JPH07805A - 安定化微小球およびその製造方法 - Google Patents

安定化微小球およびその製造方法

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JPH07805A JP5324065A JP32406593A JPH07805A JP H07805 A JPH07805 A JP H07805A JP 5324065 A JP5324065 A JP 5324065A JP 32406593 A JP32406593 A JP 32406593A JP H07805 A JPH07805 A JP H07805A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、診断アッセイにおいて使用するた
めの水中油形エマルジョンを提供することを目的とす
る。 【構成】 本発明の水中油形エマルジョンは、分散相と
して安定化された微小球粒子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、水中油形（ｏｉｌ−ｉ
ｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョン、該エマルジョンの製造
方法および診断アッセイにおける微小球粒子（ｍｉｃｒ
ｏｓｈｅｒｉｃａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の使用方法
に関する。
【０００２】
【従来の技術】エマルジョンは、液体粒子（ｄｒｏｐｌ
ｅｔ）として他方の液体中に分散させた一方の液体から
なる２つの混和しない液体層からなる液体系である。分
散した液体は分散相とよばれ、そして分散される側の液
体を連続相と呼ぶ。微小エマルジョンは、分散相の液体
粒子が極めて小さく、典型的には約０．０１μｍから約
０．２μｍである。使用される２つの層の液体および界
面活性剤の選択は、水中油形（ｏ／ｗ）、油中水形（ｗ
／ｏ）または無水のいずれかを決定する。微小エマルジ
ョンは、より大きい液体粒子からなる不連続相を用いた
エマルジョンよりも通常はより安定であるが、それは、
油層と水層の接触面の圧力が顕著に低いからである。即
ち、微小エマルジョンにおいては、凝集のために分散相
の液体粒子が小さくなる傾向がある。
【０００３】エマルジョンは通常、成分の液体（乳化
剤）を高い剪断力（ｓｈｅａｒ ｆｏｒｃｅ）に供する
ことにより製造される。この力は、動的であり、例えば
小さなオリフィスを通した混合物の激しい撹拌または押
込みである。別法として、超音波乳化を使用して局所的
な高い剪断で液体にキャビテーションを作用させる。水
性相に不溶性の物質を安定な水性溶液中で維持するため
の手段を微小エマルジョンが提供する場合、親油性薬剤
のための薬剤送達システムとして可能性の高いものとし
て興味がある。分散相の液体粒子の表面修飾は、コロイ
ド様液体粒子の物理化学的特性および生物化学的特性、
例えば血液の洗浄および組織の分配に関する特性を変更
させるのに有用であることがわかった。（イワモト（Ｉ
ｗａｍｏｔｏ，Ｋ．）ら、１９９１，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ
ｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ８０，２１９） 本明細書において使用される、エマルジョンに対する、
用語「水」は、極性の親水性液体であり、水のみに限定
されない。同様に、エマルジョンに対する、用語「油
（ｏｉｌ）」は、あらゆる非極性疎水性液体を意味す
る。用語「微小球エマルジョン」、「微小エマルジョ
ン」、および関連用語は、分散相の液体粒子が極めて小
さい場合の安定なエマルジョンに対して用いられる。
「微小粒子」、「微小球」、「粒子」、「微小球粒子」
および関連用語は、水性相中に乳化されていてもいなく
ても微小エマルジョンの分散相の微小液体に関して用い
られる。「官能基を有する（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚ
ｅｄ）」粒子、微小粒子、液体粒子または微小球は、微
小球をリガンドに対して共有結合させるのに適した反応
基を含む表面層内に両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉ
ｃ）成分を少なくともひとつ有する。
【０００４】リガンドは特異的にリセプター分子を認識
して結合する。リガンドおよびそのリセプターは特異的
結合対と呼ばれる。リセプターとリセプターの結合特異
性は、リガンドまたはリセプターのいずれかの分析物の
検出に関するアッセイに用いることができる。リガンド
／リセプター対は、例えば、抗原またはハプテンと抗
体、相補的核酸、ビオチンとアビジン／ストレプトアビ
ジン、および糖質とレクチンを含む。
【０００５】本発明の微小球の生産方法は、リポソーム
の製造において公知であるエタノール注入法と同様であ
る。しかしながら、このような方法は、表面上で疎水性
液体コアおよび両親媒性単層を用いて粒子を生産するた
めには使用されたことがない。水性媒体を含む単一二重
層リポソームの生産のためのエタノール注入法は、バツ
リ（Ｓ．Ｂａｔｚｒｉ）とコーン（Ｅ．Ｋｏｒｎ）、１
９７３，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ
２９８，１０１５およびリポソーム−実験的アプローチ
（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｒ．Ｒ．Ｃ．Ｎｅｗ，ｅｄ．，
ｐ６３）に記載されている。米国特許第５，１００，５
９１号には、両性の水不溶性物質、例えば、アンフォテ
リシンＢをホスフォリピッドの膜に取り込んだリポソー
ムの生産方法が記載されている。
【０００６】本発明の安定化微小粒子は、疎水性粒子が
望まれる場合のさまざまな応用において有用である。リ
ポソームはこれら応用の多くにおいて用いられてきた
が、さまざまな問題および欠点を有する。本発明におい
て、液体疎水性コアは、化粧品（例えば、染料および香
料）、食物（例えば、油および風味）および農業（例え
ば、殺虫剤および除草剤）における使用のための水不溶
性化合物への取り込みを可能にする。水不溶性薬剤も、
治療の応用における薬剤送達および安定性を改良するた
めに微小粒子のコアに含まれる。このような薬剤含有微
小球は、相対的に大きい水性コア中よりむしろ膜二重層
中の相対的に小さい疎水性領域に水不溶性薬剤のみを含
みうる、先行技術の「薬剤粒子（Ｐｈａｒｍａｃｏｓｏ
ｍｅ）」に比べてより多くの薬剤を取り込むことができ
