、本発明の方法により調製されるＶＢ12の誘導体も提供される。これらの誘導体は、理想的には生物適合性ポリマーに結合されるか、ナノ粒子と関連している。これらのポリマー及びナノ粒子を、薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と混合して被験者への治療投与用医薬組成物を調製できる。
【００１３】
本明細書及び請求の範囲全体を通して、特記のない限りは、用語「含む」及び「含有する」とは、記載された完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含むが、他の完全体、工程又は完全体若しくは工程の群を含むことを排除するものではない。
【００１４】
（発明を実施するための最良の形態）
図面を参照して、ここで本発明を詳細に説明する。
本発明のＶＢ12誘導体は、ポリマー、ナノ粒子、治療剤、タンパク質及びペプチド並びに他のこのような薬学的に活性な薬剤へ共役する又は結合するのに好適である。これらのＶＢ12誘導体の製造方法により、一般的に高収量で且つ純度がよい誘導体を得ることができる。
【００１５】
一般的に、これらの誘導体は、ＶＢ12又はその類似体を溶媒、好ましくは好適な非水性溶媒、例えば、乾燥ＤＭＦ、乾燥ＴＨＦ又は乾燥ＤＭＳＯ等に溶解し、カルボニル求電子剤、好ましくは１，１'−カルボニルジイミダゾール（１〜５モル過剰）との反応によりＶＢ12の５'ＯＨ基を活性化することにより得られる。５モル過剰以上の量を使用できるが、一般的には必要としない。好ましくは、ＶＢ12を、ＤＭＳＯに高濃度で溶解させる。次に、活性化ＶＢ12中間体を、ペプチド又はタンパク質に直接カップリングさせてもよいし、ジアミノ−スペーサ若しくはアミノ−スペーサー酸又はアミノ−アルキル鎖と反応させて、ミクロ粒子若しくはナノ粒子の疎水性表面又は脂質若しくはリポソームに挿入させるのに好適なＶＢ12の疎水性誘導体を形成してもよい。
【００１６】
また、本発明の別法によれば、ＶＢ12の５'ＯＨエステル誘導体の製造にＶＢ12の５'ＯＨ基を利用する。５'ＯＨエステル誘導体の合成において、まず、カルボン酸スペーサ分子を二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性求電子中間体を調製する。次に、ＶＢ12又はその類似体を、求電子中間体との反応に附することにより、ＶＢ12の５'ＯＨ基が、カルボニル求電子剤を攻撃し、離脱基に取って代わってＶＢ12誘導体が得られる。好ましくは、ＶＢ12の５'ＯＨエステル誘導体の調製において、ＶＢ12をアミノ酸スペーサ又は酸脂質に結合させる。これらの誘導体は、製造が容易であり、且つ血清エステラーゼにより容易に開裂されて生体内で在来ＶＢ12を再生するスペーサ又は結合をこれらの誘導体から生成するのが容易であるという更なる利点がある。
【００１７】
本発明者等は、カルボニル求電子剤を利用して、強陽性カルボニル基を、カルボニル基に結合した良好な離脱基と組み合わせることにより弱い５'ＯＨ求核剤の攻撃を可能にした。これらの方法により、強塩基性（強塩基によりＶＢ12が変性されることがある）を使用して架橋剤をＶＢ12分子に結合させていた従来技術の問題を克服できる。
【００１８】
好ましい実施態様によれば、前記カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ'−ジスクシンイミジルカーボネート、カルボニルジピペリジン、１，１'−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネート、より好ましくはカルボニルジイミダゾールから選択される二官能カルボニル求電子剤である。
【００１９】
また、本発明によれば、式（Ｉ）で表されるＶＢ12誘導体、又はその塩が提供される：
ＶＢ12−５'Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ1 （Ｉ）
（式中、
Ｒ1は、Ｃ1-24アルキル、Ｃ2-24アルケニル、Ｃ2-24アルキニル、Ｃ3-8シクロアルキル、（Ｃ3-8シクロアルキル）アルキル、アミノ、−（Ｃ1-12アルキル）Ｃ（Ｏ）Ｒ2、−（Ｃ2-12アルケニル）Ｃ（Ｏ）Ｒ2、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ1-8アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ2又は−ＣＨ（Ｒ3）Ｃ（Ｏ）Ｒ4（これらの全ては、任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）であり、
Ｒ2は、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ又はＣ2-6アルケニルオキシであり、
Ｒ3は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、
Ｒ4は、ヒドロキシ、Ｃ1-6アルコキシ、アミノ酸又はペプチドである）。
【００２０】
好ましくは、Ｒ1が、ヘキシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシル、アミノエチル、アミノブチル、アミノヘキシル、アミノドデカニル、ｔ−ブチル−Ｐｈｅ、スクシニルヒドラジジル、アジピルヒドラジジル、Ｇｌｙ−ＯＭｅ又はＧｌｙ−ＯＨである。
【００２１】
また、本発明によれば、式（ＩＩ）で表されるＶＢ12誘導体、又はその塩が提供される：
ＶＢ12−５'Ｏ−ＣＯ−Ｒ1 （ＩＩ）
（式中、
Ｒ1は、Ｃ1-24アルキル若しくはＣ2-24アルケニル（任意にアミノ、アミド、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）であるか、又は
Ｒ1は、−ＣＨ（Ｒ2）−ＮＨＲ3であり、
Ｒ2は、アミノ酸側鎖又はその誘導体であり、
Ｒ3は、水素、アミン保護基、アミノ酸又はペプチドである）。
【００２２】
好ましくは、Ｒ1はＣ8-24アルキル、Ｃ8-24アルケニル又は−ＣＨ（Ｒ2）−ＮＨＲ3（式中、Ｒ2はグリシンであり且つＲ3はＢｏｃ又は水素であるか、又はＲ2はフェニルアラニンであり且つＲ3はＢｏｃ又は水素である）である。当業者には、他のアミノ酸又はタンパク質を使用してＶＢ12分子又はその類似体を誘導化できることが明らかであろう。さらに、アミノ酸又はタンパク質が、これらの反応剤を本発明のカップリング反応に附する前に、ペンダント官能基の保護又は他のこのようなマスキングを必要とする場合があることが明らかであろう。
【００２３】
本発明のＶＢ12誘導体を、当業者には公知であり、且つ特許又は科学文献に公表されている標準的方法に準じてポリマーに結合させるか、ナノ粒子等と関連させてビタミン複合体を調製できる。このような方法は、例えば、欧州特許第０ ２２０ ０３０号、オーストラリア特許第６６４３６５号、米国特許第５４４９７２０号及び第５５４８０６４号に記載されている。
【００２４】
ビタミン複合体は、薬剤又は活性物質、特にホルモン、薬剤、プロドラッグ、酵素、タンパク質、ペプチド、トキシン、免疫抗原又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体を被験者に導出するのに使用される。被験者は、好ましくは脊椎動物宿主、より好ましくは獣、家畜、農業用動物及びヒトである。
【００２５】
本発明のＶＢ12誘導体から調製されるポリマー又はナノ粒子は、当業者に公知の標準的配合方法に準じてポリマー又はナノ粒子を薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤と組み合わせることにより、医薬組成物として配合できる。医薬組成物は、当業者により決定される所望の投与形態を満たすようにいずれかの許容できる方法で配合してよい。
【００２６】
本明細書で教示される方法の主要な利点には、ＶＢ12誘導体の収量の増加、及びＶＢ12の活性化の間に使用される化学薬品の減少又は活性化される酸の増加によるコストの低下などがある。
【００２７】
（実施例）
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらの実施例には限定されない。
【００２８】
実施例１：５'ＯＨ−（ヘキシル）−ＶＢ12の調製
