JP2780116B2 - リポソーム分散液安定化剤 - Google Patents
リポソーム分散液安定化剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はリポソーム分散液安定化剤及びこれを用いた
安定な免疫分析試薬に関する。
安定な免疫分析試薬に関する。
リポソームは、主として脂質よりなる二分子膜を有
し、その内部に水層を有する閉鎖小胞体である。このリ
ポソームは広く生体膜モデルとしてその物理化学的諸性
質の研究が進められている一方、その内水層に標識物質
を保持することが可能であるため、免疫測定法への利用
も試みられている。本発明者らは、すでに表面に親水性
の抗体又は抗原を固定化し、内部に親水性の標識物質を
封入したリポソーム試薬を開発した（特開昭60-138465
号、特開昭62-10882号、特開昭62-10883号公報）。この
試薬を用いた免疫分析法は以下のようなものである。す
なわち、抗原又は、抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これに補体や二次抗体を加えると抗原
−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用によってリポソ
ームが破壊され、封入されていた標識物質が流出し、こ
の流出した標識物質の量は試料中の被検物質の量に比例
するので、流出した標識物質を所定の分析方法により分
析、定量することにより被検物質を定量することができ
るというものである。
し、その内部に水層を有する閉鎖小胞体である。このリ
ポソームは広く生体膜モデルとしてその物理化学的諸性
質の研究が進められている一方、その内水層に標識物質
を保持することが可能であるため、免疫測定法への利用
も試みられている。本発明者らは、すでに表面に親水性
の抗体又は抗原を固定化し、内部に親水性の標識物質を
封入したリポソーム試薬を開発した（特開昭60-138465
号、特開昭62-10882号、特開昭62-10883号公報）。この
試薬を用いた免疫分析法は以下のようなものである。す
なわち、抗原又は、抗体が存在する試料中に前記リポソ
ーム試薬を加え、これに補体や二次抗体を加えると抗原
−抗体反応及びそれに伴なう補体の作用によってリポソ
ームが破壊され、封入されていた標識物質が流出し、こ
の流出した標識物質の量は試料中の被検物質の量に比例
するので、流出した標識物質を所定の分析方法により分
析、定量することにより被検物質を定量することができ
るというものである。
しかしながら、リポソームの構造は熱力学的には安定
でない場合が多く、懸濁液として調製しても、保存中に
リポソーム同士凝集したり、リポソームに封入した標識
物質が漏出し、そのため、被検物質の定量分析に影響を
与えるという問題点があった。この問題を回避するた
め、水系溶媒中に分散した状態で保存せず、凍結乾燥し
保存する方法が試みられているが、いまだ実用段階に至
っていない。
でない場合が多く、懸濁液として調製しても、保存中に
リポソーム同士凝集したり、リポソームに封入した標識
物質が漏出し、そのため、被検物質の定量分析に影響を
与えるという問題点があった。この問題を回避するた
め、水系溶媒中に分散した状態で保存せず、凍結乾燥し
保存する方法が試みられているが、いまだ実用段階に至
っていない。
上記の如くリポソームを用いた免疫分析試薬はその不
安定さから商品化されておらず、その安定化が望まれて
いた。
安定さから商品化されておらず、その安定化が望まれて
いた。
本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究
を行なった結果、リポソームを用いた免疫分析試薬に特
定の化合物よりなる安定化剤を添加すれば、該試薬の保
存安定性が向上し、免疫分析が高い精度で行なえること
を見出し本発明を完成した。
を行なった結果、リポソームを用いた免疫分析試薬に特
定の化合物よりなる安定化剤を添加すれば、該試薬の保
存安定性が向上し、免疫分析が高い精度で行なえること
を見出し本発明を完成した。
すなわち本発明は、リン脂質及びコレステロールを主
要構成成分とし、表面に抗原又は抗体が結合し、かつ内
部に標識物質が封入されているリポソームを、ポリエチ
レングリコール、糖類、ゼラチン、塩化リチウム、塩化
セシウム及びポリオキシエチレン系界面活性剤から選ば
れる化合物を含有する液に分散したことを特徴とする長
期保存用の免疫分析試薬、並びに、更にリポソーム内部
にポリエチレングリコール、糖類、ゼラチン、塩化リチ
ウム、塩化セシウム及びポリオキシエチレン系界面活性
剤から選ばれる化合物を封入したことを特徴とする上記
の免疫分析試薬を提供するものである。