る。例えば、ペレット（Ｐｅｒｒｅｔｔ）ら、１９９
１，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３，１５
４；ハマン（Ｈａｍａｎｎ）ら、１９８９，第５回Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔ．Ｃｏｎｆ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈ．１，
９９；ハマン（Ｈａｍａｎｎ）ら、１９８７，Ａｃｔ
ａ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．３３，６７における
リポソームへの薬剤の取り込みに関する考察を参照せ
よ。さらに、両親媒性薬剤、例えばアンフォテリシンＢ
または殺虫剤／除草剤脂肪酸は、治療および農業の応用
のために、両親媒性として本発明の微小球の表面層に取
り込まれる。
【０００７】現在安定な微小球の表面の変化は、表面単
層中で両親媒性薬剤または両親媒性脂肪の種類および量
を調節することにより増加しうるとおり、これらは、薬
剤を運ぶ電気的ポテンシャルに伴って移動するように作
成されうる。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明によれば、安定
化された微小球粒子を分散相として含む水中油形のエマ
ルジョンが提供される。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の微小粒子は、両
親媒性化合物の表面コーティングを有する液体疎水性コ
アからなる。分散相の微小粒子または液体粒子は、必要
に応じて、抗体、抗原、ハプテンまたはオリゴヌクレオ
チドリガンドにカップリングさせるために表面に反応基
を含むことにより官能基を付加される（ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎａｌｉｚｅｄ）。リガンド誘導微小粒子はリガンドと
そのリセプターの結合を含む診断アッセイにおける試薬
として有用であり、かつ、診断アッセイにおいて典型的
に使用される他の種類の粒状試薬、例えばラテックス粒
子、金属ゾル粒子、磁性ビーズ、コロイド粒子またはリ
ポソームに置換できる。水不溶性染料をコアリガンドに
含ませるならば、微小エマルジョンも診断アッセイにお
けるトレーサーとして用いられ、リポーターまたは検出
機能を提供する。本発明の微小球粒子はリポソームを用
いた場合に可能な濃度より高い濃度の染料を取り込む利
点を有し、トラップされた染料に加えて大量の水性媒体
をリポソームが含む。これらも発色ラテックス粒子より
強く発色し、即ち、アッセイ感度が増加する。
【００１０】水中油形のエマルジョンの微小球粒子は、
液体コアを乾燥せずに安定化し、そして乾燥状態からの
再構成に際してほぼ最初の大きさまで容易に水和され
る。これは、乾燥後容易に懸濁されない他の多くの種類
の粒子、例えばラテックスに比較した場合の改良点であ
る。さらに、室温で保存された場合、該微小粒子は安定
なままである。トレーサーとして用いる場合、該微小粒
子はコア中に含まれている水不溶性染料を回りの水性媒
体に漏らさない。対照的に、水溶性染料を含むリポソー
ムは水和の速度が遅く、乾燥状態からの再構成に際して
実質的な量の染料を漏らす。水和時間におけるこの違い
は、水性環境において機能するためにこれらの表面にお
いてのみ水和されることを必要とするが、それは、リポ
ソームがそれらの脂肪二重層表面上並びにそれらの内部
で水和されて凍結乾燥後の水性環境中で機能しなければ
ならないという事実のためであるらしい。シグナルの損
失を最小にした迅速な水和は、トレーサー試薬、特に免
疫キャピラリーまたは免疫クロマトグラフィー診断試験
において使用する場合に多く望まれる特性である。
【００１１】本発明の安定化微小球粒子は、水不溶性化
合物および両親媒体の混合物を用いて水中油形（ｏ／
ｗ）の微小エマルジョンとして調製される。該両親媒体
は、水不溶性化合物の分散相をコートし、そして水性相
中に安定化する。水不溶性化合物に可溶性の染料は必要
に応じて含まれる。通常、微小エマルジョンは当業界に
おいて公知のあらゆる方法により調製されるが、特定の
修飾は好ましい。両親媒体は水不溶性化合物に不溶性で
あるから、共溶剤（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ）がエマルジョ
ンの調製の間初めに含まれることが好ましい。次に、該
共溶剤は調製工程における後の段階において除去され
る。
【００１２】微小球粒子のコアを形成する水不溶性化合
物は、室温において液体であり、かつ、微小エマルジョ
ンがトレーサーとして用いられるならば水不溶性染料に
溶解する高い許容量を有することが好ましい。好ましく
は、水性溶液を凍結乾燥するために用いられる条件下
で、それら化合物は気化しにくく、乳化される水性環境
の密度、即ち、約１．０またはそれよりわずかに高い密
度と等しいかまたはわずかに高い密度を有する。微小エ
マルジョン中で安定化される場合、これらの特性を有す
る水不溶性化合物は、微小エマルジョンを凍結乾燥した
場合に固体粒子のようにふるまう。本発明の微小エマル
ジョンの製造に使用される好ましい水不溶性化合物は、
ポリジメチルジフェニルシロキサン、例えば、ＧＥシリ
コーンＳＦ１１５４［ゼネラッルエレクトリック（Ｇｅ
ｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．）社、Ｗａｔｅ
ｒｆｏｒｄ，ＮＹ］である。このシリコーン液体は、
１．０５の密度を有し、低粘度で非揮発性である。他の
シリコーン液体も本発明に使用され、例えばＧＥ ＳＦ
１２６５、またはＨｕｌｓ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｉｓｃ
ａｔａｗａｙ，ＮＪ）のフルオロシリコーンＰＳ１８１
およびＰＳ１８２が挙げられる。フルオロシリコーンを
用いる場合、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）およびエ
タノールの１：１混合物は、他の成分を溶液にするのに
必要である。
【００１３】微小エマルジョンの連続相は、所望の応用
に適切なあらゆる水性化合物である。水性連続相化合物
の例としては、水および当業界において公知のさまざま
な緩衝液を含む。
【００１４】微小エマルジョンを製造するために用いら
れる両親媒体は、油性液体粒子の凝集を妨害することに
より水性環境に対して微小エマルジョンを安定化し、分
散した油性液体粒子の表面上に層を形成する。この層は
リポソームにおいて形成される二重層の膜とは対照的に