材料：ＶＢ12は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。
【００２９】
【化１】
ＶＢ12 ＦＷ １３５５．４
ＣＤＩ ＦＷ １６２．２
ＤＭＳＯ
【００３１】
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率６０％；融点２１３〜２１５℃（分解）；Ｃ70Ｈ101Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４８２、実測値１５０５（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１０５００）。
【００３２】
実施例２：５'ＯＨ−（ドデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ドデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率５２％；融点２１５〜２１８℃（分解）；Ｃ76Ｈ113Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５６６、実測値１５８９（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１６９００）。
【００３３】
実施例３：５'ＯＨ−（テトラデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。テトラデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率４６％；融点２２８〜２３３℃（分解）；Ｃ78Ｈ119Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５９５、実測値１６１８（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１３０００）。
【００３４】
実施例４：５'ＯＨ−（ヘキサデシル）−ＶＢ12の調製
固形１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）を予めジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に溶解したものに３０℃で添加し、混合物を２５分間攪拌した。ヘキサデシルアミン（２．７ｍｍｏｌ）を一度に加え、攪拌を、室温でさらに２４時間継続した。混合物を、フェノール／ジクロロメタン（１：１、２×２０ｍＬ）で抽出し、水（１：４フェノール／ジクロロメタンから；２×２０ｍＬ）で逆抽出した。混合物を、フェニルセファロース（５０ｇ）カラムクロマトグラフィーにおいて、未変更ＶＢ12を２５％エタノールで溶出させ且つ生成物を６０％エタノールで溶出させることにより精製した。溶媒を減圧除去し、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄し、風乾した：収率４８％；融点２２３〜２２７℃（分解）；Ｃ80Ｈ121Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６２３、実測値１６４６（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝２００００）。
【００３５】
実施例５：５'ＯＨ−（オクタデシル）−ＶＢ12の調製
材料：ＶＢ12は、Ｒｏｕｓｅｌｌ−Ｕｃｌａｆから入手した。
【００３６】
【化２】
ＶＢ12 ＦＷ １３５５．４
ＣＤＩ ＦＷ １６２．２
ＤＭＳＯ
【００３８】
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解させた。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ:４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。反応混合物を、４等分し、オクタデシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）５００ｍｇをアセトン、エタノール、ジクロロメタン又はクロロホルムに溶解したものに添加した。２時間反応させた後、反応を、ＴＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣにより監視して、生成物（５'ＯＨ−（オクタデシル）−ＶＢ12）の量を求めた。
【００３９】
次に、等容積の水とＤＣＭを添加することにより生成物を未反応ＶＢ12から分離した後、Ｂｅｃｋｍａｎ高速遠心分離機で遠心分離した（５Ｋ、１０分）。ＤＣＭ相を除去し、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）により未変更ＶＢ12から分離した後、凍結乾燥した：収率６６％；融点２２０〜２２３℃（分解）；Ｃ82Ｈ125Ｎ15Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１６５１、実測値１６７４（Ｍ＋２３）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１７５００）。
【００４０】
実施例６：５'ＯＨ−（アミノエチル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１.０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノエタン（３．３当量）を、反応混合物に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、５分間音波破砕することによりアセトン（５０ｍＬ）に再懸濁させた。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いてシリカカラムによるフラッシュクロマトグラフィで精製した。次に、得られた生成物を、凍結乾燥した：収率６３％；融点２０６〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．２２；Ｃ66Ｈ94Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４４１、実測値１４４１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１９９００）。
【００４１】
実施例７：５'ＯＨ−（アミノブチル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノブタン（３．３当量）を一度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（シリカ、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した：収率７０％；融点２４２〜２４４℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．０８；Ｃ68Ｈ98Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４６９、実測値１４６９（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１５５００）。
【００４２】
実施例８：５'ＯＨ−（ｔ−ブチル−Ｐｈｅ）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。固形ｔ−ブチル−Ｐｈｅ（３．３当量）を一度に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（シリカ、イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した。
【００４３】
