WO2006073073A1

WO2006073073A1 - 安定化されたオルニチントランスカルバミラーゼ及びそれを用いたオルニチントランスカルバミラーゼの免疫学的測定法

Info

Publication number: WO2006073073A1
Application number: PCT/JP2005/023722
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Murayama; Makoto Igarashi
Original assignee: Yamasa Corporation
Priority date: 2005-01-07
Filing date: 2005-12-26
Publication date: 2006-07-13
Also published as: JPWO2006073073A1; US20080118931A1; JP4824581B2

Abstract

本発明は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase:ＯＴＣ）の安定化法及びＯＴＣの免疫学的測定法を提供するものであって、５．５～７．０のｐＨを有する安定化されたＯＴＣ溶液を提供し、さらには、また、ＯＴＣ抗原と抗ＯＴＣ抗体との反応をｐＨ７．５以上、１０．５以下の条件下で行う、ＯＴＣの免疫学的測定法、もしくはＯＴＣ抗原と抗ＯＴＣ抗体との反応を、プロクリンの存在下、ｐＨ６．５以上、１０．５以下の条件下で行う、ＯＴＣの免疫学的測定法を提供する。このような本発明の方法を用いることにより、サンプル中のＯＴＣ濃度を短時間で高感度に測定することが可能となり、肝臓病の診断あるいは発症後経過観察等に有用である。

Description

明細書

安定化されたオル二チントランス力ルバミラーゼ及びそれを用いたオル二チントランス力ルバミラーゼの免疫学的測定法

技術分野

[0001] 本発明は、安定化されたオノレニチントランス力ルバミラーゼ、それを用いたオルニチントランス力ルバミラーゼの免疫学的測定法、及び当該測定に用いるキットに関するものである。

背景技術

[0002] オル二チントランス力ルバミラーゼ（ornithine transcarbamylase:OTC)は、オルニチンカノレバモイノレトランスフェラーゼ (ornithine carbamoyltransferase:〇CT)もしくはシトルリンホスホリラ一ゼ（citmlline phosphorylase)とも称され、臨床検查上、肝臓病の診断あるいは発症後の経過観察等に有用な酵素である。

[0003] このような〇TCを免疫学的に測定する場合、標準物質として用いる OTCの安定性の問題と十分な測定感度を得るために長時間の抗原抗体反応を必要とするという測定上の問題の 2つの重大な問題が指摘されていた。

[0004] すなわち、分離精製されたネイティブ OTCあるいは DNA組換え手法により調製されたリコンビナント〇TCは、非常に不安定な酵素であり、その安定化のために 50% 程度のグリセロールを共存させるなどの処理が必須とされていた（BioChem. J. 1997; 322:625- 631、 J. Biol. Chem. 1978;253:3939-3944) ₀しかし、グリセロールだけでは O TCを長期間安定化することは難しいという問題があった。また、 BSAや動物血清などの蛋白質成分を加えることで、酵素を安定化させることは一般によく知られていることではある力 OTCに関しては、蛋白質成分だけでは長期の安定化を達成することはできなかった。

[0005] また、 OTCを免疫学的に測定する際、従来、生体内と同じ中性付近の pHである p H7. 4の条件で測定されていたが（Enzyme Protein 1994_95;48: 10_17、 Enzyme Pro tein 1994-95;48: 18-26)、この pH条件では一晩の一次反応、 3時間の二次反応、さらに 2. 5時間の三次反応時間を必要とし、結果として検查結果が得られるまでに 2日間を要していた。

[0006] さらに、上記問題以外にも、従来法では血清を希釈せずに使用しており、血清成分による影響などが懸念されるなど、従来法では解決すべき課題を数多く有していた。

[0007] 非特許文献 1 : BioChem.J., 1997;322:625-631

非特許文献 2 : J.Biol.Chem., 1978;253:3939-3944

非特許文献 3： Enzyme Protein, 1994_95;48： 10-17

非特許文献 4： Enzyme Protein, 1994-95;48： 18-26

発明の開示

[0008] 一般に、測定系の感度が悪いと、反応時間を長くする必要が生じるほか、ばらつきが大きくなるなどの問題があり、信頼性のある正確な安定した結果が得られない。また、激症肝炎などの急性疾患の場合には、迅速に治療方針を決定するため、検査結果を少しでも早く知る必要があり、測定に要する時間は短いほど好ましいとされている。し力しながら、従来の OTCの免疫学的測定法は、これらの要件を満足しうるものではなぐ短時間で、高感度に、正確に、かつ安定して OTCを測定する方法の開発が切望されていた。

[0009] また、標準物質として OTCを用いる場合、〇TC自体の安定性が悪いと長期の保存ができなくなり、結果としてキットの有効期限が極端に短くなつたり、保存温度を— 40 °C以下にするなどの処置が必要となり、使レ、勝手の悪レ、キットとならざるを得ないとレ、う問題を有していた。

[0010] 本発明者は、従来の OTCの免疫学的測定法の欠点を解決するために鋭意研究を重ねた結果、以下のことを見出した。

[0011] (l) OTCを保存する緩衝液の pHを酸性、具体的には 5. 5〜7. 0にすることにより、 OTCの安定性が格段に向上すること、

(2) OTCの保存液中に、グリセロール、蛋白質成分、基質 (または生成物及びその類似体）の少なくとも 2種類を共存させることにより、 OTCの安定性がさらに向上すること、

[0012] (3) OTCを免疫学的に測定する際、反応系の pHを 7· 5〜10· 5にすることにより、〇 TCと抗体との反応性を向上すること、および (4)反応系にプロクリン (商品名）を共存させた場合、上述の塩基性の pH範囲における OTCと抗体の反応性をさらに向上させ、さらに、中性 pH領域における OTCの免疫学的反応性が増大し、 pH6. 5以上の範囲でも十分な感度を得られる様になること

[0013] したがって、このような知見を基に完成された本願発明は、以下の通りのものである

[0014] [1] 5. 5〜7. 0の pHを有する安定化された OTC溶液。

[2]さらに、グリセロール、蛋白質、 OTCの基質又は反応生成物もしくはその類似体を含む、 [1]記載の OTC溶液。

[0015] [3] OTC溶液が液状で、蛋白質がゥシ由来の蛋白質である、 [1]記載の〇TC溶液。

[4] OTC溶液が凍結状態で、蛋白質が乳由来の蛋白質である、 [1]記載の〇TC溶液。

[0016] [5] OTC溶液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥 OTCであって、凍結乾燥の際に、安定化剤として蛋白質および糖を添加して得られたものである、安定化された凍結乾燥 OTC。