単層であると信じられている。この構造は、粒子中のマ
レイミドの総量に対する微小エマルジョン表面のマレイ
ミドの比率を１：１にすることを示す実験分析により支
持される（実施例を参照）。対照的に、リポソームは、
リポソームの大きさおよび含まれる二重層の数に依存し
て２：１またはそれ以上の比率を与える。好ましくは、
両親媒体の混合物が用いられる。適切な両親媒体は、リ
ポソームの製造において典型的に使用される脂肪を含
む。好ましい両親媒体は、ホスホリピッド、例えばホス
ファチジルコリン、ホスファチジルグリセロールおよび
ホスファチジルエタノールアミンである。最も好ましい
のは、ジステアロイルホスホリピッド、例えばジステア
ロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジステアロ
イルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびジ
ステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰ
Ｅ）である。ＤＳＰＥは、誘導によりマレイミジルカプ
ロエートモイエティを含ませ（ＤＳＰＥ−ＭＣ）、リガ
ンドへのカップリングのために微小エマルジョンに官能
基を付加する。微小エマルジョンの電荷は、ＤＳＰＧま
たはＤＳＰＥの量を増加または減少させるか、またはマ
レイミドをＭＥＳＡで処理することにより特定の薬剤ま
たはイオントフォレーシスの応用に調整される。
【００１５】微小エマルジョンに官能基を付加する場
合、両親媒体は、選択されたリガンドに共有結合されう
る少なくともひとつの両親媒体を含む両親媒体の混合物
であることが好ましい。カップリング両親媒体は、微小
粒子の表面に直接リガンドを共有結合によりカップリン
グさせるのに適切な官能基を有する誘導されたホスホリ
ピッド、例えば、ホスホリピッドまたはチオコレステロ
ールのマレイミジル誘導体である。共有結合による方法
は、微小粒子に対する抗原、抗体、ハプテンおよびオリ
ゴヌクレオチドリガンドのカップリングに適切であり、
オリゴヌクレオチドは、チオ基を通してホスホリピッド
上のマレイミド基に結合されることが好ましい。マレイ
ミド官能基を付加されたホスホリピッドは、アビジン、
ストレプトアビジンまたはビオチンにカップリングさ
せ、そしてそれらをビオチンまたはアビジン／ストレプ
トアビジン誘導リガンドに非共有結合させることにより
リガンドを微小粒子に間接的にカップリングしてもよい
［ラフレイ（Ｈ．Ｃ．Ｌｏｕｇｈｒｅｙ）ら、１９９
０、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｔｄｓ．１３２，２５］。
ビオチン化蛋白質またはオリゴヌクレオチドリガンド
は、表面ホスホリピッドへの抗ビオチン抗体の共有結合
により、微小粒子表面に間接的にカップリングしてよ
い。
【００１６】別法として、両親媒体は、液体粒子の表面
上のコーティングからなる安定化両親媒体の混合物中に
含まれてよい。例えば、カルジオリピン、４鎖ホスホリ
ピッドは、微小エマルジョンの製造のための適切な両親
媒体であり、そして梅毒の血清学試験のための抗原リガ
ンドとしても有用である。それらの表面にカルジオリピ
ンを含む微小粒子は、抗梅毒抗体の検出に関する凝集性
イムノアッセイにおいて使用されうる。
【００１７】コレステロールは両親媒体に含まれるが、
通常はリポソームのためのものとしては必要ではなく、
それは、両親媒体がリポソーム中における二重層の堆積
（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）よりむしろ微小液体粒子上に
単層を形成するからである。リポソーム膜中のコレステ
ロールの機能がリポソーム二重層のインターカレートお
よび安定化である場合、本発明において任意である。好
ましくは、微小粒子をトレーサーとして用いる場合、コ
レステロールは含まれず、その存在は特定の固相イムノ
アッセイにおいてバックグラウンド染色および凝集のベ
ースラインのレベルを増大させる。ＤＳＰＧの増量は粒
子の表面電荷を増加させ、そして抗体カップリング後の
凝集を妨害し、その結果、微小粒子が染料を含む場合、
バックグラウンドおよび偽陽性を低下させることも分か
った。別法として、リガンドへのカップリング後にＭＥ
ＳＡ（２−メルカプトエタンスルホン酸）で粒子を処理
することもバックグラウンドおよび偽陽性を低下させ
る。
【００１８】水不溶性染料は、診断アッセイにおける分
析物を検出するためのトレーサー組成物を製造するため
に、ｏ／ｗ微小エマルジョンの液体粒子中に任意に取り
込まれる。検出可能なトレーサーおよび染料を含むトレ
ーサーは、特定の結合アッセイ、即ち、リガンドと特異
的結合対メンバーの結合を含むアッセイの分野において
公知である。粒子コアの水不溶性化合物は高い濃度で水
不溶性染料を溶解することができ、それにより、診断ア
ッセイの感度を改良する。適切な水不溶性染料は、トレ
ーサーの取り込みに関して当業界において公知のもの、
例えば、リポソームへ封入されるものまたはラテックス
粒子へ取り込まれるものである。多数の分析物に関する
アッセイに使用されるべく混合されるか、または多数の
シグナルの読み取りが望まれる場合、異なる染料を別々
の微小粒子調製物に取り込ませる。本発明の使用のため
に好ましい染料はスーダンブラックＢである。
【００１９】スーダンブラックＢ（ＳＢＢ）を微小球粒
子に取り込ませる場合、染料を最初に精製することが好
ましい。ＳＢＢの主要成分の精製および単離は、フラー
（Ｐｆｕｌｌｅｒ）ら、１９７７、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ ５４，２３７およびフラー（Ｐｆｕｌｌｅ
ｒ）ら、１９７７、Ｖｅｒｂ．Ａｎａｔ．Ｇｅｓ．７
１，Ｓ１４３９に記載されている。クロロホルムを移動
相として用いる調製用薄層クロマトグラフィーを用いる
と、主要な最も早く移動する（即ち、より疎水性の）成
分を単離することができる。この成分は以後、「早いＳ
ＢＢ」と呼ぶ。早いＳＢＢも、溶剤としてジクロロメタ
ン：ヘキサンの８０：２０を用いてシリカカラム上に、
またはジクロロメタン中で移動させたＴＬＣプレートか
ら単離される。通常、ジクロロメタンはクロロホルムを
用いる場合よりも良好に、遅いＳＢＢから早いＳＢＢを
単離する。イーストマンコダック社（Ｅａｓｔｍａｎ
Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）から市販され
ているスーダンブラックＢは９８％の精製度であるが、
早いＳＢＢは全質量の約１７％含まれる（精製収量を１
００％として）。早いＳＢＢの使用は、より安定な粒