要構成成分とし、表面に抗原又は抗体が結合し、かつ内
部に標識物質が封入されているリポソームを、ポリエチ
レングリコール、糖類、ゼラチン、塩化リチウム、塩化
セシウム及びポリオキシエチレン系界面活性剤から選ば
れる化合物を含有する液に分散したことを特徴とする長
期保存用の免疫分析試薬、並びに、更にリポソーム内部
にポリエチレングリコール、糖類、ゼラチン、塩化リチ
ウム、塩化セシウム及びポリオキシエチレン系界面活性
剤から選ばれる化合物を封入したことを特徴とする上記
の免疫分析試薬を提供するものである。
本発明のリポソーム分散液安定化剤に用いる糖類とし
ては例えばブドウ糖、ガラクトース、マンノース、フル
クトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単
糖類；乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マ
ルトース等の二糖類；マンナン、プルラン、デキストラ
ン等の多糖類が挙げられる。ポリオキシエチレン系界面
活性剤としては、例えば次式（１）〜（３）で表わされ
るものが、リポソームを溶解せず、しかもリポソームの
保存安定化作用が優れているため特に好ましい。
ては例えばブドウ糖、ガラクトース、マンノース、フル
クトース、イノシトール、リボース、キシロース等の単
糖類；乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マ
ルトース等の二糖類；マンナン、プルラン、デキストラ
ン等の多糖類が挙げられる。ポリオキシエチレン系界面
活性剤としては、例えば次式（１）〜（３）で表わされ
るものが、リポソームを溶解せず、しかもリポソームの
保存安定化作用が優れているため特に好ましい。
（１）HO(C2H4O)p(C3H6O)q(C2H4O)rH 〔式中ｐ、ｑ及びｒはそれぞれ正の数を示し、ｐ＋ｒ≧
11であり、かつｑ≧15である〕 （２）[HO(C2H4O)x(C3H6O)y]2NCH2CH2N[(C3H6O)y(C2H
4O)z]2 〔式中、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ正の数を示し、ｙ≧５
であり、かつｘ＋ｚ≧30である〕 〔式中、Ｒは直鎖アルキル基を示し、ｎは30以上の数を
示す〕 本発明安定化剤のリポソーム分散液への配合量は、特
に限定されないが、リポソーム外液がリポソーム内液と
等張もしくはやや高張となるように配合するのが好まし
い。ポリオキシエチレン系界面活性剤の場合は、特に好
ましい配合量は0.001〜3.0％（w/v）（以下単に％で示
す）である。
11であり、かつｑ≧15である〕 （２）[HO(C2H4O)x(C3H6O)y]2NCH2CH2N[(C3H6O)y(C2H
4O)z]2 〔式中、ｘ、ｙ及びｚはそれぞれ正の数を示し、ｙ≧５
であり、かつｘ＋ｚ≧30である〕 〔式中、Ｒは直鎖アルキル基を示し、ｎは30以上の数を
示す〕 本発明安定化剤のリポソーム分散液への配合量は、特
に限定されないが、リポソーム外液がリポソーム内液と
等張もしくはやや高張となるように配合するのが好まし
い。ポリオキシエチレン系界面活性剤の場合は、特に好
ましい配合量は0.001〜3.0％（w/v）（以下単に％で示
す）である。
また本発明安定化剤のリポソーム分散液への配合方法
は、 （１）リポソーム分散液に本発明安定化剤を添加する
か、（２）リポソーム内部に本発明安定化剤を封入せし
め、さらに調製後のリポソーム分散液にも本発明安定化
剤を添加する方法のいずれかが好ましい。本発明安定化
剤のうち、ポリエチレングリコール、デキストラン、ゼ
ラチン、ポリオキシエチレン系界面活性剤、塩化リチウ
ム及び塩化セシウムはリポソーム分散液に添加するだけ
で充分な安定化効果を奏する。
は、 （１）リポソーム分散液に本発明安定化剤を添加する
か、（２）リポソーム内部に本発明安定化剤を封入せし
め、さらに調製後のリポソーム分散液にも本発明安定化
剤を添加する方法のいずれかが好ましい。本発明安定化
剤のうち、ポリエチレングリコール、デキストラン、ゼ
ラチン、ポリオキシエチレン系界面活性剤、塩化リチウ
ム及び塩化セシウムはリポソーム分散液に添加するだけ
で充分な安定化効果を奏する。
上記安定化剤を用いた免疫分析試薬は、自体公知の手
段例えば次の如くして製造することができる。
段例えば次の如くして製造することができる。
まず、先に特開昭60-138465号に開示された方法に従
い、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて、リポソーム
上に固定化される抗体または抗原と結合し得る官能基を
脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂質とコ
レステロール及び必要であれば他の脂質とをフラスコに
入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引
乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ
内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とう
し、リポソームの懸濁液を得る。ここで必要により標識
物質の水溶液に本発明安定化剤を添加すれば、リポソー
ム内に安定化剤を導入することができる。この添加量は
0.001〜３％が好ましい。
い、脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させて、リポソーム
上に固定化される抗体または抗原と結合し得る官能基を
脂質分子に導入する。次いで、得られた官能性脂質とコ
レステロール及び必要であれば他の脂質とをフラスコに
入れ、溶媒を加えて反応させた後、溶媒を留去し、吸引
乾燥する。しかる後、壁面に薄膜が形成されたフラスコ
内に所定の標識物質の水溶液を加え、密栓をして振とう
し、リポソームの懸濁液を得る。ここで必要により標識
物質の水溶液に本発明安定化剤を添加すれば、リポソー
ム内に安定化剤を導入することができる。この添加量は
0.001〜３％が好ましい。
一方、リポソーム表面に結合する抗体または抗原は、
緩衝液中で架橋剤と反応せしめて抗体又は抗原に架橋基
を導入し、必要により該架橋基を還元する試薬、例えば
ジチオスレイトール等を更に反応せしめて修飾抗体又は
修飾抗原とする。
緩衝液中で架橋剤と反応せしめて抗体又は抗原に架橋基
を導入し、必要により該架橋基を還元する試薬、例えば
ジチオスレイトール等を更に反応せしめて修飾抗体又は
修飾抗原とする。
次に、上記リポソーム懸濁液と修飾抗体又は修飾抗原
とを緩衝液中で例えば10〜25℃、15〜20時間反応させて
リポソーム表面に抗体又は抗原を固定化せしめる。反応
終了後、遠心洗浄を行なえば免疫分析試薬が得られる。
得られたリポソーム免疫分析試薬を、本発明安定化剤を
添加した緩衝液中に分散せしめれば、本発明の安定化剤
配合免疫分析試薬が得られる。なお、遠心洗浄の際、使
用する緩衝液中に本発明安定化剤を添加しておけば、更
に好ましい。また本発明免疫分析試薬のpHは６〜８程度
に調節することがリポソームの安定性の面から好まし
い。
とを緩衝液中で例えば10〜25℃、15〜20時間反応させて
リポソーム表面に抗体又は抗原を固定化せしめる。反応
終了後、遠心洗浄を行なえば免疫分析試薬が得られる。
得られたリポソーム免疫分析試薬を、本発明安定化剤を
添加した緩衝液中に分散せしめれば、本発明の安定化剤
配合免疫分析試薬が得られる。なお、遠心洗浄の際、使
用する緩衝液中に本発明安定化剤を添加しておけば、更
に好ましい。また本発明免疫分析試薬のpHは６〜８程度
に調節することがリポソームの安定性の面から好まし
い。
このようにして得られた本発明リポソーム免疫分析試
薬は必要により適当な濃度に希釈し測定に供することが
できる。
薬は必要により適当な濃度に希釈し測定に供することが
できる。
本発明の安定化剤をリポソーム免疫分析試薬に添加す
ることにより、該試薬の保存安定性を著しく向上させる
ことができる。
ることにより、該試薬の保存安定性を著しく向上させる
ことができる。
次に本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
が、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例1.ヒトCRP測定用リポソーム試薬の調製 リポソームの調製 ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC;10mM,10
0μｌ），コレステロール（Chol;10mM,100μｌ），ジチ
オピリジル化ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミン（DTP-DPPE;1mM20μｌ）＝1:1:0.02（モル比）
（DTP-DPPEとはDPPEのアミノ基にアミド結合を介してジ
チオピリジル基を導入したもの）をクロロホルムに溶解
し、10mlナシ型フラスコに仕込み、クロロホルムをエバ
ポレーターで留去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成さ
せた。この脂質薄膜を１〜２時間、真空乾燥した後、標
識物質として0.1Mカルボキシフルオレセイン溶液（pH7.