[6]凍結乾燥前の OTC溶液の pHが 5· 5〜7. 0である、 [5]記載の凍結乾燥〇TC。

[0017] [7]蛋白質がゥシ由来の蛋白質で、糖が単糖又は二糖である、 [5]記載の凍結乾燥 OTC。

[8] OTC抗原と抗 OTC抗体との反応を pH7. 5以上、 10. 5以下の条件下で行う、

OTCの免疫学的測定法。

[0018] [9]抗原抗体の反応系にプロクリン（商品名）を共存させる、 [8]記載の方法。

[10] OTC抗原と抗〇TC抗体との反応を、プロクリンの存在下、 pH6. 5以上、 10. 5 以下の条件下で行う、〇TCの免疫学的測定法。

[0019] [11] [8]〜[： 10]いずれかに記載の方法で OTCを測定するための〇TC検出用キッ卜。

[12]標準物質として [1]〜[7]いずれかに記載の OTC溶液又は凍結乾燥 OTCを用いる、 [11]記載のキット。

[0020] 本願発明の方法は、後述する実施例からも明らかなように、サンプル中の OTC濃度を高感度に短時間で測定することを初めて可能とした。また、 OTCの保存期間を延長させることで、本発明を用いた測定用キットを安定して供給することを可能にした

。従って、本発明の方法を用いることにより、サンプル中の OTC濃度を短時間で高感度に、正確に、かつ安定して定量、測定することが可能となり、肝臓病の診断あるいは発症後経過観察等に有用である。

図面の簡単な説明

[0021] [図 1]図 1は、リコンビナント OTCの 4°C、 15日間の保存安定性の結果を示したものである。

[図 2]図 2は、 4°C、 10日間の保存安定性に及ぼすオノレニチン及びシトルリン添カロの影響を示したものである。

[図 3]図 3は、 OTCの ELISA法における標準曲線の一例を示したものである。

[図 4]図 4は、 ELISAにおけるリコンビナント OTCとネイティブ OTCの抗体との反応性に及ぼす pH (6· 7)の影響を示したものである。

[図 5]図 5は、 ELISAにおけるリコンビナント OTCとネイティブ OTCの抗体との反応性に及ぼす pH (9· 4)の影響を示したものである。

[図 6]図 6は、プロクリン無添カ卩におけるネイティブ〇TCの抗体との反応性に及ぼす p Hの影響を示したものである。

[図 7]図 7は、プロクリン添加におけるネイティブ〇TCの抗体との反応性に及ぼす pH の影響を示したものである。

[図 8]図 8は、抗体との反応性に及ぼすプロクリン濃度の影響を示したものである。

[図 9]図 9は、酵素活性測定法と ELISA法の相関を示したものである。

発明を実施するための最良の形態

[0022] (l) OTCの安定化

本発明で使用する OTCは、哺乳動物の肝細胞由来の OTCであれば、いずれのものも使用可能である。

その中で、ヒト肝細胞由来の OTCとしては、たとえば、 BioChain社など力ら購入可能なヒト肝臓組織の抽出物、あるいは当該抽出物から常法 (J. Biol. Chem., 258(18): 6464-6469 (1977), Arch. Biochem. Biophys., 309(2):293_299 (1994))により単離精製したものをネイティブ OTCとして使用することができる。

[0023] また、ヒト肝細胞由来の OTCは、既にクローニングされ、その塩基配列は公知となつていることから、クローン化された OTC遺伝子を用いて常法により大腸菌などを宿主として大量生産させ、当該微生物の菌体より〇TCを単離精製し、これをリコンビナント〇TCとして使用してもよい（Science,224:1068-1074(1984)J.BioChem.，103:302- 3 08(1988), BioChem.J.322:625-631(1997)) ₀

[0024] 本発明の安定化された〇TC溶液は、 5. 5〜7. 0の pHを有していることを特徴とする。このような OTC溶解は、上記 pHを有する水、好ましくはリン酸緩衝液、 MES—水酸化ナトリウム緩衝液などのグッドの緩衝液、クェン酸—リン酸ナトリウム緩衝液、タエン酸—クェン酸ナトリウム緩衝液、酢酸—酢酸ナトリウム緩衝液、 13， β '—ジメチルダルタル酸—水酸化ナトリウム緩衝液、力コジル酸ナトリウム—塩酸緩衝液、マレイン酸ナトリウム一水酸化ナトリウム緩衝液、イミダゾール一塩酸緩衝液等の緩衝液に〇TC を lng/ml lOO ^ g/ml程度の濃度になるように溶解することで調製することができる。

[0025] OTC溶液には、安定性を更に向上させる目的で、グリセロール、蛋白質、糖類、 O TCの基質又は反応生成物もしくはその類似体等の安定化剤を添加してもかまわなレ、。

安定化剤としてのグリセロールは、試薬として販売されているもので力まわないが、精製度高レ、ものが好ましい。

[0026] 蛋白質としては、酵素の安定化剤として汎用されているものでよぐ好ましくはゥシ血液由来の蛋白質（たとえば、 BSA、 FCS、ゥシ血清等）や乳由来の蛋白質（スキムミルク、カゼイン、ブロックエース（商品名）等）を例示することができる。

糖類としては、グノレコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース等の単糖、シュクロース、ラタトース、マルトース、トレハロース等の二糖を使用することができる。

[0027] また、 OTCの基質又は反応生成物としては、オル二チン及びシトルリンを挙げることができる。また、それらの類似体（アナログ）としては、たとえばノルパリン (基質アナログ）、 N ^S― (フォスフォンァセチル）—L—オル二チン、アルギニンリン酸等を使用すること力 Sできる。 [0028] このような安定化剤は、 1種でも力まわなレ、が、好ましくは 2種以上を併用することで OTCのより長時間安定化することが可能である。安定化剤の組み合わせは、使用濃度などは、特に制限されるものではなぐ小規模試験にて適宜決定すればよい。また、アジィ匕ナトリウムなどの防腐剤を併用してもかまわない。

