CN113945653A - 一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析仪器和药物分析技术领域，具体公开了一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法，芯片式活体固相微萃取装置系统包括芯片入口端和芯片出口端，所述芯片入口端和芯片出口端打孔，所述芯片入口端和芯片出口端通过导管连通形成微通道，所述芯片入口端填充有固相微萃取填料，所述芯片出口端设有阻挡固相微萃取填料的栅栏结构。本发明的系统可以应用纳米药物游离浓度的活体实时分析；本发明方法操作步骤简单，检测时间短，时间分辨率为1.5min，能够完全实现在线分析、实时监测纳米药物及其代谢物血药浓度的变化。

Description

一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动 学精准分析的方法

技术领域

本发明涉及分析仪器和药物分析技术领域，尤其是涉及一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法。

背景技术

纳米药物(Nanomedicines)是纳米技术与药剂学相结合形成的新学科，是当前制药工业快速发展的新方向。与传统药物以游离分子态吸收相比，纳米药物主要以纳米聚集态形式吸收，同时兼有分子态吸收，从而具有不同的体内过程，并产生特殊的生物学活性。目前还没有成熟的方法对纳米药物的实时活体分型分析(体内的游离态和结合态)进行研究，需要进一步发展纳米药物药动学新的研究方法和手段。

纳米药物生物样本分型分析，只要解决其游离浓度的定量分析问题，结合传统总浓度的定量分析，就可以达到分型分析的实际目的(总浓度减去游离浓度就是结合态浓度)。传统的生物样品制备技术中最常用的有机溶剂萃取、沉淀蛋白或固相微萃取技术等，只能测定总浓度。而游离药物浓度测定方法中主要的样品处理方法包括平衡透析法、超滤离心法、超速离心法和凝胶过滤法，但这些方法都有一定的缺点，并且无法满足纳米药物活体实时浓度监测的需要。

微透析(microdialysis,MD)是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的技术，具有活体连续取样、动态观察、定量分析、采样量小、组织损伤轻等特点，自诞生之日起就受到了广泛关注，在药动学领域的应用尤其引人瞩目，具有极大的应用潜力和优势。MD样品具有“低浓度、小体积、高盐分、多成分、高极性”的本质特征，决定了MD样品与普通生物样本的测定存在差异性，高灵敏度的分析仪器成为首选。液相色谱-三重四极杆质谱是MD样品的首选分析仪器。但难气化的盐分会对质谱造成伤害，降低检测灵敏度甚至引发仪器故障。并且纳米药物药动学研究的纳米药物游离浓度快速定量分析方面，极低的游离血药浓度和方法的时间分辨也是限制其应用的关键技术难题。因此，研制快速在线分析、具有脱盐和富集功能并能够和商用MD仪器无缝衔接的芯片式活体固相微萃取装置，将为MD技术解脱枷锁(脱盐)及升级(富集)功能，并为活体实时纳米药物药动学精准分析提供新装置和新方法。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种芯片式活体固相微萃取装置系统及其用于纳米药物药动学精准分析的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

第一目的，本发明提供了一种芯片式活体固相微萃取装置系统，包括芯片入口端和芯片出口端，所述芯片入口端和芯片出口端打孔，所述芯片入口端和芯片出口端通过导管连通形成微通道，所述芯片入口端填充有固相微萃取填料，所述芯片出口端设有阻挡固相微萃取填料的栅栏结构。

将固相微萃取填料填充于芯片入口端，芯片出口端有栅栏结构可以阻挡固相微萃取填料流出，使得分析物既能富集在芯片上、并实现脱盐；芯片出口端可以通过导管与检测系统连接，使得芯片式活体固相微萃取装置系统可以集多种功能于一体。样品通过芯片式活体固相微萃取装置系统，一方面可以得到富集，另一方面目标物质还可以从其他干扰物质中分离出来得到纯化，从而使检测灵敏度得到了极大地提高。另外，将芯片式活体固相微萃取装置系统直接与检测系统连接，实现高度集成化装置，使复杂样本的在线分析成为可能。