実施例９：５'ＯＨ−（アミノヘキシル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温で乾燥ＤＭＳＯ（２０ｍｌ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した。ジアミノヘキサン（３．３当量）を反応混合物に加えた。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、カラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率９８％；融点２３０〜２３３℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．１１；Ｃ70Ｈ102Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４９７、実測値１４９７（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１７０００）。
【００４４】
実施例１０：５'ＯＨ−（アミノドデカニル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、ジアミノドデカン（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）に再懸濁し、５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％を用いたシリカ樹脂）で精製した後、凍結乾燥した:収率６８％；融点１５６〜１５８℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．２７；Ｃ76Ｈ114Ｎ16Ｏ15ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５８１、実測値１５８１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝３３０００）。
【００４５】
実施例１１：５'ＯＨ−（スクシニルヒドラジジル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形スクシニルジヒドラジド（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率６８％；融点２０６〜２０８℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．３６；Ｃ68Ｈ96Ｎ18Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５８１、実測値１５８１（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１５７００）。
【００４６】
実施例１２：５'ＯＨ−（アジピルヒドラジジル）−ＶＢ12の調製
ＶＢ12（１．０ｇ、１．０当量）を、室温でＤＭＳＯ（３５ｍＬ）に溶解した。固形カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ：４００ｍｇ、３．３当量）を添加し、得られた混合物を、室温で１時間攪拌した後、固形アジピルジヒドラジド（３．３当量）を一度に添加した。混合物を、１２時間攪拌した後、アセトン／酢酸エチル（１：１，２００ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を焼結ガラス漏斗で濾過し、得られた固形物をアセトンで洗浄した。生成物を、シリカカラムフラッシュクロマトグラフィ（イソプロパノール５０％、アンモニア２％、水４８％）で精製した後、凍結乾燥した:収率７３％；融点２０８〜２１０℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．３３；Ｃ70Ｈ100Ｎ18Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１５５５、実測値１５５５（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝２１１００）。
【００４７】
実施例１３：エステル結合ＶＢ12−フェニルアラニンの調製
Ｂｏｃ−フェニルアラニン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニルジイミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、得られた溶液をＣＯ2の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した。ＶＢ12（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性エステル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９ｍｏｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶＢ12を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｐｈｅ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除去した。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と、ＤＷ２３％と、ＮＨ4ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．５×５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生成物を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加することにより１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈殿させ、乾燥させた。
【００４８】
実施例１４：エステル結合ＶＢ12−グリシンの調製
Ｂｏｃ−グリシン（１．５７ｇ、０．００５９ｍｏｌ）及びカルボニルジイミダゾール（１．０１ｇ、０．００６２ｍｏｌ）をＤＭＦ（６ｍｌ）に溶解し、得られた溶液をＣＯ2の激しい発生をともないながら室温で１時間攪拌した。ＶＢ12（１．０ｇ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）に添加して調製した溶液を、活性エステル溶液に滴下した後、ＤＩＥＡ（１．２ｍｌ、０．８９ｇ、０．００６９ｍｏｌ）を加え、攪拌を、室温で一晩継続した。アセトン９０ｍｌを添加してＶＢ12を沈殿させることにより、未反応Ｂｏｃ−Ｇｌｙ、ＣＤＩ及びＤＩＥＡを除去した。次に、生成物を、ブタノール４５％と、プロパン−２−オール３０％と、ＤＷ２３％と、ＮＨ4ＯＨ２％との溶媒混合物を用いた、シリカカラム（２．５×５０ｃｍ）によるフラッシュクロマトグラフィにより精製した。精製した生成物を凍結乾燥し、乾燥粉末を、純粋ＴＦＡ（１ｍｌ／１００ｍｇ）を添加することにより１０分間で脱保護した。次に、生成物を、酢酸エチルの添加により沈殿させ、乾燥させた。
【００４９】
実施例１５：ＶＢ12−グリシン酸の 調製
シアノコバルアミン（１．０ｇ、０．７４ｍｍｏｌ）及び１，１'−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ、２６０ｍｇ）を、３０℃のジメチルスルホキシド（１２ｍＬ）に順次添加し、混合物を２０分間攪拌した。ＯＭｅ−Ｇｌｙ（２．７ｍｍｏｌ）を一度に添加した後、トリエチルアミン（２００μＬ）を添加し、得られた混合物を、室温で２４時間攪拌した。混合物を、酢酸エチル（３０ｍＬ）に注ぎ、放置した。上清を捨て、残留物を、アセトン（５０ｍＬ）中で５分間音波破砕した。混合物を濾過し、固形物を、アセトンで洗浄した。次に、残留物を０．１Ｍ ＨＣｌ溶液に溶解し、３０分間攪拌した。次に粗製酸を、Ｄｏｗｅｘ １Ｘ４樹脂において、２％酢酸で溶出させて精製した：収率９５％；融点２３９〜２４２℃（分解）；ＴＬＣ（iＰｒＯＨ ３０／ｎ−ＢｕＯＨ ４５／Ｈ2Ｏ ２５／ＮＨ4ＯＨ ２）Ｒf＝０．４１；Ｃ66Ｈ90Ｎ15Ｏ17ＣｏＰのＭＳ（ＥＳＩ）質量、理論値１４５６、実測値１４５６（Ｍ）+；ＵＶ（Ｈ2Ｏ）λ361（ε＝１９８００）。
【００５０】
実施例１６：種々の５'Ｏ−ＶＢ12誘導体の相対的ＩＦアフィニティの測定
試薬
ＩＦ緩衝液：ＢＳＡ（ＶＢ12及びＩＦ欠失）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ Ａ−３９０２）を、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に１ｍｇ／ｍｌで溶解した。