[0029] 本発明の〇TCは、上述した液状のみならず、凍結状態もしくは凍結乾燥状態であつてもかまわない。

凍結状態の〇TCの調製は、凍結による変性を防止するため、安定化剤、特に蛋白質、好ましくは乳由来の蛋白質 (スキムミルク、カゼイン、ブロックエース等）を凍結前に添加後、凍結処理することにより実施できる。

また、凍結乾燥 OTCの調製は、 5. 5〜7. 0の pHを有する〇TC溶解を調製後、好ましくは蛋白質と糖類の 2種を添加し、常法により凍結乾燥処理することで実施できる

[0030] (2)免疫学的測定法およびキット

本発明の免疫学的測定法は、プロクリン非存在下の条件においては、反応系の pH を 7. 5-10. 5、好ましくは 8. 2-10. 2にすることを特徴とし、プロクリン存在下の条件においては、反応系の pHを 6· 5〜： 10. 5、好ましくは 7. 0〜： 10. 2にすることを特徴とする。このような pH条件を採用することで、後述実施例に示すように、 OTCと抗体との反応性が向上し、短時間に、正確にサンプノレ中の OTCを定量することができる。

[0031] 反応に添加するプロクリンは、臨床診断用防腐剤として汎用されており、プロクリン 1 50、同 200、同 300、同 950の 4種力 S市販されてレ、る。レ、ずれもイソチアゾロン（5—クロロ _ 2_メチル _4_イソチアゾリン一 3_オン及び/又は 2_メチル _4_イソチアゾリン _ 3 _オン)を有効成分とし、防腐剤として使用濃度は 6〜： 15ppm (プロクリン 1 50、同 200、同 300)又 fま 48〜95ppm (プロクリン 950)カ推奨されてレヽる。本発明においても、後述実施例に示すように、この推奨濃度の範囲あるいはそれ以上の濃度で使用すればよい。

[0032] 本発明の免疫学的測定法及びキットは、上述の pH条件において OTC抗原と抗体との反応を行わせる以外は、公知の方法に準じて実施あるいは調製すればよい。すなわち、被検サンプノレとしては、肝臓疾患の疑いがある患者の血清サンプル、血漿サンプノレ等が例示されるが、特にこれに限定されない。

[0033] 本発明で使用する抗体は、 OTCに反応する抗体であればよぐモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもかまわなレ、。また、このような抗体は、抗体自体あるいはそれらの活性フラグメン KF (ab') 、 Fab'など〕であってもよい。

2

[0034] ここで、〇TCに反応する抗体とは、ネイティブ〇TCあるいはリコンビナント〇TCの両方に結合できる抗体を意味し、特定の特性を有する抗体に限定されなレ、。

[0035] このような〇TCに反応する抗体は、文献公知の方法により作製することができる。

たとえば、リコンビナント〇TCを抗原とし、常法に従って OTCに反応するポリクローナル抗体あるいはモノクローナル抗体をスクリーニングすることで調製することができる。

[0036] このような抗体を用いた免疫測定法は、上述したように、 pH条件を除き、従来行われてレ、る方法、手順など何等変わるものではなレ、。

[0037] すなわち、試料中の OTCを捕獲（トラップ)するための抗体としては、担体に結合した固相抗体を例示することができる。

固相抗体を調製する際に使用する担体としては、通常使用されているもの、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、スチレンージビニルベンゼン共重合体、スチレン無水マレイン酸共重合体、ナイロン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリプロピレン、ポリメチレンメタタリレートなどの合成有機高分子化合物、デキストラン誘導体 (セフアデックスなど）、ァガロースゲル (セファロース、バイォゲルなど）、セルロース（ペーパーディスク、濾紙など）などの多糖類、ガラス、シリカゲル、シリコーンなどの無機高分子化合物を例示することができ、これらはァミノ基、カルボキシル基、カルボニル基、水酸基、スルヒドリル基などの官能基が導入されたものであってもよい。

[0038] 担体の形状は、平板状（マイクロタイタープレート、ディスクなど）、粒子状（ビーズなど）、管状 (試験管など）、繊維状、膜状、微粒子状 (ラテックス粒子など）、カプセル状、小胞体状などいずれの形状であってもよぐ測定法に応じて好適な形状の担体を適宜選択すればよい。

担体と抗体の結合は、物理的吸着法、イオン結合法、共有結合法、包括法など公知の方法〔たとえば、「固定化酵素」（千畑一郎編、昭和 50年 3月 20日、（株)講談社発行)参照〕を採用することができ、とりわけ、物理的吸着法は簡便である点で好ましレ、。また、上記結合は直接行ってもよぐ両物質の間に他の物質を介して行ってもよレ、。

このようにして得られた固相試薬は、非特異的結合を抑制するため、ゼラチン、 BS A、スキムミルクなどの通常のブロッキング剤を用いてブロッキング処理を施してもよい

[0039] また、トラップされた〇TCを検出するための抗体としては、標識剤で標識された抗体を例示することができる。

標識剤としては、放射性同位体 (たとえば³² P、 ³H、 "C、 ¹²⁵1など）、酵素 (たとえば β—ガラタトシダーゼ、ペルォキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース _ 6 _ リン酸デヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、グルコースォキシダーゼ、乳酸ォキシダーゼ、アルコールォキシダーゼ、モノアミンォキシダーゼなど）、補酵素 ·補欠分子族（たとえば、 FAD、 FMN、 ATP、ビォチン、ヘムなど）、フルォレセイン誘導体（たとえば、フノレォレセインイソチオシァネート、フルォレセインチオフルバミノレなど）、ローダミン誘導体（たとえば、テトラメチルローダミン Bイソチオシァネートなど）、ゥンベリフエロンおよび 1ーァニリノ 8—ナフタレンスルホン酸などの蛍光色素、ルミノール誘導体〔たとえば、ノレミノール、イソルミノール、 N— (6—ァミノへキシル） N ェチルイソルミノーノレなど〕などを例示することができる。

抗体と標識剤との結合は、成書〔たとえば、「続生化学実験講座 5免疫生化学研究法」（株)東京化学同人、（1986年発行)第 102〜112頁〕に記載されているような公知の方法から適宜選択して実施すればよい。