子、より多量のＳＢＢの取り込み、および未精製のＳＢ
Ｂを用いて可能なものより安定なマレイミドの機能を提
供する。精製されたＳＢＢは粒子形成または凍結乾燥粒
子の水和の間のいずれかにおいて水性相の一部となら
ず、そしてそのためシグナルの安定化および強度の点で
好ましい。
【００２０】早いＳＢＢ調製物の精製は、７００ｎｍと
６００ｎｍの吸収比によりエタノール中で溶解した後に
近似されうる。
【００２１】 一つの態様として、シリコーン微小エマルジョンは渦巻
き撹拌の間、水性相に脂質、シリコーンおよび染料（任
意）のエタノール溶液を滴下して加えることにより製造
される。この方法は、０％から有限レベルまで、通常は
約５０％未満のエタノール濃度において漸進的増加をも
たらす。水に対するエタノールの比はこの範囲において
は明らかに臨界的でない。エタノールの最終濃度を約２
０−４０％にするために、水性相とエタノール溶液を混
合することにより粒子を製造することが好ましい。もっ
とも好ましくは、エタノール溶液および水を約１：２の
比で混合し、エタノール濃度を約３０％にする。しかし
ながら、必要であれば、エタノール濃度を約５０％以上
にし（例えば、ＩＰＡ、ベンゼン、水等を除去するため
に４Ａの分子篩を用いて）、そして脂質濃度を低下させ
る。微小粒子の形成後、エタノールの除去することが好
ましく、例えば、ウルトラフィルトレーション、カラム
クロマトグラフィーまたは透析による。エタノールの除
去は、リガンドへの微小粒子のカップリングには本質的
でないが好ましい。粒子をリガンドにカップリングする
場合、カップリングの前に濃縮することが好ましい。こ
の方法は、微小粒子の小規模の製造には迅速で簡単であ
るが、大規模の製造には好ましくない。
【００２２】微小球の製造のための大規模な方法は、ポ
ンプまたはシリンジを用いて水性相にエタノール溶液を
接触させ、好ましくは「Ｙ」接続でいっしょになる液体
流に接触させる。この方法は、自動化できる点で好まし
い。例えば、選択された比率で成分を送達するために段
階的モーターにより制御された適切なサイズのシリンジ
を伴う、異なるスピードのポンプまたはＺｙｍａｒｋ社
のＭＡＳＴＥＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＳＴＡＴＩＯ
Ｎは、自動化、スケール変更、および水に対するエタノ
ールの比率を制御できるシステムを提供する。これによ
り、構成する粒子の形成および粒子サイズの配分が可能
になる。このように自動化されたシステムも固定された
エタノール対水の比率における粒子の形成を許し、固定
された濃度の粒子をもたらす。より大きい体積の微小粒
子は、ポンプ／シリンジをより長い時間稼働させ、シリ
ンジ等のサイズを増加させることにより製造される。３
ｍｌシリンジに代えて１０および２５ｍｌのシリンジを
用いた場合、悪化は観察されなかった。このシリンジシ
ステムが好ましいのは、狭いシリンジ開口部を通った２
つの液体の流れの排除により生じた剪断力および混合が
増加するというさらなる利益を提供する。
【００２３】両製造法において、１μｍ以下および典型
的には２５０ｎｍ以下の規定されたサイズ分配の粒子
は、押出または音波処理によらずに形成されるはずであ
り、規定されたサイズのリポソームの形成に必要であ
る。シリコーンに対する脂質の比、エタノール中の脂質
とシリコーンの濃度、水性体積に対する有機（エタノー
ル溶液）体積の比は、微小エマルジョンの粒子サイズを
決定する。これらの比は、リポソームと対照的に、微小
粒子が製造後にもとのサイズに戻りうるように、微小エ
マルジョンの形成の間、所望の粒子サイズを得るために
調節される。もっとも好ましくは、微小エマルジョンは
２００ｎｍ以下の粒子サイズを有する。
【００２４】有機共溶剤は、すべての成分を可溶化する
機能を担う、水混和性有機溶剤である。例としては、短
鎖のアルコール、例えばエタノールおよびジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）が挙げられる。個々に、成分は互い
に不溶性であるか、または有機共溶剤中で不溶性であ
る。例えば、（１）脂質はシリコーン中で不溶性であ
り、そして（２）ＤＳＰＧおよびＤＳＰＥはエタノール
中で溶解性でない。しかしながら、化合された系として
は、それら成分が可溶性である。もしも存在するなら
ば、水不溶性染料はシリコーンまたは脂質に可溶性であ
る。シリコーンは、シリコーンなしに取り込まれうる量
の１０倍の量の染料を取り込まませることがわかった
（ｍＭ染料／μＭ Ｐｉが、シリコーン無しの場合０．
３であり、シリコーン有りの場合３．０）。
【００２５】好ましくは、官能基を有する微小粒子をリ
ガンドにカップリングさせる場合、それらは、ｍｌあた
り約１００ｎＭマレイミドに濃縮されることによりカッ
プリングの効率を上昇させるのが典型的である。粒子
は、透析、凍結乾燥および再構成または当業界において
公知の適切な手段により濃縮される。必要であれば、上
記のような適切なプロトコルを用いて微小粒子をリガン
ドにカップリングさせてよいが、そのようなプロトコル
には、粒子のコーティングの両親媒上にマレイミド官能
基の共有結合を形成させることを含む。蛋白質をカップ
リングさせる場合、カップリング前にチオールを還元す
る。この蛋白質はそれ自身リガンドであり（直接のカッ
プリング）、あるいは微小粒子へリガンドを非共有カッ
プリングさせるのに使用されるアビアイン、ビオチンま
たは抗体でありうる。
【００２６】イムノアッセイに関する試薬を製造するた
めの好ましい態様においては、抗体リガンドをｐＨ８に
おいて粒子にカップリングさせ、残った遊離の抗体をカ
ラムクロマトグラフィーにより除去する。３０ｍＭｎｏ
ＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシ
−プロパンスルホン酸）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００
ｍＭのグルコースおよび０．２％のＮａＮ3（ｐＨ６．
８）により平衡化されたＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ
ＦＬＯＷカラム（ファルマシアＬＫＢバイオテクノロ
ジー社、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が好ましい。こ
の緩衝液は、カラムへの粒子の粘着が最小に押さえられ
るために好結果を提供する。引き続く粒子の凍結乾燥お
よび再構成に逆に影響することなく、緩衝液中のグルコ
ースに代えてシュークロースを用いてもよい。凍結乾燥
および再構成後にアッセイの実施において不満足な結果