4）100μｌを添加し、ボルテックスミキサーで５〜10分
間激しく攪拌した。
0μｌ），コレステロール（Chol;10mM,100μｌ），ジチ
オピリジル化ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミン（DTP-DPPE;1mM20μｌ）＝1:1:0.02（モル比）
（DTP-DPPEとはDPPEのアミノ基にアミド結合を介してジ
チオピリジル基を導入したもの）をクロロホルムに溶解
し、10mlナシ型フラスコに仕込み、クロロホルムをエバ
ポレーターで留去し、フラスコ内壁に脂質薄膜を形成さ
せた。この脂質薄膜を１〜２時間、真空乾燥した後、標
識物質として0.1Mカルボキシフルオレセイン溶液（pH7.
4）100μｌを添加し、ボルテックスミキサーで５〜10分
間激しく攪拌した。
次いで、過剰のカルボキシフルオレセインを遠心除去
し、カルボキシフルオレセイン封入リポソームを得た。
この際、遠心洗浄には、0.01MのHEPES緩衝液（0.15M Na
Cl含有;pH7.4）を用いた。得られたリポソームは500μ
ｌのHEPES緩衝液に懸濁せしめた。
し、カルボキシフルオレセイン封入リポソームを得た。
この際、遠心洗浄には、0.01MのHEPES緩衝液（0.15M Na
Cl含有;pH7.4）を用いた。得られたリポソームは500μ
ｌのHEPES緩衝液に懸濁せしめた。
リポソームの抗体感作 ヤギ抗CRP抗体（IgG分画）を予め0.01M HEPES緩衝液
で透析処理して得られる2.0mg/mlの抗体溶液に0.1mMと
なるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のエタノー
ル溶液を添加し、室温で30分間反応させる。次いでセフ
ァデックスG-25カラムを用いて過剰のSPDPと抗体を分離
させるが、この際に緩衝液を0.1M酢酸緩衝液（0.15M Na
Cl含有;pH4.5）に交換すると共に分光光度計により、波
長280nmで抗体の溶出を確認した。
で透析処理して得られる2.0mg/mlの抗体溶液に0.1mMと
なるようにＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−３−（２
−ピリジルジチオ）プロピオネート（SPDP）のエタノー
ル溶液を添加し、室温で30分間反応させる。次いでセフ
ァデックスG-25カラムを用いて過剰のSPDPと抗体を分離
させるが、この際に緩衝液を0.1M酢酸緩衝液（0.15M Na
Cl含有;pH4.5）に交換すると共に分光光度計により、波
長280nmで抗体の溶出を確認した。
こうして、ジチオピリジル基を導入した抗体溶液に50
mMになるようにジチオスレイトール（DTT）を固形のま
ま添加し、室温で30分間反応させる。その後、反応溶液
をセファデックスG-25カラムを用いてゲル濾過し、過剰
のDTTと抗体とを分離させるが、この際、緩衝液を0.01M
のHEPES緩衝液に交換すると共に分光光度計により波長2
80nmで抗体の溶出を確認した。
mMになるようにジチオスレイトール（DTT）を固形のま
ま添加し、室温で30分間反応させる。その後、反応溶液
をセファデックスG-25カラムを用いてゲル濾過し、過剰
のDTTと抗体とを分離させるが、この際、緩衝液を0.01M
のHEPES緩衝液に交換すると共に分光光度計により波長2
80nmで抗体の溶出を確認した。
次いで、得られたチオール化抗体溶液（1mg/ml）500
μｌをで調製したリポソーム懸濁液500μｌに添加し
て緩徐に15〜20時間攪拌し、抗体感作リポソームを調製
した。
μｌをで調製したリポソーム懸濁液500μｌに添加し
て緩徐に15〜20時間攪拌し、抗体感作リポソームを調製
した。
リポソーム試薬への安定化剤の添加 a.グルコースの添加 において、リポソームに封入する標識物質たる0.1M
カルボキシフルオセイン溶液に代え、これに更にグリコ
ースを0.05Mとなる様に加えた溶液を用いその他は
と同様にして抗体感作リポソームを調製した。
カルボキシフルオセイン溶液に代え、これに更にグリコ
ースを0.05Mとなる様に加えた溶液を用いその他は
と同様にして抗体感作リポソームを調製した。
このリポソームを、グリコース0.2Mを含む0.005Mベロ
ナール緩衝液で遠心洗浄し未反応の抗体を除去した。次
いで、1mlの同緩衝液にリポソームを懸濁せしめ、さら
に防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加し本発明
免疫分析試薬（本発明品ａ）を得た。
ナール緩衝液で遠心洗浄し未反応の抗体を除去した。次
いで、1mlの同緩衝液にリポソームを懸濁せしめ、さら
に防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加し本発明
免疫分析試薬（本発明品ａ）を得た。
b.ゼラチンの添加 で得られた抗体感作リポソームをゼラチン0.1％、
及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール緩衝液（pH7.
5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去した。次いで同
緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤と
して0.05％となるようにNaN3を添加し本発明免疫分析試
薬（本発明品ｂ）を得た。
及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール緩衝液（pH7.
5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去した。次いで同
緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤と
して0.05％となるようにNaN3を添加し本発明免疫分析試
薬（本発明品ｂ）を得た。
c.塩化リチウムの添加 で得られた抗体感作リポソームを塩化リチウム0.18
Mを含む0.005Mベロナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄
し、未反応の抗体を除去した。次いで同緩衝液1mlにリ
ポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤として0.05％とな
るようにNaN3を添加し、本発明免疫分析試薬（本発明品
ｃ）を得た。
Mを含む0.005Mベロナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄
し、未反応の抗体を除去した。次いで同緩衝液1mlにリ
ポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤として0.05％とな
るようにNaN3を添加し、本発明免疫分析試薬（本発明品
ｃ）を得た。
d.デキストランT-10（ファルマシア社製） で得られた抗体感作リポソームをデキストランT-10
0.5％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール緩衝液（p
H7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去した。次いで
同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤
として0.05％となるようにNaN3を添加し本発明免疫分析
試薬（本発明品ｄ）を得た。
0.5％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール緩衝液（p
H7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去した。次いで
同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さらに防腐剤
として0.05％となるようにNaN3を添加し本発明免疫分析
試薬（本発明品ｄ）を得た。
e.ポリエチレングリコール600の添加 で得られた抗体感作リポソームをポリエチレングリ
コール6000.5％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール
緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去し
た。次いで同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さ
らに防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加し本発
明免疫分析試薬（本発明品ｅ）を得た。
コール6000.5％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロナール
緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を除去し
た。次いで同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せしめ、さ
らに防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加し本発
明免疫分析試薬（本発明品ｅ）を得た。
f.ポリオキシエチレン系界面活性剤の添加 で得られた抗体感作リポソームをテトロニックTR-7
04（旭電化製）0.2％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロ
ナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を
除去した。次いで同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せし
め、さらに防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加
し本発明免疫分析試薬（本発明品ｆ）を得た。
04（旭電化製）0.2％及び0.15M NaClを含む0.005Mベロ
ナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し、未反応の抗体を