[0040] このような固相抗体と標識抗体を用いての測定手順は、通常の免疫測定法の手順をそのまま採用すればよい。すなわち、固相抗体と被検試料を反応させ、必要により BF分離後、さらに標識抗体を反応させる (ツーステップ法)か、固相抗体、被検試料及び標識抗体を同時に反応させ (ワンステップ法）、以後のそれ自体公知の方法により試料中の〇TCを検出または定量することができる。

[0041] なお、免疫測定法の詳細に付いては、たとえば以下の文献を参照すればよい。 (1)入江寛編「続ラジオィムノアツセィ」（(株)講談社、昭和 54年 5月 1日発行）

(2)石) 11栄治ら編「酵素免疫測定法」（第 2版） ( (株）医学書院、 1982年 12月 15日発行）

(3)臨床病理臨時増刊特集第 53号「臨床検査のためのィムノアツセィ—技術と応用一」（臨床病理刊行会、 1983年発行）

(4)「バイオテクノロジー事典」（（株）シーエムシー、 1986年 10月 9日発行）

[0042] (5)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.70」 (Immunochemical techniques (Part A))

(6)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.73」（Immunochemical techniques (Part B))

(7)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.74j (Immunochemical techniques (Part C))

(8)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.84」（Immunochemical techniques (Part D: selected Immunoassay))

(9)「Methods in ENZYMOLOGY Vol.92」（Immunochemical techniques (Part E:

Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))

[(5)〜(9)はアカデミックプレス社発行]

[0043] 上記免疫学的測定に使用するキットは、 pH5. 5〜7. 0の緩衝液中で安定化された OTC (またはその凍結乾燥品）をキットの構成試薬 (標準物質)とし、抗原抗体反応を ρΗ7· 5〜： 10. 5 (プロクリン存在下においては ρΗを 6· 5〜： 10. 5)の条件下で行わせることを特徴とするものであり、キットの他の構成試薬は、採用した測定法により必要な試薬を適宜添付すればよい。具体的には、たとえば、 ELISA法を実施するためのキットとしては、以下のような構成試薬からなるものを例示することができる。

[0044] (1)濃度を規定した OTC標準物質

(2)抗〇TC抗体固相化プレート

(3)サンプル希釈液

(4)ペルォキシダーゼ標識抗 OTC抗体

(5)標識抗体希釈液

(5)洗浄液

(6)発色液

(7)発色停止液 [0045] 上記キットにおいて、濃度を規定した OTC標準物質は、 pH5. 5〜7. 0の緩衝液中に保存するか、またはこの緩衝液で溶解しておいてから凍結乾燥してもよい。また、例えば、サンプル希釈液や標識抗体希釈液を緩衝能力の強い緩衝液として、最終的なアツセィ系の pHを 7. 5〜： 10. 5に調節できるように構成する。

実施例

[0046] 以下、本発明を実施例をあげて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではなレ、。なお、 DNAの調製、制限酵素による切断、 T4DNAリガ一ゼによる DNA連結、並びに大腸菌の形質転換法は全て「Molecular CloningJ (Mani atisb編、し old Spring Harbor Laboratory, Cold bprmg Haroor,New YorK(1982)) に従って行った。制限酵素、 LATaqDNAポリメラーゼ、 T4DNAリガーゼはタカラバィォ (株)より入手した。

[0047] 実施例 l : OTCの安定化

(l) OTC cDNAの調製

ヒト OTCcDNAとしては公知の組み換え DNA手法を用いて肝臓力調製した mR NAより人為的に合成した OTCcDNAを用いた（Science, 224:1068-1074(1984)、 J.Bi oChem.，103:302-308(1988)、 BioChem.J.322:625- 631(1997))。すなわち、ヒト肝臓由来 cDNAライブラリー（クローンテック社、タカラバイオ社力も購入）を添付されているマニュアルに従って、組換えファージを大腸菌へ感染させて増幅させた後に、プロテァーゼ K処理（0. 2mg/ml、 37°C、 60分間）及びフエノール処理により除蛋白を行レ、、エタノール沈殿により組換えファージ DNAを沈殿させた。沈殿させた DNAを滅菌水へ溶解して組み換えファージ溶液とした。また、 OTCcDNAを PCR法により cD NAライブラリーから増幅.単離するために、以下に示す 2種類のプライマー DNAを合成した。

[0048] OTC蛋白は未成熟蛋白の N末端に 32アミノ酸残基からなるミトコンドリア移行シグナルが有る事が報告されているため、この配列を除去するために下記のセンスプライマー（A)では成熟蛋白の N末端のアミノ酸である 33番目のァスパラギンの前に発現ベクタ一 PQE31へクロ一ン化出来るように BamHI部位を設けた。アンチセンスプライマー（B)では同様に、 OTC蛋白の C末端配列及び TGAストップコドンの 5'側に pQE 31へクロ一ンィ匕するために Xbal部位を設けた。ヒト肝臓由来 cDNAライブラリーより調製したファージ DNA溶液を铸型として、上記 2つのプライマーを用いて PCR法によりヒト肝臓由来 OTCcDNA (Submitted to NCBI, Accession No. K02100)を増幅した。

[0049] プライマー（A)： 5'— CAA CCG GAT CCA AAT AAA GTG CAG CTG AAG— 3，プライマー（B)： 5，— AAC TCT AGA TCA AAA TTT AGG CTT CTG GAG— 3 '

[0050] PCRによる OTCcDNAの増幅は、 LATagDNAPolymerase (タカラバイオ社より購入）を用レヽ、 l OxLAPCR緩衝液（5 μ 1)、 25mM MgCl ( 5 μ 1)、 dNTP (8 μ 1)、

2

プライマー DNA (Α)および（B) (それぞれ l Opmol)および DNA試料（約 0. 5 μ g) を加えて最終容量を 50 μ ΐにし、タカラバイオ社製 DNA Thermal Cycler pers onalを用いて、熱変性（94°C、 1分）、アニーリング（59°C、 1分）、伸長反応（72°C、 2 分）のステップを 30回繰り返すことにより行った。