になるため、グリセロール／ＤＭＳＯのような添加物は
避けるべきである。デキストランおよびベータヒドロキ
シプロピルシクロデキストリン添加物は最適であり、凍
結乾燥後の粒子の特性に影響しない。
【００２７】保存のための微小粒子の凍結乾燥は、微小
エマルジョンを凍結して凍結乾燥することにより実施さ
れる。微小エマルジョンは、ゆっくり（例えば、凍結乾
燥機中で約−４０℃）または液体窒素中（−１５０℃）
でより素早く乾燥する。ひとつの態様においては、凍結
された微小エマルジョンは、４から１２時間にわたって
真空下で−４０℃から＋２５℃の加温が生じるようにし
て凍結乾燥される。次に、凍結乾燥が完了するまでバイ
アルを＋２５℃に維持する。バイアルを凍結乾燥後に真
空下で低湿度の環境に密封した場合、凍結乾燥された粒
子は診断アッセイにおいて改良された特性を示す。簡便
には、このようなことは凍結乾燥機中で実施される。こ
の工程は、微小エマルジョンを特定の結合アッセイにお
いて使用する場合にバックグラウンドを低下させ、それ
によりアッセイ感度を改良してアッセイのパラメーター
を評価および最適化するためにクリーナーシステムを提
供する。
【００２８】少なくとも１％の安定化蛋白質の存在下で
粒子を凍結乾燥することにより、上昇した温度における
保存および処理の間の、官能基を付加された微小球粒子
の安定性を改良することが好ましい。好ましくは、安定
化蛋白質は少なくとも１％のＢＳＡであり、より好まし
くは５％のＢＳＡ（Ｐｅｎｔｅｘ ＦｒａｃｔｉｏｎＶ
ＢＳＡ，Ｍｉｌｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｋ
ａｎｋａｋｅｅ ＩＬ）であるが、この目的に関する当
業界において公知の他の蛋白質も使用可能である。粒子
の濃度および安定化蛋白質に対する粒子の比は、再構成
された微小エマルジョンを用いた診断試験において観察
されるバックグラウンドレベルに影響する。極めて少な
いかまたは極めて多量のＢＳＡ（１３％以上）は、実施
例３に記載されるマラリア試験においてバックグラウン
ドを増加させることも注意されてきた。粒子に対する安
定化蛋白質の比（Ｐｉの量による定量）は、２８ｍｇ蛋
白質／１μＭ Ｐｉ以上かまたは２００ｍｇ／１μＭ
Ｐｉ以下が好ましい。
【００２９】密閉されたコンテナー中で保存された凍結
乾燥微小粒子はあらゆる適切な水性媒体、例えば水また
は緩衝液中で再構成（即ち、再懸濁）される。例えば、
適切な緩衝液には、ＭＯＰＳＯ／グルコース、ＭＯＰＳ
Ｏ／グルコース／ＢＳＡおよびホウ酸緩衝液が含まれ
る。再構成された粒子は凍結乾燥されなかった粒子と同
じサイズである。所望の応用における粒子の適切な希釈
は、粒子を再構成させるために添加される水性媒体の量
を調節することにより得られうる。凍結乾燥後に低湿度
において真空下で密閉されたバイアル中のサンプルは、
特に早く再構成する。
【００３０】本発明によるリガンドを含む微小粒子は、
分析物の検出のためのリガンドおよびそのリセプターの
間の特異的結合を利用する、当業界において公知のさま
ざまな方法において有用である。このようなアッセイ
は、当業界において公知のいくつかの異なるフォーマッ
トにおいて実施されうるイムノアッセイおよび核酸ハイ
ブリダイゼーションアッセイを含む。これらのアッセイ
のあるものは、リガンドおよびそのリセプターの結合に
より形成される複合体に関連することになるトレーサー
を含み、それにより、該複合体の検出を促進する。複合
体の検出はアッセイフォーマットに依存して分析物の在
否または量を示す。慣用的なトレーサーは、検出可能な
標識、例えば染料、蛍光化合物、放射性標識または基質
と反応することにより発色生成物を生成しうる酵素にカ
ップリングさせたリガンド（抗体、抗原またはオリゴヌ
クレオチド）からなる。対照的に、本発明のトレーサー
は、リセプターに結合することができるように表面に関
連したリガンドを有する、官能基を付加された微小粒
子、および疎水性液体コア中に含まれる染料からなる。
トレーサー微小球は、本質的にあらゆる公知のイムノア
ッセイまたは核酸ハイブリダイゼーションフォーマット
における慣用的なトレーサーに置換されるが、固相イム
ノアッセイが好ましく、それは、試薬の分離が他のアッ
セイフォーマットに比較して早く単純だからである。好
ましい固相アッセイ装置は、イムノキャピラリーまたは
イムノクロマトグラフィーアッセイ装置であり、染料の
発色の強度、低いバックグラウンドおよび微小球に関連
した偽陽性がより少ないことによりこれらの種類のアッ
セイにおいて特に利点を提供する。
【００３１】イムノキャピラリーまたはイムノクロマト
グラフィーアッセイ装置は、微孔性吸着材料、例えばニ
トロセルロース、ナイロン、酢酸メチル、メチルセルロ
ースまたはグラスファイバーからなる。別法としては、
特定のセラミックのような実質的な吸着剤である孔性材
料を真空下でこのような装置に適用して試薬およびサン
プルを該材料中に入れる。このような装置を用いてイム
ノアッセイを実施するために、微孔性吸着材料の一部を
液体サンプルに接触させてキャピラリーにより（ウイッ
キング）装置へサンプルを引き込み、即ち、サンプルを
接触させたポイントからはずれた位置において微孔性吸
着材料上に固定した取得（ｃａｐｔｕｒｅ）試薬にサン
プルを接触させる。固定化取得試薬は、サンプル中の抗
原または抗体分析物に結合して取得のために機能する抗
体または抗原が一般的である。競合アッセイフォーマッ
トにおいては、リガンドと分析物は、通常、同じリセプ
ターに結合する同じ分子または類似物である。競合アッ
セイにおいては、トレーサーとサンプルは微孔性吸着剤
に同時に吸上（ｗｉｃｋｅｄ ｕｐ）されて取得試薬へ
の結合に関して競合する。サンドイッチアッセイフォー
マットにおいては、分析物はリガンドに対するリセプタ
ーが通常である。該分析物は最初に取得されて、トレー
サーは取得された分析物に接触して微孔性吸着剤に吸上
されて分析物の存在を示唆するものとして分析物に結合
ずる。
【００３２】本発明の官能基を付加された微小粒子トレ
ーサーを用いるイムノキャピラリーアッセイ装置の一つ
の態様においては、抗−マラリア抗体をサンドイッチア
ッセイにおいてマラリア抗原（分析物）の検出のために
微小粒子にカップリングさせる。例示的なアッセイ装置
は、抗マラリア取得抗体を有するイムノキャピラリーデ
ィップスティックであり、該抗体は該スティックの基材
上に固定されている。取得抗体のラインの下のディップ
スティックの末端は試験されるサンプルに接触してお
り、サンプル液体は取得抗体に接触してキャピラリーに
より吸い込まれる。サンプル中に存在するかもしれない
あらゆる分析物と取得抗体の結合後、微小粒子トレーサ
