JP2007523342A - 肺及び肺以外の結核を検出するための診断キット - Google Patents

Abstract

疎水性材料でコーティングされた試験カード「ＴＢ Ｓｃｒｅｅｎ」、抗原懸濁、陽性及び陰性対照を含む肺及び肺以外の結核を検出するための診断キット。

Description

本発明は、肺及び肺以外の結核を検出するための診断キットに関する。

結核を検出する従来の方法は時間と労力を要するＡＦＢ染色法であり、感度が低いと考えられている（１００Ｘ顕微鏡を使用して塗沫標本の陽性結果を得るには、結核菌１０，０００個／ｍｌ痰を必要とする。Ｔｏｄａｒ’ｓ Ｔｅｘｔ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｏｎｌｉｎｅ参照）。ＥＬＩＳＡ−ＫＰ９０もまた感度及び特異性の低いことが知られており（カットオフ値＞１．０＋ｖｅ、及び＜０．８−ｖｅ試験結果）、ＢＣＧワクチン接種をした患者において感度及び特異性を欠く過敏性に基づくツベルクリン皮膚試験（Ｍｏｎｔａｕｘ試験）と同様に複雑な設備が必要である（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆ ＆ Ｉｍｍ １９９８；６６）。同様に、ＭＹＣＯＤＯＴはＨＩＶ関連患者には不都合であり（Ｇ．Ｒ．Ｓｏｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｔｕｂｅｒｃｌｅ ａｎｄ Ｌｕｎｇ Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９９９，ｖｏｌ ３参照）、Ｂａｃｔｅｃ−４６０及びＲｏｃｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ（ＰＣＲに基づく製品）は、感度は高いが、非常に高価な装置及び専門的技術を必要とする。

本発明の目的：
本発明の目的の一つは、結核を検出するための診断キットを提案することである。

本発明のその他の目的は、経済的で取り扱いが容易な診断キットを提案することである。

本発明のさらに他の目的は、リポソーム凝集に基づく診断キットを提案することである。

本発明の他の目的は、特異的抗原抗体反応に基づいているので、感度が高くそして特異的な診断キットを提案することである。

本発明のさらに他の目的は、結核の速やかな検出に役立つ診断キットを提案することである。

本発明の要約
本発明により、疎水性材料でコーティングされた試験カード「ＴＢ Ｓｃｒｅｅｎ」と、抗原懸濁と、陽性及び陰性対照とを含む、肺及び肺以外の結核を検出するための診断キットが提供される。

本発明により、陽性対照、陰性対照及び試験検体をそれぞれ円運動しながら疎水性材料によりコーティングされた試験カード上に適用し、該抗原懸濁を陽性、陰性及び試験検体のそれぞれに加えて結果を判定することを含み、ダークブルーの凝集として特異的抗原と抗体の凝集塊が陽性対照及び活動性結核感染を含む試験検体に観察される、キットを使用する結核を検出する方法が提供される。

発明の詳細な説明
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ_３７Ｒｖ（ＡＴＣＣ−２７２９４）株を対数期後期まで（２〜３ヶ月）Ｓａｕｔｏｎ培地上で増殖し、細胞を４〜１０℃で遠心分離して（５，０００〜１０，０００ｇ １０〜２０分間）回収し、ペレットをＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．５）で洗い、ＴＥＮ緩衝液ｐＨ８．０〜８．５（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＣｌ）に再懸濁し、７０〜８０℃（水浴）で３０〜４５分間加熱不活化し、次いで超音波処理した。グリコリピド抗原を文献に記載された方法に従い、若干の修正を加えた方法で抽出した（Ｒｅｇｇｉａｒｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９７４；Ｂｉｓｅｎ Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２００３）。脂肪分解Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの粉末（１０〜１５ｇ）をガラス試薬壜に入れ、これに１００〜１５０ｍｌのクロロホルム及びメタノールの混合物（２：１）を加えた。これを室温で５０〜６０分間攪拌し、Ｗｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１で濾過した。１／５容量の０．７％ ＫＣｌ（２０．０ｍｌ）を濾液に加え、５〜６回振とうした。この懸濁液を分液ロートに移し、２層がはっきりと分離するまで終夜２〜８℃に維持した。下の有機層を１／５容量の洗浄溶媒（Ｃ：Ｍ：Ｗ：３：４８：４７）で同様に終夜２〜８℃に維持することにより洗浄した。上の水層を除去し、下の有機層を濾過した後保存した。有機層は、ロータリー溶媒エバポレーター中で４０〜５０℃において溶媒を蒸発させて乾燥した。水分は、窒素ガスを乾燥混合物に吹き付けて除去した。中性脂肪は、３００〜５００ｍｌの冷却アセトンを加え、１０〜２０分間渦巻き攪拌し、Ｗｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１を通して濾過することにより、乾燥混合物から除去した。このステップは、フラスコ内の脂質が白っぽく又は無色になるまで繰り返した。これをＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．１を通して濾過し、濾液を廃棄した。濾紙上に存在する脂質をＣ：Ｍ（２：１）で溶解し、Ｒ．Ｂフラスコに移した。溶媒は、減圧下に４０〜５０℃においてロータリーエバポレーターで除去した。粗精製調製品は１０〜１５ｍｌのＣ：Ｍ（２：１）に溶解し、使用まで−２０℃で保存した。