除去した。次いで同緩衝液1mlにリポソームを懸濁せし
め、さらに防腐剤として0.05％となるようにNaN3を添加
し本発明免疫分析試薬（本発明品ｆ）を得た。
g.安定化剤無添加 で得られた抗体感作リポソームを0.15M NaClを含む
0.005Mベロナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し未反応
の抗体を除去した。次いで同緩衝液1mlにリポソームを
懸濁せしめ、さらに防腐剤として0.05％となるようにNa
N3を添加し、免疫分析試薬（対照品ｇ）を得た。
0.005Mベロナール緩衝液（pH7.5）で遠心洗浄し未反応
の抗体を除去した。次いで同緩衝液1mlにリポソームを
懸濁せしめ、さらに防腐剤として0.05％となるようにNa
N3を添加し、免疫分析試薬（対照品ｇ）を得た。
試験例１ 安定性試験 実施例1.のａ〜ｇで得られた免疫分析試薬のそれぞ
れ1mlを2mlのスクリューキャップ付ガラスビンに分注
し、10℃の恒温室内に一年後まで保存し、標識物質とし
て封入したカルボキシフルオレセインのリポソームから
の漏れを下記測定方法により測定した。結果を第１表に
示す。
れ1mlを2mlのスクリューキャップ付ガラスビンに分注
し、10℃の恒温室内に一年後まで保存し、標識物質とし
て封入したカルボキシフルオレセインのリポソームから
の漏れを下記測定方法により測定した。結果を第１表に
示す。
測定方法： 調製直後、６ケ月及び１年保存後の各免疫分析試薬を
とり、それぞれの外液に用いた分散液と同一組成の緩衝
液で500倍に希釈した。このものを、螢光強度計（コロ
ナ社製）を用いて下記式により相対螢光強度を求めた
（励起490nm,螢光530nm）。
とり、それぞれの外液に用いた分散液と同一組成の緩衝
液で500倍に希釈した。このものを、螢光強度計（コロ
ナ社製）を用いて下記式により相対螢光強度を求めた
（励起490nm,螢光530nm）。
相対螢光強度＝[(F1-F0)/(F2-F0)]×100（％） F1：各免疫分析試薬の螢光強度 F2：脱イオン水を添加してリポソームを破壊したものの
螢光強度 F0：各免疫分析試薬の外液に用いた分散液と同一組成の
緩衝液の螢光強度 以上の結果より、安定化剤を添加した本発明免疫分析
試薬は対照品ｇと比べ、標識物質たるカルボキシフルオ
レセインの漏出が少なく、安定であることが判る。
螢光強度 F0：各免疫分析試薬の外液に用いた分散液と同一組成の
緩衝液の螢光強度 以上の結果より、安定化剤を添加した本発明免疫分析
試薬は対照品ｇと比べ、標識物質たるカルボキシフルオ
レセインの漏出が少なく、安定であることが判る。
試験例２ CRP検量線の作成 ゼラチン−ベロナール緩衝液（0.1％ゼラチン含有ベ
ロナール緩衝液,pH7.4）に0.5mM塩化マグネシウム及び
0.15mM塩化カルシウムを添加した緩衝液（以下「GU
B2+」という）で希釈したヒトCRP抗原溶液（10〜300ng/
ml）25μｌと実施例１で調製した各試薬（ａ〜ｇの調製
直後及び１年保存後のもの）を500倍に希釈したもの25
μｌとを96穴マイクロプレートに分注し、37℃において
30分間反応させた。これに、二次抗体としてウサギ抗CR
P抗体（2mg/ml）を50倍に希釈したもの及びGUB2+で希釈
し、３〜５CH50/mlとしたモルモット補体をそれぞれ25
μｌずつ添加し、更に30分間反応せしめた。次いで補体
反応を停止させるため10mM EDTA含有ベロナール緩衝液1
00μｌを添加した。この螢光強度を測定（励起490nm,螢
光530nm）し、次式により相対螢光強度を求めた。得ら
れた検量線を第１図〜第７図に示す。
ロナール緩衝液,pH7.4）に0.5mM塩化マグネシウム及び
0.15mM塩化カルシウムを添加した緩衝液（以下「GU
B2+」という）で希釈したヒトCRP抗原溶液（10〜300ng/
ml）25μｌと実施例１で調製した各試薬（ａ〜ｇの調製
直後及び１年保存後のもの）を500倍に希釈したもの25
μｌとを96穴マイクロプレートに分注し、37℃において
30分間反応させた。これに、二次抗体としてウサギ抗CR
P抗体（2mg/ml）を50倍に希釈したもの及びGUB2+で希釈
し、３〜５CH50/mlとしたモルモット補体をそれぞれ25
μｌずつ添加し、更に30分間反応せしめた。次いで補体
反応を停止させるため10mM EDTA含有ベロナール緩衝液1
00μｌを添加した。この螢光強度を測定（励起490nm,螢
光530nm）し、次式により相対螢光強度を求めた。得ら
れた検量線を第１図〜第７図に示す。
相対螢光強度＝[(Ft-F)/(FT-F)]×100（％） Ft＝検体使用の螢光強度 FT：検体に変え10％トリトンX-100を添加したものの螢
光強度 F :検体に代えGUB2+を添加したものの螢光強度 第１図〜第６図に示す本発明免疫分析試薬（ａ〜ｆ）
の検量線は、調製後１年を経たものであっても変化は少
なく、一方、対照品（ｇ）の検量線（第７図）は明らか
に感度の低下が認められた。
光強度 F :検体に代えGUB2+を添加したものの螢光強度 第１図〜第６図に示す本発明免疫分析試薬（ａ〜ｆ）
の検量線は、調製後１年を経たものであっても変化は少
なく、一方、対照品（ｇ）の検量線（第７図）は明らか