[0051] 遺伝子増幅後、 DNAを文献（Molecular Cloning)の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、 lkb相当の DNA断片を精製した。該 DNAを制限酵素 Bam HI— Xbalで切断し、同じく制限酵素 BamHI— Xbalで消化したプラスミド pUC 1 18 ( タカラバイオ株式会社より購入)へ一度クローン化した。定法に従ってクローン化した DNA断片の塩基配列を決定した。得られた塩基配歹 IJは Akira Hataらが報告してレ、る OTCcDNAの塩基配列（J.BioChem. , 103 :302-308(1988))と完全に一致したため、これが OTC遺伝子である事を確認した。さらにこれを BamHI— Sailで切断し、同じく BamHI— Sailで切断した pQE31 (Qiagen社より購入）と T4DNAリガーゼを用いて連結し、 pQE31 : OTCプラスミドを構築した。連結反応液を用いて大腸菌 K1 2¾[M 109菌（タカラバイオ株式会社より購入）を形質転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミド PQE31：〇TCを単離した。

[0052] H. Morizonoらは大腸菌においてヒト〇TC蛋白を発現させる際に GroELと Gro ES遺伝子を共発現させる事により、大腸菌細胞内でのインクルージョンボディー形成を抑制し、〇TC蛋白が高い活性で回収される事を報告している（Biochem. J. (199 7) 322) ₀したがって、大腸菌染色体 DNAを定法に従って調製し、これを錡型として、以下に示す 2種類のプライマー DNAを常法に従って合成し、 PCR法により大腸菌 G roESL遺伝子（Submitted to NCBI、 Accession No.AAC77102_3)を増幅した。

[0053] 以下に示すプライマー（C) (センスプライマー）の合成は、 GroES遺伝子の上流でプロモーターを含む領域のさらに上流の配列を用い、プライマー（D) (アンチセンスプライマー）の配列は、 GroEL遺伝子の終止コドン下流の領域に相補的な配列を用いた。したがって、プライマー（C)とプライマー（D)を用いて大腸菌染色体 DNAより増幅した断片は、 GroESと GroELの両遺伝子の暗号化領域およびそれらのプロモ一ターを含む 2317塩基を含む。

[0054] プラィマー（〇）：5'—。八丁 000丁丁0八丁0丁。。〇八丁丁0 —3'

プライマー（D) : 5，_AAC CCC CAG ACA TTT CTG CC _ 3，

[0055] 遺伝子増幅後、 DNAを文献（Molecular Cloning)の方法に従ってァガロースゲル電気泳動により分離し、約 2. 3kb相当の DNA断片を精製した。該 DNA断片を一度 pUCl 18プラスミド (タカラバイオ株式会社より購入）へクローン化した後に制限酵素 Hindlll Smalで切断し、同じく制限酵素 BamHI— EcoRVで消化したプラスミド ACYC184 (New England Biolabs社より購入）と T4DNAリガーゼを用いて連結し、 pACYC : GroEプラスミドを構築した。連結反応液を用いて大腸菌 JM109菌を形質転換し、得られたクロラムフエ二コール耐性形質転換株よりプラスミド pACYC： Gro Eを単離 '精製した。

[0056] 発現ベクター pQE31は、開始コドンに続いて 6個のヒスチジンのコドンが存在し、発現させる組換え蛋白の N末端に 6個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）が付加される。このヒスチジンタグはニッケルや亜鉛の 2価イオンに吸着する事が知られてレ、るため、組み換え蛋白の精製方法として利用されている。ヒスチジンタグが N末端に付加された OTC蛋白の抽出'精製のため、プラスミド pQE31： OTCと pACYC： GroEを大腸菌 J M109株へ形質転換し、 JM109/pQE31 : OTC , pACYC： GroE形質転換株を造成した。

[0057] この形質転換株をアンピシリン lOOmgZL、クロラムフヱニコール lOmgZLの割合で添加した 20mlの LB培地に植菌し、 37°Cでー晚前培養した後、 500mlの LB培地（アンピシリン lOOmgZL、クロラムフヱニコール lOmgZL)に全量植継ぎしてさらに 37°Cで振とう培養した。培養を続けて OD600が 1. 0になった時点で、 IPTG を最終濃度が 0. OlmMになるように添加し、 25°Cで一晩振とう培養した。培養終了後に遠心して菌体を分離後、 50mlの抽出緩衝液（50mM Tris— HC1 pH8. 0、 5 OmM NaCl、 ImM EDTA、 ImM PMSF, 2 μ g/mlロイぺプチン、 2 μ g/ml ぺプスタチン、 4 μ g/mlァプロチュン）に懸濁後、氷冷しながら超音波破砕した。この超音波処理した細胞懸濁液を遠心して、残渣を分離後、上清液に最終的に 20% になる様に Glycerolを添加した。

[0058] 蛋白濃度を測定して約 10mg量の調製したサンプルを Histrap HPカラム 5ml (ァマシャムバイオサイエンス社）に供し、 20mlの PBS, 20%Glycerolおよび 10mlの 8 OmM imidazole, PBS、 20%Glycerolによりカラムを洗浄して共雑蛋白を溶出させた後に、 10mlの 300mM imidazole, PBS、 20%Glycerolにより OTC蛋白を溶出 '精製した。

[0059] 精製 OTC蛋白は SDS— PAGEにより分子量約 3万 6千でほぼ単一のバンドとして検出された。精製 OTC蛋白は OTC酵素活性を有しており、ウェスタンブロッテイングにより後述する抗 OTCモノクローナル抗体との反応性が確認された。精製蛋白の濃度はローリー法によりゥシ血清アルブミンを標準物質として定量した。

[0060] ヒスチジンタグが免疫反応に影響を与えないことを確認するため、ヒスチジンタグを持たないリコンビナント OTCの調製も上記と同様に行った。すなわち、以下に示す 2 種類のプライマーを用いて増幅した DNA断片を pT7Bベクターに NcoI— BamHI断片として連結し、 JM109株に形質転換して発現させた。なお、得られた OTCは菌体抽出物を精製せずにそのまま用いた。

[0061] プライマー（E) : 5'— CAA CCC ATG GGA AAT AAA GTG CAG CTG AAG —3' プライマー（F)： 5' -AAC TCT AGA TCA AAA TTT AGG CTT CTG GAG - 3'

[0062] このように得られたリコンビナント〇TC、及び肝臓由来のネイティブ OTCを用レ、、以下の安定化に影響する要因を検討した。なお、肝臓由来のネイティブヒト OTCとしては、ヒト肝臓組織の抽出物（BioChain社)を用いた。