抗原の精製：
１００〜１１０℃において１〜１．３０時間（加熱オーブン）活性化したシリカゲルＨを、手操作でガラスカラム（２．５Ｘ３０ｃｍ）に充填し、そして既知量の粗製物質（１ｇ／５ｍｌ、保存液）をカラムのいずれか一方の側に装填した。カラムをクロマトグラフジャー（４．５Ｘ２５ｃｍ）の上で、６５：２５：４（Ｃ：Ｍ：Ｗ）^７，８の比の精製用溶媒１５０〜２００ｍｌ（移動相）により上方向に室温において展開し、他端に達するまで展開した。カラムをクロマトグラフジャーから取り外し、ヒュームフードに置き、カラムから溶媒を蒸発させた。クリーンな棒を使用して１ｃｍの長さの各フラクションを注意深く掻き出して、個々の分子の移動度と遅延係数（ＲＦ）値（４６．６、５３．４、５８．３、６７．２及び７２．４％）にしたがってシリカゲルに吸着したそれぞれの分子を得た。それぞれのフラクションをそれぞれのフラクション番号を表示したクリーンな乾燥ガラス試験管の中に集めた。１０ｍｌの抽出溶媒（クロロホルム：メタノール２：１の混合物）を各試験管に加え、３０〜４０分間室温に保った。溶出した物質の純度をＴＬＣにより分析し、選択したフラクションをさらにＷｈａｔｍａｎ濾紙Ｎｏ．１を通して濾過して検体からシリカゲルを除去した。純粋なフラクションを集め、通常の方法でこれらの特徴を分析した（ＴＬＣ上の免疫染色、ＥＬＩＳＡ及びリポソームにより）。

リポソーム抗原の構築方法：
リポソームは、わずかの改良を加えて、以前に記述したように（Ｂａｎｇｈａｍ Ａ．Ｄ ｅｔ ａｌ．１９６５）調製したが、簡単に記述すると、ホスファチジルコリン１００〜１５０ｍｇ；コレステロール４５０〜５００ｍｇ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）；抗原の懸濁液（カクテル）１０〜２０ｍｇ；及び色素５０〜１００μｌ（１．０％スーダンブラックＢのクロロホルム液）を予め乾燥した丸底フラスコに入れた。溶媒をロータリー真空エバポレーターにより減圧下で蒸発させた。乾燥した内容物を４０〜５０ｍｌの無水アルコール（９９．９％ Ｈｙｍａｎ，ドイツ）に溶解し、４〜１０℃で１〜１．３０時間保持した。スクロース溶液（４〜８ｍｌ；１５０ｍＭ）をポリプロピレン遠心試験管（容量３５ｍｌ）に入れ、渦巻き攪拌しながらそれに予め調製した抗原のアルコール懸濁液４〜５ｍｌを徐々に加えた。試験管を終夜４〜１０℃に保ってリポソームを膨張させ、１０〜１５ｍｌのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて渦巻き攪拌し、１０，０００ｇにおいて１０〜２０分間遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ，ＵＳＡ）。上清を捨て、ペレットを２０〜３０ｍｌのＢ２緩衝液、ｐＨ７．２（ＮａＨ_２ＰＯ_４．２Ｈ_２Ｏ，１０ｍＭ；ＫＨ_２ＰＯ_４，１０ｍＭ；ＥＤＴＡ，１０ｍＭ；塩化コリン１０％及びチオメルゾール０．１％）で再懸濁した。これを次の使用まで４〜１０℃で保存し、キットの抗原試薬として使用した。

ホスファチジルコリンの調製：
ホスファチジルコリン（ＰＣ）は検査のコストを下げるために施設内で調製した。当業者は卵黄からのＰＣの精製法及びその最終評価法を知っている（Ｓｕｎａｍｏｔｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ １９７８）。簡単に記述すると、２５個の卵からアルブミン部分を除いた。集めた卵黄を７５０ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）で３０分間攪拌して抽出した。Ｗｈａｔｍａｎｎ Ｎｏ．１を通して濾過した。５分の１容量の０．７％ＫＣ１で濾液を脱タンパクした。こうして得られた有機層を３：４８：４７のクロロホルム：メタノール：水で洗浄した。ベンゼンを使用して水分を除いた。溶媒をロータリー真空エバポレーターにより蒸発させて、脂質の乾燥フィルムを得た。中性脂質は記述したようにアセトンで除去した。空の丸底フラスコの重量を測定した（Ｗａ）。乾燥した脂質フィルムと共にフラスコの重量を測定した。３７．５ｇの粗製脂質が単離された。この粗製製品はさらにシリカゲルＨクロマトグラフィーにより精製され、精製ＰＣは薄層クロマトグラフィーにより分析され、ＰＣの評価は先行技術（Ｓｕｎａｍｏｔｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ １９７８）で知られているように行った。