ーからなる組成物を、もし存在するならば取得されたマ
ラリア抗原に接触させて吸い込む。検出可能な発色、好
ましい発色、取得抗体の範囲における一列の染料はサン
プル中のマラリア抗原の存在を示す。
【００３３】２番目の態様においては、官能基を付加さ
れた微小球粒子（取り込まれた染料を用いても用いなく
ても）を、梅毒のＶＤＲＬ試験と同様の血清学的アッセ
イにおいて用いる。これらのアッセイにおいては、疾患
と関連した抗原を微小粒子の表面に共有カップリングさ
せるか、または該表面上の両親媒性単層コーティングに
含ませる。官能基を付加された微小粒子と、疾患に関連
した抗原に対する抗体を含む患者の血清との混合は、抗
体による微小粒子の架橋結合および可視粒子凝集をもた
らす。別法としては、抗体を微小粒子にカップリングさ
せて微小粒子の凝集により血清に存在する抗原を検出す
る。
【００３４】以下の実施例は本発明の特定の態様を例示
するために存在するものであり、本発明を限定するよう
に意図されるものではない。
【００３５】
【実施例】
実施例１ シリコーン微小エマルジョンの製造 ４７ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳ
ＰＣ，ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｐｅｌ
ｈａｍ，Ａｌ．）、１０．３ｍｇのジステアロイルホス
ファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ，Ａｖａｎｔｉ Ｐ
ｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、１．８７ｍｇのジステアロ
イルホスファチジルエタノールアミン−マレイミジルカ
プロエート（ＤＳＰＥ−ＭＣ）、５９ｍｇのファストス
ーダンブラックＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩまたはイーストマ
ンコダック、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）、１３６μｌ
のポリジフェニルジメチルシロキサン（ＧＥシリコーン
ＳＦ１１５４、ゼネラルイレクトリック社、Ｗａｔｅｒ
ｆｏｒｄ，ＮＹ）および８．８７ｍｇの２００プルーフ
エタノール（４Ａの分子篩を用いて乾燥し、ミリポアＧ
Ｖシリンジフィルター−クアンタム（Ｑｕａｎｔｕｍ）
ケミカル社、ＵＳＩ部門、Ｔｕｓｃｏｌａ，ＩＬ）を１
時間５５℃において加熱した。次に、ステッパーモータ
ーにより制御されている１０ｍｌおよび２５ｍｌのシリ
ンジを備えたＺｙｍａｒｋ社のマスターラボラトリース
テーションを用いて、エタノール溶液（１部）を水（３
部）と混合した。液体流は「Ｙ」接続部において混合さ
れ、即座に粒子が形成された。微小エマルジョンの形成
後、１０ｍＭ ＥＤＴＡに対する透析によりエタノール
を除去し、そして乾燥剤に対する透析によりによりエマ
ルジョンを濃縮した。Ｃｏｕｌｔｅｒ社（Ｈｉａｌｅａ
ｈ，Ｆｌ．）のモデルＮ４ ＭＤサブミクロン粒子分析
機により測定された粒子のサイズはｕｎｉｍｏｄａｌ分
析により約１８７ｎｍであった。亜硫酸濃度は３．４μ
Ｍ Ｐｉ／ｍｌであると測定され、そしてマレイミドは
９８．８ｎＭ ＭＣ／ｍｌであった。
【００３６】実施例２ 抗体への微小粒子のカップリング 実施例１において製造された微小粒子をウサギ抗組換え
ＨＲＰＩＩ抗体にカップリングさせた。これらの抗体
は、プラスモジウムファルシマルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉ
ｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のヒスチジンが豊富な蛋
白質ＩＩ、即ちマラリアの精神病因子（ｅｔｉｌｏｇｉ
ｃａｌ ａｇｅｎｔ）に対するものである。抗ＨＲＰＩ
Ｉ抗体をリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）（ｐＨ８）に対して透
析し、吸光度定数１．３５の２８０ｎｍの吸光度におい
て決定した濃度は２．４７ｍｇ／ｍｌであった。６ｍｇ
の抗体をＳＰＤＰ（３−（２−ピリジルジチオプロピオ
ン酸Ｎ−ヒドロキシサクシニミドエステル、シグマケミ
カル社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）により３０分間、
１．５ｍｌメタノール中の１．５ｍｇＳＰＤＰ溶液（６
０μｌ）を用いて誘導した。次に、１Ｍの酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ４．５，２８０μｌ）を加えて、次に８６μｌ
の１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加えてＤＴＴの
最終濃度を３３ｍＭにした。溶液をさらに３０分間室温
で撹拌し、次に、ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ｇ−２５カラム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ社）に適用して、遊離のＤＴＴを除去して誘導さ
れた抗体をｐＨ８のカップリング緩衝液（５０ｍＭのＴ
ｒｉｓ塩基、５０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭの塩
化ナトリウムおよび１ｍＭのＥＤＴＡ）に入れた。
【００３７】抗体の濃度は２８０ｎｍの吸光度において
測定された。抗体調製物は、使用直前にＴｒｉｓを用い
てｐＨ８にした微小エマルジョンと混合したが、１００
ｎＭマレイミドに対して１ｍｇ抗体の比で行った。混合
物を２時間インキュベートした。次に、３０ｍＭのＭＯ
ＰＳＯ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１００ｍＭのグルコース
および０．２％のアジ化ナトリウム（ｐＨ６．８）で平
衡化したＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＦＡＳＴ ＦＬＯＷカラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ社）にて、官能基を有する該粒子から遊離の抗
体を分離した。Ｍｉｌｅｓ Ｐｅｎｔｅｘの画分ＶのＢ
ＳＡを最終ｗ／ｖ濃度１％になるまで加えた。
【００３８】実施例３ トレーサー微小球を用いたイムノアッセイ マラリア抗原を検出するためのイムノキャピラリーアッ
セイ装置は、以下のとおりに製造した。８ミクロンのニ
トロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃ
ｈｕｅｌｌ社、Ｋｅｅｎｅ，Ｎ．Ｈ．）の２．８ｃｍ×
１．５ｃｍのストリップをプラスチック上に覆った。Ｈ
ＲＰＩＩのタンデムリピート配列に由来するアミノ酸配
列を有する１８マーのペプチドに対するモノクローナル
取得抗体を、１ｍｇ／ｍｌの抗体溶液を用いて１μｇ／
ｃｍ2の比でニトロセルロース上にスポットした。抗体
１８マー抗体を生産する２つのハイブリドーマを、アク
セションナンバーＨＢ１１１１１およびＨＢ１１１１２
としてアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）に寄託した。次に、膜のスト
リップを４５℃において１５分間インキュベートし、そ
して、５ｍＭのＥＤＴＡ、５％のベータラクトース、
０．２％のＮａＮ3、０．２％のＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮ
３−１０（カルビオケム社、ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａ．）
および１％のＢＬＯＴＴＯ（非脂肪性ドライミルク）の
溶液でブロックした。ブロックされたストリップを４５
℃において一晩インキュベートした。製造された膜を７
ｃｍ×１５ｃｍの上記被覆されたプラスチックに適用
し、４．７ｃｍ×１５ｃｍのグラスファイバー片（Ｇｅ
ｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍ
Ｉ）でオーバーラップして、液体をニトロセルロースに
吸い込ませる手助けをした。このストリップを７ｍｍ幅
の試験ストリップに霧、乾燥して保存した。
【００３９】アッセイに際して、分析物として１８マー
のペプチドをさまざまな希釈で含む４０μｌの正常ヒト
血清と共に、上記マラリア試験ストリップを試験管にお
いた。１８マーは、以下のアミノ酸配列（配列番号
１）： Cys-Gly-Ala-His-His-Ala-His-His-Ala-Ala-Asp-Ala-His-His-Ala-Ala-Asp-Ala を有する唯一の合成ペプチドである。
【００４０】実施例１および２において製造された微小
粒子トレーサーを１％ＢＳＡ含有ＭＯＰＳＯ緩衝液で
１：３に希釈し、血清サンプルを試験ストリップに吸上
させた（ｗｉｃｋｅｄ ｕｐ）後、希釈されたトレーサ
ーを試験管に加えた。トレーサーを試験ストリップに吸
い込ませた後、４０μｌの洗浄溶液（０．２％のＺＷＩ
ＴＴＥＲＧＥＮ３−１０を含むｐＨ７．５ホウ酸緩衝
液）を加え、吸上させた。取得抗体ラインの範囲のは職
の程度は可視的に決定され、強度に基づく主観的数値を
決めた。シグナル検出のための限界は、典型的には約１
×１０-7の希釈であり、アッセイ感度が高いことが示さ
れた。この試験結果を以下の表に示す。調製物Ａ（微小
粒子トレーサー）を、スルホローダミンＢ（ロット００
２）を含むリポソームトレーサーと比較した。
【００４１】 希釈 粒子調製物 ＮＨＳ １０-4 １０-5 １０-6 １０-7 Ａ − ４ ３ ２ １＋ ロット００２ ＷＫ＋１ ４ ３ ２ １ これらの結果から、微小粒子トレーサーを用いたアッセ
イは臨床的にあきらかな量のマラリア抗原を検出し、そ
して、実施において、染料を含むリポソームトレーサー
に比較し得るものであることが証明された。
【００４２】実施例４ 微小粒子の凍結乾燥および再構成 実施例１および２において製造された微小エマルジョン
を１％のＭｉｌｅｓＰｅｎｔｅｘ画分ＶのＢＳＡを含む
ＭＯＰＳＯ緩衝液中に保存した。１６６μｌのアリコー
トを３３３μｌのＭＯＰＳＯ緩衝液／１％ＢＳＡと共に
バイアル中に入れた。ストッパーはルーズにバイアルに
かぶせた。バイアルを液体窒素中にて凍結し、乾燥機
（Ｔｈｅ Ｖｉｒｔｉｓ社、Ｇａｒｄｉｎｅｒ，Ｎ．
Ｙ．）中の凍結棚（ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｅｌｆ）上にお
いた。真空下で１２時間にわたって棚を−４０℃から＋
２５℃に暖めるようにして、凍結乾燥サイクルを制御し
た。コンデンサーを−４０℃にした。操作が完了するま
で、即ち、最低約１８時間、バイアルを２５℃に維持し
た。次に、バイアルのストッパーを乾燥機中で付けた
が、真空下および低湿度において実施し、部屋の雰囲気
でトレイの下に気泡を満たした。ストッパーを付けたバ
イアルを１１日間４５℃に保存した。
【００４３】微小エマルジョンを再構成するために、ス
トッパーを取り除き、そして一定の体積のＭＯＰＳＯ緩
衝液／１％のＢＳＡを加えて粒子を所望の希釈に対応さ
せた。実施例３のイムノアッセイにおける使用に際して
は、５００μｌの緩衝液を加えて微小エマルジョンを再
構成した。水和は素早く起こり、２３８ｎｍの粒子を含
む微小エマルジョンを形成した。再構成された微小エマ
ルジョントレーサーの活性は実施例３のイムノアッセイ
において測定された。結果を以下に示す。
【００４４】 ＮＨＳ １×１０-4 １×１０-5 １×１０-6 １×１０-7 活性 ＋／−− ＋４ ＋２ ＋１ ＋／− 実施例５ カルジオリピン微小球 ホスファチジルコリン（１０ｍｇ，ＤＳＰＧ，Ａｖａｎ
ｔｉ Ｐｏｌａｒ ＬｉｐｉｄｓまたはＬ−アルファ混
合チェーン、シグマケミカル社の何れか）を、１ｍｇの
ＤＳＰＧ、４０μｌのＳＦ１１５４シリコーン、５０μ
ｌノカルジオリピン（シグマケミカル社、５．２ｍｇ／
ｍｌ（エタノール中））および１．５ｍｌのエタノール
と混合した。溶液を１時間５５℃において加熱し、次に
渦巻き撹拌で混合しながら、４．５ｍｌの水にＧｅｌｍ
ａｎ４４５０の０．２μｍ １３ｍｍフィルターを通し
て滴下した。その結果得られた微小エマルジョンは１７
４ｎｍの粒子を含んでいた。ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ２
透析バッグ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｌｏｓ Ａｎｇｅｌｓ，Ｃａ．，
１２−１４０００ＭＷカットオフ）中で１０ｍＭのＥＤ
ＴＡに対して微小エマルジョンを透析してエタノールを
除去した。
【００４５】市販されているＶＤＲＬ抗原（Ｄｉｆｃｏ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｄｅｔｒｏｉｔ，Ｍ
Ｉ）は、０．０３％のカルジオリピン、０．２１％のレ
クチンおよび０．９％のコレステロール（エタノール
中）を含んだ。このエタノール溶液をホルムアルデヒド
緩衝塩に加えて、コロイド懸濁液を形成した。該懸濁液