[0063] (2) OTCの安定化に影響する要因

(2— 1) ρΗの影響

OTCの水溶液中における安定性を検討した。その結果、図 1に示すように、 pH5. 0以下及び pH7. 5以上の条件下においては、 4°C、 15日間の保存で既にその 10% 以上の免疫活性が消失したのに対し、 pH5. 5〜7. 0の範囲においては 15日間の期間においてその活性を保持できることを見いだした。

[0064] (2— 2)オル二チン、シトルリンの影響

OTC水溶液（pH6. 8)に基質であるオル二チン、あるいは生成物であるシトルリンを添加したところ、図 2に示すように、添加しない場合と比べ、安定化することが明らかとなつた。また、基質アナログであるノルパリンなどでも同様に安定化することが確認された。

[0065] (2— 3)防腐剤の影響

OTC水溶液にアジィ匕ナトリウムを添加したところ、アジ化ナトリウム添カ卩による反応十生の影響がみられなかった。

[0066] (2— 4)グリセロール、蛋白質、オル二チン（またはシトルリン）の影響

OTC溶液の長期保存安定性を検討した結果、 4°C、 10日間の保存安定性の検討の結果、グリセロール、 BSA等の蛋白質、オル二チン、シトルリンのいずれ力 1つを用いた場合には、添加しない場合に比べて安定化した力 6ヶ月間の長期の安定性を検討したところ、その安定化能は必ずしも十分ではなかった。

[0067] そこで、これらの内、二種以上を組み合わせ、溶液状態、凍結状態、凍結乾燥状態の各態様で OTCの安定化を検討した。その結果、下記表 1に示すように、 10°Cもしくは— 20°Cでの保存条件下、 BSA単独の場合（No. 1)の OTCの活性保持率はそれぞれ 78%であり、グリセロール単独の場合 (No. 2)の活性保持率は、高濃度ではその活性を十分に保持したが、低濃度（特に 100ng/ml以下)では著しく活性が低下した。

[0068] これに対し、 0. l%(w/v)BSAと 10%(w/v)グリセロールを共存させた場合（No. 3) の活性保持率は、それぞれ 86%と 92%に改善された。さらに、 BSA、グリセロール及びオノレニチンを共存させた場合（No. 4)の活性保持率は、それぞれ 88%と 96% により改善された。また、 No. 3と No. 5の結果より、 BSAは溶液状態での安定化に適し、スキムミルクは凍結状態における安定化に適していることが判明した。なお、表 1には例示しなかった力蛋白質としてはゥシ血清、オル二チンの代わりにシトルリン、カレパリン (基質アナログ)を添加して同様の結果が得られ、安定化剤として使用できることを確認、した。

[0069] 一方、凍結乾燥状態における安定性は、表 1の No. 6及び No. 7に示すように、 BS Aとシユークロースを併用することで、安定性改善が確認された。

(表 1)リコンビナント OTC長期安定性 (6ヶ月保存)の検討

[0070] [表 1]

[0071] 実施例 2 : OTCの免疫学的測定

(1)抗 OTCモノクローナル抗体の作製

リコンビナント OTC50 μ gをフロインド完全アジュバンドと共に 6〜8週齢の BALB

/cマウスに 2〜3週間おきに 4回腹腔内に投与した。 4回免疫後、 2週間目に部分採血し、 OTCに対する抗体価を次の ELISA法にて調べた。

[0072] すなわち、リコンビナントヒト〇TCを PBSで 1 μ g/mlに希釈し、フレキシブルアツセィプレート（ファルコン社）に 50 _β 1ずつ分注し、 4°Cでー晚静置した。 PBSで 3回洗浄後、 0. 5%スキムミルク溶液を 200 μ ΐずつ分注し、室温で 1時間静置した。スキムミルク溶液を除去し、 1 %BSA含有 PBSで段階的に希釈したマウスの血清を 50 μ 1ずつ分注し、室温で 1時間静置した。 PBSで 3回洗浄後、 HRP標識ャギ抗マウス IgG 抗体（ザィメッド社）を 1%BSA含有 PBSで 1Z1000に希釈した溶液を 50 μ 1ずつ分注し、室温で 1時間静置した。 PBSで 3回洗浄後、基質溶液（0. 3mM 3, 3'， 5, 5' —テトラメチルベンジジン二塩酸塩、 0. 005%過酸化水素水含有 0. 2Mクェン酸緩衝液、 pH3. 8)を 100 μ ΐずつ分注し、室温で 5分間静置して発色させた。 1N硫酸を 100 μ 1ずつ加えて反応を停止し、マイクロプレートフォトメーターを用いて 450nmにおける吸光度を測定した。

[0073] 生理食塩水に溶解したリコンビナント〇TC 10 μ gをマウスに静脈投与し、最終免疫を行った。最終免疫から 3日後にマウスの脾臓を摘出し、この脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞 Sp2/0— Agl4 (Sp2) (ATCC CRL— 1581)とをケラーとミルシュタインの方法に従って細胞融合した。すなわち、脾臓細胞と骨髄腫を 10 : 1で混合後、遠心分離して得たペレットに 50%ポリエチレングリコール含有 RPMI1640溶液 lmlを徐々に加えて細胞を融合した。さらにこれに RPMI1640培地を加えて 10mlとし、遠心分離して得たペレットを 10%ゥシ胎児血清（FCS)含有 RPMI1640培地に Sp2として 3 X 10⁴個/ 100 μ ΐとなるように懸濁させ、 96ウェルマイクロタイタ一プレート 10枚に各ゥエル 100 a 1ずつ分注した。

[0074] 1日後、 HAT培地を 100 μ 1添加し、その 3〜4日おきに培地の半分量を新しい ΗΑ Τ培地で交換した。融合後 7日目に培養上清をサンプリングし、上記 ELISA法のマウス血清の代わりに培養上清を用いてスクリーニングを行った。〇TCに対する抗体陽性ゥエルを検索し、限界希釈法によりクローニングを行レ、、 2回の細胞融合により、 O TCに対する抗体産生ハイブリドーマを合計 22クローン確立し、ガラスバイアルに分注後、液体窒素中に凍結保存した。