試験の陽性対照の調製：
Ｓａｕｔｏｎの培地中でのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ増殖物を遠心分離した後に、１ｍｇのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのペレットを採取した。このペレットを２回１Ｘ ＰＢＳで洗い、残る培地を除いた。次いでペレットを４ｍｌの１Ｘリン酸緩衝食塩液に懸濁した。酸で洗った５ｍｍ直径のビーズの４〜８個を上記懸濁液に加えた。この検体を１０分間渦巻き攪拌機上で激しく振とうした。得られた懸濁液を等容量のＦｒｅｕｎｄの不完全アジュバントと混合した。この混合物を、必要レベルに達するまで繰り返し２２ｇ注射針を通して搾り出した。１００μｌの懸濁を２〜８ヶ月齢の若いウサギに接種した。多数のウサギに同様に接種した。

１ヵ月後にウサギから採血し、血清を得た。血清の反応性は、次のパラグラフに示す試験方法に記述されているように、抗原懸濁でチェックした。反応性力価をチェックした。抗原のブースター投与（５０μｌ）を再度繰り返した。ブースター投与の約７日後に約１：６４から１：１２８の増強された力価が得られた。最良の反応性力価が得られた。この血清は最適の反応性力価に１Ｘ ＰＢＳで希釈され、含まれるいずれかの汚染物質に対する保存剤として０．１％アジドを加えた。使用／バイアルへの分注まで凍結保存した。

４〜６ヶ月齢のウサギを上記抗原で免疫し、周期的に採血して、キットに供給される陽性対照に使用し、一方正常若齢ウサギを陰性対照に使用した。

試験方法：
陽性対照、陰性対照、抗原懸濁及び試験する検体などの成分は全て実験を行う前に室温に平衡させた。陽性対照、陰性対照及び試験検体（それぞれ２５μｌ）を、試験カード上に示されているように円運動させながら加えた。これらの試料を別々の棒で充分に結合するように広げ、それに２５μｌのリポソーム抗原を加え、そしてカードを４分間ゆっくりと渦巻状に動かした。

新しく採取したかあるいは凍結した試験血清検体（２５μｌ）を、疎水性材料でコートしたプラスチックスライドの円形の区域の内側に均一に広げた。結果を解釈するために、便宜上、区域１及び２にはそれぞれ、陽性対照（抗ウサギ血清）及び陰性対照（正常ウサギ血清）を広げた。区域１及び２を含む各円形区域に抗原懸濁（２５μｌ）を加え、カードを手で４分間渦巻状に動かした。ダークブルーの凝集として、特異的抗原及び抗体の凝集塊が、陽性対照並びに活動性結核感染によるＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍグリコリピッドに対する抗体を含む検体において観察された。他方、カード上に凝集塊が無い場合は、陰性の結果を示した。円形区域の縁の乾燥により不明瞭な結果を示した場合には、この標本中に検出できないレベルの抗原濃度をこれらの検体が含んでいるので、１５〜３０日以内に、さらに確認する必要がある。

血清：
最大の母集団多様性をカバーするために、インドの種々の病院の外来患者部門（ＯＰＤ）の患者血清をこの試験に登録した。患者は、臨床症状及びＸ線検査並びに塗沫標本染色及び検体の喀痰培養に基づいて診断された。患者は一人も完全な治療は行われていなかった。肺以外の結核並びに肺結核の両者の血清をこの試験に含めた。合計３２４検体の結核血清を試験した。

この試験の特異性の基準を評価するために、ＴＢの臨床症状の無い健康人の血清を陰性対照として含めた。これらの殆どはＢＣＧワクチンを受けた被検者から得た。この非ＴＢ血清は、一般的に健康人か又は結核以外の種々の病気に罹患した患者から得たものである。血清は凍結保存され、採取されてから１年以内に使用された。結核陰性血清５１１検体もこの試験に含まれた。血清選択に使用された基準の詳細は次の通りである。
・塗沫標本陰性、培養陽性肺結核症例 ５２
・塗沫標本陽性、培養陽性、肺結核症例 １８０
・肺以外の培養陽性症例 ３５
・再発肺結核症例 ５７
・薬物治療、臨床症状の無い症例 ６０
・健康な家族接触者 ５０
・ＢＣＧワクチンを受けた子供 １５
・Ｂ型肝炎陽性検体 １５
・ＴＢ以外の一般的感染症の血清 ２７
・正常人血清 ３４４