に感度の低下が認められた。
以上の結果より本発明免疫分析試薬は経時的に極めて
安定な試薬であることが判る。
安定な試薬であることが判る。
第１図〜第７図はそれぞれ本発明免疫分析試薬（ａ〜
ｆ）及び対照品（ｇ）の調製直後及び１年保存後の検量
線を示す図面である。 −・−：調製直後の検量線 −Ｘ−:1年保存後の検量線
ｆ）及び対照品（ｇ）の調製直後及び１年保存後の検量
線を示す図面である。 −・−：調製直後の検量線 −Ｘ−:1年保存後の検量線
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/544 G01N 33/531
Claims (2)
- 【請求項１】リン脂質及びコレステロールを主要構成成
分とし、表面に抗原又は抗体が結合し、かつ内部に標識
物質が封入されているリポソームを、ポリエチレングリ
コール、糖類、ゼラチン、塩化リチウム、塩化セシウム
及びポリオキシエチレン系界面活性剤から選ばれる化合
物を含有する液に分散したことを特徴とする長期保存用
の免疫分析試薬。 - 【請求項２】更にリポソーム内部にポリエチレングリコ
ール、糖類、ゼラチン、塩化リチウム、塩化セシウム及
びポリオキシエチレン系界面活性剤から選ばれる化合物
を封入したことを特徴とする請求項１記載の免疫分析試
薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1196629A JP2780116B2 (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | リポソーム分散液安定化剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1196629A JP2780116B2 (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | リポソーム分散液安定化剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0361859A JPH0361859A (ja) | 1991-03-18 |
| JP2780116B2 true JP2780116B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=16360943
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1196629A Expired - Lifetime JP2780116B2 (ja) | 1989-07-31 | 1989-07-31 | リポソーム分散液安定化剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2780116B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| FR2668063A1 (fr) * | 1990-10-17 | 1992-04-24 | Fabre Pierre Cosmetique | Liposomes d'eaux thermales stabilises dans un gel d'adn. |
| JP3044591B2 (ja) * | 1993-07-23 | 2000-05-22 | 日信工業株式会社 | ブーツの自動組付け装置と該装置を用いたブーツの自動組付け方法 |
| JP3807926B2 (ja) * | 2000-11-02 | 2006-08-09 | 株式会社ヤクルト本社 | アスコルビン酸類を含む皮膚外用剤 |
| KR100776557B1 (ko) * | 2001-07-13 | 2007-11-16 | 나노캬리아 가부시키가이샤 | 약물 내포 고분자 미셀의 동결 건조용 조성물 또는 미셀의제조방법 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4707441A (en) * | 1984-08-06 | 1987-11-17 | Technicon Instruments Corp. | Binding assays in automated apparatus with liposome compatible surfactants |
| JPH0650315B2 (ja) * | 1985-11-08 | 1994-06-29 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬および免疫分析方法 |
| JPH07113639B2 (ja) * | 1987-01-20 | 1995-12-06 | 日水製薬株式会社 | 免疫分析用試薬 |
-
1989
- 1989-07-31 JP JP1196629A patent/JP2780116B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0361859A (ja) | 1991-03-18 |
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