【００５１】
57ＣｏＶＢ12：57Ｃｏストック（５０μｌ）（Ｋｏｄａｋ）を、ストック５０μｌをＩＦ緩衝液２５ｍｌに添加したものに希釈して、１ｎｇ57ＣｏＶＢ12／２５ｍｌ溶液を得た。冷ＶＢ12２５０ｎｇを、熱57ＣｏＶＢ12溶液２５ｍｌに添加して１０ｎｇ／ｍｌ溶液を得た。
【００５２】
ブタ内因子：ブタＩＦ（シグマ）を、ＩＦ緩衝液に２００単位／ｍｌで溶解し、必要となるまで５００μｌロット（１００ＩＵアリコット）で凍結させた。
【００５３】
ＢＳＡ塗布チャコール：ＢＳＡ（１％）を、等容積の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）の５％チャコール溶液に添加し、３０分間穏やかに攪拌した。
【００５４】
手順：
ＶＢ12又はＶＢ12誘導体の１０倍順次希釈液を、ＩＦ緩衝液で１ｎｇ／ｍｌまで調製した。等容積の希釈ＩＦを、各試料に添加し、室温で２０分間インキュベーションした。等容積のＢＳＡ塗布チャコールを、各試料に添加し、混合してから遠心分離した。遠心分離後、上清と各試料のペレットとを分離し、57ＣｏＶＢ12を、ガンマカウンターでカウントすることにより求めた。データは、未変更ＶＢ12と比較したときの57ＣｏＶＢ12結合の阻害％として表す。
【００５５】
【表１】
当業者は、ここに記載の本発明は、具体的に記載以外の修正及び変更をおこなうことが分かるであろう。また、本発明は、全てのこのような修正及び変更を含む。また、本発明は、本明細書で個々に又はまとめて言及又は示した工程、特徴、組成物及び化合物の全て並びに前記工程又は特徴のいずれかの２以上の組み合わせのいずれか及び全てを含む。
【００５７】
参考文献
１．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ Ｇ．Ｊ． Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｓ ａ ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ(ビタミンＢ12輸送系のペプチド、タンパク質及びナノ粒子の経口導出用担体としての使用)． Ｐｒｏｃ． ２３ｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９９６．
２．Ａｎｔｏｎ， Ｄ．Ｌ．Ｈｏｇｅｎｋａｍｐ， Ｈ．Ｐ．Ｃ．，Ｗａｌｋｅｒ， Ｔ．Ｅ．， ａｎｄ Ｍａｔｗｉｙｏｆｆ，Ｎ．Ａ． Ｃａｒｂｏｎ−１３ ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｃｙａｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎ． Ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂ−， ｄ−， ａｎｄ ｅ−ｍｏｎｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ（シアノコバルアミンのモノカルボン酸の炭素１３核磁気共鳴の研究。ｂ−、ｄ−及びｅ−モノカルボン酸の帰属）． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， １０２：２２１５，１９８０．
３．Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ， Ｇ．Ｊ．， Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， Ｓ．Ｗ ａｎｄ Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ， Ａ．Ｄ． Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｍｅｄｉａｔｅｄ ｏｒａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（顆粒球体−コロニー刺激因子及びエリスロポイエチン用ビタミンＢ12介在経口導出システム）． Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ， ６， ４５９−４６５，１９９５．
４．Ｔｏｒａｙａ， Ｔ． ａｎｄ Ｆｕｋｕｉ， Ｓ． Ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｃｏｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ａｓ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｂｓｏｒｂｅｎｔｓ ｆｏｒ ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｄｉｏｌ ｄｅｈｙｄｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｅｎｚｙｍｅ（ビタミンＢ12コエンザイムの数種の固定化誘導体合成及びそれらのジオールデヒドラーゼとコエンザイムとの相互作用の研究用アフィニティ吸収剤としての使用）． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２５５，３５２０，１９８０．
５．Ａｎｎｕｎｚｉａｔｏ， Ｍ．Ｅ．， Ｐａｔｅｌ， Ｕ．Ｓ．， Ｒａｎａｄｅ， Ｍ．， ａｎｄ Ｐａｌｕｍｂｏ， Ｐ．Ｓ． ｐ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ： Ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｋｅｒ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｔｏ ｔｈｉｏｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ(ｐ−マレイミドフェニルイソシアネート：ヒドロキシルのチオールへのカップリング用の新規なヘテロ二官能リンカー)． Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ．，４，２１２，１９９３．
６．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ， Ｓ．Ｗ．， ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓ， Ｇ．Ｊ． Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ＧＣＳＦ ａｎｄ ＥＰＯ（ＧＣＳＦ及びＥＰＯ用ビタミンＢ12介在導出システム）． （ＵＳＰ ０８／０６４，８７３；５，５４８，０６４），１９９３．
７．Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ， Ａ．Ｄ．， Ｋｉｎｓｔｌｅｒ， Ｏ．Ｂ．， ａｎｄ Ｐｉｔｔ， Ｃ．Ｇ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ＶＢ12 ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＶＢ12とタンパク質との共役系）．（米国特許第５，５７４，０１８号）１９９６．
【図面の簡単な説明】
【図１】薬剤及びペプチドがＶＢ12に共役する可能性のある３つの部位を持つＶＢ12分子を示す。これらの共役する部位は以下の通りである：ａ）コリン環のＣｏ原子上の置換を介した軸で共役する；ｂ）ｅプロピアンイミド側鎖の酸修飾により直接共役する；及びｃ）ヌクレオチド残基のリボース成分が５'ＯＨ基へ共役する。
Claims (15)
- ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適に用いられる下記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、ＶＢ１２の５’ＯＨ基をカルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート、カルボニルジピペリジン、１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートからなる群から選択される二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いて前記活性中間体をＲ １ −ＮＨ ２ で表されるアミノ置換又はヒドラジジル置換求核性スペーサ分子と反応させて前記式（Ｉ）で表される化合物又はその塩を得る工程と、を含む方法。