更优选地，所述检测系统包括液相色谱仪或质谱仪，检测系统不仅限于此，还包括各种药物定量和表征的分析仪器；并且根据药物的分子量和性质实现与此匹配的定量和定性的方法。

作为本发明所述芯片式活体固相微萃取装置系统的优选实施方式，所述芯片式活体固相微萃取装置系统的长度为1cm～5cm，宽度为1mm～10mm，深度为10μm～1mm。

作为本发明所述芯片式活体固相微萃取装置系统的优选实施方式，所述微通道的孔径小于50μm。

微通道的孔径小于50μm，可以保证全部的固相微萃取填料在流体经过的过程中全部保留在微通道内。

作为本发明所述芯片式活体固相微萃取装置系统的优选实施方式，系统中芯片材料选择包括聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。

更优选地，固相微萃取填料包括C18、C8分子分离和纯化的固相微萃取填料。

固相微萃取填料是一种常用的反相吸附剂，通过强疏水作用保留非极性化合物，将其他组分透过吸附剂而流出芯片，利用洗脱液选择性地将目标物质洗脱下来，实现对复杂样品的分离、纯化和富集。

第二目的，本发明提供了上述芯片式活体固相微萃取装置系统的制备方法，包括以下步骤：

1)在单晶硅片上涂抹光刻胶，利用掩膜光刻，获得第一模具；

2)将聚二甲基硅氧烷与交联剂混合倒入第一模具中，抽真空，置于85～95℃下烘烤成型，获得成型的芯片，将成型的芯片脱离第一模具；

3)对成型的芯片进行切割，形成若干微通道的芯片，再将微通道的入口端和微通道的出口端打孔；

4)使用等离子体清洗仪等离子处理玻璃与步骤3)处理后的芯片，使得玻璃与芯片键合，获得制备的芯片；

5)将步骤4)制备的芯片使用修饰剂进行表面修饰，超声30～35min，放置2～3h，获得修饰后的芯片；

6)将固相微萃取填料填充满若干微通道，获得芯片式活体固相微萃取装置系统。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述聚二甲基硅氧烷与交联剂的质量比为(9～12):1；更优选地，所述聚二甲基硅氧烷与交联剂的质量比为10:1。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤4)中，使用等离子体清洗仪等离子处理时间为0.5min～5min，更优选地，使用等离子体清洗仪等离子处理时间为1min。

使用等离子体清洗仪，目的是为了使芯片微通道表面的-OH瞬间裸露出来，其亲水性增强，能更好的进行贴合。

作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述修饰剂包括浓度为0.1～5％的PEG，所述PEG的分子量为8000～50000，更优选地，所述修饰剂为浓度为0.5％的PEG 20000。

更优选地，表面修饰包括浸泡法和超声法，优选为浸泡法。

芯片使用修饰剂进行表面修饰，防止非特异性吸附，进一步目标物质获得较高的回收率；当使用浓度为0.5％的PEG 20000时，目标物质的回收率更高。

更优选地，芯片式活体固相微萃取装置系统的工作步骤包括以下内容：

1)活化：甲醇以50μL/min的流速活化10min；

2)平衡：(1)50％甲醇作为平衡溶液，流速20μL/min平衡10min；(2)接着过度到纯水，以20μL/min的流速平衡10min；

3)上样：目标物质的浓度500ng/mL，以2.5μL/min的流速上样1.5min，上样体积为3.75μL(芯片式活体固相微萃取装置系统容量为4μL)；

4)清洗：90％水-10％甲醇作为清洗液，流速10μL/min清洗5min；

5)洗脱：90％甲醇-10％0.1％甲酸水作为洗脱液，流速3uL/min洗脱30min。

第三目的，本发明提供了一种微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置，所述联用装置包括微透析装置、芯片式活体固相微萃取装置系统和检测系统，所述微透析装置包括注射装置和探针，芯片式活体固相微萃取装置系统中芯片入口端通过导管与微透析装置中的探针的一侧相连接，所述芯片出口端通过导管与检测系统相连接，使用注射装置灌注实验动物，探针位于实验动物组织器官内萃取获得目标物质，目标物质通过导管进入芯片式活体固相微萃取装置系统中进行除盐、富集和洗脱，然后目标物质进入检测系统中进行实时在线检测目标物质的浓度和代谢情况。