を遠心分離して０．０２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．
９、０．２％のメルチオレート、４０％のコリンクロリ
ドおよび０．１ＭのＥＤＴＡを含む）に懸濁した。この
調製物をＵＳＲ試薬と呼ぶ。ＵＳＲ試薬および微小エマ
ルジョンを用いて梅毒への暴露の指示としてカルジオリ
ピンに対する反応性に関して血清を試験した。
【００４６】１８ガーゼ針を通して、微小エマルジョン
またはＵＳＲ試薬１滴を、塩、血清または塩により希釈
された血清５０μｌを含む環状ガラススライドに加え
た。このスライドを１８０ＲＰＭにて４分間回転させ、
１００倍の顕微鏡により凝集を観察した。可視凝集を示
すもっとも高い希釈を力価として決定した。代表的なデ
ータを以下の表に示す。
【００４７】 シリコーン微小エマルジョン ＵＳＲ 抗血清１１０ 陰性 陰性 抗血清１１４ 陰性 陽性１：２ 抗血清１１５ 陽性１：２ 陽性１：２ 抗血清１１９ 陽性１：８ 陽性１：８ これらの結果から、既知の反応性の抗血清を用いたほと
んどの場合において、カルジオリピン微小粒子調製物
は、標準的に市販されている梅毒血清学試験と同様の反
応性を示すことが示された。
【００４８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Cys Gly Ala His His Ala His His Ala Ala Asp Ala His His Ala Ala Asp Ala 1 5 10 15
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｂ 9015−2Ｊ (72)発明者 ハンス・エイチ・フェインド アメリカ合衆国メリーランド州21120，パ ークトン，プリティボーイ・ガース ９ (72)発明者 ジェラルド・ディー・ハーン アメリカ合衆国メリーランド州21144，セ バーン，ゴールデン・パイン・サークル 7862

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）疎水性液体コア；および （ｂ）リガンドが該リガンドのリセプターに結合できる
    ように、下記粒子の表面上に層を形成する、リガンドに
    共有結合した両親媒性化合物；からなる微小球粒子を含
    む組成物。
  2. 【請求項２】 上記コアが水不溶性染料を含む、請求項
    １記載の組成物。
  3. 【請求項３】（ａ）リセプターに対する第１リガンドへ
    の結合によりリセプターを取得し; （ｂ）結合したリセプターを、微小球粒子からなるトレ
    ーサー組成物に接触させるが、その際、該粒子は液体シ
    リコーンコアからなり、そして、第２リガンドがリセプ
    ターに結合できるように、上記コアの表面上の層が、リ
    セプターに関する第２リガンドに共有結合した両親媒性
    化合物からなり； （ｃ）第２リガンドへの結合を通して結合したリセプタ
    ーに上記粒子を結合させ；そして （ｄ）結合粒子のコアに含まれる水不溶性染料手段によ
    りリセプターを検出する工程からなる、リガンドに関す
    るリセプターの検出法。
  4. 【請求項４】 結合したリセプターが、 （ａ）ポリジメチルジフェニルシロキサンおよびフルオ
    ロシリコーンからなる群から選択されるコア；および （ｂ）ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロ
    ール、ホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの
    ジステアロイル誘導体からなる群から選択されるホスホ
    リピッドからなる層；を含む粒子に結合している、請求
    項３記載の方法。
  5. 【請求項５】（ａ）微小球粒子からなるトレーサーと、
    第１リガンドを含む疑いのあるサンプルを混合するが、
    その際、上記粒子は液体シリコーンコアからなり、該コ
    アの表面上の層が、リガンドに関するリセプターへの結
    合に関して第１リガンドと競合する第２リガンドに共有
    結合した両親媒性化合物からなり； （ｂ）混合された第１リガンドおよび第２リガンドを、
    リセプターへの結合に関して競合させ； （ｃ）粒子のコア中に含まれた水不溶性染料手段によ
    り、結合した第２リガンドを検出してサンプル中の第１
    リガンドを検出する；工程からなる、第１リガンドの検
    出法。
  6. 【請求項６】（ａ）ポリジメチルジフェニルシロキサン
    およびフルオロシリコーンからなる群から選択されるシ
    リコーン；および （ｂ）ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロ
    ール、ホスファチジルエタノールアミンおよびそれらの
    ジステアロイル誘導体からなる群から選択されるホスホ
    リピッドからなる層；を含む粒子からなるトレーサー組
    成物とサンプルを混合する、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】（ａ）水混和性有機溶剤からなる溶液、液
    体シリコーン化合物、およびリガンドに共有カップリン
    グするための官能基を有する両親媒性化合物を調製し； （ｂ）該溶剤溶液を水性媒体と混合して、液体コアから
    なる微小球粒子を分散相として有する水中油形微小エマ
    ルジョンを形成させるが、その際、コアはシリコーン化
    合物からなり、そしてコアの表面上の層は両親媒性化合
    物からなり； （ｃ）リガンドを該両親媒性化合物と共有カップリング
    させ；そして （ｄ）リガンドにカップリングした微小球粒子を分離す
    る工程からなる、微小球粒子の製造法。
  8. 【請求項８】 水不溶性染料からなる上記溶剤溶液を水
    性媒体と混合する、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】（ａ）水混和性有機溶剤、液体シリコーン
    化合物、および両親媒性リガンドからなる溶液を調製
    し、そして （ｂ）該溶剤溶液を水性媒体と混合して、液体シリコー
    ンコアからなる微小球粒子を分散相として有する水中油
    形微小エマルジョンを形成させるが、その際、コアの表
    面上の層は両親媒性リガンドからなる；工程からなる、
    官能基を有する微小球粒子の製造法。
  10. 【請求項１０】 水不溶性染料からなる上記溶剤溶液を
    水性媒体と混合する、請求項９記載の方法。
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