ＶＢ １２ −５’Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ １ （Ｉ）
（式中、
Ｒ １ は、Ｃ １−２４ アルキル、Ｃ ２−２４ アルケニル、Ｃ ２−２４ アルキニル、Ｃ ３−８ シクロアルキル、（Ｃ ３−８ シクロアルキル）アルキル、アミノ、−（Ｃ １−１２ アルキル）Ｃ（Ｏ）Ｒ ２ 、−（Ｃ ２−１２ アルケニル）Ｃ（Ｏ）Ｒ ２ 、−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ １−８ アルキル−Ｃ（Ｏ）ＮＨＮＨ ２ 、及び−ＣＨ（Ｒ ３ ）Ｃ（Ｏ）Ｒ ４ からなる群から選択され、
各Ｒ １ 基は、適宜、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよく、
Ｒ ２ は、アミノ、ヒドロキシ、Ｃ １−６ アルコキシ又はＣ ２−６ アルケニルオキシであり、
Ｒ ３ は、アミノ酸側鎖であり、
Ｒ ４ は、ヒドロキシ、Ｃ １−６ アルコキシ、アミノ酸又はペプチドである）。 - 前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾールである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、オクタデシルアミンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、ジアミノエタンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、ジアミノブタンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、ジアミノヘキサンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、ジアミノドデカンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、ジアミノオクタデカンである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、アミノ酸又はペプチドである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、コハク酸ジヒドラジドである、請求項１に記載の方法。
- 前記スペーサ分子が、アジピン酸ジヒドラジドである、請求項１に記載の方法。
- ポリマー、ナノ粒子若しくは治療剤、又はタンパク質若しくはペプチドへの結合に好適に用いられる下記式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩の製造方法であって、Ｒ １ −ＣＯＯＨで表されるカルボン酸スペーサ分子をカルボニルジイミダゾール、ホスゲン、トリホスゲン、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート、カルボニルジピペリジン、１，１’−カルボニルジ（１，２，４−トリアゾール）、ジ（２−ピリジル）ケトン又はジ（１−ベンゾトリアゾリル）カーボネートからなる群から選択される二官能カルボニル求電子剤と反応させて活性中間体を形成する工程と、続いてＶＢ１２の５’ＯＨ基を前記活性中間体と反応させて前記式（ＩＩ）で表される化合物又はその塩を得る工程と、を含む方法。
ＶＢ １２ −５’Ｏ−ＣＯ−Ｒ １ （ＩＩ）
（式中、
Ｒ １ は、Ｃ １−２４ アルキル、又はＣ ２−２４ アルケニル（各Ｒ １ 基は、適宜、アミノ、ヒドロキシ、アルキル、ハロ、ハロアルキル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、アセトキシ、スルファニル、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールアルキルから選択される一つ以上の基により置換されていてもよい）、又は
Ｒ １ は、−ＣＨ（Ｒ ２ ）−ＮＨＲ ３ であり、
Ｒ ２ は、アミノ酸側鎖であり、
Ｒ ３ は、水素、アミン保護基、アミノ酸又はペプチドである）。 - 前記二官能カルボニル求電子剤が、カルボニルジイミダゾールである、請求項１２に記載の方法。
- 前記カルボン酸スペーサ分子が、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｈｅである、請求項１２に記載の方法。
- 前記カルボン酸スペーサ分子が、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙである、請求項１２に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPP4050 | 1998-06-12 | ||
| AUPP4050A AUPP405098A0 (en) | 1998-06-12 | 1998-06-12 | Novel methods of preparation of vitamin b12 derivatives suitable for conjugation to pharmaceuticals |
| AU4050 | 1998-06-12 | ||
| PCT/AU1999/000462 WO1999065930A1 (en) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | Vitamin b12 derivatives and methods for their preparation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002518405A JP2002518405A (ja) | 2002-06-25 |
| JP4794735B2 true JP4794735B2 (ja) | 2011-10-19 |
Family
ID=3808296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000554755A Expired - Fee Related JP4794735B2 (ja) | 1998-06-12 | 1999-06-11 | ビタミンｂ１２誘導体及びそれらの製造方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6150341A (ja) |
| EP (1) | EP1086118A4 (ja) |
| JP (1) | JP4794735B2 (ja) |
| KR (1) | KR20010071450A (ja) |
| AU (1) | AUPP405098A0 (ja) |
| CA (1) | CA2334598A1 (ja) |
| IL (1) | IL139848A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ538085A (ja) |
| PL (1) | PL196047B1 (ja) |
| WO (1) | WO1999065930A1 (ja) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5739313A (en) * | 1995-11-13 | 1998-04-14 | Regents Of The University Of Minnesota | Radionuclide labeling of vitamin B12 and coenzymes thereof |
| US6806363B1 (en) | 1999-04-16 | 2004-10-19 | Mayo Foundation For Medical Education & Research | Cobalamin conjugates useful as antitumor agents |