微透析装置是一种将灌流取样和透析技术结合起来并逐渐完善的一种从生物活体内进行动态微量生化取样的技术。将探针放置在实验动物的组织器官中，注射装置持续灌流生理盐水，将探针萃取出来的目标物质，通过导管进入芯片式活体固相微萃取装置系统。

芯片式活体固相微萃取装置系统中芯片入口端与微透析装置中的探针的一侧导管相连接，芯片出口端通过导管与检测系统相连接，将微透析装置与检测系统串联起来，探针透析出来的目标物质进入芯片中，芯片可以对其进行除盐、富集和洗脱。

第四目的，本发明提供了一种纳米药物药动学精准分析的方法，使用上述的芯片式活体固相微萃取装置系统或微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置实时检测实验动物的药物游离浓度和代谢情况。

更优选地，芯片式活体固相微萃取装置系统中上样体积为3.75μL，上样流速为2.5μL/min，上样时间为1.5min；芯片式活体固相微萃取装置系统中洗脱条件为：90％甲醇-10％0.1％甲酸水作为洗脱液，洗脱流速为3μL/min，洗脱为30min。

更优选地，实验动物包括小鼠、家兔、狗、猪、猴子中的一种，但该方法的应用对象不仅限于实验动物，该纳米药物药动学精准分析的方法还可以用于人体药物代谢监测，有利于分析人体药物代谢的情况。

更优选地，药物包括小分子药物、生物药物、纳米药物中的一种。

采用本发明纳米药物药动学精准分析的方法，时间分辨率为1.5min，可以实时监测纳米药物及其代谢产物的血药浓度变化。

本发明纳米药物药动学精准分析的方法，操作步骤简单，检测时间短，能够完全实现在线分析、实时监测纳米药物及其代谢物血药浓度的变化。

附图说明

图1为芯片式活体固相微萃取装置系统整体结构图(1为立体图；2为俯视图；3为正视图；4为后视图；5为侧视图)；

图2为芯片式活体固相微萃取装置系统栅栏结构的局部放大图；

图3为微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置整体结构图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、芯片式活体固相微萃取装置系统及其制备方法

一种芯片式活体固相微萃取装置系统，包括芯片入口端和芯片出口端，所述芯片入口端和芯片出口端打孔，所述芯片入口端和芯片出口端通过导管连通形成微通道，所述芯片入口端填充有固相微萃取填料，所述芯片出口端设有阻挡固相微萃取填料的栅栏结构。芯片式活体固相微萃取装置系统的长度为1cm～5cm，宽度为1mm～10mm，深度为10μm～1mm；所述微通道的孔径小于50μm。

上述芯片式活体固相微萃取装置系统的制备方法，包括以下步骤：

1)造模：利用AutoCAD构建一定尺寸的掩膜，打印，在单晶硅片上均匀涂抹SU8-2050光刻胶，利用掩膜光刻，未交联的光刻胶通过强碱清洗掉，最终形成具有一定尺寸和形状的第一模具；

2)浇筑、成型、脱模：将聚二甲基硅氧烷与交联剂以质量比10：1比例(在其他实施例中，比例可以为9:1或12:1)混合均匀后，倒入第一模具中，利用抽真空的方式使混合液中的气泡浮至表面并用移液枪吹破裂，再放入90℃电热鼓风干燥箱中烘1h左右，获得成型的芯片，用刀片划动四周将成型的芯片脱离第一模具；

3)切割、打孔：用切割刀片正面对着成型的芯片进行切割，形成若干微通道的芯片，再用打孔器(外径1mm)将微通道的入口端和微通道的出口端打在端子的正中间并垂直；打完孔后，可使用胶纸粘贴住芯片，使其保持干净；

4)键合：将一张干净的载玻片和步骤3)处理后的芯片正面向上放入等离子清洗仪中等离子处理内1min后，将其取出，正面对正面进行贴合，90℃电热鼓风干燥箱烘2h，获得制备的芯片；

5)修饰：将步骤4)制备的芯片浸泡于0.5％PEG20000中，超声30min，放置2h，使芯片表面修饰一层PEG20000，获得修饰后的芯片；

6)填充：取部分固相微萃取填料放于甲醇中，用1ml注射器固定一个长枪头吸取混悬后的固相微萃取填料-甲醇混合液，从芯片的入口端打入，少量多次填充至微通道上，使得微通道中充满固相微萃取填料，即得芯片式活体固相微萃取装置系统(参考图1和图2)。

上述芯片式活体固相微萃取装置系统的工作原理如下：在芯片入口端填满固相微萃取填料，芯片出口端有栅栏结构阻挡固相微萃取填料流出(参考图2)。芯片出口端通过导管与液相色谱/质谱相连接，可实现高度集成化装置。固相微萃取填料是一种常用的反相吸附剂，通过强疏水作用保留非极性化合物，将其他组分透过吸附剂而流出芯片，利用洗脱液选择性地将目标物洗脱下来，实现对复杂样品的分离、纯化和富集。

实施例2、微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置的构建

回收率的计算公式为：

回收率(％)＝(芯片后－透析前)浓度/透析前浓度×100％

微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置(结构参考图3)，包括微透析装置、实施例1制备的芯片式活体固相微萃取装置系统和检测系统，所述微透析装置包括注射泵和探针(血液探针CMA20)，芯片式活体固相微萃取装置系统中芯片入口端通过导管与微透析装置中的探针的一侧相连接，所述芯片出口端通过导管与检测系统相连接，使用注射泵持续灌流生理盐水至实验动物体内，探针位于实验动物组织器官内萃取获得目标物质，向芯片式活体固相微萃取装置系统加入洗脱液，目标物质通过导管进入芯片式活体固相微萃取装置系统中，利用固相微萃取填料和洗脱液进行除盐、富集和洗脱，结束后，废液排出，目标物质进入液相色谱质谱联用(LC-MS)中进行实时在线检测目标物质的浓度和代谢情况。

微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置的工作原理：通过微透析装置的注射泵持续灌流生理盐水，将放置在实验动物的组织器官中的探针萃取出的目标物质不断地通入芯片式活体固相微萃取装置系统中，进行除盐、富集和洗脱，芯片出口端直接连接质谱(或其他检测器)，样品进入质谱中，进行实时在线监测目标物质的浓度和代谢情况。

实施例3、不同洗脱条件对目标物质回收率的影响

1、不同洗脱时间对目标物质回收率的影响

使用实施例2制备的透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置，目标物质为阿霉素，其中，芯片式活体固相微萃取装置系统的工作步骤如下所示：

1)活化：甲醇以50μL/min的流速活化10min；

2)平衡：(1)50％甲醇作为平衡溶液，流速20μL/min平衡10min；(2)接着过度到纯水，以20μL/min的流速平衡10min；

3)上样：阿霉素的浓度500ng/mL，以2.5μL/min的流速上样1.5min，上样体积为3.75μL(芯片式活体固相微萃取装置系统的容量为4μL)；

4)清洗：90％水-10％甲醇作为清洗液，流速10μL/min清洗5min；

5)洗脱：90％甲醇-10％0.1％甲酸水作为洗脱液，流速3uL/min洗脱30min。

改变步骤5)中的洗脱时间为对照组，分别为15min、20min和40min，洗脱时间为30min为实验组。每组重复做三个样品进质谱检测，其洗脱时间与阿霉素回收率关系如表1所示，通过对比得出的回收率的结果，得出当流速为3μL/min，30min时的洗脱效果最好，阿霉素得到的回收率能够达到90％以上。

表1

洗脱时间	15min	20min	30min	40min
					回收率	50％	70％	90％	80％

2、不同修饰剂对目标物质回收率的影响

芯片式活体固相微萃取装置系统以不添加修饰剂为空白对照组，以浓度为1％的PVA溶液为对照组1，以浓度为0.5％的PEG20000溶液为实验组，测定阿霉素的回收率，如表2所示。

表2

芯片修饰	未修饰	1％PVA溶液	0.5％PEG20000溶液
				回收率	10％	20％	90％

结果如表2所示，未修饰的芯片式活体固相微萃取装置系统(空白对照组)在药物富集的过程中回收率很低(<10％)，这可能是因为药物在PDMS的非特异性吸附导致的。

比较对照组1和实验组，显示浓度为1％的PVA溶液比空白对照组的回收率提高一倍(20％)，但仍然较低，达不到药物检测的标准。另一方面，经过0.5％PEG20000溶液修饰的芯片式活体固相微萃取装置系统的阿霉素回收率可以达到90％以上，故每次使用芯片式活体固相微萃取装置系统之前需要使用0.5％的PEG20000溶液对芯片进行修饰，从而减少因非特异性吸附而导致回收率降低。由于微透析装置的探针的管路和针泵也可能存在对药物非特异性吸附的风险。综上所述，在芯片式活体固相微萃取装置系统中添加PEG溶液修饰，可以提高样本的回收率，防止非特异吸附。

3、上样体积对目标物质回收率的影响

以阿霉素的上样体积为3.75μL为实验组(其他条件不变)，改变阿霉素的上样体积：10μL、15μL、25μL，测定阿霉素的回收率。

如表3所示，上样量为10μL、15μL、25μL时回收率降低，这可能是因为芯片所能容纳的体积为4μL，若上样量超过4μL，会导致上样量不准确，从而导致理论与实际的浓度相差较大。当上样量控制在4μL以下，通过结合微透析装置中的注射泵使得，注射泵中透析药物的流速为2.5μL/min，将上样时间调整为1.5min，上样的总体积为3.75μL，此时回收率为90％，符合药物分析的标准。另外，若上样量过低，会影响检测的通量，因此上样量3.75μL为该装置最佳的上样量。

表3

上样量	3.75μL	10μL	15μL	20μL
					回收率	90％	30％	30％	20％

综上，通过0.5％PEG20000溶液对芯片的修饰，以2.5μL/min的速度，上样时间为1.5min的上样量以及优化出以3μL/min的速度,洗脱时间为30min的洗脱条件，可以使得整个装置连接起来后，制备目标物质的回收率可以达到90％以上。

4、芯片式活体固相微萃取装置系统富集倍数

芯片的富集倍数计算公式为：

富集倍数＝芯片后浓度/芯片前浓度

通过0.5％PEG20000溶液对芯片的修饰，以2.5μL/min的速度，上样时间为1.5min的上样量以及优化出以3μL/min的速度,洗脱时间为30min的洗脱条件，可以使得整个装置连接起来后，芯片式活体固相微萃取装置系统的富集倍数为2.0。

实施例4、纳米药物脂质体阿霉素的活体在线实时游离浓度分析

1、SD大鼠的血管插管手术

在SD大鼠四肢固定在夹具上，将异氟烷管路通入大鼠鼻腔内，使大鼠可以在一定时间内保持持续性的麻醉状态。对大鼠进行血管插管手术，首先，将大鼠颈部的毛用剃毛器剃除干净，找出大鼠脖子颈静脉一侧位置，找到颈静脉血管，最后将探针放置在颈静脉中，并固定，防止探针中途从静脉上滑落。将探针放置在颈静脉后，利用缝合线进行固定，完成SD大鼠的血管插管手术。

2、活体血样的前处理方法

将纳米药物阿霉素脂质体和内标氘代阿霉素注射到大鼠体内。微透析装置中的注射泵持续灌流生理盐水，将探针萃取出的游离的阿霉素和氘代内标物，沿着导管进入芯片式活体固相微萃取装置系统中，进行除盐、富集和洗脱。

3.3MS/MS检测

建立阿霉素的QTRAP 6500+的质谱检测方法，用质谱找出阿霉素的母离子的m/z为544.3，再找出子离子的m/z为397.2，再找出内标的母离子的m/z为548.2，子离子的m/z为401.1。优化质谱参数，在正离子模式下，以离子源气体温度为400℃，电压为5500V，气体1为50psi，气体2为55psi，去簇电压为100V，碰撞能为15.6eV的质谱参数条件，并以此条件建立MRM模式。将洗脱出的样品直接进入质谱中进行检测。

本发明纳米药物药动学精准分析的方法，添加氘代药物分子内标校正提高方法的准确度，所建立的方法操作步骤简单，检测时间短，时间分辨率为1.5min，能够完全实现在线分析、实时监测纳米药物及其代谢物血药浓度的变化。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种芯片式活体固相微萃取装置系统，其特征在于，包括芯片入口端和芯片出口端，所述芯片入口端和芯片出口端打孔，所述芯片入口端和芯片出口端通过导管连通形成微通道，所述芯片入口端填充有固相微萃取填料，所述芯片出口端设有阻挡固相微萃取填料的栅栏结构。

2.如权利要求1所述的芯片式活体固相微萃取装置系统，其特征在于，所述芯片式活体固相微萃取装置系统的长度为1cm～5cm，宽度为1mm～10mm，深度为10μm～1mm；所述微通道的孔径小于50μm。

3.如权利要求1所述的芯片式活体固相微萃取装置系统，其特征在于，系统中芯片材料选择包括聚二甲基硅氧烷或聚甲基丙烯酸甲酯。

4.如权利要求1～3任一项所述的芯片式活体固相微萃取装置系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在单晶硅片上涂抹光刻胶，利用掩膜光刻，获得第一模具；

2)将聚二甲基硅氧烷与交联剂混合倒入第一模具中，抽真空，置于85～95℃下烘烤成型，获得成型的芯片，将成型的芯片脱离第一模具；

3)对成型的芯片进行切割，形成若干微通道的芯片，再将微通道的入口端和微通道的出口端打孔；

4)使用等离子体清洗仪等离子处理玻璃与步骤3)处理后的芯片，使得玻璃与芯片键合，获得制备的芯片；

5)将步骤4)制备的芯片使用修饰剂进行表面修饰，超声30～35min，放置2～3h，获得修饰后的芯片；

6)将固相微萃取填料填充满若干微通道，获得芯片式活体固相微萃取装置系统。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷与交联剂的质量比为(9～12):1。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，使用等离子体清洗仪等离子处理时间为0.5min～5min。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述修饰剂包括浓度为0.1～5％的PEG，所述PEG的分子量为8000～50000，更优选地，所述修饰剂为浓度为0.5％的PEG 20000。

8.一种微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置，其特征在于，所述联用装置包括微透析装置、权利要求1～3任一项所述的芯片式活体固相微萃取装置系统和检测系统，所述微透析装置包括注射装置和探针，芯片式活体固相微萃取装置系统中芯片入口端通过导管与微透析装置中的探针的一侧相连接，所述芯片出口端通过导管与检测系统相连接，使用注射装置灌注实验动物，探针位于实验动物组织器官内萃取获得目标物质，目标物质通过导管进入芯片式活体固相微萃取装置系统中进行除盐、富集和洗脱，然后目标物质进入检测系统中进行实时在线检测目标物质的浓度和代谢情况。

9.一种纳米药物药动学精准分析的方法，其特征在于，使用如权利要求1～3任一项所述的芯片式活体固相微萃取装置系统或如权利要求8所述的微透析-芯片式活体固相微萃取-液质联用装置实时检测实验动物的药物游离浓度和代谢情况。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，芯片式活体固相微萃取装置系统中上样体积为3.75μL，上样流速为2.5μL/min，上样时间为1.5min；芯片式活体固相微萃取装置系统中洗脱条件为：90％甲醇-10％0.1％甲酸水作为洗脱液，洗脱流速为3μL/min，洗脱为30min。

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