[0075] 確立した各ハイプリドーマを培養し、あらカ^めプリスタンを投与してあるマウスの腹腔内に 1匹当たり 3 X 10⁶個を投与し、 8〜： 14日後に腹水を採取した。採取した腹水を 3M塩化ナトリウム含有 1. 5Mグリシン塩酸緩衝液、 pH8. 9と 1 : 1に混合後、 0. 2 2 μ mのメンブランフィルターで濾過し、同緩衝液で平衡化してあるプロテイン Aセファロース CL—4B (フアルマシア社)カラムにかけた。十分量の同緩衝液で洗浄後、 0 . 1Mクェン酸緩衝液、 pH6. 0にて抗体を溶出した。溶出液は PBSにて透析後、 SD S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて純度を確認し、精製モノクローナル抗体とした。

[0076] (2)モノクローナル抗体の酵素標識

得られた精製モノクローナル抗体 20mgを 0. 1Mクェン酸ナトリウムバッファー（pH 3. 9) 2リットル（L)を用いて 4°Cでー晚透析した。ペプシンを lmg/mlになるように 0 . 1Mクェン酸ナトリウムバッファー（pH3. 9)で溶解し、 10mg/mlの濃度の抗体溶液 2mlに対し、ペプシン溶液 100 μ ΐを加え、 37° Cで 16時間静置した。 3Μトリス緩 fn¾ (pH8. 8) 200 で中禾ロ後、 Sephacryl S _ 200iiRカラム（lx45cm、 35ml 、 PBS)に力け、 20ml/h、 0. 7mlずつ分取、 A280nmの吸光度を測定しながら最初のピークを F (ab') 2画分として回収した。

[0077] 得られた F (ab') 画分を 0· 01M炭酸ナトリウムバッファー（ρΗ9· 5) 2Lを用いて 4

2

°Cで一晩透析した。ホースラデッシュペルォキシダーゼ (HRPO：東洋紡社)を蒸留水で 4mg/mlになるように溶解し、 HRP溶液 0· 5mlに対し、 0. 1M過ヨウ素酸ナトリゥム溶液 100 /i lを加え、室温で正確に 20分間静置した。 ImM酢酸 Naバッファー（p H4. 0) 2Lを用いて 4°Cでー晚透析後、 0. 2M炭酸ナトリウムバッファー（ρΗ9· 5)を約 25 /i lカ卩え、 ρΗ9. 0〜9· 5に調整した。セラムチューブ中で HRP溶液 0. 5mlに抗体液 0. 5mlをカ卩え、室温で 2時間緩やかに撹拌し、水素化ホウ素ナトリウム 4mg/ mlを 50 μ 1加え、 4°C、 2時間静置し、 PBS 2Lでー晚透析し、酵素標識抗体を得た

[0078] (3) ELISA法による〇TCの測定

(3— 1)標準曲線

マイクロタイタープレートに抗 OTCモノクローナル抗体（3B11または 6H11)を 10 z g/mlの濃度になるよう PBSで希釈し、 100 μ ΐΖゥヱルずつコートし、 25°Cでー晚静置した後、 0. 05%Tween20含有 PBSで 3回洗浄した後、ブロッキング液（0. 5% スキムミノレク、 5%シユークロース、 0. 1 %プロクリン 300)を 300 μ ΐ/ウエノレずつ分注し、 25°C、 1時間静置してブロッキング処理を施した。

[0079] ブロッキング溶液を除去後、 HRP標識抗 OTCモノクローナル抗体（5B11または 4 G6の各 F (ab') )を 1 /i g/mlの濃度になるよう、 0. l%Tween20, 0. 1 %BSA, 1

2

50mM NaCl, 0. l%Proclin950含有 0. 25M Glycine— Na〇H緩衝液（pH9 . 4)で希釈し、各ゥエルに 50 μ ΐΖゥエル分注し、続けてサンプルをサンプル希釈液（ 0. l %Tween20, 0. 1%BSA, 150mM NaCl, lOmM PBS (pH8. 0) , 0. 1 %Proclin950)により 10倍希釈し、 50 μ lZゥエルずつ分注した。

[0080] 1分間撹拌後、室温で 2時間静置し、洗浄液（0. 1%BSA, 150mM NaCl, 0. 1 %Proclin950, lOmM Glycine— NaOH緩衝液（pH9. 4) )にて 3回洗浄した後、発色液 (TMBZ)を ΙΟΟ μ ΐ/ゥエル分注し、室温にて 15分間静置して発色させ、 1 Ν硫酸を 100 μ 1/ゥエル分注して発色を停止させた後、 450nmの吸光度を測定した。サンプルと同時にスタンダードをのせ、標準曲線から各サンプノレの濃度を計算した。

[0081] 上記操作法に従い、リコンビナント OTC標準液を測定し、その結果を図 3に示す。

なお、固相抗体に 3B11、標識抗体に 5Bl l (F (ab') )を用いた測定系と固相抗体

2

に 6H11、標識抗体に 4G6 (F (ab') )を用いた 2種類の測定系での結果を図 3に併

2

記したが、どちらの測定系でも同等の標準曲線が得られ、 OTCに反応する抗体であれば、いずれの抗体でも使用可能であることが明らかとなった。

[0082] (3— 2)ネイティブ OTCとの反応性

ヒト肝臓組織抽出物をネイティブ OTCとして用い、 OTC酵素活性当たりの ELISA 反応性をリコンビナント OTCと比較することにより、抗体のリコンビナント OTCとネィテイブ〇TCに対する反応性の違いについて検討した。その結果、図 4に示すように、ァッセィ系の pHを 6. 7とするとネイティブ〇TCに対する抗体の反応性はリコンビナント OTCと比べて 10倍近く低くなつた力図 5に示すように、アツセィ系の pHを 9. 4とすることによりネイティブ〇TCに対する抗体の反応性はリコンビナント OTCとほぼ等しくなった。

[0083] (4)アツセィ系の高感度化に関する検討

(4_ 1)アツセィ系の pHによる影響アツセィ系（固相抗体 3B11、標識抗体 5B11)の pH、具体的には標識抗体を希釈する緩衝液の pHを変動させることで、ネイティブ OTCに対する抗体の反応性に与える影響を検討した。その結果、図 6に示すように、 ρΗ7· 5〜10· 5の範囲において良好な反応性が得られることが判明した。なお、リコンビナント〇TCに対してもヒスチジンタグの有り無しに関わらず同様の結果が得られている。また、使用する抗体の組み合わせを変えても、すなわち、固相抗体に 6H11、標識抗体に 4G6を用いたアツセィ系においても同様の結果が得られ、このような pH依存性は、抗体の性質によるものではなぐ OTCの構造力 ¾Hにより変化し、抗体が認識するェピトープが表面に出るなどの原因により抗体と反応しやすくなつたことに由来するものであると推測される。

[0084] (4- 2)アツセィ系のプロクリン添カ卩による影響

臨床検查用の防腐剤として汎用されているプロクリン（ProClin : SUPELCO社、シグマアルドリッチから入手可能）をアツセィ系に添加することにより、吸光度に与える影響を検討した。その結果、プロクリンなしの条件では ρΗ7· 5〜10. 5でなければ十分な反応性が得られなかったが、図 7に示すように、プロクリンを添加することによりそれまではほとんど反応性が得られなかった ρΗ6. 5〜7. 5の範囲においても十分な反応性が得られると共に、それ以外の pHにおいても反応性が向上することが判明した。この結果は、ネイティブ〇TC、リコンビナント OTCのいずれでも観察される傾向であり、また、使用する抗体の組み合わせを変えてもやはり同様の結果が得られた。

[0085] (4 3)プロクリン濃度の影響

アツセィ系（ρΗ7· 5)にプロクリンを濃度を変えて加えたときの抗体の反応性への影響を検討した。その結果、図 8に示すように、 ρΗ7. 5においては、プロクリンを添カロしない場合の反応性はほとんど見られないのに対して、添加濃度に応じて反応性が増大することが判明した。また、 ρΗ7. 5以外の pH (例えば ρΗ9. 5)においても、プロクリンの濃度に応じて反応性が増大した。

[0086] (5)酵素活性測定法との相関の検討

酵素活性測定キット (和光純薬工業製)を用いて測定した肝臓疾患患者の血清の測定値と上記 ELISA法による測定値の相関を検討した。その結果、図 9に示す通り、両測定法の測定値は非常によく相関した。また、酵素活性測定キットの標準操作法では血清 500 μ 1を必要とするが、 ELISA法では 5 μ 1で測定が可能であり、 ELISA 法によって、 2時間の反応時間で、肝臓疾患患者の血清を十分に感度良く測定できていることを明らかとなった。

(6)健常者血清の測定

94例の健常者血清を測定した。その結果、健常者の測定値の平均は約 35ngZm 1であり、健常者測定値の上限は約 l OOngZmlであった。また、健常者でも他の肝臓疾患マーカーが陽性であった例では、 100ng/ml以上カ異常のない健常者の平均値と比べて高い傾向が観察された。

SEQUENCE LISTING

<110>Yamasa Corporation

<120> Stabilized ornithine transcarbamylase and immunoassay for ornitnine transcar bamylase using the same

く 130〉 5043-002PCT

く 150〉 JP P2005-002695

く 151〉 2005-1-7

く 160〉 6

く 170〉 Patentln Ver. 2.1

く 210〉 1

く 211〉 30

く 212〉 DNA

く 2丄 Artificial sequence

く 220〉

く 223〉 primer ror amplincation or human OTし cDNA

く 400〉 1

caaccggatc caaataaagt gcagctgaag 30 く 211〉 30

く 212〉 DNA

く 213〉 Artificial sequence

〈220〉

〈223〉 primer for amplification of human OTし cDNA く 400〉 2

aactctagat caaaatttag gcttctggag 30 〈210〉 3

く 211〉 20

く 212〉 DNA

く 213〉 Artificial Sequence

〈220〉

く 223〉 primer for amplification of GroEL gene く 400〉 3

catgggttga tgtccgattg 20 く 210〉 4

く 211〉 20

く 212〉 DNA

く 213〉 Artincial Sequence

〈220〉

く 223> primer for amplification of GroES gene く 400〉 4

aacccccaga catttctgcc 20

〈210〉 5

く 211〉 30

く 212〉 DNA

く 213〉 Artificial Sequence <223> primer for amplification of human OTC cDNA く 400〉 5

caacccatgg gaaataaagt gcagctgaag

<210> 6

<211 > 30

く 212〉 DNA

く 213〉 Artificial Sequence

<220>

<223> primer for amplification of human OTC cDNA く 400〉 6

aactctagat caaaatttag gcttctggag 30

Claims

請求の範囲

[I] 5. 5〜7. 0の pHを有する安定化されたオル二チントランスカルノミラーゼ（〇TC)溶液。

[2] さらに、グリセロール、蛋白質、 OTCの基質又は反応生成物もしくはその類似体のうち少なくとも 2つを含む、請求項 1記載の〇TC溶液。

[3] OTC溶液が液状で、蛋白質がゥシ由来の蛋白質である、請求項 1記載の〇TC溶液

[4] OTC溶液が凍結状態で、蛋白質が乳由来の蛋白質である、請求項 1記載の OTC溶液。

[5] OTC溶液を凍結乾燥して得られた凍結乾燥 OTCであって、凍結乾燥の際に、安定化剤として蛋白質および糖を添加して得られたものである、安定化された凍結乾燥 o

TC。

[6] 凍結乾燥前の OTC溶液の pHが 5. 5〜7. 0である、請求項 5記載の凍結乾燥 OTC

[7] 蛋白質がゥシ由来の蛋白質で、糖が単糖又は二糖である、請求項 5記載の凍結乾燥 OTC。

[8] OTC抗原と抗〇TC抗体との反応を pH7. 5以上、 10. 5以下の条件下で行う、 OTC の免疫学的測定法。

[9] 抗原抗体の反応系にプロクリン (商品名）を共存させる、請求項 8記載の方法。

[10] OTC抗原と抗〇TC抗体との反応を、プロクリン（商品名）の存在下、 pH6. 5以上、 1 0. 5以下の条件下で行う、〇TCの免疫学的測定法。

[II] 請求項 8〜： 10いずれかに記載の方法で OTCを測定するための〇TC検出用キット。

[12] 標準物質として請求項 1〜7のいずれかに記載の〇TC溶液又は凍結乾燥〇TCを用いる、請求項 11記載のキット。