| AUPQ071299A0 (en) * | 1999-06-02 | 1999-06-24 | Access Pharmaceuticals Australia Pty Limited | Vitamin directed dual targeting therapy |
| JP2003512338A (ja) * | 1999-10-15 | 2003-04-02 | メイオウ・フアウンデーシヨン・フオー・メデイカル・エジユケイシヨン・アンド・リサーチ | 造影剤および抗腫瘍薬として有用なコバラミン結合体 |
| CA2387767A1 (en) | 1999-10-15 | 2001-04-26 | Henricus P. C. Hogenkamp | Cobalamin conjugates useful as imaging and therapeutic agents |
| US7591995B2 (en) * | 1999-10-15 | 2009-09-22 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Cobalamin conjugates useful as imaging and therapeutic agents |
| WO2002000170A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | Ward Page Faulk | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplanted organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer |
| US20040028686A1 (en) * | 2001-06-28 | 2004-02-12 | Faulk Ward Page | Targeted delivery of cytotoxic drugs a) to activated lymphocytes in patients with transplated organs, b) as radiosensitizers to cancer cells in patients undergoing radiation therapy, and c) in vitamin-binding proteins as drug carriers in the diagnosis and treatment of cancer |
| WO2002055530A2 (en) * | 2000-10-25 | 2002-07-18 | Mayo Foundation | Transcobalamin binding conjugates useful for treating abnormal cellular proliferation |
| EP1754712A3 (en) * | 2000-10-25 | 2009-01-14 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Transcobalamin binding conjugates useful for treating abnormal cellular proliferation |
| GB2374010B (en) * | 2001-02-26 | 2004-12-29 | Council Scient Ind Res | Novel vitamin B12 - biodegradable micro particulate conjugate carrier systems for peroral delivery of drugs, therapeutic peptides/proteins and vaccines |
| EP1399215A4 (en) * | 2001-06-08 | 2004-12-22 | Utah Ventures Ii L P | TISSUE-SPECIFIC ENDOTHELM MEMBRANE PROTEINS |
| US20030144198A1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-07-31 | Collins Douglas A. | Coadministration of transport protein with conjugated cobalamin to deliver agents |
| US7232805B2 (en) * | 2003-09-10 | 2007-06-19 | Inflabloc Pharmaceuticals, Inc. | Cobalamin conjugates for anti-tumor therapy |
| WO2005061527A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-07 | Solidago Ag | Cobalamine derivatives useful for diagnosis and treatment of abnormal cellular proliferation |
| CN101222853B (zh) * | 2005-05-17 | 2012-07-18 | 卡吉尔公司 | 粒状卵磷脂、粒状溶血卵磷脂、它们的生产方法和包含它们的组合物 |
| AU2008223431B2 (en) * | 2007-03-05 | 2013-06-13 | Syracuse University | A conjugate of insulin and vitamin B12 for oral delivery |
| US20110092416A1 (en) * | 2007-03-05 | 2011-04-21 | Robert Patrick Doyle | Vitamine B12 - Peptide Conjugates for Oral Delivery |
| WO2011130716A2 (en) | 2010-04-16 | 2011-10-20 | Access Pharmaceuticals, Inc. | A nanostructures containing vitamin b12 for facilitated delivery of drugs across biological barriers |
| WO2012030745A1 (en) * | 2010-08-30 | 2012-03-08 | Access Pharmaecuticals, Inc | MULTIVITAMIN TARGETING OF RNAi THERAPEUTICS |
| EP2683410A2 (en) * | 2011-03-08 | 2014-01-15 | Access Pharmaceuticals, Inc. | Targeted nanocarrier systems for delivery of actives across biological membranes |
| WO2014005601A1 (en) * | 2012-07-02 | 2014-01-09 | Pharmathen S.A. | A process for the preparation of solifenacin or a salt thereof |
| CN103163306B (zh) * | 2013-02-05 | 2015-06-17 | 北京九强生物技术股份有限公司 | 25羟维生素d检测试剂盒及其制备方法 |
| WO2015126841A1 (en) | 2014-02-18 | 2015-08-27 | Plasmatech Biopharmaceuticals, Inc. | Nutritional and therapeutic mucoadhesive formulations |
| CN106749461B (zh) * | 2016-11-11 | 2020-10-27 | 暨南大学 | 可自主装形成纳米微粒的维生素b12衍生物及制备方法与应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54157600A (en) * | 1978-05-30 | 1979-12-12 | Squibb & Sons Inc | Vitamin b 12 derivative and its manufacture |