施設内評価：
一連の３２４検体の結核血清を使用して総合的感度９８．６８％が得られ、そのうち血清２０検体は不明瞭な結果であった。ＷＨＯにより採用されている方法に従って、不明瞭な血清は感度及び特異性の計算に含めなかった。非結核血清５１１検体を使用して９８．７８％の総合的特異性が得られた。

最近ＢＣＧで免疫された子供１５例の血清について、この試験とワクチン接種の交差反応性を試験した。陽性結果を示す血清はなかったので、インド人及びその他の国の人のＢＣＧワクチンを受けた母集団にこの試験が適することが示された。

１５症例のＢ型肝炎陽性検体が交差反応性について評価された。試験した血清のいずれにおいても反応はなかった。Ｂ型肝炎４例の血清をＨｏｐｋｉｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｏｍｂａｙにおいてキットを使用して試験したが、無反応であった（施設内試験の表には含めなかった）。

他の一般的感染症の血清２７検体のうち、２５検体は明白な陰性を示したが、残りの２検体は不明瞭な結果であった。結核への進行についてこの被検者を追跡する必要があったが、残念ながらこれを行うことができなかった。決定できない結果は特異性及び感度の計算から除外した。

施設内試験の結果を以下の表にまとめた：

調査対象の被検者の新鮮血清を使用した場合に優れた結果が得られた。凍結血清は解凍後使用することができるが、検体の凍結解凍の反復は結果に影響を及ぼす可能性がある。

Claims (10)

1. 疎水性材料でコーティングしたカード「ＴＢ Ｓｃｒｅｅｎ」と、抗原懸濁液と、陽性対照と、陰性対照とを含む、肺の及び肺以外の結核を検出するための診断キット。
2. 前記抗原懸濁がリポソーム抗原であり、前記試験カードが好ましくはプラスチックスライドである、請求項１に記載のキット。
3. 前記陰性対照が正常若齢ウサギの血液から調製される、請求項１に記載のキット。
4. 前記陽性対照が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ抗原で免疫されて周期的に採血される４から６ヶ月齢のウサギから調製される、請求項１に記載のキット。
5. 疎水性材料でコーティングした試験カード上に陽性対照、陰性対照及び試験検体をそれぞれ円運動しながら（脱字）し、該抗原懸濁を陽性対照、陰性対照及び試験検体のそれぞれに加えて結果を判定することを含み、ダークブルーの凝集として特異的な抗原と抗体の凝集塊が陽性対照及び活動性結核感染を含む試験検体に観察される、キットを使用して結核を検出する方法。
6. 前記陽性対照のための脂質抗原が、
   Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ Ｈ ３７ Ｒｖ（ＡＴＣＣ−２７２９４）株をＳａｕｔｏｎ培地上で増殖し、
   培地中の細胞を４〜１０℃において遠心分離して回収し、
   該細胞に超音波処理を行い、
   該細胞から抗原を抽出し、
   該抗原に攪拌しつつ室温においてクロロホルムとメタノールの混合物（２：１）を加え、
   該混合物を濾過のステップにかけ、
   こうして得られた懸濁液を分液ロートに移し、二つの異なる層が分離するまで終夜保ち、上の水層を除去し、下の有機層を濾過後保持し、有機層を溶媒を蒸発させることにより乾燥して脂質を得、該脂質をさらに精製のステップに付す、
   ことにより調製される、請求項５に記載の方法。
7. 前記抗原懸濁液を
   ホスファチジルコリン、コレステロール、脂質抗原及び色素をフラスコに入れて、溶媒を真空エバポレーター中で蒸発させ、
   こうして得られた乾燥した内容物を無水アルコールに溶解し、４〜１０℃に１〜２時間保って抗原懸濁液を作成し、
   該抗原溶液を攪拌を継続しつつスクロース溶液に加え、該懸濁液を２〜８℃で終夜保持し、
   該懸濁液を遠心分離のステップにかけ、上清を廃棄し、
   ペレットを緩衝液中に懸濁し、それを４〜１０℃で攪拌する、
   ことにより調製する、請求項１に記載の方法。
8. 前記脂質（抗原）が、さらにカラムクロマトグラフィーを使用して精製される、請求項５に記載の方法。
9. 前記緩衝液が、ＮａＨ_２ＰＯ_４２Ｈ_２Ｏ，ＫＨ_２ＰＯ_４，ＥＤＴＡ，塩化コリン及びチオメルゾールを含む請求項７に記載の方法。
10. 前記色素が、クロロホルム中のスーダンブラックである請求項７に記載の方法。