CN101544696A - 含色素上皮衍生因子的复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含色素上皮衍生因子的复合物，所述色素上皮衍生因子与聚烯醇类化合物或免疫球蛋白Fc片断偶联。本发明还公开了含色素上皮衍生因子的复合物的制备方法及其在制备预防、诊断或治疗肿瘤、新生血管异常增生疾病的药物中的应用。本发明含色素上皮衍生因子的复合物，能显著延长色素上皮衍生因子在体内的半衰期，同时具有与未修饰色素上皮衍生因子相同甚至更高的抑制新生血管生成及抑制肿瘤生长的活性。

Description

含色素上皮衍生因子的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种含色素上皮衍生因子(Pigment Epithelium-Derived Factor，PEDF)的复合物，尤其涉及一种能延长PEDF体内半衰期的复合物及其制备方法和应用。

背景技术

新生血管生成是指在原有的血管上生成新的毛细血管。肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管的生成，因此抑制新生血管的发生成为一种抗肿瘤治疗的新的手段。(Folkman J.N Engl J Med 1971；285：1182-1186)。

色素上皮衍生因子(PEDF)是人和动物眼中天然存在的一种糖蛋白，分子量为46KD，具有2个结构域：N端的神经营养区域和C端的丝氨酸蛋白酶抑制超基因家族反应环。DNA序列分析显示PEDF属于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因超家族，但它不具有抑制蛋白酶的活性。PEDF最初是Tombran-Tink等于1989年从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中分离出来的，由此得名。它可以诱导体外培养的视网膜母细胞瘤细胞系Y79Rb神经元分化。在人胚胎发育到17周的RPE细胞就已经具有这种活性，PEDF被认为是影响早期神经元发育的一个候补因子。1999年Dawson等首次发现PEDF具有很强的抑制血管的作用，可能是维持角膜、玻璃体等眼内组织无血管形成的主要原因，在玻璃体内是主要的血管增生抑制剂(Dawson DW，Volpert OV，Science 1999；285(5425)245-248)。

PEDF具有抑制病理性血管新生和神经营养双重生物学功能，既可以有效地抑制血管新生，又能有效地保护神经元，为眼部新生血管性疾病的治疗提供了新的思路。PEDF将成为控制糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等疾病很有潜力的药物。PEDF可特异性地作用在肿瘤新生血管丰富的区域，而对正常存在的血管没有作用，PEDF这种对新生血管内皮细胞增殖和迁移的特异性抑制，使其成为一种潜在的新生血管抑制剂类抗肿瘤药物。

但是，PEDF蛋白质药物在给药后其体内半衰期短，除了体内蛋白降解作用外，会通过肾小球过滤途径从体内被排除，在有些情况下，因结合特异性抗体而被清除或失活。为维持体内有效的治疗浓度，就需要频繁地注射给药，这种治疗方式虽然可以达到治疗目的，但给病人带来不便与痛苦，且增加了用药成本。

发明内容

本发明要解决PEDF在体内半衰期短的技术问题，提供一种含色素上皮衍生因子的复合物。此外，还需要提供含色素上皮衍生因子的复合物的制备方法和应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一个方面，提供了一种含色素上皮衍生因子的复合物，所述色素上皮衍生因子与聚烯醇类化合物或免疫球蛋白Fc片断偶联。

所述聚烯醇类化合物选自聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)、聚乙稀醇、聚丙烯醇、聚丁烯醇或它们的衍生物，优选的，所述聚烯醇类化合物为聚乙二醇，更优选的，该聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。聚乙二醇是线形或分叉，平均分子量为1,000～100,000道尔顿之间，优选10,000～40,000道尔顿之间，更优选分子量为20,000Da和40,000Da的聚乙二醇。

所述复合物中，一个色素上皮衍生因子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，该偶联的位点为色素上皮衍生因子的N端α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一个或其多个组合。

优选的，所述复合物中，一个色素上皮衍生因子与一个聚乙二醇分子偶联，该偶联的位点为色素上皮衍生因子的N端α氨基。色素上皮衍生因子N末端单一位点的修饰，使修饰后的色素上皮衍生因子分子结构均一，更有利于药物开发的应用。

所述复合物中，一个色素上皮衍生因子和一个或多个免疫球蛋白Fc片断偶联，该偶联可以是融合表达得到，也可以是通过体外蛋白偶联得到。优选的，该免疫球蛋白Fc片断为人免疫球蛋白IgG中的Fc片断。

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述复合物的缓释制剂，该缓释制剂的缓释材料选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。该缓释制剂在保留色素上皮衍生因子生物学活性的同时，能够依靠缓释进一步延长色素上皮衍生因子的体内半衰期。优选的方案为用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球对PEDF进行包埋，达到体内缓释PEDF的目的。

在本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，包括上述复合物和可药用载体。该可药用载体为含水的缓冲液，包括磷酸盐、柠檬酸盐、或其它有机酸的缓冲液、抗坏血酸或其它抗氧化剂、低分子量多肽、血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白或其它蛋白质、聚乙烯吡咯烷酮或其它亲水性多聚体。

在本发明的另一方面，提供了一种包含上述复合物的试剂盒。

在本发明的另一方面，提供了一种含色素上皮衍生因子的复合物的制备方法，包括如下步骤：

用活化的聚烯醇类化合物与色素上皮衍生因子以1：5至5：1的摩尔比混合，并在pH为3-10，温度为4-30℃的条件下进行反应。优选的，所述聚烯醇类化合物为聚乙二醇。

优选的，还包括用阳离子柱或用分子筛分离反应后获得的不同修饰的色素上皮衍生因子，以得到色素上皮衍生因子N末端单一位点修饰PEG的复合物。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述复合物在制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的应用。所述肿瘤包括肺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、骨癌、黑色素瘤、胃癌、前列腺癌、淋巴癌、食道癌、宫颈癌或其它肿瘤。

在本发明的另一方面，还提供了一种上述复合物在制备预防、诊断或治疗包括增殖性糖尿病视网膜病变、风湿性及年龄相关性黄斑变性的新生血管异常增生疾病的药物中的应用。

由本发明含色素上皮衍生因子的复合物组成的药物，其给药方式包括静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、口服、粘膜给药、眼部给药、直肠给药、阴道给药或其它给药方式。

本发明中的色素上皮衍生因子，其来源可以是人、鼠或其他哺乳动物，优选为人色素上皮衍生因子，包括人体内自然存在的野生型色素上皮衍生因子(SEQ NO.1序列)，或是其具有活性的突变体、片段、异构体或衍生物。色素上皮衍生因子的突变体是指通过氨基酸的取代、缺失、增加而得到的仍具有活性的色素上皮衍生因子。色素上皮衍生因子的片断是指SEQ NO.1序列中任何更短的部分序列，可通过酶切，或通过基因工程表达，或通过肽合成方法得到，其中优选SEQ NO.1序列的19～121位氨基酸序列。色素上皮衍生因子异构体具有相同序列，但具有与天然结构不同的构象。色素上皮衍生因子衍生物是指在本发明所述序列上进行修饰的产物，如连接小分子、短肽等，其中小分子优选磷酸分子、糖分子，短肽优选含有His-tag的15个氨基酸以内的小肽。

本发明含色素上皮衍生因子的复合物，不仅具有与色素上皮衍生因子相同甚至更高的抑制新生血管生成的活性，而且与未经修饰的色素上皮衍生因子相比，能显著减缓色素上皮衍生因子在体内的代谢、延长体内半衰期。实验结果表明，本发明由聚烯醇类化合物或免疫球蛋白Fc片断偶联修饰的色素上皮衍生因子形成的复合物，其中色素上皮衍生因子的半衰期从修饰前的4.5小时延长到修饰后的82.3小时，半衰期延长17.3倍左右，并且修饰后的色素上皮衍生因子仍具有很高的抑制小鼠肿瘤生长的活性。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例1的PEDF蛋白IPTG诱导表达图；

图2是本发明实施例1PEDF包涵体三次洗涤过程中上清液和沉淀的SDS-PAGE电泳图；

图3是本发明实施例1PEDF复性后纯化过程中洗脱组分的SDS-PAGE电泳图；

图4是本发明实施例2的20KD聚乙二醇与具有SEQ NO.2序列的重组色素上皮衍生因子的N末端偶联的电泳图；

图5是本发明实施例3的20KD聚乙二醇与具有SEQ NO.2序列的重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后用阳离子柱纯化的SDS-PAGE电泳图；

图6是本发明实施例4的40KD聚乙二醇与具有SEQ NO.2序列的重组色素上皮衍生因子的N末端偶联的电泳图；

图7是本发明实施例5的40KD聚乙二醇与具有SEQ NO.2序列的重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后用阳离子柱纯化的SDS-PAGE电泳图；

图8是本发明实施例6的20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后在血液中的长效效应曲线图；

图9是本发明实施例7的40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后在血液中的长效效应曲线图；

图10是本发明实施例8的20KD、40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制血管内皮细胞迁移活性的柱状图；

图11是本发明实施例9的20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制小鼠肺癌活性的柱状图；

图12是本发明实施例10的40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制小鼠肺癌活性的柱状图；

图13是本发明实施例11用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF的缓释制剂延长PEDF体内半衰期的柱状图。

具体实施方式

为了延长色素上皮衍生因子的体内半衰期，本发明提供一种含色素上皮衍生因子的复合物，该复合物的色素上皮衍生因子与聚烯醇类化合物或免疫球蛋白Fc片断偶联。

在本发明中，聚烯醇类化合物优选为聚乙二醇。聚乙二醇分子具有水溶性和有机溶剂相容性，无毒、极低免疫原性，被包括美国FDA和中国SFDA在内的许多国家的药品管理机构批准为可用于药物制备的原料。色素上皮衍生因子经聚乙二醇修饰后可增加蛋白的稳定性、水溶性，减少非特异性吸附和抗原性。修饰后复合物达到一定分子量时(大于50KD)，可大大降低药物的肾脏清除率，从而有效延长色素上皮衍生因子的体内半衰期。经实验证实，聚乙二醇进一步优选为单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。

聚乙二醇修饰的色素上皮衍生因子复合物的生物活性和体内药学性质除了和色素上皮衍生因子本身的性质有关以外，还和用于修饰的聚乙二醇的分子量大小、形状、修饰位点和修饰数量有关。本发明聚乙二醇的分子量为1,000～100,000道尔顿之间，优选10,000～40,000道尔顿之间，更优选分子量为20,000Da和40,000Da。本发明聚乙二醇的形状为线形或分叉，优选为分叉Y型。

本发明中，聚乙二醇在色素上皮衍生因子上的修饰位点包括色素上皮衍生因子的N端α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基或谷氨酸残基侧链的羧基中的一个或多个组合，聚乙二醇在色素上皮衍生因子上的修饰数量为一个或多个。但是，对于赖氨酸残基侧链上的ε氨基的修饰往往因为反应位点不特异而产生修饰后的同分异构体。本发明进一步实验证明，优选聚乙二醇在色素上皮衍生因子N末端单一位点的修饰，使修饰后的色素上皮衍生因子分子结构均一，更有利于药物开发的应用。

本发明复合物中，一个色素上皮衍生因子和一个或多个免疫球蛋白Fc片断偶联后，能明显延长色素上皮衍生因子的体内半衰期，且仍保持原有抗新生血管生成的活性。优选的，该免疫球蛋白Fc片断为人免疫球蛋白IgG中的Fc片断。

本发明含色素上皮衍生因子的复合物的制备方法，包括如下步骤：

用活化的聚烯醇类化合物与色素上皮衍生因子以1：5至5：1的摩尔比混合，并在pH为3-10，温度为4-30℃的条件下进行反应。优选的，所述聚烯醇类化合物为聚乙二醇。

优选的，还包括用阳离子柱或用分子筛分离反应后获得的不同修饰的色素上皮衍生因子，以得到色素上皮衍生因子N末端单一位点修饰PEG的复合物。

本发明还提供了一种包含色素上皮衍生因子复合物的缓释制剂，该缓释制剂的缓释材料选自微胶囊、水凝胶、微球、微型渗透泵或脂质体。该缓释制剂在保留色素上皮衍生因子生物学活性的同时，能够依靠缓释进一步延长色素上皮衍生因子的体内半衰期。优选的方案为用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球对PEDF进行包埋，达到体内缓释PEDF的目的。

下面结合实施例作进一步详细的说明。

实施例1  重组色素上皮衍生因子的制备

(1)菌株的构建

从人cDNA文库中克隆编码SEQ NO.2所示多肽的DNA片段，并构建入PET30a质粒，转化BL21(DE3)宿主菌，表达SEQ NO.2所示多肽。

(2)蛋白表达

将PEDF菌种接种至30ml LB液体培养基，37℃、200rpm摇床培养5小时，转接入500ml LB液体培养基，培养条件如上。将此培养液接入5L发酵罐中，培养条件为37℃、pH7.0，溶氧20～30％，在OD₆₀₀达到10以前，控制残糖为3g/L，在OD₆₀₀达到10以后，控制残糖为1g/L以内。每小时取样检测残糖和OD₆₀₀，OD₆₀₀为6时开始补加氮源。OD₆₀₀达到20左右时，加入终浓度为50mg/L IPTG进行诱导，并控制残糖0.3g/L诱导4～5个小时停止培养并收集菌体。PEDF蛋白表达情况见图1，在图1中，数字1指未诱导的菌株，2～5：分别表示用IPTG诱导1、2、3、4小时后的表达情况。

(3)包涵体洗涤

将菌体放入-20℃冰箱冻存过夜，然后用菌体湿重5～8倍体积的裂解液(50mMTris，50mM NaCl，5mM EDTA，5mM Na₂SO₃，2mM DTT，pH8.5)重悬，混匀。每克湿菌体加5000单位酶活的溶菌酶，搅拌均匀。1小时后加入DNase I(每克菌体加10μg)，室温搅拌约30分钟。高压匀浆机破菌，压力60MPa，循环3次。离心，收集破菌沉淀。以上沉淀中加入10倍湿重体积的洗涤液(2％Triton X-100，2M Urea，10mM Tris，5mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)，使液固相充分混匀。室温下静置30min后，离心，收集沉淀。重复以上洗涤过程2遍，收集沉淀，该沉淀即PEDF包涵体蛋白。PEDF包涵体洗涤过程见图2。在图2中，1：PEDF表达菌体；2：破菌上清液；3；破菌沉淀；4：第一次洗涤上清液；5：第一次洗涤液沉淀；6：第二次洗涤上清液；7：第二次洗涤液沉淀；8：第三次洗涤上清液；9：第三次洗涤液沉淀(PEDF包涵体蛋白)。

(4)PEDF的复性

将洗涤得到的PEDF包涵体蛋白用尿素溶液(8M尿素，50mM Tris，5mM EDTA，2mM DTT，pH8.0)溶解过夜，然后以1比50的比稀释到复性液(50mM Tris，20％甘油，5mM EDTA，1mM DTT，pH8.0)中，8小时后对10mM Tris，5mM EDTA，1mM DTT，pH8.0溶液进行透析。离心去除沉淀，收集上清。上清中存留的PEDF即复性的PEDF。

(5)PEDF的纯化

采用SP HP层析介质(GE公司)纯化PEDF。用20mM NaH₂PO4，1M NaCl，pH6.5溶液对层析介质进行预先处理，然后用20mM NaH₂PO4，pH6.5溶液进行平衡。上样后，用20mM NaH₂PO4，pH6.5溶液冲洗2个柱体积，然后用20mM NaH₂PO4，200mM NaCl，pH6.5溶液洗脱有活性的PEDF蛋白，最后用20mM NaH₂PO4，1M NaCl，pH6.5溶液进行清柱。将得到的活性PEDF溶液对pH5.5的30mM醋酸钠溶液进行透析，以备进行PEG修饰。纯化过程见图3。在图3中，1：复性后的PEDF；2：上样穿透液；3：冲洗组分；4：200mM NaCl洗脱组分；5：清柱组分。

实施例2  20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联

本实施例涉及的重组人色素上皮衍生因子包括具有SEQ NO.2序列的重组人色素上皮衍生因子。具体方式为将重组人色素上皮衍生因子透析到pH5.5的30mM醋酸钠溶液中，测量蛋白浓度，并调整其浓度至3-8mg/ml之间。按照目的蛋白与聚乙二醇的摩尔比1比2计算需要加入的分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛的质量，同时按照最终溶液体积计算还原剂CH3BNNa的用量，其浓度为20mM。最后调整溶液pH值至5.1-5.3。反应溶液搅拌均匀后于室温静止4-6小时或4℃10小时。此时重组人色素上皮衍生因子被一个聚乙二醇修饰的比例在50％以上，即一个重组人色素上皮衍生因子被一个分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰，且修饰位点为重组人色素上皮衍生因子的N末端(见图4)。在图4中，1：Marker，由上依次为97，66，45，35，20 KD；2：分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF；3：未修饰的PEDF。

实施例3  20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后用阳离子柱纯化

具体实施方式是将修饰后的重组人色素上皮衍生因子用阳离子柱分离纯化。具体选择GE公司的SPHP层析介质，并将修饰后的反应液调节pH值为6.3。阳离子柱用30mM、pH6.3的醋酸钠溶液平衡，并上样。再用30mM醋酸钠、1M氯化钠、pH6.3的溶液进行梯度洗脱。因聚乙二醇对蛋白本身的电荷有一定的屏蔽作用，多修饰的蛋白电荷强度最弱，其次是单修饰的蛋白，然后是未修饰的蛋白，因此洗脱时按照此顺序蛋白被依次洗脱下来。根据280nm紫外吸收，收集不同的组分并进行SDS-PAGE检测。纯化过程见图5。在图5中，1：Marker，由上依次为97，66，45，35，20KD；2：分子量为20KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF；3：穿透液；4：50mM NaCl洗脱组分；5：100mM NaCl洗脱组分；6：150mM NaCl洗脱组分；7：200mM NaCl洗脱组分；8：250mM NaCl洗脱组分；9：300mM NaCl洗脱组分；10：500mM NaCl洗脱组分；11：1000mM NaCl洗脱组分。从图5可知，第4泳道由50mM NaCl洗脱下来的蛋白即为单修饰的PEDF。

实施例4  40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联

本实施例涉及的重组人色素上皮衍生因子包括具有SEQ NO.2序列的重组人色素上皮衍生因子。具体方式为将重组人色素上皮衍生因子透析到pH5.5的30mM醋酸钠溶液中，测量蛋白浓度，并调整其浓度至3-8mg/ml之间。按照目的蛋白与聚乙二醇的摩尔比1比2计算需要加入的分子量为40KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛的量，同时按照最终溶液体积计算还原剂CH3BNNa的用量，其浓度为20mM。最后调整溶液pH值至5.1-5.3。反应溶液搅拌均匀后于室温静止4-6小时或4℃10小时。此时重组人色素上皮衍生因子被单一聚乙二醇修饰的比例在30％以上，即一个重组人色素上皮衍生因子被一个分子量为40KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰，且修饰位点为重组人色素上皮衍生因子的N末端。修饰过程电泳图谱见图6。在图6中，1：分子量为40KD的单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF；2：Marker，由上依次为116，75，50，45，30，18，14KD。

实施例5  40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后用阳离子柱纯化

具体实施方式是将修饰后的重组人色素上皮衍生因子用阳离子柱分离纯化。具体选择GE公司的SPHP层析介质，并将修饰后的反应液调节pH值为6.3。阳离子柱用30mM、pH6.3的醋酸钠溶液平衡，并上样。再用30mM醋酸钠、1M氯化钠、pH6.3的溶液进行梯度洗脱。因聚乙二醇对蛋白本身的电荷有一定的屏蔽作用，多修饰的蛋白电荷强度最弱，其次是单修饰的蛋白，然后是未修饰的蛋白，因此洗脱时按照此顺序蛋白被依次洗脱下来。根据280nm紫外吸收，收集不同的组分并进行SDS-PAGE检测。纯化过程见图7。图7中，1：Marker，从上依次为116，75，40，30，18KD；2：修饰的样品；3：穿透；4：100mM NaCl洗脱组分(目的组分)；5：200mM NaCl洗脱组分；6：300mM NaCl洗脱组分；7：1000mM NaCl洗脱组分(未修饰的PEDF)。

实施例6  20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后在血液中的长效效应

通过测量单修饰和未修饰的重组色素上皮衍生因子在大鼠体内的药物代谢半衰期来确定修饰蛋白的长效效应。选取8只健康Wistar大鼠，分为两组，每组四只，分别于尾静脉注射单修饰和未修饰的重组色素上皮衍生因子，剂量为1mg/kg体重。然后分别于注射前、注射后5分钟、注射后10分钟、20分钟、40分钟、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、168、216、264小时尾静脉取血。收集血清，用美国ADL人色素上皮衍生因子双抗体夹心法ELISA试剂盒测量血液中重组色素上皮衍生因子的浓度。结果表明，重组色素上皮衍生因子的半衰期从修饰前的4.5小时延长到修饰后蛋白78.5小时(见下表1和图8)，修饰后PEDF半衰期延长16.4倍左右。在图8中，深色曲线代表PEDF，浅色曲线代表20KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF。

表1  20KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF的药代动力学参数

 

	半衰期(h)	CLsys(ml·h/kg)	AUC(ng·h/ml)
				20 KD PEG-PEDF	78.5±19.8	212.4±18.2	39648.5±739.6
PEDF	4.5±0.6	854.9±62.0	3706.9±374.9

实施例7  40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后在血液中的长效效应

通过测量单修饰和未修饰的重组色素上皮衍生因子在大鼠体内的药物代谢半衰期来确定修饰蛋白的长效效应。选取8只健康Wistar大鼠，分为两组，每组四只，分别于尾静脉注射单修饰和未修饰的重组色素上皮衍生因子，剂量为1mg/kg体重。然后分别于注射前、注射后5分钟、注射后10分钟、20分钟、40分钟、1、2、4、8、16、24、48、72、96、120、168、216、264小时尾静脉取血。收集血清，用美国ADL人色素上皮衍生因子双抗体夹心法ELISA试剂盒测量血液中重组色素上皮衍生因子的浓度。结果表明，重组色素上皮衍生因子的半衰期从修饰前的4.5小时延长到修饰后蛋白82.3小时(见下表2和图9)，修饰后PEDF半衰期延长17.3倍左右。在图9中，深色曲线代表PEDF，浅色曲线代表40KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF。

表2  40 KD单甲氧基聚乙二醇丙醛修饰的PEDF的药代动力学参数

 

	半衰期(h)	CLsys(ml·h/kg)	AUC(ng·h/ml)
				40KD PEG-PEDF	82.3±15.8	201.4±16.7	37985.5±699.2
PEDF	4.5±0.6	854.8±71.0	3706.9±259.7

实施例8  20KD、40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制血管内皮细胞迁移的活性

具体实施方案为将人血管内皮细胞(HMEC)在含10％血清的DMEM培养基中培养至对数生长期，然后饥饿细胞12小时。将细胞用胰酶消化以后加入到Transwell中，每孔细胞数10⁴个。此时细胞培养液为DMEM培养基、1％血清、10ng/ml bFGF和青霉素、链霉素双抗。加药组的培养孔内加入浓度为0.5、1、5、25ug/ml的20KD聚乙二醇、40KD聚乙二醇单修饰和未修饰的重组色素上皮衍生因子。37℃培养8小时后，取出小皿，用1％的戊二醛固定细胞，刮掉膜上层的细胞，用苏木精对下层细胞染色，最后在显微镜下取同样视野对细胞计数。同一皿选取5个不同视野，最后计算平均抑制率。结果见图10。在图10中，1：PEDF 0.5μg/ml；2：PEDF 1μg/ml；3：PEDF 5μg/ml；4：PEDF 25μg/ml；5：20KD PEG-PEDF 0.5μg/ml；6：20KD PEG-PEDF 1μg/ml；7：20KD PEG-PEDF 5μg/ml；8：20KD PEG-PEDF 25μg/ml；9：40KD PEG-PEDF 0.5μg/ml；10：40KD PEG-PEDF 1μg/ml；11：40KD PEG-PEDF 5μg/ml；12：40KD PEG-PEDF 25μg/ml。

图10结果表明：PEDF、20KD聚乙二醇修饰的PEDF和40KD聚乙二醇修饰的PEDF在浓度为1ug/ml时对HMEC细胞迁移的抑制率达到60％左右；浓度为5ug/ml时对HMEC细胞迁移的抑制率达到80％左右；在浓度为25ug/ml时细胞大多数均出现凋亡。该实验结果说明PEDF经20KD、40KD聚乙二醇单修饰后，仍保持有未修饰PEDF抑制血管内皮细胞迁移的活性，且活性相当。

实施例9  20KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制小鼠肺癌的活性

本实施例观察了20KD聚乙二醇修饰的重组色素上皮衍生因子对小鼠肺癌的体内抑制活性。选用20g体重的昆明种小鼠，分别于腋下接种肺癌细胞，每只接入细胞数2×10⁶个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(Endostar，3mg/kg体重，每天给药)、未修饰的色素上皮衍生因子对照组(1mg/kg体重，每天给药)、五组给药组(20KD聚乙二醇修饰的重组色素上皮衍生因子，简称PEG20K-PEDF，1mg/kg体重，每三天、七天、十二天给药；0.3和3mg/kg体重，每七天给药)。尾静脉给药，共给药21-24天。给药结束后处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率。抑制率结果见图11。在图11中，1：阴性对照；2：Endostar 3mg/kg，每天给药一次；3：PEDF 1mg/kg每天给药一次；4：PEG20K-PEDF 0.3mg/kg，每7天给药一次；5：PEG20K-PEDF 3mg/kg，每7天给药一次；6：PEG20K-PEDF 1mg/kg，每3天给药一次；7：PEG20K-PEDF 1mg/kg，每7天给药一次；8：PEG20K-PEDF 1mg/kg，每12天给药一次。与阴性对照组相比，第2、4、5、7、8组P值小于0.01；第3、6组P值小于0.05。

实验结果表明：阳性对照药物Endostar 3mg/kg，每天给药一次抑瘤率为53％；PEDF 1mg/kg每天给药一次抑瘤率达到81％；PEG20K-PEDF 1mg/kg每7天给药一次抑瘤率达到68％；PEG20K-PEDF 1mg/kg每12天给药一次抑瘤率仍能达到51％。

该实验结果说明PEDF经20KD聚乙二醇单修饰后，仍具有未修饰PEDF抑制小鼠肿瘤生长的活性，且活性相当甚至超过未修饰PEDF。

实施例10  40KD聚乙二醇与重组色素上皮衍生因子的N末端偶联后纯化的单修饰组分抑制小鼠肺癌的活性

本实施例观察了40KD聚乙二醇修饰的重组色素上皮衍生因子对小鼠肺癌的体内抑制活性。选用20g体重的昆明种小鼠，分别于腋下接种肺癌细胞，每只接入细胞数2×10⁶个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(Endostar，3mg/kg体重，每天给药)、3组给药组(40KD聚乙二醇修饰的重组色素上皮衍生因子，简称PEG40K-PEDF，0.3、1、3mg/kg体重，每七天给药一次)。尾静脉给药，共给药21-24天。给药结束后处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率。抑制率结果见图12。在图12中，1：阴性对照；2：Endostar 3mg/kg，每天给药一次；3：PEG40K-PEDF 0.3mg/kg每7天给药一次；4：PEG40K-PEDF 1mg/kg，每7天给药一次；5：PEG40K-PEDF 3mg/kg，每7天给药一次。与阴性对照组相比，第2、3、4、5组P值小于0.01。

图12结果表明：阳性对照药物Endostar 3mg/kg体重，每天给药的抑瘤率为48％；PEG40K-PEDF 0.3、1、3mg/kg体重，每七天给药一次的抑瘤率分别为65％、70％和85％，量效关系明显。与20KD聚乙二醇修饰的PEDF相比，同剂量、同样给药方式的抑瘤率类似。

该实验结果说明PEDF经40KD聚乙二醇单修饰后，仍具有未修饰PEDF抑制小鼠肿瘤生长的活性，且活性相当甚至超过未修饰PEDF。

实施例11  用聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF

选用聚乳酸和羟基乙酸的比例为75/25，采用双乳液法(W/O/W法)制备聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球，固化温度为45℃，将PEDF包埋。选用20g体重的昆明种小鼠，分别于腋下接种肺癌细胞，每只接入细胞数2×10⁶个。第二天随机分组，每组8只，分别设定阴性对照组(生理盐水)、PEG20K-PEDF1mg/kg给药和微囊包埋PEDF给药组。PEG20K-PEDF每周给药一次，连续给药3周，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF给药一次。3周后处死小鼠，称瘤重，计算抑瘤率。抑制率结果见图13。在图13中，1：阴性对照组；2：PEG20K-PEDF1mg/kg给药组；3：PLGA微囊包埋PEDF给药组。

图13结果显示，聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA)包埋PEDF给药一次，3周后仍能抑制肿瘤的生长，抑瘤率达到61％。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>焦春，于昊燕

<120>含色素上皮衍生因子的复合物及其制备方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>418

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<220>

<221>PROPEP

<222>(1)..(19)

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(19)..(121)

<400>1

<210>2

<211>399

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Claims (13)

1、一种含色素上皮衍生因子的复合物，其特征在于，所述色素上皮衍生因子与聚烯醇类化合物或免疫球蛋白Fc片断偶联。

2、如权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述聚烯醇类化合物为聚乙二醇，该聚乙二醇选自单甲氧基聚乙二醇丙醛或单甲氧基聚乙二醇丁醛。

3、如权利要求2所述的复合物，其特征在于，一个色素上皮衍生因子与一个或多个聚乙二醇分子偶联，该偶联的位点为色素上皮衍生因子的N端α氨基、赖氨酸残基侧链的ε氨基、半胱氨酸残基侧链的巯基、天冬氨酸残基侧链的羧基、谷氨酸残基侧链的羧基中的一个或其多个组合。

4、如权利要求3所述复合物，其特征在于，一个色素上皮衍生因子与一个聚乙二醇分子偶联，该偶联的位点为色素上皮衍生因子的N端α氨基。

5、如权利要求1所述的复合物，其特征在于，一个色素上皮衍生因子和一个或多个免疫球蛋白Fc片断偶联。

6、一种包含权利要求1所述复合物的缓释制剂。

7、如权利要求6所述的缓释制剂，其特征在于，该缓释制剂的缓释材料为聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物微球。

8、一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的复合物和可药用载体。

9、一种包含权利要求1所述复合物的试剂盒。

10、一种含色素上皮衍生因子的复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

用活化的聚烯醇类化合物与色素上皮衍生因子以1：5至5：1的摩尔比混合，并在pH为3-10，温度为4-30℃的条件下进行反应。

11、如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，还包括用阳离子柱或用分子筛分离反应后获得的不同修饰的色素上皮衍生因子。

12、权利要求1所述的复合物在制备预防、诊断或治疗肿瘤的药物中的应用。

13、权利要求1所述的复合物在制备预防、诊断或治疗包括增殖性糖尿病视网膜病变、风湿性及年龄相关性黄斑变性的新生血管异常增生疾病的药物中的应用。

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