| JPS62103064A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-05-13 | アクテイエセルスカベツト・デ・ダンスケ・スツカ−フアブリカ− | ４，５，６または７−位を介して結合したインド−ルまたはその誘導体、およびその製造方法並びその使用方法 |
| JPH05180773A (ja) * | 1991-05-22 | 1993-07-23 | Syntex Usa Inc | ルミネセンスを利用する分析方法 |
| JPH06336494A (ja) * | 1993-05-27 | 1994-12-06 | Nippon Oil Co Ltd | 疎水性ビタミンｂ１２誘導体 |
| WO1997014740A1 (en) * | 1995-10-19 | 1997-04-24 | Receptagen Corporation | Discrete-length polyethylene glycols |
| JPH1077257A (ja) * | 1996-09-05 | 1998-03-24 | Shin Etsu Chem Co Ltd | Ｎ，ｎ−ジアルキルカルバミン酸２−ニトロベンジルエステル類およびその製造方法 |
| WO1998047870A1 (en) * | 1997-04-24 | 1998-10-29 | American Home Products Corporation | Process for the synthesis of 4-[6-(hexylcarbamoyloxy) hexylcarbamoyloxy]-piperidine-1- carboxylic acid 4-phenoxyphenyl ester |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5807832A (en) * | 1987-06-09 | 1998-09-15 | Biotech Australia Pty Limited | Oral delivery of biologically active substances bound to vitamin B12 |
| US6159502A (en) * | 1991-04-02 | 2000-12-12 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral delivery systems for microparticles |
| US5294536A (en) * | 1992-04-23 | 1994-03-15 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Conjugates |
| DE4239815A1 (de) * | 1992-11-26 | 1994-06-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verbesserte B¶1¶¶2¶-Konjugate |
| KR960702476A (ko) * | 1993-05-20 | 1996-04-27 | 로잘린드 앤 칼도르 | Lhrh 길항제(lhrh antagonists) |
| US5449720A (en) * | 1993-05-24 | 1995-09-12 | Biotech Australia Pty Limited | Amplification of the VB12 uptake system using polymers |
| US5548064A (en) * | 1993-05-24 | 1996-08-20 | Biotech Australia Pty Limited | Vitamin B12 conjugates with EPO, analogues thereof and pharmaceutical compositions |
| EP0754189B1 (en) * | 1994-04-08 | 2002-10-09 | Receptagen Corporation | Receptor modulating agents and methods relating thereto |
| US5574018A (en) * | 1994-07-29 | 1996-11-12 | Amgen Inc. | Conjugates of vitamin B12 and proteins |
| US5972917A (en) * | 1998-05-29 | 1999-10-26 | Bone Care Int Inc | 1 α-hydroxy-25-ene-vitamin D, analogs and uses thereof |
-
1998
- 1998-06-12 AU AUPP4050A patent/AUPP405098A0/en not_active Abandoned
-
1999
- 1999-06-11 EP EP99927582A patent/EP1086118A4/en not_active Withdrawn
- 1999-06-11 CA CA002334598A patent/CA2334598A1/en not_active Abandoned
- 1999-06-11 NZ NZ538085A patent/NZ538085A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-06-11 JP JP2000554755A patent/JP4794735B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-11 US US09/330,167 patent/US6150341A/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-11 PL PL99344686A patent/PL196047B1/pl unknown
- 1999-06-11 KR KR1020007014046A patent/KR20010071450A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 WO PCT/AU1999/000462 patent/WO1999065930A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-06-11 IL IL13984899A patent/IL139848A0/xx unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54157600A (en) * | 1978-05-30 | 1979-12-12 | Squibb & Sons Inc | Vitamin b 12 derivative and its manufacture |
| JPS62103064A (ja) * | 1985-08-23 | 1987-05-13 | アクテイエセルスカベツト・デ・ダンスケ・スツカ−フアブリカ− | ４，５，６または７−位を介して結合したインド−ルまたはその誘導体、およびその製造方法並びその使用方法 |
| JPH05180773A (ja) * | 1991-05-22 | 1993-07-23 | Syntex Usa Inc | ルミネセンスを利用する分析方法 |
| JPH06336494A (ja) * | 1993-05-27 | 1994-12-06 | Nippon Oil Co Ltd | 疎水性ビタミンｂ１２誘導体 |
| WO1997014740A1 (en) * | 1995-10-19 | 1997-04-24 | Receptagen Corporation | Discrete-length polyethylene glycols |
| JPH1077257A (ja) * | 1996-09-05 | 1998-03-24 | Shin Etsu Chem Co Ltd | Ｎ，ｎ−ジアルキルカルバミン酸２−ニトロベンジルエステル類およびその製造方法 |
| WO1998047870A1 (en) * | 1997-04-24 | 1998-10-29 | American Home Products Corporation | Process for the synthesis of 4-[6-(hexylcarbamoyloxy) hexylcarbamoyloxy]-piperidine-1- carboxylic acid 4-phenoxyphenyl ester |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2334598A1 (en) | 1999-12-23 |
| PL196047B1 (pl) | 2007-11-30 |
| NZ538085A (en) | 2006-10-27 |
| AUPP405098A0 (en) | 1998-07-02 |
| WO1999065930A1 (en) | 1999-12-23 |
| PL344686A1 (en) | 2001-11-19 |
| EP1086118A1 (en) | 2001-03-28 |
| JP2002518405A (ja) | 2002-06-25 |
| IL139848A0 (en) | 2002-02-10 |
| US6150341A (en) | 2000-11-21 |
| KR20010071450A (ko) | 2001-07-28 |
| EP1086118A4 (en) | 2002-05-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4794735B2 (ja) | ビタミンｂ１２誘導体及びそれらの製造方法 | |
| US7531162B2 (en) | Transcobalamin receptor binding conjugates useful for treating abnormal cellular proliferation | |
| EP0495265B1 (en) | Acid-labile linker molecules | |
| US9931407B2 (en) | Silicon based drug conjugates and methods of using same | |
| AU618995B2 (en) | Pharmaceutical formulations for parenteral use | |
| US20140179877A1 (en) | Macromolecule conjugate | |
| US20060029586A1 (en) | Use of isocyanate linkers to make hydrolyzable active agent biopolymer conjugates | |
| JP2005508332A (ja) | 薬剤を送達するための、輸送タンパク質とコンジュゲートコバラミンとの同時投与 | |
| IE890810L (en) | Pharmaceutical formulations for parenteral use | |
| JPS60193924A (ja) | トランスフエリン‐ビンカアルカロイド細胞毒性組成物 | |
| EP0063373A1 (en) | Cell-specific glycopeptide ligands | |
| JP2011148820A (ja) | 免疫グロブリンｆａｂフラグメントを選択的且つ定量的に官能基化する方法 | |
| HU210147B (en) | Process for producing antibody-drug conjugates and pharmaceutical compositions containing them | |
| US20230148277A1 (en) | Disulfide bond containing compounds and uses thereof | |
| EP0366770B1 (en) | Liposomes coupled to hormones | |
| WO1991015242A1 (en) | Conjugate compounds of polymers with other organic molecular entities | |
| US6696551B1 (en) | 225Ac-HEHA and related compounds, methods of synthesis and methods of use | |
| AU2003204343B2 (en) | Vitamin B12 derivatives and methods for their preparation | |
| AU4490099A (en) | Vitamin B12 derivatives and methods for their preparation | |
| WO2002042318A2 (en) | Transcobalamin receptor binding conjugates for neutron capture therapy | |
| US11952461B2 (en) | Siloxy polyethylene glycol and derivatives thereof | |
| EP3352797A1 (en) | Sn-117m labeled mannose coupled dextran amine | |
| EP1754712A2 (en) | Transcobalamin binding conjugates useful for treating abnormal cellular proliferation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060425 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060612 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20060719 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060728 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091125 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100224 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100303 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100325 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100401 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100412 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101005 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110131 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20110414 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110524 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110527 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20110712 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20110727 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140805 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |